抗Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体およびその使用
本発明は、赤血球凝集素に結合しＡ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプおよびグループ２サブタイプを中和する、抗体およびその抗原結合断片に関する。また、本発明は、かかる抗体および抗体断片をコードする核酸と、かかる抗体および抗体断片を産生する不死化Ｂ細胞および培養された単一血漿細胞と、かかる抗体および抗体断片に結合するエピトープと、にも関する。さらに、本発明は、スクリーニング方法、ならびにＡ型インフルエンザウイルス感染の診断、治療、および予防における、該抗体、抗体断片、およびエピトープの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ２００８年７月２５日および２００９年５月２７日に出願された、米国仮出願第６１／０８３，８３８号および第６１／１８１，５８２号の優先権の利益を主張し、それらの開示は、参照することにより、それらの全体が本明細書に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルスに対する中和抗体応答は、所与のウイルスサブタイプに対して特異的であると考えられている。赤血球凝集素（ＨＡ）によって定義される、１６個のＡ型インフルエンザサブタイプがある。この１６個のＨＡ、つまりＨ１〜Ｈ１６は、２つのグループに分類することができる。グループ１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、およびＨ１６のサブタイプからなり、グループ２には、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５のサブタイプが含まれる。トリには全てのサブタイプが存在するが、ヒトではほとんどＨ１、Ｈ２、およびＨ３のサブタイプが疾患を生じさせる。Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９のサブタイプは、ヒトにおいて孤発型の重度の感染を生じさせており、新たな世界的流行を発生し得る。Ｈ１およびＨ３ウイルスは絶え間なく進化して新たな変異体を生成する（抗原連続変異と呼ばれる現象）。その結果、過去のウイルスに応答して産生された抗体は、新たな連続変異ウイルスに対する防御が乏しいか、または全くない。その結果、出現することが予測されるＨ１およびＨ３ウイルスに対する新たなワクチンを毎年産生しなければならず、このプロセスは非常に費用がかかり、また常に効率的であるとは限らない。Ｈ５インフルエンザワクチンの産生にも同様のことが当てはまる。実際、ベトナムまたはインドネシアのＡ型インフルエンザウイルス分離株に基づく現在のＨ５ワクチンが、将来のＨ５ウイルスの世界的流行を防御するかどうかは、定かではない。
【０００３】
これらの理由から、全てのＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ、ならびにそれらの例年の変異体を中和することができる、広範に中和する抗体を誘発するワクチンを有することが非常に望ましいであろう（Ｇｅｒｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００６により概説）。さらに、広範に中和するヘテロサブタイプ抗体は、予防的または治療的設定において使用され得る。
【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスを認識する抗体は、特徴付けられている。Ｍ２（感染細胞上には発現するが、感染性ウイルス上には発現しない不変の低分子タンパク質）に対する抗体は、おそらく感染細胞をＮＫ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞による破壊の標的とすることによって、生体内で何らかの防御効果を示している。しかし、ＨＡが中和抗体の主要な標的である。それは宿主由来の酵素によって切断されて、ジスルフィド結合によって結合されたままである２つのポリペプチドを生成する、約５００個のアミノ酸の大きな外部ドメインからなる。より大きなＮ末端断片（ＨＡ１、３２０−３３０個のアミノ酸）は、受容体結合部位およびウイルス中和抗体によって認識されるほとんどの決定因子を含有する、膜遠位球状ドメインを形成する。より小さなＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０個のアミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜またはウイルス膜に固定するステム様構造を形成する。サブタイプ間の配列相同性の程度は、ＨＡ２ポリペプチド（５１％〜８０％の相同性）においてよりも、ＨＡ１ポリペプチド（サブタイプ間で３４％〜５９％の相同性）においての方が小さい。最も保存された領域は、切断部位周辺、特に融合ペプチドと称されるＨＡ２のＮ末端の１１個のアミノ酸の配列であり、これは、全てのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプの間で保存される。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡＯ）内で表面ループとして曝露されるが、ＨＡＯがＨＡ１／ＨＡ２に切断されるとアクセス不可能になる。要約すれば、異なるＨＡサブタイプ間、特にＨＡ１−ＨＡ２接合領域およびＨＡ２領域において、保存される領域が存在する。しかしながら、これらの領域は、中和抗体にはアクセスされにくい可能性がある。
【０００５】
２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和させる抗体を識別することにはあまり成功しておらず、それらの中和の幅は限られており、それらの力価は低い。Ｏｋｕｎｏらは、インフルエンザウイルスＡ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）でマウスを免疫化し、ＨＡ２の保存されている立体構造エピトープに結合し、動物モデルにおいて生体内および生体外でグループ１のＨ２、Ｈ１、およびＨ５サブタイプのＡ型インフルエンザウイルスを中和するモノクローナル抗体（Ｃ１７９）を単離した（Ｏｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００６】
近年、Ｇｉｏｉａらは、従来の季節性インフルエンザワクチンを受けた数人の血清中におけるＨ５Ｎ１ウイルス中和抗体の存在について記載した（Ｇｉｏｉａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。著者らは、その中和活性はノイラミニダーゼ（Ｎ１）に対する抗体のためであると示唆している。しかしながら、モノクローナル抗体は単離されておらず、標的エピトープも特徴付けられなかった。血清抗体が他のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和し得るかは明らかではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
数十年におよぶ研究にもかかわらず、Ａ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和または抑制するか、またはＡ型インフルエンザウイルスに起因する疾患を低減させる、市販の抗体は存在しない。したがって、複数のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプに対して保護する新規抗体を特定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＨＡと結合し、２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプの感染を中和する自然発生のヒトモノクローナル抗体による季節性インフルエンザワクチンを接種された人からの単離物、および本発明における抗体が結合する新規エピトープに一部基づく。したがって、本発明の１つの態様では、本発明は、グループ１およびグループ２のサブタイプから選択される２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプへの感染を中和させる抗体および抗原結合断片を含む。
【０００９】
本発明の一実施形態において、本発明は、グループ１およびグループ２のサブタイプであるＡ型インフルエンザ感染を中和する抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の別の実施形態において、本発明は、配列番号１〜６または１７〜２２うちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２または配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。
【００１１】
本発明のまた別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域、または配列番号３３のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２９のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、該抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する。本発明はさらに、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＦＩ６変異体１またはＦＩ６変異体２である。
【００１２】
本発明のまた別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルスにおけるグループ１およびグループ２のサブタイプへの感染を中和し、該抗体またはその断片は、不死化Ｂ細胞クローンにより発現される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。さらに別の態様において、本発明は、本発明における核酸分子を含むベクター、または本発明における抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞を含む。また別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、本発明の核酸分子、または本発明の核酸分子を含むベクター、本発明の抗体または抗体断片を発現する細胞、または本発明の免疫原性ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体と、を含む、医薬組成物をさらに含む。本発明はまた、第１の抗体またはその抗原結合断片と、第２の抗体またはその抗原結合断片と、を含む医薬組成物を含み、該第１の抗体は本発明の抗体であり、該第２の抗体はＡ型インフルエンザ感染を中和する抗体または抗原結合断片である。
【００１５】
（ｉ）Ａ型インフルエンザ感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザ感染の診断における、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、本発明の核酸、本発明の核酸を含むベクター、本発明のベクターを含む細胞、本発明の抗体またはその抗体断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原生ポリペチド、または本発明の医薬組成物の使用は、本発明の範囲内であることが企図される。さらに、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用であって、該ワクチンの抗原が正しい立体構造の特定のエピトープを含有していることを確認することにより、Ａ型インフルエンザのワクチンの品質を監視するための使用も、本発明の範囲内であることが企図される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の減少、またはＡ型インフルエンザウイルス感染への危険性の低下の１つの方法を含み、その方法は、それらを必要とする対象に本発明の抗体または抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）治療における、（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉｉ）ワクチンとしての、または（ｉｖ）Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおける、使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するエピトープを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、季節性Ａ型インフルエンザワクチンを接種された人からの、広範でＡ型インフルエンザウイルスの異なるサブタイプを中和する自然発生のヒト抗体および本発明の抗体が結合する新規エピトープ、の発見および単離に一部基づいている。少数または１つの抗体のみがＡ型インフルエンザウイルスを中和するために必要であるため、そういった抗体が望ましい。また、そういった抗体によって認識されるエピトープは、広範で季節性および世界的流行候補株である異なるサブタイプに対する保護を誘発するワクチンの一部であり得る。
【００１９】
したがって、一態様において、本発明は、グループ１およびグループ２における少なくとも２つのＡ型インフルエンザを中和する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片はＡ型インフルエンザのグループ１およびグループ２のサブタイプへの感染を中和する。
【００２０】
本発明における別の態様としては、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプのＨＡに対して広範の特異性を保持する、中和抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存されるＨＡのステム領域内においてエピトープと特異的に結合する。別の実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号３７、３８、３９、または４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２１】
ヒトモノクローナル抗体，不死化されたＢ細胞クローンまたは本発明の抗体を分泌するトランスフェクトされた宿主細胞、および本発明の抗体をコードする核酸もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される、「抗原結合断片」、「断片」、および「抗体断片」という用語は、抗体の抗原結合活性を保持する本発明の抗体のいずれの断片をも意味するために同義に使用される。例示的な抗体断片は、これらに限定されないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体およびその抗原結合断片の双方を含む。
【００２３】
本明細書で使用される「広範囲な特異性」という用語は、Ａ型インフルエンザウイルスの１つ以上のグループ１サブタイプおよび１つ以上のグループ２サブタイプと結合および／または中和する本発明の抗体または抗原結合断片を意味するために使用される。
【００２４】
本明細書で使用される「中和抗体」という用語は、病原体が宿主において感染を開始／および持続させる能力を中和する、すなわち、それらの予防、阻止、低減、遅延、または妨害する抗体である。本明細書で使用される「中和抗体」および「中和する抗体」という用語は、本明細書において同義に使用される。これらの抗体は、適切な処方で、予防薬もしくは治療薬として、能動ワクチン接種と対合して、または本明細書に記載されるような診断ツールまたは生成ツールとして、単独または組み合わせて使用することができる。
【００２５】
本発明の抗体または抗原結合断片は、グループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、およびＨ１６およびそれらの変異体）の１つ以上のＡ型インフルエンザウイルス、およびグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５およびそれら変異体）サブタイプの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスを中和する。一実施形態において、例示的なグループ１サブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、およびＨ９を含み、また、例示的なグループ２サブタイプはＨ３ およびＨ７を含む。
【００２６】
本発明の抗体および抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプの様々な組み合わせを中和する能力を持つ。一実施形態において、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１およびＨ３サブタイプ、またはＨ２およびＨ３サブタイプ、またはＨ３およびＨ５サブタイプ、またはＨ３およびＨ９サブタイプ、またはＨ１およびＨ７サブタイプ、またはＨ２およびＨ７サブタイプ、またはＨ５およびＨ７サブタイプ、またはＨ７およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２およびＨ３サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３およびＨ５サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２８】
さらに別の実施形態においては、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプを中和することができる。さらに別の実施形態においては、本発明の抗体および抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ６サブタイプを中和することに加え、１つ以上の上記の組み合わせを中和する。
【００３０】
本発明の抗体および抗原結合断片は、高中和能力を有する。Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる本発明の抗体の濃度は、例えば約５０μｇ／ｍｌまたはそれ以下となり得る。一実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる本発明の抗体濃度は、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１７．５、１５、１２．５、１１、１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌ以下である。別の実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる、本発明の抗体の濃度は、約０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００８、０．００６、０．００４、０．００３、０．００２μｇ／ｍｌまたは約０．００１μｇ／ｍｌ以下である。これは、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに、低濃度の抗体しか必要とされないことを意味する。特異性および力価は、当業者に知られている標準的な中和アッセイを使用して測定することができる。
【００３１】
本発明の抗体
本発明は、特にＨＡに対し広範な特異性を有し、グループ１からの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプおよびグループ２からの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和する抗体を提供する。本発明の抗体は、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存されるＨＡ領域においてエピトープと結合する。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１およびグループ２サブタイプのＨＡステム領域内において保存されたエピトープと結合し、ウイルス複製または拡散を妨害する抗体、例えば、単離された抗体または精製された抗体、を提供する。本発明はまた、サブタイプグループ１およびグループ２におけるＨＡステム領域内で、保存されたエピトープと特異的に結合し、細胞へのウイルス侵入を阻止する抗体、例えば、単離された抗体または精製された抗体、を提供する。いずれの理論にも束縛されるものではないが、１つの例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのステム領域において保存されたエピトープに結合し、融合ステップの阻害により細胞へのウイルス侵入を阻止する。エピトープまたはタンパク質の抗原決定因子は、抗体の結合部位（またはパラトープ）により、特異的に識別さる分子部分に対応する。したがって、エピトープは、それらの操作認識のために、相補的パラトープを要する関連実体である。タンパク質の異なる変異体間で保存されているエピトープは、同じパラトープが、これらの異なる変異体を、分子の同部との接触により特異的に認識することを意味する。
【００３３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。本発明はまた、本発明の抗体の断片、特に、抗体の抗原結合活性を保持する断片を提供する。特許請求の範囲を含む本明細書は、いくつかの箇所において、抗原結合断片（複数可）、抗体断片（複数可）、変異体（複数可）および／または抗体の誘導体（複数可）について明示的に言及する場合があるが、「抗体」または「本発明の抗体」という用語は、すべての分類の抗体、すなわち、抗体断片（複数可）、抗体断片（複数可）、変異体（複数可）、および抗体の誘導体（複数可）を含むことを理解されたい。
【００３４】
一実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、グループ１およびグループ２の、２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプの組み合わせを中和する。例示的なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプは、これらに限定されないが、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）、Ｈ１Ｎｌ（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、Ｈ１Ｎｌ（Ａ／Ｓａｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６）、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／０３）およびＨ９Ｎ２（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７）を含む。別の実施形態においては、抗体は、３、４、５、６、７、またはそれより多いＡ型インフルエンザウイルスサブタイプグループ１およびグループ２の組み合わせを中和する、および／またはそれらに特異的である。
【００３５】
例示的実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプＨ１およびＨ３（例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）；またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２）に特異的な抗体またはそれらの抗体断片を含む。さらに別の実施形態においては、抗体またはそれらの抗体断片は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９（例えば、ＨＩＮｌ、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２）に対し、特異的である。他の例示的Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプの組み合わせは、本出願で前記されている。
【００３６】
例示的本発明の抗体における、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号および、それらをコードする核酸配列の配列番号は、表１に列記される。
【００３７】
【表１】
【００３８】
一実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１３、３３、２９または３５のいずれかに記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるアミノ酸配列番号を有する重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１４または３０に記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体における重鎖可変領域は、配列番号１５、３４、３１または３６のいずれかに記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である配列を有する核酸によってコードされ得る。別の実施形態においては、本発明の抗体における軽鎖可変領域は、配列番号１６または３２に記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である配列を有する核酸にコードされ得る。
【００４０】
抗体重鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として言及される。同様に、抗体軽鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として言及される。ＣＤＲのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ番号付け体系にしたがって次のように定義される、ＣＤＲ１-ＩＭＧＴは位置２７から３８、ＣＤＲ２-ＩＭＧＴの位置は５６から６５およびＣＤＲ３-ＩＭＧＴの位置は１０５から１１７である。
【００４１】
表２は、本発明の例示的な抗体の重鎖と軽鎖の６つのＣＤＲのアミノ酸配列における配列番号をそれぞれ提供する。
【００４２】
【表２】
【００４３】
一実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１〜６または１７〜２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を伴う、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１、またはＦＩ２８変異体２からの１つ以上（すなわち、１つ、２つ、または３つ全て）の重鎖ＣＤＲを含有する重鎖を含有する抗体を提供する。例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号１７または配列番号１のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８または配列番号２のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９または配列番号３のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、本明細書に提供されている抗体または抗体断片は、重鎖を含み、重鎖は（ｉ）配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３、または（ｉｉ）配列番号１７のＣＤＲＨ１、配列番号１８のＣＤＲＨ２および配列番号１９のＣＤＲＨ３を含む。
【００４５】
ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１、またはＦＩ２８変異体２からの１つ以上（すなわち、１つ、２つ、または３つ全て）の軽鎖ＣＤＲを含有する軽鎖を含有する抗体もまた提供される。例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ３と、を含む。ある実施形態において、本明細書に提供されている抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は、（ｉ）配列番号４のＣＤＲＬｌ、配列番号５のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３、または（ｉｉ）配列番号２０のＣＤＲＬｌ、配列番号２１のＣＤＲＬ２および配列番号２のＣＤＲＬ３、を含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ６変異体１のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ６変異体２のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ２８変異体１のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。さらなる別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ２８変異体２のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。
【００４７】
本発明の例示的抗体は、これらに制限されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１またはＦＩ２８変異体２を含む。
【００４８】
本発明は、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体、またはその断片、または本発明の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片、をさらに含む。本発明の抗体はまた、本発明の抗体からの１つ以上のＣＤＲと、同じエピトープに対する別の抗体からの１つ以上のＣＤＲとを含む、ハイブリッド抗体分子を含む。一実施形態において、かかるハイブリッド抗体は、本発明の抗体からの３つのＣＤＲと、同じエピトープに対する別の抗体からの３つのＣＤＲとを含む。例示的なハイブリッド抗体は、ｉ）本発明の抗体からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび同じエピトープに対する別の抗体からの３つの重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）本発明の抗体からの３つの重鎖ＣＤＲおよび同じエピトープに対する別の抗体からの３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００４９】
変異抗体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願に記載する配列の変異形もまた本発明の範囲内に含まれる。このような変異形は、免疫応答の最中に生体内で体細胞変異が起こること、または不死化Ｂ細胞クローンの生体外での培養、により生成される天然の変異形を含む。代替として、変異形は、上述した遺伝暗号の縮重によって生じ得るか、または転写もしくは翻訳におけるエラーによって産生され得る。
【００５０】
向上した親和性および／または力価を有する抗体配列のさらなる変異形は、当技術分野において知られている方法を使用して得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸置換を、さらに向上した親和性を持つ抗体を得るために使用することができる。代替として、ヌクレオチド配列のコドン最適化を、抗体を産生するための発現系において翻訳の効率を向上させるために使用することができる。さらに、本発明の核酸配列のうちのいずれかに進化分子工学法を適用することにより、抗体特異性または中和活性のために最適化された配列を含むポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
【００５１】
一実施形態において、変異抗体の配列は、本出願に記載する配列と７０％以上（すなわち、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形態において、かかる配列同一性は、参照配列（すなわち、本出願に示した配列）の全長に関して算出される。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書に参照される同一性の割合（％）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって指定される初期パラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を使用して、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて決定される。
【００５２】
別の態様において、本発明はまた、本発明の抗体の一部または全ての軽鎖および重鎖ならびにＣＤＲをコードする核酸配列も含む。本発明はまた、本発明の例示的抗体の一部または全ての軽鎖および重鎖ならびにＣＤＲをコードする核酸配列も含む。表１は、本発明の例示的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列の配列番号を提供する。例えば、本明細書に提供されている核酸配列は、配列番号１５（ＦＩ６変異体１重鎖可変領域をコードする）、配列番号３４（ＦＩ６変異体２重鎖可変領域をコードする）配列番号１６（ＦＩ６変異体１およびＦＩ６変異体２軽鎖可変領域をコードする）、配列番号３１（ＦＩ２８変異体１重鎖可変領域をコードする）、配列番号３６（ＦＩ２８変異体２重鎖可変領域をコードする）配列番号３２（ＦＩ２８変異体１および変異体２軽鎖可変領域をコードする）。
【００５３】
表３は、本発明の例示的な抗体のＣＤＲへコードする核酸配列の配列番号を提供する。遺伝暗号の冗長性に起因して、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異形が存在するであろう。
【００５４】
【表３】
【００５５】
一実施形態において、本発明に従う核酸配列は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含む。別の実施形態において、本発明の核酸配列は、本発明の抗体の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲをコードする核酸の配列を有する。例えば、本発明に従う核酸配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、３４、２３〜２８、３１、３２、または３６の核酸配列と少なくとも７５％相同である配列を含む。
【００５６】
本発明による核酸配列を含むベクター、例えば、発現ベクターが本発明の範囲内にさらに含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲内に含まれる。かかる細胞の例は、これらに限定されないが、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、または植物細胞を含む。一実施形態において、細胞は哺乳類細胞、例えば、ヒト、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞である。
【００５７】
また、本発明は、これらに限定されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１およびＦＩ２８変異体２から構成される群より選択されるモノクローナル抗体を含む、本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープに結合するモノクローナル抗体にも関する。
【００５８】
モノクローナルおよび組換え抗体は、個々のポリペプチドまたはそれらが向けられる他の抗原の識別および精製に特に有用である。本発明の抗体は、それらが、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において試薬として用いられ得るという点で、付加的な有用性を有する。これらの用途において、抗体は、放射性同位元素、蛍光分子、または酵素等の分析的に検出可能な試薬で標識することができる。また、抗体は、抗原の分子的識別および特徴付け（エピトープマッピング）のためにも使用され得る。
【００５９】
本発明の抗体は、治療部位への送達のために薬物に連結することができるか、またはＡ型インフルエンザウイルスに感染した細胞等の目的の細胞を含む部位の画像化を容易にさせるように、検出可能な標識に連結することができる。薬物および検出可能な標識に抗体を連結するための方法は、当技術分野において知られており、検出可能な標識を使用して画像化するための方法も同様である。標識された抗体は、様々な標識を用いて、様々なアッセイにおいて用いられ得る。本発明の抗体および目的のエピトープ（Ａ型インフルエンザウイルスエピトープ）間の抗体―抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を付着させることによって容易にすることができる。適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光物質、色素原、酵素基質または補助因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用を含む。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールであり、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、ならびに適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等の様々な既知のアッセイにおいて使用され得る。（例えば、米国特許第３，７６６，１６２号、米国特許第３，７９１，９３２号、米国特許第３，８１７，８３号、および米国特許第４，２３３，４０２号を参照のこと）。
【００６０】
本発明による抗体は、細胞毒、治療薬、または放射性金属イオンもしくは放射性同位元素等の治療部分に共役され得る。放射性同位元素の例としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体共役体は、所与の生物学的応答を改変するために使用することができるが、薬物部分は、古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を持つタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素を含み得る。
【００６１】
かかる治療部分を抗体に共役する技術は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ． Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６；ｅｄ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ， Ｍｉｌａｎｏ， Ｉｔａｌｙ，１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照されたい。
【００６２】
代替として、抗体、またはその抗体断片は、米国特許第４，６７６，９８０号記載のように、第２の抗体、またはその抗体断片に共役させて、抗体異種共役体を形成することができる。さらに、リンカーを、標識および本発明の抗体間で使用することができる（例えば、米国特許第４，８３１，１７５号）。抗体、またはその抗原結合断片は、放射性ヨード、インジウム、イットリウム、または当技術分野において既知の他の放射性粒子で直接標識され得る（例えば、米国特許第５，５９５，７２１号）。治療は、同時に投与またはその後投与される共役抗体と非共役抗体の治療の組み合わせから成り得る（例えば、国際公開第５２０３１号、国際公開第５２４７３号）。
【００６３】
本発明の抗体はまた、固体支持体にも付着され得る。さらに、本発明の抗体またはその機能的抗体断片は、ポリマーへの共有結合性共役により化学修飾することで、例えば、循環半減期を増大することができる。ポリマーの例、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号および米国特許第４，６０９，５４６号に示される。いくつかの実施形態におおいて、ポリマーはポリエキシエチレン化されたポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有し、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基等の保護基であることができる。一実施形態において、保護基は、１から８個の炭素を有し得る。さらなる実施形態において、保護基はメチルである。記号ｎは、正の整数である。一実施形態において、ｎは１から１，０００の間である。別の実施形態において、ｎは２から５００の間である。一実施形態においては、ＰＥＧは、１，０００から４０，０００の平均分子量を保持する。さらなる実施形態においては、ＰＥＧは２，０００から２０，０００の平均分子量を保持する。さらなる実施形態においては、ＰＥＧは３，０００から１２，０００の平均分子量を保持する。一実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を保持する。別の実施形態において、ＰＥＧは、末端ヒドロキシ基を有する。さらに別の実施形態において、このヒドロキシル基は、阻害剤の遊離アミノ基と反応するように活性化される末端ヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の型および量は、本発明の共有結合的に共役されたＰＥＧ／抗体を達成するために変化し得ることが理解される。
【００６４】
また、水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等を含む。一実施形態において、ＰＯＧが用いられる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物およびヒトにおいて、モノ−、ジ−、トリグリセリド中に自然に発生する骨格と同じであるため、この分岐は、必ずしも体内において異質の物質であるとは見なされない。いくつかの実施形態において、ＰＯＧは、ＰＥＧと同程度の分子量を有する。循環半減期を増大させるために使用され得る別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８２）、Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）、および（１９８０）に考察される他の薬物送達系は当技術分野において知られており、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（１９８０）およびＰｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）に記載される。
【００６５】
本発明の抗体は、精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、組成物の９０（重量）％未満、通常６０％未満、およびさらに通常５０％未満が他のポリペプチドで構成される。
【００６６】
本発明の抗体は、非ヒト（異種）宿主、例えばマウスにおいて免疫原性であり得る。具体的には、抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主においては免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトが使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等の宿主から容易に単離することができないもの、およびヒト化によって、または異種マウスから概して得ることができないものを含む。
【００６７】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭつまり、α、γまたはμ重鎖）であることができるが、概してＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有し得る。
【００６８】
抗体の産生
本発明による抗体は、当技術分野において知られているいかなる方法でも作成可能である。例えば、ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論が周知である（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，１９７５；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）．一実施形態において、国際公開第２００４／０７６６７７号に記述される代替的なＥＢＶ不死化方法が使用される。
【００６９】
国際公開第２００４／０７６６７７号に記述される方法を使用して、本発明の抗体を産生するＢ細胞は、多クローン性Ｂ細胞活性化因子の存在下においてＥＢＶで形質転換することができる。ＥＢＶによる形質転換は標準的な技術であり、多クローン性Ｂ細胞活性化因子を含むように容易に適合することができる。
【００７０】
細胞増殖および分化の付加的な刺激薬を、任意で、効率をさらに増強させるために形質転換ステップ時に添加することができる。これらの刺激薬は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５等のサイトカインで有り得る。一態様において、不死化効率をさらに向上させるために、不死化ステップの最中にＩＬ−２が添加されるが、その使用は必須ではない。
【００７１】
次いで、これらの方法を使用して産生した不死化Ｂ細胞を、当技術分野において既知の方法を使用して培養し、抗体をそこから単離することができる。
【００７２】
英国特許出願第０８１９３７６．５号に記載されている方法を使用して、マイクロウェル培養プレートにおいて単一血漿細胞を培養することも可能である。抗体は、培養されている単一血漿細胞から単離可能である。さらに、当技術分野において知られている方法を使用して、単一血漿細胞の培養物からＲＮＡを抽出し、単細胞ＰＣＲを行うことができる。抗体のＶＨおよびＶＬ領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定を行い、発現ベクター中にクローン化し、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の宿主細胞中にトランスフェクトする。発現ベクターにおける核酸のクローン化、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクトした宿主細胞の培養、および産生された抗体の単離は、当業者に知られている任意の方法を使用して行うことができる。
【００７３】
抗体は、所望される場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィ等の種々のクロマトグラフ法を使用してさらに精製され得る。製薬等級抗体を産生するための技術を含む、抗体、例えばモノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において知られている。
【００７４】
本発明の抗体の断片は、ペプシンもしくはパパイン等の酵素での消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、抗体から得ることができる。代替として、抗体の断片は、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含み得る。また、本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖から派生する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含し、例えば、本発明は、本発明の抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖または軽鎖単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体ならびに単鎖抗体、例えば、重鎖および軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される一本鎖Ｆｖも含む。
【００７５】
本発明の抗体断片は、単価または多価相互作用を与え、および上記された様々な構造に含有され得る。例えば、ｓｃＦｖ分子は、三価の「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）」または「テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）」を作成する、または合成され得る。ｓｃＦｖ分子は、Ｆｃ領域のドメインを含み得、その結果二価ミニボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）をもたらす。さらに、本発明の配列は、多選択性分子の１つの構成要素で有り得、そこにおいて本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、および他の分子部位が他の標的へ結合する。例示的分子は、これらに限定されないが、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、二重特異性ｓｃＦｖ、および２重特異性抗体（ディアボディ）を含む（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１１２６−１１３６）。
【００７６】
分子生物学の標準的な技術を、本発明の抗体または抗体の断片をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて使用することができる。
【００７７】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子またはその断片をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、および、特にＦｖ断片および単鎖抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖｓ等の抗体断片の発現のために、細菌、例えば大腸菌、および他の微生物系が部分的に使用され得る。真核生物、例えば哺乳類宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の産生のために使用され得る。適切な哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞を含む。
【００７８】
また、本発明は、本発明による抗体分子を産生するための過程も提供し、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で、本発明の核酸にコードするベクターを含む宿主細胞を培養することと、抗体分子を単離することとを含む。
【００７９】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合においては、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、宿主細胞を形質移入するために使用する必要があるだけである。重鎖および軽鎖の両方を含む産物を産生するためには、細胞系は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターを形質移入され得る。代替として、単一のベクターが使用され得、該ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００８０】
代替として、本発明による抗体は、ｉ）細胞内で本発明による核酸配列を発現すること、およびｉｉ）発現された抗体産物を単離することによって産生され得る。加えて、方法は、ｉｉｉ）抗体を精製することを含み得る。
【００８１】
形質転換されたＢ細胞、培養された単一血漿細胞およびトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のスクリーニング
形質転換されたＢ細胞および培養された単一血漿細胞は、所望の特異性または機能を有する抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。
【００８２】
スクリーニングステップは、免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ、組織または細胞（形質移入された細胞を含む）の染色、中和アッセイ、または所望の特異性または機能を識別するための当技術分野において知られている多くの他の方法のうちの１つによって行われ得る。アッセイは、単純抗原認識に基づいて選択し得るか、または、例えば、抗原結合抗体だけではなく中和抗体を選択し、標的細胞の特徴、たとえば、それらのシグナリングカスケード、それらの形、それらの増殖速度、他の細胞に影響するそれらの能力、他の細胞もしくは他の試薬または条件の変化による影響に対するそれらの応答、それらの分化状態等を変化させることができる抗体を選択する等のような、所望の機能にさらに基づいて選択され得る。
【００８３】
個々の形質転換されたＢ細胞クローンは、陽性形質転換されたＢ細胞培養から産出され得る。陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するクローニングステップは、限界希釈法，顕微操作、細胞分類による単細胞沈着、または当技術分野において知られている別の方法を使用して行われ得る。
【００８４】
培養された単一血漿細胞からの核酸は、当技術分野において知られている方法を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内、または、他の宿主細胞内で単離、クローンおよび発現可能である。
【００８５】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、例えば、モノクローナル抗体源として、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）源等として、研究のために等、種々の方法で使用することができる。
【００８６】
本発明は、サブタイプグループ１およびグループ２から選択された、少なくとも２つの異なるＡ型インフルエンザウイルスサブタイプを中和する抗体を産出する、不死化Ｂメモリー細胞または宿主細胞のトランスフェクションを含む組成物を提供する。
【００８７】
エピトープ
上記のように、本発明の抗体は、それらが結合するエピトープをマッピングするために使用することができる。本発明者は、ＨＡに見出されるエピトープに向けられるＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する抗体を発見した。一実施形態において、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプグループ１およびグループ２の間で保存されている、ＨＡのステム領域において１つまたはそれ以上のエピトープに向けられる。本発明の抗体が結合するエピトープは、直線的（連続的）または立体構造的（非連続的）で有り得る。一実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、本明細書で考察されるように配列号３７、３８、３９または４０を含むポリペプチドの領域へ結合する。
【００８８】
本発明の抗体によって認識されるエピトープは、多くの用途があり得る。精製された形態または合成形態でのエピトープおよびそのミモトープは、免疫学的応答を惹起するために（つまり、ワクチンとして、または他の使用のために抗体を産生するため）、またはエピトープもしくはそのミモトープと免役反応する抗体に対して血清をスクリーニングするために使用することができる。一実施形態において、かかるエピトープもしくはミモトープ、またはかかるエピトープもしくはミモトープを含む抗原は、免疫反応を向上させるためのワクチンとして使用され得る。本発明の抗体および抗体断片はまた、ワクチンの品質を監視する方法においても使用することができる。具体的には、抗体は、ワクチン中の抗原が正しい立体構造の正しい免疫原性エピトープを含有していることを確認するために使用することができる。
【００８９】
また、エピトープは、該エピトープに結合するリガンドのスクリーニングにおいても有用であり得る。これらに限定されないが、ラクダ、サメおよび他の種由来の抗体、抗体の断片、ペプチド、ファージディスプレイ技術の産物、アプタマー、アドネクチン、または他のウイルスもしくは細胞タンパク質の断片を含むかかるリガンドは、エピトープをブロックし、したがって感染を予防することができる。このようなリガンドは、本発明の範囲内に包含される。
【００９０】
組換え発現
また、本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞は、その後の組換え発現のための抗体遺伝子のクローニングのために核酸源としても使用し得る。組換え源からの発現は、例えば、安定性、再現性、培養の容易さ等の理由で、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも、医薬目的上より一般的である。
【００９１】
したがって、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された単一血漿細胞から１つ以上の核酸（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を得るステップと、（ｉｉ）該核酸を発現ベクターへ挿入するステップと、（ｉｉｉ）宿主内における目的の抗体の発現を可能にするように、ベクターをトランスフェクトするステップとを含む。
【００９２】
同様に、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された単一血漿細胞から核酸を配列決定するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現宿主内における目的の抗体の発現を可能にするように、その宿主内に挿入するために核酸を調製するステップとを含む。制限酵素部位を導入するため、コドン使用頻度を変更するため、ならびに／または転写および／もしくは翻訳制御配列を最適化するために、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）の間で核酸を操作することができるが、その必要はない。
【００９３】
また、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞を調製する方法を提供し、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするステップを含み、該核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から得た核酸である。したがって、最初に、該核酸を調製し、次いで、宿主細胞をトランスフェクトするためにそれを使用する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９４】
次いで、本発明のこれらの組換え細胞は、発現および培養目的で使用することができる。それらは、大規模の薬剤生産のための抗体の発現に特に有用である。また、それらは、医薬組成物の活性成分としても使用することができる。任意の適切な培養技術を使用することができ、その技術には、静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空糸型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニファーメンター、攪拌槽、マイクロキャリア培養、セラミック中子灌流等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
Ｂ細胞または血漿細胞から免疫グロブリン遺伝子を得る、および配列決定するための方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｉＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００を参照）。
【００９６】
トランスフェクトされた宿主細胞は、酵母および動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ ２００３）またはＨＫＢ−１１（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２００３）細胞等のヒト細胞、骨髄腫細胞（米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第６，３００，１０４号等））、ならびに植物細胞を含む真核細胞であり得る。好適な発現宿主は、特に、それ自体ではヒトにおいて免疫原性ではない糖鎖構造を用いて、本発明の抗体をグリコシル化することができる。一実施形態において、発現宿主細胞は無血清培地で成長することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、動物由来産物が存在しない培養物中で成長することができる。トランスフェクトされた宿主細胞は、細胞系を得るために培養され得る。
【００９７】
本発明は、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を調製するための方法を提供し、（ｉ）本発明により、不死化Ｂ細胞クローンの調製または血漿細胞を培養するステップと、（ｉｉ）目標の抗体をコードする核酸をＢ細胞クローンまたは培養された該単一血漿細胞から得るステップを含む。本発明はまた、目的の抗体をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、（ｉ）本発明により、不死化Ｂ細胞クローンを調製または血漿細胞を培養するステップと、（ｉｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を配列決定するステップと、を含む。
【００９８】
また、本発明は、目的の抗体をコードする核酸分子を調製する方法も提供し、本発明の形質転換Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を得るステップを含む。したがって、最初に、Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞を得、次いで、Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を得る手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９９】
本発明は、（例えば医薬用途のために）抗体を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体を発現する選択したＢ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から１つ以上の核酸（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子）を得るステップおよび／または配列決定するステップと、（ｉｉ）核酸を挿入するか、または核酸を使用して、発現ベクターを調製するステップと、（ｉｉｉ）目的の抗体を発現する宿主細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｖ）目的の抗体が発現される条件下で、トランスフェクトされた宿主細胞を培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）目的の抗体を精製するステップとを含む。
【０１００】
また、本発明は、抗体を調製する方法も提供し、目的の抗体が発現される条件下で、発現宿主細胞集団を培養または継代培養するステップと、任意に、目的の抗体を精製するステップとを含み、該発現宿主細胞集団は、（ｉ）上記のように調製されたＢメモリーリンパ球の集団により産生される目的の抗体を発現する選択したＢ細胞をコードする核酸を提供すること、（ｉｉ）発現ベクター内に核酸を挿入すること、および（ｉｉｉ）該ベクターを目的の抗体を発現することができる該発現宿主細胞内でトランスフェクトすること、（ｉｖ）目的の抗体を産生するために、該挿入した核酸を含むトランスフェクトされた該宿主細胞を培養または継代培養すること、とによって調製されている。したがって、最初に、組換え発現宿主を調製し、次いで、抗体を発現するためにそれを培養する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１０１】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体および／もしくは抗体断片、ならびに／またはかかる抗体をコードする核酸、ならびに／または本発明の抗体により認識されるエピトープを含有する医薬組成物を提供する。また、医薬組成物は、投与を可能にするように、薬学的に許容可能な担体も含有し得る。担体は、それ自体が、組成物を受け取る個人に有害である抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子等の大型かつ代謝速度が遅い巨大分子であり得る。
【０１０２】
薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩等の鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩等の有機酸の塩を使用することができる。
【０１０３】
治療用組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール等の液体をさらに含有し得る。加えて、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質等の補助物質がかかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として医薬組成物を製剤化することが可能である。
【０１０４】
本発明の範囲内で、好適な投与形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス投与または持続注入による非経口投与に適した形態を含み得る。製品が注射または注入のためのものである場合、それは、油性または水性媒体中での懸濁液、溶液または乳濁液の形態を取り得、そしてそれは、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。代替として、抗体分子は、使用前の適切な滅菌液との再構成のために、乾燥状態であり得る。
【０１０５】
製剤化され次第、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。一実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合されることが好ましい。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、鼻腔内、腸内、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されないあらゆる経路によって投与され得る。また、本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレーも使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製され得る。
【０１０７】
組成物の直接的な送達は、概して、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内送達によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。また、組成物は、病変内にも投与することができる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であってもよい。既知の抗体ベースの医薬品は、例えば、医薬品を毎日、毎週、毎月等送達すべきかどうか等の投与頻度に関する手引きを提供する。また、頻度および用量は、症状の重症度にも依存し得る。
【０１０８】
本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製することができる（例えば、防腐剤を含有する滅菌水との再構成のために、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））等の凍結乾燥された組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製され得る。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に、香味づけたもの）として調製され得る。
【０１０９】
組成物は、微粉末またはスプレーを使用して、例えば、肺内投与のために吸入剤として調製され得る。組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のために、例えば、ドロップとして調製され得る。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与直前に再構成できるように設計されたキット形態であり得る。例えば、凍結乾燥された抗体は、滅菌水または滅菌緩衝液を有するキット形態で提供することができる。
【０１１０】
組成物中の有効成分は抗体分子、抗体断片、またはその変異体および誘導体であることが理解されよう。したがって、それは、胃腸管における分解に影響されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いた経路によって投与されるのであれば、組成物は、分解から抗体を保護するが、それが胃腸管から吸収され次第、抗体を放出する薬物を含有する必要がある。
【０１１１】
薬学的に許容される担体についての徹底的な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、通常、５．５から８．５の間のｐＨを有し、いくつかの実施形態において、６から８の間であり得、さらなる実施形態においては７であり得る。緩衝液の使用によりｐＨを維持することができる。組成物は、無菌であり得るか、および／または発熱物質を含み得ない。組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、密封容器中に供給される。
【０１１３】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の抗体および／もしくは本発明の抗体に結合するエピトープを含むポリペプチドの有効量、つまり、所望の疾患または状態を治療する、寛解させる、もしくは予防するのに十分な、または検出可能な治療効果を呈するのに十分な量を含む。また、治療効果は、身体症状の軽減も含む。任意の特定の対象に対する正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに治療学または投与のために選択された治療学の組み合わせに依存する。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって決定され、臨床従事者の判断内にある。本発明の目的で、有効用量は、概して、投与される個人において、本発明の組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。既知の抗体ベースの医薬品は、この点における手引きを提供し、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初期負荷用量は体重１ｋｇあたり４ｍｇであり、毎週の維持量は体重１ｋｇあたり２ｍｇであり、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、３７５ｍｇ／ｍ２を毎週投与される。
【０１１４】
一実施形態において、組成物は、１つより多くの（例えば、２つ、３つ、等）の本発明の抗体を含み、相加的または相乗的な治療効果を提供することができる。さらなる実施形態において、組成物は、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、等）の本発明の抗体および、Ａ型インフルエンザウイルスに対する１つ以上の（例えば、２つ、３つ、等）の追加の抗体とを含むことができる。例えば、１つの抗体は、１つのＨＡエピトープに結合し、別の抗体はＨＡ上の異なるエピトープへ結合、またはノイラミニダーゼおよび／または基質タンパク質上のエピトープへ結合し得る。さらに、Ａ型インフルエンザワクチンまたはＡ型インフルエンザウイルスとは別の特異性を持つ抗体と共に、本発明の抗体を投与することも本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗体は、インフルエンザワクチンまたはＡ型インフルエンザウイルスとは別の特異性を有する抗体と、組み合わせて／同時に、またはそれらから別時に、投与可能である。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで第１の抗体は本発明の抗体であり、ＨＡエピトープに対し特異的であり、第２の抗体はノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープおよび／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。例えば、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで、第１の抗体はＡ型インフルエンザウイルスＨＡのステムにおけるエピトープに対し特異的であり、および第２の抗体はノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープ（例えば、ＨＡの球状部領域におけるエピトープ、第２のＨＡステムにおけるエピトープ）、および／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。ステムにおける、またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡの球状部領域における第２のエピトープは、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ間で保存され得るが、そうである必要はない。
【０１１６】
さらに別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで、第１の抗体はノイラミニダーゼエピトープに対し特異的であり、第２の抗体は第２のノイラミニダーゼエピトープ、ＨＡエピトープおよび／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。
【０１１７】
さらなる別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、第１の抗体はマトリックスエピトープに対し特異的であり、第２の抗体は、第２のマトリックスエピトープ、ＨＡにおけるエピトープおよび／またはノイラミニダーゼに対し特異的である。
【０１１８】
本発明のＡ型インフルエンザウイルス標的タンパク質に対し特異的な例示的抗体は、これらに限定されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１またはＦＩ２８変異体２を含む。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ６変異体１またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ６変異体２またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体１またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体２またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１２０】
本発明の抗体は、例えば、放射線療法、化学療法化合物等の他の治療学とともに投与する（組み合わせてまたは別個に）ことができる。一実施形態において、治療化合物はタミフル等の抗ウイルス化合物を含む。かかる併用療法は、単独で投与する場合に、個々の治療薬と比較して治療効果の相加的または相乗的向上を提供する。本明細書で使用される「相乗作用」という用語は、各それぞれの活性薬剤の個々の効果の和よりも大きい２つ以上の活性薬剤の併用効果を説明するために使用する。したがって、２つ以上の薬剤の併用効果が活性またはプロセスの「相乗的阻害」をもたらす場合、それは、活性またはプロセスの阻害が、各それぞれの活性薬剤の阻害効果の和よりも大きいことを意図する。本明細書で使用される「相乗的治療効果」という用語は、２つ以上の治療の組み合わせで観察された治療効果を指し、治療効果（多数のパラメータのいずれかによって測定されたような）は、それぞれ個々の治療で観察される個々の治療効果の和よりも大きい。
【０１２１】
抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス治療に対して以前に反応を示さなかった、つまり、抗インフルエンザ治療に対して抵抗性を示したそれらの患者に投与され得る。かかる治療は、抗ウイルス剤を用いた以前の治療を含み得る。これは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスの抗ウイルス耐性株による感染に起因し得る。
【０１２２】
一実施形態において、本発明の抗体を含む本発明の組成物において、抗体は、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）を占める。かかる組成物において、抗体は精製された形態である。
【０１２３】
本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、（ｉ）本発明の抗体を調製するステップと、（ｉｉ）精製した抗体を１つ以上の薬学的に許容される担体と混合するステップとを含む、方法である。
【０１２４】
また、本発明は、医薬品を調製する方法も提供し、抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを混合するステップを含み、抗体は、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得、次いで、医薬品を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１２５】
治療目的のために抗体またはＢ細胞を送達することの代替案として、核酸が原位置で対象内に発現され、所望の治療効果を提供できるように、目的のモノクローナル抗体（またはその活性断片）をコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）を対象に送達することが可能である。適切な遺伝子治療法および核酸送達ベクターは、当技術分野において既知である。
【０１２６】
本発明の組成物は、免疫原性組成物、およびいくつかの実施形態においては、本発明の抗体に認識されたエピトープを含有する抗体を含むワクチン組成物で有り得る。本発明によるワクチンは、予防のため（つまり、感染を防止するため）または治療のため（つまり、感染を治療するため）のいずれかであり得る。一実施形態において、本発明は、配列番号３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【０１２７】
組成物は、特に複数回投与形式でパッケージされる場合に、抗菌薬を含み得る。組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含むことができる。界面活性剤は、通常、例えば、＜０．０１％の低濃度で存在する。組成物はまた、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）も含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が典型的である。
【０１２８】
さらに、組成物は、特に、それらが凍結乾燥される場合か、またはそれらが、凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合に、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を含む。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調製され得る。
【０１２９】
また、本発明の組成物は、１つ以上の免疫調節剤も含み得る。一実施形態において、免疫調節剤のうちの１つ以上は、アジュバントを含む（複数可）。
【０１３０】
本発明のエピトープ組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染に効果的に対処するために、細胞媒介免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫学的応答は、持続性（例えば、中和）抗体および、Ａ型インフルエンザウイルスへの曝露後に急速に応答することができる細胞媒介の免疫との両方を誘発し得る。
【０１３１】
医学的治療および用途
本発明の抗体および抗体断片、または誘導体およびその変異体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防またはＡ型インフルエンザウイルス感染の診断のために使用され得る。
【０１３２】
診断方法は、抗体または抗体断片を試料と接触させることを含む。かかる試料は、例えば、鼻腔、洞、腔、唾液腺、肺、肝臓，膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳または皮膚から取った組織試料であり得る。また、診断方法は、抗原／抗体複合体の検出も含む。
【０１３３】
したがって、本発明は、治療における使用のための（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、またはその変異体および誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープ、または（ｉｖ）本発明の抗体に結合するエピトープに結合する能力を持つ、好ましくは抗体であるリガンドを提供する。
【０１３４】
本発明はまた、本発明による抗体、抗体断片、もしくはその変異体および誘導体、または、本発明の抗体に結合するエピトープに結合する能力を持つ、好ましくは抗体であるリガンドを患者に投与することを含む、患者を治療する方法も提供する。一実施形態において、該方法は、対象のＡ型インフルエンザウイルス感染を減少させる。別の実施形態において、該方法は、対象におけるＡ型インフルエンザウイルス感染を阻止、そのリスクを低減、または感染を遅延させる。
【０１３５】
本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための薬物製造における、（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、もしくはその変異体および誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープ、または（ｉｖ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープに結合する、好ましくは抗体であるリガンドの使用も提供する。
【０１３６】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための薬物として使用するための組成物を提供する。また、患者の治療および／または患者の診断のための薬物の製造における、本発明の抗体および／またはかかる抗体が結合するエピトープを含むタンパク質の使用も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、対象を治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、対象はヒトであり得る。治療処置の有効性を確認する一方法は、本発明の組成物の投与後に、疾患症状をモニターすることを包含する。治療は、単回投与計画または複数回投与計画であることができる。
【０１３７】
一実施形態において、本発明による抗体、抗体断片、不死化Ｂ細胞クローン、エピトープまたは組成物は、かかる治療を必要とする対象へ投与される。かかる対象は、これに限定されないが、特にＡ型インフルエンザウイルス感染の危険性のある者であり、例えば、免疫不全者を含む。本発明の抗体または抗体断片は、受動免疫または能動ワクチン接種において使用可能である。
【０１３８】
抗体およびその断片は、本発明において記述したように、Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断のためのキットにおいても使用され得る。さらに、本発明の抗体へ結合可能なエピトープは、防御的抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することによりワクチン摂取手順の効率を監視するためのキットにおいて使用し得る。また、本発明において記述したように、抗体、抗体断片、またはその変異体および誘導体は、所望の免疫原性でのワクチン製造をモニターするためのキットにおいても使用され得る。
【０１３９】
また、本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、モノクローナル抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合するステップを含み、モノクローナル抗体は、本発明のトランスフェクトされた宿主から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得て（例えば、それを発現するおよび／またはそれを精製する）、次いで、それを医薬担体と混合する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１４０】
本発明の形質転換されたＢ細胞または培養されている血漿細胞から始めて、継代培養、クローニング、サブクローニング、配列決定、核酸調製等の種々のステップを、各ステップでの任意の最適化と伴い、形質転換されたＢ細胞または培養されている血漿細胞によって発現される抗体を永続化させるために行うことができる。好適な実施形態において、上記の方法は、抗体をコードする核酸に適用される最適化の技術（例えば、親和性成熟または最適化）をさらに含む。本発明は、そのようなステップ時に使用および調製される全ての細胞、核酸、ベクター、配列、抗体等を包含する。
【０１４１】
これらの全ての方法において、発現宿主内で使用される核酸は、ある種の核酸配列を挿入、欠失または修正するように、操作され得る。かかる操作からの変更は、制限酵素部位を導入するため、コドン使用頻度を変更するため、転写および／または翻訳制御配列を追加または最適化するため等の変更を含むが、これらに限定されない。また、コードされたアミノ酸を変化させるために、核酸を変更することも可能である。例えば、それは、抗体のアミノ酸配列に１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等）のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を導入するために有用であり得る。このような点突然変異は、エフェクター機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性等を修飾することができるか、共有結合基（例えば、標識）の付着のためにアミノ酸を導入することができるか、またはタグ（例えば、精製目的で）を導入することができる。突然変異は、特異的部位に導入することができるか、または、ランダムとその後の淘汰（例えば、分子進化）により導入することができる。例えば、本発明の抗体のＣＤＲ領域、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域のうちのいずれかをコードする１つ以上の核酸に、無作為にまたは方向付けをもって変異を導入して、コードしたアミノ酸に異なる特性をもたらすことができる。かかる変化は反復プロセスの結果であり得、そこでは最初の変化が保持されて、他のヌクレオチドの位置で新しい変化が導入される。さらに、独立したステップにおいて達成される変化を組み合わすことができる。コードされたアミノ酸にもたらされる異なる特性は、これに限定されないが、親和性の増大を含む。
【０１４２】
一般
本明細書で用いられている「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみから成るか、または、例えばＸ＋Ｙ等、何らかの付加的なものを含み得る。
【０１４３】
「実質的に」という用語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もあり得る。必要であれば、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略され得る。
【０１４４】
数値ｘに関連する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４５】
本明細書で用いる「疾患」という用語は、概して、正常機能を損ない、そして、典型的には、特徴的な徴候および症状によって顕在化し、ヒトもしくは動物の正常機能を損なわせる、ヒトもしくは動物の体の、またはその一部の異常な状態を反映するという点で、「障害」および「状態」（医学的状態等の状態）という用語と同義であり、それらと互換的に使用されることが意図されている。
【０１４６】
本明細書で用いる場合、患者の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」への言及は、予防、予防法および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を含むことを意図する。本明細書で用いられる「対象」または「患者」という用語は、ヒトを含む全ての哺乳類を意味し、互換的に使用される。対象の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウサギが挙げられる。一実施形態において、患者はヒトである。
【実施例】
【０１４７】
実施例
以下の実施例において、本発明の例示的な実施形態を提供する。以下の実施例は、単なる例示目的として、本発明を使用する当業者の補助となるように提示される。実施例は、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１４８】
例１． 血漿細胞からのＡ型インフルエンザウイルスを広範に中和する抗体の産生および特徴付け
季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１およびＨ３ＨＡを含有する）に応答してヘテロサブタイプ抗体を産出する個人を識別するために、ワクチンまたは非関連であるＨ５ ＨＡ（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）に結合する抗体を分泌する能力を促進されてから７日目に採取された、循環血漿細胞によるＥＬＩＳＰＯＴによりスクリーニングを行った。特筆すべきことに、Ｈ５特異的な血漿細胞を試験された５人中４人のドナーが検出不可能であったが、１人のドナーでは、ＩｇＧを分泌している血漿細胞の１４％がＨ５に対する抗体を産出し、５７％がワクチンに対して抗体を産出した。ＣＤ１３８＋血漿細胞は、磁性マイクロビーズを使用し、続いてＦＡＣＳＡｒｉａを使用して細胞分類することにより、ワクチン接種後から７日目に採取された抹消血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から単離された。限られた数の血漿細胞が、マイクロウェル培養皿に播種された。培養上清は、抗原組換えＨ５またはＨ９ ＨＡおよび無関係な抗原破傷風トキソイドを使用した３つの平行線定量ＥＬＩＳＡ法において試験された。スクリーニングされた４，９２８の培養上清検体中、１２がＨ５ ＨＡと結合したがＨ９ ＨＡには結合せず、２５がＨ９ ＨＡと結合したがＨ５ ＨＡには結合せず、５４がＨ５およびＨ９の双方と結合した。最も高いＯＤシグナルを伴う５４の培養物のいくつかを、ＲＴ−ＰＣＲに供し、２対のＶＨおよびＶＬ遺伝子が回収された。
【０１４９】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現ベクターへクローン化され、および組換え抗体が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって産生された。２つのモノクローナル抗体、ＦＩ６およびＦＩ２８、は大部分のＶ、ＤおよびＪ遺伝子断片（ＩＧＨＶ３−３０＊０１、ＩＧＨＤ３−９＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２およびＩＧＫＶ４−１＊０１）を共有したが、Ｎ領域、ＩＧＫＪ使用頻度および体細胞変異のパターンにおいて異なっており、したがって、クローン的には関連しない。
【０１５０】
組換え抗体の特異性は、異なったサブタイプに属するＨＡの一パネルを使用したＥＬＩＳＡ法により調査された。著しくも、ＦＩ６は、グループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループ２（Ｈ３およびＨ７）を含む、試験された全てのＡ型インフルエンザにおけるＨＡサブタイプと結合したが、Ｂ型インフルエンザウイルスからのＨＡとは結合しなかった。一方、ＦＩ２８は、３つのグループ１ ＨＡ（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）とのみ結合した。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
２つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列における相同性を鑑みて、ＦＩ６、ＦＩ２８、および７Ｉ１３（Ｈ鎖と同様のＶ、ＤおよびＪ要素を使用するｈＣＭＶ特異性抗体）のＨおよびＬ鎖を使用して、シャッフリング実験を行った。Ｈ７への結合にはＦＩ６ ＨおよびＬ鎖が対になることを要したが、Ｈ５への結合はＦＩ６およびＦＩ２８ Ｌ鎖がシャッフルされた時も維持された。さらに、Ｈ５との結合は、ＦＩ６のＨ鎖が非関連７Ｉ１３ Ｌ鎖と対になった時観察された。一方、Ｈ５との結合は、相同７１１３Ｈ鎖がＦＩ６Ｌ鎖と対になった時は観察されなかった。いずれの理論にも束縛されるものではないが、これらの結果は、Ｈ５結合に対する主な貢献はＨ鎖によるものであるが、Ｈ７結合はＦＩ６のＨおよびＬ鎖の正確な対を要することを示している。
【０１５３】
ＦＩ６およびＦＩ２８は、次に、Ａ型インフルエンザサブタイプにおけるグループ１およびグループ２を中和する能力を、偽型ウイルス（表５）および伝染性ウイルス（表６）を使用して試験した。著しくも、ＦＩ６は、抗原性の異なる分岐群０、１、２．１、２．２および２．３、および２つのＨ７鳥分離株に属する、６つのＨ５分離株を含む、試験された全ての偽型ウイルスを中和した。さらに、ＦＩ６は、２つのＨ３Ｎ２ウイルスおよび、近年大流行したＨ１Ｎｌ分離株Ａ／ＣＡ／０４／０９までの数十年範囲で４つのＨ１Ｎｌウイルス（表６）を含む、試験された全ての感染性ウイルスを中和した。ＦＩ２８は全てのＨ５偽型ウイルスを中和したが、試験された全てのＨ７偽型ウイルスおよび感染性ウイルスを中和しなかった。偽型ウイルスにおける中和力価は、感染性ウイルスにおける力価よりも高かった。
【０１５４】
【表５】
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
例２． ＦＩ６およびＦＩ２８抗原性結合部位
抗体ＦＩ６およびＦＩ２８が結合する抗原性部位を識別するため、我々は、第一に、ＨＡステム領域における保存された領域にマップされたマウスモノクロナール抗体である、Ｃ１７９の結合を阻止する能力を試験した（Ｙ．Ｏｋｕｎｏ， ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７，２５５２（１９９３））。ＦＩ６およびＦＩ２８の双方が、組換えＨ５ＶＮ／１２０３／０４ＨＡとＣ１７９の結合を完全に阻止し、それらが重複するエピトープを認識することを示唆している。一方、ＦＩ６およびＦＩ２８は、ＨＡの球状部領域において異なるエピトープを認識するＨ５Ｎ１免疫ドナーから単離された、Ｈ５特異性抗体の一群と競合しなかった（Ｃ．Ｐ．Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ４，ｅｌ７８（２００７）；Ｓ． Ｋｈｕｒａｎａ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ６，ｅｌ００００４９（２００９））。エスケープ変異体の選択によるＦＩ６エピトープをマップする試みは失敗したが、それはそのエピトープが、ウイルス適応性の損傷無しには、容易には変異可能ではないことを示唆している。
【０１５７】
我々は、次に、ＨＡ ＡＡＨＳｆ／１１９４／０４の線状および環状ペプチドライブラリを使用した、ペプチドをベースとしたマッピング、ならびにＰｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ ＢＶシステムを使用したヘリックススキャンを行った（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。この分析は、ＦＩ６の結合領域を特定し、ＨＡ２融合ペプチドＦＧＡＩＡＧ（Ｈ３番号付けでは、アミノ酸３〜８、配列番号３７）、ＨＡ２ヘリックスＡペプチドＤＧＶＴＮＫＶＮＳ（アミノ酸４６〜５４、配列番号３８）、ＨＡ２ヘリックスＢペプチドＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫ（アミノ酸１０２〜１１６、配列番号３９）、およびＨＡ１ Ｃ末端ペプチドＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰ（アミノ酸３１５〜３２５、配列番号４０）を含む。この抗体は、ＨＡ１ Ｃ末端ペプチドおよびＨＡ２ヘリックスＢペプチドと反応しなかったため、ＦＩ２８の結合領域は、ＦＩ６のものとは異なる。
【０１５８】
参考文献
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【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ２００８年７月２５日および２００９年５月２７日に出願された、米国仮出願第６１／０８３，８３８号および第６１／１８１，５８２号の優先権の利益を主張し、それらの開示は、参照することにより、それらの全体が本明細書に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型インフルエンザウイルスに対する中和抗体応答は、所与のウイルスサブタイプに対して特異的であると考えられている。赤血球凝集素（ＨＡ）によって定義される、１６個のＡ型インフルエンザサブタイプがある。この１６個のＨＡ、つまりＨ１〜Ｈ１６は、２つのグループに分類することができる。グループ１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、およびＨ１６のサブタイプからなり、グループ２には、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５のサブタイプが含まれる。トリには全てのサブタイプが存在するが、ヒトではほとんどＨ１、Ｈ２、およびＨ３のサブタイプが疾患を生じさせる。Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９のサブタイプは、ヒトにおいて孤発型の重度の感染を生じさせており、新たな世界的流行を発生し得る。Ｈ１およびＨ３ウイルスは絶え間なく進化して新たな変異体を生成する（抗原連続変異と呼ばれる現象）。その結果、過去のウイルスに応答して産生された抗体は、新たな連続変異ウイルスに対する防御が乏しいか、または全くない。その結果、出現することが予測されるＨ１およびＨ３ウイルスに対する新たなワクチンを毎年産生しなければならず、このプロセスは非常に費用がかかり、また常に効率的であるとは限らない。Ｈ５インフルエンザワクチンの産生にも同様のことが当てはまる。実際、ベトナムまたはインドネシアのＡ型インフルエンザウイルス分離株に基づく現在のＨ５ワクチンが、将来のＨ５ウイルスの世界的流行を防御するかどうかは、定かではない。
【０００３】
これらの理由から、全てのＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ、ならびにそれらの例年の変異体を中和することができる、広範に中和する抗体を誘発するワクチンを有することが非常に望ましいであろう（Ｇｅｒｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００６により概説）。さらに、広範に中和するヘテロサブタイプ抗体は、予防的または治療的設定において使用され得る。
【０００４】
Ａ型インフルエンザウイルスを認識する抗体は、特徴付けられている。Ｍ２（感染細胞上には発現するが、感染性ウイルス上には発現しない不変の低分子タンパク質）に対する抗体は、おそらく感染細胞をＮＫ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞による破壊の標的とすることによって、生体内で何らかの防御効果を示している。しかし、ＨＡが中和抗体の主要な標的である。それは宿主由来の酵素によって切断されて、ジスルフィド結合によって結合されたままである２つのポリペプチドを生成する、約５００個のアミノ酸の大きな外部ドメインからなる。より大きなＮ末端断片（ＨＡ１、３２０−３３０個のアミノ酸）は、受容体結合部位およびウイルス中和抗体によって認識されるほとんどの決定因子を含有する、膜遠位球状ドメインを形成する。より小さなＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０個のアミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜またはウイルス膜に固定するステム様構造を形成する。サブタイプ間の配列相同性の程度は、ＨＡ２ポリペプチド（５１％〜８０％の相同性）においてよりも、ＨＡ１ポリペプチド（サブタイプ間で３４％〜５９％の相同性）においての方が小さい。最も保存された領域は、切断部位周辺、特に融合ペプチドと称されるＨＡ２のＮ末端の１１個のアミノ酸の配列であり、これは、全てのＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプの間で保存される。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡＯ）内で表面ループとして曝露されるが、ＨＡＯがＨＡ１／ＨＡ２に切断されるとアクセス不可能になる。要約すれば、異なるＨＡサブタイプ間、特にＨＡ１−ＨＡ２接合領域およびＨＡ２領域において、保存される領域が存在する。しかしながら、これらの領域は、中和抗体にはアクセスされにくい可能性がある。
【０００５】
２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和させる抗体を識別することにはあまり成功しておらず、それらの中和の幅は限られており、それらの力価は低い。Ｏｋｕｎｏらは、インフルエンザウイルスＡ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）でマウスを免疫化し、ＨＡ２の保存されている立体構造エピトープに結合し、動物モデルにおいて生体内および生体外でグループ１のＨ２、Ｈ１、およびＨ５サブタイプのＡ型インフルエンザウイルスを中和するモノクローナル抗体（Ｃ１７９）を単離した（Ｏｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００６】
近年、Ｇｉｏｉａらは、従来の季節性インフルエンザワクチンを受けた数人の血清中におけるＨ５Ｎ１ウイルス中和抗体の存在について記載した（Ｇｉｏｉａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。著者らは、その中和活性はノイラミニダーゼ（Ｎ１）に対する抗体のためであると示唆している。しかしながら、モノクローナル抗体は単離されておらず、標的エピトープも特徴付けられなかった。血清抗体が他のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和し得るかは明らかではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
数十年におよぶ研究にもかかわらず、Ａ型インフルエンザウイルス感染を広範に中和または抑制するか、またはＡ型インフルエンザウイルスに起因する疾患を低減させる、市販の抗体は存在しない。したがって、複数のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプに対して保護する新規抗体を特定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＨＡと結合し、２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプの感染を中和する自然発生のヒトモノクローナル抗体による季節性インフルエンザワクチンを接種された人からの単離物、および本発明における抗体が結合する新規エピトープに一部基づく。したがって、本発明の１つの態様では、本発明は、グループ１およびグループ２のサブタイプから選択される２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプへの感染を中和させる抗体および抗原結合断片を含む。
【０００９】
本発明の一実施形態において、本発明は、グループ１およびグループ２のサブタイプであるＡ型インフルエンザ感染を中和する抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の別の実施形態において、本発明は、配列番号１〜６または１７〜２２うちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２または配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３とを含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。本発明のさらに別の実施形態において、本発明は、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３とを含む、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。
【００１１】
本発明のまた別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含有する軽鎖可変領域、または配列番号３３のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２９のアミノ酸配列を含有する重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、該抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する。本発明はさらに、抗体またはその抗原結合断片を含み、該抗体はＦＩ６変異体１またはＦＩ６変異体２である。
【００１２】
本発明のまた別の実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を含み、Ａ型インフルエンザウイルスにおけるグループ１およびグループ２のサブタイプへの感染を中和し、該抗体またはその断片は、不死化Ｂ細胞クローンにより発現される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。さらに別の態様において、本発明は、本発明における核酸分子を含むベクター、または本発明における抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞を含む。また別の態様において、本発明は、本発明の抗体または抗原結合断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、本発明の核酸分子、または本発明の核酸分子を含むベクター、本発明の抗体または抗体断片を発現する細胞、または本発明の免疫原性ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体と、を含む、医薬組成物をさらに含む。本発明はまた、第１の抗体またはその抗原結合断片と、第２の抗体またはその抗原結合断片と、を含む医薬組成物を含み、該第１の抗体は本発明の抗体であり、該第２の抗体はＡ型インフルエンザ感染を中和する抗体または抗原結合断片である。
【００１５】
（ｉ）Ａ型インフルエンザ感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザ感染の診断における、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、本発明の核酸、本発明の核酸を含むベクター、本発明のベクターを含む細胞、本発明の抗体またはその抗体断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原生ポリペチド、または本発明の医薬組成物の使用は、本発明の範囲内であることが企図される。さらに、本発明の抗体またはその抗原結合断片の使用であって、該ワクチンの抗原が正しい立体構造の特定のエピトープを含有していることを確認することにより、Ａ型インフルエンザのワクチンの品質を監視するための使用も、本発明の範囲内であることが企図される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の減少、またはＡ型インフルエンザウイルス感染への危険性の低下の１つの方法を含み、その方法は、それらを必要とする対象に本発明の抗体または抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）治療における、（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉｉ）ワクチンとしての、または（ｉｖ）Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおける、使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するエピトープを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、季節性Ａ型インフルエンザワクチンを接種された人からの、広範でＡ型インフルエンザウイルスの異なるサブタイプを中和する自然発生のヒト抗体および本発明の抗体が結合する新規エピトープ、の発見および単離に一部基づいている。少数または１つの抗体のみがＡ型インフルエンザウイルスを中和するために必要であるため、そういった抗体が望ましい。また、そういった抗体によって認識されるエピトープは、広範で季節性および世界的流行候補株である異なるサブタイプに対する保護を誘発するワクチンの一部であり得る。
【００１９】
したがって、一態様において、本発明は、グループ１およびグループ２における少なくとも２つのＡ型インフルエンザを中和する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片はＡ型インフルエンザのグループ１およびグループ２のサブタイプへの感染を中和する。
【００２０】
本発明における別の態様としては、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプのＨＡに対して広範の特異性を保持する、中和抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存されるＨＡのステム領域内においてエピトープと特異的に結合する。別の実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号３７、３８、３９、または４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２１】
ヒトモノクローナル抗体，不死化されたＢ細胞クローンまたは本発明の抗体を分泌するトランスフェクトされた宿主細胞、および本発明の抗体をコードする核酸もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される、「抗原結合断片」、「断片」、および「抗体断片」という用語は、抗体の抗原結合活性を保持する本発明の抗体のいずれの断片をも意味するために同義に使用される。例示的な抗体断片は、これらに限定されないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む。本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体およびその抗原結合断片の双方を含む。
【００２３】
本明細書で使用される「広範囲な特異性」という用語は、Ａ型インフルエンザウイルスの１つ以上のグループ１サブタイプおよび１つ以上のグループ２サブタイプと結合および／または中和する本発明の抗体または抗原結合断片を意味するために使用される。
【００２４】
本明細書で使用される「中和抗体」という用語は、病原体が宿主において感染を開始／および持続させる能力を中和する、すなわち、それらの予防、阻止、低減、遅延、または妨害する抗体である。本明細書で使用される「中和抗体」および「中和する抗体」という用語は、本明細書において同義に使用される。これらの抗体は、適切な処方で、予防薬もしくは治療薬として、能動ワクチン接種と対合して、または本明細書に記載されるような診断ツールまたは生成ツールとして、単独または組み合わせて使用することができる。
【００２５】
本発明の抗体または抗原結合断片は、グループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、およびＨ１６およびそれらの変異体）の１つ以上のＡ型インフルエンザウイルス、およびグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５およびそれら変異体）サブタイプの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスを中和する。一実施形態において、例示的なグループ１サブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、およびＨ９を含み、また、例示的なグループ２サブタイプはＨ３ およびＨ７を含む。
【００２６】
本発明の抗体および抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプの様々な組み合わせを中和する能力を持つ。一実施形態において、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１およびＨ３サブタイプ、またはＨ２およびＨ３サブタイプ、またはＨ３およびＨ５サブタイプ、またはＨ３およびＨ９サブタイプ、またはＨ１およびＨ７サブタイプ、またはＨ２およびＨ７サブタイプ、またはＨ５およびＨ７サブタイプ、またはＨ７およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２７】
別の実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２およびＨ３サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３およびＨ５サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２８】
さらに別の実施形態においては、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ５サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９サブタイプを中和することができる。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９サブタイプを中和することができる。さらに別の実施形態においては、本発明の抗体および抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ６サブタイプを中和することに加え、１つ以上の上記の組み合わせを中和する。
【００３０】
本発明の抗体および抗原結合断片は、高中和能力を有する。Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる本発明の抗体の濃度は、例えば約５０μｇ／ｍｌまたはそれ以下となり得る。一実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる本発明の抗体濃度は、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１７．５、１５、１２．５、１１、１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５μｇ／ｍｌまたは約１μｇ／ｍｌ以下である。別の実施形態において、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに必要とされる、本発明の抗体の濃度は、約０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００８、０．００６、０．００４、０．００３、０．００２μｇ／ｍｌまたは約０．００１μｇ／ｍｌ以下である。これは、Ａ型インフルエンザウイルスを５０％中和するのに、低濃度の抗体しか必要とされないことを意味する。特異性および力価は、当業者に知られている標準的な中和アッセイを使用して測定することができる。
【００３１】
本発明の抗体
本発明は、特にＨＡに対し広範な特異性を有し、グループ１からの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプおよびグループ２からの１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプを中和する抗体を提供する。本発明の抗体は、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存されるＨＡ領域においてエピトープと結合する。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１およびグループ２サブタイプのＨＡステム領域内において保存されたエピトープと結合し、ウイルス複製または拡散を妨害する抗体、例えば、単離された抗体または精製された抗体、を提供する。本発明はまた、サブタイプグループ１およびグループ２におけるＨＡステム領域内で、保存されたエピトープと特異的に結合し、細胞へのウイルス侵入を阻止する抗体、例えば、単離された抗体または精製された抗体、を提供する。いずれの理論にも束縛されるものではないが、１つの例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのステム領域において保存されたエピトープに結合し、融合ステップの阻害により細胞へのウイルス侵入を阻止する。エピトープまたはタンパク質の抗原決定因子は、抗体の結合部位（またはパラトープ）により、特異的に識別さる分子部分に対応する。したがって、エピトープは、それらの操作認識のために、相補的パラトープを要する関連実体である。タンパク質の異なる変異体間で保存されているエピトープは、同じパラトープが、これらの異なる変異体を、分子の同部との接触により特異的に認識することを意味する。
【００３３】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体、または組換え抗体であり得る。本発明はまた、本発明の抗体の断片、特に、抗体の抗原結合活性を保持する断片を提供する。特許請求の範囲を含む本明細書は、いくつかの箇所において、抗原結合断片（複数可）、抗体断片（複数可）、変異体（複数可）および／または抗体の誘導体（複数可）について明示的に言及する場合があるが、「抗体」または「本発明の抗体」という用語は、すべての分類の抗体、すなわち、抗体断片（複数可）、抗体断片（複数可）、変異体（複数可）、および抗体の誘導体（複数可）を含むことを理解されたい。
【００３４】
一実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、グループ１およびグループ２の、２つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプの組み合わせを中和する。例示的なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプは、これらに限定されないが、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）、Ｈ１Ｎｌ（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、Ｈ１Ｎｌ（Ａ／Ｓａｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６）、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／０３）およびＨ９Ｎ２（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７）を含む。別の実施形態においては、抗体は、３、４、５、６、７、またはそれより多いＡ型インフルエンザウイルスサブタイプグループ１およびグループ２の組み合わせを中和する、および／またはそれらに特異的である。
【００３５】
例示的実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプＨ１およびＨ３（例えば、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）；またはＨ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１およびＨ９Ｎ２）に特異的な抗体またはそれらの抗体断片を含む。さらに別の実施形態においては、抗体またはそれらの抗体断片は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９（例えば、ＨＩＮｌ、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２）に対し、特異的である。他の例示的Ａ型インフルエンザウイルスサブタイプの組み合わせは、本出願で前記されている。
【００３６】
例示的本発明の抗体における、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号および、それらをコードする核酸配列の配列番号は、表１に列記される。
【００３７】
【表１】
【００３８】
一実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１３、３３、２９または３５のいずれかに記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるアミノ酸配列番号を有する重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１４または３０に記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体における重鎖可変領域は、配列番号１５、３４、３１または３６のいずれかに記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である配列を有する核酸によってコードされ得る。別の実施形態においては、本発明の抗体における軽鎖可変領域は、配列番号１６または３２に記載されている配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である配列を有する核酸にコードされ得る。
【００４０】
抗体重鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として言及される。同様に、抗体軽鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として言及される。ＣＤＲのアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ番号付け体系にしたがって次のように定義される、ＣＤＲ１-ＩＭＧＴは位置２７から３８、ＣＤＲ２-ＩＭＧＴの位置は５６から６５およびＣＤＲ３-ＩＭＧＴの位置は１０５から１１７である。
【００４１】
表２は、本発明の例示的な抗体の重鎖と軽鎖の６つのＣＤＲのアミノ酸配列における配列番号をそれぞれ提供する。
【００４２】
【表２】
【００４３】
一実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、配列番号１〜６または１７〜２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を伴う、少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１、またはＦＩ２８変異体２からの１つ以上（すなわち、１つ、２つ、または３つ全て）の重鎖ＣＤＲを含有する重鎖を含有する抗体を提供する。例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号１７または配列番号１のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８または配列番号２のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１９または配列番号３のアミノ酸配列を伴う重鎖ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、本明細書に提供されている抗体または抗体断片は、重鎖を含み、重鎖は（ｉ）配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および配列番号３のＣＤＲＨ３、または（ｉｉ）配列番号１７のＣＤＲＨ１、配列番号１８のＣＤＲＨ２および配列番号１９のＣＤＲＨ３を含む。
【００４５】
ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１、またはＦＩ２８変異体２からの１つ以上（すなわち、１つ、２つ、または３つ全て）の軽鎖ＣＤＲを含有する軽鎖を含有する抗体もまた提供される。例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を伴う軽鎖ＣＤＲ３と、を含む。ある実施形態において、本明細書に提供されている抗体は、軽鎖を含み、軽鎖は、（ｉ）配列番号４のＣＤＲＬｌ、配列番号５のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３、または（ｉｉ）配列番号２０のＣＤＲＬｌ、配列番号２１のＣＤＲＬ２および配列番号２のＣＤＲＬ３、を含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ６変異体１のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ６変異体２のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ２８変異体１のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。さらなる別の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、表２に列記される抗体ＦＩ２８変異体２のすべてのＣＤＲを含み、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する。
【００４７】
本発明の例示的抗体は、これらに制限されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１またはＦＩ２８変異体２を含む。
【００４８】
本発明は、本発明の抗体と同じエピトープに結合する抗体、またはその断片、または本発明の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその断片、をさらに含む。本発明の抗体はまた、本発明の抗体からの１つ以上のＣＤＲと、同じエピトープに対する別の抗体からの１つ以上のＣＤＲとを含む、ハイブリッド抗体分子を含む。一実施形態において、かかるハイブリッド抗体は、本発明の抗体からの３つのＣＤＲと、同じエピトープに対する別の抗体からの３つのＣＤＲとを含む。例示的なハイブリッド抗体は、ｉ）本発明の抗体からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび同じエピトープに対する別の抗体からの３つの重鎖ＣＤＲ、またはｉｉ）本発明の抗体からの３つの重鎖ＣＤＲおよび同じエピトープに対する別の抗体からの３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
【００４９】
変異抗体も本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願に記載する配列の変異形もまた本発明の範囲内に含まれる。このような変異形は、免疫応答の最中に生体内で体細胞変異が起こること、または不死化Ｂ細胞クローンの生体外での培養、により生成される天然の変異形を含む。代替として、変異形は、上述した遺伝暗号の縮重によって生じ得るか、または転写もしくは翻訳におけるエラーによって産生され得る。
【００５０】
向上した親和性および／または力価を有する抗体配列のさらなる変異形は、当技術分野において知られている方法を使用して得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。例えば、アミノ酸置換を、さらに向上した親和性を持つ抗体を得るために使用することができる。代替として、ヌクレオチド配列のコドン最適化を、抗体を産生するための発現系において翻訳の効率を向上させるために使用することができる。さらに、本発明の核酸配列のうちのいずれかに進化分子工学法を適用することにより、抗体特異性または中和活性のために最適化された配列を含むポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
【００５１】
一実施形態において、変異抗体の配列は、本出願に記載する配列と７０％以上（すなわち、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形態において、かかる配列同一性は、参照配列（すなわち、本出願に示した配列）の全長に関して算出される。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書に参照される同一性の割合（％）は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって指定される初期パラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス、ギャップオープンペナルティ＝１１およびギャップ伸長ペナルティ＝１］を使用して、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を用いて決定される。
【００５２】
別の態様において、本発明はまた、本発明の抗体の一部または全ての軽鎖および重鎖ならびにＣＤＲをコードする核酸配列も含む。本発明はまた、本発明の例示的抗体の一部または全ての軽鎖および重鎖ならびにＣＤＲをコードする核酸配列も含む。表１は、本発明の例示的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列の配列番号を提供する。例えば、本明細書に提供されている核酸配列は、配列番号１５（ＦＩ６変異体１重鎖可変領域をコードする）、配列番号３４（ＦＩ６変異体２重鎖可変領域をコードする）配列番号１６（ＦＩ６変異体１およびＦＩ６変異体２軽鎖可変領域をコードする）、配列番号３１（ＦＩ２８変異体１重鎖可変領域をコードする）、配列番号３６（ＦＩ２８変異体２重鎖可変領域をコードする）配列番号３２（ＦＩ２８変異体１および変異体２軽鎖可変領域をコードする）。
【００５３】
表３は、本発明の例示的な抗体のＣＤＲへコードする核酸配列の配列番号を提供する。遺伝暗号の冗長性に起因して、同じアミノ酸配列をコードするこれらの配列の変異形が存在するであろう。
【００５４】
【表３】
【００５５】
一実施形態において、本発明に従う核酸配列は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する核酸配列を含む。別の実施形態において、本発明の核酸配列は、本発明の抗体の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲをコードする核酸の配列を有する。例えば、本発明に従う核酸配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、３４、２３〜２８、３１、３２、または３６の核酸配列と少なくとも７５％相同である配列を含む。
【００５６】
本発明による核酸配列を含むベクター、例えば、発現ベクターが本発明の範囲内にさらに含まれる。かかるベクターで形質転換された細胞も本発明の範囲内に含まれる。かかる細胞の例は、これらに限定されないが、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、または植物細胞を含む。一実施形態において、細胞は哺乳類細胞、例えば、ヒト、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞である。
【００５７】
また、本発明は、これらに限定されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１およびＦＩ２８変異体２から構成される群より選択されるモノクローナル抗体を含む、本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープに結合するモノクローナル抗体にも関する。
【００５８】
モノクローナルおよび組換え抗体は、個々のポリペプチドまたはそれらが向けられる他の抗原の識別および精製に特に有用である。本発明の抗体は、それらが、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において試薬として用いられ得るという点で、付加的な有用性を有する。これらの用途において、抗体は、放射性同位元素、蛍光分子、または酵素等の分析的に検出可能な試薬で標識することができる。また、抗体は、抗原の分子的識別および特徴付け（エピトープマッピング）のためにも使用され得る。
【００５９】
本発明の抗体は、治療部位への送達のために薬物に連結することができるか、またはＡ型インフルエンザウイルスに感染した細胞等の目的の細胞を含む部位の画像化を容易にさせるように、検出可能な標識に連結することができる。薬物および検出可能な標識に抗体を連結するための方法は、当技術分野において知られており、検出可能な標識を使用して画像化するための方法も同様である。標識された抗体は、様々な標識を用いて、様々なアッセイにおいて用いられ得る。本発明の抗体および目的のエピトープ（Ａ型インフルエンザウイルスエピトープ）間の抗体―抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を付着させることによって容易にすることができる。適切な検出手段は、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体、化学発光物質、色素原、酵素基質または補助因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用を含む。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールであり、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、ならびに適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。かかる標識された試薬は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光免疫測定法等の様々な既知のアッセイにおいて使用され得る。（例えば、米国特許第３，７６６，１６２号、米国特許第３，７９１，９３２号、米国特許第３，８１７，８３号、および米国特許第４，２３３，４０２号を参照のこと）。
【００６０】
本発明による抗体は、細胞毒、治療薬、または放射性金属イオンもしくは放射性同位元素等の治療部分に共役され得る。放射性同位元素の例としては、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体共役体は、所与の生物学的応答を改変するために使用することができるが、薬物部分は、古典的な化学治療薬に制限されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を持つタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の毒素を含み得る。
【００６１】
かかる治療部分を抗体に共役する技術は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ． Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３−２５６；ｅｄ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｅｄ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２ｄ ｅｄ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３−６５３；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ'８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｐｐ．４７５−５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ， Ｍｉｌａｎｏ， Ｉｔａｌｙ，１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５），ｐｐ．３０３−３１６、およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照されたい。
【００６２】
代替として、抗体、またはその抗体断片は、米国特許第４，６７６，９８０号記載のように、第２の抗体、またはその抗体断片に共役させて、抗体異種共役体を形成することができる。さらに、リンカーを、標識および本発明の抗体間で使用することができる（例えば、米国特許第４，８３１，１７５号）。抗体、またはその抗原結合断片は、放射性ヨード、インジウム、イットリウム、または当技術分野において既知の他の放射性粒子で直接標識され得る（例えば、米国特許第５，５９５，７２１号）。治療は、同時に投与またはその後投与される共役抗体と非共役抗体の治療の組み合わせから成り得る（例えば、国際公開第５２０３１号、国際公開第５２４７３号）。
【００６３】
本発明の抗体はまた、固体支持体にも付着され得る。さらに、本発明の抗体またはその機能的抗体断片は、ポリマーへの共有結合性共役により化学修飾することで、例えば、循環半減期を増大することができる。ポリマーの例、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号および米国特許第４，６０９，５４６号に示される。いくつかの実施形態におおいて、ポリマーはポリエキシエチレン化されたポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。ＰＥＧは、室温で水溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎＯ−−Ｒを有し、Ｒは、水素、またはアルキル基もしくはアルカノール基等の保護基であることができる。一実施形態において、保護基は、１から８個の炭素を有し得る。さらなる実施形態において、保護基はメチルである。記号ｎは、正の整数である。一実施形態において、ｎは１から１，０００の間である。別の実施形態において、ｎは２から５００の間である。一実施形態においては、ＰＥＧは、１，０００から４０，０００の平均分子量を保持する。さらなる実施形態においては、ＰＥＧは２，０００から２０，０００の平均分子量を保持する。さらなる実施形態においては、ＰＥＧは３，０００から１２，０００の平均分子量を保持する。一実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を保持する。別の実施形態において、ＰＥＧは、末端ヒドロキシ基を有する。さらに別の実施形態において、このヒドロキシル基は、阻害剤の遊離アミノ基と反応するように活性化される末端ヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の型および量は、本発明の共有結合的に共役されたＰＥＧ／抗体を達成するために変化し得ることが理解される。
【００６４】
また、水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等を含む。一実施形態において、ＰＯＧが用いられる。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物およびヒトにおいて、モノ−、ジ−、トリグリセリド中に自然に発生する骨格と同じであるため、この分岐は、必ずしも体内において異質の物質であるとは見なされない。いくつかの実施形態において、ＰＯＧは、ＰＥＧと同程度の分子量を有する。循環半減期を増大させるために使用され得る別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８２）、Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）、および（１９８０）に考察される他の薬物送達系は当技術分野において知られており、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（１９８０）およびＰｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）に記載される。
【００６５】
本発明の抗体は、精製された形態で提供される。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、組成物の９０（重量）％未満、通常６０％未満、およびさらに通常５０％未満が他のポリペプチドで構成される。
【００６６】
本発明の抗体は、非ヒト（異種）宿主、例えばマウスにおいて免疫原性であり得る。具体的には、抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主においては免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトが使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等の宿主から容易に単離することができないもの、およびヒト化によって、または異種マウスから概して得ることができないものを含む。
【００６７】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭつまり、α、γまたはμ重鎖）であることができるが、概してＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであり得る。本発明の抗体は、κまたはλ軽鎖を有し得る。
【００６８】
抗体の産生
本発明による抗体は、当技術分野において知られているいかなる方法でも作成可能である。例えば、ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論が周知である（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，１９７５；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）．一実施形態において、国際公開第２００４／０７６６７７号に記述される代替的なＥＢＶ不死化方法が使用される。
【００６９】
国際公開第２００４／０７６６７７号に記述される方法を使用して、本発明の抗体を産生するＢ細胞は、多クローン性Ｂ細胞活性化因子の存在下においてＥＢＶで形質転換することができる。ＥＢＶによる形質転換は標準的な技術であり、多クローン性Ｂ細胞活性化因子を含むように容易に適合することができる。
【００７０】
細胞増殖および分化の付加的な刺激薬を、任意で、効率をさらに増強させるために形質転換ステップ時に添加することができる。これらの刺激薬は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５等のサイトカインで有り得る。一態様において、不死化効率をさらに向上させるために、不死化ステップの最中にＩＬ−２が添加されるが、その使用は必須ではない。
【００７１】
次いで、これらの方法を使用して産生した不死化Ｂ細胞を、当技術分野において既知の方法を使用して培養し、抗体をそこから単離することができる。
【００７２】
英国特許出願第０８１９３７６．５号に記載されている方法を使用して、マイクロウェル培養プレートにおいて単一血漿細胞を培養することも可能である。抗体は、培養されている単一血漿細胞から単離可能である。さらに、当技術分野において知られている方法を使用して、単一血漿細胞の培養物からＲＮＡを抽出し、単細胞ＰＣＲを行うことができる。抗体のＶＨおよびＶＬ領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、配列決定を行い、発現ベクター中にクローン化し、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の宿主細胞中にトランスフェクトする。発現ベクターにおける核酸のクローン化、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクトした宿主細胞の培養、および産生された抗体の単離は、当業者に知られている任意の方法を使用して行うことができる。
【００７３】
抗体は、所望される場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣまたは親和性クロマトグラフィ等の種々のクロマトグラフ法を使用してさらに精製され得る。製薬等級抗体を産生するための技術を含む、抗体、例えばモノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において知られている。
【００７４】
本発明の抗体の断片は、ペプシンもしくはパパイン等の酵素での消化を含む方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、抗体から得ることができる。代替として、抗体の断片は、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含み得る。また、本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖から派生する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含し、例えば、本発明は、本発明の抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖または軽鎖単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体ならびに単鎖抗体、例えば、重鎖および軽鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結される一本鎖Ｆｖも含む。
【００７５】
本発明の抗体断片は、単価または多価相互作用を与え、および上記された様々な構造に含有され得る。例えば、ｓｃＦｖ分子は、三価の「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）」または「テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）」を作成する、または合成され得る。ｓｃＦｖ分子は、Ｆｃ領域のドメインを含み得、その結果二価ミニボディ（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）をもたらす。さらに、本発明の配列は、多選択性分子の１つの構成要素で有り得、そこにおいて本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、および他の分子部位が他の標的へ結合する。例示的分子は、これらに限定されないが、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、二重特異性ｓｃＦｖ、および２重特異性抗体（ディアボディ）を含む（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１１２６−１１３６）。
【００７６】
分子生物学の標準的な技術を、本発明の抗体または抗体の断片をコードするＤＮＡ配列を調製するために使用することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは部分的に合成され得る。部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて使用することができる。
【００７７】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子またはその断片をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、および、特にＦｖ断片および単鎖抗体断片、例えば、一本鎖Ｆｖｓ等の抗体断片の発現のために、細菌、例えば大腸菌、および他の微生物系が部分的に使用され得る。真核生物、例えば哺乳類宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含む、より大きな抗体分子の産生のために使用され得る。適切な哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞を含む。
【００７８】
また、本発明は、本発明による抗体分子を産生するための過程も提供し、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で、本発明の核酸にコードするベクターを含む宿主細胞を培養することと、抗体分子を単離することとを含む。
【００７９】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合においては、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、宿主細胞を形質移入するために使用する必要があるだけである。重鎖および軽鎖の両方を含む産物を産生するためには、細胞系は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターを形質移入され得る。代替として、単一のベクターが使用され得、該ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００８０】
代替として、本発明による抗体は、ｉ）細胞内で本発明による核酸配列を発現すること、およびｉｉ）発現された抗体産物を単離することによって産生され得る。加えて、方法は、ｉｉｉ）抗体を精製することを含み得る。
【００８１】
形質転換されたＢ細胞、培養された単一血漿細胞およびトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のスクリーニング
形質転換されたＢ細胞および培養された単一血漿細胞は、所望の特異性または機能を有する抗体の産生のためにスクリーニングされ得る。
【００８２】
スクリーニングステップは、免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ、組織または細胞（形質移入された細胞を含む）の染色、中和アッセイ、または所望の特異性または機能を識別するための当技術分野において知られている多くの他の方法のうちの１つによって行われ得る。アッセイは、単純抗原認識に基づいて選択し得るか、または、例えば、抗原結合抗体だけではなく中和抗体を選択し、標的細胞の特徴、たとえば、それらのシグナリングカスケード、それらの形、それらの増殖速度、他の細胞に影響するそれらの能力、他の細胞もしくは他の試薬または条件の変化による影響に対するそれらの応答、それらの分化状態等を変化させることができる抗体を選択する等のような、所望の機能にさらに基づいて選択され得る。
【００８３】
個々の形質転換されたＢ細胞クローンは、陽性形質転換されたＢ細胞培養から産出され得る。陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するクローニングステップは、限界希釈法，顕微操作、細胞分類による単細胞沈着、または当技術分野において知られている別の方法を使用して行われ得る。
【００８４】
培養された単一血漿細胞からの核酸は、当技術分野において知られている方法を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内、または、他の宿主細胞内で単離、クローンおよび発現可能である。
【００８５】
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたはトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、例えば、モノクローナル抗体源として、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）源等として、研究のために等、種々の方法で使用することができる。
【００８６】
本発明は、サブタイプグループ１およびグループ２から選択された、少なくとも２つの異なるＡ型インフルエンザウイルスサブタイプを中和する抗体を産出する、不死化Ｂメモリー細胞または宿主細胞のトランスフェクションを含む組成物を提供する。
【００８７】
エピトープ
上記のように、本発明の抗体は、それらが結合するエピトープをマッピングするために使用することができる。本発明者は、ＨＡに見出されるエピトープに向けられるＡ型インフルエンザウイルス感染を中和する抗体を発見した。一実施形態において、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプグループ１およびグループ２の間で保存されている、ＨＡのステム領域において１つまたはそれ以上のエピトープに向けられる。本発明の抗体が結合するエピトープは、直線的（連続的）または立体構造的（非連続的）で有り得る。一実施形態において、本発明の抗体および抗体断片は、本明細書で考察されるように配列号３７、３８、３９または４０を含むポリペプチドの領域へ結合する。
【００８８】
本発明の抗体によって認識されるエピトープは、多くの用途があり得る。精製された形態または合成形態でのエピトープおよびそのミモトープは、免疫学的応答を惹起するために（つまり、ワクチンとして、または他の使用のために抗体を産生するため）、またはエピトープもしくはそのミモトープと免役反応する抗体に対して血清をスクリーニングするために使用することができる。一実施形態において、かかるエピトープもしくはミモトープ、またはかかるエピトープもしくはミモトープを含む抗原は、免疫反応を向上させるためのワクチンとして使用され得る。本発明の抗体および抗体断片はまた、ワクチンの品質を監視する方法においても使用することができる。具体的には、抗体は、ワクチン中の抗原が正しい立体構造の正しい免疫原性エピトープを含有していることを確認するために使用することができる。
【００８９】
また、エピトープは、該エピトープに結合するリガンドのスクリーニングにおいても有用であり得る。これらに限定されないが、ラクダ、サメおよび他の種由来の抗体、抗体の断片、ペプチド、ファージディスプレイ技術の産物、アプタマー、アドネクチン、または他のウイルスもしくは細胞タンパク質の断片を含むかかるリガンドは、エピトープをブロックし、したがって感染を予防することができる。このようなリガンドは、本発明の範囲内に包含される。
【００９０】
組換え発現
また、本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞は、その後の組換え発現のための抗体遺伝子のクローニングのために核酸源としても使用し得る。組換え源からの発現は、例えば、安定性、再現性、培養の容易さ等の理由で、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも、医薬目的上より一般的である。
【００９１】
したがって、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された単一血漿細胞から１つ以上の核酸（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を得るステップと、（ｉｉ）該核酸を発現ベクターへ挿入するステップと、（ｉｉｉ）宿主内における目的の抗体の発現を可能にするように、ベクターをトランスフェクトするステップとを含む。
【００９２】
同様に、本発明は、組換え細胞を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された単一血漿細胞から核酸を配列決定するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）からの配列情報を使用して、発現宿主内における目的の抗体の発現を可能にするように、その宿主内に挿入するために核酸を調製するステップとを含む。制限酵素部位を導入するため、コドン使用頻度を変更するため、ならびに／または転写および／もしくは翻訳制御配列を最適化するために、ステップ（ｉ）と（ｉｉ）の間で核酸を操作することができるが、その必要はない。
【００９３】
また、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞を調製する方法を提供し、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸で宿主細胞をトランスフェクトするステップを含み、該核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から得た核酸である。したがって、最初に、該核酸を調製し、次いで、宿主細胞をトランスフェクトするためにそれを使用する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９４】
次いで、本発明のこれらの組換え細胞は、発現および培養目的で使用することができる。それらは、大規模の薬剤生産のための抗体の発現に特に有用である。また、それらは、医薬組成物の活性成分としても使用することができる。任意の適切な培養技術を使用することができ、その技術には、静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空糸型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニファーメンター、攪拌槽、マイクロキャリア培養、セラミック中子灌流等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
Ｂ細胞または血漿細胞から免疫グロブリン遺伝子を得る、および配列決定するための方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｉＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００を参照）。
【００９６】
トランスフェクトされた宿主細胞は、酵母および動物細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ ２００３）またはＨＫＢ−１１（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２００３）細胞等のヒト細胞、骨髄腫細胞（米国特許第５，８０７，７１５号、米国特許第６，３００，１０４号等））、ならびに植物細胞を含む真核細胞であり得る。好適な発現宿主は、特に、それ自体ではヒトにおいて免疫原性ではない糖鎖構造を用いて、本発明の抗体をグリコシル化することができる。一実施形態において、発現宿主細胞は無血清培地で成長することができる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、動物由来産物が存在しない培養物中で成長することができる。トランスフェクトされた宿主細胞は、細胞系を得るために培養され得る。
【００９７】
本発明は、目的の抗体をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖および／または軽鎖遺伝子）を調製するための方法を提供し、（ｉ）本発明により、不死化Ｂ細胞クローンの調製または血漿細胞を培養するステップと、（ｉｉ）目標の抗体をコードする核酸をＢ細胞クローンまたは培養された該単一血漿細胞から得るステップを含む。本発明はまた、目的の抗体をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、（ｉ）本発明により、不死化Ｂ細胞クローンを調製または血漿細胞を培養するステップと、（ｉｉ）目的の抗体をコードするＢ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を配列決定するステップと、を含む。
【００９８】
また、本発明は、目的の抗体をコードする核酸分子を調製する方法も提供し、本発明の形質転換Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を得るステップを含む。したがって、最初に、Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞を得、次いで、Ｂ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から核酸を得る手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時間に行うことができる。
【００９９】
本発明は、（例えば医薬用途のために）抗体を調製するための方法を提供し、（ｉ）目的の抗体を発現する選択したＢ細胞クローンまたは培養された血漿細胞から１つ以上の核酸（例えば、重鎖および軽鎖遺伝子）を得るステップおよび／または配列決定するステップと、（ｉｉ）核酸を挿入するか、または核酸を使用して、発現ベクターを調製するステップと、（ｉｉｉ）目的の抗体を発現する宿主細胞をトランスフェクトするステップと、（ｉｖ）目的の抗体が発現される条件下で、トランスフェクトされた宿主細胞を培養または継代培養するステップと、任意に、（ｉｖ）目的の抗体を精製するステップとを含む。
【０１００】
また、本発明は、抗体を調製する方法も提供し、目的の抗体が発現される条件下で、発現宿主細胞集団を培養または継代培養するステップと、任意に、目的の抗体を精製するステップとを含み、該発現宿主細胞集団は、（ｉ）上記のように調製されたＢメモリーリンパ球の集団により産生される目的の抗体を発現する選択したＢ細胞をコードする核酸を提供すること、（ｉｉ）発現ベクター内に核酸を挿入すること、および（ｉｉｉ）該ベクターを目的の抗体を発現することができる該発現宿主細胞内でトランスフェクトすること、（ｉｖ）目的の抗体を産生するために、該挿入した核酸を含むトランスフェクトされた該宿主細胞を培養または継代培養すること、とによって調製されている。したがって、最初に、組換え発現宿主を調製し、次いで、抗体を発現するためにそれを培養する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１０１】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体および／もしくは抗体断片、ならびに／またはかかる抗体をコードする核酸、ならびに／または本発明の抗体により認識されるエピトープを含有する医薬組成物を提供する。また、医薬組成物は、投与を可能にするように、薬学的に許容可能な担体も含有し得る。担体は、それ自体が、組成物を受け取る個人に有害である抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子等の大型かつ代謝速度が遅い巨大分子であり得る。
【０１０２】
薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩等の鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩等の有機酸の塩を使用することができる。
【０１０３】
治療用組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール等の液体をさらに含有し得る。加えて、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質等の補助物質がかかる組成物中に存在し得る。かかる担体は、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として医薬組成物を製剤化することが可能である。
【０１０４】
本発明の範囲内で、好適な投与形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス投与または持続注入による非経口投与に適した形態を含み得る。製品が注射または注入のためのものである場合、それは、油性または水性媒体中での懸濁液、溶液または乳濁液の形態を取り得、そしてそれは、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。代替として、抗体分子は、使用前の適切な滅菌液との再構成のために、乾燥状態であり得る。
【０１０５】
製剤化され次第、本発明の組成物は、対象に直接投与することができる。一実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合されることが好ましい。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、鼻腔内、腸内、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されないあらゆる経路によって投与され得る。また、本発明の医薬組成物を投与するためにハイポスプレーも使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製され得る。
【０１０７】
組成物の直接的な送達は、概して、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内送達によって達成されるか、または組織の間質腔に送達される。また、組成物は、病変内にも投与することができる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であってもよい。既知の抗体ベースの医薬品は、例えば、医薬品を毎日、毎週、毎月等送達すべきかどうか等の投与頻度に関する手引きを提供する。また、頻度および用量は、症状の重症度にも依存し得る。
【０１０８】
本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入物質として調製され得る。また、注入前に、液体媒体中の溶液または懸濁液に適した固形も調製することができる（例えば、防腐剤を含有する滅菌水との再構成のために、シナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））等の凍結乾燥された組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製され得る。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に、香味づけたもの）として調製され得る。
【０１０９】
組成物は、微粉末またはスプレーを使用して、例えば、肺内投与のために吸入剤として調製され得る。組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のために、例えば、ドロップとして調製され得る。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与直前に再構成できるように設計されたキット形態であり得る。例えば、凍結乾燥された抗体は、滅菌水または滅菌緩衝液を有するキット形態で提供することができる。
【０１１０】
組成物中の有効成分は抗体分子、抗体断片、またはその変異体および誘導体であることが理解されよう。したがって、それは、胃腸管における分解に影響されやすい。したがって、組成物が胃腸管を用いた経路によって投与されるのであれば、組成物は、分解から抗体を保護するが、それが胃腸管から吸収され次第、抗体を放出する薬物を含有する必要がある。
【０１１１】
薬学的に許容される担体についての徹底的な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は、通常、５．５から８．５の間のｐＨを有し、いくつかの実施形態において、６から８の間であり得、さらなる実施形態においては７であり得る。緩衝液の使用によりｐＨを維持することができる。組成物は、無菌であり得るか、および／または発熱物質を含み得ない。組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、密封容器中に供給される。
【０１１３】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の抗体および／もしくは本発明の抗体に結合するエピトープを含むポリペプチドの有効量、つまり、所望の疾患または状態を治療する、寛解させる、もしくは予防するのに十分な、または検出可能な治療効果を呈するのに十分な量を含む。また、治療効果は、身体症状の軽減も含む。任意の特定の対象に対する正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、状態の性質および程度、ならびに治療学または投与のために選択された治療学の組み合わせに依存する。所与の状況に対する有効量は、日常的な実験によって決定され、臨床従事者の判断内にある。本発明の目的で、有効用量は、概して、投与される個人において、本発明の組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである。既知の抗体ベースの医薬品は、この点における手引きを提供し、例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、２１ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初期負荷用量は体重１ｋｇあたり４ｍｇであり、毎週の維持量は体重１ｋｇあたり２ｍｇであり、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））は、３７５ｍｇ／ｍ２を毎週投与される。
【０１１４】
一実施形態において、組成物は、１つより多くの（例えば、２つ、３つ、等）の本発明の抗体を含み、相加的または相乗的な治療効果を提供することができる。さらなる実施形態において、組成物は、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、等）の本発明の抗体および、Ａ型インフルエンザウイルスに対する１つ以上の（例えば、２つ、３つ、等）の追加の抗体とを含むことができる。例えば、１つの抗体は、１つのＨＡエピトープに結合し、別の抗体はＨＡ上の異なるエピトープへ結合、またはノイラミニダーゼおよび／または基質タンパク質上のエピトープへ結合し得る。さらに、Ａ型インフルエンザワクチンまたはＡ型インフルエンザウイルスとは別の特異性を持つ抗体と共に、本発明の抗体を投与することも本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗体は、インフルエンザワクチンまたはＡ型インフルエンザウイルスとは別の特異性を有する抗体と、組み合わせて／同時に、またはそれらから別時に、投与可能である。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで第１の抗体は本発明の抗体であり、ＨＡエピトープに対し特異的であり、第２の抗体はノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープおよび／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。例えば、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで、第１の抗体はＡ型インフルエンザウイルスＨＡのステムにおけるエピトープに対し特異的であり、および第２の抗体はノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープ（例えば、ＨＡの球状部領域におけるエピトープ、第２のＨＡステムにおけるエピトープ）、および／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。ステムにおける、またはＡ型インフルエンザウイルスＨＡの球状部領域における第２のエピトープは、１つ以上のＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ間で保存され得るが、そうである必要はない。
【０１１６】
さらに別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、そこで、第１の抗体はノイラミニダーゼエピトープに対し特異的であり、第２の抗体は第２のノイラミニダーゼエピトープ、ＨＡエピトープおよび／またはマトリックスエピトープに対し特異的である。
【０１１７】
さらなる別の実施形態において、本発明は、２つ以上の抗体を含有する医薬組成物を提供し、第１の抗体はマトリックスエピトープに対し特異的であり、第２の抗体は、第２のマトリックスエピトープ、ＨＡにおけるエピトープおよび／またはノイラミニダーゼに対し特異的である。
【０１１８】
本発明のＡ型インフルエンザウイルス標的タンパク質に対し特異的な例示的抗体は、これらに限定されないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１またはＦＩ２８変異体２を含む。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ６変異体１またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ６変異体２またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体１またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体２またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１２０】
本発明の抗体は、例えば、放射線療法、化学療法化合物等の他の治療学とともに投与する（組み合わせてまたは別個に）ことができる。一実施形態において、治療化合物はタミフル等の抗ウイルス化合物を含む。かかる併用療法は、単独で投与する場合に、個々の治療薬と比較して治療効果の相加的または相乗的向上を提供する。本明細書で使用される「相乗作用」という用語は、各それぞれの活性薬剤の個々の効果の和よりも大きい２つ以上の活性薬剤の併用効果を説明するために使用する。したがって、２つ以上の薬剤の併用効果が活性またはプロセスの「相乗的阻害」をもたらす場合、それは、活性またはプロセスの阻害が、各それぞれの活性薬剤の阻害効果の和よりも大きいことを意図する。本明細書で使用される「相乗的治療効果」という用語は、２つ以上の治療の組み合わせで観察された治療効果を指し、治療効果（多数のパラメータのいずれかによって測定されたような）は、それぞれ個々の治療で観察される個々の治療効果の和よりも大きい。
【０１２１】
抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス治療に対して以前に反応を示さなかった、つまり、抗インフルエンザ治療に対して抵抗性を示したそれらの患者に投与され得る。かかる治療は、抗ウイルス剤を用いた以前の治療を含み得る。これは、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスの抗ウイルス耐性株による感染に起因し得る。
【０１２２】
一実施形態において、本発明の抗体を含む本発明の組成物において、抗体は、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上）を占める。かかる組成物において、抗体は精製された形態である。
【０１２３】
本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、（ｉ）本発明の抗体を調製するステップと、（ｉｉ）精製した抗体を１つ以上の薬学的に許容される担体と混合するステップとを含む、方法である。
【０１２４】
また、本発明は、医薬品を調製する方法も提供し、抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを混合するステップを含み、抗体は、本発明の形質転換されたＢ細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得、次いで、医薬品を調製する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１２５】
治療目的のために抗体またはＢ細胞を送達することの代替案として、核酸が原位置で対象内に発現され、所望の治療効果を提供できるように、目的のモノクローナル抗体（またはその活性断片）をコードする核酸（典型的には、ＤＮＡ）を対象に送達することが可能である。適切な遺伝子治療法および核酸送達ベクターは、当技術分野において既知である。
【０１２６】
本発明の組成物は、免疫原性組成物、およびいくつかの実施形態においては、本発明の抗体に認識されたエピトープを含有する抗体を含むワクチン組成物で有り得る。本発明によるワクチンは、予防のため（つまり、感染を防止するため）または治療のため（つまり、感染を治療するため）のいずれかであり得る。一実施形態において、本発明は、配列番号３７、３８、３９または４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むワクチンを提供する。
【０１２７】
組成物は、特に複数回投与形式でパッケージされる場合に、抗菌薬を含み得る。組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含むことができる。界面活性剤は、通常、例えば、＜０．０１％の低濃度で存在する。組成物はまた、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）も含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が典型的である。
【０１２８】
さらに、組成物は、特に、それらが凍結乾燥される場合か、またはそれらが、凍結乾燥された材料から再構成された材料を含む場合に、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）で、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を含む。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調製され得る。
【０１２９】
また、本発明の組成物は、１つ以上の免疫調節剤も含み得る。一実施形態において、免疫調節剤のうちの１つ以上は、アジュバントを含む（複数可）。
【０１３０】
本発明のエピトープ組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染に効果的に対処するために、細胞媒介免疫応答および体液性免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫学的応答は、持続性（例えば、中和）抗体および、Ａ型インフルエンザウイルスへの曝露後に急速に応答することができる細胞媒介の免疫との両方を誘発し得る。
【０１３１】
医学的治療および用途
本発明の抗体および抗体断片、または誘導体およびその変異体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防またはＡ型インフルエンザウイルス感染の診断のために使用され得る。
【０１３２】
診断方法は、抗体または抗体断片を試料と接触させることを含む。かかる試料は、例えば、鼻腔、洞、腔、唾液腺、肺、肝臓，膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳または皮膚から取った組織試料であり得る。また、診断方法は、抗原／抗体複合体の検出も含む。
【０１３３】
したがって、本発明は、治療における使用のための（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、またはその変異体および誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープ、または（ｉｖ）本発明の抗体に結合するエピトープに結合する能力を持つ、好ましくは抗体であるリガンドを提供する。
【０１３４】
本発明はまた、本発明による抗体、抗体断片、もしくはその変異体および誘導体、または、本発明の抗体に結合するエピトープに結合する能力を持つ、好ましくは抗体であるリガンドを患者に投与することを含む、患者を治療する方法も提供する。一実施形態において、該方法は、対象のＡ型インフルエンザウイルス感染を減少させる。別の実施形態において、該方法は、対象におけるＡ型インフルエンザウイルス感染を阻止、そのリスクを低減、または感染を遅延させる。
【０１３５】
本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための薬物製造における、（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、もしくはその変異体および誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープ、または（ｉｖ）本発明の抗体に結合する能力を持つエピトープに結合する、好ましくは抗体であるリガンドの使用も提供する。
【０１３６】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防または治療のための薬物として使用するための組成物を提供する。また、患者の治療および／または患者の診断のための薬物の製造における、本発明の抗体および／またはかかる抗体が結合するエピトープを含むタンパク質の使用も提供する。本発明はまた、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、対象を治療するための方法も提供する。いくつかの実施形態において、対象はヒトであり得る。治療処置の有効性を確認する一方法は、本発明の組成物の投与後に、疾患症状をモニターすることを包含する。治療は、単回投与計画または複数回投与計画であることができる。
【０１３７】
一実施形態において、本発明による抗体、抗体断片、不死化Ｂ細胞クローン、エピトープまたは組成物は、かかる治療を必要とする対象へ投与される。かかる対象は、これに限定されないが、特にＡ型インフルエンザウイルス感染の危険性のある者であり、例えば、免疫不全者を含む。本発明の抗体または抗体断片は、受動免疫または能動ワクチン接種において使用可能である。
【０１３８】
抗体およびその断片は、本発明において記述したように、Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断のためのキットにおいても使用され得る。さらに、本発明の抗体へ結合可能なエピトープは、防御的抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することによりワクチン摂取手順の効率を監視するためのキットにおいて使用し得る。また、本発明において記述したように、抗体、抗体断片、またはその変異体および誘導体は、所望の免疫原性でのワクチン製造をモニターするためのキットにおいても使用され得る。
【０１３９】
また、本発明は、医薬品を調製する方法を提供し、モノクローナル抗体を１つ以上の薬学的に許容可能な担体と混合するステップを含み、モノクローナル抗体は、本発明のトランスフェクトされた宿主から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初に、モノクローナル抗体を得て（例えば、それを発現するおよび／またはそれを精製する）、次いで、それを医薬担体と混合する手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって非常に異なる時間に行うことができる。
【０１４０】
本発明の形質転換されたＢ細胞または培養されている血漿細胞から始めて、継代培養、クローニング、サブクローニング、配列決定、核酸調製等の種々のステップを、各ステップでの任意の最適化と伴い、形質転換されたＢ細胞または培養されている血漿細胞によって発現される抗体を永続化させるために行うことができる。好適な実施形態において、上記の方法は、抗体をコードする核酸に適用される最適化の技術（例えば、親和性成熟または最適化）をさらに含む。本発明は、そのようなステップ時に使用および調製される全ての細胞、核酸、ベクター、配列、抗体等を包含する。
【０１４１】
これらの全ての方法において、発現宿主内で使用される核酸は、ある種の核酸配列を挿入、欠失または修正するように、操作され得る。かかる操作からの変更は、制限酵素部位を導入するため、コドン使用頻度を変更するため、転写および／または翻訳制御配列を追加または最適化するため等の変更を含むが、これらに限定されない。また、コードされたアミノ酸を変化させるために、核酸を変更することも可能である。例えば、それは、抗体のアミノ酸配列に１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個等）のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を導入するために有用であり得る。このような点突然変異は、エフェクター機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性等を修飾することができるか、共有結合基（例えば、標識）の付着のためにアミノ酸を導入することができるか、またはタグ（例えば、精製目的で）を導入することができる。突然変異は、特異的部位に導入することができるか、または、ランダムとその後の淘汰（例えば、分子進化）により導入することができる。例えば、本発明の抗体のＣＤＲ領域、重鎖可変領域、または軽鎖可変領域のうちのいずれかをコードする１つ以上の核酸に、無作為にまたは方向付けをもって変異を導入して、コードしたアミノ酸に異なる特性をもたらすことができる。かかる変化は反復プロセスの結果であり得、そこでは最初の変化が保持されて、他のヌクレオチドの位置で新しい変化が導入される。さらに、独立したステップにおいて達成される変化を組み合わすことができる。コードされたアミノ酸にもたらされる異なる特性は、これに限定されないが、親和性の増大を含む。
【０１４２】
一般
本明細書で用いられている「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみから成るか、または、例えばＸ＋Ｙ等、何らかの付加的なものを含み得る。
【０１４３】
「実質的に」という用語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もあり得る。必要であれば、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略され得る。
【０１４４】
数値ｘに関連する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４５】
本明細書で用いる「疾患」という用語は、概して、正常機能を損ない、そして、典型的には、特徴的な徴候および症状によって顕在化し、ヒトもしくは動物の正常機能を損なわせる、ヒトもしくは動物の体の、またはその一部の異常な状態を反映するという点で、「障害」および「状態」（医学的状態等の状態）という用語と同義であり、それらと互換的に使用されることが意図されている。
【０１４６】
本明細書で用いる場合、患者の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」への言及は、予防、予防法および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）を含むことを意図する。本明細書で用いられる「対象」または「患者」という用語は、ヒトを含む全ての哺乳類を意味し、互換的に使用される。対象の例としては、ヒト、雌ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウサギが挙げられる。一実施形態において、患者はヒトである。
【実施例】
【０１４７】
実施例
以下の実施例において、本発明の例示的な実施形態を提供する。以下の実施例は、単なる例示目的として、本発明を使用する当業者の補助となるように提示される。実施例は、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１４８】
例１． 血漿細胞からのＡ型インフルエンザウイルスを広範に中和する抗体の産生および特徴付け
季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１およびＨ３ＨＡを含有する）に応答してヘテロサブタイプ抗体を産出する個人を識別するために、ワクチンまたは非関連であるＨ５ ＨＡ（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）に結合する抗体を分泌する能力を促進されてから７日目に採取された、循環血漿細胞によるＥＬＩＳＰＯＴによりスクリーニングを行った。特筆すべきことに、Ｈ５特異的な血漿細胞を試験された５人中４人のドナーが検出不可能であったが、１人のドナーでは、ＩｇＧを分泌している血漿細胞の１４％がＨ５に対する抗体を産出し、５７％がワクチンに対して抗体を産出した。ＣＤ１３８＋血漿細胞は、磁性マイクロビーズを使用し、続いてＦＡＣＳＡｒｉａを使用して細胞分類することにより、ワクチン接種後から７日目に採取された抹消血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から単離された。限られた数の血漿細胞が、マイクロウェル培養皿に播種された。培養上清は、抗原組換えＨ５またはＨ９ ＨＡおよび無関係な抗原破傷風トキソイドを使用した３つの平行線定量ＥＬＩＳＡ法において試験された。スクリーニングされた４，９２８の培養上清検体中、１２がＨ５ ＨＡと結合したがＨ９ ＨＡには結合せず、２５がＨ９ ＨＡと結合したがＨ５ ＨＡには結合せず、５４がＨ５およびＨ９の双方と結合した。最も高いＯＤシグナルを伴う５４の培養物のいくつかを、ＲＴ−ＰＣＲに供し、２対のＶＨおよびＶＬ遺伝子が回収された。
【０１４９】
ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、発現ベクターへクローン化され、および組換え抗体が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって産生された。２つのモノクローナル抗体、ＦＩ６およびＦＩ２８、は大部分のＶ、ＤおよびＪ遺伝子断片（ＩＧＨＶ３−３０＊０１、ＩＧＨＤ３−９＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２およびＩＧＫＶ４−１＊０１）を共有したが、Ｎ領域、ＩＧＫＪ使用頻度および体細胞変異のパターンにおいて異なっており、したがって、クローン的には関連しない。
【０１５０】
組換え抗体の特異性は、異なったサブタイプに属するＨＡの一パネルを使用したＥＬＩＳＡ法により調査された。著しくも、ＦＩ６は、グループ１（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）およびグループ２（Ｈ３およびＨ７）を含む、試験された全てのＡ型インフルエンザにおけるＨＡサブタイプと結合したが、Ｂ型インフルエンザウイルスからのＨＡとは結合しなかった。一方、ＦＩ２８は、３つのグループ１ ＨＡ（Ｈ１、Ｈ５およびＨ９）とのみ結合した。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
２つの抗体のＶＨおよびＶＬ配列における相同性を鑑みて、ＦＩ６、ＦＩ２８、および７Ｉ１３（Ｈ鎖と同様のＶ、ＤおよびＪ要素を使用するｈＣＭＶ特異性抗体）のＨおよびＬ鎖を使用して、シャッフリング実験を行った。Ｈ７への結合にはＦＩ６ ＨおよびＬ鎖が対になることを要したが、Ｈ５への結合はＦＩ６およびＦＩ２８ Ｌ鎖がシャッフルされた時も維持された。さらに、Ｈ５との結合は、ＦＩ６のＨ鎖が非関連７Ｉ１３ Ｌ鎖と対になった時観察された。一方、Ｈ５との結合は、相同７１１３Ｈ鎖がＦＩ６Ｌ鎖と対になった時は観察されなかった。いずれの理論にも束縛されるものではないが、これらの結果は、Ｈ５結合に対する主な貢献はＨ鎖によるものであるが、Ｈ７結合はＦＩ６のＨおよびＬ鎖の正確な対を要することを示している。
【０１５３】
ＦＩ６およびＦＩ２８は、次に、Ａ型インフルエンザサブタイプにおけるグループ１およびグループ２を中和する能力を、偽型ウイルス（表５）および伝染性ウイルス（表６）を使用して試験した。著しくも、ＦＩ６は、抗原性の異なる分岐群０、１、２．１、２．２および２．３、および２つのＨ７鳥分離株に属する、６つのＨ５分離株を含む、試験された全ての偽型ウイルスを中和した。さらに、ＦＩ６は、２つのＨ３Ｎ２ウイルスおよび、近年大流行したＨ１Ｎｌ分離株Ａ／ＣＡ／０４／０９までの数十年範囲で４つのＨ１Ｎｌウイルス（表６）を含む、試験された全ての感染性ウイルスを中和した。ＦＩ２８は全てのＨ５偽型ウイルスを中和したが、試験された全てのＨ７偽型ウイルスおよび感染性ウイルスを中和しなかった。偽型ウイルスにおける中和力価は、感染性ウイルスにおける力価よりも高かった。
【０１５４】
【表５】
【０１５５】
【表６】
【０１５６】
例２． ＦＩ６およびＦＩ２８抗原性結合部位
抗体ＦＩ６およびＦＩ２８が結合する抗原性部位を識別するため、我々は、第一に、ＨＡステム領域における保存された領域にマップされたマウスモノクロナール抗体である、Ｃ１７９の結合を阻止する能力を試験した（Ｙ．Ｏｋｕｎｏ， ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７，２５５２（１９９３））。ＦＩ６およびＦＩ２８の双方が、組換えＨ５ＶＮ／１２０３／０４ＨＡとＣ１７９の結合を完全に阻止し、それらが重複するエピトープを認識することを示唆している。一方、ＦＩ６およびＦＩ２８は、ＨＡの球状部領域において異なるエピトープを認識するＨ５Ｎ１免疫ドナーから単離された、Ｈ５特異性抗体の一群と競合しなかった（Ｃ．Ｐ．Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ４，ｅｌ７８（２００７）；Ｓ． Ｋｈｕｒａｎａ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ６，ｅｌ００００４９（２００９））。エスケープ変異体の選択によるＦＩ６エピトープをマップする試みは失敗したが、それはそのエピトープが、ウイルス適応性の損傷無しには、容易には変異可能ではないことを示唆している。
【０１５７】
我々は、次に、ＨＡ ＡＡＨＳｆ／１１９４／０４の線状および環状ペプチドライブラリを使用した、ペプチドをベースとしたマッピング、ならびにＰｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ ＢＶシステムを使用したヘリックススキャンを行った（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。この分析は、ＦＩ６の結合領域を特定し、ＨＡ２融合ペプチドＦＧＡＩＡＧ（Ｈ３番号付けでは、アミノ酸３〜８、配列番号３７）、ＨＡ２ヘリックスＡペプチドＤＧＶＴＮＫＶＮＳ（アミノ酸４６〜５４、配列番号３８）、ＨＡ２ヘリックスＢペプチドＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫ（アミノ酸１０２〜１１６、配列番号３９）、およびＨＡ１ Ｃ末端ペプチドＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰ（アミノ酸３１５〜３２５、配列番号４０）を含む。この抗体は、ＨＡ１ Ｃ末端ペプチドおよびＨＡ２ヘリックスＢペプチドと反応しなかったため、ＦＩ２８の結合領域は、ＦＩ６のものとは異なる。
【０１５８】
参考文献
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Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．２５３−３１５
Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｖｓ ３６：２７７
ＫｏＨ１ｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，．１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７．
Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２．
国際公開第２００４／０７６６７７号
Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｆ Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００；ＡＳＩＮ：０７１６７３３３１５
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００３，１９（１）：１６３−８
Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００１，３７：２３−３０ Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００３，１９：２２９−３２
米国特許第５，８０７，７１５号
米国特許第６，３００，１０４号
Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７（４）：９３７−４３．
Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．，（２００５）．Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １１， ４１１−４１６．
Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００）．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４５，１７３３−１７４１．
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Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０，８７１−８７５．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプおよびグループ２サブタイプの感染を中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、赤血球凝集素のステム領域内のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片は、配列番号３７、３８、３９、または４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和に必要とされる抗体の濃度は、２０μｇ／ｍｌ以下である、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項５】
Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和に必要とされる抗体の濃度は、４μｇ／ｍｌ以下である、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項６】
前記グループ１サブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、またはＨ９である、請求項１、２、もしくは３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記グループ２サブタイプは、Ｈ３またはＨ７である、請求項１、２、または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体断片は、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のサブタイプのＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する、請求項１、２、または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体は、サブタイプ（ｉ）Ｈ１およびＨ３、（ｉｉ）Ｈ１およびＨ７、（ｉｉｉ）Ｈ３およびＨ５、（ｉｖ）Ｈ３およびＨ９、（ｖ）Ｈ５およびＨ７、（ｖｉ）Ｈ７およびＨ９、（ｖｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７、または（ｖｉｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９のＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１〜６または１７〜２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１または配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２または配列番号 １８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３と、を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３と、を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３、あるいはＣＤＲＨ１に対して配列番号１７、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１８、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１１または１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６、あるいはＣＤＲＬ１に対して配列番号２０、ＣＤＲＬ２に対して配列番号２１、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１、１２、または１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号１３、３３、２９、または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号１４または配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片
【請求項１８】
前記抗体は、ＦＩ６変異体１またはＦＩ６変異体２である、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗体は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、精製された抗体、単離された抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体と同一エピトープに結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、３４、２３〜２８、３１、３２、または３６のうちのいずれか１つの核酸配列と少なくとも７５％相同である、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現するか、または請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２２もしくは請求項２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、または請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
第１の抗体またはその抗原結合断片と、第２の抗体またはその抗原結合断片と、を含む医薬組成物であって、前記第１の抗体は、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体であり、前記第２の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する、医薬組成物。
【請求項２９】
（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断における、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２２もしくは請求項２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチド、または請求項２７もしくは請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
抗Ａ型インフルエンザウイルスワクチンの抗原が正しい立体構造の特定のエピトープを含有していることを確認することにより、前記ワクチンの品質を監視するための、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項３１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染を低減させるか、またはＡ型インフルエンザウイルス感染の危険性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
（ｉ）治療における、（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉｉ）ワクチンとしての、または（ｉｖ）Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおける、使用のための、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する、エピトープ。
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスのグループ１サブタイプおよびグループ２サブタイプの感染を中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、赤血球凝集素のステム領域内のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、グループ１およびグループ２から選択されるＡ型インフルエンザウイルスの２つ以上のサブタイプの間で保存される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片は、配列番号３７、３８、３９、または４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和に必要とされる抗体の濃度は、２０μｇ／ｍｌ以下である、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項５】
Ａ型インフルエンザウイルスの５０％中和に必要とされる抗体の濃度は、４μｇ／ｍｌ以下である、請求項１、２、または３に記載の抗体。
【請求項６】
前記グループ１サブタイプは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、またはＨ９である、請求項１、２、もしくは３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記グループ２サブタイプは、Ｈ３またはＨ７である、請求項１、２、または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗体断片は、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のサブタイプのＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する、請求項１、２、または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体は、サブタイプ（ｉ）Ｈ１およびＨ３、（ｉｉ）Ｈ１およびＨ７、（ｉｉｉ）Ｈ３およびＨ５、（ｉｖ）Ｈ３およびＨ９、（ｖ）Ｈ５およびＨ７、（ｖｉ）Ｈ７およびＨ９、（ｖｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７、または（ｖｉｉｉ）Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９のＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１〜６または１７〜２２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列相同性を有する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１または配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１と、配列番号２または配列番号 １８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２と、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３と、を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号４または配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６または配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３と、を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
ＣＤＲＨ１に対して配列番号１、ＣＤＲＨ２に対して配列番号２、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号３、あるいはＣＤＲＨ１に対して配列番号１７、ＣＤＲＨ２に対して配列番号１８、およびＣＤＲＨ３に対して配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１１または１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
ＣＤＲＬ１に対して配列番号４、ＣＤＲＬ２に対して配列番号５、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号６、あるいはＣＤＲＬ１に対して配列番号２０、ＣＤＲＬ２に対して配列番号２１、およびＣＤＲＬ３に対して配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１、１２、または１３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号１３、３３、２９、または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
配列番号１４または配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１５のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片
【請求項１８】
前記抗体は、ＦＩ６変異体１またはＦＩ６変異体２である、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
前記抗体は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、精製された抗体、単離された抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体と同一エピトープに結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、Ａ型インフルエンザウイルスを中和する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための、前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
前述の請求項のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、３４、２３〜２８、３１、３２、または３６のうちのいずれか１つの核酸配列と少なくとも７５％相同である、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現するか、または請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片に結合するエピトープを含む、単離または精製された免疫原性ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２２もしくは請求項２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、または請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤または担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
第１の抗体またはその抗原結合断片と、第２の抗体またはその抗原結合断片と、を含む医薬組成物であって、前記第１の抗体は、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体であり、前記第２の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和する、医薬組成物。
【請求項２９】
（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉ）ワクチンにおける、または（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の診断における、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２２もしくは請求項２３に記載の核酸、請求項２４に記載のベクター、請求項２５に記載の細胞、請求項２６に記載の免疫原性ポリペプチド、または請求項２７もしくは請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
抗Ａ型インフルエンザウイルスワクチンの抗原が正しい立体構造の特定のエピトープを含有していることを確認することにより、前記ワクチンの品質を監視するための、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項３１】
Ａ型インフルエンザウイルス感染を低減させるか、またはＡ型インフルエンザウイルス感染の危険性を低下させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
（ｉ）治療における、（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルス感染の治療のための薬物の製造における、（ｉｉｉ）ワクチンとしての、または（ｉｖ）Ａ型インフルエンザウイルス感染を中和することが可能なリガンドのスクリーニングにおける、使用のための、請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する、エピトープ。
【公表番号】特表２０１１−５２８９０１（Ｐ２０１１−５２８９０１Ａ）
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１９２５２（Ｐ２０１１−５１９２５２）
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６６１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０４６６
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５１１０１７２８７）インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン (4)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２７日（２００９．７．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６６１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１０４６６
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５１１０１７２８７）インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン (4)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ
【Ｆターム（参考）】
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