抗菌及び／又は抗真菌性を有するカチオン性線状ペプチド
本発明は、式（ＫＬＡＫＬＡＫ）（式中、Ｋはリシンアミノ酸であり、Ｌはロイシンアミノ酸であり、かつＡはアラニンアミノ酸である）の第１ペプチド配列、及び式βＸＸβ（式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつＸはいかなるアミノ酸でも良い）の少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式（Ｂ）（式中、Ｂは中性ｐＨの、正に帯電した、４から１５個のアミノ酸のペプチドである）の第２ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第１ペプチド配列はｎ回反復され、かつ前記第２ペプチド配列はｍ回反復され、ｎ及びｍは、１〜５の整数であるペプチドを対象とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト、動物又は植物における細菌及び真菌感染治療の分野に関する。本発明は、細菌及び真菌類のような病原体による感染を予防及び／又は治療するためのペプチド及びそれらを含む組成物を特には対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物において病原性、かつ重度の感染の原因となる多数の微生物は、臨床で一般に使用される抗生物質耐性を有する。増大する微生物耐性の発達は、公衆衛生の重大な問題である。それ故数年前から、新規分子の同定に関する、及び特に抗菌及び抗真菌活性を有し、かつ通常使用される抗生物質とは異なる作用様式を有する短いペプチド（１５から３０個のアミノ酸）の研究に関する著しい関心が増大した。多数のペプチドが、抗微生物性を有するとして知られているヒト、動物及び植物タンパクから生じ、他方で、他のものは、物理化学研究に基づき合成して生成される。
【０００３】
配列ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫの１４ｍｅｒの線状ペプチドが、抗菌活性を有する非溶血ペプチドとして文献に記載された（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ ＭＭ、Ｊｕｂａｎ ＭＭ、Ｌｏ ＷＣ、Ｂｉｓｈｏｐ ＳＭ、Ａｌｂｅｒｔｙ ＪＢ、Ｃｏｗｅｌｌ ＳＭ、Ｂｅｃｋｅｒ ＣＬ、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＭＬ。低い哺乳類細胞毒性を有する新規の抗微生物ペプチド（Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）。Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ａｕｇ ２；３９（１６）：３１０７−１３）。このペプチドにより行われた限られた研究は、４時間の短いインキュベーション時間の間、３種の細菌株（大腸菌、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌）に対する活性を示した。より長いインキュベーション時間による結果が、記載されたことはなかった。
【０００４】
出願人は、標準評価条件（１８時間のインキュベーション）でこのペプチドの抗菌性のインビトロでの研究を行ったが、文献に記載された濃度では、該条件は、いかなる生物学的活性も示さなかった。反対に、思いがけないことに、モチーフＫＬＡＫＬＡＫが、抗菌及び／又は抗真菌性を有さないペプチド配列及びこのモチーフを含むペプチドに抗菌及び／又は抗真菌性を与えることが可能であることが今般明らかにされた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は：
−式（ＫＬＡＫＬＡＫ）（式中、Ｋはリシンアミノ酸であり、Ｌはロイシンアミノ酸であり、かつＡはアラニンアミノ酸である）の第１ペプチド配列、及び
−式βＸＸβ（式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつＸはいかなるアミノ酸でも良い）の少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式（Ｂ）（式中、Ｂは中性ｐＨの、正に帯電した、４から１５個のアミノ酸のペプチドである）の第２ペプチド配列を含む、又はそれらから構成される好適には線状かつカチオン性ペプチドであって、前記第１ペプチド配列はｎ回反復され、かつ前記第２ペプチド配列はｍ回反復され、ｎ及びｍは、１〜５の整数であるペプチドを対象とする。ｎは、好ましくは１〜３の整数である。好適には、ｍは、１より大きく、かつ第２ペプチド配列（Ｂ）は、同一又は異なる。
【０００６】
従って本発明のペプチドは、同一又は異なる幾つかの第２ペプチド配列（Ｂ）、及びそれ故に各第２ペプチド配列（Ｂ）中に、同一又は異なる式βＸＸβの幾つかのペプチドモチーフを含み得る。
【０００７】
好適には、本発明のペプチドは、線状である。従ってそれらは、次の一般式（Ｉ）：（ＫＬＡＫＬＡＫ）ｎ（Ｂ）ｍ（式中、第１及び第２ペプチド配列は：
−交互である、又は
−第１又は第２ペプチド配列の１つ、又は前記第１又は第２ペプチド配列の、Ｎ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められる）に対応する。
【０００８】
好ましくは、本発明のペプチドにおいて、第１ペプチド配列は、第２ペプチド配列のＮ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められる。
【０００９】
好ましくは、前記第１及び第２ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合される。
【００１０】
式βＸＸβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつＸは、好ましくはロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む群から選択される。
【００１１】
本発明によるペプチド組成物中に入る第２ペプチド配列の特異的な例として、次の配列：
−配列番号１：ＶＫＲＧＬＫＬ
−配列番号２：ＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ
−配列番号３：ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰを挙げることができる。
【００１２】
これらの第２ペプチド配列は、微生物による１８時間のインキュベーション後に、抗菌及び／又は抗真菌活性を有するカチオン性線状ペプチドを生成するように、２回反復される第１ペプチド配列：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４）に結合され得る。
【００１３】
本発明のペプチドは、化学合成、又は細菌のような原核細胞、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウサギ、ヤギ、ヒツジ等の乳、又は例えばタバコの苗等のようなトランスジェニック植物における酵母、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞のような真核細胞中の遺伝子工学によって調製され得る。
【００１４】
本発明は、脂質、糖、ヌクレオチド配列とのカップリングのような化学修飾、又はグリコシル化のような翻訳後プロセスから生じた修飾を含むペプチドのような、上記に定義したペプチドの機能同等物にも、これらの修飾が下記の実験の部に示すテストによる前記ペプチドの抗菌及び／又は抗真菌活性を修飾しない限りにおいて、関する。機能同等物は、１個又は数個のアミノ酸が、コンフォメーションＤのアミノ酸であるペプチドも含む。本発明は、レトロペプチド及びレトロインベルソペプチドも同様にカバーする。
【００１５】
本発明は、細菌及び／又は真菌感染を予防及び／又は治療するための、ヒト、動物又は植物における前記ペプチドの使用も対象とする。従って、本発明は、薬剤、化粧又は農業食品組成物であって、医薬上許容される１つ又は幾つかのビヒクル、希釈剤又は賦形剤と前記組成物中で結合される、以上で定義したような少なくとも１つのペプチドを有効成分として含む薬剤、化粧又は農業食品組成物に関する。本発明のペプチドは、低い毒性を有し、かつ更にこれらのペプチドは、非溶血性である。
【００１６】
ビヒクル、希釈剤及び賦形剤は、薬剤、化粧又は農学的な組成物の用途のタイプに応じて選択される。
【００１７】
このように、本発明はまた、抗菌及び／又は抗真菌目的の、薬剤、化粧、皮膚科学又は農業食品組成物の調製のための、以上で定義したようなペプチドの使用を対象とする。
【００１８】
本発明のペプチドは、グラム陰性、グラム陽性細菌、糸状菌及び酵母に対する活性を含む、多様な微生物に対する抗菌活性を有するが、しかるに分離して取った第２及び第１配列は、選択した評価条件において活性を有さない。
【００１９】
本発明の組成物は、予防的にも、治療的にも有用である
【００２０】
本発明による薬剤組成物の投与は、治療薬に許容される任意の投与方法によって行われ得る。これらの方法には、例えば頭蓋内外科方法、又は眼内投与による、全身、局所又は中枢投与を含む。生分解性移植片の皮下埋め込みも挙げることができる。
【００２１】
経口投与は、錠剤、ゼラチン質カプセル剤、遅延又は持続性放出製剤を含む軟カプセル剤、丸薬、粉末、細粒、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップ及びエマルジョンによって行うことができる。この提示形状は、腸関門通過、及び抗菌及び／又は抗真菌化合物の最も一般的な使用に特に適している。
【００２２】
抗菌及び／又は抗真菌化合物の非経口投与は、潅流による静脈内又は筋肉内注射によって一般的に行われる。注射可能な組成物は、懸濁又は溶液か、脂質製剤若しくはデキストラン製剤、又はＰＬＧＡ若しくは同等物の生分解性微小粒子又はナノ粒子中にペプチドを封入するような、遅延又は持続性放出製剤を含む適切な液体中での即時溶解に適した固形で、従来の形状で調製することができる。この提示形状は、血液脳関門通過、及び抗菌及び／又は抗真菌化合物の病院での使用に特に適している。
【００２３】
非経口投与の可能性は、一定レベルの分量の維持を確実にする、緩速放出又は持続性放出システムの移植を使用する。
【００２４】
もう一つの可能性は、カテーテル、人工補綴又は生体糊のような担体上に本発明のペプチドを吸着その他により固定することからなる。
【００２５】
鼻腔内投与のために、適当な鼻腔内ビヒクルを使用することができる。
【００２６】
その他の慣習的な局所調剤には、クリーム、軟膏、ローション、ゲル及びエアゾールスプレーを含む。これらは、細菌及び／又は真菌性気管支肺感染の治療に特に適している。
【００２７】
化粧組成物中での本発明のペプチドの使用は、重要な予防として有用であり、クリーム、マニキュア液、生殖器衛生製品、練り歯磨き、口腔衛生溶液中に、前記ペプチドを封入する、又はそれらを、例えばおむつ、綿棒、包帯、化粧落とし綿、生理用ナプキン又は動物用敷藁中に含まれる、水相で緩速拡散する微小粒子中に封入することからなる。
【００２８】
投与方法に応じて、化合物は固体、半固体又は液体形状であっても良い。
【００２９】
錠剤、丸薬、遊離状態又はゼラチン質カプセル剤中に封入される粉末又は細粒のような固体組成物に関して、有効成分は：
−希釈剤、例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン；
−潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール；
−結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びアルミニウム、デンプン糊、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン；必要な場合、
−崩壊剤、例えばデンプン、寒天、アルギン酸、又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物；及び／又は
−吸収剤、着色剤、芳香剤及び甘味料と組み合され得る。賦形剤は、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム及び薬剤品質の類似体であっても良い。
【００３０】
座薬のような半固体組成物に関して、賦形剤は、例えば脂肪性エマルジョン又は懸濁液であっても良く、又はポリプロピレングリコールのような、ポリアルキレングリコールを主成分としても良い。
【００３１】
特に注射可能な、又は軟カプセル剤中に封入する、液体組成物は、例えば水、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油及び類似体のような、薬剤的に純粋な溶剤中の有効成分の溶解、分散等によって例えば調製され得る。
【００３２】
本発明によるペプチドは、小型単層小嚢、大型単層小嚢、及び多層小嚢の形状のような、リポゾームタイプの放出システムの形状で同様に投与され得る。リポゾームは、コレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリンを含む多様なリン脂質から形成され得る。実施形において、液状成分フィルムが、薬剤をカプセルに入れる脂質層を形成するために、薬剤の水溶液によって水和され得る。
【００３３】
本発明による組成物は、滅菌され、かつ／又はアジュバント、及び保存剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調整する塩及び／又は緩衝液のような無毒性補助剤を含み得る。更に、本発明による組成物は、治療的有用性を有する他の物質を同様に含み得る。組成物は、従来の混合、細粒化又はコーティング方法によってそれぞれ調製され、かつ約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の有効成分を含む。
【００３４】
本発明によるペプチドは、標的とし得る薬剤担体のような可溶性重合体と同様に結合され得る。かかる重合体には、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパンアミド（ａｓｐａｎａｍｉｄｅ）−フェノール又はポリ（酸化エチレン）−ポリリシンで、パルミトイル残基によって置換されたもの、デキストランを含み得る。更に、本発明による化合物は、薬剤、例えばポリ（乳酸）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状の配列決定された、又は両親媒性ヒドロゲル共重合体の制御された放出を行うために有用な生分解性重合体類と結合され得る。
【００３５】
本発明によるペプチド投与のための薬量は、患者のタイプ、種族、年齢、体重、性別及び医療状態；治療する状態の深刻さ；投与方法；患者の腎臓及び肝臓の機能状態、及び使用する特殊な化合物又は塩の性質を含む多数の要因に応じて選択される。普通に経験を積んだ医師又は獣医ならば、治療する医療状態の進行を予防し、妨げ又は停止させるための有効量を容易に決定し、かつ処方するであろう。
【００３６】
本発明による組成物は、０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％の有効成分を含み得る。
【００３７】
例として、本発明によるペプチドの経口薬量は、経口で約０．５〜１ｍｇ／日であり、かつ好ましくは０．５、１、２．５、５、１０、１５、２５、５０、１００、２５０、５００及び１０００ｍｇの有効成分を含む錠剤の形状で与えられる。ペプチドの有効な血漿濃度は、体重１ｋｇ当たり、かつ１日当たり０．００２ｍｇ〜５０ｍｇに及ぶ薬量から得られる。
【００３８】
本発明のペプチドは、単一の１日量、又は１日当たり２、３又は４分量の形状で投与され得る。
【００３９】
本発明は、上記ペプチドの投与だけでなく、宿主、及び特に動物、植物又は原核生物を形質転換するために、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用も同様に検討する。これらの配列は、文献中に記載された遺伝子工学技術に従って使用される。
【００４０】
従って、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び例えば前記核酸分子を含む動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主、並びにそれらを含む特に薬剤組成物を同様に対象とする。
【００４１】
植物若しくは動物細胞、又は原核生物を形質転換するために使用され得るかかるポリヌクレオチドの例として：
− ペプチドＶＫＲＧＬＫＬＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号６）をコードする配列５’ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ３’（配列番号５）、
− ペプチドＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ（配列番号８）をコードする配列５’ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ３’（配列番号７）、
− ペプチドＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号１０）をコードする配列５’ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ３’（配列番号９）を挙げることができる。
【００４２】
従って、本発明は、植物を植物病原性細菌及び真菌に耐性を有するようにし、かつ環境に有害な化学殺虫剤の予防又は治療的な使用をこのようにして減少させるための、以上に記載したペプチドの農学的応用にも係る。有効量の抗菌及び／又は抗真菌ペプチド、又はそれを含む組成物を植物に直接適用することは、農学的応用の第１の実施形となる。この応用の第２の実施形は、上記の１つ又は幾つかの抗菌及び／又は抗真菌ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、植物細胞のＤＮＡに安定して組み込むことからなる形質転換生成技術に基づく。このように形質転換した植物細胞により、細菌及び／又は真菌感染に耐性を有する性質を子孫に伝達する植物を再生させることが可能になる。植物の例として、稲、トウモロコシ、菜種、甜菜、小麦、タバコ、トマト、ジャガイモ等を挙げることができる。
【００４３】
ペプチド配列のアミノ酸は、一般的に１文字表記によって表すが、下記の命名法による３文字表記によっても表すことができる：
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｋ Ｌｙｓ リシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
【００４４】
本発明のその他の利点及び特徴は、例証として示し、かつ添付図面を参照する、これに続く実施例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
材料。
【００４６】
１）線状ペプチド。
【００４７】
１号：ＶＫＲＧＬＫＬＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号６）
２号：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ（配列番号８）
３号：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号１０）
【００４８】
２）細菌、糸状菌及び酵母。
【００４９】
種々の結果において使用し、かつ参照する株は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）のコレクションバンク及びパストゥール研究所に由来する。
【００５０】
３）細胞。
【００５１】
Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）に由来し、かつ＋４℃で保存される、全血液に由来する赤血球。
【００５２】
４）ペプチドの調製。
【００５３】
ペプチド合成が、当業者に公知の技術により行われた。ペプチドは、水溶性である。
【００５４】
結果。
【００５５】
Ｉ − ペプチドの抗微生物活性。
【００５６】
Ａ − 液状媒体での最小抑制濃度（ＣＭＩ）及び最小殺細菌濃度（ＣＭＢ）の決定。
【００５７】
ＣＭＩは、９６ウェルのポリスチレンプレートの細菌種全体に対して、液状媒体（ＮＣＣＬＳ Ｍ７Ａ５）で微量希釈法によって決定される。
【００５８】
培地は、研究する細菌種に応じて補足物を加えた、ミュラー−ヒントンブイヨン（ＭＨＢ）（ｐＨ＝７．２〜７．４）である。すなわち：
−手のかからない株に、ＭＨＢのみ、
−連鎖球菌、リステリア及びナイセリアに、ＭＨＢ＋３％の溶解したウマ血液、
−ヘモフィルスに、ＭＨＢ＋ヘミン１５ｍｇ／ｌ＋ＮＡＤ１５ｍｇ／ｌ＋酵母抽出物５ｇ／ｌ。
【００５９】
細菌接種は：
−ＣＬＥＤ寒天：手のかからない株、
−血液＋５％のウマ血液の入った寒天：連鎖球菌、リステリア、桿菌、
−チョコレート寒天：ヘモフィルス、ナイセリア、に対して行われた再分離から行われた。
【００６０】
最終接種は、〜５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）である。５０μｌの細菌接種が、細菌種に応じて適切な培地（０．５〜５１２μｇ／ｍｌ）中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に分配される。培養物は、１６〜２０時間（連鎖球菌には２０〜２４時間）、周囲空気で３５℃でインキュベートされた。
【００６１】
μｇ／ｍｌで表現したＣＭＩは、細菌生育を示さない第１の濃度である。
【００６２】
ＣＭＢの決定は、ＣＭＩプレートのインキュベーション及び読み取り後に行われる。
【００６３】
体積３μｌの各抗生物質濃度を、寒天：
−手のかからない株に：ＭＨ、
−連鎖球菌、リステリア、桿菌、ナイセリアに：ＭＨ＋５％のヒツジ血液、
−ヘモフィルスに：ＨＴＭ上に堆積させる。
【００６４】
寒天を、雰囲気：
−手のかからない株に：周囲空気で、
−連鎖球菌、リステリア、ヘモフィルス、ナイセリアに：５〜６％のＣＯ２中で、３５℃で１８時間インキュベートする。
【００６５】
ＣＭＢは、移植寒天上であらゆる細菌生育を抑制する（＜０．１％の生存＞、最も低い抗生物質濃度である。
【００６６】
下記の表１で、細菌に対するペプチドの活性を報告する。
【００６７】
結果は、ペプチド２号が、ペプチド１号よりも活性であることを明瞭に示している。ペプチド３号は、活性でない。
【００６８】
ＣＭＢは、ＣＭＩに非常に近い：ＣＭＢ／ＣＭＩ比は、しばしば２に等しく、まれに４より大きく、このことは、ペプチド１号及び２号の殺細菌活性を表す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
下記の表２で、抗体物質への公知の耐性メカニズムを有する又は有さない臨床病原株全体に対して決定したペプチド１及び２の抗菌活性を報告する。
Ｐａｓｅ：ペニシリナーゼ
Ｃａｓｅ：セファロスポリナーゼ
Ｃａｓｅ ＨＮ：抑制解除セファロスポリナーゼ
ＢＬＳＥ：拡大スペクトルベータラクタマーゼ
Ｒ ＩＰＭ：耐イミペネム性
Ｍｅｔｉ Ｒ：耐メチリシン性
【００７１】
これらの結果は、ペプチド２が、より活性であることを確認している。更に、これらの結果は、ペプチド２及び臨床で一般に使用される抗生物質の間に交差耐性メカニズムがないことを明瞭に示している。
【００７２】
【表２】
【００７３】
Ｂ − 抗菌活性の反応速度研究。
【００７４】
細菌大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の分離したコロニーが、３〜５ｍｌのミュラー−ヒントン（ＭＨ）培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、３７℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われる；ＭＨ媒体は、一晩の培養により１／５０ｅで植え付けられ、かつ攪拌して３７℃で２時間インキュベートされた。細菌濃度は、ＭＨ媒体中で１〜２×１０６ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位）に調節される。
【００７５】
１×１０５〜１×１０６ｃｆｕが、１０ｍｌのＭＨの最終体積において、漸増時間（３０分、１時間、３時間及び６時間）でペプチド（ｘμｇ／ｍｌ）の存在下、又は不存在下で３７℃でインキュベートされる。これらの異なるインキュベーション時間でのｃｆｕ数は、５００μｌの細菌懸濁液を、１８時間３７℃でインキュベートされたＭＨ寒天の箱に広げて、評価される。
【００７６】
図１で、大腸菌に対するペプチド１号の殺細菌活性の研究を報告し、図２で、大腸菌に対するペプチド２号の殺細菌活性の研究を報告し、かつ図３で、緑膿菌に対するペプチド２号の殺細菌活性の研究を報告する。
【００７７】
結果は、ペプチド１号が、殺細菌性であることを示している。表１に記載されたＣＭＩの４倍に相当する濃度６４μｇ／ｍｌによる６時間のインキュベーション後に３ Ｌｏｇより大きい生存細菌数の減少が観察される。
【００７８】
図２及び３の結果は、ペプチド２号が大腸菌（図２）及び緑膿菌（図３）に対する高い殺細菌活性を有することを示している。
【００７９】
大腸菌細菌の３０分のインキュベーションから、懸濁液中で高い生存細菌数の減少が観察される。５ Ｌｏｇの減少が、表１に記載されたＣＭＩに相当する濃度２μｇ／ｍｌで観察される。より高い濃度に関して、３０分のインキュベーション後に、いかなる生存細菌も検出できなかった。
【００８０】
緑膿菌に対するペプチド２号の殺細菌活性は、表１に記載されたＣＭＩに対応する濃度８μｇ／ｍｌによる３０分のインキュベーション後に、生存細菌の全体的欠如によって図３に表される。
【００８１】
Ｃ − ペプチドの抗菌活性に対するヒト血清タンパクの影響の研究。
【００８２】
細菌大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の分離したコロニーが、３〜５ｍｌのミュラー−ヒントン（ＭＨ）培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、３７℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われた；ＭＨ媒体は、一晩の培養により１／５０ｅで植え付けられ、かつ攪拌して３７℃で２時間インキュベートされた。細菌濃度は、０、１０、２５又は５０％のヒト血清を含むＭＨ媒体中で〜５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位）に調節される。５０μｌの細菌接種が、０、１０、２５又は５０％のヒト血清が添加されたＭＨ媒体中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に（９６ウェルのポリスチレンプレート）分配される（０．５〜５１２μｇ／ｍｌのペプチド濃度）。ＣＭＩは、３７℃で保温器中で１８時間培養した後に細菌生育の欠如（混濁度の欠如）を引き起こす最も低い濃度として決定される。ＣＭＩは、μｇ／ｍｌ（ｍｇ／ｌ）で表す。
【００８３】
下記の表３で、ヒト血清の不存在下及び存在下で評価したペプチド１号及び２号のＣＭＩを報告する。
【００８４】
【表３】
【００８５】
ペプチド１号の緑膿菌に対する抗菌活性は、血清の存在下で修飾されない。大腸菌に対するペプチド１号の活性は、培地中で２５％及び５０％のヒト血清の存在下で増加する。
【００８６】
ヒト血清の漸増濃度は、大腸菌に対するペプチド２の抗菌活性に効果を有さない。緑膿菌に対するペプチド２号の活性は、２５％及び５０％のヒト血清の存在下で減少する。
【００８７】
Ｄ − 糸状菌及び酵母に関する液状媒体での最小抑制濃度（ＣＭＩ）の決定。
【００８８】
テストしたペプチド濃度：０．２μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ。
【００８９】
下記の表４で、真菌類に対するペプチドの活性を報告する。
【００９０】
【表４】
【００９１】
結果は、テストした３つのペプチドが、クリプトコックスネオフォルマンスに対して活性であることを示す。
【００９２】
ＩＩ − ペプチドの溶血活性の評価。
【００９３】
１×１０６のヒト赤血球が、１５０μｌの最終体積において、ペプチドの漸増濃度（０〜５００μｇ／ｍｌ）により３０分間インキュベートされる。溶血活性は、細胞上清の波長４１４ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ）（ヘモグロビン吸光度）の測定によって評価される。水中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、１００％の溶血（Ａｂｓ１００）に相当し、かつＰＢＳ中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、０％の溶血（Ａｂｓ０）に相当する。パーセンテージで表わされるペプチドの溶血活性は、（Ａｂｓｐｅｐｔｉｄｅ−Ａｂｓ０）／Ａｂｓ１００×１００に相当する。
【００９４】
図４で、ヒト赤血球に対するペプチド１号、２号及び３号の溶血活性の研究を報告する。ペプチドは、溶血活性を示さない。
【００９５】
ＩＩＩ − ペプチドの安定性の評価。
【００９６】
ヒト血漿の３．９ｍｌの体積が、１００μｌのペプチド２号、２ｍＭに添加される。安定性は、３７℃で作られた。０、０．５、１、２、４及び６時間後、３×２００μｌが、採取され、かつ水中の８００μｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％が添加される水中の１０μｌの内標準（ペプチド１号）、５００μＭに添加される。体積１ｍｌのこの混合物が、水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％、アセトニトリル中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％、及び水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％と予め平衡を取った樹脂Ｃ２（ＥＣ）上に堆積される。水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％による２回の洗浄後、ペプチド及びこれら代謝物の溶出が、メタノール中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％によって行われる。これは、次に空気流で乾燥され、かつ、水中の２００μｌのＴＦＡ０．１％中に戻される。１００μｌの体積は、溶剤Ａとして、水中のＴＦＡ０．１％により、かつ溶剤Ｂとして、アセトニトリル中のＴＦＡ０．１％により、カラムＬｕｎａ Ｃ１８（２）、３μ、４．６×１００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上でのＨＰＬＣによって分析される。１２分でのＢの１５〜４５％の勾配が、１．２ｍｌ／分の流量での溶出のために使用され、かつ検出は、２１４ｎｍで行われた。
【００９７】
図５で、異なる血液型に由来する３組のヒト血漿：Ａ＋（Ａ）；Ｂ＋（Ｂ）及びＯ＋（Ｃ）におけるペプチド２の安定性の研究を報告する。（◆：ペプチド２号、□及び△：代謝物
【００９８】
２つの主要な代謝物が、ペプチド２号の開裂によって生成される。ペプチド２号は、ヒト血漿中の６時間のインキュベーションの後に最大で４１％分解する。血漿が由来する血液型が、何であれ、ペプチド分解に著しい差異はない。
【００９９】
ＩＶ − ペプチドのインビボでの毒性の評価。
【０１００】
各ペプチドの最大耐量（ＭＤＴ）は、注射後の２８日に、雌マウスＯＦ１に対して決定される。ＭＤＴは、注射可能な最大非致死量として定義される。ペプチドは、約１５分の潅流で静脈内に投与される。注射量は、１０μｌ／ｇであり、潅流時間は、１．２ｍｌ／時であり、かつ賦形剤は、０．８％のＮａＣｌ溶液である。
【０１０１】
下記の表５で、ペプチド１号及び２号のＭＤＴを報告する。
【０１０２】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】大腸菌に対する配列番号６の配列のペプチド１号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図２】大腸菌に対する配列番号８の配列のペプチド２号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図３】緑膿菌に対する配列番号８の配列のペプチド２号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図４】ヒト赤血球に対する配列番号６、配列番号８、配列番号１０の配列のそれぞれペプチド１号、２号及び３号の溶血活性の研究を報告する。
【図５】ヒト血漿中の配列のペプチド２号（配列番号８）の安定性を報告する。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト、動物又は植物における細菌及び真菌感染治療の分野に関する。本発明は、細菌及び真菌類のような病原体による感染を予防及び／又は治療するためのペプチド及びそれらを含む組成物を特には対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ヒト及び動物において病原性、かつ重度の感染の原因となる多数の微生物は、臨床で一般に使用される抗生物質耐性を有する。増大する微生物耐性の発達は、公衆衛生の重大な問題である。それ故数年前から、新規分子の同定に関する、及び特に抗菌及び抗真菌活性を有し、かつ通常使用される抗生物質とは異なる作用様式を有する短いペプチド（１５から３０個のアミノ酸）の研究に関する著しい関心が増大した。多数のペプチドが、抗微生物性を有するとして知られているヒト、動物及び植物タンパクから生じ、他方で、他のものは、物理化学研究に基づき合成して生成される。
【０００３】
配列ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫの１４ｍｅｒの線状ペプチドが、抗菌活性を有する非溶血ペプチドとして文献に記載された（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ ＭＭ、Ｊｕｂａｎ ＭＭ、Ｌｏ ＷＣ、Ｂｉｓｈｏｐ ＳＭ、Ａｌｂｅｒｔｙ ＪＢ、Ｃｏｗｅｌｌ ＳＭ、Ｂｅｃｋｅｒ ＣＬ、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＭＬ。低い哺乳類細胞毒性を有する新規の抗微生物ペプチド（Ｄｅ ｎｏｖｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）。Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ａｕｇ ２；３９（１６）：３１０７−１３）。このペプチドにより行われた限られた研究は、４時間の短いインキュベーション時間の間、３種の細菌株（大腸菌、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌）に対する活性を示した。より長いインキュベーション時間による結果が、記載されたことはなかった。
【０００４】
出願人は、標準評価条件（１８時間のインキュベーション）でこのペプチドの抗菌性のインビトロでの研究を行ったが、文献に記載された濃度では、該条件は、いかなる生物学的活性も示さなかった。反対に、思いがけないことに、モチーフＫＬＡＫＬＡＫが、抗菌及び／又は抗真菌性を有さないペプチド配列及びこのモチーフを含むペプチドに抗菌及び／又は抗真菌性を与えることが可能であることが今般明らかにされた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は：
−式（ＫＬＡＫＬＡＫ）（式中、Ｋはリシンアミノ酸であり、Ｌはロイシンアミノ酸であり、かつＡはアラニンアミノ酸である）の第１ペプチド配列、及び
−式βＸＸβ（式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつＸはいかなるアミノ酸でも良い）の少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式（Ｂ）（式中、Ｂは中性ｐＨの、正に帯電した、４から１５個のアミノ酸のペプチドである）の第２ペプチド配列を含む、又はそれらから構成される好適には線状かつカチオン性ペプチドであって、前記第１ペプチド配列はｎ回反復され、かつ前記第２ペプチド配列はｍ回反復され、ｎ及びｍは、１〜５の整数であるペプチドを対象とする。ｎは、好ましくは１〜３の整数である。好適には、ｍは、１より大きく、かつ第２ペプチド配列（Ｂ）は、同一又は異なる。
【０００６】
従って本発明のペプチドは、同一又は異なる幾つかの第２ペプチド配列（Ｂ）、及びそれ故に各第２ペプチド配列（Ｂ）中に、同一又は異なる式βＸＸβの幾つかのペプチドモチーフを含み得る。
【０００７】
好適には、本発明のペプチドは、線状である。従ってそれらは、次の一般式（Ｉ）：（ＫＬＡＫＬＡＫ）ｎ（Ｂ）ｍ（式中、第１及び第２ペプチド配列は：
−交互である、又は
−第１又は第２ペプチド配列の１つ、又は前記第１又は第２ペプチド配列の、Ｎ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められる）に対応する。
【０００８】
好ましくは、本発明のペプチドにおいて、第１ペプチド配列は、第２ペプチド配列のＮ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められる。
【０００９】
好ましくは、前記第１及び第２ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合される。
【００１０】
式βＸＸβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつＸは、好ましくはロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む群から選択される。
【００１１】
本発明によるペプチド組成物中に入る第２ペプチド配列の特異的な例として、次の配列：
−配列番号１：ＶＫＲＧＬＫＬ
−配列番号２：ＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ
−配列番号３：ＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰを挙げることができる。
【００１２】
これらの第２ペプチド配列は、微生物による１８時間のインキュベーション後に、抗菌及び／又は抗真菌活性を有するカチオン性線状ペプチドを生成するように、２回反復される第１ペプチド配列：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号４）に結合され得る。
【００１３】
本発明のペプチドは、化学合成、又は細菌のような原核細胞、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックウサギ、ヤギ、ヒツジ等の乳、又は例えばタバコの苗等のようなトランスジェニック植物における酵母、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞のような真核細胞中の遺伝子工学によって調製され得る。
【００１４】
本発明は、脂質、糖、ヌクレオチド配列とのカップリングのような化学修飾、又はグリコシル化のような翻訳後プロセスから生じた修飾を含むペプチドのような、上記に定義したペプチドの機能同等物にも、これらの修飾が下記の実験の部に示すテストによる前記ペプチドの抗菌及び／又は抗真菌活性を修飾しない限りにおいて、関する。機能同等物は、１個又は数個のアミノ酸が、コンフォメーションＤのアミノ酸であるペプチドも含む。本発明は、レトロペプチド及びレトロインベルソペプチドも同様にカバーする。
【００１５】
本発明は、細菌及び／又は真菌感染を予防及び／又は治療するための、ヒト、動物又は植物における前記ペプチドの使用も対象とする。従って、本発明は、薬剤、化粧又は農業食品組成物であって、医薬上許容される１つ又は幾つかのビヒクル、希釈剤又は賦形剤と前記組成物中で結合される、以上で定義したような少なくとも１つのペプチドを有効成分として含む薬剤、化粧又は農業食品組成物に関する。本発明のペプチドは、低い毒性を有し、かつ更にこれらのペプチドは、非溶血性である。
【００１６】
ビヒクル、希釈剤及び賦形剤は、薬剤、化粧又は農学的な組成物の用途のタイプに応じて選択される。
【００１７】
このように、本発明はまた、抗菌及び／又は抗真菌目的の、薬剤、化粧、皮膚科学又は農業食品組成物の調製のための、以上で定義したようなペプチドの使用を対象とする。
【００１８】
本発明のペプチドは、グラム陰性、グラム陽性細菌、糸状菌及び酵母に対する活性を含む、多様な微生物に対する抗菌活性を有するが、しかるに分離して取った第２及び第１配列は、選択した評価条件において活性を有さない。
【００１９】
本発明の組成物は、予防的にも、治療的にも有用である
【００２０】
本発明による薬剤組成物の投与は、治療薬に許容される任意の投与方法によって行われ得る。これらの方法には、例えば頭蓋内外科方法、又は眼内投与による、全身、局所又は中枢投与を含む。生分解性移植片の皮下埋め込みも挙げることができる。
【００２１】
経口投与は、錠剤、ゼラチン質カプセル剤、遅延又は持続性放出製剤を含む軟カプセル剤、丸薬、粉末、細粒、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁液、シロップ及びエマルジョンによって行うことができる。この提示形状は、腸関門通過、及び抗菌及び／又は抗真菌化合物の最も一般的な使用に特に適している。
【００２２】
抗菌及び／又は抗真菌化合物の非経口投与は、潅流による静脈内又は筋肉内注射によって一般的に行われる。注射可能な組成物は、懸濁又は溶液か、脂質製剤若しくはデキストラン製剤、又はＰＬＧＡ若しくは同等物の生分解性微小粒子又はナノ粒子中にペプチドを封入するような、遅延又は持続性放出製剤を含む適切な液体中での即時溶解に適した固形で、従来の形状で調製することができる。この提示形状は、血液脳関門通過、及び抗菌及び／又は抗真菌化合物の病院での使用に特に適している。
【００２３】
非経口投与の可能性は、一定レベルの分量の維持を確実にする、緩速放出又は持続性放出システムの移植を使用する。
【００２４】
もう一つの可能性は、カテーテル、人工補綴又は生体糊のような担体上に本発明のペプチドを吸着その他により固定することからなる。
【００２５】
鼻腔内投与のために、適当な鼻腔内ビヒクルを使用することができる。
【００２６】
その他の慣習的な局所調剤には、クリーム、軟膏、ローション、ゲル及びエアゾールスプレーを含む。これらは、細菌及び／又は真菌性気管支肺感染の治療に特に適している。
【００２７】
化粧組成物中での本発明のペプチドの使用は、重要な予防として有用であり、クリーム、マニキュア液、生殖器衛生製品、練り歯磨き、口腔衛生溶液中に、前記ペプチドを封入する、又はそれらを、例えばおむつ、綿棒、包帯、化粧落とし綿、生理用ナプキン又は動物用敷藁中に含まれる、水相で緩速拡散する微小粒子中に封入することからなる。
【００２８】
投与方法に応じて、化合物は固体、半固体又は液体形状であっても良い。
【００２９】
錠剤、丸薬、遊離状態又はゼラチン質カプセル剤中に封入される粉末又は細粒のような固体組成物に関して、有効成分は：
−希釈剤、例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン；
−潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール；
−結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びアルミニウム、デンプン糊、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン；必要な場合、
−崩壊剤、例えばデンプン、寒天、アルギン酸、又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物；及び／又は
−吸収剤、着色剤、芳香剤及び甘味料と組み合され得る。賦形剤は、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム及び薬剤品質の類似体であっても良い。
【００３０】
座薬のような半固体組成物に関して、賦形剤は、例えば脂肪性エマルジョン又は懸濁液であっても良く、又はポリプロピレングリコールのような、ポリアルキレングリコールを主成分としても良い。
【００３１】
特に注射可能な、又は軟カプセル剤中に封入する、液体組成物は、例えば水、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油及び類似体のような、薬剤的に純粋な溶剤中の有効成分の溶解、分散等によって例えば調製され得る。
【００３２】
本発明によるペプチドは、小型単層小嚢、大型単層小嚢、及び多層小嚢の形状のような、リポゾームタイプの放出システムの形状で同様に投与され得る。リポゾームは、コレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリンを含む多様なリン脂質から形成され得る。実施形において、液状成分フィルムが、薬剤をカプセルに入れる脂質層を形成するために、薬剤の水溶液によって水和され得る。
【００３３】
本発明による組成物は、滅菌され、かつ／又はアジュバント、及び保存剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調整する塩及び／又は緩衝液のような無毒性補助剤を含み得る。更に、本発明による組成物は、治療的有用性を有する他の物質を同様に含み得る。組成物は、従来の混合、細粒化又はコーティング方法によってそれぞれ調製され、かつ約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の有効成分を含む。
【００３４】
本発明によるペプチドは、標的とし得る薬剤担体のような可溶性重合体と同様に結合され得る。かかる重合体には、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチル−アスパンアミド（ａｓｐａｎａｍｉｄｅ）−フェノール又はポリ（酸化エチレン）−ポリリシンで、パルミトイル残基によって置換されたもの、デキストランを含み得る。更に、本発明による化合物は、薬剤、例えばポリ（乳酸）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状の配列決定された、又は両親媒性ヒドロゲル共重合体の制御された放出を行うために有用な生分解性重合体類と結合され得る。
【００３５】
本発明によるペプチド投与のための薬量は、患者のタイプ、種族、年齢、体重、性別及び医療状態；治療する状態の深刻さ；投与方法；患者の腎臓及び肝臓の機能状態、及び使用する特殊な化合物又は塩の性質を含む多数の要因に応じて選択される。普通に経験を積んだ医師又は獣医ならば、治療する医療状態の進行を予防し、妨げ又は停止させるための有効量を容易に決定し、かつ処方するであろう。
【００３６】
本発明による組成物は、０．１〜９９％、好ましくは１〜７０％の有効成分を含み得る。
【００３７】
例として、本発明によるペプチドの経口薬量は、経口で約０．５〜１ｍｇ／日であり、かつ好ましくは０．５、１、２．５、５、１０、１５、２５、５０、１００、２５０、５００及び１０００ｍｇの有効成分を含む錠剤の形状で与えられる。ペプチドの有効な血漿濃度は、体重１ｋｇ当たり、かつ１日当たり０．００２ｍｇ〜５０ｍｇに及ぶ薬量から得られる。
【００３８】
本発明のペプチドは、単一の１日量、又は１日当たり２、３又は４分量の形状で投与され得る。
【００３９】
本発明は、上記ペプチドの投与だけでなく、宿主、及び特に動物、植物又は原核生物を形質転換するために、これらのペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の使用も同様に検討する。これらの配列は、文献中に記載された遺伝子工学技術に従って使用される。
【００４０】
従って、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡ、及び例えば前記核酸分子を含む動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主、並びにそれらを含む特に薬剤組成物を同様に対象とする。
【００４１】
植物若しくは動物細胞、又は原核生物を形質転換するために使用され得るかかるポリヌクレオチドの例として：
− ペプチドＶＫＲＧＬＫＬＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号６）をコードする配列５’ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ３’（配列番号５）、
− ペプチドＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ（配列番号８）をコードする配列５’ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ３’（配列番号７）、
− ペプチドＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号１０）をコードする配列５’ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ３’（配列番号９）を挙げることができる。
【００４２】
従って、本発明は、植物を植物病原性細菌及び真菌に耐性を有するようにし、かつ環境に有害な化学殺虫剤の予防又は治療的な使用をこのようにして減少させるための、以上に記載したペプチドの農学的応用にも係る。有効量の抗菌及び／又は抗真菌ペプチド、又はそれを含む組成物を植物に直接適用することは、農学的応用の第１の実施形となる。この応用の第２の実施形は、上記の１つ又は幾つかの抗菌及び／又は抗真菌ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、植物細胞のＤＮＡに安定して組み込むことからなる形質転換生成技術に基づく。このように形質転換した植物細胞により、細菌及び／又は真菌感染に耐性を有する性質を子孫に伝達する植物を再生させることが可能になる。植物の例として、稲、トウモロコシ、菜種、甜菜、小麦、タバコ、トマト、ジャガイモ等を挙げることができる。
【００４３】
ペプチド配列のアミノ酸は、一般的に１文字表記によって表すが、下記の命名法による３文字表記によっても表すことができる：
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｋ Ｌｙｓ リシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
【００４４】
本発明のその他の利点及び特徴は、例証として示し、かつ添付図面を参照する、これに続く実施例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
材料。
【００４６】
１）線状ペプチド。
【００４７】
１号：ＶＫＲＧＬＫＬＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号６）
２号：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＫＨＬＫＫＨＬＫＫＨＬＫ（配列番号８）
３号：ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫＧＫＲＫＫＫＧＫＬＧＫＫＲＤＰ（配列番号１０）
【００４８】
２）細菌、糸状菌及び酵母。
【００４９】
種々の結果において使用し、かつ参照する株は、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）のコレクションバンク及びパストゥール研究所に由来する。
【００５０】
３）細胞。
【００５１】
Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）に由来し、かつ＋４℃で保存される、全血液に由来する赤血球。
【００５２】
４）ペプチドの調製。
【００５３】
ペプチド合成が、当業者に公知の技術により行われた。ペプチドは、水溶性である。
【００５４】
結果。
【００５５】
Ｉ − ペプチドの抗微生物活性。
【００５６】
Ａ − 液状媒体での最小抑制濃度（ＣＭＩ）及び最小殺細菌濃度（ＣＭＢ）の決定。
【００５７】
ＣＭＩは、９６ウェルのポリスチレンプレートの細菌種全体に対して、液状媒体（ＮＣＣＬＳ Ｍ７Ａ５）で微量希釈法によって決定される。
【００５８】
培地は、研究する細菌種に応じて補足物を加えた、ミュラー−ヒントンブイヨン（ＭＨＢ）（ｐＨ＝７．２〜７．４）である。すなわち：
−手のかからない株に、ＭＨＢのみ、
−連鎖球菌、リステリア及びナイセリアに、ＭＨＢ＋３％の溶解したウマ血液、
−ヘモフィルスに、ＭＨＢ＋ヘミン１５ｍｇ／ｌ＋ＮＡＤ１５ｍｇ／ｌ＋酵母抽出物５ｇ／ｌ。
【００５９】
細菌接種は：
−ＣＬＥＤ寒天：手のかからない株、
−血液＋５％のウマ血液の入った寒天：連鎖球菌、リステリア、桿菌、
−チョコレート寒天：ヘモフィルス、ナイセリア、に対して行われた再分離から行われた。
【００６０】
最終接種は、〜５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）である。５０μｌの細菌接種が、細菌種に応じて適切な培地（０．５〜５１２μｇ／ｍｌ）中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に分配される。培養物は、１６〜２０時間（連鎖球菌には２０〜２４時間）、周囲空気で３５℃でインキュベートされた。
【００６１】
μｇ／ｍｌで表現したＣＭＩは、細菌生育を示さない第１の濃度である。
【００６２】
ＣＭＢの決定は、ＣＭＩプレートのインキュベーション及び読み取り後に行われる。
【００６３】
体積３μｌの各抗生物質濃度を、寒天：
−手のかからない株に：ＭＨ、
−連鎖球菌、リステリア、桿菌、ナイセリアに：ＭＨ＋５％のヒツジ血液、
−ヘモフィルスに：ＨＴＭ上に堆積させる。
【００６４】
寒天を、雰囲気：
−手のかからない株に：周囲空気で、
−連鎖球菌、リステリア、ヘモフィルス、ナイセリアに：５〜６％のＣＯ２中で、３５℃で１８時間インキュベートする。
【００６５】
ＣＭＢは、移植寒天上であらゆる細菌生育を抑制する（＜０．１％の生存＞、最も低い抗生物質濃度である。
【００６６】
下記の表１で、細菌に対するペプチドの活性を報告する。
【００６７】
結果は、ペプチド２号が、ペプチド１号よりも活性であることを明瞭に示している。ペプチド３号は、活性でない。
【００６８】
ＣＭＢは、ＣＭＩに非常に近い：ＣＭＢ／ＣＭＩ比は、しばしば２に等しく、まれに４より大きく、このことは、ペプチド１号及び２号の殺細菌活性を表す。
【００６９】
【表１】
【００７０】
下記の表２で、抗体物質への公知の耐性メカニズムを有する又は有さない臨床病原株全体に対して決定したペプチド１及び２の抗菌活性を報告する。
Ｐａｓｅ：ペニシリナーゼ
Ｃａｓｅ：セファロスポリナーゼ
Ｃａｓｅ ＨＮ：抑制解除セファロスポリナーゼ
ＢＬＳＥ：拡大スペクトルベータラクタマーゼ
Ｒ ＩＰＭ：耐イミペネム性
Ｍｅｔｉ Ｒ：耐メチリシン性
【００７１】
これらの結果は、ペプチド２が、より活性であることを確認している。更に、これらの結果は、ペプチド２及び臨床で一般に使用される抗生物質の間に交差耐性メカニズムがないことを明瞭に示している。
【００７２】
【表２】
【００７３】
Ｂ − 抗菌活性の反応速度研究。
【００７４】
細菌大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の分離したコロニーが、３〜５ｍｌのミュラー−ヒントン（ＭＨ）培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、３７℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われる；ＭＨ媒体は、一晩の培養により１／５０ｅで植え付けられ、かつ攪拌して３７℃で２時間インキュベートされた。細菌濃度は、ＭＨ媒体中で１〜２×１０６ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位）に調節される。
【００７５】
１×１０５〜１×１０６ｃｆｕが、１０ｍｌのＭＨの最終体積において、漸増時間（３０分、１時間、３時間及び６時間）でペプチド（ｘμｇ／ｍｌ）の存在下、又は不存在下で３７℃でインキュベートされる。これらの異なるインキュベーション時間でのｃｆｕ数は、５００μｌの細菌懸濁液を、１８時間３７℃でインキュベートされたＭＨ寒天の箱に広げて、評価される。
【００７６】
図１で、大腸菌に対するペプチド１号の殺細菌活性の研究を報告し、図２で、大腸菌に対するペプチド２号の殺細菌活性の研究を報告し、かつ図３で、緑膿菌に対するペプチド２号の殺細菌活性の研究を報告する。
【００７７】
結果は、ペプチド１号が、殺細菌性であることを示している。表１に記載されたＣＭＩの４倍に相当する濃度６４μｇ／ｍｌによる６時間のインキュベーション後に３ Ｌｏｇより大きい生存細菌数の減少が観察される。
【００７８】
図２及び３の結果は、ペプチド２号が大腸菌（図２）及び緑膿菌（図３）に対する高い殺細菌活性を有することを示している。
【００７９】
大腸菌細菌の３０分のインキュベーションから、懸濁液中で高い生存細菌数の減少が観察される。５ Ｌｏｇの減少が、表１に記載されたＣＭＩに相当する濃度２μｇ／ｍｌで観察される。より高い濃度に関して、３０分のインキュベーション後に、いかなる生存細菌も検出できなかった。
【００８０】
緑膿菌に対するペプチド２号の殺細菌活性は、表１に記載されたＣＭＩに対応する濃度８μｇ／ｍｌによる３０分のインキュベーション後に、生存細菌の全体的欠如によって図３に表される。
【００８１】
Ｃ − ペプチドの抗菌活性に対するヒト血清タンパクの影響の研究。
【００８２】
細菌大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３の分離したコロニーが、３〜５ｍｌのミュラー−ヒントン（ＭＨ）培地中で懸濁状態に置かれ、かつ攪拌して一晩中、３７℃でインキュベートされた。この夜の培養から、株の指数増殖期の培養が行われた；ＭＨ媒体は、一晩の培養により１／５０ｅで植え付けられ、かつ攪拌して３７℃で２時間インキュベートされた。細菌濃度は、０、１０、２５又は５０％のヒト血清を含むＭＨ媒体中で〜５×１０５ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位）に調節される。５０μｌの細菌接種が、０、１０、２５又は５０％のヒト血清が添加されたＭＨ媒体中で半分ずつに希釈されるペプチド溶液と等しい容量を含むウェル毎に（９６ウェルのポリスチレンプレート）分配される（０．５〜５１２μｇ／ｍｌのペプチド濃度）。ＣＭＩは、３７℃で保温器中で１８時間培養した後に細菌生育の欠如（混濁度の欠如）を引き起こす最も低い濃度として決定される。ＣＭＩは、μｇ／ｍｌ（ｍｇ／ｌ）で表す。
【００８３】
下記の表３で、ヒト血清の不存在下及び存在下で評価したペプチド１号及び２号のＣＭＩを報告する。
【００８４】
【表３】
【００８５】
ペプチド１号の緑膿菌に対する抗菌活性は、血清の存在下で修飾されない。大腸菌に対するペプチド１号の活性は、培地中で２５％及び５０％のヒト血清の存在下で増加する。
【００８６】
ヒト血清の漸増濃度は、大腸菌に対するペプチド２の抗菌活性に効果を有さない。緑膿菌に対するペプチド２号の活性は、２５％及び５０％のヒト血清の存在下で減少する。
【００８７】
Ｄ − 糸状菌及び酵母に関する液状媒体での最小抑制濃度（ＣＭＩ）の決定。
【００８８】
テストしたペプチド濃度：０．２μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ。
【００８９】
下記の表４で、真菌類に対するペプチドの活性を報告する。
【００９０】
【表４】
【００９１】
結果は、テストした３つのペプチドが、クリプトコックスネオフォルマンスに対して活性であることを示す。
【００９２】
ＩＩ − ペプチドの溶血活性の評価。
【００９３】
１×１０６のヒト赤血球が、１５０μｌの最終体積において、ペプチドの漸増濃度（０〜５００μｇ／ｍｌ）により３０分間インキュベートされる。溶血活性は、細胞上清の波長４１４ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ）（ヘモグロビン吸光度）の測定によって評価される。水中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、１００％の溶血（Ａｂｓ１００）に相当し、かつＰＢＳ中での赤血球インキュベーション後の上清の吸光度は、０％の溶血（Ａｂｓ０）に相当する。パーセンテージで表わされるペプチドの溶血活性は、（Ａｂｓｐｅｐｔｉｄｅ−Ａｂｓ０）／Ａｂｓ１００×１００に相当する。
【００９４】
図４で、ヒト赤血球に対するペプチド１号、２号及び３号の溶血活性の研究を報告する。ペプチドは、溶血活性を示さない。
【００９５】
ＩＩＩ − ペプチドの安定性の評価。
【００９６】
ヒト血漿の３．９ｍｌの体積が、１００μｌのペプチド２号、２ｍＭに添加される。安定性は、３７℃で作られた。０、０．５、１、２、４及び６時間後、３×２００μｌが、採取され、かつ水中の８００μｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％が添加される水中の１０μｌの内標準（ペプチド１号）、５００μＭに添加される。体積１ｍｌのこの混合物が、水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％、アセトニトリル中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％、及び水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％と予め平衡を取った樹脂Ｃ２（ＥＣ）上に堆積される。水中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％による２回の洗浄後、ペプチド及びこれら代謝物の溶出が、メタノール中の１ｍｌのＴＦＡ０．１％によって行われる。これは、次に空気流で乾燥され、かつ、水中の２００μｌのＴＦＡ０．１％中に戻される。１００μｌの体積は、溶剤Ａとして、水中のＴＦＡ０．１％により、かつ溶剤Ｂとして、アセトニトリル中のＴＦＡ０．１％により、カラムＬｕｎａ Ｃ１８（２）、３μ、４．６×１００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上でのＨＰＬＣによって分析される。１２分でのＢの１５〜４５％の勾配が、１．２ｍｌ／分の流量での溶出のために使用され、かつ検出は、２１４ｎｍで行われた。
【００９７】
図５で、異なる血液型に由来する３組のヒト血漿：Ａ＋（Ａ）；Ｂ＋（Ｂ）及びＯ＋（Ｃ）におけるペプチド２の安定性の研究を報告する。（◆：ペプチド２号、□及び△：代謝物
【００９８】
２つの主要な代謝物が、ペプチド２号の開裂によって生成される。ペプチド２号は、ヒト血漿中の６時間のインキュベーションの後に最大で４１％分解する。血漿が由来する血液型が、何であれ、ペプチド分解に著しい差異はない。
【００９９】
ＩＶ − ペプチドのインビボでの毒性の評価。
【０１００】
各ペプチドの最大耐量（ＭＤＴ）は、注射後の２８日に、雌マウスＯＦ１に対して決定される。ＭＤＴは、注射可能な最大非致死量として定義される。ペプチドは、約１５分の潅流で静脈内に投与される。注射量は、１０μｌ／ｇであり、潅流時間は、１．２ｍｌ／時であり、かつ賦形剤は、０．８％のＮａＣｌ溶液である。
【０１０１】
下記の表５で、ペプチド１号及び２号のＭＤＴを報告する。
【０１０２】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】大腸菌に対する配列番号６の配列のペプチド１号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図２】大腸菌に対する配列番号８の配列のペプチド２号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図３】緑膿菌に対する配列番号８の配列のペプチド２号の殺細菌活性の反応速度を報告する。
【図４】ヒト赤血球に対する配列番号６、配列番号８、配列番号１０の配列のそれぞれペプチド１号、２号及び３号の溶血活性の研究を報告する。
【図５】ヒト血漿中の配列のペプチド２号（配列番号８）の安定性を報告する。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−式（ＫＬＡＫＬＡＫ）（式中、Ｋはリシンアミノ酸であり、Ｌはロイシンアミノ酸であり、かつＡはアラニンアミノ酸である）の第１ペプチド配列、及び
−式βＸＸβ（式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつＸはいかなるアミノ酸でも良い）の少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式（Ｂ）（式中、Ｂは中性ｐＨの、正に帯電した、４から１５個のアミノ酸のペプチドである）の第２ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第１ペプチド配列はｎ回反復され、かつ前記第２ペプチド配列はｍ回反復され、ｎ及びｍは、１〜５の整数であるペプチド。
【請求項２】
ｎは、１〜３の整数であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ｍは、１より大きいこと、及び第２ペプチド配列（Ｂ）は、同一又は異なることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４】
式βＸＸβのペプチドモチーフは、各第２ペプチド配列（Ｂ）中で同一又は異なることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第１及び第２ペプチド配列は：
−交互である、又は
−第１又は第２ペプチド配列の１つ、又は前記第１又は第２ペプチド配列の、Ｎ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
第１ペプチド配列は、第２ペプチド配列のＮ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
前記第１及び第２ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
式βＸＸβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつＸは、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の少なくとも１つのペプチドを活性作用物質として含む薬剤、化粧、農業食品又は農学組成物。
【請求項１０】
ヒト、動物又は植物における細菌及び／又は真菌感染を予防及び／又は治療するために有用であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主。
【請求項１４】
請求項１３に記載の植物細胞から生成する植物。
【請求項１】
−式（ＫＬＡＫＬＡＫ）（式中、Ｋはリシンアミノ酸であり、Ｌはロイシンアミノ酸であり、かつＡはアラニンアミノ酸である）の第１ペプチド配列、及び
−式βＸＸβ（式中、βは塩基性アミノ酸であり、かつＸはいかなるアミノ酸でも良い）の少なくとも１つのペプチドモチーフを含む、又はそれから構成される、式（Ｂ）（式中、Ｂは中性ｐＨの、正に帯電した、４から１５個のアミノ酸のペプチドである）の第２ペプチド配列を含む、又はそれらから構成されるペプチドであって、前記第１ペプチド配列はｎ回反復され、かつ前記第２ペプチド配列はｍ回反復され、ｎ及びｍは、１〜５の整数であるペプチド。
【請求項２】
ｎは、１〜３の整数であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ｍは、１より大きいこと、及び第２ペプチド配列（Ｂ）は、同一又は異なることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のペプチド。
【請求項４】
式βＸＸβのペプチドモチーフは、各第２ペプチド配列（Ｂ）中で同一又は異なることを特徴とする請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
第１及び第２ペプチド配列は：
−交互である、又は
−第１又は第２ペプチド配列の１つ、又は前記第１又は第２ペプチド配列の、Ｎ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
第１ペプチド配列は、第２ペプチド配列のＮ末端及びＣ末端の一方及び／又は他方に集められることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
前記第１及び第２ペプチド配列は、好適にはペプチドの共有結合によって結合されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
式βＸＸβのペプチドモチーフにおいて、βは、好ましくはアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）を含む群から選択される塩基性アミノ酸であり、かつＸは、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）及びヒスチジン（Ｈ）を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の少なくとも１つのペプチドを活性作用物質として含む薬剤、化粧、農業食品又は農学組成物。
【請求項１０】
ヒト、動物又は植物における細菌及び／又は真菌感染を予防及び／又は治療するために有用であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれかに記載のペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むベクターのような核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、動物若しくは植物細胞、又は原核生物のような宿主。
【請求項１４】
請求項１３に記載の植物細胞から生成する植物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００６−５１２０５３（Ｐ２００６−５１２０５３Ａ）
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１８８８７（Ｐ２００４−５１８８８７）
【出願日】平成１５年７月８日（２００３．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００５３３９
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０１０４６７８５）ディアトス （ソシエテ アノニム） (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年７月８日（２００３．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００３／００２１２３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００５３３９
【国際公開日】平成１６年１月１５日（２００４．１．１５）
【出願人】（５０１０４６７８５）ディアトス （ソシエテ アノニム） (5)
【Ｆターム（参考）】
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