抗連鎖球菌物質の確認方法、及び連鎖球菌感染症治療のためのその使用
抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、（ａ）第１の成分として、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、（ｂ）第２の成分として、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、（ｂ）第３の成分として、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を提供すること、（ｄ）成分を試験物質と、試験物質の存在なしに成分が相互作用できる条件下で接触させること、及び（ｅ）試験物質が、成分間の相互作用を阻害するか否かを確認することを含み、それによって試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗連鎖球菌物質の確認方法に関する。本発明は、また、このような物質の連鎖球菌感染症の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、最も一般的で重要なヒトの病原細菌の１つである。この細菌は、咽頭炎（連鎖球菌咽頭炎）、及び膿痂疹のような比較的軽度の感染症だけではなく、リウマチ熱、溶連菌感染後糸球体腎炎、壊疽性筋膜炎、敗血症、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）のような重篤な臨床症状も引き起こす。１９８０年代後期以来、世界中で、生命にかかわる全身性ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感染症の数が増加していると報告されており、かなりの注目及び関心を集めている。
【０００３】
ストレプトコッカスパイオゲンスは、αヘリックスコイルドコイルの表面タンパク質であるＭタンパク質を、かなりの量発現する。Ｍタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンスの臨床上の発病決定因子であり、この細菌がヒトの血液中で生存するのを助長する。Ｍタンパク質は、この細菌の細胞壁と関係があることに加えて、この細菌が分泌するシステインプロテイナーゼの作用により表面からも放出される。
【０００４】
多形核好中球（ＰＭＮ）は、細菌感染に対する第一線の防御の部分である。この細胞が血流中から炎症部位に動員するには、この細胞が炎症メディエータを認識し、血管内皮の接着分子と相互作用し、最終的に侵入した細菌をＰＭＮが食作用する炎症部位まで内皮のバリアを通過して遊走することが必要である。生理学的条件のもとでは、非活性のＰＭＮが血流中を循環している。しかし、一旦化学走化性シグナルにより活性化されると、ＰＭＮは接着性となり、感染部位に向かって内皮上を転がり始めて感染部位で内皮に強く付着して感染した組織中に滲出し始める。このような接着のプロセスには、ＰＭＮ及び内皮の両者の上で、インテグリンを含む多くの様々な接着分子を連続的に上下調節する必要がある。活性化したＰＭＮは、また、細胞内の貯蔵場所からヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）を放出する。ＨＢＰは、血管の漏出を誘発する炎症メディエータである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体とＰＭＮのβ２インテグリンとの相互作用でＰＭＮの活性化、及びヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出が起こり、それにより炎症反応が起こることを示している。この相互作用により、抗連鎖球菌物質を確認する新規の標的が呈示され、この抗連鎖球菌物質を用いて連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体とβ２インテグリンとの間の相互作用を阻止することができるため、ＰＭＳの活性化を妨げ、そうでなければ起こったかもしれない炎症反応を阻止する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、このようにして抗連鎖球菌物質の確認方法が提供され、この方法は：
（ａ）第１の成分として、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で接触させること、及び
（ｅ）試験物質が、成分間の相互作用を阻害するか否かを確認することを含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する。
【０００７】
本発明は、また、抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、フィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で接触させること、及び
（ｅ）ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすること
を含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法と、
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン及びその機能性変異体、並びにβ２インテグリン又はその機能性変異体、の間の相互作用を阻害できる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体
を含むテストキットと、
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及びＰＭＮ、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）１つ又は複数のＰＭＮ
を含むテストキットと、
本発明の方法により確認される抗連鎖球菌物質と、
ヒト又は動物の身体の治療による処置の方法に用いる、本発明の方法により確認される抗連鎖球菌物質と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、インテグリン拮抗物質の使用と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質の使用と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、本発明の方法により確認された物質の使用と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、治療上有効な量の本発明の方法により確認された物質を前記個体に投与することを含む治療方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、治療上有効な量のインテグリン拮抗物質を前記個体に投与することを含む治療方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法と、
本発明の方法により確認された、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質、並びに薬学的に許容された基剤又は希釈剤を含む薬剤組成物と、
薬剤組成物を提供する方法であって、
（ａ）本発明の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用を阻害する物質を確認すること、及び
（ｂ）このようにして確認された阻害物質を、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に処方すること
を含む方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体を治療する方法であって、
（ｃ）本発明の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用を阻害する物質を確認すること、及び
（ｄ）このようにして確認された阻害物質を、前記個体に治療上有効な量で投与することを含む方法と
をも提供する。
【０００８】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）受入れ番号ＮＰ＿２６９９７３）のＭ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、フィブリノーゲンのＮＨ２−末端領域由来のペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、フィブリノーゲンのＮＨ２−末端領域由来の第２のペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、実施例で用いたＲＴ−ＰＣＲのプライマーである。
配列番号５は、ヒトフィブリノーゲンα鎖アイソフォームαプレプロタンパク質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０６８６５７）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ヒトフィブリノーゲンβ鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号Ｐ０２６７５）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ヒトフィブリノーゲンγ鎖アイソフォームγ−Ｂ前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０６８６５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ヒトインテグリンαＭ鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０００６２３）のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトインテグリンαサブユニット（αＸ鎖）前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＡＡＡ５１６２０）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ヒトβ２インテグリン鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０００２０２）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、抗連鎖球菌物質の確認方法を提供する。本発明の適する方法は、本質的に：
（ｉ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、（ｉｉ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び（ｉｉｉ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を、試験物質の存在なしに成分が相互作用できるであろう条件下、試験物質と接触させること、並びに
試験物質が、成分間の相互作用を阻害できるか否かを決定すること
からなる。
【００１０】
したがって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを、容易に決定することができる。
【００１１】
分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、第１の成分として提供される。連鎖球菌のＭタンパク質及びＭ様タンパク質は、よく知られている。８０を超える様々な連鎖球菌のＭタンパク質が存在する。本発明のＭタンパク質は、例えば、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ１１、Ｍ１２、又はＭ２８であることができる。好ましくは、Ｍタンパク質はＭ１又はＭ３である。典型的には、Ｍタンパク質がストレプトコッカスパイオゲンス由来である。Ｍタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンスのＭ１タンパク質であるのが好ましい。ストレプトコッカスパイオゲンスのＭ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に述べる。
【００１２】
連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、フィブリノーゲンと複合体を形成する能力を維持している。このような複合体は、β２インテグリンと結合することができる。機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質のフラグメントであることができる。連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、フィブリノーゲンに特異的に結合するのが典型的である。Ｍタンパク質のフィブリノーゲンへの結合は、Ａｋｅｓｓｏｎらが記載した（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３００巻、８７７〜８６６頁）ように分析することができる。連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体とフィブリノーゲンとの相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００１３】
典型的には、このような機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型Ｍタンパク質の結合親和力と実質的に同じである。或いは、フィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型連鎖球菌のＭタンパク質の結合親和力を超えるか、又はそれより小さくてよい。例えば、機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型連鎖球菌のＭタンパク質の、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型の連鎖球菌のＭタンパク質の、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体の、フィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型の、９５％から１０５％、９０％から１１０％、８５％から１２０％、８０％から１３０％、７５％から１４０％、又は７０％から１５０％であることができる。いずれの場合も、連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体と、フィブリノーゲンとの間の相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００１４】
連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、配列番号１のストレプトコッカスパイオゲンスの天然型Ｍ１タンパク質のような、Ｍタンパク質のポリペプチドの配列と同様の配列のポリペプチドであることができる。したがって、これらの配列の全部の長さにわたって計算すると、機能性変異体は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、連鎖球菌のＭタンパク質の配列と一致する配列を有するのが一般的である。ＵＷＧＣＧパッケージは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供し、このプログラムを用いて（例えばそのデフォルト設定で使用して）同一性を計算することができる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．、１９９３年、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ、３６巻、２９０〜３００頁、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１５巻、４０３〜１０頁に記載されたように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを代わりに使用して、同一性を計算し、又は配列を決定することも可能である。したがって、ＵＷＧＣＧパッケージを用いてＢＥＳＴＦＩＴプログラムをデフォルト設定で用いて、同一性を計算することができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、配列の同一性を計算することも可能である。ＢＬＡＳＴは、デフォルト設定で用いることができる。
【００１５】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公的に入手できる。このアルゴリズムは、まず、データベース配列に同じ長さの言葉を並べた時に、ある正の値の境界スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔに一致するか又は条件を満足する問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、長さＷの短い言葉を同定することにより、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを必要とする。Ｔは、文字列スコア境界値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の文字列のヒットは、それを含むＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔｓ）は、各配列に沿って、累積アラインメントスコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）が増大できる限り両方向に広がる。両方向でワードヒットの伸長が止まるのは、その最高達成値（ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｖａｌｕｅ）に由来する値Ｘにより累積配列スコアが低下する時、１つ又は複数の負の値の残余アラインメント（ｒｅｓｉｄｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の蓄積により累積スコアがゼロ又はそれ未満になる時、又はどちらかの配列の末端に達した時である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムでは、デフォルトとして、文字列の長さ１１（Ｗ）を、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９巻、１０９１５〜１０９１９頁を参照）ではアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
【００１６】
このＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の相似性の統計的分析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５７８７頁を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する相似性の指標の１つとして、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））があり、これは２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間に一致（ｍａｔｃｈ）が偶然起こる確率の指標となる。例えば、第１の配列を第２の配列に対して比較して、最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列と同じであると考えられる。
【００１７】
機能性変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のような連鎖球菌のＭタンパク質の修飾型であることができる。修飾型の配列は、天然型Ｍタンパク質のアミノ酸配列とは異なる。天然型Ｍタンパク質の修飾型には、例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は付加があることがある。例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の、最高１００個又は５０個又は３０個までの、アミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から１００個、２から５０個、３から３０個、又は５から１５個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。置換がある場合、例えば次の表によるように、置換は保存的置換であるのが典型的である。第２コラムで同じ区画にあるアミノ酸、好ましくは、第３コラムの同じ行のアミノ酸は、相互に置換することができる。欠失は、連鎖球菌のＭタンパク質の配列の一端又は両端のアミノ酸の欠失であるのが好ましい。或いは、フィブリノーゲンとの相互作用に関係のない領域の欠失である。例えば、欠失はストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のＳ−Ｃ３フラグメント中であることができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、さらなる異種ポリペプチド配列と融合して融合ポリペプチドを生成することができる。したがって、さらなるアミノ酸残基を、例えば、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の、片側末端又は両側末端に設けることができる。さらなる配列は、あらゆる知られた機能を遂行することができる。典型的には、キャリヤーポリペプチドを提供する目的で加えることができ、キャリヤーポリペプチドにより、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を、例えばラベル、固体マトリックス、又は担体に固定することができる。したがって、本発明で使用する第１の成分は、異種の配列を含む融合ポリペプチドの形態であることができる。実際、融合ポリペプチドを用いると多くの場合で実際上便利であることがある。これは、融合ポリペプチドは、リコンビナント細胞系、例えばリコンビナント細菌又は昆虫細胞系で、容易且つ安価に生成できるからである。融合ポリペプチドは、天然型連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体よりも高レベルで発現することがある。典型的には、これは、エンコードするＲＮＡの翻訳が増加するか、又は分解が減少するためである。さらに、融合ポリペプチドは、確認及び分離が容易であることがある。融合ポリペプチドは、上記に述べたポリペプチド配列、及びキャリヤー又はリンカー配列を含むのが典型的である。キャリヤー又はリンカー配列は、典型的にはヒト以外、好ましくは哺乳類以外の起源、例えばバクテリア起源に由来する。これは、構造Ｍタンパク質又はその機能性変異体の標的である、融合ポリペプチド及びフィブリノーゲンの異種配列間の非特異的相互作用の発生を最小にするためである。
【００２０】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、その分離を助けるために、例えば、ヒスチジン残基、Ｔ７タグ、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを付加して修飾することができる。或いは、異種の配列は、例えば、細胞からの連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の分泌を促進することができるか、又は、細胞膜のような特定の細胞内の場所を発現の標的にすることができる。アミノ酸キャリヤーは、長さ１から４００個のアミノ酸、又はより典型的には長さ５から２００残基であることができる。Ｍタンパク質又はその機能性変異体は、キャリヤーポリペプチドと直接、又は介在するリンカー配列を介して結合することができる。結合に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸である。
【００２１】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、例えば翻訳後修飾のように、化学的に修飾することができる。例えば、修飾されたアミノ酸残基を含むことができるか、又はグリコシル化することができる。これらは、アミド及びポリペプチドの結合体を含む様々な形態のポリペプチド誘導体であることができる。
【００２２】
化学的に修飾された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体はまた、機能性側基の反応により化学的に誘導された残基を１つ又は複数有するものを含む。このように誘導された側基は、誘導されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、及びホルミル基を構成するものを含む。遊離のカルボキシル基を誘導して、塩、メチル及びエチルエステル、若しくはその他のタイプのエステル、又はヒドラジドを構成することができる。遊離のヒドロキシル基を誘導してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を構成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを構成することができる。
【００２３】
また、化学的に修飾された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体として、２０個の標準アミノ酸の、１つ又は複数の天然アミノ酸誘導体を含むものも、含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンに置換することがあり、ホモセリンがセリンに置換することがある。
【００２４】
連鎖球菌のＭタンパク質若しくはその機能性変異体、及び／又は第１の成分の部分として用いられる他のポリペプチドは、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルには、１２５Ｉ、３２Ｐ、若しくは３５Ｓのような同位体ラベル、蛍光ラベル、酵素ラベル、又はビオチンのようなその他のタンパク質ラベルが含まれる。
【００２５】
第２の成分は、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を含む。フィブリノーゲンは、酵素トロンビンの作用により血液中の不溶性フィブリンから変換される可溶性の血漿タンパク質である。フィブリノーゲンは血餅の形成の一因となる。フィブリノーゲンは、６個のペプチド鎖から構成される。これらのペプチド鎖は、２個の同一のサブユニット中に配置され、各々のサブユニットは１個のＡα、１個のＢβ、及び１個のγ鎖がジスルフィド結合で結合したものから成る。連鎖球菌のＭタンパク質はフィブリノーゲンに結合し（Ｋａｎｔｏｒ、１９６５年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２１巻、８４９〜８５９頁）、その親和力は高い（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。フィブリノーゲンもまた、β２インテグリンを介してＰＭＮに結合する（Ａｌｔｉｅｒｉ、１９９９年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８２巻、７８１〜７８６頁）。β２インテグリンに対する結合部位Ｍａｃ１は、フィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端部位にあると同定されている。さらに、γ鎖のＣ末端終末部に見出される、独特の配列であるＫＱＡＧＤＶは、インテグリンの結合に不可欠である。
【００２６】
フィブリノーゲンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質に結合して、複合体を形成する能力を維持している。このような複合体は、その後、β２インテグリンに結合することができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質に対し実質的に特異的な結合を示すのが典型的である。フィブリノーゲンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質との間の相互作用に対する結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００２７】
典型的には、フィブリノーゲンの機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力と実質的に同じである。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力を超えることもあり、それより小さいこともある。例えば、フィブリノーゲンの機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の９５％から１０５％、９０％から１１０％、８５％から１２０％、８０％から１３０％、７５％から１４０％、又は７０％から１５０％であることができる。いずれの場合も、フィブリノーゲンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質との間の相互作用に対する結合定数は１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００２８】
フィブリノーゲンの機能性変異体は、フィブリノーゲンの天然Ａα鎖の配列と同じ配列を有するＡα鎖、例えば配列番号５に示したヒトＡα鎖を含むことができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、天然Ｂβ鎖の配列と同様の配列を有するＢβ鎖、例えば配列番号６に示したヒトＢβ鎖を含むことができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、天然γ鎖の配列と同様であるγ鎖、例えば配列番号７に示したヒトγ鎖を含むことができる。したがって、Ａα、Ｂβ、又はγ鎖の配列は、フィブリノーゲンの天然型Ａα、Ｂβ、又はγ鎖、例えば配列番号５から７に示したヒトＡα、Ｂβ、又はγ鎖に対し、これら配列のすべての長さにわたって計算して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列が同一である。一方、鎖は依然として集合して機能性分子になることができなければならない。上記に述べた方法を用いて、配列の同一性を計算することができる。ＵＷＧＣＧパッケージのＢＥＳＴＦＩＴプログラムを、デフォルト設定で用いることができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムをデフォルト設定で用いることができる。
【００２９】
機能性変異体は、例えば、フィブリノーゲンのＡα、及び／又はＢβ、及び／又はγ鎖におけるアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有することができるフィブリノーゲンの修飾型であることができる。このような置換、欠失、又は付加は、例えば、配列番号５から７に示したヒトＡα、Ｂβ又はγ鎖の配列に対してなされることができる。鎖のあらゆる組合せを、又はすべての鎖を修飾することができる。一方、どんな置換、欠失、又は付加があっても、フィブリノーゲンのＡα、Ｂβ又はγ鎖が集まって機能性分子となることが依然としてできなければならない。それぞれの鎖において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、又は少なくとも５０個の、例えば、各々の鎖につき最高７０個又は５０個又は３０個までの、アミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から７０個、２から５０個、３から３０個、又は５から２０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。置換がある場合は、上記に述べたように、置換は保存的置換であるのが典型的である。欠失は、例えば配列番号５から７に示したもののような、フィブリノーゲンのＡα、Ｂβ又はγ鎖の配列の片側末端又は両側末端のアミノ酸の欠失であるのが好ましい。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質との相互作用に関係のない領域の欠失である。
【００３０】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖はいずれも、ポリペプチド鎖が集合して機能性分子となることが依然としてできる限り、さらなる異種のポリペプチド配列と融合して、融合ポリペプチドを生成することができる。このような融合ポリペプチドは、キャリヤーポリペプチドであることができるか、又はリンカー配列を含むことができる。このようなポリペプチドは、上記に述べてある。
【００３１】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖は、上記に述べたように化学的に修飾することができる。或いは、フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖は、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルは、上記に述べてある。
【００３２】
第３の成分は、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体である。インテグリンは、β鎖とα鎖とから構成されるヘテロ二量体細胞表面接着受容体の大系統群である。各サブユニットは、大きな細胞外領域、１個の膜内外領域、及び短い細胞質領域から成る。多くのα及びβサブユニットが確認されており、これらは限られた方法で関わることができる。通常、αサブユニットは、特定のβサブユニットと関わるにすぎないが、βサブユニットはさらに手当たり次第に関わりを持つ。β２インテグリンは、ＰＭＮにより発現される最も豊富なインテグリンである。４個の異なるα鎖（αＭ、αＬ、αＸ、及びαＤ）がβ２鎖と関わることができる。この中では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８としても知られるαＭβ２、及びＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８としても知られるαＸβ２は、ＰＭＮで発現する主要なインテグリンである。これらはフィブリノーゲンのレセプターである。
【００３３】
β２インテグリンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合する能力を維持している。β２インテグリンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体と特異的に結合するのが典型的である。β２インテグリンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との間の相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００３４】
典型的には、β２インテグリンの機能性変異体の、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力と実質的に同じである。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力を超えることもあり、それより小さいこともある。例えば、β２インテグリンの機能性変異体の、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体に対する結合定数は、天然型β２インテグリンの少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する機能性変異体の結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力の７０％から１６０％、７５％から１５０％、８０％から１４０％、８５％から１３０％、９０％から１２０％、又は９５％から１１０％であることができる。いずれの場合も、β２インテグリンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との間の相互作用に対する結合定数は１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００３５】
β２インテグリンの機能性変異体は、β２インテグリンの天然α鎖又は天然β鎖のいずれかの配列と同様の配列を有するα及び／又はβ２鎖を含むことができる。例えば、α鎖は、配列番号８に示したヒトαＭ鎖の配列、又は配列番号９に示したヒトαＸ鎖の配列と同様の配列を有することができる。β２鎖は、配列番号１０に示したヒトβ２鎖の配列と同様の配列を有することができる。したがって、α及び／又はβ２鎖は、天然型α又はβ２鎖の配列、例えば配列番号８から１０に示したものと、これら配列のすべての長さにわたって計算して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の配列を有することができる。再び、上記に述べたパッケージを用いて、配列の同一性を計算することができる。ＵＷＧＣＧパッケージのＢＥＳＴＦＩＴプログラムを、デフォルト設定で用いることができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムをデフォルト設定で用いることができる。
【００３６】
β２インテグリンの機能性変異体は、例えばα又はβ２鎖の一方又は両方にアミノ酸が置換、欠失、又は付加した、β２インテグリンの修飾型であることができる。例えば、αＭ、αＸ、又はβ２鎖は、例えば配列番号８から１０に示したヒトαＭ、αＸ、及びβ２鎖の配列のような天然αＭ、αＸ、又はβ２鎖の配列に対する、置換、欠失、又は付加を含むことができる。α及びβ２鎖の一方又は両方で、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個、例えば、最高２００個、１００個、５０個、又は３０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から２００個、２から１５０個、３から１００個、５個から５０個、又は１０から３０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。上記に述べたように、あらゆる置換は保存的置換であるのが典型的である。欠失は、好ましくは、配列番号８から１０に示した配列のいずれかのような、α又はβ２鎖の配列の片側末端又は両側末端のアミノ酸の欠失である。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との相互作用に関与しない領域の欠失である。
【００３７】
β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、異種のポリペプチド配列と融合して融合ポリペプチドを生成することができる。これにより、上記に述べたようにキャリヤーポリペプチドを生成することができる。或いは、β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、例えば、その分離を助けるために、アミノ酸残基の付加などにより修飾されることができる。これはキャリヤーポリペプチドと直接、又はリンカー配列を通じて結合することができる。β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、上記に述べたように化学的に修飾することができるか、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルは、上記に述べてある。
【００３８】
本発明の方法は、あらゆる好適なプロトコールに従って実行することができる。この方法が、例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレートのシングルウェルのような個別の反応器中で行うことができるよう調節され、したがって高処理能力スクリーニングに適合できるのが、好ましい。したがって、アッセイがｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイであるのが好ましい。
【００３９】
第１の成分の一部として用いられる、連鎖球菌のＭタンパク質若しくはその機能性変異体、及び／又はその他のポリペプチドは、リコンビナントＤＮＡ法を用いて発現することができる。例えば、好適なポリペプチドは、例えば、細菌又は昆虫の細胞系で発現することができる（例えば、Ｍｕｎｇｅｒら、１９９８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、９巻、２６２７〜２６３８頁）。典型的には、リコンビナント連鎖球菌のＭタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現で生成することができる。Ｍタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質であるのが好ましい。リコンビナントポリペプチドは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体をエンコードしたポリヌクレオチドを提供することにより生成される。このようなポリヌクレオチドには、例えばプロモーター配列のような、好適なコントロール部位が提供され、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の発現のために発現ベクター及び同様のものに提供される。好適なポリペプチドは、あらゆる適する細菌から、生化学的に分離することができる。
【００４０】
或いは、Ｍタンパク質は、内因性にＭタンパク質を発現する連鎖球菌の細胞から、又はリコンビナント法の使用により得ることができる。例えば、ストレプトコッカスパイオゲンス由来のＭタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンスの細胞をプロテアーゼで処理して生成することができる。Ｍタンパク質は、Ｍ１タンパク質であるのが好ましい。プロテアーゼは、ストレプトコッカスパイオゲンス内因性、例えば、ストレプトコッカスパイオゲンスシステインプロテイナーゼＳｐｅＢであることができる。或いは、プロテアーゼはＰＭＮから誘導することができる。ＰＭＮプロテアーゼはＰＭＮを溶解して生成するのが典型的である。プロテアーゼもまた、リコンビナントで生成することができる。Ｍタンパク質は、或いは、細胞膜貫通部を欠く、先端のない型のＭタンパク質の発現により得ることができる（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３１８頁）。このようなタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンス又は大腸菌で発現でき、タンパク質分解の切断を必要とせずに細菌により分泌される。
【００４１】
或いは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、化学的に合成することができる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の固相合成法のような合成技術は、純粋であり、抗原特異性があり、不要な副産物がなく、産生が容易であるとの理由から好ましいことがある。固相ペプチド合成法に適した技術は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６９年、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２巻、２２１〜９６頁、及びＦｉｅｌｄｓら、１９９０年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、３５巻、１６１〜２１４頁を参照されたい）。一般に、固相合成法は、伸長していくペプチド鎖に１つ又は複数のアミノ酸残基、又は好適に保護されたアミノ酸残基を連続的に付加することを含む。
【００４２】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体は、上記に述べたように細菌又は昆虫の細胞系での発現のようなリコンビナント法により生成することができる。或いは、フィブリノーゲン又はその機能性変異体は、化学的に合成することができる。フィブリノーゲンは、ヒトの血液、好ましくはヒト血漿から分離することができる。
【００４３】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、フィブリノーゲン又はその機能性変異体と共同して提供することができる。即ち、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体と、フィブリノーゲン又はその機能性変異体との複合体を本発明で用いることができる。このような複合体は、β２インテグリンと結合することができる。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体と、フィブリノーゲン又はその機能性変異体とを、個々に提供することができる。
【００４４】
β２インテグリン又はその機能性変異体は、上記に述べたようにリコンビナント法又は化学的合成で生成することができる。β２インテグリンは、ＰＭＮ溶解物から分離することができる。
【００４５】
上記に述べた方法で用いられる、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンは、実質的に分離された形態で提供される、即ち、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン、又はこれらのあらゆる機能性変異体は、上記に述べたように生成し、その後分離することができる。これらは、一般に、製剤中の乾燥量の、少なくとも８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、９５重量％、又は９９重量％を含むことができる。
【００４６】
本発明で用いる連鎖球菌のＭタンパク質、及び／又はフィブリノーゲン、及び／又はβ２インテグリンは、非天然型の形態で存在することができる。連鎖球菌のＭタンパク質、及び／又はフィブリノーゲン、及び／又はβ２インテグリンは、実質的に精製された形態であることができる。
【００４７】
本発明の代替方法は、実質的に、
（ｉ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、（ｉｉ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び（ｉｉｉ）１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を、試験物質の存在なしに成分が相互作用できる条件下で試験物質と接触させること、及び
ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすること
からなる。
【００４８】
そこで、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かが、速やかに決定できる。
【００４９】
第１の成分である連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、及び第２の成分であるフィブリノーゲン又はその機能性変異体は、上記に述べたあらゆる方法で提供することができる。ＰＭＮは、ヒト血液中に備えられていることがある。連鎖球菌のＭタンパク質及びフィブリノーゲンは、ＰＭＮの表面上でβ２インテグリンを介してＰＭＮに結合する。
【００５０】
本発明の典型的な方法では、分離された連鎖球菌のＭタンパク質、分離されたフィブリノーゲン、及び分離されたβ２インテグリンを混合する。その後、試験物質の存在なしに成分が相互作用できる条件下で、試験物質を混合物に添加する。分離された連鎖球菌のＭタンパク質、分離されたフィブリノーゲン、及び分離されたβ２インテグリンを、試験物質存在なしに混合し、試験物質のないところで成分が相互作用をするかどうかを決定し、例えば、試験物質のないところで成分が凝集物を形成するか否かを決定することにより、好適な条件を確認することができる。こうした凝集物は、電子顕微鏡で検出することができる。或いは、放射性同位元素でラベルしたタンパク質を用いて、反応混合物をスパイクし、凝集物中の放射能量を用いて凝集物形成を定量することができる。
【００５１】
本発明の代替方法では、連鎖球菌のＭタンパク質と血漿との混合物でＰＭＮを再構成する（フィブリノーゲンを提供するために）。その後、試験物質の存在なしに成分が相互反応できる条件下で、試験物質を混合物に添加する。試験物質の存在なしにＰＭＮを連鎖球菌のＭタンパク質と血漿との混合物で再構成して、且つ、成分が凝集物を形成するか否か、又は試験物質の存在なしにＰＭＮが活性化するか否かを決定して、好適な条件を確認することができる。ＰＭＮの活性化は、ＨＢＰの放出をモニターすることにより決定するのが典型的である。
【００５２】
細胞接着アッセイを、代わりに行うことができる。典型的な細胞接着アッセイでは、分離されたＭタンパク質及び分離されたフィブリノーゲンから形成された、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体が、好適な器、特にプラスチック製のマイクロタイタープレートのウェルの壁面上にコーティングしてある。１つの好適なアッセイ形式では、例えば、化学的に、又はリコンビナントで生成され、その後分離された第３の成分であるβ２インテグリンを、試験物質と一緒にアッセイ用の器に添加するだけである。β２インテグリンがＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合した後、例えば放射線ラベル又は蛍光ラベルのようなラベルを有するβ２インテグリンを使用することができる。
【００５３】
或いは、別の好適なアッセイ形式では、ＰＭＮ細胞を器に添加し、試験物質の存在下で連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体を相互作用させる。この複合体は、連鎖球菌のＭタンパク質をフィブリノーゲンと混合するだけで構成することができる。その後、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合する細胞数を決定する。これは、例えば、細胞を染色し、その後分光光度法を行って実施することができる。場合により、染料を溶出させ、溶出した試料を分光測定することがある。
【００５４】
本発明の代替のアッセイでは、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体は、好適な器の壁面にコーティングされ、その後、器にＰＭＮ細胞を添加して、試験物質の存在下でＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体と相互作用させる。ＰＭＮの活性化をモニターすることで、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体とＰＭＮとの結合阻害を検出する。典型的には、これはヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出をモニターして検出することができる。本発明の好ましい方法は、上記に述べたアッセイにおけるように、ＰＭＮの表面上でＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体がβ２インテグリンに結合するのを試験物質が阻害するか否かを試験するために、ストレプトコッカスパイオゲンス、フィブリノーゲン、及びＰＭＮを試験物質に提供することを含む。
【００５５】
本発明の好適な方法は、適する緩衝液の存在下で行うことができる。
【００５６】
好適な対照実験を行うことができる。例えば、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体と分離されたβ２インテグリン又はＰＭＮとの間の相互作用をモニターするために、試験物質の存在なしにアッセイを行うことができる。
【００５７】
上記の方法で試験することができる好適な試験物質には、コンビナトリアルライブラリ、規定された化学物質、ペプチド及びペプチド類似体、オリゴヌクレオチド、並びに天然物ライブラリ、例えばディスプレイ（ファージ提示法ライブラリなど）及び抗体生成物が含まれる。例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、並びにヒト化抗体を用いることができる。抗体は、完全な免疫グロブリン分子、又はそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントであることができる。好適なペプチドは、ＧＰＲＰ配列のペプチドを含む。好適な抗体は、ストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のＢ反復に対する抗体、モノクローナル抗体ＩＢ４、及びＣＤ１１ｃに対する抗体を含む。
【００５８】
好適な試験物質は、また、インテグリン拮抗物質、典型的にはβ２インテグリン拮抗物質を含む。好適なインテグリン拮抗物質は、抗インテグリン抗体、ペプチド類似体、及び非ペプチド類似体を含む。抗インテグリン抗体は、上記に述べた抗体のあらゆるタイプであることができる。拮抗物質は、拮抗物質が存在する場合にはレセプターに結合して生物学的作用を表す作用物質の作用を、拮抗物質の存在なしでは、阻害するか否かを試験することにより確認することができる。
【００５９】
典型的には有機分子、好ましくは分子量５０から２５００ダルトンの小型有機分子を審査する。候補となる製品は、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、又はそれらの組合せを含む生体分子であることができる。候補となる物質は、合成又は天然化合物のライブラリを含む多方面の供給源から得られる。知られた薬物に、目的のある、又は任意の化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等を行い、構造類似体を生成することができる。
【００６０】
最初の審査では、試験物質は、例えば１反応当たり１０個の物質を用いることができ、阻害を示したバッチの物質は個々に試験した。試験物質は、１ｎＭから１０００μＭの濃度、好ましくは１μＭから１００μＭの濃度、より好ましくは１μＭから１０μＭの濃度で用いることができる。
【００６１】
連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質は、上記に述べた方法における相互作用において測定可能な減少を引き起こした阻害物質である。相互作用の阻害物質は、その阻害物質の存在なしでの相互作用の程度に比較すると、減少又は実質的にない程度の相互作用を引き起こす物質である。好ましい阻害物質は、１μｇｍｌ−１、１０μｇｍｌ−１、１００μｇｍｌ−１、５００μｇｍｌ−１、１ｍｇｍｌ−１、１０ｍｇｍｌ−１、１００ｍｇｍｌ−１の阻害物質の濃度で、相互作用を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％阻害する物質である。阻害のパーセント値は、試験物質の存在下、及び存在なしでのアッセイを比較したとき、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間のあらゆる相互作用でパーセント値が減少したことを表す。上記に述べた阻害パーセント値及び阻害物質の濃度のあらゆる組合せを用いて、本発明の阻害物質を規定することができ、この場合、濃度が低くなるほど阻害が大きくなるのが好ましい。本発明の方法で活性を示す試験物質は、動物疾病モデルのようなｉｎ ｖｉｖｏ法で試験することができる。即ち候補となる阻害物質は、連鎖球菌によりマウスに引き起こされる炎症、及び／又は肺の病変を緩和する能力を試験することができる。したがって、本発明の方法で確認された試験物質が、抗連鎖球菌物質として効果的であるか否かを決定することができる。
【００６２】
本発明の阻害物質は、実質的に精製された形態であることができる。これらは、実質的に分離された形態であることができ、この場合、概ね、製剤中の乾燥量の少なくとも８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、９５重量％、９７重量％、又は９９重量％を含む。生成物には、実質的に他の細胞構成成分がないのが典型的である。本発明の方法では、生成物は、このように実質的に分離されたか、精製されたか、又は遊離の形態で使用することができる。
【００６３】
本発明は、また、テストキットを提供する。好適なキットは、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体から実質的に成る。本発明の代替のキットは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び１つ又は複数のＰＭＮから実質的に成る。テストキットは、また、試験物質が成分間の相互作用をかく乱するか否かを決定する手段も含む。そのような手段は、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン又はＰＭＮが、本技術分野で知られたあらゆる方法で相互作用をするか否かを決定するのに必要な試薬及び溶液であることができる。本発明のテストキットは、１つ又は複数の緩衝液もまた含むことができる。本発明のキットは、場合により包装して提供され、好ましくはキットの使用説明書を含む。
【００６４】
本発明の阻害物質を、ヒト又は動物の身体の治療による処置方法に使用することができる。特に、本発明の阻害物質を連鎖球菌感染症の治療、好ましくはストレプトコッカスパイオゲンスによる感染症の治療に用いることができる。連鎖球菌感染症に罹患している患者の病状を改善するために阻害物質を用いることができる。このような阻害物質を、ヒト又は動物の処置に用いてもよい。このような阻害物質を、予防的処置に、例えば連鎖球菌感染症に、より罹患しやすい免疫抑制された患者に用いることができる。或いは、このような物質を、連鎖球菌感染症であることが実証された患者の症状を軽減するために用いることができる。阻害物質の治療上有効な量を、それを必要とする宿主に与えることができる。
【００６５】
阻害物質は、様々な剤形で投与することができる。即ち、例えば、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ剤、水性又は油性懸濁剤、分散可能な粉末剤又は顆粒剤として、経口投与することができる。これらはまた、皮下に、静脈に、筋肉内に、胸骨内に、経皮的に、又は点適法など、非経口的に投与することができる。これらはまた、坐剤として投与することもできる。医師が、特定の患者ごとに必要な投与経路を決定することができる。
【００６６】
連鎖球菌感染症の予防又は処置に用いるための阻害物質の処方は、薬理学的使用を意図するか、獣医学的使用を意図するかなどといった、その物質の性質のような要因による。阻害物質は、同時使用、単独使用、又は連続使用に処方することができる。
【００６７】
阻害物質は、本発明において、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に、投与するために処方するのが典型的である。薬学的に許容された基剤又は希釈剤は、例えば等張液であることができる。例えば、経口用固体剤形は、有効成分と共に、ラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、又はバレイショデンプンのような希釈剤、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、及び／又はポリエチレングリコールのような滑沢剤、デンプン、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルピロリドンのような結合剤、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、又はナトリウムスターチグリコレートのような崩壊剤、飽和剤、色素、甘味剤、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸のような湿潤剤、並びに、一般的に薬剤処方に使用される非毒性で薬学的に不活性の物質を含むことができる。このような薬物製剤は、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖衣コーティング、又はフィルムコーティングのプロセスのような知られた方法で製造される。
【００６８】
経口投与のための液体分散系は、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤であることができる。シロップ剤は、例えば、ショ糖、若しくはショ糖入りグリセリン、及び／又はマンニトール、及び／又はソルビトールを基剤として含むことができる。
【００６９】
懸濁剤及び乳剤は、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを基剤として含むことができる。筋肉注射用の懸濁剤又は水溶液は、有効成分と共に薬学的に許容された基剤、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、及び所望により適量の塩酸リドカインを含むことができる。
【００７０】
静脈投与又は注入用の溶液は、基剤として、例えば、滅菌水を含むことができるか、又は好ましくは、滅菌等張生理食塩水の形態であることができる。
【００７１】
治療上有効な量の阻害物質を、それを必要とする個体に投与する。阻害物質の投与量は、様々なパラメータに応じ、特に、用いる物質、治療する患者の年齢、体重及び病状、投与経路、並びに必要とする治療計画に応じて決定することができる。繰り返すと、医師は、あらゆる特定な患者に必要な投与経路及び投与量を決定することができる。典型的な１日投与量は、特定の物質の活性、治療を行う対象者の年齢、体重、及び病状、変性のタイプ及び重症度、並びに投与頻度及び経路により、体重１ｋｇ当たり約０．１から５０ｍｇである。１日投与量のレベルが、５ｍｇから２ｇであるのが好ましい。
【００７２】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。
【実施例】
【００７３】
材料と方法
試薬。好中球分離培地（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＮＩＭ）はＣａｒｄｉｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（ニューメキシコ州、サンタフェ）より購入した。Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（登録商標）入りＲＰＭＩ １６４０培地、アール塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ）及びＬ−グルタミン酸入り最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ））、ウシ胎児血清、及びペニシリン（５０００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍｌ）溶液は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（スウェーデン、Ｔａｂｙ）より購入した。イオノマイシン及びホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州、ラホーヤ）より入手した。Ｎ，Ｎ’−（１，２−エタンジイルビス（オキシ−２，１−フェニレン））ビス（Ｎ−（カルボキシメチル））（ＢＡＰＴＡ）、及びＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州、ユージーン）より入手した。４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）は、Ｍｅｒｃｋ（ニュージャージー州、ホワイトハウスステーション）より入手した。連鎖球菌のシステインプロテイナーゼ（ＳｐｅＢ）酵素前駆体は、ＡＰ１細菌の培地より、硫酸アンモニウム沈殿（８０％ｗ／ｖ）により、その後Ｓ−セファロース分画により精製した（Ｂｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）、リコンビナントＭ１タンパク質、Ａ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント、及びタンパク質Ｈは、先に記載したように、大腸菌における発現により得、精製した（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。リコンビナントヒトＨＢＰは、Ｓｆ９昆虫細胞におけるバキュロウィルス発現系（カリフォルニア州、カールズバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）を用いて生成し、記載通りに精製した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０〜６８５頁）。リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州、セントルイス）より入手した。マウスｍＡＢ ２Ｆ２３Ｃ３、及びリコンビナントＨＢＰに対するウサギ抗血清（４０９Ａ）は、先に記載したように調製及び精製し（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、６６巻、６３４〜６４３頁）、ペルオキシダーゼ結合体ヤギ抗ウサギＩｇＧは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州、リッチモンド）より入手した。ペプチドＨ−２９３５（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）、及びＨ−２９４０（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）は、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ（スイス、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ）より購入した。フルニアソン／フェンタニル、及びミダゾラムは、ベルギー、Ｂｅｅｒｓ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、及びスイス、バーゼル、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅより入手した。
【００７４】
細胞の培養、好中球の分離、及び細胞の刺激。健康志願者の新鮮ヘパリン化血液より、一段階密度勾配培地であるＮＩＭを用いて、製造元より提供された指示に従い、ヒトＰＭＮを分離した。血球計算機でＰＭＮを計数し、ＭＥＭ培地中１０７細胞／ｍｌに再懸濁し、使用するまで室温でこの培地中で回転を続けた。分離したＰＭＮに対する実験はすべてＮａ培地中で行い、ＰＭＮ分離後１時間以内に開始した。前述した通り（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とクロスリンクしている抗体を通じてＰＭＮを活性化することにより、好中球のプロテイナーゼの放出を誘導した。
【００７５】
細菌株。本研究で用いたストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＡＰ１株は、チェコスロバキア共和国、プラハにある、世界保健機構連鎖球菌照会・研究コラボレーティングセンター、衛生疫学研究所（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）から得た４０／５８株である。この株の、タンパク質結合特性について記載されている（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９０年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５２３〜５３１頁、Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＧｏｍｉら、１９９０年、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖ．１４４巻、４０４６〜４０５２頁）。ＭＣ２５株はＡＰ１の変異株であり、表面に関連するＭ１タンパク質を欠いているが、先に記載した通り生成された（Ｃｏｌｌｉｎ及びＯｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３１８頁）。
【００７６】
ストレプトコッカスパイオゲンスの酵素処理。ストレプトコッカスパイオゲンス（ＡＰ１株）を、トッドヘヴィットブロス（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ）（ミシガン州、デトロイト、Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃１６時間増殖後、３０００ｘｇで２０分間遠心分離して回収した。細菌をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して２×１０９細胞／ｍｌとした。ＰＭＮの分泌生成物を様々な量で細菌懸濁液に添加し、続けて３７℃で２時間インキュベートした。細菌を３０００ｘｇで２０分間遠心沈降させ、得られたペレット及び上清を保存した。ＳＤＳ還元型サンプルバッファーを添加して、消化を終了させた。
【００７７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、及びイムノプリンティング。タンパク質は、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下、１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０〜６８５頁）。分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州、セントルイス）より入手した。溶解したタンパク質は、銀染色法で可視化した。タンパク質もまた、ニトロセルロース膜上で１００ｍＡで３０分間移動させた（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻、２０３〜２０９頁）。５％（ｗ／ｖ）乾燥ミルク粉末及び０．０５％（ｗ／ｖ）トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む、ｐＨ７．４のＰＢＳで膜をブロックした。移動したタンパク質のイムノプリンティングは、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻、４３５０〜４３５４頁）に従って行った。Ｍ１タンパク質に対するポリクローナル抗体は、ブロッキングバッファーで１：５００００に希釈して用いた。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：３０００希釈）を用いて検出し、続けて化学発光検出法で検出した。或いは、膜をブロックし、フィブリノーゲン（２μｇ／ｍｌ）でインキュベート後、抗フィブリノーゲン抗体（１：１０００）及びペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン二次抗体（１：３０００希釈）で免疫検出した。
【００７８】
ＨＢＰ放出。ヒト血液１００μｌをＰＢＳで希釈して最終体積を１．０ｍｌとし、様々なＰＭＮ活性化成分と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し（３００ｘｇで１５分間）、上清をサンドウィッチＥＬＩＳＡで分析した。血液中のＨＢＰの総量を定量するために、細胞を０．０２％（ｖ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で溶解し、上記に述べたようにペレットにした。
【００７９】
ＨＢＰの測定。好中球滲出物中のＨＢＰ濃度を、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（Ｔａｐｐｅｒら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、１７８５〜１７９３頁）で測定した。ＥＬＩＳＡは、特異性が高く、エラスターゼ、カテプシンＧ、又はプロテイナーゼ３と交差反応性を示さないことがわかっている。
【００８０】
沈降反応アッセイ。放射性同位体でラベルしたＭ１タンパク質（１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質）１００００ｃｐｍを、放射性同位体非ラベルの様々な量のＭ１タンパク質の１０％血漿又は０．３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを含むＰＢＳ溶液と共に３０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、γ線を計測して沈殿したＭタンパク質を検出した。
【００８１】
走査型電子顕微鏡。ミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｆｉｌｔｅｒ）（ミルフォード、Ｗａｔｅｒｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に、静かにプローブを適用した。その後、下に湿ったろ紙を置いたフィルターの上にサンプルを吸引した。このフィルターを、ｐＨ７．２の２％（ｖ／ｖ）グルタールアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、０．１Ｍショ糖中で４℃で１時間固定し、ｐＨ７．２の０．１５Ｍカコジル酸で洗浄した。フィルターを、ｐＨ７．２の１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム、０．１５Ｍカコジル酸ナトリウムで４℃で１時間、後固定し、洗浄後、カコジル酸緩衝液中に貯蔵した。固定したろ紙サンプルを、エタノールを段階的に増加して脱水し（１ステップ当たり１０分）、乾燥し、アルミニウムホルダー上に載せ、パラジウム／金で被覆し、Ｊｅｏｌ ＪＳＭ−３５０走査型電子顕微鏡で観察した。
【００８２】
薄切片及び透過型電子顕微鏡。サンプルを室温で１時間、その後ｐＨ７．４、２．５％グルタールアルデヒドの０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（カコジル酸緩衝液）で４℃で一夜固定した。その後、カコジル酸緩衝液で洗浄し、室温で１時間、１％四酸化オスミウムカコジル酸緩衝液溶液で後固定し、連続段階濃度のエタノールで脱水した後、中間溶媒としてアセトンを用いてＥｐｏｎ８１２に包埋した。試料を、ＬＫＢウルトラミクロトーム上、ダイアモンドナイフで５０ｎｍ厚の超薄切片に切断した。超薄切片を、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Ｊｅｏｌ ＪＥＭ１２３０電子顕微鏡を８０ｋＶの加速電圧で作動し、試料を観察した。画像は、Ｇａｔａｎ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ７９１ ＣＣＤカメラで記録した。
【００８３】
血液凝固測定。凝固計（ドイツ、Ｌｅｍｇｏ、Ａｍｅｌｕｎｇ製）で、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を測定した。クエン酸処理したヒト血漿サンプル２００μｌを、ペプチドＨ−２３９５又はＨ−２９４０（５ｍｇ／ｍｌ）４μｌと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。ＴＣＴ試薬（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）１００μｌを添加して、凝固を開始させた。
【００８４】
マウス骨髄細胞及び白血球の調製及び刺激。３から５匹のマウスから骨髄細胞及び全血を採集し、各サンプルを調製した。骨髄細胞は、マウスの大腿骨から回収し、プールして、カルシウムを加えないＰＢＳに懸濁した。心臓穿刺により全血を採集し、１０ｍＭ ＥＤＴＡで凝固阻止した（Ｇａｕｔａｍら、２００１年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７巻、１１２３〜１１２７頁）。デキストラン沈降法（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて、血液中の白血球を分離した。血液及び骨髄由来の細胞は、ビュルケル計算板を用いて計数した。白血球は、ＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁して１×１０７細胞／ｍｌとした。顆粒タンパク質の放出を刺激するために、白血球（約１０７細胞／ｍｌ）を、サイトカラシンＢ（１０μＭ）と共に室温で５分間プレインキュベートした後、さらに３７℃で３０分間、１００ｎＭｆＭＬＰと共にインキュベートした。遠心分離（２０００ｘｇ、１０分）後、さらなる分析のために上清を採集した。或いは、ｐＨ７．４の１％沸騰ＳＤＳの１０ｍＭトリス塩酸溶液を添加して、白血球を溶解させた。溶液はさらなる５分間沸騰させ、その後短時間超音波処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析後、ウェスタンブロッティング及びイムノプリンティングを行った。機能上の試験には、細胞を１０分間水中でインキュベートして溶解させ、その後遠心分離のステップを続けた（５００ｘｇ、１０分間）。
【００８５】
ＲＮＡ調製。ネズミ科動物の大腿骨から回収した骨髄細胞からＲＮＡを調製した。細胞を４００ｇで遠心分離して、ペレットにした。その後、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを調製し、Ａ２６０／２８０比（通常＞１．８）より純粋さを評価した。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＧｅｎｅＡｍｐ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＲＮＡ ＰＣＲキットを用い、製造元のプロトコールに従って、ＲＴ−ＰＣＲを行った。手短に説明すると、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）の水溶液を加熱（６５℃、１０分）し、氷冷し、１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害物質、及び２．５％脱イオンホルムアミドで逆転写した（ヒトＨＢＰの遺伝子配列（ＮＭ ００１７００）由来のＧＧ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＡ３’、４２°２０分）。変性（９９℃、５分）後、サンプルをＰＣＲバッファー（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＭプライマー、２．５％脱イオンホルムアミド、及び０．０５ １Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ）中、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００を用いて、アニーリング５０から６０℃、エクステンション７２℃で、２０〜３５サイクル増幅した。産物を、アガロースゲル（１％ゲル）電気泳動により分析した。
【００８７】
動物。Ｃ５７ＢＬ／６株、オス成年マウス（約３０ｇ）を用いた。マウスを、等量のフルアニソン／フェンタニル（Ｈｙｐｎｏｒｍ１０、０．２ｍｇ／ｍｌ）、及びミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ、５ｍｇ／ｍｌ）を滅菌水で１：１希釈したもの（投与量：マウス当たり０．２ｍｌを筋注）で麻酔した。２％イソフルラン吸入剤を、麻酔に補充した。動物実験はすべて、地域の倫理委員会の承認を受けた。マウスに、Ｍ１タンパク質１５０μｇ／ｍｌを含む溶液を、１００μｌ静脈注射した。或いは、Ｍ１タンパク質１５０μｇ／ｍｌ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを４ｍｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌを静脈注射した。対照として、基剤のみを同じ経路で適用した。注射３０分後にマウスを屠殺し、肺を摘出した。或いは、細菌溶液１００μｌ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ４００μｇの存在あり、又はなしで、ＡＰ１細菌２×１０９／ｍｌ）を、空気０．９ｍｌと共に、マウスの背面部に注入した。３０分後、マウスにＰＢＳ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ若しくはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏをそれぞれ２ｍｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌを静脈注射した。注射６時間後、マウスを屠殺し肺を摘出した。
【００８８】
組織化学。マウスを屠殺し、速やかに外科手術で肺を摘出し、４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７．４、Ｋｅｂｏ）で４℃で２４時間固定した。組織を脱水し、パラフィン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＰｒｏｄｕｃｔｓＡＢ）中に包埋し、４μｍの切片に切断し、封入した。パラフィン除去後、組織をマイヤーのヘマトキシリン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＰｒｏｄｕｃｔｓＡＢ）及びエオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）で染色した。
【００８９】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡。Ｍ１Ｔ１ストレプトコッカスパイオゲンス株により引き起こされた壊疽性筋膜炎の患者に由来する炎症の中心部（筋膜）又は炎症の徴候のない離れた部位（筋肉）から採集し（カナダ、トロント、Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ病院、Ｄｏｎａｌｄ Ｅ Ｌｏｗ教授より好意的に提供された）瞬時凍結した組織のバイオプシーを凍結切片にし、先に述べた通りに固定した（Ｎｏｒｒｂｙ−Ｔｅｇｌｕｎｄら、２００１年）。組織切片は、最初、２０％ウシ胎児血清のＰＢＳ−サポニン溶液（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社製）で３０分間ブロックした後、アビジン及びビオチンでそれぞれ１５分間ずつブロックし（カナダ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、最後にＰＢＳ−サポニン含有０．１％ＢＳＡ−ｃ（オランダ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ａｕｒｉｏｎ製）で３０分間インキュベートした。抗体及び蛍光色素は、すべて、ＰＢＳ−サポニン−ＢＳＡ−ｃで希釈した。抗Ｍ１ポリクローナルウサギ抗血清（１：１００００に希釈）と共に一夜インキュベートした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００に希釈、カリフォルニア州、バーリンゲーム、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３０分間インキュベートし、続いて１：６００に希釈したストレプトアビジン結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（米国、オレゴン州、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加して、Ｍ１タンパク質の染色を達成した。Ｚｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５３２ＩｇＧラベリングキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で３ｍｇ／ｍｌ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）の濃度に希釈した精製ウサギ抗フィブリノーゲン抗体を直接ラベルし、組織切片を９０分間インキュベートして、フィブリノーゲンの二重染色を得た。封入剤として、ｄａｐｉを補充したベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．）を用いた。ランスフィールドＡ群多糖体に対するポリクローナルサギ抗血清を用いて、ストレプトコッカスパイオゲンスを検出し（Ｎｏｒｒｂｙ−Ｔｅｇｌｕｎｄら、２００１年）、Ｍ１染色の特異性を裏付けるための陽性対照とした。染色パターンの特異性を確実にするために、単染色もまた行った。ＬｅｉｃａＤＭＩＲＥ２ 倒立顕微鏡付きＬｅｉｃａ共焦点スキャナーＴＣＳ２ ＡＯＢＳを用いて評価を行った。
【００９０】
結果
好中球のプロテイナーゼが、ストレプトコッカスパイオゲンスの表面からＭ１タンパク質を放出する
ヒト好中球プロテイナーゼと共に以下の処理をした連鎖球菌の表面からＭ１タンパク質が放出するか否かを試験するために、抗体とクロスリンクしたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８により刺激を受けたＰＭＮ（２×１０６細胞／ｍｌ）に由来する分泌産生物（滲出物）の連続希釈（１００μｌ、１０μｌ、又は１μｌ）と共に、ＡＰ１細菌（２×１０９細菌／ｍｌ）を３７℃で２時間インキュベートした。抗体とのクロスリンクによるβ２インテグリンの活性化は、接着依存レセプターの進入機序とよく似ており、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、及びプロテイナーゼ３の放出を誘導し（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）、これは我々が間接ＥＬＩＳＡの実験を設定して確認した（データは示していない）。好中球の滲出物をＡＰ１細菌とインキュベートすると、細菌の細胞壁由来の連鎖球菌タンパク質をいくつか可溶化する結果となった。これは、細菌を遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離すると観察された（データは示していない）。Ｍ１タンパク質に対するポリクローナル抗血清を用いた、ウェスタンブロット法では、可溶化したタンパク質の中にＭ１タンパク質の存在が分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、可溶化したタンパク質をニトロセルロース上に移し、Ｍ１タンパク質の抗体でプローブした。結合した抗体は、ペルオキシダーゼと結合したウサギ免疫グロブリンの二次抗体で検出し、その後化学発光検出法で検出した。未処理の細菌から得た上清を、対照として使用した。
【００９１】
放出された好中球の成分が存在しないところでは、Ｍ１タンパク質は細菌の上清中にほんの少量しか見出されなかったが、細菌と共にインキュベートする好中球分泌生成物の体積が増加すると、様々な分子量のＭ１タンパク質フラグメントが、より大量に検出された。精製されたＭ１に比較して、Ｍ１タンパク質フラグメントのサイズが最も大型であることから、これがＭ１タンパク質の細胞外部分の、すべてではないにしても、殆どを包含することが示唆される。好中球分泌生成物の濃度が上昇すると共に、Ｍ１タンパク質はさらに分解した。
【００９２】
産生されたＭ１タンパク質フラグメントが依然としてフィブリノーゲンと結合できるか否かを試験するために、可溶化した連鎖球菌タンパク質（精製Ｍ１タンパク質１０ｎｇ、好中球分泌生成物１００μｌで放出されたＡＰ１表面タンパク質、及び精製タンパク質Ｈ１０ｎｇ）を、最も多容量の好中球滲出物で処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、これをニトロセルロース上に移し、フィブリノーゲン（２μｇ／ｍｌ）でプローブした。先に述べたように、フィブリノーゲンに対する特異的抗体、及び抗ウサギ免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ結合抗体で、結合フィブリノーゲンを免疫検出した。大腸菌の産生する可溶性Ｍ１タンパク質は、フィブリノーゲンに高い親和性で結合する一方で、密接な関係のあるタンパク質Ｈはフィブリノーゲンとの相互作用は示さなかった（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。これは我々の結果で実証され、我々の結果はまた、分泌された好中球の成分と処理することでフィブリノーゲン結合フラグメントがＡＰ１細菌から２つ放出されたことをも示している。これらフラグメントの分子量は、先に見られたＭ１タンパク質フラグメントと良く相関していた。好中球滲出物とインキュベートする前後のＡＰ１細菌（１００μｌＰＭＮ滲出物／１０６細菌）の薄切片を透過型電子顕微鏡で分析したところ、これらの生成物がＡＰ１細菌の繊維性の表面タンパク質を取り除くのに効果的なことが明らかとなった。これらの毛髪様構造はＭタンパク質を表し、この結果は、好中球滲出物が、細菌の表面からフィブリノーゲン結合Ｍ１タンパク質フラグメントを放出することを示している。
【００９３】
Ｍ１タンパク質は、ヒト血液中でＰＭＮからヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出を誘発する
炎症メディエータのＨＢＰは、ＨＢＰを生成すると報告された唯一の血液細胞であるＰＭＮから放出され（Ｅｄｅｎｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｏｓ、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０巻、２５〜３０頁）、ストレプトコッカスパイオゲンスは炎症の強力な誘発因子であることが知られている。Ｍ１タンパク質のフラグメントが、好中球プロテイナーゼにより可溶化されることが観察され、これは、これらのフラグメント及び／又はストレプトコッカスパイオゲンスの他の成分が、ＰＭＮからＨＢＰを放出することにより炎症反応を増強する可能性があるか否かという問題を提起した。そこで、連鎖球菌の可溶性成分を、ヒト全血に添加した。図１Ａは、血液にＭ１タンパク質を最終濃度１μｇ／ｍｌで添加すると、ＰＭＮ中に貯えられたＨＢＰの約６３％が動員されたことを示す。興味深いことに、濃度がより低くてもより高くても、ＨＢＰの放出の効率は低下する結果となった。Ｍ１タンパク質の他に、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）、及びリポタイコ酸（ＬＴＡ）がＨＢＰの分泌を引き起こした。しかし、Ｍ１タンパク質が誘導する放出とは対照に、これらの作用は用量依存性であった。連鎖球菌の莢膜の部分であるヒアルロン酸（ＨＡ）、分泌された連鎖球菌タンパク質ＳｐｅＢ、及びタンパク質ＳＩＣは、ＨＢＰの放出を誘導しなかった。タンパク質Ｈは、ＡＰ１細菌のＩｇＧ結合表面タンパク質であり（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５２３〜５３１頁）、Ｍ１タンパク質とは構造的に密接に相関するが、フィブリノーゲンとは結合しない（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）。タンパク質Ｈを血液に添加した後に、ほんの微量のＨＢＰが分泌された。
【００９４】
ＰＭＮからのＨＢＰ分泌を引き起こすＭ１タンパク質の領域を突き止めるために、Ｍ１タンパク質（図１Ｂ、上）由来のＡ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）を試験した。図１Ｂは、Ａ−Ｓフラグメントを共に処理するとＨＢＰを動員したが、Ｓ−Ｃ３フラグメントには作用がなかったことを示している。この結果は、ＨＢＰの放出にはＭ１タンパク質のＮＨ２末端部が必要であることを実証している。以前の研究では、Ａ−ＳフラグメントのＢドメインのフィブリノーゲン結合部位、Ｓ−Ｃ３のＣ反復のアルブミン結合部位、及び両方のフラグメントに存在するＳ領域のＩｇＧ Ｆｃ結合活性が確認されている（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）。Ｍ１タンパク質、及びその２つのフラグメントは、大腸菌が産生するリコンビナントタンパク質である。一方、ＣＯＯＨ末端細胞壁定着モチーフを欠く不完全なＭ１タンパク質を発現する、ＭＣ２５と呼ばれるＡＰ１変異株の同質遺伝子型株で示されるように、ストレプトコッカスパイオゲンスが生成するＭ１タンパク質もまたＨＢＰを放出する。この細菌株には、表面結合性のＭ１タンパク質がないが、Ｍ１タンパク質フラグメントを産生し増殖培地中に分泌する（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３０８頁）。図１Ｃは、ＭＣ２５細菌の一夜培養物の上清がＨＢＰの放出を引き起こしたが、ＡＰ１細菌の培養液上清、又は増殖培地のみにはこの作用がなかったことを示す。この結果は、大腸菌又はストレプトコッカスパイオゲンスが産生する可溶性のＭ１タンパク質は、ヒト血液中でＨＢＰの放出を誘導することを実証している。
【００９５】
ヒト血液中におけるＰＭＮからのＨＢＰ放出は、シグナル形質導入メディエータ及び細胞外の２価金属イオンにより調節される
ＰＭＮは、細胞が溶解する際、又は精巧なシグナル形質導入機構を伴う調節された分泌メカニズムにより顆粒の内容物を放出する（Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｃｏｗｌａｎｄ、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ、８９巻、３５０３〜３５２１頁）。Ｍ１タンパク質がヒト血液中でＨＢＰの動員を誘導するメカニズムを調べるために、シグナル形質導入阻害物質のＨＢＰ放出に対する影響を分析した。理論上では、ｆＭＬＰがＭ１タンパク質製剤を汚染するとＰＭＮの活性化を起こす可能性があり、試験を行った最初の物質はｔｂｏｃ−ＭＬＰ（ｆＭＬＰ拮抗物質）及び百日咳毒素（ｆＭＬＰレセプターが属する、Ｇｉタンパク質結合七回膜貫通型受容体の拮抗物質）であった。図２及び表１で示すように、２つの成分はどちらもＨＢＰの放出を阻害せず、これは、ｆＭＬＰがＭ１タンパク質調製物中に存在せず、Ｍ１タンパク質はｆＭＬＰレセプター作用物質として作用しないことを意味している。使用すべき次のシグナル形質導入阻害物質は、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害物質（Ｏ’Ｄｅｌｌら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５３巻、５５８〜５６０頁））、及びワートマニン（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害物質（Ｃａｒｄｅｎａｓら、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、４２７〜４３３頁））であった。これらの阻害物質は、β２インテグリンが引き起こすＰＭＮシグナリングのダウンストリーム効果を阻害し（Ａｘｅｌｓｓｏｎら、２０００年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２５６巻、２５７〜２６３頁）、両者ともＨＢＰの放出を殆ど完全に遮断した。細胞内及び細胞外カルシウムの効果を研究するために、細胞をＢＡＰＴＡ（細胞内カルシウムと錯体を作る）及びＥＧＴＡ（細胞外カルシウムと錯体を作る）でインキュベートした。ゲニステイン及びワートマニンと同様に、この処理を行うとＨＢＰの動員を阻害した。ＢＡＴＰＡの存在なしにＥＧＴＡを使用しても、ＨＢＰの放出を遮断した。これらの結果は、Ｍ１タンパク質のＰＭＮへの結合は２価の金属イオンに依存することを示唆している。主にＧタンパク質結合レセプター及び成長ホルモンレセプターのシグナル形質導入経路に関わる他の阻害物質、例えばＡＧ１４７８（ＥＧＦレセプターチロシンキナーゼの選択的阻害物質（Ｏｓｈｅｒｏｖ ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｚｋｉ、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２５巻、１０４７〜１０５３頁））、ＧＦ１０９２０３（プロテインキナーゼＣ阻害物質（Ｔｏｕｌｌｅｃら、１９９１年、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、１５７７１〜１５７８１頁））、Ｈ−８９（ｃＡＭＰ−依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の阻害物質（Ｆｕｊｉｈａｒａら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１４８９８〜１４９０５頁）、ＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫ経路の阻害物質（Ｄｕｄｌｅｙら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、７６８６〜７６８９頁））、及びＵ−７３１２２（ホスホリパーゼＣ阻害物質（Ｓｍａｌｌｒｉｄｇｅら、１９９２年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３１巻、１８８３〜１８８８頁）は、ＨＢＰの分泌を妨害しなかった。総合すると、この結果が示すのは、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出は、連鎖球菌のタンパク質が好中球の表面に位置するレセプター様構造に結合することに依存するということである。データはまた、細胞外の２価の金属イオンに結合が依存することも実証している。
【００９６】
Ｍ１タンパク質が、血漿中でフィブリノーゲンを沈殿させる
血液中でＨＢＰの放出を媒介する好中球のレセプターを確認するために、１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質の精製ＰＭＮに対する結合を試験した。しかし、ＰＭＮに対する意味のある結合は検出されず、相互作用には補助因子、おそらく血漿タンパク質を必要とすることが示唆された。我々が最初に観察したものの１つは、Ｍ１タンパク質を（１μｇ／ｍｌの濃度で）血漿（１／１０に希釈）に添加すると、肉眼で見える沈殿を引き起こすが、Ｍ１タンパク質のその他の濃度では、血漿サンプル中に沈殿を形成しなかった（図３Ａ）。明らかに、１／１０に希釈した血液中のＭ１タンパク質の濃度１μｇ／ｍｌの時に、ＰＭＮからＨＢＰの最大の放出が記録され（図３Ｂ）、これはＭ１の沈殿とＨＢＰの放出に相関があることを示唆している。Ｍタンパク質がヒト血漿中に沈殿を形成するという発見は、１９６５年にすでに報告されており、Ｍタンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用の結果であることが見出されている（Ｋａｎｔｏｒ、１９６５年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２１巻、８４９〜８５９頁）。したがって、溶液中における、精製Ｍ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用も研究され、この場合も、Ｍ１タンパク質及びフィブリノーゲンは血漿中と同じ濃度で沈殿を形成した（図３Ｃ）。対照に、フィブリノーゲンを除いた血漿にＭ１タンパク質を添加した場合に、沈殿を生じなかった（データは示していない）。セリンプロテイナーゼ阻害物質が存在してもＭ１タンパク質が誘導する沈殿には影響がなかったことから、フィブリノーゲンをトロンビン様に切断しても、沈殿を起こさなかったことが指摘された（データは示していない）。沈殿を走査型電子顕微鏡で観察すると、無定形の凝集が表れ、個々のタンパク質の成分を識別できなかった。対照に、トロンビンが誘導した血漿の凝固では、以前に記載されたものと同様のフィブリン原繊維の網状組織が示された（Ｈｅｒｗａｌｄら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、４巻、２９８〜３０２頁、及びＰｅｒｓｓｏｎら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２巻、１４１５〜１４２４頁）。超薄切片を透過型電子顕微鏡で高分解能で分析すると、不規則なマイクロ原繊維のＭ１タンパク質／血漿沈殿、及び高度に組織化した交差縞のトロンビン誘導フィブリン原繊維が示された。この結果は、Ｍ１タンパク質を狭い濃度範囲でヒト血漿に添加すると、血漿沈殿を引き起こす可能性を示している。形成された沈殿は、トロンビンが誘導する生理学的な凝固とは形態学的に異なる。
【００９７】
Ｍ１タンパク質沈殿及びフィブリノーゲンがＰＭＮを活性化する
別の一連の実験で、我々は、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿とＰＭＮとの相互作用を、走査型電子顕微鏡で分析した。結果は、Ｍ１タンパク質（１μｇ／ｍｌ）とヒト血漿（１０％ＰＢＳ溶液）とを含む混合物と共に再構成したＰＭＮは凝集を形成し、凝集は、先に見られたＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿同様の無定形のタンパク質層で覆われていることを示していた。Ｍ１タンパク質の存在しない血漿中でＰＭＮを再構成した場合、又は血漿の代わりに緩衝液に溶解したＭ１タンパク質でＰＭＮを処理した場合では、沈殿又は凝集物は見られなかった。対照として、精製したＰＭＮを緩衝液のみでインキュベートしたものを用いた。血漿を用いたさらなる実験により、Ｍ１タンパク質の存在下のＰＭＮの凝集は、フィブリノーゲン依存であったことが明らかとなった（データは示していない）。ＰＭＮとＭ１タンパク質／フィブリノーゲン複合体との間の相互作用が沈殿し、細胞を活性化し、結果としてＨＢＰを放出することを、データは示している。そこで我々は、予め形成されたＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿がＰＭＮの活性化に必要であるか否かを分析した。Ｍ１タンパク質（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を、フィブリノーゲン（０．３ｍｇ／ｍｌ）又は血漿（１／１０に希釈）と共に、３０分間インキュベートした。次いで、遠心分離及び洗浄し、得られたペレットをヒト血液（１／１０に希釈）に３０分間添加し、ＨＢＰの放出を測定した。対照として、Ｍ１タンパク質の存在なしに、フィブリノーゲン及び血漿を同様に処理した。図４では、フィブリノーゲン溶液又は血漿中に形成されたＭ１タンパク質が誘導する沈殿はＨＢＰの放出を引き起こしたが、対照では陰性であったことを実証している。この段落に記載したデータを総合すると、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿はＰＭＮに結合し、その凝集及び活性化を誘導し、結果としてＨＢＰが放出されることが示される。
【００９８】
Ｍ１タンパク質誘導性ＨＢＰ放出は、β２インテグリン拮抗物質により阻止される
ヒトフィブリノーゲンは、β２インテグリンを介してＰＭＮに結合し（Ａｌｔｉｅｒｉ、１９９９年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８２巻、７８１〜７８６頁）、ＣＤ１１ｃ／Ｃｄ１８では、結合部位はフィブリノーゲンのＡα鎖のＮＨ２末端領域であると位置決めされた。この領域に由来するペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）は、ＴＮＦに刺激されたＰＭＮがフィブリノーゲンでコートされた表面に接着するのを阻止するが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏなどの同領域由来の他のペプチドにはその作用がないことが示されている（Ｌｏｉｋｅら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０４４〜１０４８頁）。さらに、β２インテグリンに対する抗体は、フィブリノーゲンが活性化したＰＭＮに結合するのを阻害し、これらの抗体の中ではインテグリンの通常のβ鎖に対するモノクローナル抗体（ＩＢ４）が最も強力であることが実証された（Ｌｏｉｋｅら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０４４〜１０４８頁）。血小板が誘導するＰＭＮの活性化も、また、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８と血小板が発現するフィブリノーゲンのＡα鎖との相互作用に依存することが見出された（Ｒｕｆ ａｎｄ Ｐａｔｓｃｈｅｋｅ、１９９５年、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、９０巻、７９１〜７９６頁）。フィブリノーゲンのＰＭＮに対する結合で示されるように、血小板が誘導する活性化もまた、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドにより、及びＣＤ１１ｃに対する抗体により阻害されたが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドには作用はなかった。これらの報告が指摘するのは、ＰＭＮが固定化（例えばカバーガラス上、又は血小板上に）したフィブリノーゲンに結合すると、β２インテグリンがＰＭＮの活性化を導くことに関係があることを伴うことである。興味深いことに、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏはフィブリノーゲンがβ２インテグリンに結合するのを阻害するだけでなく、凝固の形成も防止し（Ｌａｕｄａｎｏ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９巻、１０１３〜１０１９頁）、また、図５Ａは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが通常の血漿でトロンビンが誘導する凝固を完全に阻止したが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは凝固時間に影響を及ぼさなかったことを示している。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、フィブリン分子の重合部位に曝されたトロンビンに結合することによりフィブリン繊維の形成を妨げることを強調したい（Ｓｐｒａｇｇｏｎら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、３８９巻、４５５〜４６２頁）。したがって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが凝固の形成に及ぼす作用は、インテグリン依存ではない。Ｍ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用に及ぼすこの２つのペプチドの影響を、競合的ＥＬＩＳＡで試験した。しかし、このアッセイでは、どちらのペプチドにも作用はなかった（データは示していない）。
【００９９】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド、並びにβ２インテグリンに対する抗体（ＩＢ４）が、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの分泌を阻害する能力についても試験を行った。図５Ｂに示すように、ヒト血液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを添加すると、用量依存的にＭ１タンパク質によるＨＢＰの動員を阻止し、また、インテグリンの通常のβ鎖に対するＩＢ４抗体は、放出が弱まった。対照物質であるＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、及びＨ−キニノーゲンに対する関連のない抗体は、ＨＢＰ分泌に影響を及ぼさなかった（図５Ｂ）。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが、Ｍ１タンパク質が誘導するＰＭＮ凝集に及ぼす作用は、走査型電子顕微鏡分析で確認した。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、血漿とＭ１タンパク質との混合物中における精製ＰＭＮの凝集を阻害した。対照に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、ＰＭＮの凝集には作用がなかった。これらの結果は、Ｍ１タンパク質−フィブリノーゲン複合体が、β２インテグリンのライゲーションによりＰＭＮを活性化し、ＨＢＰの放出を引き起こす概念を裏付けている。この機序は、先に記載した接着依存性レセプターの関与を模倣しＰＭＮからのＨＢＰの大量の放出を引き起こす、抗体が媒介するＣＤ１１ｂ／Ｃｄ１８のクロスリンクと同様であると考えられる（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）。
【０１００】
Ｍ１タンパク質をマウスに静脈注射し重症の肺の病変を引き起こし、これはβ２インテグリン拮抗薬投与により防止される
今までのところ、ＨＢＰが確認されているのはヒト及びブタのみである（Ｆｌｏｄｇａａｒｄら、１９９１年、ＥｕｒＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７巻、５３５〜５４７頁）。我々は、マウスの実験を行う前に、ＨＢＰ類似体がマウスにも存在するか否かを調査した。調査の終わりには、マウス由来の骨髄細胞が分離され、ＲＴ−ＰＣＲ分析、及びウェスタンブロット分析により、ネズミ科ＨＢＰ類似体の存在が実証された。ヒトＨＢＰ配列由来のプライマーセットを用いて、骨髄細胞から調製したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。ヒトＨＢＰに対する抗体で免疫染色を行ったヒトＨＰＢ、及びネズミ科骨髄溶解物を電気泳動した後、ウェスタンブロット検出を行った。次いで、麻酔したマウスで一連の動物実験を行った。３匹のマウスにＭ１タンパク質を静脈注射し（１匹当たり１５μｇ）、３匹にはＭ１タンパク質（１匹当たり１５μｇ）及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１匹当たり４００μｇ）の混合物、３匹にはＭ１タンパク質（１匹当たり１５μｇ）及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１匹当たり４００μｇ）の混合物、及び３匹には媒体のみを処置した。投与３０分後、Ｍ１タンパク質、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとを注射したマウスの呼吸に、他のマウスに比べて明らかな影響があった。動物を屠殺して肺を摘出し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡に供するか、又は走査型電子顕微鏡で分析した。緩衝液のみを注射したマウス由来の典型的な肺のサンプルは、無傷の肺の組織を示していた。一方、Ｍ１タンパク質を注射したマウス由来の肺の切片からは、重篤な出血及び組織の破壊が実証された。これらの病変は、Ｍ１タンパク質をＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏと一緒に注射した場合に、継続する炎症反応の徴候である僅かな腫脹が組織に残っていたものの、殆ど完全に防止されていた。対照的に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを適用しても、Ｍ１タンパク質が誘導する出血及び組織の破壊を防止することはできなかった。Ｈタンパク質を対照として注射して肺組織を分析しても、出血は見られず肺胞炎の腫脹も少ない様子だった。より高倍率で肺の病変を分析するために、組織切片を走査型電子顕微鏡で分析した。ＰＢＳで処置したマウス由来の肺切片には、いかなる肺損傷の徴候は見られなかった。しかし、Ｍ１タンパク質の注射により、先にも見られたように赤血球が重度に漏出しただけでなく、タンパク質の凝集物が析出する結果となった。凝集物の形態は、先に見られたＭ１タンパク質が誘導する無定形の血漿沈殿に類似していた。Ｍ１タンパク質及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを注射したマウスの肺には、凝集物は含まれなかった。しかし、肺胞が幾分腫脹し、赤血球が軽度に漏出しているのが観察され、炎症反応をほのめかしていた。対照に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏで処置しても、Ｍ１タンパク質が引き起こす肺の損傷に影響を及ぼさなかった。Ｈタンパク質を注射しても、重度の出血を引き起こさず、組織がひどく炎症を起こした様子もなかった。
【０１０１】
肺の障害の程度を定量するために、これら１２匹の動物の各々から肺組織切片を無作為に６個選び、電子顕微鏡で分析し、肺の総面積に対するタンパク質凝集物を含む肺の面積を測定した。緩衝液のみ、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとを注射した動物の肺組織で、タンパク質凝集物が含まれていたのは、１０％未満であった（それぞれ、３±１％、及び６±２％）。対照に、Ｍ１タンパク質、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとの混合物で処置した動物の肺の９０％に、タンパク質の凝集物が含まれていた（両方の場合とも、９０±２％）。これらの動物実験より、Ｍ１タンパク質−フィブリノーゲン凝集物は、β２インテグリンを介してＰＭＮを活性化し、結果として重度に血管漏出し、肺組織においてタンパク凝集物が析出することが示唆される。この結果は、フィブリノーゲンが誘発するβ２インテグリンのクロスリンクをＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドが防ぐことで、この病態生理学的作用が阻止できることも示している。
【０１０２】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰｒｏはＭ１タンパク質発現ストレプトコッカスパイオゲンスに感染したマウスの血管漏出及び肺の損傷を防止する
第２シリーズの動物実験では、Ｍ１タンパク質発現ストレプトコッカスパイオゲンスを９匹のマウスに皮下注射して感染させた。材料と方法に記載したように、各グループ３匹のマウスを、それぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド、及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドで処置したが、３匹のマウスは処置しかった。対照として、３匹のマウスにＰＢＳを皮下注射した。注射６時間後、動物を屠殺し、肺を摘出して、走査型電子顕微鏡で検査した。動物から採取した血液サンプルを分析したところ、連鎖球菌は現れていなかったことが判明し、細菌が感染部位から拡散を開始していなかったことを示していた。これらの動物から取った代表的な肺組織切片の電子顕微鏡写真を得た。細菌の代わりに緩衝液を与えたマウスから回収した肺は、肺損傷の徴候を示していなかった。一方、連鎖球菌に感染したマウスは、広範囲の赤血球浸潤、及びフィブリンの析出に示される重度の肺の病変を被っていた。感染した動物をＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏで処置すると、肺の障害はかなり少なく見受けられたが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの処置では、肺の損傷を防ぐことはできなかった。連鎖球菌に感染したマウス由来の肺を、Ｍ１タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色電子顕微鏡でさらに分析した。浸潤された沈殿にＭ１タンパク質が見られることが、この分析で示された。対照に、非感染の動物由来の肺を検査したところＭ１タンパク質が染色されたものは観察されなかった。総合すると、感染モデルでは、細菌が拡散し感染した動物の肺に堆積する沈殿を形成するより前に、脱落したＭ１タンパク質が循環中に見られることが、これらの結果から示唆される。
【０１０３】
連鎖球菌毒素性ショック症候群、及び壊疽性筋膜炎の患者に、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿が形成される
ＳＴＳＳは、連鎖球菌感染症から重篤な合併症を成し、高い罹患率、及び高い致死率と関連付けられる（再考には、（Ｓｔｅｖｅｎｓ、２００３年、Ｃｕｒｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ、５巻、３７９〜３８６頁）を参照されたい）。ＳＴＳＳの臨床上の徴候は、激痛、四肢の紅斑、低血圧、発熱、柔組織の腫脹、及び呼吸器機能不全である（Ｓｔｅｖｅｎｓ、２０００年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、５１巻、２７１〜２８８頁）。これらの症状のいくつかはＭ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用、及びそれに続くＨＢＰの放出により引き起こされる可能性があるということを我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのデータは意味するため、Ｍ１タンパク質を発現するＭ１Ｔ１株感染で起こったＳＴＳＳ壊疽性筋膜炎に罹患する患者から取った組織切片を分析した。組織切片を薄片に切断し、固定し、Ｍ１タンパク質及びフィブリノーゲン用に染色し、ヒトフィブリノーゲン及びＭ１タンパク質に対する抗体を用いて共焦点免疫蛍光顕微鏡法で（材料と方法に記載したとおりに）検査した。顕微鏡写真では、感染の中心（即ち、筋膜）にこの領域で容易に検出されるＭ１タンパク質と共に大量の連鎖球菌が明らかに見られた。Ｍ１タンパク質の中には、細菌に関連することが見出されたものもあるが、大半のタンパク質は連鎖球菌の表面から放出されていた。Ｍ１タンパク質は、細菌の負荷がないか、又は大変少ない末端の領域からは生検では検出されないため、非特異性の染色は除外した。重要なことには、感染の局所部位では、脱落したＭ１タンパク質がフィブリノーゲンと共に強力に共存しており、炎症の経過中に産生され放出されたＭ１タンパク質の量は、フィブリノーゲンと共に沈殿を形成するのに十分だったことを実証していた。総合すると、これらの結果より、ＳＴＳＳ壊疽性筋膜炎に罹患する患者で、細菌の表面からＭ１タンパク質が放出され、それに続いてＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿を形成することにより、重要な毒性の機序を示す強力な証拠が提供される。
【０１０４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ヒト血液におけるＨＢＰの放出を示す図である。パネルＡ：ヒト血液を、Ｍ１タンパク質、Ｈタンパク質、ＳｐｅＢ、ＳＩＣタンパク質、ｆＭＬＰ、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はヒアルロン酸（ＨＡ）と、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレットにし、上清のＨＢＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。細胞をトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で溶解して血中のＨＢＰの総量を測定し、刺激を与えずに３７℃で３０分間インキュベートした後放出されたＨＢＰの量をバックグラウンドとみなした。この図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＢ：ヒト血液を、Ｍ１タンパク質、Ｍ１タンパク質のＡ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント（上部に略図を示した）、又はＨタンパク質で３７℃で３０分間刺激を与えた。細胞をペレットにし、上清のＨＢＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＣ：ＡＰ１及びＭＣ２５株の一夜培養物の上清を連続希釈したもの、又は増殖培地のみをヒト血液に添加し、ＨＢＰの放出を測定した。
【図２】ヒト血液における、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出の阻害を示す図である。ヒト血液を、Ｍ１タンパク質（１μｇ／１ｍＭ）の存在下、又は存在なしに、ｔＢｏｃ（１００μＭ）、百日咳毒素（１μｇ／１ｍＭ）、ゲニステイン（１００μＭ）、ワートマニン（０．２μＭ）、ＢＡＰＴＡＭ／ＥＧＴＡ（１０μｇ／１ｍＭ）、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）、ＡＧ１４７８（２μＭ）、ＧＦ１０９２０３（２μＭ）、Ｈ−８９（１μＭ）、ＰＤ９８０５９（２０μＭ）、又はＵ−７３１２２（１０μＭ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、阻害物質の存在なしで放出されるＨＢＰ（１００％）に対する、阻害物質の存在下で放出されるＨＢＰのパーセントで表した。図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図３】Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出が、Ｍ１タンパク質が誘導する血漿タンパク質の沈殿と相関があることを示す図である。パネルＡ：１０％ヒト血漿ＰＢＳ溶液のサンプル（１ｍｌ）を、非ラベルのＭタンパク質の存在下（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌ）又は存在なしに、１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質（１０５ｃｐｍ／ｍｌ、約１ｎｇ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、ペレットの放射能を測定した。結果は、添加した全放射能のパーセントとして表し、図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＢ：ヒト全血をＭ１タンパク質（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間処理した。細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰの量を測定した。パネルＣ：ヒト血漿（１０％ＰＢＳ溶液）又はフィブリノーゲン（３００μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）のサンプル１ｍｌを、非ラベルのＭ１タンパク質の存在下（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、若しくは１０μｇ／ｍｌ）又は存在なしに１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質（１０５ｃｐｍ／ｍｌ、約１ｎｇ）と共にインキュベートした。３７℃で３０分インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、ペレットの放射能を測定した。結果は、全放射能のパーセントで表してある。数値は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図４】フィブリノーゲン溶液中又は血漿中に形成されたＭ１タンパク質が誘導する沈殿が、ＨＢＰの放出を引き起こすことを示す図である。１０％ヒト血漿又はフィブリノーゲン（３００μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液に、Ｍ１タンパク質（１μｇ／ｍｌ）を３０分間加えた。遠心分離後、得られたペレットを再懸濁してＰＢＳで希釈した１０％ヒト血液と共に３０分間インキュベートし、続いて、放出されたＨＢＰを測定した。Ｍ１タンパク質を添加しない血漿又はフィブリノーゲン溶液を同様に処理し、陰性対照とした。図は、４つの独立して行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図５】フィブリノーゲンに由来するペプチド及びＣＤ１８に対する抗体が、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出を阻害することを示す図である。パネルＡ：ヒト血漿を、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１００μｇ／ｍｌ）、又は緩衝液のみと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。トロンビンを添加して凝固を開始させ、凝固時間を測定した。パネルＢ：ヒト全血（１μｇ／ｍｌ）にＭ１タンパク質を添加し、次いでＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、ＣＤ１８に対するｍＡＢＩＢ４抗体、又はＡＳ８８抗体（ヒトＨ−キニノゲンに対する）を様々な量添加した。３７℃で３０分インキュベート後、細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰ量を測定した。データは、Ｍ１タンパク質のみが誘導したＨＢＰの放出のパーセントとして表し、棒グラフは、３つの実験をそれぞれ２回ずつ行った平均値±標準偏差を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗連鎖球菌物質の確認方法に関する。本発明は、また、このような物質の連鎖球菌感染症の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、最も一般的で重要なヒトの病原細菌の１つである。この細菌は、咽頭炎（連鎖球菌咽頭炎）、及び膿痂疹のような比較的軽度の感染症だけではなく、リウマチ熱、溶連菌感染後糸球体腎炎、壊疽性筋膜炎、敗血症、連鎖球菌毒素性ショック症候群（ＳＴＳＳ）のような重篤な臨床症状も引き起こす。１９８０年代後期以来、世界中で、生命にかかわる全身性ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感染症の数が増加していると報告されており、かなりの注目及び関心を集めている。
【０００３】
ストレプトコッカスパイオゲンスは、αヘリックスコイルドコイルの表面タンパク質であるＭタンパク質を、かなりの量発現する。Ｍタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンスの臨床上の発病決定因子であり、この細菌がヒトの血液中で生存するのを助長する。Ｍタンパク質は、この細菌の細胞壁と関係があることに加えて、この細菌が分泌するシステインプロテイナーゼの作用により表面からも放出される。
【０００４】
多形核好中球（ＰＭＮ）は、細菌感染に対する第一線の防御の部分である。この細胞が血流中から炎症部位に動員するには、この細胞が炎症メディエータを認識し、血管内皮の接着分子と相互作用し、最終的に侵入した細菌をＰＭＮが食作用する炎症部位まで内皮のバリアを通過して遊走することが必要である。生理学的条件のもとでは、非活性のＰＭＮが血流中を循環している。しかし、一旦化学走化性シグナルにより活性化されると、ＰＭＮは接着性となり、感染部位に向かって内皮上を転がり始めて感染部位で内皮に強く付着して感染した組織中に滲出し始める。このような接着のプロセスには、ＰＭＮ及び内皮の両者の上で、インテグリンを含む多くの様々な接着分子を連続的に上下調節する必要がある。活性化したＰＭＮは、また、細胞内の貯蔵場所からヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）を放出する。ＨＢＰは、血管の漏出を誘発する炎症メディエータである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体とＰＭＮのβ２インテグリンとの相互作用でＰＭＮの活性化、及びヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出が起こり、それにより炎症反応が起こることを示している。この相互作用により、抗連鎖球菌物質を確認する新規の標的が呈示され、この抗連鎖球菌物質を用いて連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体とβ２インテグリンとの間の相互作用を阻止することができるため、ＰＭＳの活性化を妨げ、そうでなければ起こったかもしれない炎症反応を阻止する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、このようにして抗連鎖球菌物質の確認方法が提供され、この方法は：
（ａ）第１の成分として、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で接触させること、及び
（ｅ）試験物質が、成分間の相互作用を阻害するか否かを確認することを含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する。
【０００７】
本発明は、また、抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、フィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で接触させること、及び
（ｅ）ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすること
を含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法と、
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン及びその機能性変異体、並びにβ２インテグリン又はその機能性変異体、の間の相互作用を阻害できる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体
を含むテストキットと、
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及びＰＭＮ、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）１つ又は複数のＰＭＮ
を含むテストキットと、
本発明の方法により確認される抗連鎖球菌物質と、
ヒト又は動物の身体の治療による処置の方法に用いる、本発明の方法により確認される抗連鎖球菌物質と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、インテグリン拮抗物質の使用と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質の使用と、
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、本発明の方法により確認された物質の使用と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、治療上有効な量の本発明の方法により確認された物質を前記個体に投与することを含む治療方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、治療上有効な量のインテグリン拮抗物質を前記個体に投与することを含む治療方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法と、
本発明の方法により確認された、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質、並びに薬学的に許容された基剤又は希釈剤を含む薬剤組成物と、
薬剤組成物を提供する方法であって、
（ａ）本発明の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用を阻害する物質を確認すること、及び
（ｂ）このようにして確認された阻害物質を、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に処方すること
を含む方法と、
連鎖球菌感染症に罹患する個体を治療する方法であって、
（ｃ）本発明の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用を阻害する物質を確認すること、及び
（ｄ）このようにして確認された阻害物質を、前記個体に治療上有効な量で投与することを含む方法と
をも提供する。
【０００８】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）受入れ番号ＮＰ＿２６９９７３）のＭ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、フィブリノーゲンのＮＨ２−末端領域由来のペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、フィブリノーゲンのＮＨ２−末端領域由来の第２のペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、実施例で用いたＲＴ−ＰＣＲのプライマーである。
配列番号５は、ヒトフィブリノーゲンα鎖アイソフォームαプレプロタンパク質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０６８６５７）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ヒトフィブリノーゲンβ鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号Ｐ０２６７５）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ヒトフィブリノーゲンγ鎖アイソフォームγ−Ｂ前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０６８６５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ヒトインテグリンαＭ鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０００６２３）のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ヒトインテグリンαサブユニット（αＸ鎖）前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＡＡＡ５１６２０）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ヒトβ２インテグリン鎖前駆物質（ＮＣＢＩ受入れ番号ＮＰ＿０００２０２）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、抗連鎖球菌物質の確認方法を提供する。本発明の適する方法は、本質的に：
（ｉ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、（ｉｉ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び（ｉｉｉ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を、試験物質の存在なしに成分が相互作用できるであろう条件下、試験物質と接触させること、並びに
試験物質が、成分間の相互作用を阻害できるか否かを決定すること
からなる。
【００１０】
したがって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを、容易に決定することができる。
【００１１】
分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、第１の成分として提供される。連鎖球菌のＭタンパク質及びＭ様タンパク質は、よく知られている。８０を超える様々な連鎖球菌のＭタンパク質が存在する。本発明のＭタンパク質は、例えば、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ１１、Ｍ１２、又はＭ２８であることができる。好ましくは、Ｍタンパク質はＭ１又はＭ３である。典型的には、Ｍタンパク質がストレプトコッカスパイオゲンス由来である。Ｍタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンスのＭ１タンパク質であるのが好ましい。ストレプトコッカスパイオゲンスのＭ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に述べる。
【００１２】
連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、フィブリノーゲンと複合体を形成する能力を維持している。このような複合体は、β２インテグリンと結合することができる。機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質のフラグメントであることができる。連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、フィブリノーゲンに特異的に結合するのが典型的である。Ｍタンパク質のフィブリノーゲンへの結合は、Ａｋｅｓｓｏｎらが記載した（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３００巻、８７７〜８６６頁）ように分析することができる。連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体とフィブリノーゲンとの相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００１３】
典型的には、このような機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型Ｍタンパク質の結合親和力と実質的に同じである。或いは、フィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型連鎖球菌のＭタンパク質の結合親和力を超えるか、又はそれより小さくてよい。例えば、機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型連鎖球菌のＭタンパク質の、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体のフィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型の連鎖球菌のＭタンパク質の、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体の、フィブリノーゲンに対する結合親和力は、天然型の、９５％から１０５％、９０％から１１０％、８５％から１２０％、８０％から１３０％、７５％から１４０％、又は７０％から１５０％であることができる。いずれの場合も、連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体と、フィブリノーゲンとの間の相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００１４】
連鎖球菌のＭタンパク質の機能性変異体は、配列番号１のストレプトコッカスパイオゲンスの天然型Ｍ１タンパク質のような、Ｍタンパク質のポリペプチドの配列と同様の配列のポリペプチドであることができる。したがって、これらの配列の全部の長さにわたって計算すると、機能性変異体は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、連鎖球菌のＭタンパク質の配列と一致する配列を有するのが一般的である。ＵＷＧＣＧパッケージは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供し、このプログラムを用いて（例えばそのデフォルト設定で使用して）同一性を計算することができる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２巻、３８７〜３９５頁）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．、１９９３年、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ、３６巻、２９０〜３００頁、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２１５巻、４０３〜１０頁に記載されたように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを代わりに使用して、同一性を計算し、又は配列を決定することも可能である。したがって、ＵＷＧＣＧパッケージを用いてＢＥＳＴＦＩＴプログラムをデフォルト設定で用いて、同一性を計算することができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、配列の同一性を計算することも可能である。ＢＬＡＳＴは、デフォルト設定で用いることができる。
【００１５】
ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公的に入手できる。このアルゴリズムは、まず、データベース配列に同じ長さの言葉を並べた時に、ある正の値の境界スコア（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔに一致するか又は条件を満足する問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において、長さＷの短い言葉を同定することにより、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを必要とする。Ｔは、文字列スコア境界値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の文字列のヒットは、それを含むＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔｓ）は、各配列に沿って、累積アラインメントスコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）が増大できる限り両方向に広がる。両方向でワードヒットの伸長が止まるのは、その最高達成値（ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｖａｌｕｅ）に由来する値Ｘにより累積配列スコアが低下する時、１つ又は複数の負の値の残余アラインメント（ｒｅｓｉｄｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の蓄積により累積スコアがゼロ又はそれ未満になる時、又はどちらかの配列の末端に達した時である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムでは、デフォルトとして、文字列の長さ１１（Ｗ）を、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９巻、１０９１５〜１０９１９頁を参照）ではアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
【００１６】
このＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の相似性の統計的分析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、５８７３〜５７８７頁を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する相似性の指標の１つとして、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））があり、これは２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間に一致（ｍａｔｃｈ）が偶然起こる確率の指標となる。例えば、第１の配列を第２の配列に対して比較して、最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列と同じであると考えられる。
【００１７】
機能性変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のような連鎖球菌のＭタンパク質の修飾型であることができる。修飾型の配列は、天然型Ｍタンパク質のアミノ酸配列とは異なる。天然型Ｍタンパク質の修飾型には、例えば、アミノ酸の置換、欠失、又は付加があることがある。例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、又は少なくとも２０個の、最高１００個又は５０個又は３０個までの、アミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から１００個、２から５０個、３から３０個、又は５から１５個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。置換がある場合、例えば次の表によるように、置換は保存的置換であるのが典型的である。第２コラムで同じ区画にあるアミノ酸、好ましくは、第３コラムの同じ行のアミノ酸は、相互に置換することができる。欠失は、連鎖球菌のＭタンパク質の配列の一端又は両端のアミノ酸の欠失であるのが好ましい。或いは、フィブリノーゲンとの相互作用に関係のない領域の欠失である。例えば、欠失はストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のＳ−Ｃ３フラグメント中であることができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、さらなる異種ポリペプチド配列と融合して融合ポリペプチドを生成することができる。したがって、さらなるアミノ酸残基を、例えば、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の、片側末端又は両側末端に設けることができる。さらなる配列は、あらゆる知られた機能を遂行することができる。典型的には、キャリヤーポリペプチドを提供する目的で加えることができ、キャリヤーポリペプチドにより、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を、例えばラベル、固体マトリックス、又は担体に固定することができる。したがって、本発明で使用する第１の成分は、異種の配列を含む融合ポリペプチドの形態であることができる。実際、融合ポリペプチドを用いると多くの場合で実際上便利であることがある。これは、融合ポリペプチドは、リコンビナント細胞系、例えばリコンビナント細菌又は昆虫細胞系で、容易且つ安価に生成できるからである。融合ポリペプチドは、天然型連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体よりも高レベルで発現することがある。典型的には、これは、エンコードするＲＮＡの翻訳が増加するか、又は分解が減少するためである。さらに、融合ポリペプチドは、確認及び分離が容易であることがある。融合ポリペプチドは、上記に述べたポリペプチド配列、及びキャリヤー又はリンカー配列を含むのが典型的である。キャリヤー又はリンカー配列は、典型的にはヒト以外、好ましくは哺乳類以外の起源、例えばバクテリア起源に由来する。これは、構造Ｍタンパク質又はその機能性変異体の標的である、融合ポリペプチド及びフィブリノーゲンの異種配列間の非特異的相互作用の発生を最小にするためである。
【００２０】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、その分離を助けるために、例えば、ヒスチジン残基、Ｔ７タグ、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを付加して修飾することができる。或いは、異種の配列は、例えば、細胞からの連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の分泌を促進することができるか、又は、細胞膜のような特定の細胞内の場所を発現の標的にすることができる。アミノ酸キャリヤーは、長さ１から４００個のアミノ酸、又はより典型的には長さ５から２００残基であることができる。Ｍタンパク質又はその機能性変異体は、キャリヤーポリペプチドと直接、又は介在するリンカー配列を介して結合することができる。結合に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸である。
【００２１】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、例えば翻訳後修飾のように、化学的に修飾することができる。例えば、修飾されたアミノ酸残基を含むことができるか、又はグリコシル化することができる。これらは、アミド及びポリペプチドの結合体を含む様々な形態のポリペプチド誘導体であることができる。
【００２２】
化学的に修飾された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体はまた、機能性側基の反応により化学的に誘導された残基を１つ又は複数有するものを含む。このように誘導された側基は、誘導されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、及びホルミル基を構成するものを含む。遊離のカルボキシル基を誘導して、塩、メチル及びエチルエステル、若しくはその他のタイプのエステル、又はヒドラジドを構成することができる。遊離のヒドロキシル基を誘導してＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を構成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを構成することができる。
【００２３】
また、化学的に修飾された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体として、２０個の標準アミノ酸の、１つ又は複数の天然アミノ酸誘導体を含むものも、含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンに置換することがあり、ホモセリンがセリンに置換することがある。
【００２４】
連鎖球菌のＭタンパク質若しくはその機能性変異体、及び／又は第１の成分の部分として用いられる他のポリペプチドは、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルには、１２５Ｉ、３２Ｐ、若しくは３５Ｓのような同位体ラベル、蛍光ラベル、酵素ラベル、又はビオチンのようなその他のタンパク質ラベルが含まれる。
【００２５】
第２の成分は、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を含む。フィブリノーゲンは、酵素トロンビンの作用により血液中の不溶性フィブリンから変換される可溶性の血漿タンパク質である。フィブリノーゲンは血餅の形成の一因となる。フィブリノーゲンは、６個のペプチド鎖から構成される。これらのペプチド鎖は、２個の同一のサブユニット中に配置され、各々のサブユニットは１個のＡα、１個のＢβ、及び１個のγ鎖がジスルフィド結合で結合したものから成る。連鎖球菌のＭタンパク質はフィブリノーゲンに結合し（Ｋａｎｔｏｒ、１９６５年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２１巻、８４９〜８５９頁）、その親和力は高い（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。フィブリノーゲンもまた、β２インテグリンを介してＰＭＮに結合する（Ａｌｔｉｅｒｉ、１９９９年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８２巻、７８１〜７８６頁）。β２インテグリンに対する結合部位Ｍａｃ１は、フィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端部位にあると同定されている。さらに、γ鎖のＣ末端終末部に見出される、独特の配列であるＫＱＡＧＤＶは、インテグリンの結合に不可欠である。
【００２６】
フィブリノーゲンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質に結合して、複合体を形成する能力を維持している。このような複合体は、その後、β２インテグリンに結合することができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質に対し実質的に特異的な結合を示すのが典型的である。フィブリノーゲンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質との間の相互作用に対する結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００２７】
典型的には、フィブリノーゲンの機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力と実質的に同じである。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力を超えることもあり、それより小さいこともある。例えば、フィブリノーゲンの機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、機能性変異体の連鎖球菌のＭタンパク質に対する結合親和力は、天然型フィブリノーゲンの結合親和力の９５％から１０５％、９０％から１１０％、８５％から１２０％、８０％から１３０％、７５％から１４０％、又は７０％から１５０％であることができる。いずれの場合も、フィブリノーゲンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質との間の相互作用に対する結合定数は１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００２８】
フィブリノーゲンの機能性変異体は、フィブリノーゲンの天然Ａα鎖の配列と同じ配列を有するＡα鎖、例えば配列番号５に示したヒトＡα鎖を含むことができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、天然Ｂβ鎖の配列と同様の配列を有するＢβ鎖、例えば配列番号６に示したヒトＢβ鎖を含むことができる。フィブリノーゲンの機能性変異体は、天然γ鎖の配列と同様であるγ鎖、例えば配列番号７に示したヒトγ鎖を含むことができる。したがって、Ａα、Ｂβ、又はγ鎖の配列は、フィブリノーゲンの天然型Ａα、Ｂβ、又はγ鎖、例えば配列番号５から７に示したヒトＡα、Ｂβ、又はγ鎖に対し、これら配列のすべての長さにわたって計算して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列が同一である。一方、鎖は依然として集合して機能性分子になることができなければならない。上記に述べた方法を用いて、配列の同一性を計算することができる。ＵＷＧＣＧパッケージのＢＥＳＴＦＩＴプログラムを、デフォルト設定で用いることができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムをデフォルト設定で用いることができる。
【００２９】
機能性変異体は、例えば、フィブリノーゲンのＡα、及び／又はＢβ、及び／又はγ鎖におけるアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有することができるフィブリノーゲンの修飾型であることができる。このような置換、欠失、又は付加は、例えば、配列番号５から７に示したヒトＡα、Ｂβ又はγ鎖の配列に対してなされることができる。鎖のあらゆる組合せを、又はすべての鎖を修飾することができる。一方、どんな置換、欠失、又は付加があっても、フィブリノーゲンのＡα、Ｂβ又はγ鎖が集まって機能性分子となることが依然としてできなければならない。それぞれの鎖において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、又は少なくとも５０個の、例えば、各々の鎖につき最高７０個又は５０個又は３０個までの、アミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から７０個、２から５０個、３から３０個、又は５から２０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。置換がある場合は、上記に述べたように、置換は保存的置換であるのが典型的である。欠失は、例えば配列番号５から７に示したもののような、フィブリノーゲンのＡα、Ｂβ又はγ鎖の配列の片側末端又は両側末端のアミノ酸の欠失であるのが好ましい。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質との相互作用に関係のない領域の欠失である。
【００３０】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖はいずれも、ポリペプチド鎖が集合して機能性分子となることが依然としてできる限り、さらなる異種のポリペプチド配列と融合して、融合ポリペプチドを生成することができる。このような融合ポリペプチドは、キャリヤーポリペプチドであることができるか、又はリンカー配列を含むことができる。このようなポリペプチドは、上記に述べてある。
【００３１】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖は、上記に述べたように化学的に修飾することができる。或いは、フィブリノーゲン又はその機能性変異体のポリペプチド鎖は、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルは、上記に述べてある。
【００３２】
第３の成分は、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体である。インテグリンは、β鎖とα鎖とから構成されるヘテロ二量体細胞表面接着受容体の大系統群である。各サブユニットは、大きな細胞外領域、１個の膜内外領域、及び短い細胞質領域から成る。多くのα及びβサブユニットが確認されており、これらは限られた方法で関わることができる。通常、αサブユニットは、特定のβサブユニットと関わるにすぎないが、βサブユニットはさらに手当たり次第に関わりを持つ。β２インテグリンは、ＰＭＮにより発現される最も豊富なインテグリンである。４個の異なるα鎖（αＭ、αＬ、αＸ、及びαＤ）がβ２鎖と関わることができる。この中では、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８としても知られるαＭβ２、及びＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８としても知られるαＸβ２は、ＰＭＮで発現する主要なインテグリンである。これらはフィブリノーゲンのレセプターである。
【００３３】
β２インテグリンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合する能力を維持している。β２インテグリンの機能性変異体は、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体と特異的に結合するのが典型的である。β２インテグリンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との間の相互作用の結合定数は、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００３４】
典型的には、β２インテグリンの機能性変異体の、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力と実質的に同じである。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力を超えることもあり、それより小さいこともある。例えば、β２インテグリンの機能性変異体の、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、又は少なくとも７０％であることができる。或いは、機能性変異体に対する結合定数は、天然型β２インテグリンの少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％であることができる。例えば、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に対する機能性変異体の結合親和力は、天然型β２インテグリンの結合親和力の７０％から１６０％、７５％から１５０％、８０％から１４０％、８５％から１３０％、９０％から１２０％、又は９５％から１１０％であることができる。いずれの場合も、β２インテグリンの機能性変異体と連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との間の相互作用に対する結合定数は１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍであるのが典型的である。例えば、結合定数は、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍ、又は１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍであることができる。
【００３５】
β２インテグリンの機能性変異体は、β２インテグリンの天然α鎖又は天然β鎖のいずれかの配列と同様の配列を有するα及び／又はβ２鎖を含むことができる。例えば、α鎖は、配列番号８に示したヒトαＭ鎖の配列、又は配列番号９に示したヒトαＸ鎖の配列と同様の配列を有することができる。β２鎖は、配列番号１０に示したヒトβ２鎖の配列と同様の配列を有することができる。したがって、α及び／又はβ２鎖は、天然型α又はβ２鎖の配列、例えば配列番号８から１０に示したものと、これら配列のすべての長さにわたって計算して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の配列を有することができる。再び、上記に述べたパッケージを用いて、配列の同一性を計算することができる。ＵＷＧＣＧパッケージのＢＥＳＴＦＩＴプログラムを、デフォルト設定で用いることができる。或いは、ＰＩＬＥＵＰ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムをデフォルト設定で用いることができる。
【００３６】
β２インテグリンの機能性変異体は、例えばα又はβ２鎖の一方又は両方にアミノ酸が置換、欠失、又は付加した、β２インテグリンの修飾型であることができる。例えば、αＭ、αＸ、又はβ２鎖は、例えば配列番号８から１０に示したヒトαＭ、αＸ、及びβ２鎖の配列のような天然αＭ、αＸ、又はβ２鎖の配列に対する、置換、欠失、又は付加を含むことができる。α及びβ２鎖の一方又は両方で、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個、例えば、最高２００個、１００個、５０個、又は３０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。例えば、１から２００個、２から１５０個、３から１００個、５個から５０個、又は１０から３０個までのアミノ酸の置換又は欠失があることがある。上記に述べたように、あらゆる置換は保存的置換であるのが典型的である。欠失は、好ましくは、配列番号８から１０に示した配列のいずれかのような、α又はβ２鎖の配列の片側末端又は両側末端のアミノ酸の欠失である。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体との相互作用に関与しない領域の欠失である。
【００３７】
β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、異種のポリペプチド配列と融合して融合ポリペプチドを生成することができる。これにより、上記に述べたようにキャリヤーポリペプチドを生成することができる。或いは、β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、例えば、その分離を助けるために、アミノ酸残基の付加などにより修飾されることができる。これはキャリヤーポリペプチドと直接、又はリンカー配列を通じて結合することができる。β２インテグリン又はその機能性変異体のα又はβ２鎖は、上記に述べたように化学的に修飾することができるか、検出用ラベルを有することができる。好適なラベルは、上記に述べてある。
【００３８】
本発明の方法は、あらゆる好適なプロトコールに従って実行することができる。この方法が、例えば、プラスチック製のマイクロタイタープレートのシングルウェルのような個別の反応器中で行うことができるよう調節され、したがって高処理能力スクリーニングに適合できるのが、好ましい。したがって、アッセイがｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイであるのが好ましい。
【００３９】
第１の成分の一部として用いられる、連鎖球菌のＭタンパク質若しくはその機能性変異体、及び／又はその他のポリペプチドは、リコンビナントＤＮＡ法を用いて発現することができる。例えば、好適なポリペプチドは、例えば、細菌又は昆虫の細胞系で発現することができる（例えば、Ｍｕｎｇｅｒら、１９９８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、９巻、２６２７〜２６３８頁）。典型的には、リコンビナント連鎖球菌のＭタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現で生成することができる。Ｍタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質であるのが好ましい。リコンビナントポリペプチドは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体をエンコードしたポリヌクレオチドを提供することにより生成される。このようなポリヌクレオチドには、例えばプロモーター配列のような、好適なコントロール部位が提供され、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体の発現のために発現ベクター及び同様のものに提供される。好適なポリペプチドは、あらゆる適する細菌から、生化学的に分離することができる。
【００４０】
或いは、Ｍタンパク質は、内因性にＭタンパク質を発現する連鎖球菌の細胞から、又はリコンビナント法の使用により得ることができる。例えば、ストレプトコッカスパイオゲンス由来のＭタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンスの細胞をプロテアーゼで処理して生成することができる。Ｍタンパク質は、Ｍ１タンパク質であるのが好ましい。プロテアーゼは、ストレプトコッカスパイオゲンス内因性、例えば、ストレプトコッカスパイオゲンスシステインプロテイナーゼＳｐｅＢであることができる。或いは、プロテアーゼはＰＭＮから誘導することができる。ＰＭＮプロテアーゼはＰＭＮを溶解して生成するのが典型的である。プロテアーゼもまた、リコンビナントで生成することができる。Ｍタンパク質は、或いは、細胞膜貫通部を欠く、先端のない型のＭタンパク質の発現により得ることができる（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３１８頁）。このようなタンパク質は、ストレプトコッカスパイオゲンス又は大腸菌で発現でき、タンパク質分解の切断を必要とせずに細菌により分泌される。
【００４１】
或いは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、化学的に合成することができる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の固相合成法のような合成技術は、純粋であり、抗原特異性があり、不要な副産物がなく、産生が容易であるとの理由から好ましいことがある。固相ペプチド合成法に適した技術は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６９年、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２巻、２２１〜９６頁、及びＦｉｅｌｄｓら、１９９０年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ、３５巻、１６１〜２１４頁を参照されたい）。一般に、固相合成法は、伸長していくペプチド鎖に１つ又は複数のアミノ酸残基、又は好適に保護されたアミノ酸残基を連続的に付加することを含む。
【００４２】
フィブリノーゲン又はその機能性変異体は、上記に述べたように細菌又は昆虫の細胞系での発現のようなリコンビナント法により生成することができる。或いは、フィブリノーゲン又はその機能性変異体は、化学的に合成することができる。フィブリノーゲンは、ヒトの血液、好ましくはヒト血漿から分離することができる。
【００４３】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体は、フィブリノーゲン又はその機能性変異体と共同して提供することができる。即ち、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体と、フィブリノーゲン又はその機能性変異体との複合体を本発明で用いることができる。このような複合体は、β２インテグリンと結合することができる。或いは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体と、フィブリノーゲン又はその機能性変異体とを、個々に提供することができる。
【００４４】
β２インテグリン又はその機能性変異体は、上記に述べたようにリコンビナント法又は化学的合成で生成することができる。β２インテグリンは、ＰＭＮ溶解物から分離することができる。
【００４５】
上記に述べた方法で用いられる、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンは、実質的に分離された形態で提供される、即ち、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン、又はこれらのあらゆる機能性変異体は、上記に述べたように生成し、その後分離することができる。これらは、一般に、製剤中の乾燥量の、少なくとも８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、９５重量％、又は９９重量％を含むことができる。
【００４６】
本発明で用いる連鎖球菌のＭタンパク質、及び／又はフィブリノーゲン、及び／又はβ２インテグリンは、非天然型の形態で存在することができる。連鎖球菌のＭタンパク質、及び／又はフィブリノーゲン、及び／又はβ２インテグリンは、実質的に精製された形態であることができる。
【００４７】
本発明の代替方法は、実質的に、
（ｉ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、（ｉｉ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び（ｉｉｉ）１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を、試験物質の存在なしに成分が相互作用できる条件下で試験物質と接触させること、及び
ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすること
からなる。
【００４８】
そこで、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かが、速やかに決定できる。
【００４９】
第１の成分である連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、及び第２の成分であるフィブリノーゲン又はその機能性変異体は、上記に述べたあらゆる方法で提供することができる。ＰＭＮは、ヒト血液中に備えられていることがある。連鎖球菌のＭタンパク質及びフィブリノーゲンは、ＰＭＮの表面上でβ２インテグリンを介してＰＭＮに結合する。
【００５０】
本発明の典型的な方法では、分離された連鎖球菌のＭタンパク質、分離されたフィブリノーゲン、及び分離されたβ２インテグリンを混合する。その後、試験物質の存在なしに成分が相互作用できる条件下で、試験物質を混合物に添加する。分離された連鎖球菌のＭタンパク質、分離されたフィブリノーゲン、及び分離されたβ２インテグリンを、試験物質存在なしに混合し、試験物質のないところで成分が相互作用をするかどうかを決定し、例えば、試験物質のないところで成分が凝集物を形成するか否かを決定することにより、好適な条件を確認することができる。こうした凝集物は、電子顕微鏡で検出することができる。或いは、放射性同位元素でラベルしたタンパク質を用いて、反応混合物をスパイクし、凝集物中の放射能量を用いて凝集物形成を定量することができる。
【００５１】
本発明の代替方法では、連鎖球菌のＭタンパク質と血漿との混合物でＰＭＮを再構成する（フィブリノーゲンを提供するために）。その後、試験物質の存在なしに成分が相互反応できる条件下で、試験物質を混合物に添加する。試験物質の存在なしにＰＭＮを連鎖球菌のＭタンパク質と血漿との混合物で再構成して、且つ、成分が凝集物を形成するか否か、又は試験物質の存在なしにＰＭＮが活性化するか否かを決定して、好適な条件を確認することができる。ＰＭＮの活性化は、ＨＢＰの放出をモニターすることにより決定するのが典型的である。
【００５２】
細胞接着アッセイを、代わりに行うことができる。典型的な細胞接着アッセイでは、分離されたＭタンパク質及び分離されたフィブリノーゲンから形成された、連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体が、好適な器、特にプラスチック製のマイクロタイタープレートのウェルの壁面上にコーティングしてある。１つの好適なアッセイ形式では、例えば、化学的に、又はリコンビナントで生成され、その後分離された第３の成分であるβ２インテグリンを、試験物質と一緒にアッセイ用の器に添加するだけである。β２インテグリンがＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合した後、例えば放射線ラベル又は蛍光ラベルのようなラベルを有するβ２インテグリンを使用することができる。
【００５３】
或いは、別の好適なアッセイ形式では、ＰＭＮ細胞を器に添加し、試験物質の存在下で連鎖球菌のＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体を相互作用させる。この複合体は、連鎖球菌のＭタンパク質をフィブリノーゲンと混合するだけで構成することができる。その後、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体に結合する細胞数を決定する。これは、例えば、細胞を染色し、その後分光光度法を行って実施することができる。場合により、染料を溶出させ、溶出した試料を分光測定することがある。
【００５４】
本発明の代替のアッセイでは、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体は、好適な器の壁面にコーティングされ、その後、器にＰＭＮ細胞を添加して、試験物質の存在下でＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体と相互作用させる。ＰＭＮの活性化をモニターすることで、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体とＰＭＮとの結合阻害を検出する。典型的には、これはヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出をモニターして検出することができる。本発明の好ましい方法は、上記に述べたアッセイにおけるように、ＰＭＮの表面上でＭタンパク質−フィブリノーゲン複合体がβ２インテグリンに結合するのを試験物質が阻害するか否かを試験するために、ストレプトコッカスパイオゲンス、フィブリノーゲン、及びＰＭＮを試験物質に提供することを含む。
【００５５】
本発明の好適な方法は、適する緩衝液の存在下で行うことができる。
【００５６】
好適な対照実験を行うことができる。例えば、Ｍタンパク質−フィブリノーゲン複合体と分離されたβ２インテグリン又はＰＭＮとの間の相互作用をモニターするために、試験物質の存在なしにアッセイを行うことができる。
【００５７】
上記の方法で試験することができる好適な試験物質には、コンビナトリアルライブラリ、規定された化学物質、ペプチド及びペプチド類似体、オリゴヌクレオチド、並びに天然物ライブラリ、例えばディスプレイ（ファージ提示法ライブラリなど）及び抗体生成物が含まれる。例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、並びにヒト化抗体を用いることができる。抗体は、完全な免疫グロブリン分子、又はそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントであることができる。好適なペプチドは、ＧＰＲＰ配列のペプチドを含む。好適な抗体は、ストレプトコッカスパイオゲンスＭ１タンパク質のＢ反復に対する抗体、モノクローナル抗体ＩＢ４、及びＣＤ１１ｃに対する抗体を含む。
【００５８】
好適な試験物質は、また、インテグリン拮抗物質、典型的にはβ２インテグリン拮抗物質を含む。好適なインテグリン拮抗物質は、抗インテグリン抗体、ペプチド類似体、及び非ペプチド類似体を含む。抗インテグリン抗体は、上記に述べた抗体のあらゆるタイプであることができる。拮抗物質は、拮抗物質が存在する場合にはレセプターに結合して生物学的作用を表す作用物質の作用を、拮抗物質の存在なしでは、阻害するか否かを試験することにより確認することができる。
【００５９】
典型的には有機分子、好ましくは分子量５０から２５００ダルトンの小型有機分子を審査する。候補となる製品は、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、又はそれらの組合せを含む生体分子であることができる。候補となる物質は、合成又は天然化合物のライブラリを含む多方面の供給源から得られる。知られた薬物に、目的のある、又は任意の化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等を行い、構造類似体を生成することができる。
【００６０】
最初の審査では、試験物質は、例えば１反応当たり１０個の物質を用いることができ、阻害を示したバッチの物質は個々に試験した。試験物質は、１ｎＭから１０００μＭの濃度、好ましくは１μＭから１００μＭの濃度、より好ましくは１μＭから１０μＭの濃度で用いることができる。
【００６１】
連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質は、上記に述べた方法における相互作用において測定可能な減少を引き起こした阻害物質である。相互作用の阻害物質は、その阻害物質の存在なしでの相互作用の程度に比較すると、減少又は実質的にない程度の相互作用を引き起こす物質である。好ましい阻害物質は、１μｇｍｌ−１、１０μｇｍｌ−１、１００μｇｍｌ−１、５００μｇｍｌ−１、１ｍｇｍｌ−１、１０ｍｇｍｌ−１、１００ｍｇｍｌ−１の阻害物質の濃度で、相互作用を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％阻害する物質である。阻害のパーセント値は、試験物質の存在下、及び存在なしでのアッセイを比較したとき、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間のあらゆる相互作用でパーセント値が減少したことを表す。上記に述べた阻害パーセント値及び阻害物質の濃度のあらゆる組合せを用いて、本発明の阻害物質を規定することができ、この場合、濃度が低くなるほど阻害が大きくなるのが好ましい。本発明の方法で活性を示す試験物質は、動物疾病モデルのようなｉｎ ｖｉｖｏ法で試験することができる。即ち候補となる阻害物質は、連鎖球菌によりマウスに引き起こされる炎症、及び／又は肺の病変を緩和する能力を試験することができる。したがって、本発明の方法で確認された試験物質が、抗連鎖球菌物質として効果的であるか否かを決定することができる。
【００６２】
本発明の阻害物質は、実質的に精製された形態であることができる。これらは、実質的に分離された形態であることができ、この場合、概ね、製剤中の乾燥量の少なくとも８０重量％、例えば、少なくとも９０重量％、９５重量％、９７重量％、又は９９重量％を含む。生成物には、実質的に他の細胞構成成分がないのが典型的である。本発明の方法では、生成物は、このように実質的に分離されたか、精製されたか、又は遊離の形態で使用することができる。
【００６３】
本発明は、また、テストキットを提供する。好適なキットは、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体から実質的に成る。本発明の代替のキットは、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び１つ又は複数のＰＭＮから実質的に成る。テストキットは、また、試験物質が成分間の相互作用をかく乱するか否かを決定する手段も含む。そのような手段は、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン又はＰＭＮが、本技術分野で知られたあらゆる方法で相互作用をするか否かを決定するのに必要な試薬及び溶液であることができる。本発明のテストキットは、１つ又は複数の緩衝液もまた含むことができる。本発明のキットは、場合により包装して提供され、好ましくはキットの使用説明書を含む。
【００６４】
本発明の阻害物質を、ヒト又は動物の身体の治療による処置方法に使用することができる。特に、本発明の阻害物質を連鎖球菌感染症の治療、好ましくはストレプトコッカスパイオゲンスによる感染症の治療に用いることができる。連鎖球菌感染症に罹患している患者の病状を改善するために阻害物質を用いることができる。このような阻害物質を、ヒト又は動物の処置に用いてもよい。このような阻害物質を、予防的処置に、例えば連鎖球菌感染症に、より罹患しやすい免疫抑制された患者に用いることができる。或いは、このような物質を、連鎖球菌感染症であることが実証された患者の症状を軽減するために用いることができる。阻害物質の治療上有効な量を、それを必要とする宿主に与えることができる。
【００６５】
阻害物質は、様々な剤形で投与することができる。即ち、例えば、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ剤、水性又は油性懸濁剤、分散可能な粉末剤又は顆粒剤として、経口投与することができる。これらはまた、皮下に、静脈に、筋肉内に、胸骨内に、経皮的に、又は点適法など、非経口的に投与することができる。これらはまた、坐剤として投与することもできる。医師が、特定の患者ごとに必要な投与経路を決定することができる。
【００６６】
連鎖球菌感染症の予防又は処置に用いるための阻害物質の処方は、薬理学的使用を意図するか、獣医学的使用を意図するかなどといった、その物質の性質のような要因による。阻害物質は、同時使用、単独使用、又は連続使用に処方することができる。
【００６７】
阻害物質は、本発明において、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に、投与するために処方するのが典型的である。薬学的に許容された基剤又は希釈剤は、例えば等張液であることができる。例えば、経口用固体剤形は、有効成分と共に、ラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、又はバレイショデンプンのような希釈剤、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、及び／又はポリエチレングリコールのような滑沢剤、デンプン、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルピロリドンのような結合剤、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、又はナトリウムスターチグリコレートのような崩壊剤、飽和剤、色素、甘味剤、レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸のような湿潤剤、並びに、一般的に薬剤処方に使用される非毒性で薬学的に不活性の物質を含むことができる。このような薬物製剤は、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖衣コーティング、又はフィルムコーティングのプロセスのような知られた方法で製造される。
【００６８】
経口投与のための液体分散系は、シロップ剤、乳剤、又は懸濁剤であることができる。シロップ剤は、例えば、ショ糖、若しくはショ糖入りグリセリン、及び／又はマンニトール、及び／又はソルビトールを基剤として含むことができる。
【００６９】
懸濁剤及び乳剤は、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを基剤として含むことができる。筋肉注射用の懸濁剤又は水溶液は、有効成分と共に薬学的に許容された基剤、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、及び所望により適量の塩酸リドカインを含むことができる。
【００７０】
静脈投与又は注入用の溶液は、基剤として、例えば、滅菌水を含むことができるか、又は好ましくは、滅菌等張生理食塩水の形態であることができる。
【００７１】
治療上有効な量の阻害物質を、それを必要とする個体に投与する。阻害物質の投与量は、様々なパラメータに応じ、特に、用いる物質、治療する患者の年齢、体重及び病状、投与経路、並びに必要とする治療計画に応じて決定することができる。繰り返すと、医師は、あらゆる特定な患者に必要な投与経路及び投与量を決定することができる。典型的な１日投与量は、特定の物質の活性、治療を行う対象者の年齢、体重、及び病状、変性のタイプ及び重症度、並びに投与頻度及び経路により、体重１ｋｇ当たり約０．１から５０ｍｇである。１日投与量のレベルが、５ｍｇから２ｇであるのが好ましい。
【００７２】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。
【実施例】
【００７３】
材料と方法
試薬。好中球分離培地（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＮＩＭ）はＣａｒｄｉｎａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（ニューメキシコ州、サンタフェ）より購入した。Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ（登録商標）入りＲＰＭＩ １６４０培地、アール塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ）及びＬ−グルタミン酸入り最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ））、ウシ胎児血清、及びペニシリン（５０００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍｌ）溶液は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（スウェーデン、Ｔａｂｙ）より購入した。イオノマイシン及びホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州、ラホーヤ）より入手した。Ｎ，Ｎ’−（１，２−エタンジイルビス（オキシ−２，１−フェニレン））ビス（Ｎ−（カルボキシメチル））（ＢＡＰＴＡ）、及びＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｋｉｔは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州、ユージーン）より入手した。４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）は、Ｍｅｒｃｋ（ニュージャージー州、ホワイトハウスステーション）より入手した。連鎖球菌のシステインプロテイナーゼ（ＳｐｅＢ）酵素前駆体は、ＡＰ１細菌の培地より、硫酸アンモニウム沈殿（８０％ｗ／ｖ）により、その後Ｓ−セファロース分画により精製した（Ｂｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）、リコンビナントＭ１タンパク質、Ａ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント、及びタンパク質Ｈは、先に記載したように、大腸菌における発現により得、精製した（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。リコンビナントヒトＨＢＰは、Ｓｆ９昆虫細胞におけるバキュロウィルス発現系（カリフォルニア州、カールズバッド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）を用いて生成し、記載通りに精製した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０〜６８５頁）。リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州、セントルイス）より入手した。マウスｍＡＢ ２Ｆ２３Ｃ３、及びリコンビナントＨＢＰに対するウサギ抗血清（４０９Ａ）は、先に記載したように調製及び精製し（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、６６巻、６３４〜６４３頁）、ペルオキシダーゼ結合体ヤギ抗ウサギＩｇＧは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州、リッチモンド）より入手した。ペプチドＨ−２９３５（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）、及びＨ−２９４０（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）は、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ（スイス、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ）より購入した。フルニアソン／フェンタニル、及びミダゾラムは、ベルギー、Ｂｅｅｒｓ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、及びスイス、バーゼル、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅより入手した。
【００７４】
細胞の培養、好中球の分離、及び細胞の刺激。健康志願者の新鮮ヘパリン化血液より、一段階密度勾配培地であるＮＩＭを用いて、製造元より提供された指示に従い、ヒトＰＭＮを分離した。血球計算機でＰＭＮを計数し、ＭＥＭ培地中１０７細胞／ｍｌに再懸濁し、使用するまで室温でこの培地中で回転を続けた。分離したＰＭＮに対する実験はすべてＮａ培地中で行い、ＰＭＮ分離後１時間以内に開始した。前述した通り（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８とクロスリンクしている抗体を通じてＰＭＮを活性化することにより、好中球のプロテイナーゼの放出を誘導した。
【００７５】
細菌株。本研究で用いたストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＡＰ１株は、チェコスロバキア共和国、プラハにある、世界保健機構連鎖球菌照会・研究コラボレーティングセンター、衛生疫学研究所（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）から得た４０／５８株である。この株の、タンパク質結合特性について記載されている（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９０年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５２３〜５３１頁、Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＧｏｍｉら、１９９０年、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖ．１４４巻、４０４６〜４０５２頁）。ＭＣ２５株はＡＰ１の変異株であり、表面に関連するＭ１タンパク質を欠いているが、先に記載した通り生成された（Ｃｏｌｌｉｎ及びＯｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３１８頁）。
【００７６】
ストレプトコッカスパイオゲンスの酵素処理。ストレプトコッカスパイオゲンス（ＡＰ１株）を、トッドヘヴィットブロス（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ ｂｒｏｔｈ）（ミシガン州、デトロイト、Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃１６時間増殖後、３０００ｘｇで２０分間遠心分離して回収した。細菌をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して２×１０９細胞／ｍｌとした。ＰＭＮの分泌生成物を様々な量で細菌懸濁液に添加し、続けて３７℃で２時間インキュベートした。細菌を３０００ｘｇで２０分間遠心沈降させ、得られたペレット及び上清を保存した。ＳＤＳ還元型サンプルバッファーを添加して、消化を終了させた。
【００７７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、及びイムノプリンティング。タンパク質は、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ存在下、１２．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０年、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０〜６８５頁）。分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（ミズーリ州、セントルイス）より入手した。溶解したタンパク質は、銀染色法で可視化した。タンパク質もまた、ニトロセルロース膜上で１００ｍＡで３０分間移動させた（Ｋｈｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０巻、２０３〜２０９頁）。５％（ｗ／ｖ）乾燥ミルク粉末及び０．０５％（ｗ／ｖ）トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む、ｐＨ７．４のＰＢＳで膜をブロックした。移動したタンパク質のイムノプリンティングは、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻、４３５０〜４３５４頁）に従って行った。Ｍ１タンパク質に対するポリクローナル抗体は、ブロッキングバッファーで１：５００００に希釈して用いた。結合した抗体は、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：３０００希釈）を用いて検出し、続けて化学発光検出法で検出した。或いは、膜をブロックし、フィブリノーゲン（２μｇ／ｍｌ）でインキュベート後、抗フィブリノーゲン抗体（１：１０００）及びペルオキシダーゼ結合抗ウサギ免疫グロブリン二次抗体（１：３０００希釈）で免疫検出した。
【００７８】
ＨＢＰ放出。ヒト血液１００μｌをＰＢＳで希釈して最終体積を１．０ｍｌとし、様々なＰＭＮ活性化成分と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し（３００ｘｇで１５分間）、上清をサンドウィッチＥＬＩＳＡで分析した。血液中のＨＢＰの総量を定量するために、細胞を０．０２％（ｖ／ｖ）トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で溶解し、上記に述べたようにペレットにした。
【００７９】
ＨＢＰの測定。好中球滲出物中のＨＢＰ濃度を、サンドウィッチＥＬＩＳＡ（Ｔａｐｐｅｒら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、１７８５〜１７９３頁）で測定した。ＥＬＩＳＡは、特異性が高く、エラスターゼ、カテプシンＧ、又はプロテイナーゼ３と交差反応性を示さないことがわかっている。
【００８０】
沈降反応アッセイ。放射性同位体でラベルしたＭ１タンパク質（１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質）１００００ｃｐｍを、放射性同位体非ラベルの様々な量のＭ１タンパク質の１０％血漿又は０．３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを含むＰＢＳ溶液と共に３０分間インキュベートした。遠心分離後、ペレットをＰＢＳに再懸濁し、γ線を計測して沈殿したＭタンパク質を検出した。
【００８１】
走査型電子顕微鏡。ミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｆｉｌｔｅｒ）（ミルフォード、Ｗａｔｅｒｓ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に、静かにプローブを適用した。その後、下に湿ったろ紙を置いたフィルターの上にサンプルを吸引した。このフィルターを、ｐＨ７．２の２％（ｖ／ｖ）グルタールアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、０．１Ｍショ糖中で４℃で１時間固定し、ｐＨ７．２の０．１５Ｍカコジル酸で洗浄した。フィルターを、ｐＨ７．２の１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウム、０．１５Ｍカコジル酸ナトリウムで４℃で１時間、後固定し、洗浄後、カコジル酸緩衝液中に貯蔵した。固定したろ紙サンプルを、エタノールを段階的に増加して脱水し（１ステップ当たり１０分）、乾燥し、アルミニウムホルダー上に載せ、パラジウム／金で被覆し、Ｊｅｏｌ ＪＳＭ−３５０走査型電子顕微鏡で観察した。
【００８２】
薄切片及び透過型電子顕微鏡。サンプルを室温で１時間、その後ｐＨ７．４、２．５％グルタールアルデヒドの０．１５Ｍカコジル酸ナトリウム溶液（カコジル酸緩衝液）で４℃で一夜固定した。その後、カコジル酸緩衝液で洗浄し、室温で１時間、１％四酸化オスミウムカコジル酸緩衝液溶液で後固定し、連続段階濃度のエタノールで脱水した後、中間溶媒としてアセトンを用いてＥｐｏｎ８１２に包埋した。試料を、ＬＫＢウルトラミクロトーム上、ダイアモンドナイフで５０ｎｍ厚の超薄切片に切断した。超薄切片を、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Ｊｅｏｌ ＪＥＭ１２３０電子顕微鏡を８０ｋＶの加速電圧で作動し、試料を観察した。画像は、Ｇａｔａｎ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ７９１ ＣＣＤカメラで記録した。
【００８３】
血液凝固測定。凝固計（ドイツ、Ｌｅｍｇｏ、Ａｍｅｌｕｎｇ製）で、トロンビン凝固時間（ＴＣＴ）を測定した。クエン酸処理したヒト血漿サンプル２００μｌを、ペプチドＨ−２３９５又はＨ−２９４０（５ｍｇ／ｍｌ）４μｌと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。ＴＣＴ試薬（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）１００μｌを添加して、凝固を開始させた。
【００８４】
マウス骨髄細胞及び白血球の調製及び刺激。３から５匹のマウスから骨髄細胞及び全血を採集し、各サンプルを調製した。骨髄細胞は、マウスの大腿骨から回収し、プールして、カルシウムを加えないＰＢＳに懸濁した。心臓穿刺により全血を採集し、１０ｍＭ ＥＤＴＡで凝固阻止した（Ｇａｕｔａｍら、２００１年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７巻、１１２３〜１１２７頁）。デキストラン沈降法（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いて、血液中の白血球を分離した。血液及び骨髄由来の細胞は、ビュルケル計算板を用いて計数した。白血球は、ＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁して１×１０７細胞／ｍｌとした。顆粒タンパク質の放出を刺激するために、白血球（約１０７細胞／ｍｌ）を、サイトカラシンＢ（１０μＭ）と共に室温で５分間プレインキュベートした後、さらに３７℃で３０分間、１００ｎＭｆＭＬＰと共にインキュベートした。遠心分離（２０００ｘｇ、１０分）後、さらなる分析のために上清を採集した。或いは、ｐＨ７．４の１％沸騰ＳＤＳの１０ｍＭトリス塩酸溶液を添加して、白血球を溶解させた。溶液はさらなる５分間沸騰させ、その後短時間超音波処理しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析後、ウェスタンブロッティング及びイムノプリンティングを行った。機能上の試験には、細胞を１０分間水中でインキュベートして溶解させ、その後遠心分離のステップを続けた（５００ｘｇ、１０分間）。
【００８５】
ＲＮＡ調製。ネズミ科動物の大腿骨から回収した骨髄細胞からＲＮＡを調製した。細胞を４００ｇで遠心分離して、ペレットにした。その後、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを調製し、Ａ２６０／２８０比（通常＞１．８）より純粋さを評価した。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＧｅｎｅＡｍｐ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＲＮＡ ＰＣＲキットを用い、製造元のプロトコールに従って、ＲＴ−ＰＣＲを行った。手短に説明すると、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）の水溶液を加熱（６５℃、１０分）し、氷冷し、１Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害物質、及び２．５％脱イオンホルムアミドで逆転写した（ヒトＨＢＰの遺伝子配列（ＮＭ ００１７００）由来のＧＧ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＡ３’、４２°２０分）。変性（９９℃、５分）後、サンプルをＰＣＲバッファー（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＭプライマー、２．５％脱イオンホルムアミド、及び０．０５ １Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ）中、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００を用いて、アニーリング５０から６０℃、エクステンション７２℃で、２０〜３５サイクル増幅した。産物を、アガロースゲル（１％ゲル）電気泳動により分析した。
【００８７】
動物。Ｃ５７ＢＬ／６株、オス成年マウス（約３０ｇ）を用いた。マウスを、等量のフルアニソン／フェンタニル（Ｈｙｐｎｏｒｍ１０、０．２ｍｇ／ｍｌ）、及びミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ、５ｍｇ／ｍｌ）を滅菌水で１：１希釈したもの（投与量：マウス当たり０．２ｍｌを筋注）で麻酔した。２％イソフルラン吸入剤を、麻酔に補充した。動物実験はすべて、地域の倫理委員会の承認を受けた。マウスに、Ｍ１タンパク質１５０μｇ／ｍｌを含む溶液を、１００μｌ静脈注射した。或いは、Ｍ１タンパク質１５０μｇ／ｍｌ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを４ｍｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌを静脈注射した。対照として、基剤のみを同じ経路で適用した。注射３０分後にマウスを屠殺し、肺を摘出した。或いは、細菌溶液１００μｌ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ ４００μｇの存在あり、又はなしで、ＡＰ１細菌２×１０９／ｍｌ）を、空気０．９ｍｌと共に、マウスの背面部に注入した。３０分後、マウスにＰＢＳ又はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ若しくはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏをそれぞれ２ｍｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌを静脈注射した。注射６時間後、マウスを屠殺し肺を摘出した。
【００８８】
組織化学。マウスを屠殺し、速やかに外科手術で肺を摘出し、４％ホルマリン緩衝液（ｐＨ７．４、Ｋｅｂｏ）で４℃で２４時間固定した。組織を脱水し、パラフィン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＰｒｏｄｕｃｔｓＡＢ）中に包埋し、４μｍの切片に切断し、封入した。パラフィン除去後、組織をマイヤーのヘマトキシリン（Ｈｉｓｔｏｌａｂ ＰｒｏｄｕｃｔｓＡＢ）及びエオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）で染色した。
【００８９】
免疫蛍光及び共焦点顕微鏡。Ｍ１Ｔ１ストレプトコッカスパイオゲンス株により引き起こされた壊疽性筋膜炎の患者に由来する炎症の中心部（筋膜）又は炎症の徴候のない離れた部位（筋肉）から採集し（カナダ、トロント、Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ病院、Ｄｏｎａｌｄ Ｅ Ｌｏｗ教授より好意的に提供された）瞬時凍結した組織のバイオプシーを凍結切片にし、先に述べた通りに固定した（Ｎｏｒｒｂｙ−Ｔｅｇｌｕｎｄら、２００１年）。組織切片は、最初、２０％ウシ胎児血清のＰＢＳ−サポニン溶液（ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社製）で３０分間ブロックした後、アビジン及びビオチンでそれぞれ１５分間ずつブロックし（カナダ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、最後にＰＢＳ−サポニン含有０．１％ＢＳＡ−ｃ（オランダ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ａｕｒｉｏｎ製）で３０分間インキュベートした。抗体及び蛍光色素は、すべて、ＰＢＳ−サポニン−ＢＳＡ−ｃで希釈した。抗Ｍ１ポリクローナルウサギ抗血清（１：１００００に希釈）と共に一夜インキュベートした後、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００に希釈、カリフォルニア州、バーリンゲーム、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３０分間インキュベートし、続いて１：６００に希釈したストレプトアビジン結合ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（米国、オレゴン州、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加して、Ｍ１タンパク質の染色を達成した。Ｚｅｎｏｎ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５３２ＩｇＧラベリングキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で３ｍｇ／ｍｌ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）の濃度に希釈した精製ウサギ抗フィブリノーゲン抗体を直接ラベルし、組織切片を９０分間インキュベートして、フィブリノーゲンの二重染色を得た。封入剤として、ｄａｐｉを補充したベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ．）を用いた。ランスフィールドＡ群多糖体に対するポリクローナルサギ抗血清を用いて、ストレプトコッカスパイオゲンスを検出し（Ｎｏｒｒｂｙ−Ｔｅｇｌｕｎｄら、２００１年）、Ｍ１染色の特異性を裏付けるための陽性対照とした。染色パターンの特異性を確実にするために、単染色もまた行った。ＬｅｉｃａＤＭＩＲＥ２ 倒立顕微鏡付きＬｅｉｃａ共焦点スキャナーＴＣＳ２ ＡＯＢＳを用いて評価を行った。
【００９０】
結果
好中球のプロテイナーゼが、ストレプトコッカスパイオゲンスの表面からＭ１タンパク質を放出する
ヒト好中球プロテイナーゼと共に以下の処理をした連鎖球菌の表面からＭ１タンパク質が放出するか否かを試験するために、抗体とクロスリンクしたＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８により刺激を受けたＰＭＮ（２×１０６細胞／ｍｌ）に由来する分泌産生物（滲出物）の連続希釈（１００μｌ、１０μｌ、又は１μｌ）と共に、ＡＰ１細菌（２×１０９細菌／ｍｌ）を３７℃で２時間インキュベートした。抗体とのクロスリンクによるβ２インテグリンの活性化は、接着依存レセプターの進入機序とよく似ており、好中球エラスターゼ、カテプシンＧ、及びプロテイナーゼ３の放出を誘導し（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）、これは我々が間接ＥＬＩＳＡの実験を設定して確認した（データは示していない）。好中球の滲出物をＡＰ１細菌とインキュベートすると、細菌の細胞壁由来の連鎖球菌タンパク質をいくつか可溶化する結果となった。これは、細菌を遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離すると観察された（データは示していない）。Ｍ１タンパク質に対するポリクローナル抗血清を用いた、ウェスタンブロット法では、可溶化したタンパク質の中にＭ１タンパク質の存在が分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、可溶化したタンパク質をニトロセルロース上に移し、Ｍ１タンパク質の抗体でプローブした。結合した抗体は、ペルオキシダーゼと結合したウサギ免疫グロブリンの二次抗体で検出し、その後化学発光検出法で検出した。未処理の細菌から得た上清を、対照として使用した。
【００９１】
放出された好中球の成分が存在しないところでは、Ｍ１タンパク質は細菌の上清中にほんの少量しか見出されなかったが、細菌と共にインキュベートする好中球分泌生成物の体積が増加すると、様々な分子量のＭ１タンパク質フラグメントが、より大量に検出された。精製されたＭ１に比較して、Ｍ１タンパク質フラグメントのサイズが最も大型であることから、これがＭ１タンパク質の細胞外部分の、すべてではないにしても、殆どを包含することが示唆される。好中球分泌生成物の濃度が上昇すると共に、Ｍ１タンパク質はさらに分解した。
【００９２】
産生されたＭ１タンパク質フラグメントが依然としてフィブリノーゲンと結合できるか否かを試験するために、可溶化した連鎖球菌タンパク質（精製Ｍ１タンパク質１０ｎｇ、好中球分泌生成物１００μｌで放出されたＡＰ１表面タンパク質、及び精製タンパク質Ｈ１０ｎｇ）を、最も多容量の好中球滲出物で処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後、これをニトロセルロース上に移し、フィブリノーゲン（２μｇ／ｍｌ）でプローブした。先に述べたように、フィブリノーゲンに対する特異的抗体、及び抗ウサギ免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ結合抗体で、結合フィブリノーゲンを免疫検出した。大腸菌の産生する可溶性Ｍ１タンパク質は、フィブリノーゲンに高い親和性で結合する一方で、密接な関係のあるタンパク質Ｈはフィブリノーゲンとの相互作用は示さなかった（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、３００巻、８７７〜８８６頁、及びＢｅｒｇｅら、１９９７年、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２０７７４〜２０７８１頁）。これは我々の結果で実証され、我々の結果はまた、分泌された好中球の成分と処理することでフィブリノーゲン結合フラグメントがＡＰ１細菌から２つ放出されたことをも示している。これらフラグメントの分子量は、先に見られたＭ１タンパク質フラグメントと良く相関していた。好中球滲出物とインキュベートする前後のＡＰ１細菌（１００μｌＰＭＮ滲出物／１０６細菌）の薄切片を透過型電子顕微鏡で分析したところ、これらの生成物がＡＰ１細菌の繊維性の表面タンパク質を取り除くのに効果的なことが明らかとなった。これらの毛髪様構造はＭタンパク質を表し、この結果は、好中球滲出物が、細菌の表面からフィブリノーゲン結合Ｍ１タンパク質フラグメントを放出することを示している。
【００９３】
Ｍ１タンパク質は、ヒト血液中でＰＭＮからヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出を誘発する
炎症メディエータのＨＢＰは、ＨＢＰを生成すると報告された唯一の血液細胞であるＰＭＮから放出され（Ｅｄｅｎｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｏｓ、２００３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０巻、２５〜３０頁）、ストレプトコッカスパイオゲンスは炎症の強力な誘発因子であることが知られている。Ｍ１タンパク質のフラグメントが、好中球プロテイナーゼにより可溶化されることが観察され、これは、これらのフラグメント及び／又はストレプトコッカスパイオゲンスの他の成分が、ＰＭＮからＨＢＰを放出することにより炎症反応を増強する可能性があるか否かという問題を提起した。そこで、連鎖球菌の可溶性成分を、ヒト全血に添加した。図１Ａは、血液にＭ１タンパク質を最終濃度１μｇ／ｍｌで添加すると、ＰＭＮ中に貯えられたＨＢＰの約６３％が動員されたことを示す。興味深いことに、濃度がより低くてもより高くても、ＨＢＰの放出の効率は低下する結果となった。Ｍ１タンパク質の他に、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ）、及びリポタイコ酸（ＬＴＡ）がＨＢＰの分泌を引き起こした。しかし、Ｍ１タンパク質が誘導する放出とは対照に、これらの作用は用量依存性であった。連鎖球菌の莢膜の部分であるヒアルロン酸（ＨＡ）、分泌された連鎖球菌タンパク質ＳｐｅＢ、及びタンパク質ＳＩＣは、ＨＢＰの放出を誘導しなかった。タンパク質Ｈは、ＡＰ１細菌のＩｇＧ結合表面タンパク質であり（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５２３〜５３１頁）、Ｍ１タンパク質とは構造的に密接に相関するが、フィブリノーゲンとは結合しない（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）。タンパク質Ｈを血液に添加した後に、ほんの微量のＨＢＰが分泌された。
【００９４】
ＰＭＮからのＨＢＰ分泌を引き起こすＭ１タンパク質の領域を突き止めるために、Ｍ１タンパク質（図１Ｂ、上）由来のＡ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）を試験した。図１Ｂは、Ａ−Ｓフラグメントを共に処理するとＨＢＰを動員したが、Ｓ−Ｃ３フラグメントには作用がなかったことを示している。この結果は、ＨＢＰの放出にはＭ１タンパク質のＮＨ２末端部が必要であることを実証している。以前の研究では、Ａ−ＳフラグメントのＢドメインのフィブリノーゲン結合部位、Ｓ−Ｃ３のＣ反復のアルブミン結合部位、及び両方のフラグメントに存在するＳ領域のＩｇＧ Ｆｃ結合活性が確認されている（Ａｋｅｓｓｏｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３００巻、８７７〜８８６頁）。Ｍ１タンパク質、及びその２つのフラグメントは、大腸菌が産生するリコンビナントタンパク質である。一方、ＣＯＯＨ末端細胞壁定着モチーフを欠く不完全なＭ１タンパク質を発現する、ＭＣ２５と呼ばれるＡＰ１変異株の同質遺伝子型株で示されるように、ストレプトコッカスパイオゲンスが生成するＭ１タンパク質もまたＨＢＰを放出する。この細菌株には、表面結合性のＭ１タンパク質がないが、Ｍ１タンパク質フラグメントを産生し増殖培地中に分泌する（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６巻、１３０６〜１３０８頁）。図１Ｃは、ＭＣ２５細菌の一夜培養物の上清がＨＢＰの放出を引き起こしたが、ＡＰ１細菌の培養液上清、又は増殖培地のみにはこの作用がなかったことを示す。この結果は、大腸菌又はストレプトコッカスパイオゲンスが産生する可溶性のＭ１タンパク質は、ヒト血液中でＨＢＰの放出を誘導することを実証している。
【００９５】
ヒト血液中におけるＰＭＮからのＨＢＰ放出は、シグナル形質導入メディエータ及び細胞外の２価金属イオンにより調節される
ＰＭＮは、細胞が溶解する際、又は精巧なシグナル形質導入機構を伴う調節された分泌メカニズムにより顆粒の内容物を放出する（Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｃｏｗｌａｎｄ、１９９７年、Ｂｌｏｏｄ、８９巻、３５０３〜３５２１頁）。Ｍ１タンパク質がヒト血液中でＨＢＰの動員を誘導するメカニズムを調べるために、シグナル形質導入阻害物質のＨＢＰ放出に対する影響を分析した。理論上では、ｆＭＬＰがＭ１タンパク質製剤を汚染するとＰＭＮの活性化を起こす可能性があり、試験を行った最初の物質はｔｂｏｃ−ＭＬＰ（ｆＭＬＰ拮抗物質）及び百日咳毒素（ｆＭＬＰレセプターが属する、Ｇｉタンパク質結合七回膜貫通型受容体の拮抗物質）であった。図２及び表１で示すように、２つの成分はどちらもＨＢＰの放出を阻害せず、これは、ｆＭＬＰがＭ１タンパク質調製物中に存在せず、Ｍ１タンパク質はｆＭＬＰレセプター作用物質として作用しないことを意味している。使用すべき次のシグナル形質導入阻害物質は、ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害物質（Ｏ’Ｄｅｌｌら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５３巻、５５８〜５６０頁））、及びワートマニン（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害物質（Ｃａｒｄｅｎａｓら、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、４２７〜４３３頁））であった。これらの阻害物質は、β２インテグリンが引き起こすＰＭＮシグナリングのダウンストリーム効果を阻害し（Ａｘｅｌｓｓｏｎら、２０００年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２５６巻、２５７〜２６３頁）、両者ともＨＢＰの放出を殆ど完全に遮断した。細胞内及び細胞外カルシウムの効果を研究するために、細胞をＢＡＰＴＡ（細胞内カルシウムと錯体を作る）及びＥＧＴＡ（細胞外カルシウムと錯体を作る）でインキュベートした。ゲニステイン及びワートマニンと同様に、この処理を行うとＨＢＰの動員を阻害した。ＢＡＴＰＡの存在なしにＥＧＴＡを使用しても、ＨＢＰの放出を遮断した。これらの結果は、Ｍ１タンパク質のＰＭＮへの結合は２価の金属イオンに依存することを示唆している。主にＧタンパク質結合レセプター及び成長ホルモンレセプターのシグナル形質導入経路に関わる他の阻害物質、例えばＡＧ１４７８（ＥＧＦレセプターチロシンキナーゼの選択的阻害物質（Ｏｓｈｅｒｏｖ ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｚｋｉ、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２５巻、１０４７〜１０５３頁））、ＧＦ１０９２０３（プロテインキナーゼＣ阻害物質（Ｔｏｕｌｌｅｃら、１９９１年、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻、１５７７１〜１５７８１頁））、Ｈ−８９（ｃＡＭＰ−依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の阻害物質（Ｆｕｊｉｈａｒａら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１４８９８〜１４９０５頁）、ＰＤ９８０５９（ＭＡＰＫ経路の阻害物質（Ｄｕｄｌｅｙら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、７６８６〜７６８９頁））、及びＵ−７３１２２（ホスホリパーゼＣ阻害物質（Ｓｍａｌｌｒｉｄｇｅら、１９９２年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３１巻、１８８３〜１８８８頁）は、ＨＢＰの分泌を妨害しなかった。総合すると、この結果が示すのは、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出は、連鎖球菌のタンパク質が好中球の表面に位置するレセプター様構造に結合することに依存するということである。データはまた、細胞外の２価の金属イオンに結合が依存することも実証している。
【００９６】
Ｍ１タンパク質が、血漿中でフィブリノーゲンを沈殿させる
血液中でＨＢＰの放出を媒介する好中球のレセプターを確認するために、１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質の精製ＰＭＮに対する結合を試験した。しかし、ＰＭＮに対する意味のある結合は検出されず、相互作用には補助因子、おそらく血漿タンパク質を必要とすることが示唆された。我々が最初に観察したものの１つは、Ｍ１タンパク質を（１μｇ／ｍｌの濃度で）血漿（１／１０に希釈）に添加すると、肉眼で見える沈殿を引き起こすが、Ｍ１タンパク質のその他の濃度では、血漿サンプル中に沈殿を形成しなかった（図３Ａ）。明らかに、１／１０に希釈した血液中のＭ１タンパク質の濃度１μｇ／ｍｌの時に、ＰＭＮからＨＢＰの最大の放出が記録され（図３Ｂ）、これはＭ１の沈殿とＨＢＰの放出に相関があることを示唆している。Ｍタンパク質がヒト血漿中に沈殿を形成するという発見は、１９６５年にすでに報告されており、Ｍタンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用の結果であることが見出されている（Ｋａｎｔｏｒ、１９６５年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２１巻、８４９〜８５９頁）。したがって、溶液中における、精製Ｍ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用も研究され、この場合も、Ｍ１タンパク質及びフィブリノーゲンは血漿中と同じ濃度で沈殿を形成した（図３Ｃ）。対照に、フィブリノーゲンを除いた血漿にＭ１タンパク質を添加した場合に、沈殿を生じなかった（データは示していない）。セリンプロテイナーゼ阻害物質が存在してもＭ１タンパク質が誘導する沈殿には影響がなかったことから、フィブリノーゲンをトロンビン様に切断しても、沈殿を起こさなかったことが指摘された（データは示していない）。沈殿を走査型電子顕微鏡で観察すると、無定形の凝集が表れ、個々のタンパク質の成分を識別できなかった。対照に、トロンビンが誘導した血漿の凝固では、以前に記載されたものと同様のフィブリン原繊維の網状組織が示された（Ｈｅｒｗａｌｄら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、４巻、２９８〜３０２頁、及びＰｅｒｓｓｏｎら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２巻、１４１５〜１４２４頁）。超薄切片を透過型電子顕微鏡で高分解能で分析すると、不規則なマイクロ原繊維のＭ１タンパク質／血漿沈殿、及び高度に組織化した交差縞のトロンビン誘導フィブリン原繊維が示された。この結果は、Ｍ１タンパク質を狭い濃度範囲でヒト血漿に添加すると、血漿沈殿を引き起こす可能性を示している。形成された沈殿は、トロンビンが誘導する生理学的な凝固とは形態学的に異なる。
【００９７】
Ｍ１タンパク質沈殿及びフィブリノーゲンがＰＭＮを活性化する
別の一連の実験で、我々は、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿とＰＭＮとの相互作用を、走査型電子顕微鏡で分析した。結果は、Ｍ１タンパク質（１μｇ／ｍｌ）とヒト血漿（１０％ＰＢＳ溶液）とを含む混合物と共に再構成したＰＭＮは凝集を形成し、凝集は、先に見られたＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿同様の無定形のタンパク質層で覆われていることを示していた。Ｍ１タンパク質の存在しない血漿中でＰＭＮを再構成した場合、又は血漿の代わりに緩衝液に溶解したＭ１タンパク質でＰＭＮを処理した場合では、沈殿又は凝集物は見られなかった。対照として、精製したＰＭＮを緩衝液のみでインキュベートしたものを用いた。血漿を用いたさらなる実験により、Ｍ１タンパク質の存在下のＰＭＮの凝集は、フィブリノーゲン依存であったことが明らかとなった（データは示していない）。ＰＭＮとＭ１タンパク質／フィブリノーゲン複合体との間の相互作用が沈殿し、細胞を活性化し、結果としてＨＢＰを放出することを、データは示している。そこで我々は、予め形成されたＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿がＰＭＮの活性化に必要であるか否かを分析した。Ｍ１タンパク質（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を、フィブリノーゲン（０．３ｍｇ／ｍｌ）又は血漿（１／１０に希釈）と共に、３０分間インキュベートした。次いで、遠心分離及び洗浄し、得られたペレットをヒト血液（１／１０に希釈）に３０分間添加し、ＨＢＰの放出を測定した。対照として、Ｍ１タンパク質の存在なしに、フィブリノーゲン及び血漿を同様に処理した。図４では、フィブリノーゲン溶液又は血漿中に形成されたＭ１タンパク質が誘導する沈殿はＨＢＰの放出を引き起こしたが、対照では陰性であったことを実証している。この段落に記載したデータを総合すると、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿はＰＭＮに結合し、その凝集及び活性化を誘導し、結果としてＨＢＰが放出されることが示される。
【００９８】
Ｍ１タンパク質誘導性ＨＢＰ放出は、β２インテグリン拮抗物質により阻止される
ヒトフィブリノーゲンは、β２インテグリンを介してＰＭＮに結合し（Ａｌｔｉｅｒｉ、１９９９年、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、８２巻、７８１〜７８６頁）、ＣＤ１１ｃ／Ｃｄ１８では、結合部位はフィブリノーゲンのＡα鎖のＮＨ２末端領域であると位置決めされた。この領域に由来するペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ）は、ＴＮＦに刺激されたＰＭＮがフィブリノーゲンでコートされた表面に接着するのを阻止するが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏなどの同領域由来の他のペプチドにはその作用がないことが示されている（Ｌｏｉｋｅら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０４４〜１０４８頁）。さらに、β２インテグリンに対する抗体は、フィブリノーゲンが活性化したＰＭＮに結合するのを阻害し、これらの抗体の中ではインテグリンの通常のβ鎖に対するモノクローナル抗体（ＩＢ４）が最も強力であることが実証された（Ｌｏｉｋｅら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１０４４〜１０４８頁）。血小板が誘導するＰＭＮの活性化も、また、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８と血小板が発現するフィブリノーゲンのＡα鎖との相互作用に依存することが見出された（Ｒｕｆ ａｎｄ Ｐａｔｓｃｈｅｋｅ、１９９５年、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、９０巻、７９１〜７９６頁）。フィブリノーゲンのＰＭＮに対する結合で示されるように、血小板が誘導する活性化もまた、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドにより、及びＣＤ１１ｃに対する抗体により阻害されたが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドには作用はなかった。これらの報告が指摘するのは、ＰＭＮが固定化（例えばカバーガラス上、又は血小板上に）したフィブリノーゲンに結合すると、β２インテグリンがＰＭＮの活性化を導くことに関係があることを伴うことである。興味深いことに、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏはフィブリノーゲンがβ２インテグリンに結合するのを阻害するだけでなく、凝固の形成も防止し（Ｌａｕｄａｎｏ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９巻、１０１３〜１０１９頁）、また、図５Ａは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが通常の血漿でトロンビンが誘導する凝固を完全に阻止したが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは凝固時間に影響を及ぼさなかったことを示している。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、フィブリン分子の重合部位に曝されたトロンビンに結合することによりフィブリン繊維の形成を妨げることを強調したい（Ｓｐｒａｇｇｏｎら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、３８９巻、４５５〜４６２頁）。したがって、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが凝固の形成に及ぼす作用は、インテグリン依存ではない。Ｍ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用に及ぼすこの２つのペプチドの影響を、競合的ＥＬＩＳＡで試験した。しかし、このアッセイでは、どちらのペプチドにも作用はなかった（データは示していない）。
【００９９】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド、並びにβ２インテグリンに対する抗体（ＩＢ４）が、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの分泌を阻害する能力についても試験を行った。図５Ｂに示すように、ヒト血液にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを添加すると、用量依存的にＭ１タンパク質によるＨＢＰの動員を阻止し、また、インテグリンの通常のβ鎖に対するＩＢ４抗体は、放出が弱まった。対照物質であるＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、及びＨ−キニノーゲンに対する関連のない抗体は、ＨＢＰ分泌に影響を及ぼさなかった（図５Ｂ）。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏが、Ｍ１タンパク質が誘導するＰＭＮ凝集に及ぼす作用は、走査型電子顕微鏡分析で確認した。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、血漿とＭ１タンパク質との混合物中における精製ＰＭＮの凝集を阻害した。対照に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏは、ＰＭＮの凝集には作用がなかった。これらの結果は、Ｍ１タンパク質−フィブリノーゲン複合体が、β２インテグリンのライゲーションによりＰＭＮを活性化し、ＨＢＰの放出を引き起こす概念を裏付けている。この機序は、先に記載した接着依存性レセプターの関与を模倣しＰＭＮからのＨＢＰの大量の放出を引き起こす、抗体が媒介するＣＤ１１ｂ／Ｃｄ１８のクロスリンクと同様であると考えられる（Ｇａｕｔａｍら、２０００年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、１８２９〜１８３９頁）。
【０１００】
Ｍ１タンパク質をマウスに静脈注射し重症の肺の病変を引き起こし、これはβ２インテグリン拮抗薬投与により防止される
今までのところ、ＨＢＰが確認されているのはヒト及びブタのみである（Ｆｌｏｄｇａａｒｄら、１９９１年、ＥｕｒＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７巻、５３５〜５４７頁）。我々は、マウスの実験を行う前に、ＨＢＰ類似体がマウスにも存在するか否かを調査した。調査の終わりには、マウス由来の骨髄細胞が分離され、ＲＴ−ＰＣＲ分析、及びウェスタンブロット分析により、ネズミ科ＨＢＰ類似体の存在が実証された。ヒトＨＢＰ配列由来のプライマーセットを用いて、骨髄細胞から調製したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。ヒトＨＢＰに対する抗体で免疫染色を行ったヒトＨＰＢ、及びネズミ科骨髄溶解物を電気泳動した後、ウェスタンブロット検出を行った。次いで、麻酔したマウスで一連の動物実験を行った。３匹のマウスにＭ１タンパク質を静脈注射し（１匹当たり１５μｇ）、３匹にはＭ１タンパク質（１匹当たり１５μｇ）及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１匹当たり４００μｇ）の混合物、３匹にはＭ１タンパク質（１匹当たり１５μｇ）及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１匹当たり４００μｇ）の混合物、及び３匹には媒体のみを処置した。投与３０分後、Ｍ１タンパク質、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとを注射したマウスの呼吸に、他のマウスに比べて明らかな影響があった。動物を屠殺して肺を摘出し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡に供するか、又は走査型電子顕微鏡で分析した。緩衝液のみを注射したマウス由来の典型的な肺のサンプルは、無傷の肺の組織を示していた。一方、Ｍ１タンパク質を注射したマウス由来の肺の切片からは、重篤な出血及び組織の破壊が実証された。これらの病変は、Ｍ１タンパク質をＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏと一緒に注射した場合に、継続する炎症反応の徴候である僅かな腫脹が組織に残っていたものの、殆ど完全に防止されていた。対照的に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを適用しても、Ｍ１タンパク質が誘導する出血及び組織の破壊を防止することはできなかった。Ｈタンパク質を対照として注射して肺組織を分析しても、出血は見られず肺胞炎の腫脹も少ない様子だった。より高倍率で肺の病変を分析するために、組織切片を走査型電子顕微鏡で分析した。ＰＢＳで処置したマウス由来の肺切片には、いかなる肺損傷の徴候は見られなかった。しかし、Ｍ１タンパク質の注射により、先にも見られたように赤血球が重度に漏出しただけでなく、タンパク質の凝集物が析出する結果となった。凝集物の形態は、先に見られたＭ１タンパク質が誘導する無定形の血漿沈殿に類似していた。Ｍ１タンパク質及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを注射したマウスの肺には、凝集物は含まれなかった。しかし、肺胞が幾分腫脹し、赤血球が軽度に漏出しているのが観察され、炎症反応をほのめかしていた。対照に、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏで処置しても、Ｍ１タンパク質が引き起こす肺の損傷に影響を及ぼさなかった。Ｈタンパク質を注射しても、重度の出血を引き起こさず、組織がひどく炎症を起こした様子もなかった。
【０１０１】
肺の障害の程度を定量するために、これら１２匹の動物の各々から肺組織切片を無作為に６個選び、電子顕微鏡で分析し、肺の総面積に対するタンパク質凝集物を含む肺の面積を測定した。緩衝液のみ、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとを注射した動物の肺組織で、タンパク質凝集物が含まれていたのは、１０％未満であった（それぞれ、３±１％、及び６±２％）。対照に、Ｍ１タンパク質、又はＭ１タンパク質とＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドとの混合物で処置した動物の肺の９０％に、タンパク質の凝集物が含まれていた（両方の場合とも、９０±２％）。これらの動物実験より、Ｍ１タンパク質−フィブリノーゲン凝集物は、β２インテグリンを介してＰＭＮを活性化し、結果として重度に血管漏出し、肺組織においてタンパク凝集物が析出することが示唆される。この結果は、フィブリノーゲンが誘発するβ２インテグリンのクロスリンクをＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドが防ぐことで、この病態生理学的作用が阻止できることも示している。
【０１０２】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＰｒｏはＭ１タンパク質発現ストレプトコッカスパイオゲンスに感染したマウスの血管漏出及び肺の損傷を防止する
第２シリーズの動物実験では、Ｍ１タンパク質発現ストレプトコッカスパイオゲンスを９匹のマウスに皮下注射して感染させた。材料と方法に記載したように、各グループ３匹のマウスを、それぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド、及びＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチドで処置したが、３匹のマウスは処置しかった。対照として、３匹のマウスにＰＢＳを皮下注射した。注射６時間後、動物を屠殺し、肺を摘出して、走査型電子顕微鏡で検査した。動物から採取した血液サンプルを分析したところ、連鎖球菌は現れていなかったことが判明し、細菌が感染部位から拡散を開始していなかったことを示していた。これらの動物から取った代表的な肺組織切片の電子顕微鏡写真を得た。細菌の代わりに緩衝液を与えたマウスから回収した肺は、肺損傷の徴候を示していなかった。一方、連鎖球菌に感染したマウスは、広範囲の赤血球浸潤、及びフィブリンの析出に示される重度の肺の病変を被っていた。感染した動物をＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏで処置すると、肺の障害はかなり少なく見受けられたが、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの処置では、肺の損傷を防ぐことはできなかった。連鎖球菌に感染したマウス由来の肺を、Ｍ１タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色電子顕微鏡でさらに分析した。浸潤された沈殿にＭ１タンパク質が見られることが、この分析で示された。対照に、非感染の動物由来の肺を検査したところＭ１タンパク質が染色されたものは観察されなかった。総合すると、感染モデルでは、細菌が拡散し感染した動物の肺に堆積する沈殿を形成するより前に、脱落したＭ１タンパク質が循環中に見られることが、これらの結果から示唆される。
【０１０３】
連鎖球菌毒素性ショック症候群、及び壊疽性筋膜炎の患者に、Ｍ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿が形成される
ＳＴＳＳは、連鎖球菌感染症から重篤な合併症を成し、高い罹患率、及び高い致死率と関連付けられる（再考には、（Ｓｔｅｖｅｎｓ、２００３年、Ｃｕｒｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｒｅｐ、５巻、３７９〜３８６頁）を参照されたい）。ＳＴＳＳの臨床上の徴候は、激痛、四肢の紅斑、低血圧、発熱、柔組織の腫脹、及び呼吸器機能不全である（Ｓｔｅｖｅｎｓ、２０００年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ、５１巻、２７１〜２８８頁）。これらの症状のいくつかはＭ１タンパク質とフィブリノーゲンとの相互作用、及びそれに続くＨＢＰの放出により引き起こされる可能性があるということを我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのデータは意味するため、Ｍ１タンパク質を発現するＭ１Ｔ１株感染で起こったＳＴＳＳ壊疽性筋膜炎に罹患する患者から取った組織切片を分析した。組織切片を薄片に切断し、固定し、Ｍ１タンパク質及びフィブリノーゲン用に染色し、ヒトフィブリノーゲン及びＭ１タンパク質に対する抗体を用いて共焦点免疫蛍光顕微鏡法で（材料と方法に記載したとおりに）検査した。顕微鏡写真では、感染の中心（即ち、筋膜）にこの領域で容易に検出されるＭ１タンパク質と共に大量の連鎖球菌が明らかに見られた。Ｍ１タンパク質の中には、細菌に関連することが見出されたものもあるが、大半のタンパク質は連鎖球菌の表面から放出されていた。Ｍ１タンパク質は、細菌の負荷がないか、又は大変少ない末端の領域からは生検では検出されないため、非特異性の染色は除外した。重要なことには、感染の局所部位では、脱落したＭ１タンパク質がフィブリノーゲンと共に強力に共存しており、炎症の経過中に産生され放出されたＭ１タンパク質の量は、フィブリノーゲンと共に沈殿を形成するのに十分だったことを実証していた。総合すると、これらの結果より、ＳＴＳＳ壊疽性筋膜炎に罹患する患者で、細菌の表面からＭ１タンパク質が放出され、それに続いてＭ１タンパク質／フィブリノーゲン沈殿を形成することにより、重要な毒性の機序を示す強力な証拠が提供される。
【０１０４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ヒト血液におけるＨＢＰの放出を示す図である。パネルＡ：ヒト血液を、Ｍ１タンパク質、Ｈタンパク質、ＳｐｅＢ、ＳＩＣタンパク質、ｆＭＬＰ、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はヒアルロン酸（ＨＡ）と、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレットにし、上清のＨＢＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。細胞をトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で溶解して血中のＨＢＰの総量を測定し、刺激を与えずに３７℃で３０分間インキュベートした後放出されたＨＢＰの量をバックグラウンドとみなした。この図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＢ：ヒト血液を、Ｍ１タンパク質、Ｍ１タンパク質のＡ−Ｓ及びＳ−Ｃ３フラグメント（上部に略図を示した）、又はＨタンパク質で３７℃で３０分間刺激を与えた。細胞をペレットにし、上清のＨＢＰ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＣ：ＡＰ１及びＭＣ２５株の一夜培養物の上清を連続希釈したもの、又は増殖培地のみをヒト血液に添加し、ＨＢＰの放出を測定した。
【図２】ヒト血液における、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出の阻害を示す図である。ヒト血液を、Ｍ１タンパク質（１μｇ／１ｍＭ）の存在下、又は存在なしに、ｔＢｏｃ（１００μＭ）、百日咳毒素（１μｇ／１ｍＭ）、ゲニステイン（１００μＭ）、ワートマニン（０．２μＭ）、ＢＡＰＴＡＭ／ＥＧＴＡ（１０μｇ／１ｍＭ）、ＥＧＴＡ（１ｍＭ）、ＡＧ１４７８（２μＭ）、ＧＦ１０９２０３（２μＭ）、Ｈ−８９（１μＭ）、ＰＤ９８０５９（２０μＭ）、又はＵ−７３１２２（１０μＭ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果は、阻害物質の存在なしで放出されるＨＢＰ（１００％）に対する、阻害物質の存在下で放出されるＨＢＰのパーセントで表した。図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図３】Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出が、Ｍ１タンパク質が誘導する血漿タンパク質の沈殿と相関があることを示す図である。パネルＡ：１０％ヒト血漿ＰＢＳ溶液のサンプル（１ｍｌ）を、非ラベルのＭタンパク質の存在下（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌ）又は存在なしに、１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質（１０５ｃｐｍ／ｍｌ、約１ｎｇ）と共に、３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルを遠心分離し、ペレットの放射能を測定した。結果は、添加した全放射能のパーセントとして表し、図は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。パネルＢ：ヒト全血をＭ１タンパク質（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び１０μｇ／ｍｌ）で、３７℃で３０分間処理した。細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰの量を測定した。パネルＣ：ヒト血漿（１０％ＰＢＳ溶液）又はフィブリノーゲン（３００μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）のサンプル１ｍｌを、非ラベルのＭ１タンパク質の存在下（０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、若しくは１０μｇ／ｍｌ）又は存在なしに１２５Ｉ−Ｍ１タンパク質（１０５ｃｐｍ／ｍｌ、約１ｎｇ）と共にインキュベートした。３７℃で３０分インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、ペレットの放射能を測定した。結果は、全放射能のパーセントで表してある。数値は、３つの実験を独立してそれぞれ２回ずつ行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図４】フィブリノーゲン溶液中又は血漿中に形成されたＭ１タンパク質が誘導する沈殿が、ＨＢＰの放出を引き起こすことを示す図である。１０％ヒト血漿又はフィブリノーゲン（３００μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液に、Ｍ１タンパク質（１μｇ／ｍｌ）を３０分間加えた。遠心分離後、得られたペレットを再懸濁してＰＢＳで希釈した１０％ヒト血液と共に３０分間インキュベートし、続いて、放出されたＨＢＰを測定した。Ｍ１タンパク質を添加しない血漿又はフィブリノーゲン溶液を同様に処理し、陰性対照とした。図は、４つの独立して行った実験の平均値±標準偏差を表している。
【図５】フィブリノーゲンに由来するペプチド及びＣＤ１８に対する抗体が、Ｍ１タンパク質が誘導するＨＢＰの放出を阻害することを示す図である。パネルＡ：ヒト血漿を、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏペプチド（１００μｇ／ｍｌ）、又は緩衝液のみと共に、３７℃で１５分間インキュベートした。トロンビンを添加して凝固を開始させ、凝固時間を測定した。パネルＢ：ヒト全血（１μｇ／ｍｌ）にＭ１タンパク質を添加し、次いでＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、ＣＤ１８に対するｍＡＢＩＢ４抗体、又はＡＳ８８抗体（ヒトＨ−キニノゲンに対する）を様々な量添加した。３７℃で３０分インキュベート後、細胞を遠心分離し、上清のＨＢＰ量を測定した。データは、Ｍ１タンパク質のみが誘導したＨＢＰの放出のパーセントとして表し、棒グラフは、３つの実験をそれぞれ２回ずつ行った平均値±標準偏差を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で、接触させること、及び
（ｅ）試験物質が、成分間の相互作用を阻害するか否かを確認することを含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法。
【請求項２】
抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、フィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で、接触させること、及び
（ｅ）ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすることを含み、
それによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フィブリノーゲン、及びＰＭＮを試験物質の存在下で接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＭＮの活性化の阻害が、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出の測定によりモニターされる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の成分が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）をプロテアーゼと接触させることにより供給される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼがＰＭＮ由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼがストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）内因性である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記連鎖球菌のＭタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭ１タンパク質であるか、フィブリノーゲンと複合体を構成する能力を維持するその同族体であるか、又はフィブリノーゲンと複合体を形成する能力を維持するそれらのいずれかの機能的変異体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的変異体が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭ１タンパク質のフラグメントであるか、その同族体のフラグメントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）が、試験物質の存在下で前記成分が凝集物を形成するか否かを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン及びその機能性変異体、並びにβ２インテグリン又はその機能性変異体、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体
を含むテストキット。
【請求項１２】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及びＰＭＮ、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）１つ又は複数のＰＭＮ
を含むテストキット。
【請求項１３】
１つ又は複数の緩衝液をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のテストキット。
【請求項１４】
試験物質が、成分間の相互作用をかく乱するか否かを決定する手段をさらに含む、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のテストキット。
【請求項１５】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により同定される、抗連鎖球菌物質。
【請求項１６】
ヒト又は動物の身体の治療による処置方法に用いる、請求項１５に記載の抗連鎖球菌物質。
【請求項１７】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、インテグリン拮抗物質の使用。
【請求項１８】
前記拮抗物質が、抗インテグリン抗体、ペプチド類似体、又は非ペプチド類似体である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質の使用。
【請求項２０】
前記阻害物質がＧＰＲＰ配列を含むペプチドである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記阻害物質が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１タンパク質のＢ反復に特異的に結合する抗体である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により確認された物質の使用。
【請求項２３】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により確認された治療上有効な量の物質を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２４】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、インテグリン拮抗物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２５】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により同定確認された、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質、並びに薬学的に許容された基剤又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２７】
薬剤組成物を提供する方法であって、
（ａ）請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用を阻害する物質を確認すること、並びに
（ｂ）このようにして確認された阻害物質を、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に処方すること
を含む方法。
【請求項２８】
連鎖球菌感染症に罹患する個体を処置する方法であって、
（ａ）請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用を阻害する物質を同定すること、並びに
（ｂ）前記個体に、このようにして確認された、治療上有効な量の阻害物質を投与すること
を含む方法。
【請求項１】
抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で、接触させること、及び
（ｅ）試験物質が、成分間の相互作用を阻害するか否かを確認することを含み、
これらによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法。
【請求項２】
抗連鎖球菌物質を確認する方法であって、
（ａ）第１の成分として、連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体を提供すること、
（ｂ）第２の成分として、フィブリノーゲン又はその機能性変異体を提供すること、
（ｃ）第３の成分として、１つ又は複数の多形核好中球（ＰＭＮ）を提供すること、
（ｄ）前記成分を試験物質と、試験物質の存在なしに該成分が相互作用できる条件下で、接触させること、及び
（ｅ）ＰＭＮの活性化のあらゆる阻害をモニターすることを含み、
それによって、試験物質が抗連鎖球菌物質であるか否かを決定する方法。
【請求項３】
ステップ（ｄ）が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、フィブリノーゲン、及びＰＭＮを試験物質の存在下で接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＭＮの活性化の阻害が、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）の放出の測定によりモニターされる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の成分が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）をプロテアーゼと接触させることにより供給される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼがＰＭＮ由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼがストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）内因性である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記連鎖球菌のＭタンパク質が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭ１タンパク質であるか、フィブリノーゲンと複合体を構成する能力を維持するその同族体であるか、又はフィブリノーゲンと複合体を形成する能力を維持するそれらのいずれかの機能的変異体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的変異体が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭ１タンパク質のフラグメントであるか、その同族体のフラグメントである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）が、試験物質の存在下で前記成分が凝集物を形成するか否かを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン及びその機能性変異体、並びにβ２インテグリン又はその機能性変異体、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）分離された連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）分離されたフィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）分離されたβ２インテグリン又はその機能性変異体
を含むテストキット。
【請求項１２】
連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及びＰＭＮ、の間の相互作用を阻害することのできる試験物質を確認する使用に適したテストキットであって、
（ａ）連鎖球菌のＭタンパク質又はその機能性変異体、
（ｂ）フィブリノーゲン又はその機能性変異体、及び
（ｃ）１つ又は複数のＰＭＮ
を含むテストキット。
【請求項１３】
１つ又は複数の緩衝液をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のテストキット。
【請求項１４】
試験物質が、成分間の相互作用をかく乱するか否かを決定する手段をさらに含む、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のテストキット。
【請求項１５】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により同定される、抗連鎖球菌物質。
【請求項１６】
ヒト又は動物の身体の治療による処置方法に用いる、請求項１５に記載の抗連鎖球菌物質。
【請求項１７】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、インテグリン拮抗物質の使用。
【請求項１８】
前記拮抗物質が、抗インテグリン抗体、ペプチド類似体、又は非ペプチド類似体である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質の使用。
【請求項２０】
前記阻害物質がＧＰＲＰ配列を含むペプチドである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記阻害物質が、ストレプトコッカスパイオゲンス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１タンパク質のＢ反復に特異的に結合する抗体である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
連鎖球菌感染症の治療用薬物の製造における、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により確認された物質の使用。
【請求項２３】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により確認された治療上有効な量の物質を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２４】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、インテグリン拮抗物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２５】
連鎖球菌感染症に罹患する個体の治療方法であって、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用の阻害物質の治療上有効な量を前記個体に投与することを含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により同定確認された、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用の阻害物質、並びに薬学的に許容された基剤又は希釈剤を含む薬剤組成物。
【請求項２７】
薬剤組成物を提供する方法であって、
（ａ）請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリン間の相互作用を阻害する物質を確認すること、並びに
（ｂ）このようにして確認された阻害物質を、薬学的に許容された基剤又は希釈剤と共に処方すること
を含む方法。
【請求項２８】
連鎖球菌感染症に罹患する個体を処置する方法であって、
（ａ）請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法により、連鎖球菌のＭタンパク質、フィブリノーゲン、及びβ２インテグリンの間の相互作用を阻害する物質を同定すること、並びに
（ｂ）前記個体に、このようにして確認された、治療上有効な量の阻害物質を投与すること
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５３５６５４（Ｐ２００７−５３５６５４Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５２８６（Ｐ２００６−５０５２８６）
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４６８
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５０５３９３４７４）ハンサ メディカル アクチボラゲット (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４４２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４６８
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（５０５３９３４７４）ハンサ メディカル アクチボラゲット (3)
【Ｆターム（参考）】
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