本発明は、所与の宿主細胞中での発現のためにタンパク質コード配列を最適化する方法に関する。本方法は、遺伝的アルゴリズムを当てはめて、所定のアミノ酸配列をコードする単一コドン適合および／またはコドンペア適合配列を最適化する。アルゴリズムでは、変異体コード配列が単一コドン適合および／またはコドンペア適合の最小値に達するまで、新しい配列変異体の生成および適合変異体の引き続く選択が反復される。本発明はまた、プロセッサーおよびメモリーを含んでなるコンピューターにも関し、プロセッサーはメモリーから読み取ってそれに書き込むように構成され、メモリーは単一コドン適合および／またはコドンペア適合の最適化のための遺伝的アルゴリズムを遂行する能力をプロセッサーに提供するように構成されたデータおよび命令を含んでなる。本発明はさらに、所定のアミノ酸配列のためのコード配列を含んでなる核酸と、このような核酸を含んでなる宿主細胞と、その中でこれらの宿主細胞が使用されるポリペプチドおよびその他の発酵産物を生成する方法とに関し、コード配列は本発明の方法において、特定の宿主のために単一コドン適合および／またはコドンペア適合について最適化される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）所定のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのオリジナルコード配列を作り出すステップと、
ｂ）この少なくとも１つのオリジナルコード配列中で、１つ以上のコドンを同義コドンによって置換することによって、この少なくとも１つのオリジナルコード配列から少なくとも１つの新たに作り出されたコード配列を作り出すステップと、
ｃ）所定の宿主細胞について単一コドン適合およびコドンペア適合の少なくとも１つを判定する適合関数を使用して、前記少なくとも１つのオリジナルコード配列の適合値および前記少なくとも１つの新たに作り出されたコード配列の適合値を判定するステップと、
ｄ）前記適合値が高いほど選択される確率が高くなるような所定の選択基準に従って、前記少なくとも１つのオリジナルコード配列および前記少なくとも１つの新たに作り出されたコード配列中で、１つ以上の選択されるコード配列を選択するステップと、
ｅ）操作ｂ）からｄ）において、前記１つ以上の選択されたコード配列を１つ以上のオリジナルコード配列として処理しながら、所定の反復停止基準が満たされるまで操作ｂ）からｄ）を繰り返すステップと
を含んでなる、それによって所定の宿主細胞内での発現のためにコード配列が最適化される、所定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドコード配列を最適化する方法。
【請求項２】
前記所定の選択基準が、前記１つ以上の選択されるコード配列が所定の基準に従って最良適合値を有するような基準である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
操作ｅ）の後に、
ｆ）前記１つ以上の選択されるコード配列中で最良の個々のコード配列を選択するステップを含んでなり、前記最良の個々のコード配列がその他の選択されたコード配列よりも良い適合値を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の反復停止基準が、
（ａ）前記選択されたコード配列の少なくとも１つが所定の閾値を超える最良適合値を有するかどうかの試験、
（ｂ）前記選択されたコード配列がいずれも前記所定の閾値未満の最良適合値を有さないかどうかの試験、
（ｃ）前記選択されたコード配列の少なくとも１つが、前記オリジナルコード配列中で所定の宿主細胞について関連する正のコドンペア重みがあるコドンペアの少なくとも３０％を関連する負の重みがあるコドンペアに転換するかどうかの試験、
（ｄ）前記選択されたコード配列の少なくとも１つが、前記オリジナルコード配列中で所定の宿主細胞について０を超える関連する正の重みがあるコドンペアの少なくとも３０％を０未満の関連する重みがあるコドンペアに転換するかどうかの試験
の少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記適合関数が、
【数１】


（式中、
ｇはコード配列、｜ｇ｜はその長さ、ｇ（ｋ）はそのｋ番目のコドンを表し、
【数２】


はコドンｃ（ｋ）の所望の比率であり、
【数３】


はヌクレオチドコード配列ｇ中の実際の比率である）によって単一コドン適合を定義する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記適合関数が、
【数４】


（式中、
ｗ（（ｃ（ｋ）、ｃ（ｋ＋１））はコード配列ｇ中のコドンペア重みであり、｜ｇ｜は前記ヌクレオチドコード配列の長さであり、ｃ（ｋ）は前記コード配列中のｋ番目のコドンである）によってコドンペア適合を定義する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記適合関数が、
【数５】


（式中、
【数６】


であり、ｃｐｉは０を超える実数であり、ｆｉｔ_ｃｐ（ｇ）はコドンペア適合関数であり、ｆｉｔ_ｓｃ（ｇ）は単一コドン適合関数であり、ｗ（（ｃ（ｋ）、ｃ（ｋ＋１））はコード配列ｇ中のコドンペアの重みであり、｜ｇ｜は前記コード配列の長さであり、ｃ（ｋ）は前記コドン配列中のｋ番目のコドンであり、
【数７】


は、コドンｃ（ｋ）の所望の比率であり、
【数８】


はコード配列ｇ中の実際の比率である）によって定義される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｃｐｉが１０^−４〜０．５の間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コドンペア重みｗが、停止コドンなしの６１×６１コドンペアマトリックス、または停止コドンを含めた６１×６４コドンペアマトリックスから測定され、前記コドンペア重みｗが、
（ａ）所定の宿主の少なくとも２００個のコード配列からなる一群のヌクレオチド配列、
（ｂ）所定の宿主が属する種の少なくとも２００個のコード配列からなる一群のヌクレオチド配列、
（ｃ）所定の宿主のゲノム配列中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも５％からなる一群のヌクレオチド配列、
（ｄ）所定の宿主の近縁の属のゲノム配列中のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも５％からなる一群のヌクレオチド配列
の少なくとも１つをインプットとして使用して、コンピューターベースの方法に基づいて計算される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記コドンペア重みｗが、停止コドンとしての終結シグナルを含めた可能な６１×６４コドンペアの少なくとも５％、１０％、２０％、５０％、好ましくは１００％について判定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コドンペア重みｗが、停止コドンなしの６１×６１コドンペアマトリックス、または停止コドンを含めた６１×６４コドンペアマトリックスから測定され、
前記コドンペア重みｗが、
【数９】


によって定義され、総合期待値
【数１０】


が、
【数１１】


によって定義され、
【数１２】


は全ゲノムデータセット中の単一コドン比率ｃ_ｋを示し、
【数１３】


はそのｍＲＮＡが少なくとも細胞あたり２０コピーのレベルで検出できる遺伝子である高度に発現される群中のペアの出現率（ｃ_ｉ，ｃ_ｊ）を示す、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
所定のアミノ酸配列をコードする前記オリジナルのコーディングヌクレオチド配列が、
（ａ）前記所定のアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列、
（ｂ）それによって所定のアミノ酸配列中のアミノ酸位置のためのコドンが、アミノ酸をコードする同義コドンから無作為に選択される、所定のアミノ酸配列の逆翻訳、
（ｃ）それによって所定のアミノ酸配列中のアミノ酸位置のためのコドンが、所定の宿主細胞または宿主細胞の近縁種の単一コドンバイアスに従って選択される、所定のアミノ酸配列の逆翻訳
から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記所定の宿主細胞が、微生物、好ましくはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、クリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択される属の微生物の細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記所定の宿主細胞が、動物または植物細胞、好ましくはＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）、ＨＥＫ−２９３、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９、およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ２１から選択される細胞系の細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
プロセッサーがメモリーから読み取ってメモリーに書き込むように構成され、前記メモリーが前記プロセッサーに請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を遂行する能力を提供するように構成されたデータおよび命令を含んでなる、プロセッサーおよびメモリーを含んでなるコンピューター。
【請求項１６】
プロセッサーもまた含んでなるコンピューターのメモリー内にロードされるように構成された、データおよび命令を含んでなるコンピュータープログラム製品であって、前記プロセッサーが前記メモリーから読み取って前記メモリーに書き込むように構成され、前記データおよび命令が請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を遂行する能力を前記プロセッサーに提供するように構成された、コンピュータープログラム製品。
【請求項１７】
請求項１６に記載のコンピュータープログラム製品を備えたデータ媒体。
【請求項１８】
所定のアミノ酸配列をコードするコード配列を含んでなり、コード配列が天然コード配列でなく、コード配列が所定の宿主細胞について少なくとも−０．１未満、好ましくは−０．２未満、より好ましくは−０．３未満のｆｉｔ_ｃｐ（ｇ）を有する、核酸分子。
【請求項１９】
所定のアミノ酸配列をコードするコード配列を含んでなり、コード配列が天然コード配列でなく、コード配列が所定の宿主細胞について少なくとも−０．１未満、好ましくは−０．２未満のｆｉｔ_ｃｐ（ｇ）を有し、所定の宿主細胞について少なくとも０．１未満のｆｉｔ_ｓｃｉ（ｇ）を有する、核酸分子。
【請求項２０】
コード配列が、所定の宿主細胞内でコード配列の発現を指示できる発現制御配列と作動的に連結する、請求項１８または１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞をポリペプチド発現に寄与する条件下で培養するステップと、場合によりポリペプチドを回収するステップを含んでなる、所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の宿主細胞を代謝産物の生成に寄与する条件下で培養するステップを含んでなり、それによって好ましくは所定のアミノ酸配列を有するポリペプチドが代謝産物の生成に関与する、細胞内および細胞外代謝産物の少なくとも１つを生成する方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図５ｃ】

【図５ｄ】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図８ａ】

【図８ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５（１）】

【図１５（２）】

【図１６（１）】

【図１６（２）】

【図１７】

【図１８】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４（１）】

【図２４（２）】

【図２５ａ】

【図２５ｂ】

【図２５ｃ】

【図２６】

【図２７】

【図１９】

【公表番号】特表２００９−５４０８４５（Ｐ２００９−５４０８４５Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７０９９（Ｐ２００９−５１７０９９）
【出願日】平成１９年６月１５日（２００７．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０００６３２
【国際公開日】平成２０年１月３日（２００８．１．３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
２．ＰＥＮＴＩＵＭ
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム　アイピー　アセッツ　ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】