持効型活性を有する新規インスリン類似体
糖尿病の予防及び治療に役立つ可能性がある、持効型治療活性を有する組み換えヒトインスリンの新規生合成類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、持効型治療活性を有する組み換えヒトインスリンの新規生合成類似体に関するものであり、糖尿病の予防及び治療に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
インスリンとそのさまざまな誘導体は、糖尿病の治療に大量に使用され、しばしば工業的に大規模に製造される。インスリンの改変誘導体は数多く知られており、異なる活性プロファイルを有する多数の医薬製剤が存在するが、人体内で長時間にわたりグルコースを一定のレベルに保つことを可能とする薬品の探索は続いている。
【０００３】
正常ヒトインスリン製剤には、遅効型及び／又は持効型の活性効果を得るために、例えば、さまざまな分量のプロタミンなどの特定の添加物を含有するものがある。プロタミンは、インスリンと共に不溶性の錯体を形成するタンパク質であり、皮下組織に沈着物を形成し、そこからインスリンが徐々に放出されるものである。
【０００４】
糖尿病の治療に使用されるヒトインスリン誘導体には、アミノ酸が付加されたもの、あるいはいくつかのアミノ酸の配列が改変されたものなど、さまざまなものが知られている。インスリンの一次構造の変更は、その二次構造及び三次構造に影響し、それがタンパク質の化学的及び生物学的性質に影響を及ぼし、結果的に、薬物動態学及び薬力学上の効果をもたらす。これらの変更はさまざまな特徴を有し、改変されたインスリンの活性を即効型、又は、遅効型且つ持効型にしたりすることができる。インスリンの活性形は単量体で、これは皮下注射後に容易に血液中に浸透する。溶液中の外因生ヒトインスリンは６量体であり、これが接種後に２量体へ、続いて血流中に浸透する前には単量体へと解離することが分かっている。即効性を特徴とするインスリン誘導体の１つはリスプロ・インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））で、これは、Ｂ鎖中のプロリン（２８）−リジン（２９）の配列が反転されたものである。立体的な観点から、これは溶液中でのインスリン２量体の形成を困難にする。こうした誘導体の第２は、Ｂ鎖２８位のプロリンがアスパラギン酸に置換されたものである。こうして導入された負電荷は、インスリン単量体の自己会合の可能性を引き下げる。これらのインスリン誘導体はいずれも、その構造のために、吸収速度が速くなる。
【０００５】
持効型組み換えヒトインスリン類似体は、Ｂ鎖を塩基性アミノ酸で延長するか、又はＢ鎖のリジンのεアミノ基を１２個前後の炭素原子を有する脂肪酸でアシル化することによって構成される。
【０００６】
これらの追加塩基性アミノ酸の導入は、インスリンの化学的又は物理的な性質をいくつかに変更する。最も重要な変更は等電点の移行であり、過剰の正電荷が分子内に導入される結果、等電点は、改変されていない天然インスリンの５．４から、約５．５から約８．５までの範囲に移行する。その結果、これらの類似体の中性水環境における溶解性は低下し、そのためこうした改変インスリンを含む医薬製剤の生産における弱酸性環境の使用が必要になる。
【０００７】
しかし、追加塩基性アミノ酸の導入による、明白な利点のほかに、主として酸性環境中で生じるＡ２１位のアスパラギンの脱アミノ化反応に由来する新規類似体の安定性低下という欠点も観察される。
【０００８】
この問題点は、Ａ２１Ａｓｎを、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、トレオニンその他のアミノ酸に置換することによって対処される。こうした類似体の１つが、Ａ鎖アスパラギン（２１）をグリシン（２１）に置換し、Ｂ鎖Ｃ末端に２個のアルギニン残基が結合した組み換えヒトインスリン誘導体である。これはいわゆるインスリンのグラルギン誘導体で、ランタスという名称で製造されている（米国特許第５６５６７２２号）。
【０００９】
本発明の過程で、Ｂ鎖Ｃ末端にリジン（Ｂ３１Ｌｙｓ）とアルギニン（Ｂ３２Ａｒｇ）の残基を付加したヒトインスリン誘導体は、グラルギン誘導体に類似した生物活性を示すことが実証され、すでに上市されている。動物で実施した予備試験では、リズアルグインスリンと称するこの製剤は、天然インスリンの分泌を模した持効型の活性と均一の放出プロファイルを特徴とし、臨床の観点から言えば−夜間低血糖を軽減することが示される。ヒトインスリン及びプロインスリンに酷似しているため、薬剤候補の漸進的な開発及びその最終的な商品化を可能とする良好な研究結果が期待される。ヒトインスリンのＢ鎖Ｃ末端のＬｙｓＡｒｇ配列がヒトのプロインスリンに存在していることが重要であり、カルボキシペプチダーゼＣの存在によるリズアルグインスリンのヒトインスリンへの転換を予想させるはずである。このことは、人体内でのリズアルグインスリンの最初の代謝産物は、外因生ホルモンの場合でも、周知の、容認できる特徴を有するヒトインスリンである可能性があることを意味する。ラットについて拡大前臨床試験が実施され、この新規インスリン類似体の持効型活性が確認された。
【００１０】
しかしこの誘導体には、その有利な生物活性とは別に、酸性の注射溶液中での安定性に乏しいという特徴が判明した。第一義的に脱アミド反応として出現する安定性不足の主因は、Ａ鎖Ｃ末端のアスパラギン残基の存在であり、酸性水環境中ではそこでカルボキシル基に由来するプロトンによる自己触媒脱アミド反応が発生する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５６５６７２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、酸性注射溶液（ｐＨ３．５〜５）中で適切な安定性を示すと同時に求められる生物活性を有するインスリンの新規類似体を提供することである。それらが天然インスリンの生物活性の特徴を示すことが特に望ましい。また、新規誘導体の活性開始が実用上迅速で、患者への投与直後に効果を発揮し、かつ投与量の一部分の持続的放出能力を有することが特に重要である。これにより、インスリン類似体を含有する医薬製剤の持つ即効型と持効型の両方の作用を提供することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明において、予想外に上記の目標が達成された。
【００１４】
本発明の基本態様は、Ａ鎖及びＢ鎖を構成する２つのポリペプチドを含むインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩であり、ここでＡ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜５から選択されると共に、Ｂ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６〜８から選択される。本発明による好ましいインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩は、等電点５〜８．５の組み換えヒトインスリン類似体であり、且つ、式１であることを特徴とする。
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、ＲはＮＨ２基又は式Ａｓｎ−Ｒ２で表される基を示し、ここでＲ２は中性Ｌ−アミノ酸又はＮＨ２基を示し、且つ、
Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇを示し、ここでＢ３Ａｓｎは選択的に他のアミノ酸、有利にはＧｌｕに置換されていてもよい。
【００１７】
有利には、本発明によるインスリン誘導体又はその生理学的に容認できる塩は下記を特徴とする：
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示し、Ｂ３ＡｓｎはＢ３Ｇｌｕで置換されていること。
【００１８】
上記のように、グラルギンの場合、低安定性の問題はＡ２１位のアスパラギンをグリシンで置換することによって解決されている。本発明で説明される、持効性と酸性注射液中での安定性を呈するインスリン類似体を得ることを目的とする研究は、別の方向に進んだ。低安定性の原因であるカルボキシル基をブロックするために、遺伝子工学と酵素形質転換の手法を用いてアスパラギン残基中のカルボキシル基を別の方法で改変した、リズアルグインスリンの新規誘導体を得た。研究を実施した結果、予想外に、式１のヒトインスリンの誘導体で、Ａ鎖のＣ末端を中性アミノ酸残基（Ａ２２）で延長し、又はＡ鎖Ｃ末端のアスパラギンもしくはシステインのカルボキシル基をカルボキシアミド基に変換し、かつ、Ｂ鎖Ｃ末端にリジンとアルギニンの残基（Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ）、又は２個のアルギニン残基（Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ）、又は１個のアルギニン残基（Ｂ３１Ａｒｇ）を付加したものが、グラルギン及びリズアルギン誘導体に似た化学的・生物学的性質を呈することが判明した。このような方法で得られた新規類似体は、酸性注射溶液（ｐＨ３．５〜５）中で適切な安定性を有すると同時に、所望の生物活性を呈する。
【００１９】
導入された改変は、予想外に、安定なインスリン誘導体の医薬組成物を得ると同時に、生物活性を維持し、等電点のｐＨ５〜８への移行をもたらした。このため、注射された場所の生理的ｐＨにおける新規インスリン誘導体の溶解性が低下する。これにより、皮下組織中でのインスリン誘導体の微細沈着物が沈殿し、その後の同物質が血液中へ持続放出され、長時間にわたって治療レベルが維持されることになる。
【００２０】
これらの化合物の特性とその組成は、安定性試験及び実験的糖尿病の動物における活性試験によって確認されている。この間に、予想外に、低血糖活性効果が著しく長時間にわたって発揮され、参照した市販の持効型インスリン誘導体で観察される効果と比較して、その効果が当該薬品の投与を停止した後も長時間持続することが判明した。このことから、本発明の主題である誘導体の性質は、薬品の投与頻度を著しく減らすことを可能にし、それによって患者治療の有効性、安全性及び快適性が向上することが予想できる。また、本発明による新規誘導体の活性開始は実用上迅速で、これはこれらの化合物が予想外に即効型及び持効型活性両方の既成インスリン類似体の生物活性の特徴を呈することを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
式１のインスリン誘導体の例には下記のものがあるが、これらに限定されない。
【００２２】
【００２３】
本発明の主題である組み換えヒトインスリン類似体の名称を単純化するために、「インスリン」の名称と、付加されるか又は元のヒトインスリン粒子中に存在するアミノ酸を置換したアミノ酸残基を示す２〜４個のアルファベット大文字とからなる記号を付した。大半の場合、これらの文字は、文献中で見られるアミノ酸残基の一文字表記と一致。自然には生じない２つの残基についてのみ、別の文字、すなわち「Ｚ」と「Ｘ」を使用した。いずれの場合も、その文字はＡ鎖のＣ末端に位置する残基を示し、そこに末端ＣＯＯＨ基に代わってＣＯＮＨ２基が入ったものである。文字「Ｚ」は対応するアスパラギンアミド（すなわちＡ２１Ａｓｎ−ＮＨ２）を示し、文字「Ｘ」はシステインアミド（すなわちｄｅ（Ａ２１Ａｓｎ）Ａ２０Ｃｙｓ−ＮＨ２）を示す。
【００２４】
式１のインスリン類似体は、遺伝子工学の標準的方法を使用する一連の遺伝子操作によって作成した。
【００２５】
このために、例えば部位特異的突然変異導入などの遺伝子工学を使用して、組み換えヒトプロインスリンをコードする遺伝子の変異体を作成した。部位特異的突然変異導入反応は、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用して実施し、テンプレートとしてプラスミドＤＮＡのｐｌＧＡＬＺＵＩＮＳ−ｐ５／ＺＵＩＮＳ又はｐｌＧＴＥＴＺＵＩＮＳ−ｐ６／ＺＵＩＮＳを使用した。また、組み換えヒトプロインスリン又はプレプロインスリンの適当な配列を含むその他のＤＮＡも、テンプレートとして使用できる。
【００２６】
本発明によれば、一般に認められた用語に鑑み、組み換えヒトプロインスリンはヒトインスリンのＡ鎖とＢ鎖がジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇによって連結されたポリペプチドの鎖と理解され、組み換えプレプロインスリンはプロインスリンと付加される、例えば、ユビキチン等のリーダーポリペプチドの組合せ、又はＳＯＤもしくはその断片と理解される。
【００２７】
例としてＤＨ５α、ＤＨ５又はＨＢ１０１などの適当な大腸菌株のコンピテント細胞の形質転換のために反応混合物を使用したが、他の大腸菌株の細胞もしくは他の微生物の細胞、または組み換えタンパク質の発現に使用できるその他の既知の細胞株を使用することができる。ヌクレオチド配列の正確性を検証するために、組み換えヒトプロインスリンをコードする遺伝子の所与の改変を含むプラスミドを分離し、解読した。本発明の一変型では、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換に組み換えヒトプロインスリンをコードする改変遺伝子を含むプラスミドを使用し、細菌は選抜抗生物質（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、温度３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。菌株バンク用に細菌材料を作成し、細菌培養物と４０％グリセロール１：１の試料は−７０℃で保管した。
【００２８】
大腸菌株における発現により得られた組み換えプレプロインスリンの変異体は、細胞が分解された後に封入体の形で分離され、その後、融合タンパク質精製の標準処理を行った。再生後に得られたハイブリッドタンパク質にインスリン類似体を加えた溶液は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４６，ｐａｇｅ６７８６〜６７９１（１９７１）にＫｅｍｍｌｅｒａ他により、あるいは米国特許第６６８６１７７号及び同６１００３７６号に記述された方法など、既知の多数の方法の例と同様に、トリプシンを加えて制御された処理を行った。得られたインスリン類似体は、主として低圧クロマトグラフィ、限外濾過、及び／又はＨＰＬＣの周知の方法を用いて精製処理を行った。生成物は、十分に精製したインスリン類似体溶液から沈殿させた。
【００２９】
Ａ鎖Ｃ末端に残基Ａ２１Ａｓｎ−ＮＨ２又はＡ２０Ｃｙｓ−ＮＨ２を含む誘導体を得るために、活性αアミド体に変換された反応基質である生物のプロホルモン中で自然に発現する転換を触媒するαアミド化酵素（α−ＡＥ）を使用した。
【００３０】
酵素ＰＡＭ（ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ）は、ＰＨＭ（ペプチジルグリシンαヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ）及びＰＡＬ（ペプチジルアミドグリコール酸リアーゼ活性）活性（図表１）として表される二つの活性を有するプロテアーゼであり、Ｃ末端アミドの取得を可能にする。調査により、オキシトシン又はバソプレシン等のペプチドホルモンの半数は、最適活性を達成するのにＣ末端アミド基を必要とすることが判明した。この反応において、Ｃ末端グリシン残基からアミド基が生成し、それがここでは直接の反応前駆体である（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２。Ｍｉｌｌｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｓａｙａｄ Ｋ．Ｕ．，Ｋｕｌａｔｈｉｌａ Ｒ．Ｂｅａｕｄｒｙ Ｇ．Ａ．，Ｍｅｒｋｌｅｒ Ｄ．Ｊ．，Ｂｅｒｔｅｌｓｅｎ Ａ．Ｈ．；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ− ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９２ Ｎｏｖ １；２９８（２）：３８０−８）。
【００３１】
【化２】
図表１．活性ＰＡＭプロテアーゼによるペプチドのαアミド化の概要（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２による）
【００３２】
ＰＡＭプロテアーゼは、特にさまざまな長さのアミノ酸鎖を有する真核生物に見られるタンパク質である。本プロジェクトでは、ヒト（ホモサピエンス）由来のプロテアーゼが使用され、そこにはαアミド化プロテアーゼの活性を呈するタンパク質をコードする６個の遺伝子が見られる。
【００３３】
式１の組み換えヒトインスリン類似体の基本的な物理化学的性質でヒトインスリンと異なるのは等電点の値で、約５から約８までの値である。これは、この化合物が酸性から弱酸性のｐＨの溶液への溶解性が良いことを意味する。この性質により、組成物（酸性ｐＨの新規インスリン誘導体溶液）の調合が可能になる。
【００３４】
本発明の一態様は、有効な作用を発揮する量の、本発明によるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする医薬組成物でもある。好適には、本発明による医薬組成物は、１０から５０μｇ／ｍｌの亜鉛も含む。
【００３５】
本発明の更に他の態様は、糖尿病の治療又は予防のための薬品を製造するために、上記の本発明によるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用でもある。
【００３６】
上記によれば、本発明による医薬組成物は、有効な作用を示す量の式１のヒトインスリン生合成類似体、又はその薬理学的に容認できる塩及び補助成分を含む。
【００３７】
本発明による生合成ヒトインスリン類似体の塩は、例えばアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が可能である。
【００３８】
投与を目的として、本発明による組成物は溶液の形で調合され、有効な作用を示す量の式１のヒトインスリン生合成類似体又はその薬理学的に許容される塩、及び等張剤、防腐剤、安定化剤、任意に緩衝剤などの補助成分を含む。
【００３９】
本発明による組成物に使用される有効成分の量は約１〜１６００ｕ／ｍｌで、好適には１０〜１２００ｕ／ｍｌ、特に好適には１０〜５００ｕ／ｍｌである。本発明の主題である各ヒトインスリン類似体の場合、１単位（１ｕ）は１補助単位を意味し、６ｎモル（すなわち６×１０−９モル）に対応するインスリンの１国際単位と同じモル数の類似体を含む。
【００４０】
本発明による医薬組成物について、溶液のｐＨ値は約３．５から約５であり、好適には４．０〜４．５である。
【００４１】
一般に、本発明による組成物中の補助成分は、周知の組み換えヒトインスリンを含む製剤で使用されるものと同じ成分である。
【００４２】
本発明による等張成分は、ヒト血漿と等浸透圧の溶液を得ることが可能な成分なら何でもよい。通常、薬品に使用される等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、グリシン等であり、好ましくはグリセリンである。グリセリンの使用が好適である。
【００４３】
本発明による組成物中に使用される有用な保存剤は、ｍ−クレゾール、フェノール又はその混合物に属するグループから選択した化合物である。
【００４４】
組み換えられた正常ヒトインスリンと同様、新誘導体は、とりわけ塩化亜鉛又は酸化亜鉛の形で溶液中に導入される亜鉛イオンを付加することによって安定化する。亜鉛の量は、約５μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲が可能である。
【００４５】
以下の、本発明による組み換えヒトインスリン誘導体を含む組成物の含有成分の例を開発した：式１のヒトインスリン生合成類似体又はその薬理学的に容認できる塩１０〜５００ｕ／ｍｌ、グリセリン１６ｍｇ／ｍｌ、ｍ−クレゾール２．７〜３ｍｇ／ｍｌ、亜鉛１０〜５０μｇ／ｍｌ、及び注射用水１ｍｌになるまで。
【００４６】
本発明の本質をより良く説明するために、この明細書本文では本発明の実施例について詳細に記述しており、添付の配列リスト及び以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】組み換えインスリンのＧＫＲタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）の構造を表す。
【図２−１】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−２】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−３】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−４】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図３】インスリンＳＫＲタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）の構造を表す。
【図４−１】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−２】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−３】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−４】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図５】ゲンスリンＮ製剤と比較した、正常血糖ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量５ｕ／ｋｇ体重）の影響を表す。平均値±標準誤差。統計的有意性 ＊＊ｐ＜０．０１：インスリンＧＫＲ対初期グルコース濃度；＃＃ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５：ゲンスリンＮ対初期グルコース濃度；＾＾ｐ＜０．０１：インスリンＧＫＲ対ゲンスリンＮ。
【図６】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり５ｕ）の影響（ランタス製剤との比較）を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ対ランタス。
【図７】重度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり２．５ｕ、５ｕ、及び７．５ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１ ＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ２．５ｕ対対照；＾＾ｐ＜０．０１ ＾ｐ＜０．０５ ＧＫＲ５ｕ対対照；＃＃ｐ＜０．０１ ＃ｐ＜０．０５ ＧＫＲ７．５ｕ対対照。
【図８】重度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり７．５ｕ）の影響（ランタス製剤との比較）を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ対ランタス。
【図９】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量体重ｋｇ当たり５ｕでのＧＫＲインスリンの複数回投与後のラットの血中グルコース濃度を表す（ランタス製剤との比較）。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。
【図１０】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量体重ｋｇ当たり５ｕでのＧＫＲインスリン投与停止後の期間におけるラットの血中グルコース濃度を表す（ランタス製剤との比較）。
【図１１】ランタス製剤と比較した、中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり１０ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＲ対ランタス。
【図１２】レベミル製剤と比較した、中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＥＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり１０ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖。
【００４８】
実施例１．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこのプラスミドによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンの改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。ユビキチン遺伝子内でアルギニンコドンがアラニンコドンに置換され、ユビキチン遺伝子のＣ末端に追加のアルギニンコドンが付加されている。ユビキチンの一部分を構成するペプチドは、インスリン前駆体のための担体であり、大腸菌内での高効率融合タンパク質合成のための条件である。改変融合タンパク質ユビキチン−ヒトインスリンをコードする領域は、ｐｍｓ（ＷＯ０５０６６３４４Ａ２）プロモーターの制御下におかれる。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を保持する。ｐ５／ＺＵＩＮＳベクターの構築のためにｐｌＧＡＬ１プラスミドを使用し、遺伝子バンクに保管されている配列の番号はＡＹ４２４３１０である。
【００４９】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子は、Ａ鎖Ｃ末端に追加のＧＧＴコドンを付加してある点が、モデルヒトプロインスリン遺伝子と異なる。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＧｌｙ−グリシン−アミノ酸残基が延長されている。
【００５０】
ヒト組み換えプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００５１】
【化３】
【００５２】
点突然変異反応は、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用して実施した。テンプレートとして、プラスミドＤＮＡのｐ５／ＺＵＩＮＳを使用した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞は反応混合物を使って形質転換した。グリシンをコードするＧＧＴヌクレオチドの存在及びプラスミド配列の有効性を確認するために、プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）を分離し、解読した。コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換には組み換えｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする改変遺伝子を有するプラスミドを使用し、その後、このコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を、アンピシリン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を付加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。細菌材料を菌株バンクのために作成し、細菌培養液と４０％グリセロールを１：１で含む試料を−７０℃で保管した。
【００５３】
得られた大腸菌株は、実施例１０に従った生合成によるＧＫＲインスリン取得のプロセスにおいて、初期の生物素材を構成する。
【００５４】
ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの遺伝子構築
プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）は４７７５塩基対の長さがあり、次の調節配列と遺伝子で構築される：
−３７４番から１２３４番までの塩基対にアンピシリン耐性遺伝子ＡＭＰ Ｒがあり、
−４１５８番から４３２３番までの塩基対にｐｍｓプロモーターをコードする領域があり、
−４３２７番から４５５４番までの塩基対に改変合成ユビキチン遺伝子ＺＵＢＩをコードする配列があり、
−４５５８番から４７２２番までの塩基対に組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子をコードする配列があり、
−４７２９番から４７７５番までの塩基対に転写ターミネーターＴｅｒをコードする領域がある。
【００５５】
組み換えヒトインスリンタンパク質（ＧＫＲインスリン）をコードする遺伝子を含むｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構造は、図１に概略図を、また図２にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【００５６】
実施例２．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子の構築において、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）遺伝子は、Ｂ鎖３１位のＡＡＧ（Ｌｙｓ）コドンをＣＧＴ（Ａｒｇ）コドンで置換されていることを特徴とする。
【００５７】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子を改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００５８】
【化４】
【００５９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。得られた大腸菌株は、実施例１１に従った生合成によるＧＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００６０】
実施例３．ｐ５／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子と、組み換えプロインスリンＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）をコードする遺伝子との差異は、Ａ鎖２２位のＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンをＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンで置換していることである。
【００６１】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＡ鎖２２位のＧＧＴ（Ｇｌｙ）をＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンで置換して改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００６２】
【化５】
【００６３】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００６４】
得られた大腸菌株は、実施例１２に従った生合成によるＳＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００６５】
実施例４．ｐ５／ＺＵＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プロインスリンの遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端にＧＣＴコドンを付加していることである。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＡｌａ−アラニンアミノ酸残基が延長された。
【００６６】
組み換えヒトインスリン配列をコードする遺伝子をそのＣ末端にＧＣＴ（Ａｌａ）コドンを付加して改変するために、点突然変異のための次のプライマーを設計した。
【００６７】
【化６】
【００６８】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００６９】
得られた大腸菌株は、実施例１３に従った生合成によるＡＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００７０】
実施例５．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子と、組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子との差異は、Ｂ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換していることである。
【００７１】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＢ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）をＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換して改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００７２】
【化７】
【００７３】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００７４】
得られた大腸菌株は、実施例１４に従った生合成によるＧＥＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００７５】
実施例１〜５において、プラスミドの宿主としてＤＨ５α大腸菌を使用したが、上記の本発明の実施モデルにおいて、例えばＤＨ５又はＨＢ１０１のような他の大腸菌株を使用することも可能である。
【００７６】
実施例６．ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンをコードする改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。ユビキチンをコードする遺伝子内でアルギニンコドンがアラニンコドンに置換され、ユビキチン遺伝子のＣ末端に追加のアルギニンコドンが付加されている。ユビキチンの一部分を構成するペプチドは、インスリン前駆体のための担体であり、これは大腸菌内での高効率融合タンパク質発現を調節するものである。改変ユビキチン−ヒトインスリン融合タンパク質をコードする領域は、ｐｍｓプロモーター（ＷＯ０５０６６３４４Ａ２）の制御下に置かれる。このプラスミドは、テトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。ｐ６／ＺＵＩＮＳベクターの構築のためにｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。
【００７７】
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端に追加のＴＣＴコドンを付加してある点である。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＳｅｒ−セリンアミノ酸残基が延長された。
【００７８】
組み換えプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００７９】
【化８】
【００８０】
点突然変異反応を実施するためにストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用し、テンプレートとして、ｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドＤＮＡを使用した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞を反応混合物を使って形質転換した。セリンをコードするＴＣＴヌクレオチドの存在及びプラスミド配列の正確性を確認するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドを分離し、解読した。大腸菌ＤＨ５α細菌の形質転換にはｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする改変遺伝子を有するプラスミドを使用した。その後、この細菌を、テトラサイクリン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を付加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。
【００８１】
細菌材料を菌株バンクのために作成し、細菌培養液と４０％グリセロールを１：１で含む試料を−７０℃で保管した。
【００８２】
得られた大腸菌株は、実施例１５に従った生合成によるＳＫＲインスリン製造のプロセスにおいて、初期の生物素材を構成する。
【００８３】
ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの遺伝子構築
ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドは４９１１塩基対の長さがあり、次の調節配列と遺伝子で構築される：
−１４６番から１３３６番までの塩基対にテトラサイクリン耐性遺伝子ＴＥＴ Ｒがあり、
−４３０４番から４４６９番までの塩基対にｐｍｓプロモーターをコードする領域があり、
−４４７３番から４７０３番までの塩基対に改変合成ユビキチンをコードする遺伝子をコードする領域があり、次の改変がある：ユビキチン遺伝子の４２位、５４位、７２位、７４位のアルギニンアミノ酸のアラニンによる置換、７７位にユビキチンの除去を可能にするアルギニンの付加。
−４７０４番から４８６８番までの塩基対に組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子をコードする配列があり、
−４８７５番から４９１１番までの塩基対に転写ターミネーターＴｅｒをコードする領域がある。
【００８４】
組み換えヒトインスリンタンパク質（ＳＫＲタンパク質）をコードする遺伝子を含むｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの構造は、図３に概略図を、また図４にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【００８５】
実施例７．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンをコードする改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。
【００８６】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端に追加のＧＧＴコドンを付加してある点である。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＧｌｙ−グリシンアミノ酸残基が延長された。
【００８７】
組み換えヒトプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００８８】
【化９】
【００８９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５細菌の取得は、実施例６と同様に行った。
【００９０】
得られた大腸菌株は、実施例１６に従った生合成によるＧＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材を構成する。
【００９１】
実施例８．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリンの遺伝子と、組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンの遺伝子との差異は、Ｂ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換していることである。
【００９２】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＢ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換して改変するために、点突然変異を起こすための次のプライマーを設計した。
【００９３】
【化１０】
【００９４】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５の取得は、実施例６と同様に行った。
【００９５】
得られた大腸菌株は、実施例１７に従った生合成によるＧＥＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００９６】
実施例９．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子は、Ｂ鎖３１位のＡＡＧ（Ｌｙｓ）コドンをＣＧＴ（Ａｒｇ）コドンで置換していることを特徴とする。
【００９７】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子を改変するために、点突然変異を起こすための次のプライマーを設計した。
【００９８】
【化１１】
【００９９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５の取得は、実施例６と同様に行った。
【０１００】
得られた大腸菌株は、実施例１８に従った生合成によるＧＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【０１０１】
実施例１０．ＧＫＲインスリンの製造
ＧＫＲインスリンは、実施例１により得られたＧＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、標準的な方法（接種、種培養、量産培養）で実現される生合成プロセスで製造した。量産培養は、１５０ｄｍ３発酵タンク内で、ｐＨ、温度、最適密度、グルコース濃度及び曝気を制御しながら、３７℃で２０時間実施した。ＧＫＲ類似体は、その発酵条件下で、封入体として細胞内で生産された。発酵終了後、発酵培養液を濃縮し、次いでリゾチームによって消化し、細菌細胞を分解した。得られた懸濁液を水で希釈し、トライトンと共に培養した後、遠心分離した。作成された封入体の粗沈殿物を先ず精製し、最終的に封入体ホモジネートを得た。
【０１０２】
得られたホモジネートは、ＥＤＴＡを添加した炭酸ナトリウム溶液中で溶解し（１０〜１５ｍｇ／ｃｍ３）、再生し、リジンの遊離アミノ基の保護のために、無水シトラコン酸を伴う反応によりシトラコニル化可逆工程に供した。溶解タンパク質は、リーダータンパク質を分解し、インスリン鎖を分割するためにトリプシンで消化した。トリプシンが作用した結果、ＧＫＲインスリンを得た。トリプシン消化後の溶液は、ＤＥＡＥセファロースＦＦゲル上で低圧液体クロマトグラフィによって精製し、その後、膜分離と濃縮−ＱセファロースＦＦゲル上での２回目の低圧液体クロマトグラフィを行った。主要画分は、Ｋｒｏｍａｓｉｌ−ＲＰＣ８ １００Ａ １０μｍゲル上で高圧液体クロマトグラフィによって精製した。主要画分は、透析を用いて濃度３０〜４０ｍｇ／ｃｍ３まで濃縮し、精製ＧＫＲインスリンをクエン酸ナトリウム、酢酸亜鉛、クエン酸を用いた結晶化によって分離した。
【０１０３】
封入体１バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％の結晶ＧＫＲインスリン約５．４ｇを得た。
【０１０４】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定された分子量は６１４９で、理論値（６１４９．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
−配列及びアミノ酸組成：理論と一致。
キャピラリー電気泳動法によって決定される等電点は７．１９であった。
【０１０５】
実施例１１．ＧＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例２により得られたＧＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７．５％のＧＲインスリン５．２ｇを得た。
【０１０６】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０２１で、理論値（６０２０．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
−配列及びアミノ酸組成：理論と一致。
等電点：６．３９。
【０１０７】
実施例１２．ＳＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例３により得られたＳＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％のＳＲインスリン５．５ｇを得た。
【０１０８】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０５１で、理論値（６０５０．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．５５。
【０１０９】
実施例１３．ＡＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例４により得られたＡＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９６．５％のＡＫＲインスリン４．７ｇを得た。
【０１１０】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１６３で、理論値（６１６３．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．０７。
【０１１１】
実施例１４．ＧＥＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例５により得られたＧＥＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７．５％のＧＥＫＲインスリン５．０ｇを得た。
【０１１２】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１６４で、理論値（６１６４．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．２９。
【０１１３】
実施例１５．ＳＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例６により得られたＳＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９８％のＳＫＲインスリン５．３ｇを得た。
【０１１４】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１７９で、理論値（６１７９．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．０５。
【０１１５】
実施例１６．ＧＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例７により得られたＧＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９５．５％のＧＫＲインスリン６．３ｇを得た。
【０１１６】
生成物（ＧＫＲインスリン）の残余の属性は実施例１０のとおりである。
【０１１７】
実施例１７．ＧＥＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例８により得られたＧＥＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％のＧＥＫＲインスリン６．０ｇを得た。
【０１１８】
生成物（ＧＥＫＲインスリン）の残余の属性は実施例１４のとおりである。
【０１１９】
実施例１８．ＧＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例９により得られたＧＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９６．５％のＧＲインスリン５．５ｇを得た。
【０１２０】
生成物（ＧＲインスリン）の残余の属性は実施例１１のとおりである。
【０１２１】
実施例１９．ＺＫＲインスリンの製造
ｐＨ５．０〜５．５の１００ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液中で、実施例１０又は１６により製造されたＧＫＲインスリン溶液１０００ｍｌ（濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）に、１μＭのＣｕＳＯ４、１００μｇ／ｍｌのカタラーゼ、５ｍＭのアスコルビン酸及び２μＭのＰＡＭ酵素（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２に従って得られたもの）を加え、その後、混合物を３７℃で２時間静置した。１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。
【０１２２】
ろ過後、得られた溶液をイオン交換クロマトグラフィ及びＨＰＬＣ法によって精製した。
【０１２３】
ＺＫＲインスリンを含む主要画分を濃縮し、クエン酸ナトリウム、クエン酸亜鉛、クエン酸を用いて結晶化した。反応混合物１バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％の結晶ＺＫＲインスリン約１０ｍｇを得た。
【０１２４】
生成物の構造は、次の結果によって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０９１で、理論値（６０９１．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．５４。
【０１２５】
実施例２０．ＺＲインスリンの製造
ｐＨ４．５の１００ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液中で、実施例１１又は１８により製造されたＧＲインスリン溶液１００ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）に、１μＭのＣｕＳＯ４、１００μｇ／ｍｌのカタラーゼ、５ｍＭのアスコルビン酸及び２μＭのＰＡＭ酵素を加え、その後、その溶液を３７℃で１時間、穏やかに混合した。１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ＰＡＭを使った反応後の溶液は、イオン交換及びＨＰＬＣ法によって精製した。
【０１２６】
インスリンを含む主要画分は濃縮し、クエン酸ナトリウム、クエン酸亜鉛、クエン酸を用いて結晶化した。反応混合物１バッチから、ＨＰＬＣ純度９８％の結晶ＺＲインスリン２２ｍｇを得た。
【０１２７】
生成物の構造は、次の結果によって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は５９６３で、理論値（５９６２．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．９７。
【０１２８】
実施例２１．ＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１２９】
【０１３０】
調製手順は次のとおりである：
次の２つの溶液を作成した：
【０１３１】
溶液１
最終的な亜鉛イオン濃度が３０μｇ／ｍｌに達するために必要な量の酸化亜鉛を、１０ｍＭの塩酸４０ｍｌに溶解した。その後、得られた溶液に、インスリンＧＫＲ１０，０００ｕに対応する量のインスリンＧＫＲを添加し、透明な溶液が得られるまで穏やかに撹拌し、その後、ｐＨの値を４．５に調整した。
【０１３２】
溶液２
別に、ｍ−クレゾール２７０ｍｇと無水グリセロール１６００ｍｌを４０ｍｌの注射用水に溶解した。
【０１３３】
溶液１と２の混合
溶液１を、撹拌しながら溶液２に加え、注射用水を１００ｍｌになるまで加えて、必要な場合は１０ｍＭの塩酸又は０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨを４．５に補正した。得られた混合物は、無菌状態で０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、３ｍｌのガラスバイアルに等分した。加速安定性試験において、ＧＫＲインスリンを含む製剤（１００ｕ／ｍｌ）は、５６日間の実験期間中、室温で安定性を呈すると判断された（実施例２４）。
【０１３４】
実施例２２．ＧＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１３５】
【０１３６】
手順は、ＧＫＲインスリンに代わってＧＲインスリン（３６１ｍｇの量、１０，０００ｕ）を使用したこと、及び最終的なｐＨの値が４．０であることを除き、実施例２１と同一である。
【０１３７】
実施例２３．ＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１３８】
【０１３９】
手順は、ＧＫＲインスリンに代わってＧＥＫＲインスリン（量、１０，０００ｕ）を使用したこと、及び最終的なｐＨの値が４．０であることを除き、実施例２１と同一である。
【０１４０】
実施例２４．ＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の加速安定性試験
実施例２１により作成されたＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）について、加速安定性試験（２５℃±２℃）を行った。この試験の間に、純度及びタンパク質汚染レベルの分析を実施した。下記に、生成物（ＧＫＲインスリン）のＨＰＬＣ純度、及び「０」、２８、４２、及び５６日の時点におけるＨＰＬＣ試験での、単独で最も汚染の強い汚染物質、脱アミド誘導体及び重合体の寄与比を示す。
【０１４１】
【０１４２】
実施例２５．ＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の加速安定性試験
実施例２３により作成されたＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）について、加速安定性試験（２５℃±２℃）を行った。この試験の間に、純度及びタンパク質汚染レベルの分析を実施した。下記に、生成物（ＧＥＫＲインスリン）のＨＰＬＣ純度、及び「０」、及び１４日、１、２、及び３ヶ月の時点におけるＨＰＬＣ試験での、単独で最も汚染の強い汚染物質、及び重合体の寄与比を示す。
【０１４３】
【０１４４】
実施例２６．正常血糖動物におけるＧＫＲ活性の判定
組み換えヒトインスリン類似体（ＧＫＲインスリン）は、ゲンスリンＮ（組み換えイソフェンヒトインスリン）と同様に、活性時間延長が見られ、正常血糖ラットの低血糖は類似の過程をたどる。双方の製剤の低血糖活性における重大な差異は、投与後０．５時間及び１時間に観察された。この時点で、ＧＫＲインスリン投与後のグルコース濃度の急速かつ大幅な低下が観察された。ＧＫＲインスリンとゲンスリンＮの活性ピークは２時間目であった。
【０１４５】
初期研究において、ＧＫＲインスリンは持効型低血糖活性を有する活性類似体であることが確認された。ＧＫＲインスリン投与後のグルコースレベルの低下は最大１２時間観察され、一方、２４時間後のグルコースレベルは初期と同等だった。ＧＫＲインスリン及びゲンスリンＮ製剤の単回投与に対する正常血糖ラットの反応結果（平均値±標準誤差を考慮）は、表１及び図５に示す。
【０１４６】
実施例２７．実験的糖尿病動物におけるＧＫＲインスリン活性の判定
ラット糖尿病の実験モデル（ストレプトゾトシンによる誘発）に関する研究により、ＧＫＲインスリンの低血糖活性が疑いなく確認された。この活性は、持効型活性を特徴としていた。
【０１４７】
単回投与後、実験ラットの血中グルコース濃度の低下は、対照と比較すると、最大８〜１０時間目まで（糖尿病の重篤度及び投与量に依存する）統計的に有意な状態が続いた。研究の間に、参照製剤のインスリン・グラルギン（ランタス）と比較したＧＫＲインスリンによる活性開始の早期化及びピーク活性到達の早期化（開始で３０分、ピークで１〜２時間）が実証された。この現象の統計的有意性は、重度及び中等度の糖尿病で確認された。
【０１４８】
ＧＫＲインスリン及び参照製剤インスリン・グラルギンの複数回投与の研究でも、両類似体の同様の活性が実証された。製剤を２１日間、１日当たり３回投与したところ、軽度糖尿病における血糖パラメータの改善が生じ、基本的には効果の程度に統計的な差は出なかった。唯一の差は、ＧＫＲインスリンの活性プロファイルが顕著に均等化したことであった。
【０１４９】
さらに、ＧＫＲ製剤の投与終了後、低血糖効果が長く持続するという非常に興味深い現象が観察された。この観察は、類似体を投与量５ｕ／ｋｇ体重で２１日間投与された軽度糖尿病群のうち、ＧＫＲ製剤で治療されたラット９匹及びランタスで治療された３匹に実施された。得られた結果は、ＧＫＲインスリンの組織内（おそらく皮下組織）における非常に強度の結合の存在の証拠になり得る。それらは、区画が存在し、そこにインスリンが蓄積され、ゆっくりと再配分されるという主張を裏付ける。この現象は、参照製剤では観察されなかった。この性質は、ヒトで確認されれば、例えば薬品の投与を１日１回未満にすることが可能になり、持効型インスリン類似体による治療の突破口になり得る。
【０１５０】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける投与量５ｕ／ｋｇ体重でのＧＫＲインスリン単回投与後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表２及び図６に示す。
【０１５１】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、１回の投与量２．５ｕ／ｋｇ体重、５ｕ／ｋｇ体重及び７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を示す結果（ランタス製剤及び対照との比較）は、表３に示す。
【０１５２】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、１回の投与量２．５ｕ／ｋｇ体重、５ｕ／ｋｇ体重及び７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を表す結果（対照との比較）は、図７に示す。
【０１５３】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を表す結果（ランタス製剤との比較）は、図８に示す。
【０１５４】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおけるＧＫＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での複数回投与後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表４及び図９に示す。
【０１５５】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおけるＧＫＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での投与終了後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表５及び図１０に示す。
【０１５６】
【表１】
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
【表４】
【０１６０】
【表５】
【０１６１】
実施例２８．実験的糖尿病動物におけるＧＲインスリン活性の判定
ＧＲインスリンの低血糖活性は、ラットの中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病において確認された。
【０１６２】
ＧＲインスリンの、５ｕ又は１０ｕ／ｋｇ体重単回投与後の活性は、急速かつ強力であると判定された。製剤投与後３０分ですでに活性開始が見られ、最大２時間同じレベルが維持され、その後、２４〜３６時間目に初期レベルに到達まで低下した。
【０１６３】
中等度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける投与量５ｕ及び１０ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＲインスリン製剤の影響を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表６に示す。ＧＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での投与後のグルコース濃度／時間変化のプロットは、図１１に示す。
【０１６４】
実施例２９．実験的糖尿病動物におけるＧＥＫＲインスリン活性の判定
ＧＥＫＲインスリン類似体の低血糖活性は、中等度の経過をたどるストレプトゾトシン誘発性糖尿病のラットでの予備試験において確認された。
【０１６５】
ＧＥＫＲインスリンの１０ｕ／ｋｇ体重単回投与後、非常に急速（０．５時間後にすでに）かつ強力な動物血中グルコース濃度を低下させる活性が見られた。この活性は、製剤投与後１時間ですでにピークに達し、ゆっくりと低下したが、投与後最大１２時間まで、初期値と比較して有意なグルコースレベルの低下をもたらした。この研究は、持効型活性を有するインスリン類似体のレベミル製剤（インスリン・デテミル）と比較して実施された。
【０１６６】
レベミル製剤と比較した、糖尿病の中等度ストレプトゾトシン誘発性モデルにおける投与量１０ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＥＫＲインスリンの影響を示す結果を、表７に示し、ＧＥＫＲインスリン１０ｕ／ｋｇ体重での投与後の時間の関数としてのグルコース濃度の変化を示すプロットは、図１２に示す。
【０１６７】
【表６】
【０１６８】
【表７】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、持効型治療活性を有する組み換えヒトインスリンの新規生合成類似体に関するものであり、糖尿病の予防及び治療に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
インスリンとそのさまざまな誘導体は、糖尿病の治療に大量に使用され、しばしば工業的に大規模に製造される。インスリンの改変誘導体は数多く知られており、異なる活性プロファイルを有する多数の医薬製剤が存在するが、人体内で長時間にわたりグルコースを一定のレベルに保つことを可能とする薬品の探索は続いている。
【０００３】
正常ヒトインスリン製剤には、遅効型及び／又は持効型の活性効果を得るために、例えば、さまざまな分量のプロタミンなどの特定の添加物を含有するものがある。プロタミンは、インスリンと共に不溶性の錯体を形成するタンパク質であり、皮下組織に沈着物を形成し、そこからインスリンが徐々に放出されるものである。
【０００４】
糖尿病の治療に使用されるヒトインスリン誘導体には、アミノ酸が付加されたもの、あるいはいくつかのアミノ酸の配列が改変されたものなど、さまざまなものが知られている。インスリンの一次構造の変更は、その二次構造及び三次構造に影響し、それがタンパク質の化学的及び生物学的性質に影響を及ぼし、結果的に、薬物動態学及び薬力学上の効果をもたらす。これらの変更はさまざまな特徴を有し、改変されたインスリンの活性を即効型、又は、遅効型且つ持効型にしたりすることができる。インスリンの活性形は単量体で、これは皮下注射後に容易に血液中に浸透する。溶液中の外因生ヒトインスリンは６量体であり、これが接種後に２量体へ、続いて血流中に浸透する前には単量体へと解離することが分かっている。即効性を特徴とするインスリン誘導体の１つはリスプロ・インスリン（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））で、これは、Ｂ鎖中のプロリン（２８）−リジン（２９）の配列が反転されたものである。立体的な観点から、これは溶液中でのインスリン２量体の形成を困難にする。こうした誘導体の第２は、Ｂ鎖２８位のプロリンがアスパラギン酸に置換されたものである。こうして導入された負電荷は、インスリン単量体の自己会合の可能性を引き下げる。これらのインスリン誘導体はいずれも、その構造のために、吸収速度が速くなる。
【０００５】
持効型組み換えヒトインスリン類似体は、Ｂ鎖を塩基性アミノ酸で延長するか、又はＢ鎖のリジンのεアミノ基を１２個前後の炭素原子を有する脂肪酸でアシル化することによって構成される。
【０００６】
これらの追加塩基性アミノ酸の導入は、インスリンの化学的又は物理的な性質をいくつかに変更する。最も重要な変更は等電点の移行であり、過剰の正電荷が分子内に導入される結果、等電点は、改変されていない天然インスリンの５．４から、約５．５から約８．５までの範囲に移行する。その結果、これらの類似体の中性水環境における溶解性は低下し、そのためこうした改変インスリンを含む医薬製剤の生産における弱酸性環境の使用が必要になる。
【０００７】
しかし、追加塩基性アミノ酸の導入による、明白な利点のほかに、主として酸性環境中で生じるＡ２１位のアスパラギンの脱アミノ化反応に由来する新規類似体の安定性低下という欠点も観察される。
【０００８】
この問題点は、Ａ２１Ａｓｎを、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、トレオニンその他のアミノ酸に置換することによって対処される。こうした類似体の１つが、Ａ鎖アスパラギン（２１）をグリシン（２１）に置換し、Ｂ鎖Ｃ末端に２個のアルギニン残基が結合した組み換えヒトインスリン誘導体である。これはいわゆるインスリンのグラルギン誘導体で、ランタスという名称で製造されている（米国特許第５６５６７２２号）。
【０００９】
本発明の過程で、Ｂ鎖Ｃ末端にリジン（Ｂ３１Ｌｙｓ）とアルギニン（Ｂ３２Ａｒｇ）の残基を付加したヒトインスリン誘導体は、グラルギン誘導体に類似した生物活性を示すことが実証され、すでに上市されている。動物で実施した予備試験では、リズアルグインスリンと称するこの製剤は、天然インスリンの分泌を模した持効型の活性と均一の放出プロファイルを特徴とし、臨床の観点から言えば−夜間低血糖を軽減することが示される。ヒトインスリン及びプロインスリンに酷似しているため、薬剤候補の漸進的な開発及びその最終的な商品化を可能とする良好な研究結果が期待される。ヒトインスリンのＢ鎖Ｃ末端のＬｙｓＡｒｇ配列がヒトのプロインスリンに存在していることが重要であり、カルボキシペプチダーゼＣの存在によるリズアルグインスリンのヒトインスリンへの転換を予想させるはずである。このことは、人体内でのリズアルグインスリンの最初の代謝産物は、外因生ホルモンの場合でも、周知の、容認できる特徴を有するヒトインスリンである可能性があることを意味する。ラットについて拡大前臨床試験が実施され、この新規インスリン類似体の持効型活性が確認された。
【００１０】
しかしこの誘導体には、その有利な生物活性とは別に、酸性の注射溶液中での安定性に乏しいという特徴が判明した。第一義的に脱アミド反応として出現する安定性不足の主因は、Ａ鎖Ｃ末端のアスパラギン残基の存在であり、酸性水環境中ではそこでカルボキシル基に由来するプロトンによる自己触媒脱アミド反応が発生する可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５６５６７２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、酸性注射溶液（ｐＨ３．５〜５）中で適切な安定性を示すと同時に求められる生物活性を有するインスリンの新規類似体を提供することである。それらが天然インスリンの生物活性の特徴を示すことが特に望ましい。また、新規誘導体の活性開始が実用上迅速で、患者への投与直後に効果を発揮し、かつ投与量の一部分の持続的放出能力を有することが特に重要である。これにより、インスリン類似体を含有する医薬製剤の持つ即効型と持効型の両方の作用を提供することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明において、予想外に上記の目標が達成された。
【００１４】
本発明の基本態様は、Ａ鎖及びＢ鎖を構成する２つのポリペプチドを含むインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩であり、ここでＡ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜５から選択されると共に、Ｂ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６〜８から選択される。本発明による好ましいインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩は、等電点５〜８．５の組み換えヒトインスリン類似体であり、且つ、式１であることを特徴とする。
【００１５】
【化１】
【００１６】
ここで、ＲはＮＨ２基又は式Ａｓｎ−Ｒ２で表される基を示し、ここでＲ２は中性Ｌ−アミノ酸又はＮＨ２基を示し、且つ、
Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇを示し、ここでＢ３Ａｓｎは選択的に他のアミノ酸、有利にはＧｌｕに置換されていてもよい。
【００１７】
有利には、本発明によるインスリン誘導体又はその生理学的に容認できる塩は下記を特徴とする：
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲはＮＨ２基を示し、Ｒ１はＢ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１はＢ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示し、Ｂ３ＡｓｎはＢ３Ｇｌｕで置換されていること。
【００１８】
上記のように、グラルギンの場合、低安定性の問題はＡ２１位のアスパラギンをグリシンで置換することによって解決されている。本発明で説明される、持効性と酸性注射液中での安定性を呈するインスリン類似体を得ることを目的とする研究は、別の方向に進んだ。低安定性の原因であるカルボキシル基をブロックするために、遺伝子工学と酵素形質転換の手法を用いてアスパラギン残基中のカルボキシル基を別の方法で改変した、リズアルグインスリンの新規誘導体を得た。研究を実施した結果、予想外に、式１のヒトインスリンの誘導体で、Ａ鎖のＣ末端を中性アミノ酸残基（Ａ２２）で延長し、又はＡ鎖Ｃ末端のアスパラギンもしくはシステインのカルボキシル基をカルボキシアミド基に変換し、かつ、Ｂ鎖Ｃ末端にリジンとアルギニンの残基（Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ）、又は２個のアルギニン残基（Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ）、又は１個のアルギニン残基（Ｂ３１Ａｒｇ）を付加したものが、グラルギン及びリズアルギン誘導体に似た化学的・生物学的性質を呈することが判明した。このような方法で得られた新規類似体は、酸性注射溶液（ｐＨ３．５〜５）中で適切な安定性を有すると同時に、所望の生物活性を呈する。
【００１９】
導入された改変は、予想外に、安定なインスリン誘導体の医薬組成物を得ると同時に、生物活性を維持し、等電点のｐＨ５〜８への移行をもたらした。このため、注射された場所の生理的ｐＨにおける新規インスリン誘導体の溶解性が低下する。これにより、皮下組織中でのインスリン誘導体の微細沈着物が沈殿し、その後の同物質が血液中へ持続放出され、長時間にわたって治療レベルが維持されることになる。
【００２０】
これらの化合物の特性とその組成は、安定性試験及び実験的糖尿病の動物における活性試験によって確認されている。この間に、予想外に、低血糖活性効果が著しく長時間にわたって発揮され、参照した市販の持効型インスリン誘導体で観察される効果と比較して、その効果が当該薬品の投与を停止した後も長時間持続することが判明した。このことから、本発明の主題である誘導体の性質は、薬品の投与頻度を著しく減らすことを可能にし、それによって患者治療の有効性、安全性及び快適性が向上することが予想できる。また、本発明による新規誘導体の活性開始は実用上迅速で、これはこれらの化合物が予想外に即効型及び持効型活性両方の既成インスリン類似体の生物活性の特徴を呈することを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
式１のインスリン誘導体の例には下記のものがあるが、これらに限定されない。
【００２２】
【００２３】
本発明の主題である組み換えヒトインスリン類似体の名称を単純化するために、「インスリン」の名称と、付加されるか又は元のヒトインスリン粒子中に存在するアミノ酸を置換したアミノ酸残基を示す２〜４個のアルファベット大文字とからなる記号を付した。大半の場合、これらの文字は、文献中で見られるアミノ酸残基の一文字表記と一致。自然には生じない２つの残基についてのみ、別の文字、すなわち「Ｚ」と「Ｘ」を使用した。いずれの場合も、その文字はＡ鎖のＣ末端に位置する残基を示し、そこに末端ＣＯＯＨ基に代わってＣＯＮＨ２基が入ったものである。文字「Ｚ」は対応するアスパラギンアミド（すなわちＡ２１Ａｓｎ−ＮＨ２）を示し、文字「Ｘ」はシステインアミド（すなわちｄｅ（Ａ２１Ａｓｎ）Ａ２０Ｃｙｓ−ＮＨ２）を示す。
【００２４】
式１のインスリン類似体は、遺伝子工学の標準的方法を使用する一連の遺伝子操作によって作成した。
【００２５】
このために、例えば部位特異的突然変異導入などの遺伝子工学を使用して、組み換えヒトプロインスリンをコードする遺伝子の変異体を作成した。部位特異的突然変異導入反応は、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用して実施し、テンプレートとしてプラスミドＤＮＡのｐｌＧＡＬＺＵＩＮＳ−ｐ５／ＺＵＩＮＳ又はｐｌＧＴＥＴＺＵＩＮＳ−ｐ６／ＺＵＩＮＳを使用した。また、組み換えヒトプロインスリン又はプレプロインスリンの適当な配列を含むその他のＤＮＡも、テンプレートとして使用できる。
【００２６】
本発明によれば、一般に認められた用語に鑑み、組み換えヒトプロインスリンはヒトインスリンのＡ鎖とＢ鎖がジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇによって連結されたポリペプチドの鎖と理解され、組み換えプレプロインスリンはプロインスリンと付加される、例えば、ユビキチン等のリーダーポリペプチドの組合せ、又はＳＯＤもしくはその断片と理解される。
【００２７】
例としてＤＨ５α、ＤＨ５又はＨＢ１０１などの適当な大腸菌株のコンピテント細胞の形質転換のために反応混合物を使用したが、他の大腸菌株の細胞もしくは他の微生物の細胞、または組み換えタンパク質の発現に使用できるその他の既知の細胞株を使用することができる。ヌクレオチド配列の正確性を検証するために、組み換えヒトプロインスリンをコードする遺伝子の所与の改変を含むプラスミドを分離し、解読した。本発明の一変型では、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換に組み換えヒトプロインスリンをコードする改変遺伝子を含むプラスミドを使用し、細菌は選抜抗生物質（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、温度３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。菌株バンク用に細菌材料を作成し、細菌培養物と４０％グリセロール１：１の試料は−７０℃で保管した。
【００２８】
大腸菌株における発現により得られた組み換えプレプロインスリンの変異体は、細胞が分解された後に封入体の形で分離され、その後、融合タンパク質精製の標準処理を行った。再生後に得られたハイブリッドタンパク質にインスリン類似体を加えた溶液は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４６，ｐａｇｅ６７８６〜６７９１（１９７１）にＫｅｍｍｌｅｒａ他により、あるいは米国特許第６６８６１７７号及び同６１００３７６号に記述された方法など、既知の多数の方法の例と同様に、トリプシンを加えて制御された処理を行った。得られたインスリン類似体は、主として低圧クロマトグラフィ、限外濾過、及び／又はＨＰＬＣの周知の方法を用いて精製処理を行った。生成物は、十分に精製したインスリン類似体溶液から沈殿させた。
【００２９】
Ａ鎖Ｃ末端に残基Ａ２１Ａｓｎ−ＮＨ２又はＡ２０Ｃｙｓ−ＮＨ２を含む誘導体を得るために、活性αアミド体に変換された反応基質である生物のプロホルモン中で自然に発現する転換を触媒するαアミド化酵素（α−ＡＥ）を使用した。
【００３０】
酵素ＰＡＭ（ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ）は、ＰＨＭ（ペプチジルグリシンαヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ）及びＰＡＬ（ペプチジルアミドグリコール酸リアーゼ活性）活性（図表１）として表される二つの活性を有するプロテアーゼであり、Ｃ末端アミドの取得を可能にする。調査により、オキシトシン又はバソプレシン等のペプチドホルモンの半数は、最適活性を達成するのにＣ末端アミド基を必要とすることが判明した。この反応において、Ｃ末端グリシン残基からアミド基が生成し、それがここでは直接の反応前駆体である（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２。Ｍｉｌｌｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｓａｙａｄ Ｋ．Ｕ．，Ｋｕｌａｔｈｉｌａ Ｒ．Ｂｅａｕｄｒｙ Ｇ．Ａ．，Ｍｅｒｋｌｅｒ Ｄ．Ｊ．，Ｂｅｒｔｅｌｓｅｎ Ａ．Ｈ．；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ− ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９２ Ｎｏｖ １；２９８（２）：３８０−８）。
【００３１】
【化２】
図表１．活性ＰＡＭプロテアーゼによるペプチドのαアミド化の概要（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２による）
【００３２】
ＰＡＭプロテアーゼは、特にさまざまな長さのアミノ酸鎖を有する真核生物に見られるタンパク質である。本プロジェクトでは、ヒト（ホモサピエンス）由来のプロテアーゼが使用され、そこにはαアミド化プロテアーゼの活性を呈するタンパク質をコードする６個の遺伝子が見られる。
【００３３】
式１の組み換えヒトインスリン類似体の基本的な物理化学的性質でヒトインスリンと異なるのは等電点の値で、約５から約８までの値である。これは、この化合物が酸性から弱酸性のｐＨの溶液への溶解性が良いことを意味する。この性質により、組成物（酸性ｐＨの新規インスリン誘導体溶液）の調合が可能になる。
【００３４】
本発明の一態様は、有効な作用を発揮する量の、本発明によるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする医薬組成物でもある。好適には、本発明による医薬組成物は、１０から５０μｇ／ｍｌの亜鉛も含む。
【００３５】
本発明の更に他の態様は、糖尿病の治療又は予防のための薬品を製造するために、上記の本発明によるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用でもある。
【００３６】
上記によれば、本発明による医薬組成物は、有効な作用を示す量の式１のヒトインスリン生合成類似体、又はその薬理学的に容認できる塩及び補助成分を含む。
【００３７】
本発明による生合成ヒトインスリン類似体の塩は、例えばアルカリ金属塩又はアンモニウム塩が可能である。
【００３８】
投与を目的として、本発明による組成物は溶液の形で調合され、有効な作用を示す量の式１のヒトインスリン生合成類似体又はその薬理学的に許容される塩、及び等張剤、防腐剤、安定化剤、任意に緩衝剤などの補助成分を含む。
【００３９】
本発明による組成物に使用される有効成分の量は約１〜１６００ｕ／ｍｌで、好適には１０〜１２００ｕ／ｍｌ、特に好適には１０〜５００ｕ／ｍｌである。本発明の主題である各ヒトインスリン類似体の場合、１単位（１ｕ）は１補助単位を意味し、６ｎモル（すなわち６×１０−９モル）に対応するインスリンの１国際単位と同じモル数の類似体を含む。
【００４０】
本発明による医薬組成物について、溶液のｐＨ値は約３．５から約５であり、好適には４．０〜４．５である。
【００４１】
一般に、本発明による組成物中の補助成分は、周知の組み換えヒトインスリンを含む製剤で使用されるものと同じ成分である。
【００４２】
本発明による等張成分は、ヒト血漿と等浸透圧の溶液を得ることが可能な成分なら何でもよい。通常、薬品に使用される等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、グリシン等であり、好ましくはグリセリンである。グリセリンの使用が好適である。
【００４３】
本発明による組成物中に使用される有用な保存剤は、ｍ−クレゾール、フェノール又はその混合物に属するグループから選択した化合物である。
【００４４】
組み換えられた正常ヒトインスリンと同様、新誘導体は、とりわけ塩化亜鉛又は酸化亜鉛の形で溶液中に導入される亜鉛イオンを付加することによって安定化する。亜鉛の量は、約５μｇ／ｍｌから約１５０μｇ／ｍｌの範囲が可能である。
【００４５】
以下の、本発明による組み換えヒトインスリン誘導体を含む組成物の含有成分の例を開発した：式１のヒトインスリン生合成類似体又はその薬理学的に容認できる塩１０〜５００ｕ／ｍｌ、グリセリン１６ｍｇ／ｍｌ、ｍ−クレゾール２．７〜３ｍｇ／ｍｌ、亜鉛１０〜５０μｇ／ｍｌ、及び注射用水１ｍｌになるまで。
【００４６】
本発明の本質をより良く説明するために、この明細書本文では本発明の実施例について詳細に記述しており、添付の配列リスト及び以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】組み換えインスリンのＧＫＲタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）の構造を表す。
【図２−１】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−２】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−３】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図２−４】プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図３】インスリンＳＫＲタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）の構造を表す。
【図４−１】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−２】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−３】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図４−４】プラスミドｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）のヌクレオチドとアミノ酸の配列を表す。
【図５】ゲンスリンＮ製剤と比較した、正常血糖ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量５ｕ／ｋｇ体重）の影響を表す。平均値±標準誤差。統計的有意性 ＊＊ｐ＜０．０１：インスリンＧＫＲ対初期グルコース濃度；＃＃ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．０５：ゲンスリンＮ対初期グルコース濃度；＾＾ｐ＜０．０１：インスリンＧＫＲ対ゲンスリンＮ。
【図６】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり５ｕ）の影響（ランタス製剤との比較）を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ対ランタス。
【図７】重度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり２．５ｕ、５ｕ、及び７．５ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１ ＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ２．５ｕ対対照；＾＾ｐ＜０．０１ ＾ｐ＜０．０５ ＧＫＲ５ｕ対対照；＃＃ｐ＜０．０１ ＃ｐ＜０．０５ ＧＫＲ７．５ｕ対対照。
【図８】重度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり７．５ｕ）の影響（ランタス製剤との比較）を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＫＲ対ランタス。
【図９】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量体重ｋｇ当たり５ｕでのＧＫＲインスリンの複数回投与後のラットの血中グルコース濃度を表す（ランタス製剤との比較）。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。
【図１０】軽度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量体重ｋｇ当たり５ｕでのＧＫＲインスリン投与停止後の期間におけるラットの血中グルコース濃度を表す（ランタス製剤との比較）。
【図１１】ランタス製剤と比較した、中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり１０ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。０−基準高血糖；対照−生理食塩水１０μｌ／２００ｇ体重。統計的有意性：＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５ ＧＲ対ランタス。
【図１２】レベミル製剤と比較した、中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットの血中グルコース濃度への、ＧＥＫＲインスリンの単回投与（投与量体重ｋｇ当たり１０ｕ）の影響を表す。０−基準高血糖。
【００４８】
実施例１．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこのプラスミドによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンの改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。ユビキチン遺伝子内でアルギニンコドンがアラニンコドンに置換され、ユビキチン遺伝子のＣ末端に追加のアルギニンコドンが付加されている。ユビキチンの一部分を構成するペプチドは、インスリン前駆体のための担体であり、大腸菌内での高効率融合タンパク質合成のための条件である。改変融合タンパク質ユビキチン−ヒトインスリンをコードする領域は、ｐｍｓ（ＷＯ０５０６６３４４Ａ２）プロモーターの制御下におかれる。このプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を保持する。ｐ５／ＺＵＩＮＳベクターの構築のためにｐｌＧＡＬ１プラスミドを使用し、遺伝子バンクに保管されている配列の番号はＡＹ４２４３１０である。
【００４９】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子は、Ａ鎖Ｃ末端に追加のＧＧＴコドンを付加してある点が、モデルヒトプロインスリン遺伝子と異なる。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＧｌｙ−グリシン−アミノ酸残基が延長されている。
【００５０】
ヒト組み換えプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００５１】
【化３】
【００５２】
点突然変異反応は、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用して実施した。テンプレートとして、プラスミドＤＮＡのｐ５／ＺＵＩＮＳを使用した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞は反応混合物を使って形質転換した。グリシンをコードするＧＧＴヌクレオチドの存在及びプラスミド配列の有効性を確認するために、プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）を分離し、解読した。コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換には組み換えｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする改変遺伝子を有するプラスミドを使用し、その後、このコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を、アンピシリン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を付加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。細菌材料を菌株バンクのために作成し、細菌培養液と４０％グリセロールを１：１で含む試料を−７０℃で保管した。
【００５３】
得られた大腸菌株は、実施例１０に従った生合成によるＧＫＲインスリン取得のプロセスにおいて、初期の生物素材を構成する。
【００５４】
ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの遺伝子構築
プラスミドｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）は４７７５塩基対の長さがあり、次の調節配列と遺伝子で構築される：
−３７４番から１２３４番までの塩基対にアンピシリン耐性遺伝子ＡＭＰ Ｒがあり、
−４１５８番から４３２３番までの塩基対にｐｍｓプロモーターをコードする領域があり、
−４３２７番から４５５４番までの塩基対に改変合成ユビキチン遺伝子ＺＵＢＩをコードする配列があり、
−４５５８番から４７２２番までの塩基対に組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子をコードする配列があり、
−４７２９番から４７７５番までの塩基対に転写ターミネーターＴｅｒをコードする領域がある。
【００５５】
組み換えヒトインスリンタンパク質（ＧＫＲインスリン）をコードする遺伝子を含むｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構造は、図１に概略図を、また図２にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【００５６】
実施例２．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子の構築において、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）遺伝子は、Ｂ鎖３１位のＡＡＧ（Ｌｙｓ）コドンをＣＧＴ（Ａｒｇ）コドンで置換されていることを特徴とする。
【００５７】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子を改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００５８】
【化４】
【００５９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。得られた大腸菌株は、実施例１１に従った生合成によるＧＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００６０】
実施例３．ｐ５／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子と、組み換えプロインスリンＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）をコードする遺伝子との差異は、Ａ鎖２２位のＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンをＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンで置換していることである。
【００６１】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＡ鎖２２位のＧＧＴ（Ｇｌｙ）をＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンで置換して改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００６２】
【化５】
【００６３】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００６４】
得られた大腸菌株は、実施例１２に従った生合成によるＳＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００６５】
実施例４．ｐ５／ＺＵＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プロインスリンの遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端にＧＣＴコドンを付加していることである。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＡｌａ−アラニンアミノ酸残基が延長された。
【００６６】
組み換えヒトインスリン配列をコードする遺伝子をそのＣ末端にＧＣＴ（Ａｌａ）コドンを付加して改変するために、点突然変異のための次のプライマーを設計した。
【００６７】
【化６】
【００６８】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＡｌａ（２２Ａ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００６９】
得られた大腸菌株は、実施例１３に従った生合成によるＡＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００７０】
実施例５．ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子と、組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子との差異は、Ｂ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換していることである。
【００７１】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＢ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）をＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換して改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００７２】
【化７】
【００７３】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ５／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５α細菌の取得は、実施例１と同様に行った。
【００７４】
得られた大腸菌株は、実施例１４に従った生合成によるＧＥＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００７５】
実施例１〜５において、プラスミドの宿主としてＤＨ５α大腸菌を使用したが、上記の本発明の実施モデルにおいて、例えばＤＨ５又はＨＢ１０１のような他の大腸菌株を使用することも可能である。
【００７６】
実施例６．ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンをコードする改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。ユビキチンをコードする遺伝子内でアルギニンコドンがアラニンコドンに置換され、ユビキチン遺伝子のＣ末端に追加のアルギニンコドンが付加されている。ユビキチンの一部分を構成するペプチドは、インスリン前駆体のための担体であり、これは大腸菌内での高効率融合タンパク質発現を調節するものである。改変ユビキチン−ヒトインスリン融合タンパク質をコードする領域は、ｐｍｓプロモーター（ＷＯ０５０６６３４４Ａ２）の制御下に置かれる。このプラスミドは、テトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。ｐ６／ＺＵＩＮＳベクターの構築のためにｐ５／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。
【００７７】
組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端に追加のＴＣＴコドンを付加してある点である。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＳｅｒ−セリンアミノ酸残基が延長された。
【００７８】
組み換えプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＴＣＴ（Ｓｅｒ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００７９】
【化８】
【００８０】
点突然変異反応を実施するためにストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用し、テンプレートとして、ｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドＤＮＡを使用した。大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞を反応混合物を使って形質転換した。セリンをコードするＴＣＴヌクレオチドの存在及びプラスミド配列の正確性を確認するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドを分離し、解読した。大腸菌ＤＨ５α細菌の形質転換にはｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする改変遺伝子を有するプラスミドを使用した。その後、この細菌を、テトラサイクリン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を付加したＬＢ培地５００ｍｌ中で、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。
【００８１】
細菌材料を菌株バンクのために作成し、細菌培養液と４０％グリセロールを１：１で含む試料を−７０℃で保管した。
【００８２】
得られた大腸菌株は、実施例１５に従った生合成によるＳＫＲインスリン製造のプロセスにおいて、初期の生物素材を構成する。
【００８３】
ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの遺伝子構築
ｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドは４９１１塩基対の長さがあり、次の調節配列と遺伝子で構築される：
−１４６番から１３３６番までの塩基対にテトラサイクリン耐性遺伝子ＴＥＴ Ｒがあり、
−４３０４番から４４６９番までの塩基対にｐｍｓプロモーターをコードする領域があり、
−４４７３番から４７０３番までの塩基対に改変合成ユビキチンをコードする遺伝子をコードする領域があり、次の改変がある：ユビキチン遺伝子の４２位、５４位、７２位、７４位のアルギニンアミノ酸のアラニンによる置換、７７位にユビキチンの除去を可能にするアルギニンの付加。
−４７０４番から４８６８番までの塩基対に組み換えＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子をコードする配列があり、
−４８７５番から４９１１番までの塩基対に転写ターミネーターＴｅｒをコードする領域がある。
【００８４】
組み換えヒトインスリンタンパク質（ＳＫＲタンパク質）をコードする遺伝子を含むｐ６／ＺＵＩＮＳＳｅｒ（２２Ａ）プラスミドの構造は、図３に概略図を、また図４にそのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【００８５】
実施例７．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子を構築するために、合成ユビキチンをコードする改変遺伝子に組み換えインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片が付加されたｐ６／ＺＵＩＮＳプラスミドを使用した。
【００８６】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンをコードする遺伝子と、モデルヒトプロインスリン遺伝子との差異は、前者のＡ鎖Ｃ末端に追加のＧＧＴコドンを付加してある点である。その結果、Ａ鎖のアミノ酸配列は、２２位にＧｌｙ−グリシンアミノ酸残基が延長された。
【００８７】
組み換えヒトプロインスリン配列をコードする遺伝子を、Ｃ末端にＧＧＴ（Ｇｌｙ）コドンを付加することによって改変するために、点突然変異反応のための次のプライマーを設計した。
【００８８】
【化９】
【００８９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５細菌の取得は、実施例６と同様に行った。
【００９０】
得られた大腸菌株は、実施例１６に従った生合成によるＧＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材を構成する。
【００９１】
実施例８．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３Ｂ）プロインスリンの遺伝子と、組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリンの遺伝子との差異は、Ｂ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換していることである。
【００９２】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子をＢ鎖３位のＡＡＣ（Ａｓｎ）コドンをＧＡＡ（Ｇｌｕ）コドンで置換して改変するために、点突然変異を起こすための次のプライマーを設計した。
【００９３】
【化１０】
【００９４】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ｇｌｕ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５の取得は、実施例６と同様に行った。
【００９５】
得られた大腸菌株は、実施例１７に従った生合成によるＧＥＫＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【００９６】
実施例９．ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドの構築及びこれによって形質転換された菌株の取得
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリン遺伝子を構築するために、ｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プラスミドを使用した。組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プロインスリンをコードする遺伝子は、Ｂ鎖３１位のＡＡＧ（Ｌｙｓ）コドンをＣＧＴ（Ａｒｇ）コドンで置換していることを特徴とする。
【００９７】
組み換えＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）プロインスリン配列をコードする遺伝子を改変するために、点突然変異を起こすための次のプライマーを設計した。
【００９８】
【化１１】
【００９９】
点突然変異反応を実施するために、ストラタジーンのキット（カタログ番号２００５１８−５）を使用した。プラスミドのヌクレオチド配列の分離及び有効性確認、ならびにｐ６／ＺＵＩＮＳＧｌｙ（２２Ａ）Ａｒｇ（３１Ｂ）プラスミドを有する大腸菌ＤＨ５の取得は、実施例６と同様に行った。
【０１００】
得られた大腸菌株は、実施例１８に従った生合成によるＧＲインスリン製造のプロセスにおける初期の生物素材である。
【０１０１】
実施例１０．ＧＫＲインスリンの製造
ＧＫＲインスリンは、実施例１により得られたＧＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、標準的な方法（接種、種培養、量産培養）で実現される生合成プロセスで製造した。量産培養は、１５０ｄｍ３発酵タンク内で、ｐＨ、温度、最適密度、グルコース濃度及び曝気を制御しながら、３７℃で２０時間実施した。ＧＫＲ類似体は、その発酵条件下で、封入体として細胞内で生産された。発酵終了後、発酵培養液を濃縮し、次いでリゾチームによって消化し、細菌細胞を分解した。得られた懸濁液を水で希釈し、トライトンと共に培養した後、遠心分離した。作成された封入体の粗沈殿物を先ず精製し、最終的に封入体ホモジネートを得た。
【０１０２】
得られたホモジネートは、ＥＤＴＡを添加した炭酸ナトリウム溶液中で溶解し（１０〜１５ｍｇ／ｃｍ３）、再生し、リジンの遊離アミノ基の保護のために、無水シトラコン酸を伴う反応によりシトラコニル化可逆工程に供した。溶解タンパク質は、リーダータンパク質を分解し、インスリン鎖を分割するためにトリプシンで消化した。トリプシンが作用した結果、ＧＫＲインスリンを得た。トリプシン消化後の溶液は、ＤＥＡＥセファロースＦＦゲル上で低圧液体クロマトグラフィによって精製し、その後、膜分離と濃縮−ＱセファロースＦＦゲル上での２回目の低圧液体クロマトグラフィを行った。主要画分は、Ｋｒｏｍａｓｉｌ−ＲＰＣ８ １００Ａ １０μｍゲル上で高圧液体クロマトグラフィによって精製した。主要画分は、透析を用いて濃度３０〜４０ｍｇ／ｃｍ３まで濃縮し、精製ＧＫＲインスリンをクエン酸ナトリウム、酢酸亜鉛、クエン酸を用いた結晶化によって分離した。
【０１０３】
封入体１バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％の結晶ＧＫＲインスリン約５．４ｇを得た。
【０１０４】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定された分子量は６１４９で、理論値（６１４９．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
−配列及びアミノ酸組成：理論と一致。
キャピラリー電気泳動法によって決定される等電点は７．１９であった。
【０１０５】
実施例１１．ＧＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例２により得られたＧＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７．５％のＧＲインスリン５．２ｇを得た。
【０１０６】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０２１で、理論値（６０２０．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
−配列及びアミノ酸組成：理論と一致。
等電点：６．３９。
【０１０７】
実施例１２．ＳＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例３により得られたＳＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％のＳＲインスリン５．５ｇを得た。
【０１０８】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０５１で、理論値（６０５０．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．５５。
【０１０９】
実施例１３．ＡＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例４により得られたＡＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９６．５％のＡＫＲインスリン４．７ｇを得た。
【０１１０】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１６３で、理論値（６１６３．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．０７。
【０１１１】
実施例１４．ＧＥＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例５により得られたＧＥＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７．５％のＧＥＫＲインスリン５．０ｇを得た。
【０１１２】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１６４で、理論値（６１６４．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．２９。
【０１１３】
実施例１５．ＳＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例６により得られたＳＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９８％のＳＫＲインスリン５．３ｇを得た。
【０１１４】
生成物の構造は、次のデータによって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６１７９で、理論値（６１７９．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．０５。
【０１１５】
実施例１６．ＧＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例７により得られたＧＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９５．５％のＧＫＲインスリン６．３ｇを得た。
【０１１６】
生成物（ＧＫＲインスリン）の残余の属性は実施例１０のとおりである。
【０１１７】
実施例１７．ＧＥＫＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例８により得られたＧＥＫＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％のＧＥＫＲインスリン６．０ｇを得た。
【０１１８】
生成物（ＧＥＫＲインスリン）の残余の属性は実施例１４のとおりである。
【０１１９】
実施例１８．ＧＲインスリンの製造
実施例１０と類似の手順で、実施例９により得られたＧＲインスリン前駆体をコードするＤＮＡ断片を有する大腸菌株を使用して、類似の封入体バッチから、ＨＰＬＣ純度９６．５％のＧＲインスリン５．５ｇを得た。
【０１２０】
生成物（ＧＲインスリン）の残余の属性は実施例１１のとおりである。
【０１２１】
実施例１９．ＺＫＲインスリンの製造
ｐＨ５．０〜５．５の１００ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液中で、実施例１０又は１６により製造されたＧＫＲインスリン溶液１０００ｍｌ（濃度０．１ｍｇ／ｍｌ）に、１μＭのＣｕＳＯ４、１００μｇ／ｍｌのカタラーゼ、５ｍＭのアスコルビン酸及び２μＭのＰＡＭ酵素（Ｓａｔａｎｉ Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ．，Ｈａｒａｄａ Ｓ．，Ｋａｉｄａ Ｙ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｍ．；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００３ Ａｐｒ；２８（２）：２９３−３０２に従って得られたもの）を加え、その後、混合物を３７℃で２時間静置した。１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。
【０１２２】
ろ過後、得られた溶液をイオン交換クロマトグラフィ及びＨＰＬＣ法によって精製した。
【０１２３】
ＺＫＲインスリンを含む主要画分を濃縮し、クエン酸ナトリウム、クエン酸亜鉛、クエン酸を用いて結晶化した。反応混合物１バッチから、ＨＰＬＣ純度９７％の結晶ＺＫＲインスリン約１０ｍｇを得た。
【０１２４】
生成物の構造は、次の結果によって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は６０９１で、理論値（６０９１．１）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：７．５４。
【０１２５】
実施例２０．ＺＲインスリンの製造
ｐＨ４．５の１００ｍＭのＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液中で、実施例１１又は１８により製造されたＧＲインスリン溶液１００ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）に、１μＭのＣｕＳＯ４、１００μｇ／ｍｌのカタラーゼ、５ｍＭのアスコルビン酸及び２μＭのＰＡＭ酵素を加え、その後、その溶液を３７℃で１時間、穏やかに混合した。１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。ＰＡＭを使った反応後の溶液は、イオン交換及びＨＰＬＣ法によって精製した。
【０１２６】
インスリンを含む主要画分は濃縮し、クエン酸ナトリウム、クエン酸亜鉛、クエン酸を用いて結晶化した。反応混合物１バッチから、ＨＰＬＣ純度９８％の結晶ＺＲインスリン２２ｍｇを得た。
【０１２７】
生成物の構造は、次の結果によって確認された：
−質量分析によって決定される分子量は５９６３で、理論値（５９６２．９）と一致。
−ペプチドマップ：一致。
等電点：６．９７。
【０１２８】
実施例２１．ＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１２９】
【０１３０】
調製手順は次のとおりである：
次の２つの溶液を作成した：
【０１３１】
溶液１
最終的な亜鉛イオン濃度が３０μｇ／ｍｌに達するために必要な量の酸化亜鉛を、１０ｍＭの塩酸４０ｍｌに溶解した。その後、得られた溶液に、インスリンＧＫＲ１０，０００ｕに対応する量のインスリンＧＫＲを添加し、透明な溶液が得られるまで穏やかに撹拌し、その後、ｐＨの値を４．５に調整した。
【０１３２】
溶液２
別に、ｍ−クレゾール２７０ｍｇと無水グリセロール１６００ｍｌを４０ｍｌの注射用水に溶解した。
【０１３３】
溶液１と２の混合
溶液１を、撹拌しながら溶液２に加え、注射用水を１００ｍｌになるまで加えて、必要な場合は１０ｍＭの塩酸又は０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨを４．５に補正した。得られた混合物は、無菌状態で０．２２μｍのフィルターを通してろ過し、３ｍｌのガラスバイアルに等分した。加速安定性試験において、ＧＫＲインスリンを含む製剤（１００ｕ／ｍｌ）は、５６日間の実験期間中、室温で安定性を呈すると判断された（実施例２４）。
【０１３４】
実施例２２．ＧＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１３５】
【０１３６】
手順は、ＧＫＲインスリンに代わってＧＲインスリン（３６１ｍｇの量、１０，０００ｕ）を使用したこと、及び最終的なｐＨの値が４．０であることを除き、実施例２１と同一である。
【０１３７】
実施例２３．ＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の製造
次の組成のＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）１００ｍｌを作成した（１．０ｍｌ当たりの値）：
【０１３８】
【０１３９】
手順は、ＧＫＲインスリンに代わってＧＥＫＲインスリン（量、１０，０００ｕ）を使用したこと、及び最終的なｐＨの値が４．０であることを除き、実施例２１と同一である。
【０１４０】
実施例２４．ＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の加速安定性試験
実施例２１により作成されたＧＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）について、加速安定性試験（２５℃±２℃）を行った。この試験の間に、純度及びタンパク質汚染レベルの分析を実施した。下記に、生成物（ＧＫＲインスリン）のＨＰＬＣ純度、及び「０」、２８、４２、及び５６日の時点におけるＨＰＬＣ試験での、単独で最も汚染の強い汚染物質、脱アミド誘導体及び重合体の寄与比を示す。
【０１４１】
【０１４２】
実施例２５．ＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）の加速安定性試験
実施例２３により作成されたＧＥＫＲインスリン医薬製剤（１００ｕ／ｍｌ）について、加速安定性試験（２５℃±２℃）を行った。この試験の間に、純度及びタンパク質汚染レベルの分析を実施した。下記に、生成物（ＧＥＫＲインスリン）のＨＰＬＣ純度、及び「０」、及び１４日、１、２、及び３ヶ月の時点におけるＨＰＬＣ試験での、単独で最も汚染の強い汚染物質、及び重合体の寄与比を示す。
【０１４３】
【０１４４】
実施例２６．正常血糖動物におけるＧＫＲ活性の判定
組み換えヒトインスリン類似体（ＧＫＲインスリン）は、ゲンスリンＮ（組み換えイソフェンヒトインスリン）と同様に、活性時間延長が見られ、正常血糖ラットの低血糖は類似の過程をたどる。双方の製剤の低血糖活性における重大な差異は、投与後０．５時間及び１時間に観察された。この時点で、ＧＫＲインスリン投与後のグルコース濃度の急速かつ大幅な低下が観察された。ＧＫＲインスリンとゲンスリンＮの活性ピークは２時間目であった。
【０１４５】
初期研究において、ＧＫＲインスリンは持効型低血糖活性を有する活性類似体であることが確認された。ＧＫＲインスリン投与後のグルコースレベルの低下は最大１２時間観察され、一方、２４時間後のグルコースレベルは初期と同等だった。ＧＫＲインスリン及びゲンスリンＮ製剤の単回投与に対する正常血糖ラットの反応結果（平均値±標準誤差を考慮）は、表１及び図５に示す。
【０１４６】
実施例２７．実験的糖尿病動物におけるＧＫＲインスリン活性の判定
ラット糖尿病の実験モデル（ストレプトゾトシンによる誘発）に関する研究により、ＧＫＲインスリンの低血糖活性が疑いなく確認された。この活性は、持効型活性を特徴としていた。
【０１４７】
単回投与後、実験ラットの血中グルコース濃度の低下は、対照と比較すると、最大８〜１０時間目まで（糖尿病の重篤度及び投与量に依存する）統計的に有意な状態が続いた。研究の間に、参照製剤のインスリン・グラルギン（ランタス）と比較したＧＫＲインスリンによる活性開始の早期化及びピーク活性到達の早期化（開始で３０分、ピークで１〜２時間）が実証された。この現象の統計的有意性は、重度及び中等度の糖尿病で確認された。
【０１４８】
ＧＫＲインスリン及び参照製剤インスリン・グラルギンの複数回投与の研究でも、両類似体の同様の活性が実証された。製剤を２１日間、１日当たり３回投与したところ、軽度糖尿病における血糖パラメータの改善が生じ、基本的には効果の程度に統計的な差は出なかった。唯一の差は、ＧＫＲインスリンの活性プロファイルが顕著に均等化したことであった。
【０１４９】
さらに、ＧＫＲ製剤の投与終了後、低血糖効果が長く持続するという非常に興味深い現象が観察された。この観察は、類似体を投与量５ｕ／ｋｇ体重で２１日間投与された軽度糖尿病群のうち、ＧＫＲ製剤で治療されたラット９匹及びランタスで治療された３匹に実施された。得られた結果は、ＧＫＲインスリンの組織内（おそらく皮下組織）における非常に強度の結合の存在の証拠になり得る。それらは、区画が存在し、そこにインスリンが蓄積され、ゆっくりと再配分されるという主張を裏付ける。この現象は、参照製剤では観察されなかった。この性質は、ヒトで確認されれば、例えば薬品の投与を１日１回未満にすることが可能になり、持効型インスリン類似体による治療の突破口になり得る。
【０１５０】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける投与量５ｕ／ｋｇ体重でのＧＫＲインスリン単回投与後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表２及び図６に示す。
【０１５１】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、１回の投与量２．５ｕ／ｋｇ体重、５ｕ／ｋｇ体重及び７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を示す結果（ランタス製剤及び対照との比較）は、表３に示す。
【０１５２】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、１回の投与量２．５ｕ／ｋｇ体重、５ｕ／ｋｇ体重及び７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を表す結果（対照との比較）は、図７に示す。
【０１５３】
重度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける、投与量７．５ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＫＲインスリンの影響を表す結果（ランタス製剤との比較）は、図８に示す。
【０１５４】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおけるＧＫＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での複数回投与後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表４及び図９に示す。
【０１５５】
軽度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおけるＧＫＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での投与終了後のラットの血中グルコース濃度を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表５及び図１０に示す。
【０１５６】
【表１】
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
【表４】
【０１６０】
【表５】
【０１６１】
実施例２８．実験的糖尿病動物におけるＧＲインスリン活性の判定
ＧＲインスリンの低血糖活性は、ラットの中等度のストレプトゾトシン誘発性糖尿病において確認された。
【０１６２】
ＧＲインスリンの、５ｕ又は１０ｕ／ｋｇ体重単回投与後の活性は、急速かつ強力であると判定された。製剤投与後３０分ですでに活性開始が見られ、最大２時間同じレベルが維持され、その後、２４〜３６時間目に初期レベルに到達まで低下した。
【０１６３】
中等度ストレプトゾトシン誘発性糖尿病モデルにおける投与量５ｕ及び１０ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＲインスリン製剤の影響を示す結果（ランタス製剤との比較）は、表６に示す。ＧＲインスリン５ｕ／ｋｇ体重での投与後のグルコース濃度／時間変化のプロットは、図１１に示す。
【０１６４】
実施例２９．実験的糖尿病動物におけるＧＥＫＲインスリン活性の判定
ＧＥＫＲインスリン類似体の低血糖活性は、中等度の経過をたどるストレプトゾトシン誘発性糖尿病のラットでの予備試験において確認された。
【０１６５】
ＧＥＫＲインスリンの１０ｕ／ｋｇ体重単回投与後、非常に急速（０．５時間後にすでに）かつ強力な動物血中グルコース濃度を低下させる活性が見られた。この活性は、製剤投与後１時間ですでにピークに達し、ゆっくりと低下したが、投与後最大１２時間まで、初期値と比較して有意なグルコースレベルの低下をもたらした。この研究は、持効型活性を有するインスリン類似体のレベミル製剤（インスリン・デテミル）と比較して実施された。
【０１６６】
レベミル製剤と比較した、糖尿病の中等度ストレプトゾトシン誘発性モデルにおける投与量１０ｕ／ｋｇ体重での単回投与後のラットの血中グルコース濃度へのＧＥＫＲインスリンの影響を示す結果を、表７に示し、ＧＥＫＲインスリン１０ｕ／ｋｇ体重での投与後の時間の関数としてのグルコース濃度の変化を示すプロットは、図１２に示す。
【０１６７】
【表６】
【０１６８】
【表７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ鎖及びＢ鎖を形成する２つのポリペプチドを含むインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩であって、Ａ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜６から選択されると共に、Ｂ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７〜１０から選択されるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
等電点５〜８．５の組み換えヒトインスリンの類似体であり、且つ、式１であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
ここで、ＲはＮＨ２基、又は式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２は中性Ｌ−アミノ酸又はＮＨ２基を示し；且つ、
Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇを示し、ここでＢ３Ａｓｎは任意選択的に他のアミノ酸、好適にはＧｌｕに置換することができる。
【請求項３】
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示し、且つ、Ｂ３Ａｓｎは、Ｂ３Ｇｌｕで置換されている、請求項２に記載のインスリン誘導体又はその生理学的に許容される塩。
【請求項４】
有効に作用する量の、請求項１から３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
１０から５０μｇ／ｍｌの亜鉛を含むことを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
糖尿病の治療又は予防のための薬品を製造するための、請求項１から３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項７】
糖尿病を罹患する患者の治療方法であって、該治療を必要とする患者に対し、請求項４及び５に記載の有効に作用する量の医薬組成物を投与することを特徴とする治療方法。
【請求項１】
Ａ鎖及びＢ鎖を形成する２つのポリペプチドを含むインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩であって、Ａ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜６から選択されると共に、Ｂ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７〜１０から選択されるインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
等電点５〜８．５の組み換えヒトインスリンの類似体であり、且つ、式１であることを特徴とする請求項１に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
ここで、ＲはＮＨ２基、又は式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２は中性Ｌ−アミノ酸又はＮＨ２基を示し；且つ、
Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇ、又はＢ３１Ａｒｇを示し、ここでＢ３Ａｓｎは任意選択的に他のアミノ酸、好適にはＧｌｕに置換することができる。
【請求項３】
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、且つ、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇ−Ｂ３２Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＡｌａを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＴｈｒを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＳｅｒを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＮＨ２基を示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、ＮＨ２基を示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ａｒｇを示すか、又は、
式１のＲは、式Ａｓｎ−Ｒ２の基を示し、ここでＲ２はＧｌｙを示し、Ｒ１は、Ｂ３１Ｌｙｓ−Ｂ３２Ａｒｇを示し、且つ、Ｂ３Ａｓｎは、Ｂ３Ｇｌｕで置換されている、請求項２に記載のインスリン誘導体又はその生理学的に許容される塩。
【請求項４】
有効に作用する量の、請求項１から３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
１０から５０μｇ／ｍｌの亜鉛を含むことを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
糖尿病の治療又は予防のための薬品を製造するための、請求項１から３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項７】
糖尿病を罹患する患者の治療方法であって、該治療を必要とする患者に対し、請求項４及び５に記載の有効に作用する量の医薬組成物を投与することを特徴とする治療方法。
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図３】
【図２−２】
【図２−３】
【図２−４】
【図４−１】
【図４−２】
【図４−３】
【図４−４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２６８８６（Ｐ２０１１−５２６８８６Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６１９７（Ｐ２０１１−５１６１９７）
【出願日】平成２１年７月４日（２００９．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＬ２００９／０５００１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００２２８３
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５１１００５０１１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月４日（２００９．７．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＬ２００９／０５００１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００２２８３
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（５１１００５０１１）
【Ｆターム（参考）】
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