抗腫瘍剤
【課題】抗腫瘍効果に優れ、かつ、安全性の高い抗腫瘍剤を提供することである。
【解決手段】キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤であり、前記酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０であるのが好ましく、前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」であるのが好ましい。
【解決手段】キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤であり、前記酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０であるのが好ましく、前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」であるのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関し、さらに詳しくは、キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有し、人体に対して安全性が高く、腫瘍サイズを減少させることを可能にする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、心筋梗塞及び脳卒中と並ぶ「現代人の三大疾病」の一つに挙げられており、治療方法として、化学療法、放射線療法及び外科療法のいわゆる三大療法が用いられている。特に、抗癌剤投与を行う場合、重篤な副作用を伴うものも多く、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ：生活の質）を著しく低下させてしまうことが多い。このような背景から、安全性の高い抗腫瘍剤が求められるようになり、種々の天然物由来の抗腫瘍剤に関する研究がなされている。天然物由来の抗腫瘍剤としては、例えば、ハタケシメジ抽出物又はその精製物を活性成分とする抗腫瘍剤（特許文献１参照）、牡蠣肉熱水抽出物にアルコールを接触させて得られるアルコール処理物を有効成分とする抗腫瘍剤（特許文献２参照）、スイートコーン又はスイートコーンのグリコーゲン粗抽出物を含有した抗腫瘍剤（特許文献３参照）等が知られている。
【０００３】
一方、本出願人らは、酸性キシロオリゴ糖の製造方法や、酸性キシロオリゴ糖のアレルギー性鼻炎改善作用について報告している（特許文献４及び５参照）。しかし、酸性キシロオリゴ糖の抗腫瘍作用に関して報告している文献はない。
【特許文献１】特開平１１−３０２１９１号公報
【特許文献２】特開平１０−３３８６４０号公報
【特許文献３】特開２００４−２１０６９６号公報
【特許文献４】特開２００３−１８３３０３号公報
【特許文献５】特開２００５−１１２８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、抗腫瘍効果に優れ、かつ、安全性の高い抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決するべく、鋭意研究した結果、ウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖組成物が、優れた抗腫瘍効果を持つことを見出した。
本発明は、以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤」である。
本発明の第２は、前記第１発明において、「該酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０である抗腫瘍剤」である。
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、「前記酸性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たものである抗腫瘍剤」である。
本発明の第４は、前記第１〜第３の発明において、「ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である抗腫瘍剤」である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、抗腫瘍効果に優れた安全性の高い抗腫瘍剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の構成について詳述するが、本発明はこれにより限定されるものではない。本発明の抗腫瘍剤は、キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする。
キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖とは、キシロオリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。また、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性キシロオリゴ糖組成物について説明する。
【０００８】
本発明においては、酸性キシロオリゴ糖組成物の平均重合度が２．０〜１５.０であるのが好ましく、なかでも、２．０〜１１．０であるのが好ましい。また、キシロース鎖長の上限と下限との差は２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては、特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸が好ましい。
【０００９】
上記のような酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。特に、（２）の方法が５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で好ましい。以下、（２）の方法についての概要を示す。
【００１０】
酸性キシロオリゴ糖組成物は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程及び精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖とを含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するので、セラミックフィルター又は濾紙等を用いた濾過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１１】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程及び吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去される。着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程には、限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析又は透析等でも可能である。こうして得られた糖液中には酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖とが溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から酸性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。次いで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。
【００１２】
樹脂に吸着した酸性キシロオリゴ糖を、低濃度の塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。この溶液に、例えば、スプレードライ処理や凍結乾燥処理等を施すことにより、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００１３】
化学パルプ由来のリグノセルロースを原料とし、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体とした酸性キシロオリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性に富む点とキシロースの平均重合度の高い酸性キシロオリゴ糖組成物が容易に得られる点とにある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００１４】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、たとえば、酸性キシロオリゴ糖と各種希釈剤とを混合し、加熱乾燥させた後、粉体化することにより製造することができる。抗腫瘍剤における酸性キシロオリゴ糖の割合としては、一般に１〜１００ｗｔ％であり、なかでも、５〜８０ｗｔ％であるのが好ましい。酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、ヒト又は動物に投与することができる。投与としては、経口投与又は非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。経口投与には、舌下投与も含まれる。非経口投与としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射又は点滴等を挙げることができ、更に、坐剤による直腸投与も可能である。
【００１５】
希釈剤としては、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤又は溶剤等を挙げることができる。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース若しくはその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン又は高級アルコール等を挙げることができる。なお、希釈剤の形態としては、固体、液体又は半固体のいずれであってもよい。
【００１６】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、そのまま摂取しても良いが、飲料や食品に添加したりして摂取することもできる。抗腫瘍剤の形態としては、粉体化しても良いし、打錠により錠剤化しても良い。
【００１７】
本発明に於ける酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、各種食品、経腸栄養剤等の栄養成分又は医薬品と混合して医療用食品や機能性食品として提供することが出来る。また、一般的に医薬部外品や医薬品に使用される成分と混合し、医薬部外品や医薬品としても提供することも出来る。なお、上述の食品、医療用食品、機能性食品、医薬部外品及び医薬品は、ヒトだけではなく、犬や猫のペットにも用いることができる。
【００１８】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、有効薬量の有効成分が含有される限りにおいて、常法により、投薬単位の剤形で提供することができる。例えば、抗腫瘍剤が経口用である場合、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤又は乳剤等にすることができ、非経口用である場合、注射液のアンプル、ビン形態又は坐剤等にすることができる。
【００１９】
酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤の１日の摂取量として、ヒトを対象にする場合には、一般的に、体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇが好ましく、さらに好ましくは、１０〜５００ｍｇであり、この量を１〜４回に分けて摂取するのがよい。なお、動物かヒトかの違い、年齢や個人差、病状等によって摂取量が影響されるので、前記の範囲外の量を摂取することも可能である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である酸性キシロオリゴ糖（ＵＸ１０）の調製例を示す。
＜測定法の概要＞
(１) 全糖量の定量
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(２) 還元糖量の定量
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(３) ウロン酸量の定量
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(４) 平均重合度の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。遠心分離後、不溶物を除去し、得られた上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(５) 酸性キシロオリゴ糖の分析方法
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（日本ダイオネクス（株）社製分析用カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭのＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｍＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝１０：０〜４：６となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。
(６) オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。遠心分離後、不溶物を除去し、得られた上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
(７) 酵素力価の定義
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義は、キシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００２１】
＜酸性キシロオリゴ糖の調製＞
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹７０％、ユーカリ３０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９.６、パルプ粘度２５.１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
バチルスｓｐ.Ｓ−２１１３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター、寄託菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを１単位／パルプｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、濾過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０５０Ｌを得た。
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３.５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルター濾過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）に通過させた後、活性炭（和光純薬工業（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから７５ｍＭのＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液をスプレードライ処理することによって、酸性キシロオリゴ糖の白色粉末（全糖量３５３ｇ、回収率１３.１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖をＵＸ１０とする。前述の測定方法により、ＵＸ１０は平均重合度１０.３、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００２２】
＜抗腫瘍活性試験＞
１匹のＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雌、５週齢）の腹腔内にＳａｃｒｏｍａｌ８０ガン細胞を移植して１０日間飼育した。１０日経過後、このマウスの腹腔内からガン細胞を採取し、６匹のＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雌、５週齢）それぞれの皮下に、ガン細胞を５×１０５個（１匹当たり）移植した。移植２４時間後から、酸性キシロオリゴ糖（生理食塩水に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇの割合で、毎日１回、１０日間にわたって経口投与（ｐ．ｏ）した。尚、コントロールとして生理食塩水を用いて経口投与した。移植1週間後から毎週1回腫瘍の大きさを測定した。また、４週目における生存率をコントロール群と比較した。その結果を表１に示す。
【００２３】
酸性キシロオリゴ糖投与群では、コントロール群に比べて腫瘍サイズが減少し、生存率が上昇していることがわかった。
【００２４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、抗腫瘍効果を有する健康食品の原料として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤に関し、さらに詳しくは、キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分として含有し、人体に対して安全性が高く、腫瘍サイズを減少させることを可能にする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、心筋梗塞及び脳卒中と並ぶ「現代人の三大疾病」の一つに挙げられており、治療方法として、化学療法、放射線療法及び外科療法のいわゆる三大療法が用いられている。特に、抗癌剤投与を行う場合、重篤な副作用を伴うものも多く、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ：生活の質）を著しく低下させてしまうことが多い。このような背景から、安全性の高い抗腫瘍剤が求められるようになり、種々の天然物由来の抗腫瘍剤に関する研究がなされている。天然物由来の抗腫瘍剤としては、例えば、ハタケシメジ抽出物又はその精製物を活性成分とする抗腫瘍剤（特許文献１参照）、牡蠣肉熱水抽出物にアルコールを接触させて得られるアルコール処理物を有効成分とする抗腫瘍剤（特許文献２参照）、スイートコーン又はスイートコーンのグリコーゲン粗抽出物を含有した抗腫瘍剤（特許文献３参照）等が知られている。
【０００３】
一方、本出願人らは、酸性キシロオリゴ糖の製造方法や、酸性キシロオリゴ糖のアレルギー性鼻炎改善作用について報告している（特許文献４及び５参照）。しかし、酸性キシロオリゴ糖の抗腫瘍作用に関して報告している文献はない。
【特許文献１】特開平１１−３０２１９１号公報
【特許文献２】特開平１０−３３８６４０号公報
【特許文献３】特開２００４−２１０６９６号公報
【特許文献４】特開２００３−１８３３０３号公報
【特許文献５】特開２００５−１１２８２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、抗腫瘍効果に優れ、かつ、安全性の高い抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記課題を解決するべく、鋭意研究した結果、ウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖組成物が、優れた抗腫瘍効果を持つことを見出した。
本発明は、以下の構成を採用する。即ち、本発明の第１は、「キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤」である。
本発明の第２は、前記第１発明において、「該酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０である抗腫瘍剤」である。
本発明の第３は、前記第１または第２の発明において、「前記酸性キシロオリゴ糖が、リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たものである抗腫瘍剤」である。
本発明の第４は、前記第１〜第３の発明において、「ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である抗腫瘍剤」である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、抗腫瘍効果に優れた安全性の高い抗腫瘍剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の構成について詳述するが、本発明はこれにより限定されるものではない。本発明の抗腫瘍剤は、キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする。
キシロオリゴ糖とは、キシロースの２量体であるキシロビオース、３量体であるキシロトリオース、あるいは４量体〜２０量体程度のキシロースの重合体を言う。本発明で使用する酸性キシロオリゴ糖とは、キシロオリゴ糖１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を有するものを言う。また、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であっても良い。一般的には、天然物から製造するために、このような組成物として得られることが多く、以下、主として酸性キシロオリゴ糖組成物について説明する。
【０００８】
本発明においては、酸性キシロオリゴ糖組成物の平均重合度が２．０〜１５.０であるのが好ましく、なかでも、２．０〜１１．０であるのが好ましい。また、キシロース鎖長の上限と下限との差は２０以下が好ましく、１０以下がより好ましい。ウロン酸は天然では、ペクチン、ペクチン酸、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸等の種々の生理活性を持つ多糖の構成成分として知られている。本発明におけるウロン酸としては、特に限定されないが、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸が好ましい。
【０００９】
上記のような酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることが出来れば、その製法は特に限定されないが、（１）木材からキシランを抽出し、それを酵素的に分解する方法（セルラーゼ研究会発行、セルラーゼ研究会報第１６巻、２００１年６月１４日発行、ｐ１７−２６）と、（２）リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離する方法が挙げられる。特に、（２）の方法が５〜１０量体のように比較的高い重合度のものを大量に安価に製造することが可能である点で好ましい。以下、（２）の方法についての概要を示す。
【００１０】
酸性キシロオリゴ糖組成物は、化学パルプ由来のリグノセルロース材料を原料とし、加水分解工程、濃縮工程、希酸処理工程及び精製工程を経て得ることができる。加水分解工程では、希酸処理、高温高圧の水蒸気（蒸煮・爆砕）処理もしくは、ヘミセルラーゼによってリグノセルロース中のキシランを選択的に加水分解し、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体として得る。濃縮工程では逆浸透膜等により、キシロオリゴ糖−リグニン様物質複合体が濃縮され、低重合度のオリゴ糖や低分子の夾雑物などを除去することができる。濃縮工程は逆浸透膜を用いることが好ましいが、限外濾過膜、塩析、透析などでも可能である。得られた濃縮液の希酸処理工程により、複合体からリグニン様物質が遊離し、酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖とを含む希酸処理液を得ることができる。この時、複合体から切り離されたリグニン様物質は酸性下で縮合し沈殿するので、セラミックフィルター又は濾紙等を用いた濾過等により除去することができる。希酸処理工程では、酸による加水分解を用いることが好ましいが、リグニン分解酵素などを用いた酵素分解などでも可能である。
【００１１】
精製工程は、限外濾過工程、脱色工程及び吸着工程からなる。一部のリグニン様物質は可溶性高分子として溶液中に残存するが、限外濾過工程で除去される。着色物質等の夾雑物は活性炭を用いた脱色工程によってそのほとんどが取り除かれる。限外濾過工程には、限外濾過膜を用いることが好ましいが、逆浸透膜、塩析又は透析等でも可能である。こうして得られた糖液中には酸性キシロオリゴ糖と中性キシロオリゴ糖とが溶解している。イオン交換樹脂を用いた吸着工程により、この糖液から酸性キシロオリゴ糖のみを取り出すことができる。糖液をまず強陽イオン交換樹脂にて処理し、糖液中の金属イオンを除去する。次いで強陰イオン交換樹脂を用いて糖液中の硫酸イオンなどを除去する。この工程では、硫酸イオンの除去と同時に弱酸である有機酸の一部と着色成分の除去も同時に行っている。強陰イオン交換樹脂で処理された糖液はもう一度強陽イオン交換樹脂で処理し更に金属イオンを除去する。最後に弱陰イオン交換樹脂で処理し、酸性キシロオリゴ糖を樹脂に吸着させる。
【００１２】
樹脂に吸着した酸性キシロオリゴ糖を、低濃度の塩（ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２など）によって溶出させることにより、夾雑物を含まない酸性キシロオリゴ糖溶液を得ることができる。この溶液に、例えば、スプレードライ処理や凍結乾燥処理等を施すことにより、白色の酸性キシロオリゴ糖組成物の粉末を得ることができる。
【００１３】
化学パルプ由来のリグノセルロースを原料とし、キシロオリゴ糖とリグニンからなる高分子量の複合体を中間体とした酸性キシロオリゴ糖組成物の上記製造法のメリットは、経済性に富む点とキシロースの平均重合度の高い酸性キシロオリゴ糖組成物が容易に得られる点とにある。平均重合度は、例えば、希酸処理条件を調節するか、再度ヘミセルラーゼで処理することによって変えることが可能である。また、弱陰イオン交換樹脂溶出時に用いる溶出液の塩濃度を変化させることによって、１分子あたりに結合するウロン酸残基の数が異なる酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることもできる。さらに、適当なキシラナーゼ、ヘミセルラーゼを作用させることによってウロン酸結合部位が末端に限定された酸性キシロオリゴ糖組成物を得ることも可能である。
【００１４】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、たとえば、酸性キシロオリゴ糖と各種希釈剤とを混合し、加熱乾燥させた後、粉体化することにより製造することができる。抗腫瘍剤における酸性キシロオリゴ糖の割合としては、一般に１〜１００ｗｔ％であり、なかでも、５〜８０ｗｔ％であるのが好ましい。酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、ヒト又は動物に投与することができる。投与としては、経口投与又は非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。経口投与には、舌下投与も含まれる。非経口投与としては、例えば、皮下注射、筋肉注射、静脈注射又は点滴等を挙げることができ、更に、坐剤による直腸投与も可能である。
【００１５】
希釈剤としては、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤又は溶剤等を挙げることができる。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース若しくはその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン又は高級アルコール等を挙げることができる。なお、希釈剤の形態としては、固体、液体又は半固体のいずれであってもよい。
【００１６】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、そのまま摂取しても良いが、飲料や食品に添加したりして摂取することもできる。抗腫瘍剤の形態としては、粉体化しても良いし、打錠により錠剤化しても良い。
【００１７】
本発明に於ける酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、各種食品、経腸栄養剤等の栄養成分又は医薬品と混合して医療用食品や機能性食品として提供することが出来る。また、一般的に医薬部外品や医薬品に使用される成分と混合し、医薬部外品や医薬品としても提供することも出来る。なお、上述の食品、医療用食品、機能性食品、医薬部外品及び医薬品は、ヒトだけではなく、犬や猫のペットにも用いることができる。
【００１８】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、有効薬量の有効成分が含有される限りにおいて、常法により、投薬単位の剤形で提供することができる。例えば、抗腫瘍剤が経口用である場合、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤又は乳剤等にすることができ、非経口用である場合、注射液のアンプル、ビン形態又は坐剤等にすることができる。
【００１９】
酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤の１日の摂取量として、ヒトを対象にする場合には、一般的に、体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇが好ましく、さらに好ましくは、１０〜５００ｍｇであり、この量を１〜４回に分けて摂取するのがよい。なお、動物かヒトかの違い、年齢や個人差、病状等によって摂取量が影響されるので、前記の範囲外の量を摂取することも可能である。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。まず、各測定法の概要、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である酸性キシロオリゴ糖（ＵＸ１０）の調製例を示す。
＜測定法の概要＞
(１) 全糖量の定量
全糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、フェノール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(２) 還元糖量の定量
還元糖量は検量線をＤ−キシロース（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、ソモジ−ネルソン法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(３) ウロン酸量の定量
ウロン酸は検量線をＤ−グルクロン酸（和光純薬工業（株）製）を用いて作製し、カルバゾール硫酸法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）にて定量した。
(４) 平均重合度の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。遠心分離後、不溶物を除去し、得られた上清液の全糖量を還元糖量（共にキシロース換算）で割って平均重合度を求めた。
(５) 酸性キシロオリゴ糖の分析方法
オリゴ糖鎖の分布はイオンクロマトグラフ（日本ダイオネクス（株）社製分析用カラム：Ｃａｒｂｏ Ｐａｃ ＰＡ−１０）を用いて分析した。分離溶媒には１００ｍＭのＮａＯＨ溶液を用い、溶出溶媒には前述の分離溶媒に酢酸ナトリウムを５００ｍＭとなるように添加し、溶液比で、分離溶媒：溶出溶媒＝１０：０〜４：６となるような直線勾配を組み分離した。得られたクロマトグラムより、キシロース鎖長の上限と下限との差を求めた。
(６) オリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数の決定法
サンプル糖液を５０℃に保ち、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。遠心分離後、不溶物を除去し、得られた上清液のウロン酸量（Ｄ−グルクロン酸換算）を還元糖量（キシロース換算）で割ってオリゴ糖１分子あたりのウロン酸残基数を求めた。
(７) 酵素力価の定義
酵素として用いたキシラナーゼの活性測定にはカバキシラン（シグマ社製）を用いた。酵素力価の定義は、キシラナーゼがキシランを分解することで得られる還元糖の還元力をＤＮＳ法（還元糖の定量法、学会出版センター発行）を用いて測定し、１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力を生成させる酵素量を１ユニットとした。
【００２１】
＜酸性キシロオリゴ糖の調製＞
混合広葉樹チップ（国内産広葉樹７０％、ユーカリ３０％）を原料として、クラフト蒸解及び酸素脱リグニン工程により、酸素脱リグニンパルプスラリー（カッパー価９.６、パルプ粘度２５.１ｃｐｓ）を得た。スラリーからパルプを濾別、洗浄した後、パルプ濃度１０％、ｐＨ８に調製したパルプスラリーを用いて以下のキシラナーゼによる酵素処理を行った。
バチルスｓｐ.Ｓ−２１１３株（独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター、寄託菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５２６４）の生産するキシラナーゼを１単位／パルプｇとなるように添加した後、６０℃で１２０分間処理した。その後、濾過によりパルプ残渣を除去し、酵素処理液１０５０Ｌを得た。
次に、得られた酵素処理液を濃縮工程、希酸処理工程、精製工程の順に供した。
濃縮工程では、逆浸透膜（日東電工（株）製、ＲＯ ＮＴＲ−７４１０）を用いて濃縮液（４０倍濃縮）を調製した。希酸処理工程では、得られた濃縮液のｐＨを３.５に調整した後、１２１℃で６０分間加熱処理し、リグニンなどの高分子夾雑物の沈殿を形成させた。さらに、この沈殿をセラミックフィルター濾過で取り除くことにより、希酸処理溶液を得た。
精製工程では、限外濾過・脱色工程、吸着工程の順に供した。限外濾過・脱色工程では、希酸処理溶液を限外濾過膜（オスモニクス社製、分画分子量８０００）に通過させた後、活性炭（和光純薬工業（株）製）７７０ｇの添加及びセラミックフィルター濾過により脱色処理液を得た。吸着工程では、脱色処理液を強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＫ２１８）、強陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＡ４０８）、強陽イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＰＫ２１８）各１００ｋｇを充填したカラムに順次通過させた後、弱陰イオン交換樹脂（三菱化学（株）製、ＷＡ３０）１００ｋｇを充填したカラムに供した。この弱陰イオン交換樹脂充填カラムから７５ｍＭのＮａＣｌ溶液によって溶出した溶液をスプレードライ処理することによって、酸性キシロオリゴ糖の白色粉末（全糖量３５３ｇ、回収率１３.１％）を得た。以下、この酸性キシロオリゴ糖をＵＸ１０とする。前述の測定方法により、ＵＸ１０は平均重合度１０.３、キシロース鎖長の上限と下限との差は１０、酸性キシロオリゴ糖１分子あたりウロン酸残基を１つ含む糖組成化合物であった。
【００２２】
＜抗腫瘍活性試験＞
１匹のＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雌、５週齢）の腹腔内にＳａｃｒｏｍａｌ８０ガン細胞を移植して１０日間飼育した。１０日経過後、このマウスの腹腔内からガン細胞を採取し、６匹のＩＣＲ／ＳＬＣ系マウス（雌、５週齢）それぞれの皮下に、ガン細胞を５×１０５個（１匹当たり）移植した。移植２４時間後から、酸性キシロオリゴ糖（生理食塩水に溶解）を１００ｍｇ／ｋｇの割合で、毎日１回、１０日間にわたって経口投与（ｐ．ｏ）した。尚、コントロールとして生理食塩水を用いて経口投与した。移植1週間後から毎週1回腫瘍の大きさを測定した。また、４週目における生存率をコントロール群と比較した。その結果を表１に示す。
【００２３】
酸性キシロオリゴ糖投与群では、コントロール群に比べて腫瘍サイズが減少し、生存率が上昇していることがわかった。
【００２４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の酸性キシロオリゴ糖を配合した抗腫瘍剤は、抗腫瘍効果を有する健康食品の原料として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０である前記請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」である前記請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である前記請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１】
キシロオリゴ糖分子中にウロン酸残基を有する酸性キシロオリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記酸性キシロオリゴ糖が、キシロースの重合度が異なるオリゴ糖の混合組成物であり、平均重合度が２．０〜１５.０である前記請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記酸性キシロオリゴ糖が、「リグノセルロース材料を酵素的及び／又は物理化学的に処理してキシロオリゴ糖成分とリグニン成分の複合体を得、次いで該複合体を酸加水分解処理してキシロオリゴ糖混合物を得、得られるキシロオリゴ糖混合物から、１分子中に少なくとも１つ以上のウロン酸残基を側鎖として有するキシロオリゴ糖を分離して得たもの」である前記請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ウロン酸が、グルクロン酸もしくは４−Ｏ−メチル−グルクロン酸である前記請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
【公開番号】特開２００８−６３２３７（Ｐ２００８−６３２３７Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３９８９９（Ｐ２００６−２３９８９９）
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【出願人】（５０３３０６１１３）王子木材緑化株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月５日（２００６．９．５）
【出願人】（０００１２２２９８）王子製紙株式会社 (2,055)
【出願人】（５０３３０６１１３）王子木材緑化株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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