擬似ペプチドライブラリー
【課題】本発明は、従来のペプチドライブラリーよりも簡便に作製できる、多くの種類の擬似ペプチドを含む（サイズが大きい）擬似ペプチドライブラリーを提供することを課題とする。
【解決手段】デンドリマー及びその誘導体の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーにより、上記の課題を解決する。
【解決手段】デンドリマー及びその誘導体の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーにより、上記の課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンドリマーの複数の末端基にアミノ酸が結合したアミノ酸修飾デンドリマー（擬似ペプチド）の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のシグナル伝達反応などの生体反応は、タンパク質とタンパク質との相互作用、例えば、酵素と基質、受容体とリガンド、抗原と抗体の間の相互作用により媒介される。このような生体内のタンパク質の間の相互作用について研究することは、有用な生理活性物質の発見、疾患に関連する受容体の解析、ひいては疾患を治療しうる医薬品の発見などにつながる重要な研究である。
【０００３】
ある特定の標的分子（例えば受容体）とタンパク質が相互作用する場合、相互作用に関与するタンパク質の領域は、ある大きさ以下のペプチドであることが知られている。よって、標的分子と相互作用可能なタンパク質を見出すために、ある大きさのペプチドの集合であるペプチドライブラリーを用いることが簡便であることがよく知られている。ペプチドライブラリーとは、任意の長さの種々のアミノ酸配列を有するペプチドの混合物であり、このペプチドの混合物と標的分子とを反応させて、標的分子に結合可能なペプチドを選択することができる。このようなペプチドライブラリーは、コンビナトリアルケミストリーにおいて重要な要素であり、従来、生物学的な方法（バクテリオファージ法など）又は化学的なペプチド合成法により作製されている。
【０００４】
生物学的方法により作製されたライブラリーは、目的とするペプチドを遺伝子組み換えなどにより発現させるので、現在、１０8種もの多数のペプチドを含む大きいサイズのライブラリーを得ることが可能になっている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、化学的な方法によるペプチドライブラリーの作製は、従来、主にペプチドの固相合成法に基づいて行われている。
しかし、従来の化学的なペプチド合成では、長くても６アミノ酸程度のペプチドの混合物であるペプチドライブラリーしか提供できない。２０種類のアミノ酸が存在することを考慮すると、化学的なペプチド合成により提供できるペプチドライブラリーを構成するペプチドの種類は、理論的には最大で２０6種である。しかし、実際に全ての種類のアミノ酸配列を有するペプチドのペプチドライブラリーを作製することは不可能であり、化学合成法により得られるペプチドライブラリーのサイズは、生物学的に得られるライブラリーのサイズよりも小さい（非特許文献１）。
【０００６】
固相合成のような化学合成法により得られるペプチドライブラリーに含まれる各ペプチドは、６アミノ酸程度の長さの直鎖状のペプチドであるが、このようなペプチドの構造は三次元構造が比較的不安定であり、標的分子との結合の際に構造が安定しにくいので、ペプチドライブラリーのペプチドと標的分子との間の結合定数が大きくなりにくい（解離定数が大きくなりやすい）、という問題も存在する。
【０００７】
ところで、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した高分子として、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という。）が知られている。デンドリマーは、従来の線状の高分子に比べて、分子量や分子構造をより厳密に規定できるので、デンドリマーに基づいて設計された機能的材料は、様々な分野で用いられている。
例えば、デンドリマーの末端に抗原ペプチドを結合させた多価抗原ペプチドが製造され、ワクチンとして機能することが知られている（非特許文献２）。
【０００８】
また、デンドリマーを支持体として、デンドリマーの末端でペプチド合成を行うことにより、ペプチドライブラリーを作製する方法が知られている（非特許文献３）。この方法は、デンドリマーの末端基に１種類のアミノ酸を別々に結合させたものを混合し、１種類ずつのアミノ酸を結合させてペプチド鎖を伸長し、作製されたペプチドをデンドリマーから切断して、ペプチドライブラリーを作製する方法である。
【非特許文献１】コンビナトリアルケミストリー研究会編、「コンビナトリアルケミストリー」、化学同人社、1997年4月10日、ｐ．４４〜６４
【非特許文献２】青井 啓悟、柿本 雅明 監修、「デンドリティック高分子−多分岐構造が拡げる高機能化の世界」、ＮＴＳ社、2005年10月31日、ｐ．３５４−３５６
【非特許文献３】R. M. Kim, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, (1996) p. 10012-10017
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来のペプチドライブラリーよりも簡便に作製できる、多くの種類の擬似ペプチドを含む（サイズが大きい）擬似ペプチドライブラリーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、デンドリマーの複数の末端基のそれぞれにアミノ酸を１分子ずつ結合させた分子が、直鎖状に結合したアミノ酸の配列を有するペプチドのように作用して標的分子と結合し得ることを見出した。すなわち、デンドリマーの末端基にアミノ酸を１分子ずつ結合させることにより得られるアミノ酸修飾デンドリマーの混合物を、擬似ペプチドライブラリーとして用い得ることができることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
よって、本発明は、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という）の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーを提供する。
【００１２】
本明細書において、「擬似ペプチドライブラリー」とは、ペプチド結合したアミノ酸の並びからなるペプチドではないが、標的分子に結合可能であるという意味においてペプチドと同様の作用を発揮できる分子の混合物を意味する。「擬似ペプチドライブラリー」は、２種以上の異なる分子の混合物である。
また、本明細書において、「擬似ペプチド」とは、擬似ペプチドライブラリーを構成する各分子のことであり、より具体的には、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーのことである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの混合物であるので、デンドリマーにアミノ酸を結合させる１段階の反応で作製することができ、作製が簡便である。また、デンドリマーの世代を増加させることにより、デンドリマーの末端基の数が増え、より長い擬似ペプチドを作製できるので、ライブラリーのサイズを大きくすることが容易である。
【００１４】
また、本発明の擬似ペプチドライブラリーの構成要素である各擬似ペプチド（アミノ酸修飾デンドリマー）は、比較的密な構造を有するデンドリマーの末端基にアミノ酸が結合したものであるので、従来のペプチドライブラリーの直鎖状に結合したペプチドに比べて、擬似ペプチドの構造が比較的安定する。よって、標的分子との結合実験において用いる場合に、直鎖状のペプチドよりも、標的分子との結合をより強固な安定したものとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に用いられるデンドリマー及びその誘導体とは、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した化合物である。デンドリマーの誘導体とは、デンドリマーを構成する部分構造であるデンドロンを含む。本発明において、デンドリマーは、デンドロンが好ましい。
一般に、デンドリマーは、コアと、いくつかの世代の分岐部分と、末端基とからなる。
デンドリマーのコアは、１つ以上の官能基を有する化合物から誘導されるものである。好ましい官能基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、水酸基、カルボン酸基、チオール基、エステル基、アミド基、ケトン基、アルデヒド基などが挙げられる。
【００１６】
デンドリマーのコアは、上記のコアがジスルフィド結合により連結されたものであってもよい。
デンドリマーがデンドロンである場合、コアは、適切な保護基で保護されていてもよいし、置換されていてもよいし、以下に記載する標識物質で標識されていてもよい。適切な保護基としては、Boc（ｔ−ブトキシカルボニル）、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。
【００１７】
デンドリマーの分岐部分は、３以上の原子価を有する原子を含む分岐構造単位の繰り返しからなる。３以上の原子価を有する原子としては、炭素、窒素、ケイ素、リンなどが挙げられる。
デンドリマーの分岐部分としては、以下に示すような構造が、一般的に知られている。
【００１８】
【化１】
【００１９】
上記の分岐構造を有する各デンドリマーについては、以下の文献に記載されている。
（Ａ）D.A. Tomaliaら、Polym. J. 17, 117 (1985)；D.A. Tomaliaら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138 (1990)
（Ｂ）E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1308 (1993)；E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Macromol. Symp. 77, 51 (1994)；J.C. Hummelenら、Chem. Eng. J. 3, 1489 (1997)；C. Wanerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1300 (1993)
（Ｃ）H.K. Hall Jr.ら、Polym. Bull. 17, 409 (1987)
【００２０】
（Ｄ）米国特許第4289872号；米国特許第4410688号
（Ｅ）L.J. Twymanら、Tetrahedron Lett. 35, 4423 (1994)
（Ｆ）K.E. Uhrichら、J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1623 (1992)
（Ｇ）S.C.E. Bucksonら、Macromol. Symp. 77, 1 (1994)
（Ｈ）G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 50, 2004 (1985)；G.R. Newkomeら、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 752 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 108, 849 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 112, 8458 (1990)；G.R. Newkomeら、Macromolecules 24, 1443 (1991)；G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 53, 5552 (1988)；米国特許第5136096号；米国特許第5206410号；米国特許第5210309号
（Ｉ）M. Okazakiら、J. Am. Chem. Soc. 125, 8120 (2003)；I. Washioら、Macromolecules 38, 2237 (2005)
【００２１】
（Ｊ）R. Haagら、J. Am. Chem. Soc. 122, 2954 (2000)
（Ｋ）M. Jayaramanら、J. Am. Chem. Soc. 120, 12996 (1998)
（Ｌ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7638 (1990)；G. L'abbeら、Chem. Commun. 2143 (1996)
（Ｍ）P. Murerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2116 (1995)
（Ｎ）H.T. Changら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 182 (1995)
（Ｏ）H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 118, 6388 (1995)；H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 123, 5908 (2001)
【００２２】
（Ｐ）Y. Hirayamaら、Org. Lett. 7, 525 (2005)；中村大輔ら、高分子学会予稿集、54, 2949 (2005)
（Ｑ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 114, 8405 (1992)；C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 121, 262 (1999)；D.M. Haddletonら、J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 649 (1996)
（Ｒ）D. Seebachら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2795 (1996)；D. Seebachら、Helv. Chim. Acta. 80, 989 (1997)
（Ｓ）M.A. Carnahanら、J. Am. Chem. Soc. 123, 2905 (2001)
（Ｔ）M.A. Carnahanら、Macromolecules 34, 7648 (2001)
（Ｕ）F. Zengら、J. Am. Chem. Soc. 118, 5326 (1996)
【００２３】
（Ｖ）A. Morikawaら、Macromolecules 26, 6324 (1993)；A. Morikawa, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1806
（Ｗ）S.R. Rannardら、J. Am. Chem. Soc. 122, 11729 (2000)
（Ｘ）M. Tominagaら、Chem. Lett. 374 (2000)
（Ｙ）H. Uchidaら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7077 (1990)；A. Morikawaら、Macromolecules 24, 3460 (1991)；M. Kakimoto, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1809
【００２４】
デンドリマーの分岐部分は、デンドリマーの水溶性の観点から、水溶性を示すアミド結合などの酸素原子及び／又は窒素原子を含む構造が好ましい。
【００２５】
デンドリマーの分岐部分は、上記のような繰り返し単位を２種以上含むものであってもよい。
【００２６】
デンドリマーの末端基の構造は、所望により適宜選択できる。例えば、末端基は、分岐部分の最後の繰り返し単位の構造を有してもよいし、末端基は、分岐部分とは別の構造を有してもよい。
また、デンドリマーの末端基の数は、分岐部分の構造及びデンドリマーの世代数に依存する。デンドリマーは、一般に、コアの官能基に分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第１世代、第１世代の末端基の末端に別の分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第２世代というように、分岐構造を有する単位の数に応じて、「第ｎ世代（Ｇｎ）のデンドリマー」と称される。一般に、第１〜１０世代のデンドリマーが知られており、理論的には、より大きい世代のデンドリマーを製造することも可能である。
【００２７】
第１世代の末端基の数は、（コアの官能基の数）×１であり、第２世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）であり、第ｎ世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）n-1である。
なお、例えば、分岐部分が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜である場合、「分岐部分の分岐数」は３である。
【００２８】
本発明におけるデンドリマーは、好ましくは、ポリアミドアミンデンドリマー（例えば上記の（Ａ）の分岐部分を有するもの）、ポリイミンデンドリマー（例えば（Ｂ））、ポリアミンデンドリマー（例えば（Ｃ））、ポリアミドデンドリマー（例えば（Ｄ）〜（Ｇ））、ポリエーテルアミドデンドリマー（例えば（Ｈ）、（Ｉ））、ポリエーテルデンドリマー（例えば（Ｊ）〜（Ｎ））、ポリエステルデンドリマー（例えば（Ｏ）〜（Ｔ））、ポリエーテルエステルデンドリマー（例えば（Ｕ））、ポリエーテルケトンデンドリマー（例えば（Ｖ））、ポリカルボナートデンドリマー（例えば（Ｗ））、複素環含有デンドリマー（例えば（Ｘ））、ケイ素含有デンドリマー（例えば（Ｙ））である。
これらのデンドリマーの製造方法は、上記の文献に記載されている。
【００２９】
上記のデンドリマーは、より好ましくは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの部分骨格（デンドロン）である。ポリアミドアミンデンドロンは、以下の式に示される構造を有するものである。
第１世代（Ｇ１）：Ｒ1Ｎ（ＸＨ2）2
Ｇ２：Ｒ1Ｎ（Ｘ（ＸＨ2）2）2
Ｇ３：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2
Ｇ４：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2
Ｇ５：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2
Ｇ６：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2
Ｇ７：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2
Ｇ８：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2）2
（式中、Ｒ1は、置換されていてもよいアミノアルキル基、メルカプトアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルデヒドアルキル基、アジドアルキル基、エポキシアルキル基又はアセチレンアルキル基を表し、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００３０】
本発明において、上記のポリアミドアミンデンドロンは、Ｇ２以上かつＧ７以下のものが好ましい。
【００３１】
上記の式中、Ｒ1のアルキル鎖としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ2〜Ｃ5の低級アルキルが好ましい。Ｒ1は、好ましくはアミノエチル基である。
Ｒ1基は、所望により置換又は保護されていてもよい。適切な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。また、例えば、本発明によるアミノ酸修飾デンドリマーが標識される場合、Ｒ1のアミノ基が標識物質と結合することもできる。
【００３２】
上記のデンドリマーは、従来公知の製造方法により製造できる。また、一部のものは市販でも入手可能である。
【００３３】
例えば、上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンは、原料である第１級アミンに、アクリル酸エステルを反応させるマイケル付加反応と、ジアミノアルカンを用いるエステルアミド交換反応とにより第１世代のアミド化合物を得て、マイケル付加反応及びエステルアミド交換反応を繰り返すことにより製造できる（Tomalia, D.ら、Polym. J. 17、117〜132 (1985)；Frechet, J. M. J., Tomalia, D. A.編、(2001) Dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, West Sussexを参照）。原料となるジアミンは、市販で入手可能である。
上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンの製造法のスキームの例を、以下に示す。
【００３４】
【化２】
（式中、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００３５】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、上記のデンドリマーの末端基に、同じ又は異なるアミノ酸が１分子ずつ結合したアミノ酸修飾デンドリマーからなる。
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基とを同一分子内に有する化合物、及びアミノ基、カルボキシル基又はそれ以外の基が保護又は置換されたものも含むことを意図する。
アミノ酸は、天然のタンパク質を構成する２０種のアミノ酸（天然アミノ酸)、及びそれ以外のアミノ酸を含む。
天然アミノ酸以外のアミノ酸としては、例えばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸、δ−アミノレブリン酸、ホモシステイン、ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。
【００３６】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる。本発明においては、あるアミノ酸修飾デンドリマー分子と、別のアミノ酸修飾デンドリマー分子とを比較したときに、少なくとも１つの位置の末端基を修飾しているアミノ酸の種類が異なる場合に、これらのアミノ酸修飾デンドリマーは異なる種類であるとみなす。例えば、４つの末端基Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4がアミノ酸Ａ又はＢで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの末端アミノ酸の組み合わせとしては、以下の１６種類が考えられる。
（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝
（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、
（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）
これらのうち、例えば（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）と（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）のものは、Ａが３分子、Ｂが１分子という点では同じであるが、Ｙ3、Ｙ4の位置の末端基を修飾するアミノ酸が異なるので、２種類の異なるアミノ酸修飾デンドリマーとみなすことができる。
また、本発明の擬似ペプチドライブラリーは、末端基を修飾するアミノ酸がすべて同じもの、例えば（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）のようなものも含み得る。
【００３７】
本発明の擬似ペプチドライブラリーにおいて、アミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーの全ての末端基がアミノ酸で修飾されていてもよく、デンドリマーの一部の末端基がアミノ酸で修飾されていてもよい。
【００３８】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、ペプチドライブラリーの代替として用いることができる、異なる擬似ペプチドの混合物である。本発明の２種以上の擬似ペプチド、すなわちアミノ酸修飾デンドリマーを含む擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸をデンドリマーと反応させることにより、作製することができる。
２種以上のアミノ酸とデンドリマーとの反応は、デンドリマーの末端基の種類によって適宜選択できる。例えばデンドリマーの末端基が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2である場合のようにデンドリマーの末端基の末端がアミノ基である場合、アミノ酸のカルボキシル基を末端のアミノ基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーの末端基がカルボキシル基である場合、アミノ酸のアミノ基を末端のカルボキシル基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーとアミノ酸の結合として、ヒドロキシル基とカルボキシル基、チオール基同士、チオール基やマレインイミド基、アジド基とアルキン、エポキシ基とアルキンの結合などを利用することも可能である。
デンドリマーとアミノ酸とを結合させる反応では、通常、アミノ酸のデンドリマーと反応する反応部位以外の反応性部位を保護又は置換すること、アミノ酸に反応性部位を導入することなどが行われる。
【００３９】
上記のアミノ酸修飾デンドリマーは、末端基に結合したアミノ酸同士はペプチド結合していないにもかかわらず、デンドリマーが密な分子構造を有するので、その末端に結合したアミノ酸が、あたかも直鎖状にペプチド結合しているかのように擬似ペプチドとして作用できる。よって、標的分子の結合部位に結合することが可能である。
【００４０】
本発明の擬似ペプチドライブラリーに含まれるアミノ酸修飾デンドリマーは、標識物質と結合していることが好ましい。標識物質とは、標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別できる物質であれば、特に限定されない。標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別する様式としては、標識物質が放射線を含む光を吸収及び発光すること、標識物質がアミノ酸修飾デンドリマー以外の別の物質と特異的に結合することなどが挙げられる。
標識物質は、蛍光物質、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなど）、放射性同位元素（例えば125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなど）、別の物質と特異的に結合可能な物質（例えばアビジン又はストレプトアビジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）が挙げられる。
【００４１】
上記の蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びその誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、Ｑｄｏｔ（登録商標）、ローダミン及びその誘導体、Ｃｙ色素及びその誘導体のような、当該分野で公知の物質が挙げられる。また、蛍光物質として、ＨＰＬＣ用の誘導化試薬を用いることができ、そのような試薬としては、以下のようなものが挙げられる：
DPS-Cl（4-（5,6-ジメトキシ-N-フタルイミジニル）ベンゼンスルホニルクロリド）
NBD-Cl（4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
NBD-F（4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
Dansyl-Cl（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルクロリド）
Dansyl-F（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルフロリド）
Fluorescamin（4-フェニルスピロ[フラン-2-(3H),1'-フタラン]-3,3'-ジオン）
Dabsyl-Cl（4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリド）
Dabcyl-Cl（4-[[（4-ジメチルアミノ）フェニル]アゾ]安息香酸スクシンイミジルエステル）
ABD-F（4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1-,3-ベンゾキサジアゾール）
NAM（N-(9-アクリジニル)マレイミド）
SBD-F（アンモニウム4-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-7-スルホネート）
DDB（1,2-ジアミノ-4,5-ジメトキシベンゼン二塩酸塩）
MDB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩）
Br-DMEQ（3-ブロモメチル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-1,2-ジヒドロキノキサリン-2-オン）
Br-Mmc（4-ブロモメチル-7-メトキシクマリン）
DMEQ-COCl（3-クロロカルボニル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-2(1H)-キノキサリノン）
【００４２】
上記のアミノ酸修飾デンドリマーと標識物質との結合は、標識物質の種類に応じて、当該分野で公知の方法により行うことができる。標識物質は、デンドリマーのコアに結合してもよいし、末端基に結合してもよい。好ましくは、デンドリマーのコアに標識物質が結合することである。
【００４３】
例えば、デンドリマーのコアに反応可能なアミノ基が存在する場合、このアミノ基を、標識物質に結合させた反応性官能基、例えばイソチオシアネート基、ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）基をもつ標識物質をアミノ酸修飾デンドリマーに結合させることができる。
なお、標識物質と結合しているアミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーと標識物質を先に反応させ、その後、アミノ酸でデンドリマーを修飾してもよいが、操作が簡便であるので、デンドリマーをアミノ酸で修飾した後に、アミノ酸修飾デンドリマーに標識物質を結合させることが好ましい。
【００４４】
本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを用いて、標的分子と結合可能な擬似ペプチドを選択する方法も提供する。
よって、本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法でもある。
【００４５】
上記の標的分子は、標的分子に結合するペプチドを検出することが所望される分子であれば特に限定されず、ペプチド、受容体などのタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、脂質、糖鎖などが挙げられる。
【００４６】
上記の擬似ペプチドライブラリーと標的分子との接触は、標的分子とそれに結合可能な擬似ペプチドとの結合が可能となる条件下で行うことができる。このような条件は、標的分子の種類に応じて適宜決定できる。
【００４７】
標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程は、従来公知のタンパク質の相互作用を測定する方法により行うことができる。当該相互作用測定方法としては、溶液中で相互作用を測定する方法、担体上で相互作用を測定する方法などが挙げられる。溶液中で相互作用を測定する方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、流体力学的方法（例えば沈降平衡法、電気泳動法、ゲルろ過法など）、光学的方法（吸光度、蛍光強度などの測定、円偏光二色性スペクトルの測定などに基づく方法）アフィニティクロマトグラフィー、電場中での分子の配向の変化を測定する方法などが挙げられる。また、担体上で相互作用を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）などが挙げられる。
本発明の方法で用いる擬似ペプチドライブラリーは、好ましくは親水性の高いデンドリマーにアミノ酸が結合しているので、溶液中で相互作用を測定する方法であっても有利に測定を行うことができる。
【００４８】
本発明の方法により得られた知見は、標的分子に結合可能なタンパク質のモチーフを同定するための情報として用いることができる。すなわち、本発明により検出されたアミノ酸修飾デンドリマーの末端基のアミノ酸の配列に基づいて、標的分子、例えば疾患に関与する受容体に結合できる医薬品の開発のための情報を提供できる。
【実施例】
【００４９】
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１
（１）コアにアミノ基を有するポリアミドアミンデンドロンの製造
デンドリマーとしてのコアにアミノ基を有するポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドロンは、Haradaら（Bioconjugate Chem. 2006, 17, p.3-5）に記載される方法に従って合成した。
具体的には、Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（4.889 g, 3.05×10-2 mol）を、アクリル酸メチル（300 mL, 3.35 mol）に溶解し、混合物をアルゴン雰囲気下に還流させた。７日後に、未反応のアクリル酸メチルを減圧除去し、残渣を、CHCl3：メタノール（MeOH）＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（０．５世代）を得た。
【００５０】
０．５世代のPAMAMデンドロン（3.38 g, 1.02×10-2 mol）を、メタノール（6 ml）に溶解し、混合物を、シアン化ナトリウム（100mg, 2.04×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に40℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを反応混合物から真空下で除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第１世代）を得た。
【００５１】
メタノール（6 ml）に溶解した第1世代のPAMAMデンドロン（2.75 g, 7.08×10-3 mol）を、アクリル酸メチル（450 ml, 5.02 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて4日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、CHCl3： MeOH＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー、及びメタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第1.5世代）を得た。
【００５２】
メタノール（6 ml）に溶解した第1.5世代のPAMAMデンドロン（2.10 g, 2.87×10-3 mol）を、シアン化ナトリウム（90 mg, 1.84×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。3日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第２世代）を得た。
【００５３】
メタノール（4 ml）に溶解した第２世代のPAMAMデンドロン（2.00 g, 2.37×10-3 mol）を、アクリル酸メチル（500 ml, 5.58 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて3日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第2.5世代）を得た。
【００５４】
メタノール（4 ml）に溶解した第2.5世代のPAMAMデンドロン（3.27 g, 2.13×10-3 mol）を、シアン化ナトリウム（60 mg, 1.20×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（200 ml, 3.00 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第３世代；Ｇ３）を得た。
PAMAMデンドロンの製造のスキームを、以下に示す。
【００５５】
【化３】
（上記の式中、Ｘは−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００５６】
（２）アセチル化アミノ酸の調製
Ｌ−フェニルアラニン（1.2g, 10mmol）又はＬ−アラニン（5.5g, 56mmol）を、ＮａＯＨ水溶液（4M）に溶解した。過剰量の無水酢酸と同時に、過剰量のＮａＯＨ水溶液（4M）を滴下し、この溶液のｐＨを９．５〜１１．５に保って氷上で一晩撹拌した。その後、6N ＨＣｌを加えて、ｐＨを２．５に調整した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いて抽出したアセチル化アミノ酸を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化した。アセチル化フェニルアラニン（Ac-Phe）及びアセチル化アラニン（Ac-Ala）の収率は、それぞれ７７％及び５４％であった。これらの生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲで分析した。
【００５７】
Ac-Alaについての1H NMR: δ1.39 (d, Hβ), 2.01 (s, CH3CO) and 4.29 (q, Hα).
Ac-Alaについての13C NMR: δ19.3 (Cβ), 24.6 (CH3CO), 52.1 (Cα) and 176.9 (CO).
Ac-Pheについての1H NMR: δ1.91 (s, CH3CO), 2.92 and 3.19 (m, Hβ), 4.46 (m, Hα), and 7.29 and 7.36 (m, phenyl).
Ac-Pheについての13C NMR: δ24.7 (CH3CO), 40.5 (Cβ), 59.1 (Cα), 129.8, 131.5, 132.2 and 140.7 (phenyl) and 176.3 (CO).
【００５８】
（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸を異なる混合比（モル比）で混合した混合アミノ酸（Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０）を、それぞれ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．６ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代）（30mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００５９】
例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて修飾されたアミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.34 (m, Hβ of Ala), 1.42 (s, Boc), 1.95 (s, CH3CO of Phe) and 2.02 (s, CH3CO of Ala), 2.24 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.63 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.81 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.06 (br, NCH2CH2N (core)), 3.36 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.21 (br, Hα of Ala), 4.49 (br, Hα of Phe) and 7.31 (m, phenyl).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図１に示す。
【００６０】
（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーに、2mlのＴＦＡを加えて氷上で４時間反応させてＢｏｃ基を脱保護した。溶媒を蒸発させた後に、過剰量のＴＥＡを加え、ＭｅＯＨ及びエーテルで再沈殿させた。残渣をエタノールに溶解し、過剰量の４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、Sephadex LH-20カラムを用いて精製した。Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０の混合比のアミノ酸混合物で修飾したＮＢＤ標識デンドリマーの収率は、それぞれ出発物質の５５、４７、５４、５７、６５、３３及び６９％であった。これらの生成物を、ＣＤ3ＯＤに溶解して、1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００６１】
例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.32 (d, Hβ of Ala), 1.90 (s, CH3CO of Phe) and 2.08 (s, CH3CO of Ala), 2.40 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.87 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.41 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.23 (br, Hα of Ala), 4.50 (br, Hα of Phe) and 7.24 (m, phenyl and NBD).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図２に示す。
【００６２】
上記の各比率のアミノ酸と反応させて得られたアミノ酸修飾デンドリマーについて得られたＮＭＲスペクトルを図１及び２に示す。これらのスペクトルに基づいて、Ala又はPheのデンドリマーに対する積分値を求め、この値から、実際にデンドリマーの末端基に結合した各アミノ酸の数を推定した。この結果を、表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
表１の結果から、デンドリマーの実質的に全ての末端基にアミノ酸分子が結合していることがわかる。また、デンドリマーの末端基に結合した２種のアミノ酸の割合は、反応させた２種のアミノ酸の混合比とほぼ等しいことがわかる。よって、デンドリマーに反応させる種々のアミノ酸の混合比を調節することにより、擬似ペプチドライブラリー中の擬似ペプチドのアミノ酸の比を調節できることが示唆される。
【００６５】
（４）で得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーを、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（トーソー社製）、
検出器：ＵＶ検出器（ＵＶ−２０７５Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、及び蛍光検出器（λｅｘ＝４５０ｎｍ，λｅｍ＝５３０ｎｍ；ＦＲ−２０２０Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、
ポンプ：ＰＵ−２０８９Ｐｌｕｓ（日本分光社製）、
流速：１．０ｍｌ／分
サンプル溶液：１０％メタノール（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、
グラジエント：０分：１００％（Ａ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、３０分：（Ａ）１０％及び（Ｂ）９０％含有２０ｍＭリン酸緩衝液。
【００６６】
ＨＰＬＣの結果を、図３に示す。
【００６７】
図３の結果から、標識アミノ酸結合デンドリマーは、Ac-Ala/Ac-Pheの比が１０／０のときは約９．１分で、Ac-Ala/Ac-Pheの比が０／１０のときは約１７．１分で、それぞれＨＰＬＣのカラムから溶出され、Ac-Ala/Ac-Pheの比がこれらの間である場合は、複数のピーク又はブロードなピークを示すことがわかる。例えば、Ac-Ala/Ac-Pheの比が７／３のときは、約９．１分、約１０．９分、約１２．２分、約１３．６分にピークが見られた。これらのピークは、それぞれAc-Ala 8/Ac-Phe 0、Ac-Ala 7/Ac-Phe 1、Ac-Ala 6/Ac-Phe 2、Ac-Ala 5/Ac-Phe 3に対応すると考えられる。このことから、様々な比で結合した種々の分子が得られたことがＨＰＬＣによって確認された。
【００６８】
実施例２
（１）ポリアミドアミンデンドロンの製造
実施例１の（１）と同様にして、Boc保護されたPAMAMデンドロンを製造した。また、実施例１の（１）の第２世代から第３世代のデンドリマーの製造と同様にして、Boc保護された第４世代（Ｇ４）のPAMAMデンドロンを製造した。
【００６９】
（２）アセチル化アミノ酸の調製
実施例１の（２）と同様にして、アセチル化したＬ−プロリン及びＬ−アラニン（それぞれAc-Pro及びAc-Ala）を得た。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13C ＮＭＲで分析した。
Ac-Proについての1H NMR: δ1.86-1.91 and 2.24-2.29 (m, Hβ), 1.97 (m, Hγ), 2.10 (s, CH3CO), 3.44-3.65 (m, Hδ) and 4.31-4.37 (m, Hα).
Ac-Proについての13C NMR: δ24.2 (CH3CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO).
【００７０】
また、Boc及びTos（ｐ−トルエンスルホニル）基で保護されたアルギニン（Boc-Arg (Tos)）（1.0g, 2.2mmol）を、氷上で５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で４時間処理した。溶媒を蒸発させた。蒸留水を加えて蒸発させる操作を２回行った。得られた生成物を、実施例１の（１）と同様にして、アセチル化されたＬ−アルギニン（Ac-Arg (Tos)）を得た。収率：５０％。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13C ＮＭＲで分析した。
1H NMR: δ1.49-1.65 (m, Hβ and Hα), 1.99 (s, CH3CO), 2.40 (s, CH3 (Tos)), 3.18 (br, Hδ), 4.08 (m, Hα) and 7.40 and 7.75 (d, phenyl (Tos)).
13C NMR: δ24.2 (CH3CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO).
【００７１】
（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸をAc-Pro/Ac-Arg(Tos)＝３／１の比で混合した混合アミノ酸、又は（２）で調製したAc-Ala（2.0mmol）を、ＮＨＳ（2.4mmol）、ＤＣＣ（2.6mmol）及びＴＥＡ（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ＤＭＳＯに溶解したＧ３世代又はＧ４世代の（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（300mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ９１及び９３％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解して1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲで分析した。
【００７２】
Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CH3 of Tos group), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.83 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).
【００７３】
Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CH3 of Tos group), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.83 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).
【００７４】
Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.84 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.21 (m, Hα).
Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.82 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.17 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.22 (m, Hα).
【００７５】
（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーを、実施例１の（４）と同様にして、ＮＢＤで標識した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。これらにトリフルオロ酢酸、1.85ml、チオアニソール、0.222ml、トリフルオロメタンスルホン酸、0.02mlを加えて室温で8時間反応させることで、結合したアルギニンの保護基を除去した。反応混合物にエーテルを加えて再沈させた後、残渣にトリエチルアミン１ｍｌとメタノール１ｍｌを加え、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製したものを、最終生成物とした。一方、Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８５％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解して1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００７６】
Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.67-1.85 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.91-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.99, 2.06 and 2.14 (s, CH3CO), 2.47 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.73 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.90 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.12 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.51 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.23 (m, Hα of Arg) and 4.34 and 4.50 (m, Hα of Pro).
【００７７】
Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.65-1.84 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.92-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.98, 2.05 and 2.13 (s, CH3CO), 2.27 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.45 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.87 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.21 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.24 (m, Hα of Arg) and 4.33 and 4.49 (m, Hα of Pro).
【００７８】
Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.03 (s, CH3CO), 2.43 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.77 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.04 (s, CH3CO), 2.43 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.77 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
NBD部分に由来するシグナルは、その不溶性のためにNMRで検出されなかった。
【００７９】
（５）結合アッセイ
最小の共通ペプチド配列Pro-X-X-Proを認識して結合することが知られているSrc-homology 3（ＳＨ３）ドメインを用いて、実施例２で作製した擬似ペプチドライブラリーが、ＳＨ３ドメインとの結合活性を有するかについて調べた。
ＧＳＴタグをＮ末端に融合したAmphiphysin (Bin1)のＳＨ３ドメイン（３７４番目から４５４番目までのアミノ酸）を、以下のようにして調製した。該当部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、pGEX-6P-1（Amersham Pharmacia）に組み込んだベクターで大腸菌（DH5α）を形質転換させた。次に、100mg/Lのアンピシリンを含む25mlのLuria-Bertani（LB）培地で一晩培養した大腸菌を500mlのLB培地で２時間培養し、続いて室温にてイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を1mMまで加えてさらに２時間培養した。遠心によって集菌し、細胞溶解バッファー（1% NP-40, 100mM EDTA, 1mM PMSF, 5μg/ml Apr, 2μg/ml Leu, 3μg/ml PepAを添加したリン酸緩衝食塩水(PBS)）に懸濁し、超音波照射によって細胞膜を粉砕した。このようにして得た細胞抽出液から、グルタチオンビーズを用いてＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインを精製した。コントロールとして用いるためのＧＳＴ蛋白質は、pGEXベクターを用いて同様に作製した。
【００８０】
Ac-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマー（Ｇ３）又はAc-Ala修飾標識デンドリマー（Ｇ３）(500nmol)と、グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ融合ＳＨ３ドメイン（10nmol）を、Trisバッファー中（20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.005% Tween20）で4℃、2時間インキュベーションした。その後、ビーズをTrisバッファー1 mlで4回洗浄し、50％酢酸水溶液を200μl加え、2時間インキュベーションした。15000rpmで20分遠心し、上清の蛍光量(ex.450nm, em.530nm)を測定した。
比較として、GSTのみとアミノ酸修飾標識デンドリマーを用いて同様に結合実験を行った。
【００８１】
結果を、図４に示す。縦軸は、結合率（×１０-3）＝（測定された蛍光量）／（ＧＳＴ融合タンパク質を加えなかった（アミノ酸修飾標識デンドリマーのみ）場合の蛍光量）を示す。また、ＳＨ３−Ｐｒｏは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＳＨ３−Ａｌａは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ｐｒｏは、ＧＳＴタンパク質とAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ａｌａは、ＧＳＴタンパク質とAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合の結果を示す。
この結果から、本発明のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる擬似ペプチドライブラリーは、標的分子に結合する能力を有する擬似ペプチドを含むことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させたアミノ酸修飾デンドリマー（Boc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の1H NMRスペクトルである。
【図２】末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させた蛍光標識アミノ酸修飾デンドリマー（PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の1H NMRスペクトルである。
【図３】異なる混合比で混合したアラニンとフェニルアラニンを用いて作製した本発明の擬似ペプチドライブラリーのＨＰＬＣのチャートである。
【図４】本発明の擬似ペプチドライブラリーと、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとの結合実験の結果を示す棒グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンドリマーの複数の末端基にアミノ酸が結合したアミノ酸修飾デンドリマー（擬似ペプチド）の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のシグナル伝達反応などの生体反応は、タンパク質とタンパク質との相互作用、例えば、酵素と基質、受容体とリガンド、抗原と抗体の間の相互作用により媒介される。このような生体内のタンパク質の間の相互作用について研究することは、有用な生理活性物質の発見、疾患に関連する受容体の解析、ひいては疾患を治療しうる医薬品の発見などにつながる重要な研究である。
【０００３】
ある特定の標的分子（例えば受容体）とタンパク質が相互作用する場合、相互作用に関与するタンパク質の領域は、ある大きさ以下のペプチドであることが知られている。よって、標的分子と相互作用可能なタンパク質を見出すために、ある大きさのペプチドの集合であるペプチドライブラリーを用いることが簡便であることがよく知られている。ペプチドライブラリーとは、任意の長さの種々のアミノ酸配列を有するペプチドの混合物であり、このペプチドの混合物と標的分子とを反応させて、標的分子に結合可能なペプチドを選択することができる。このようなペプチドライブラリーは、コンビナトリアルケミストリーにおいて重要な要素であり、従来、生物学的な方法（バクテリオファージ法など）又は化学的なペプチド合成法により作製されている。
【０００４】
生物学的方法により作製されたライブラリーは、目的とするペプチドを遺伝子組み換えなどにより発現させるので、現在、１０8種もの多数のペプチドを含む大きいサイズのライブラリーを得ることが可能になっている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、化学的な方法によるペプチドライブラリーの作製は、従来、主にペプチドの固相合成法に基づいて行われている。
しかし、従来の化学的なペプチド合成では、長くても６アミノ酸程度のペプチドの混合物であるペプチドライブラリーしか提供できない。２０種類のアミノ酸が存在することを考慮すると、化学的なペプチド合成により提供できるペプチドライブラリーを構成するペプチドの種類は、理論的には最大で２０6種である。しかし、実際に全ての種類のアミノ酸配列を有するペプチドのペプチドライブラリーを作製することは不可能であり、化学合成法により得られるペプチドライブラリーのサイズは、生物学的に得られるライブラリーのサイズよりも小さい（非特許文献１）。
【０００６】
固相合成のような化学合成法により得られるペプチドライブラリーに含まれる各ペプチドは、６アミノ酸程度の長さの直鎖状のペプチドであるが、このようなペプチドの構造は三次元構造が比較的不安定であり、標的分子との結合の際に構造が安定しにくいので、ペプチドライブラリーのペプチドと標的分子との間の結合定数が大きくなりにくい（解離定数が大きくなりやすい）、という問題も存在する。
【０００７】
ところで、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した高分子として、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という。）が知られている。デンドリマーは、従来の線状の高分子に比べて、分子量や分子構造をより厳密に規定できるので、デンドリマーに基づいて設計された機能的材料は、様々な分野で用いられている。
例えば、デンドリマーの末端に抗原ペプチドを結合させた多価抗原ペプチドが製造され、ワクチンとして機能することが知られている（非特許文献２）。
【０００８】
また、デンドリマーを支持体として、デンドリマーの末端でペプチド合成を行うことにより、ペプチドライブラリーを作製する方法が知られている（非特許文献３）。この方法は、デンドリマーの末端基に１種類のアミノ酸を別々に結合させたものを混合し、１種類ずつのアミノ酸を結合させてペプチド鎖を伸長し、作製されたペプチドをデンドリマーから切断して、ペプチドライブラリーを作製する方法である。
【非特許文献１】コンビナトリアルケミストリー研究会編、「コンビナトリアルケミストリー」、化学同人社、1997年4月10日、ｐ．４４〜６４
【非特許文献２】青井 啓悟、柿本 雅明 監修、「デンドリティック高分子−多分岐構造が拡げる高機能化の世界」、ＮＴＳ社、2005年10月31日、ｐ．３５４−３５６
【非特許文献３】R. M. Kim, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, (1996) p. 10012-10017
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来のペプチドライブラリーよりも簡便に作製できる、多くの種類の擬似ペプチドを含む（サイズが大きい）擬似ペプチドライブラリーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、デンドリマーの複数の末端基のそれぞれにアミノ酸を１分子ずつ結合させた分子が、直鎖状に結合したアミノ酸の配列を有するペプチドのように作用して標的分子と結合し得ることを見出した。すなわち、デンドリマーの末端基にアミノ酸を１分子ずつ結合させることにより得られるアミノ酸修飾デンドリマーの混合物を、擬似ペプチドライブラリーとして用い得ることができることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
よって、本発明は、デンドリマー及びその誘導体（以下、「デンドリマー」という）の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリーを提供する。
【００１２】
本明細書において、「擬似ペプチドライブラリー」とは、ペプチド結合したアミノ酸の並びからなるペプチドではないが、標的分子に結合可能であるという意味においてペプチドと同様の作用を発揮できる分子の混合物を意味する。「擬似ペプチドライブラリー」は、２種以上の異なる分子の混合物である。
また、本明細書において、「擬似ペプチド」とは、擬似ペプチドライブラリーを構成する各分子のことであり、より具体的には、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーのことである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、デンドリマーの末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの混合物であるので、デンドリマーにアミノ酸を結合させる１段階の反応で作製することができ、作製が簡便である。また、デンドリマーの世代を増加させることにより、デンドリマーの末端基の数が増え、より長い擬似ペプチドを作製できるので、ライブラリーのサイズを大きくすることが容易である。
【００１４】
また、本発明の擬似ペプチドライブラリーの構成要素である各擬似ペプチド（アミノ酸修飾デンドリマー）は、比較的密な構造を有するデンドリマーの末端基にアミノ酸が結合したものであるので、従来のペプチドライブラリーの直鎖状に結合したペプチドに比べて、擬似ペプチドの構造が比較的安定する。よって、標的分子との結合実験において用いる場合に、直鎖状のペプチドよりも、標的分子との結合をより強固な安定したものとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に用いられるデンドリマー及びその誘導体とは、樹状構造を有する３次元的に高度に分枝した化合物である。デンドリマーの誘導体とは、デンドリマーを構成する部分構造であるデンドロンを含む。本発明において、デンドリマーは、デンドロンが好ましい。
一般に、デンドリマーは、コアと、いくつかの世代の分岐部分と、末端基とからなる。
デンドリマーのコアは、１つ以上の官能基を有する化合物から誘導されるものである。好ましい官能基としては、第１級アミノ基、第２級アミノ基、水酸基、カルボン酸基、チオール基、エステル基、アミド基、ケトン基、アルデヒド基などが挙げられる。
【００１６】
デンドリマーのコアは、上記のコアがジスルフィド結合により連結されたものであってもよい。
デンドリマーがデンドロンである場合、コアは、適切な保護基で保護されていてもよいし、置換されていてもよいし、以下に記載する標識物質で標識されていてもよい。適切な保護基としては、Boc（ｔ−ブトキシカルボニル）、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。
【００１７】
デンドリマーの分岐部分は、３以上の原子価を有する原子を含む分岐構造単位の繰り返しからなる。３以上の原子価を有する原子としては、炭素、窒素、ケイ素、リンなどが挙げられる。
デンドリマーの分岐部分としては、以下に示すような構造が、一般的に知られている。
【００１８】
【化１】
【００１９】
上記の分岐構造を有する各デンドリマーについては、以下の文献に記載されている。
（Ａ）D.A. Tomaliaら、Polym. J. 17, 117 (1985)；D.A. Tomaliaら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138 (1990)
（Ｂ）E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1308 (1993)；E.M.M. de Brabander-van den Bergら、Macromol. Symp. 77, 51 (1994)；J.C. Hummelenら、Chem. Eng. J. 3, 1489 (1997)；C. Wanerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 1300 (1993)
（Ｃ）H.K. Hall Jr.ら、Polym. Bull. 17, 409 (1987)
【００２０】
（Ｄ）米国特許第4289872号；米国特許第4410688号
（Ｅ）L.J. Twymanら、Tetrahedron Lett. 35, 4423 (1994)
（Ｆ）K.E. Uhrichら、J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1623 (1992)
（Ｇ）S.C.E. Bucksonら、Macromol. Symp. 77, 1 (1994)
（Ｈ）G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 50, 2004 (1985)；G.R. Newkomeら、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 752 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 108, 849 (1986)；G.R. Newkomeら、J. Am. Chem. Soc. 112, 8458 (1990)；G.R. Newkomeら、Macromolecules 24, 1443 (1991)；G.R. Newkomeら、J. Org. Chem. 53, 5552 (1988)；米国特許第5136096号；米国特許第5206410号；米国特許第5210309号
（Ｉ）M. Okazakiら、J. Am. Chem. Soc. 125, 8120 (2003)；I. Washioら、Macromolecules 38, 2237 (2005)
【００２１】
（Ｊ）R. Haagら、J. Am. Chem. Soc. 122, 2954 (2000)
（Ｋ）M. Jayaramanら、J. Am. Chem. Soc. 120, 12996 (1998)
（Ｌ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7638 (1990)；G. L'abbeら、Chem. Commun. 2143 (1996)
（Ｍ）P. Murerら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2116 (1995)
（Ｎ）H.T. Changら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 182 (1995)
（Ｏ）H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 118, 6388 (1995)；H. Threら、J. Am. Chem. Soc. 123, 5908 (2001)
【００２２】
（Ｐ）Y. Hirayamaら、Org. Lett. 7, 525 (2005)；中村大輔ら、高分子学会予稿集、54, 2949 (2005)
（Ｑ）C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 114, 8405 (1992)；C.J. Hawkerら、J. Am. Chem. Soc. 121, 262 (1999)；D.M. Haddletonら、J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, 649 (1996)
（Ｒ）D. Seebachら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2795 (1996)；D. Seebachら、Helv. Chim. Acta. 80, 989 (1997)
（Ｓ）M.A. Carnahanら、J. Am. Chem. Soc. 123, 2905 (2001)
（Ｔ）M.A. Carnahanら、Macromolecules 34, 7648 (2001)
（Ｕ）F. Zengら、J. Am. Chem. Soc. 118, 5326 (1996)
【００２３】
（Ｖ）A. Morikawaら、Macromolecules 26, 6324 (1993)；A. Morikawa, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1806
（Ｗ）S.R. Rannardら、J. Am. Chem. Soc. 122, 11729 (2000)
（Ｘ）M. Tominagaら、Chem. Lett. 374 (2000)
（Ｙ）H. Uchidaら、J. Am. Chem. Soc. 112, 7077 (1990)；A. Morikawaら、Macromolecules 24, 3460 (1991)；M. Kakimoto, "Polymeric Materials Encyclopedia" J.C. Salamone ed., CRC Press, 1996, vol. 3, p.1809
【００２４】
デンドリマーの分岐部分は、デンドリマーの水溶性の観点から、水溶性を示すアミド結合などの酸素原子及び／又は窒素原子を含む構造が好ましい。
【００２５】
デンドリマーの分岐部分は、上記のような繰り返し単位を２種以上含むものであってもよい。
【００２６】
デンドリマーの末端基の構造は、所望により適宜選択できる。例えば、末端基は、分岐部分の最後の繰り返し単位の構造を有してもよいし、末端基は、分岐部分とは別の構造を有してもよい。
また、デンドリマーの末端基の数は、分岐部分の構造及びデンドリマーの世代数に依存する。デンドリマーは、一般に、コアの官能基に分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第１世代、第１世代の末端基の末端に別の分岐構造を有する単位が１つずつ結合したものを第２世代というように、分岐構造を有する単位の数に応じて、「第ｎ世代（Ｇｎ）のデンドリマー」と称される。一般に、第１〜１０世代のデンドリマーが知られており、理論的には、より大きい世代のデンドリマーを製造することも可能である。
【００２７】
第１世代の末端基の数は、（コアの官能基の数）×１であり、第２世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）であり、第ｎ世代の末端基の数は、（第１世代の末端基の数）×（分岐部分の分岐数−１）n-1である。
なお、例えば、分岐部分が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜である場合、「分岐部分の分岐数」は３である。
【００２８】
本発明におけるデンドリマーは、好ましくは、ポリアミドアミンデンドリマー（例えば上記の（Ａ）の分岐部分を有するもの）、ポリイミンデンドリマー（例えば（Ｂ））、ポリアミンデンドリマー（例えば（Ｃ））、ポリアミドデンドリマー（例えば（Ｄ）〜（Ｇ））、ポリエーテルアミドデンドリマー（例えば（Ｈ）、（Ｉ））、ポリエーテルデンドリマー（例えば（Ｊ）〜（Ｎ））、ポリエステルデンドリマー（例えば（Ｏ）〜（Ｔ））、ポリエーテルエステルデンドリマー（例えば（Ｕ））、ポリエーテルケトンデンドリマー（例えば（Ｖ））、ポリカルボナートデンドリマー（例えば（Ｗ））、複素環含有デンドリマー（例えば（Ｘ））、ケイ素含有デンドリマー（例えば（Ｙ））である。
これらのデンドリマーの製造方法は、上記の文献に記載されている。
【００２９】
上記のデンドリマーは、より好ましくは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの部分骨格（デンドロン）である。ポリアミドアミンデンドロンは、以下の式に示される構造を有するものである。
第１世代（Ｇ１）：Ｒ1Ｎ（ＸＨ2）2
Ｇ２：Ｒ1Ｎ（Ｘ（ＸＨ2）2）2
Ｇ３：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2
Ｇ４：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2
Ｇ５：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2
Ｇ６：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2
Ｇ７：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2
Ｇ８：Ｒ1Ｎ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2）2
（式中、Ｒ1は、置換されていてもよいアミノアルキル基、メルカプトアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、アルデヒドアルキル基、アジドアルキル基、エポキシアルキル基又はアセチレンアルキル基を表し、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００３０】
本発明において、上記のポリアミドアミンデンドロンは、Ｇ２以上かつＧ７以下のものが好ましい。
【００３１】
上記の式中、Ｒ1のアルキル鎖としては、直鎖状又は分岐鎖状のＣ2〜Ｃ5の低級アルキルが好ましい。Ｒ1は、好ましくはアミノエチル基である。
Ｒ1基は、所望により置換又は保護されていてもよい。適切な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、Tos（ｐ−トルエンスルホニル）、Z（ベンジルオキシカルボニル）、Fmoc（9-フルオレニルメトキシ）などが挙げられる。また、例えば、本発明によるアミノ酸修飾デンドリマーが標識される場合、Ｒ1のアミノ基が標識物質と結合することもできる。
【００３２】
上記のデンドリマーは、従来公知の製造方法により製造できる。また、一部のものは市販でも入手可能である。
【００３３】
例えば、上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンは、原料である第１級アミンに、アクリル酸エステルを反応させるマイケル付加反応と、ジアミノアルカンを用いるエステルアミド交換反応とにより第１世代のアミド化合物を得て、マイケル付加反応及びエステルアミド交換反応を繰り返すことにより製造できる（Tomalia, D.ら、Polym. J. 17、117〜132 (1985)；Frechet, J. M. J., Tomalia, D. A.編、(2001) Dendrimers and other dendritic polymers, J. Wiley & Sons, West Sussexを参照）。原料となるジアミンは、市販で入手可能である。
上記の好ましいポリアミドアミンデンドロンの製造法のスキームの例を、以下に示す。
【００３４】
【化２】
（式中、Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００３５】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、上記のデンドリマーの末端基に、同じ又は異なるアミノ酸が１分子ずつ結合したアミノ酸修飾デンドリマーからなる。
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基とを同一分子内に有する化合物、及びアミノ基、カルボキシル基又はそれ以外の基が保護又は置換されたものも含むことを意図する。
アミノ酸は、天然のタンパク質を構成する２０種のアミノ酸（天然アミノ酸)、及びそれ以外のアミノ酸を含む。
天然アミノ酸以外のアミノ酸としては、例えばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸、δ−アミノレブリン酸、ホモシステイン、ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。
【００３６】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる。本発明においては、あるアミノ酸修飾デンドリマー分子と、別のアミノ酸修飾デンドリマー分子とを比較したときに、少なくとも１つの位置の末端基を修飾しているアミノ酸の種類が異なる場合に、これらのアミノ酸修飾デンドリマーは異なる種類であるとみなす。例えば、４つの末端基Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3及びＹ4がアミノ酸Ａ又はＢで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの末端アミノ酸の組み合わせとしては、以下の１６種類が考えられる。
（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝
（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ａ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ａ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ａ）、
（Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ａ、Ｂ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ａ、Ｂ）、（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ａ）、
（Ｂ、Ｂ、Ｂ、Ｂ）
これらのうち、例えば（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ｂ）と（Ａ、Ａ、Ｂ、Ａ）のものは、Ａが３分子、Ｂが１分子という点では同じであるが、Ｙ3、Ｙ4の位置の末端基を修飾するアミノ酸が異なるので、２種類の異なるアミノ酸修飾デンドリマーとみなすことができる。
また、本発明の擬似ペプチドライブラリーは、末端基を修飾するアミノ酸がすべて同じもの、例えば（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3、Ｙ4）＝（Ａ、Ａ、Ａ、Ａ）のようなものも含み得る。
【００３７】
本発明の擬似ペプチドライブラリーにおいて、アミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーの全ての末端基がアミノ酸で修飾されていてもよく、デンドリマーの一部の末端基がアミノ酸で修飾されていてもよい。
【００３８】
本発明の擬似ペプチドライブラリーは、ペプチドライブラリーの代替として用いることができる、異なる擬似ペプチドの混合物である。本発明の２種以上の擬似ペプチド、すなわちアミノ酸修飾デンドリマーを含む擬似ペプチドライブラリーは、２種以上のアミノ酸をデンドリマーと反応させることにより、作製することができる。
２種以上のアミノ酸とデンドリマーとの反応は、デンドリマーの末端基の種類によって適宜選択できる。例えばデンドリマーの末端基が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2である場合のようにデンドリマーの末端基の末端がアミノ基である場合、アミノ酸のカルボキシル基を末端のアミノ基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーの末端基がカルボキシル基である場合、アミノ酸のアミノ基を末端のカルボキシル基と反応させることにより、アミノ酸をデンドリマーの末端基に結合させることができる。また、デンドリマーとアミノ酸の結合として、ヒドロキシル基とカルボキシル基、チオール基同士、チオール基やマレインイミド基、アジド基とアルキン、エポキシ基とアルキンの結合などを利用することも可能である。
デンドリマーとアミノ酸とを結合させる反応では、通常、アミノ酸のデンドリマーと反応する反応部位以外の反応性部位を保護又は置換すること、アミノ酸に反応性部位を導入することなどが行われる。
【００３９】
上記のアミノ酸修飾デンドリマーは、末端基に結合したアミノ酸同士はペプチド結合していないにもかかわらず、デンドリマーが密な分子構造を有するので、その末端に結合したアミノ酸が、あたかも直鎖状にペプチド結合しているかのように擬似ペプチドとして作用できる。よって、標的分子の結合部位に結合することが可能である。
【００４０】
本発明の擬似ペプチドライブラリーに含まれるアミノ酸修飾デンドリマーは、標識物質と結合していることが好ましい。標識物質とは、標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別できる物質であれば、特に限定されない。標識物質が結合しているアミノ酸修飾デンドリマーの存在を他の物質と区別する様式としては、標識物質が放射線を含む光を吸収及び発光すること、標識物質がアミノ酸修飾デンドリマー以外の別の物質と特異的に結合することなどが挙げられる。
標識物質は、蛍光物質、酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなど）、放射性同位元素（例えば125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなど）、別の物質と特異的に結合可能な物質（例えばアビジン又はストレプトアビジン、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）が挙げられる。
【００４１】
上記の蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びその誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリン、Ｑｄｏｔ（登録商標）、ローダミン及びその誘導体、Ｃｙ色素及びその誘導体のような、当該分野で公知の物質が挙げられる。また、蛍光物質として、ＨＰＬＣ用の誘導化試薬を用いることができ、そのような試薬としては、以下のようなものが挙げられる：
DPS-Cl（4-（5,6-ジメトキシ-N-フタルイミジニル）ベンゼンスルホニルクロリド）
NBD-Cl（4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
NBD-F（4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール）
Dansyl-Cl（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルクロリド）
Dansyl-F（5-（ジメチルアミノ）ナフタレン-1-スルホニルフロリド）
Fluorescamin（4-フェニルスピロ[フラン-2-(3H),1'-フタラン]-3,3'-ジオン）
Dabsyl-Cl（4-（4-ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンスルホニルクロリド）
Dabcyl-Cl（4-[[（4-ジメチルアミノ）フェニル]アゾ]安息香酸スクシンイミジルエステル）
ABD-F（4-アミノスルホニル-7-フルオロ-2,1-,3-ベンゾキサジアゾール）
NAM（N-(9-アクリジニル)マレイミド）
SBD-F（アンモニウム4-フルオロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-7-スルホネート）
DDB（1,2-ジアミノ-4,5-ジメトキシベンゼン二塩酸塩）
MDB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン二塩酸塩）
Br-DMEQ（3-ブロモメチル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-1,2-ジヒドロキノキサリン-2-オン）
Br-Mmc（4-ブロモメチル-7-メトキシクマリン）
DMEQ-COCl（3-クロロカルボニル-6,7-ジメトキシ-1-メチル-2(1H)-キノキサリノン）
【００４２】
上記のアミノ酸修飾デンドリマーと標識物質との結合は、標識物質の種類に応じて、当該分野で公知の方法により行うことができる。標識物質は、デンドリマーのコアに結合してもよいし、末端基に結合してもよい。好ましくは、デンドリマーのコアに標識物質が結合することである。
【００４３】
例えば、デンドリマーのコアに反応可能なアミノ基が存在する場合、このアミノ基を、標識物質に結合させた反応性官能基、例えばイソチオシアネート基、ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）基をもつ標識物質をアミノ酸修飾デンドリマーに結合させることができる。
なお、標識物質と結合しているアミノ酸修飾デンドリマーは、デンドリマーと標識物質を先に反応させ、その後、アミノ酸でデンドリマーを修飾してもよいが、操作が簡便であるので、デンドリマーをアミノ酸で修飾した後に、アミノ酸修飾デンドリマーに標識物質を結合させることが好ましい。
【００４４】
本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを用いて、標的分子と結合可能な擬似ペプチドを選択する方法も提供する。
よって、本発明は、上記の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法でもある。
【００４５】
上記の標的分子は、標的分子に結合するペプチドを検出することが所望される分子であれば特に限定されず、ペプチド、受容体などのタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、脂質、糖鎖などが挙げられる。
【００４６】
上記の擬似ペプチドライブラリーと標的分子との接触は、標的分子とそれに結合可能な擬似ペプチドとの結合が可能となる条件下で行うことができる。このような条件は、標的分子の種類に応じて適宜決定できる。
【００４７】
標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程は、従来公知のタンパク質の相互作用を測定する方法により行うことができる。当該相互作用測定方法としては、溶液中で相互作用を測定する方法、担体上で相互作用を測定する方法などが挙げられる。溶液中で相互作用を測定する方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、流体力学的方法（例えば沈降平衡法、電気泳動法、ゲルろ過法など）、光学的方法（吸光度、蛍光強度などの測定、円偏光二色性スペクトルの測定などに基づく方法）アフィニティクロマトグラフィー、電場中での分子の配向の変化を測定する方法などが挙げられる。また、担体上で相互作用を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）などが挙げられる。
本発明の方法で用いる擬似ペプチドライブラリーは、好ましくは親水性の高いデンドリマーにアミノ酸が結合しているので、溶液中で相互作用を測定する方法であっても有利に測定を行うことができる。
【００４８】
本発明の方法により得られた知見は、標的分子に結合可能なタンパク質のモチーフを同定するための情報として用いることができる。すなわち、本発明により検出されたアミノ酸修飾デンドリマーの末端基のアミノ酸の配列に基づいて、標的分子、例えば疾患に関与する受容体に結合できる医薬品の開発のための情報を提供できる。
【実施例】
【００４９】
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１
（１）コアにアミノ基を有するポリアミドアミンデンドロンの製造
デンドリマーとしてのコアにアミノ基を有するポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドロンは、Haradaら（Bioconjugate Chem. 2006, 17, p.3-5）に記載される方法に従って合成した。
具体的には、Ｎ−（２−アミノエチル）カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（4.889 g, 3.05×10-2 mol）を、アクリル酸メチル（300 mL, 3.35 mol）に溶解し、混合物をアルゴン雰囲気下に還流させた。７日後に、未反応のアクリル酸メチルを減圧除去し、残渣を、CHCl3：メタノール（MeOH）＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（０．５世代）を得た。
【００５０】
０．５世代のPAMAMデンドロン（3.38 g, 1.02×10-2 mol）を、メタノール（6 ml）に溶解し、混合物を、シアン化ナトリウム（100mg, 2.04×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に40℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを反応混合物から真空下で除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第１世代）を得た。
【００５１】
メタノール（6 ml）に溶解した第1世代のPAMAMデンドロン（2.75 g, 7.08×10-3 mol）を、アクリル酸メチル（450 ml, 5.02 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて4日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、CHCl3： MeOH＝10：1（容量比）の混液で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィー、及びメタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第1.5世代）を得た。
【００５２】
メタノール（6 ml）に溶解した第1.5世代のPAMAMデンドロン（2.10 g, 2.87×10-3 mol）を、シアン化ナトリウム（90 mg, 1.84×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（300 ml, 4.50 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。3日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第２世代）を得た。
【００５３】
メタノール（4 ml）に溶解した第２世代のPAMAMデンドロン（2.00 g, 2.37×10-3 mol）を、アクリル酸メチル（500 ml, 5.58 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に35℃にて3日間撹拌した。メタノール及び未反応のアクリル酸メチルを、減圧下に除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第2.5世代）を得た。
【００５４】
メタノール（4 ml）に溶解した第2.5世代のPAMAMデンドロン（3.27 g, 2.13×10-3 mol）を、シアン化ナトリウム（60 mg, 1.20×10-3 mol）を含むエチレンジアミン（200 ml, 3.00 mol）に加え、アルゴン雰囲気下に45℃にて撹拌した。5日後に、メタノール及び未反応のエチレンジアミンを減圧除去した。得られた生成物を、メタノールで溶出するSephadex LH-20カラムを用いて精製して、Boc保護されたPAMAMデンドロン（第３世代；Ｇ３）を得た。
PAMAMデンドロンの製造のスキームを、以下に示す。
【００５５】
【化３】
（上記の式中、Ｘは−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を表す。）
【００５６】
（２）アセチル化アミノ酸の調製
Ｌ−フェニルアラニン（1.2g, 10mmol）又はＬ−アラニン（5.5g, 56mmol）を、ＮａＯＨ水溶液（4M）に溶解した。過剰量の無水酢酸と同時に、過剰量のＮａＯＨ水溶液（4M）を滴下し、この溶液のｐＨを９．５〜１１．５に保って氷上で一晩撹拌した。その後、6N ＨＣｌを加えて、ｐＨを２．５に調整した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を用いて抽出したアセチル化アミノ酸を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化した。アセチル化フェニルアラニン（Ac-Phe）及びアセチル化アラニン（Ac-Ala）の収率は、それぞれ７７％及び５４％であった。これらの生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲで分析した。
【００５７】
Ac-Alaについての1H NMR: δ1.39 (d, Hβ), 2.01 (s, CH3CO) and 4.29 (q, Hα).
Ac-Alaについての13C NMR: δ19.3 (Cβ), 24.6 (CH3CO), 52.1 (Cα) and 176.9 (CO).
Ac-Pheについての1H NMR: δ1.91 (s, CH3CO), 2.92 and 3.19 (m, Hβ), 4.46 (m, Hα), and 7.29 and 7.36 (m, phenyl).
Ac-Pheについての13C NMR: δ24.7 (CH3CO), 40.5 (Cβ), 59.1 (Cα), 129.8, 131.5, 132.2 and 140.7 (phenyl) and 176.3 (CO).
【００５８】
（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸を異なる混合比（モル比）で混合した混合アミノ酸（Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０）を、それぞれ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．６ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代）（30mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００５９】
例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて修飾されたアミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.34 (m, Hβ of Ala), 1.42 (s, Boc), 1.95 (s, CH3CO of Phe) and 2.02 (s, CH3CO of Ala), 2.24 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.63 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.81 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.06 (br, NCH2CH2N (core)), 3.36 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.21 (br, Hα of Ala), 4.49 (br, Hα of Phe) and 7.31 (m, phenyl).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図１に示す。
【００６０】
（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーに、2mlのＴＦＡを加えて氷上で４時間反応させてＢｏｃ基を脱保護した。溶媒を蒸発させた後に、過剰量のＴＥＡを加え、ＭｅＯＨ及びエーテルで再沈殿させた。残渣をエタノールに溶解し、過剰量の４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）を加えて１時間撹拌した。その後、Sephadex LH-20カラムを用いて精製した。Ac-Ala/Ac-Phe＝０／１０，１／９，３／７，５／５，７／３，９／１及び１０／０の混合比のアミノ酸混合物で修飾したＮＢＤ標識デンドリマーの収率は、それぞれ出発物質の５５、４７、５４、５７、６５、３３及び６９％であった。これらの生成物を、ＣＤ3ＯＤに溶解して、1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００６１】
例えば、Ac-Ala/Ac-Phe＝５／５のアミノ酸混合物を用いて得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーについて: δ1.32 (d, Hβ of Ala), 1.90 (s, CH3CO of Phe) and 2.08 (s, CH3CO of Ala), 2.40 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.87 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.41 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.23 (br, Hα of Ala), 4.50 (br, Hα of Phe) and 7.24 (m, phenyl and NBD).
その他のアミノ酸修飾デンドリマーのＮＭＲは、図２に示す。
【００６２】
上記の各比率のアミノ酸と反応させて得られたアミノ酸修飾デンドリマーについて得られたＮＭＲスペクトルを図１及び２に示す。これらのスペクトルに基づいて、Ala又はPheのデンドリマーに対する積分値を求め、この値から、実際にデンドリマーの末端基に結合した各アミノ酸の数を推定した。この結果を、表１に示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】
表１の結果から、デンドリマーの実質的に全ての末端基にアミノ酸分子が結合していることがわかる。また、デンドリマーの末端基に結合した２種のアミノ酸の割合は、反応させた２種のアミノ酸の混合比とほぼ等しいことがわかる。よって、デンドリマーに反応させる種々のアミノ酸の混合比を調節することにより、擬似ペプチドライブラリー中の擬似ペプチドのアミノ酸の比を調節できることが示唆される。
【００６５】
（４）で得られた標識アミノ酸修飾デンドリマーを、以下の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（トーソー社製）、
検出器：ＵＶ検出器（ＵＶ−２０７５Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、及び蛍光検出器（λｅｘ＝４５０ｎｍ，λｅｍ＝５３０ｎｍ；ＦＲ−２０２０Ｐｌｕｓ；日本分光社製）、
ポンプ：ＰＵ−２０８９Ｐｌｕｓ（日本分光社製）、
流速：１．０ｍｌ／分
サンプル溶液：１０％メタノール（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、
グラジエント：０分：１００％（Ａ）含有２０ｍＭリン酸緩衝液、３０分：（Ａ）１０％及び（Ｂ）９０％含有２０ｍＭリン酸緩衝液。
【００６６】
ＨＰＬＣの結果を、図３に示す。
【００６７】
図３の結果から、標識アミノ酸結合デンドリマーは、Ac-Ala/Ac-Pheの比が１０／０のときは約９．１分で、Ac-Ala/Ac-Pheの比が０／１０のときは約１７．１分で、それぞれＨＰＬＣのカラムから溶出され、Ac-Ala/Ac-Pheの比がこれらの間である場合は、複数のピーク又はブロードなピークを示すことがわかる。例えば、Ac-Ala/Ac-Pheの比が７／３のときは、約９．１分、約１０．９分、約１２．２分、約１３．６分にピークが見られた。これらのピークは、それぞれAc-Ala 8/Ac-Phe 0、Ac-Ala 7/Ac-Phe 1、Ac-Ala 6/Ac-Phe 2、Ac-Ala 5/Ac-Phe 3に対応すると考えられる。このことから、様々な比で結合した種々の分子が得られたことがＨＰＬＣによって確認された。
【００６８】
実施例２
（１）ポリアミドアミンデンドロンの製造
実施例１の（１）と同様にして、Boc保護されたPAMAMデンドロンを製造した。また、実施例１の（１）の第２世代から第３世代のデンドリマーの製造と同様にして、Boc保護された第４世代（Ｇ４）のPAMAMデンドロンを製造した。
【００６９】
（２）アセチル化アミノ酸の調製
実施例１の（２）と同様にして、アセチル化したＬ−プロリン及びＬ−アラニン（それぞれAc-Pro及びAc-Ala）を得た。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13C ＮＭＲで分析した。
Ac-Proについての1H NMR: δ1.86-1.91 and 2.24-2.29 (m, Hβ), 1.97 (m, Hγ), 2.10 (s, CH3CO), 3.44-3.65 (m, Hδ) and 4.31-4.37 (m, Hα).
Ac-Proについての13C NMR: δ24.2 (CH3CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO).
【００７０】
また、Boc及びTos（ｐ−トルエンスルホニル）基で保護されたアルギニン（Boc-Arg (Tos)）（1.0g, 2.2mmol）を、氷上で５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で４時間処理した。溶媒を蒸発させた。蒸留水を加えて蒸発させる操作を２回行った。得られた生成物を、実施例１の（１）と同様にして、アセチル化されたＬ−アルギニン（Ac-Arg (Tos)）を得た。収率：５０％。３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解し、1Ｈ及び13C ＮＭＲで分析した。
1H NMR: δ1.49-1.65 (m, Hβ and Hα), 1.99 (s, CH3CO), 2.40 (s, CH3 (Tos)), 3.18 (br, Hδ), 4.08 (m, Hα) and 7.40 and 7.75 (d, phenyl (Tos)).
13C NMR: δ24.2 (CH3CO), 27.2 (Cγ), 32.4 (Cβ), 51.5 (Cδ), 62.2 (Cα) and 175.9 (CO).
【００７１】
（３）アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（２）で調製したアセチル化アミノ酸をAc-Pro/Ac-Arg(Tos)＝３／１の比で混合した混合アミノ酸、又は（２）で調製したAc-Ala（2.0mmol）を、ＮＨＳ（2.4mmol）、ＤＣＣ（2.6mmol）及びＴＥＡ（3.0mmol）と、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、氷上で４時間反応させた。蒸留ＤＭＳＯに溶解したＧ３世代又はＧ４世代の（１）で得られたBoc保護PAMAMデンドロン（300mg）を加え、反応混合物を室温にて２日間撹拌した。アセチル化アミノ酸で修飾されたBoc保護PAMAMデンドロンを、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代のデンドリマーの収率は、それぞれ９１及び９３％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解して1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲで分析した。
【００７２】
Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CH3 of Tos group), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.83 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).
【００７３】
Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.41 (s, Boc), 1.53-1.68 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.89 and 2.21 (br, Hβ), 1.97 (br, Hγ of Pro), 2.03 and 2.13 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CH3 of Tos group), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.83 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core) and Hδ of Arg), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 and 3.67 (m, Hδ of pro), 4.14 (m, Hα of Arg), 4.32 and 4.48 (m, Hα of Pro) and 7.40 and 7.75 (br, phenyl of Tos group).
【００７４】
Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.84 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.18 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.21 (m, Hα).
Ac-Alaで修飾されたアミノ酸修飾デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 1.43 (s, Boc), 2.03 (s, CH3CO), 2.42 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.64 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.82 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.17 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 4.22 (m, Hα).
【００７５】
（４）標識アミノ酸修飾デンドリマーの作製
（３）で得られたアミノ酸修飾デンドリマーを、実施例１の（４）と同様にして、ＮＢＤで標識した。Ac-Pro/Ac-Arg(Tos)で修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８０％であった。これらにトリフルオロ酢酸、1.85ml、チオアニソール、0.222ml、トリフルオロメタンスルホン酸、0.02mlを加えて室温で8時間反応させることで、結合したアルギニンの保護基を除去した。反応混合物にエーテルを加えて再沈させた後、残渣にトリエチルアミン１ｍｌとメタノール１ｍｌを加え、溶離液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用いてSephadex LH-20カラムで精製したものを、最終生成物とした。一方、Ac-Alaで修飾されたＧ３及びＧ４世代の標識デンドリマーの収率は、それぞれ８３及び８５％であった。生成物を、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸−ｄ4ナトリウム塩含有Ｄ2Ｏに溶解して1Ｈ ＮＭＲで分析した。
【００７６】
Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.67-1.85 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.91-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.99, 2.06 and 2.14 (s, CH3CO), 2.47 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.73 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.90 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.12 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.51 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.23 (m, Hα of Arg) and 4.34 and 4.50 (m, Hα of Pro).
【００７７】
Ac-Pro/Ac-Argで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.65-1.84 (br, Hβ and Hγ of Arg), 1.92-2.13 (br, Hβand Hγ of Pro), 1.98, 2.05 and 2.13 (s, CH3CO), 2.27 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.45 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.87 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.21 (br, NCH2CH2N (core)), 3.33 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), 3.53 (m, Hδ of Arg) and 3.66 (m, Hδ of Pro), 4.24 (m, Hα of Arg) and 4.33 and 4.49 (m, Hα of Pro).
【００７８】
Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ３）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.03 (s, CH3CO), 2.43 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.77 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
Ac-Alaで修飾された標識デンドリマー（Ｇ４）についての1H NMR: δ1.35 (d, Hβ), 2.04 (s, CH3CO), 2.43 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.65 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 2.77 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N), 3.08 (br, NCH2CH2N (core)), 3.32 (br, CH2CH2NHCOCH2CH2N and CONHCH2CH2NHCOCH2CH2N (terminal)), and 4.22 (q, Hα).
NBD部分に由来するシグナルは、その不溶性のためにNMRで検出されなかった。
【００７９】
（５）結合アッセイ
最小の共通ペプチド配列Pro-X-X-Proを認識して結合することが知られているSrc-homology 3（ＳＨ３）ドメインを用いて、実施例２で作製した擬似ペプチドライブラリーが、ＳＨ３ドメインとの結合活性を有するかについて調べた。
ＧＳＴタグをＮ末端に融合したAmphiphysin (Bin1)のＳＨ３ドメイン（３７４番目から４５４番目までのアミノ酸）を、以下のようにして調製した。該当部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、pGEX-6P-1（Amersham Pharmacia）に組み込んだベクターで大腸菌（DH5α）を形質転換させた。次に、100mg/Lのアンピシリンを含む25mlのLuria-Bertani（LB）培地で一晩培養した大腸菌を500mlのLB培地で２時間培養し、続いて室温にてイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を1mMまで加えてさらに２時間培養した。遠心によって集菌し、細胞溶解バッファー（1% NP-40, 100mM EDTA, 1mM PMSF, 5μg/ml Apr, 2μg/ml Leu, 3μg/ml PepAを添加したリン酸緩衝食塩水(PBS)）に懸濁し、超音波照射によって細胞膜を粉砕した。このようにして得た細胞抽出液から、グルタチオンビーズを用いてＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインを精製した。コントロールとして用いるためのＧＳＴ蛋白質は、pGEXベクターを用いて同様に作製した。
【００８０】
Ac-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマー（Ｇ３）又はAc-Ala修飾標識デンドリマー（Ｇ３）(500nmol)と、グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ融合ＳＨ３ドメイン（10nmol）を、Trisバッファー中（20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.005% Tween20）で4℃、2時間インキュベーションした。その後、ビーズをTrisバッファー1 mlで4回洗浄し、50％酢酸水溶液を200μl加え、2時間インキュベーションした。15000rpmで20分遠心し、上清の蛍光量(ex.450nm, em.530nm)を測定した。
比較として、GSTのみとアミノ酸修飾標識デンドリマーを用いて同様に結合実験を行った。
【００８１】
結果を、図４に示す。縦軸は、結合率（×１０-3）＝（測定された蛍光量）／（ＧＳＴ融合タンパク質を加えなかった（アミノ酸修飾標識デンドリマーのみ）場合の蛍光量）を示す。また、ＳＨ３−Ｐｒｏは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＳＨ３−Ａｌａは、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ｐｒｏは、ＧＳＴタンパク質とAc-Pro/Ac-Arg修飾標識デンドリマーとを混合した場合、ＧＳＴ−Ａｌａは、ＧＳＴタンパク質とAc-Ala修飾標識デンドリマーとを混合した場合の結果を示す。
この結果から、本発明のアミノ酸修飾デンドリマーの混合物からなる擬似ペプチドライブラリーは、標的分子に結合する能力を有する擬似ペプチドを含むことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させたアミノ酸修飾デンドリマー（Boc保護PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の1H NMRスペクトルである。
【図２】末端基に異なる混合比でアラニンとフェニルアラニンを結合させた蛍光標識アミノ酸修飾デンドリマー（PAMAMデンドロン（Ｇ３世代））の1H NMRスペクトルである。
【図３】異なる混合比で混合したアラニンとフェニルアラニンを用いて作製した本発明の擬似ペプチドライブラリーのＨＰＬＣのチャートである。
【図４】本発明の擬似ペプチドライブラリーと、ＧＳＴ融合ＳＨ３ドメインとの結合実験の結果を示す棒グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマー及びその誘導体の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリー。
【請求項２】
前記デンドリマーが、ポリアミドアミンデンドリマーである請求項１に記載の擬似ペプチドライブラリー。
【請求項３】
前記アミノ酸修飾デンドリマーが、標識物質と結合している請求項１又は２に記載の擬似ペプチドライブラリー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法。
【請求項１】
デンドリマー及びその誘導体の末端基が同じ又は異なるアミノ酸１分子ずつで修飾されているアミノ酸修飾デンドリマーの２種以上の混合物からなる擬似ペプチドライブラリー。
【請求項２】
前記デンドリマーが、ポリアミドアミンデンドリマーである請求項１に記載の擬似ペプチドライブラリー。
【請求項３】
前記アミノ酸修飾デンドリマーが、標識物質と結合している請求項１又は２に記載の擬似ペプチドライブラリー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の擬似ペプチドライブラリーを、標的分子と接触させ、標的分子と結合したアミノ酸修飾デンドリマーを検出する工程を含む、標的分子に結合可能なアミノ酸修飾デンドリマーを検出する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−９６９２９（Ｐ２００９−９６９２９Ａ）
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７１６０１（Ｐ２００７−２７１６０１）
【出願日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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