改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
【課題】公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供すること。
【解決手段】野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨであり、特定のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【解決手段】野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨであり、特定のアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする改変型ＦＡＤＧＤＨ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）、その製造方法及びグルコースセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の１０％程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血糖を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９%程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特許文献２には、アスペルギルス・テレウス属野生株を液体培養または小麦フスマ培養することによりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを得たこと、および、アスペルギルス・テレウス属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、組換え大腸菌、組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）、組換え酵母（Ｃａｎｄｉｄａ属）でそれぞれ発現させ得られた酵素を精製したことが記載されている。
【０００７】
また、特許文献２には、それらの酵素の性質試験、および、センサーに適用したときの特性比較についていくつかの事例が開示されている。
【０００８】
しかし本願発明者らは、特許文献２の酵素は、産業上の要請という観点において、その記載内容が十分でなく、その要請を満たしていない可能性があると考えた。例えば、産業上の要請の重要な要件の１つである大量生産に最も適していると思われた大腸菌で発現させた酵素について、同様に極めて重要な要件である温度安定性の記載がない点が挙げられる。そこで本願発明者は、酵素の安定供給という観点から、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することを視野に先行技術を再検討した。また、アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的に検討を重ねた。
【０００９】
その結果、意外にも、最も大量生産に適していると思われた大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒＦＡＤＧＤＨ）は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣ることが判明した。
【００１０】
例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したａＦＡＤＧＤＨは、５０℃・１５分処理において約７７％の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒａＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性は、５０℃・１５分処理において約１３％程度であった。また、アスペルギルス・テレウスＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒｔＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性も、５０℃・１５分処理において約２８％程度であった。
【００１１】
特許文献２にその構造や製造方法が記載されている酵素についても、同様に、大腸菌で発現させて取得した酵素は、熱安定性が、野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて劣る可能性が高いと考えられる。
【００１２】
これは、遺伝子組み換えにより生産された酵素は、表面に多糖が付加されておらず、熱安定性が低下したからであると考えられた。
【００１３】
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。
【００１４】
そこで我々は、大腸菌による遺伝子組み換えにより生産しても十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
【００１５】
その結果、我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来またはアスペルギルス・テレウス株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
【００１６】
すなわち本発明は以下の通りである。
[項１]
改変することにより熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２]
真核生物由来である項１記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３]
糸状菌由来である項１記載のＦＡＤＧＤＨ。
[項４]
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来である項１記載のＦＡＤＧＤＨ。
[項５]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項６]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項７]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が３５％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項８]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が４０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項９]
５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１０]
５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が８０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１１]
配列表の配列番号２または配列番号４６に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１２]
配列表の配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、配列表の配列番号４６において１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位、５４７位の位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１３]
配列表の配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換が、Ｋ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（ Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ） 、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、 （Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、配列表の配列番号４６において少なくとも、アミノ酸置換が、Ｋ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ１１６Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑのうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１４]
改変することによりｐＨ安定性が向上した項１〜１４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１５]
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上であることを特徴とする項１〜１５記載の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ。
[項１６]
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が９０％以上であることを特徴とする項１〜１５記載の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ。
[項１７]
配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変体ＦＡＤＧＤＨ。
[項１８]
配列表の配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、他の種における上記と同様の配置における位置におけるアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１９]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
[項２０]
請求項１９に記載の遺伝子を含むベクター。
[項２１]
請求項２０に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項２２]
請求項２１に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
[項２３]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
[項２４]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
[項２５]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
[項２６]
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における５３位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２７]
キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の５．０％以下である項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２８]
アミノ酸置換を、配列番号２における、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ及びＧ５３Ｃからなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置に有する項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２９]
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位、１６７位および５５１位からなる群のうちいずれか１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３０]
配列番号２のアミノ酸配列における(Ｇ５３Ｈ+Ｓ１６７Ｐ)、(Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ)、（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）および（Ｇ５３Ｎ+Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項２９に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３１]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子であり、さらに、該遺伝子を含むベクターであり、さらに、該ベクターで形質転換された形質転換体であり、さらに、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
[項３２]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
[項３３]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定方法。
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも五炭糖類に対する作用性が低下している。五炭糖としてはキシロースが例示できる。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のＦＡＤＧＤＨよりもキシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の５.０％以下である。なお、キシロースに対する作用性とは、グルコースを基質とした場合とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１とする）を意味する。
【００１７】
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上していることが好ましい。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であり、好ましくは４０％以上であり、更に好ましくは７０％以上である。このような安定性を維持することができれば、製剤時に加熱乾燥することが可能となる。
【００１８】
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりもｐＨ安定性が向上していることが好ましい。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上であるか、または、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上、好ましくは９０％以上である。
[項３４]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨ。ここで、ＦＡＤＧＤＨは、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であることが好ましく、さらには４０％以上であることが好ましく、さらには８０％以上であることが好ましい。
［項３５］
配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨであり、例えば、配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。ここで、１６２位、１６３位、１６７位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨがさらに好ましいものとして例示できる。
［項３６］
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３７］
配列番号２のアミノ酸配列における、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置において同等のアミノ酸置換を有する、前パラグラフ記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３８］
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位に加えて、さらに、１２０位、１６０位、１６２位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位および４７１位からなる群のうちいずれか１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３９］
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりもｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨ
［項４０］。
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位に加えて、さらに、１６７位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、ｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
［項４１］
配列番号２のアミノ酸配列におけるＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ） からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置において同等のアミノ酸置換を有する、前パラグラフ記載の改変型ＦＡＤＧＤＨである。
［項４２］
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上、好ましくは９０％以上である項３４〜４１のいずれかのＦＡＤＧＤＨ。
［項４３］
配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変体ＦＡＤＧＤＨ。
［項４４］
配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、他の種における上記と同様の配置における位置におけるアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項４５］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
［項４６］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットまたはグルコースセンサー。
［項４７］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法である。
【００１９】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨにおいて、特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００２０】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。また、「（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）」は、１６０位のＧをＥに、１６７位のＳをＰにそれぞれ置換すること、＋はその両方の置換を有する多重（この例では二重）変異体であることを意味する。
【００２１】
加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アスペルオリゼ由来 WT（野生型）、改変型FADGDH精製標品のpH安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐH６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は組み換えＦＡＤＧＤＨよりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを含む。
【００２５】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００２６】
本発明者らは、National Center for Biotechnology Information（以下ＮＣＢＩと表記）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、我々はPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、P.lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。その概要を以下の＜実験例１＞＜実験例２＞に示す。
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定］
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。
【００２８】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
［ｃＤＮＡの作製］
Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにReverTra-Plus-TM（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３７）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号３８）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとP.lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３９、４０に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号４１）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４２）からなることが明らかとなった。データベース予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株 ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、データベースに基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、データベースより推定したＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入］
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。
【００２９】
Ｓ２では、配列番号４３のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４４のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
【００３０】
なお、この改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
【００３１】
この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。
【００３２】
配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
＜実験例４＞
ｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・テレウス NBRC33026（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）Ｌ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元させた。５００ｍｌ 坂口フラスコに１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、１％マルトエキスｐＨ６．５を５０ｍｌ調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して植菌し、３０℃,２４時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスク社製セパゾールＲＮＡ Ｉを用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製ReverTra-Plus-TMを用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを調製した。
＜実験例５＞
GDH遺伝子の配列決定
我々はAspergillus oryzae、Penicillium lilacinoechinulatum 、およびPenicillium italicum由来 GDH遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。アスペルギルス・テレウスよりGDH遺伝子をクローニングするために、上記３種のGDHの推定アミノ酸配列をアラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、ディジェネレートプライマーを作製した。＜実験例４＞で作製したゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。決定したＧＤＨ部分配列を元に、該配列部分の５’側および３’側隣接領域をＲＡＣＥ法により決定した。決定した遺伝子領域の開始コドンから終始コドンまでの配列を配列番号４５に、また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４６に示す。なお、特許文献１に示されているアスペルギルス・テレウス FERM BP-08578由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素とは、アミノ酸レヘ゛ルで約98.5%と非常に高い相同性をもち、本質的に同等であると考えられる。「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮しうるものである）における、オーバーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。このようなアルゴリズムの例としては、非特許文献１〜４に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【非特許文献１】Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) Vol.90 p5873-5877
【非特許文献２】Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) Vol.48 p444-453
【非特許文献３】Myers and Miller, CABIOS Vol.4 p11-17
【非特許文献４】Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) Vol.85 p2444-2448＜実験例６＞GDH組換えプラスミドおよび組換え体の作製 配列番号４５のＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列について、SignalP 3.0 Serverを利用して、シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛予測を行った。この結果を元に、シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛を除去すべく、Ｎ末端配列25コドンが削除され、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列増幅が増幅されるようにＰＣＲプライマーを作製した（配列番号４７、４８）。これらのプライマーを用いて、NBRC33026 ｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンＡＴＧに合わせＮｄｅＩ認識配列のＡＴＧを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを構築した(pAtGDH-s2-7)。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、アスペルギルス・テレウス由来 GDH 組換え体を取得した。該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、菌体内に培養液１ｍｌ当たり１．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。
【００３３】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号２または配列番号４６のアミノ酸配列における上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
【００３４】
例えば、「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２アミノ酸配列と、配列番号２と相同性（好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＧＤＨとを、アラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００３５】
基質特異性、及び/または、熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、５３位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＧ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３６】
ここで、「Ｇ５３Ｈ」は、５３位のＧ（Ｇｌy）を(H i s）に置換することを意味する。
特に、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性の向上に寄与し、Ｇ５３Ｈ+Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性、及び/または、安定性の向上に寄与する。
【００３７】
熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。上記のうち、１６２位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３８】
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３９】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００４０】
特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００４１】
また、配列番号４６のアミノ酸配列において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００４２】
好ましくは配列番号４６のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ116Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００４３】
ここで、「K116D」は116位のK (Lys)をD (Asp)に置換することを意味する。
【００４４】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法または、配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAが作成される。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。
【００４５】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5・、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイJM109;東洋紡績製）を用いても良い。
【００４６】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型ＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、改変型ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は6〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはpH6.0〜9.0程度である。
【００４７】
培養物中の改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変型ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変型ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００４８】
このようにして得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
【００４９】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型FADGDHを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型FADGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型FADGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５０】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型FADGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型FADGDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００５２】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型FADGDH熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・テレウス由来改変型FADGDHを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型FADGDH（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
【００５３】
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００５４】
実施例２：アスペルギルス・オリゼ由来FADGDH遺伝子への変異導入
野生型FADGDHをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50mg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl；pH7.3）を摂取し、30℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として用いDiversifyTMPCR Ramdom Mutagenesis Kit(Clontech社製)を用いた変異処理をそのプロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００５５】
実施例３：アスペルギルス・オリゼ由来改変型FADGDHを含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００５６】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例3の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、3種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら3種の改変体をコードするプラスミドをpAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4と命名した。
【００５７】
pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M1で配列番号２記載の162番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M2では167番目のセリンがプロリンに471番目のリジンがアルギニン、pAOGDH-M3では180番目のアラニンがグリシンに551番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M4では120番目のリジンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリンに369番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
pAOGDH-S2のプラスミドを鋳型として、160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号3の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号4の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、162番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号5の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号6の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号7の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、165番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号8の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号9の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、167番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号10の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、168番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号11の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、169番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号12の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、170番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号13の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号14の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、172番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号15の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、329番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号16の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号17の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、331番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号18の合成オリゴヌクレオチド、551番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号19の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００６０】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００６１】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、16種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら16種の改変体をコードするプラスミドを、pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、pAOGDH-M19と命名した。
【００６２】
pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16 、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、pAOGDH-M19の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M5で配列番号２記載の160番目のグリシンがプロリン、pAOGDH-M6では163番目のグリシンがリジン、pAOGDH-M7では163番目のグリシンがロイシン、pAOGDH-M8では163番目のグリシンがアルギニン、pAOGDH-M9では167番目のセリンがアラニン、pAOGDH-M10では167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M11では167番目のセリンがアルギニン、pAOGDH-M12では167番目のセリンがバリン、pAOGDH-M13では171番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M14では551番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M15では551番目のバリンがシステイン、pAOGDH-M16では551番目のバリンがスレオニン、pAOGDH-M17では551番目のバリンがグルタミン、pAOGDH-M18では551番目のバリンがセリン、pAOGDH-M19では551番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表2に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
pAOGDH-M10のプラスミドを鋳型として、160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号20の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号21の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、162番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号22の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号23の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号24の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、165番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号25の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号26の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、168番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号27の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、169番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号28の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、170番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号29の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号30の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、172番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号31の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、329番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号32の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号33の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、331番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号34の合成オリゴヌクレオチド、551番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号35の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６５】
pAOGDH-M15のプラスミドを鋳型として、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号36の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６６】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００６７】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、57種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら57種の改変体をコードするプラスミドを、pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39 pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76と命名した。
【００６８】
pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39 pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer ; Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M20で配列番号２記載の160番目のグリシンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M21では160番目のグリシンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M22では160番目のグリシンがセリングルタミンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M23では160番目のグリシンがグルタミンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M24では162番目のセリンがアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M25では162番目のセリンがシステインに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M26では162番目のセリンがアスパラギン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M27では162番目のセリンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M28では162番目のセリンがフェニルアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M29では162番目のセリンがヒスチジンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M30では162番目のセリンがロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M31では163番目のグリシンがアスパラギン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M32では164番目のセリンがフェニルアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M33では164番目のセリンがスレオニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M34では164番目のセリンがチロシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M35では165番目のロイシンがアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M36では165番目のロイシンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M37では165番目のロイシンがアスパラギンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M38では165番目のロイシンがプロリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M39では165番目のロイシンがバリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M40では166番目のアラニンがシステインに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M41では166番目のアラニンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M42では166番目のアラニンがリジンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M43では166番目のアラニンがロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M44では166番目のアラニンがメチオニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M45では166番目のアラニンがプロリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M46では166番目のアラニンがセリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M47では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがリジン、pAOGDH-M48では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがプロリン、pAOGDH-M49では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがチロシン、pAOGDH-M50では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがトリプトファン、pAOGDH-M51では167番目のセリンがプロリンに170番目のロイシンがシステイン、pAOGDH-M52では167番目のセリンがプロリンに170番目のロイシンがフェニルアラニン、pAOGDH-M53では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがイソロイシンに、pAOGDH-M54では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがリジン、pAOGDH-M55では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがメチオニン、pAOGDH-M56では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがグルタミン、pAOGDH-M57では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがバリン、pAOGDH-M58では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M59では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがシステインに、pAOGDH-M60では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがグルタミン酸、pAOGDH-M61では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがイソロイシン、pAOGDH-M62では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがメチオニン、pAOGDH-M63では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがシステイン、pAOGDH-M64では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがグルタミン酸、pAOGDH-M65では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがトリプトファン、pAOGDH-M66では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがにチロシン、pAOGDH-M67では167番目のセリンがプロリンに329番目のバリンがグルタミン、pAOGDH-M68では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがシステイン、pAOGDH-M69では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがアスパラギン酸、pAOGDH-M70では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがイソロイシン、pAOGDH-M71では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがリジンpAOGDH-M72では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがロイシン、AOGDH-M73では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがメチオニン、pAOGDH-M74では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表3に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
実施例６：アスペルギルス・オリゼ由来改変型FADGDHの取得
改変型FADGDH生産菌として、pAOGDH-M10、pAOGDH-M15、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、TB培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型FADGDHサンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００７１】
【表４】
【００７２】
実施例７：ｐＨ安定性
実施例６で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１M 酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１M ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１M トリス塩酸バッファー、ｐH６．０〜７．７：０．１M リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図１に示す。図１に示すようにpH安定域の幅が広がっていることが確認された。
【００７３】
実施例８：アスペルギルス・テレウス由来FADGDH遺伝子への変異導入
我々はアスペルギルス・オリゼ由来 GDH遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。また、熱安定性を指標としたスクリーニングを実施し、熱安定性向上に効果のあるアミノ酸部位を同定している。そこで、アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、アスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨにおいて、アスペルギルス・オリゼＦＡＤＧＤＨで熱安定性向上に効果のあった部位に対応するアミノ残基を同定した。
【００７４】
実験例６で作製した組換えプラスミドpAtGDH-s2-7を鋳型として用い、116番目のリジンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、159番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のグルタミン酸を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、167番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、175番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、325番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、327番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、365番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、547番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩培養した。
【００７５】
実施例９：アスペルギルス・テレウス由来改変型FADGDHを含む粗酵素液の調整
得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００７６】
実施例１０：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例９の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【００７７】
これらＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列については、DNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)により配列確認を実施した。加熱処理前の活性に対する加熱処理後の残存活性率（％）を表５に示した。この結果より、組換え体を用いて熱安定性が向上したアスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼを取得すること可能となった。
【００７８】
【表５】
【００７９】
また、種々の糖類に対する基質特異性については、上記の活性測定方法に従い、酵素活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とそれに代えて同じモル濃度の比較対象の糖類（例えばマルトース）を基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。
【００８０】
上記で得られた種々の変異体の基質特異性は良好であった。
【００８１】
実施例１１：FADGDH遺伝子への変異導入
野生型FADGDHをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50・g/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl；pH7.3）を摂取し、30℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として５３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００８２】
実施例１２：改変型FADGDHを含む粗酵素液の調製
実施例２で調整したプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００８３】
実施例１３：基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、７種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら７種の改変体をコードするプラスミドをpAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M５、pAOGDH-M６、pAOGDH-M７と命名した。
【００８４】
pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M５、pAOGDH-M６、pAOGDH-M７の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M１で配列番号２記載の５３番目のグリシンがシステイン、pAOGDH-M２で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジン、pAOGDH-M３で配列番号２記載の５３番目のグリシンがリジン、pAOGDH-M４で配列番号２記載の５３番目のグリシンがメチオニン、pAOGDH-M５で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギン、pAOGDH-M６で配列番号２記載の５３番目のグリシンがスレオニン、pAOGDH-M７で配列番号２記載の５３番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００８５】
【表６】
【００８６】
実施例１４：基質特異性、及び/または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例１３で調整したプラスミドpAOGDH-M2を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH-M５を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH-M2を鋳型として、１６３番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号５１の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに５５１番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号５２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例２の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び/または、熱安定性に優れた改変型FADGDHを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例４の方法と同様にDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M８で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジンに、１６７番目のセリンがプロリンに、pAOGDH-M９で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６７番目のセリンがプロリンに、pAOGDH-M１０で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６３番目のグリシンがアルギニンに、５５１番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例４と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例３の方法と同様に、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表２に示す。
【００８７】
【表７】
【００８８】
実施例１５：改変型FADGDHの取得
改変型FADGDH生産菌として、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、TB培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型FADGDHサンプルとした。表３に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００８９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて熱安定性向上に関与しているアミノ酸残基を見出すことができ、あらゆる属、種のＦＡＤ−ＧＤＨにもあてはまる可能が示された。また、本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、また、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする改変型ＦＡＤＧＤＨ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）、その製造方法及びグルコースセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン（本書ではピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７）が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＮＡＤＧＤＨとも記載する。）は安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではＰＱＱ依存型グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）は、基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため測定値の正確性を損ねてしまうという欠点がある。
【０００４】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（本書ではフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをＦＡＤＧＤＨとも記載する。）が開示されている。本酵素は、キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の１０％程度あるため、キシロース負荷試験を受けている人の血糖を測定する場合、測定値の正確性を損ねてしまう可能性がある。熱安定性については５０℃、１５分処理で８９%程度の活性残存率であり安定性についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述のような公知の血糖センサ用酵素と比較して、さらに実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特許文献２には、アスペルギルス・テレウス属野生株を液体培養または小麦フスマ培養することによりフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを得たこと、および、アスペルギルス・テレウス属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、組換え大腸菌、組換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）、組換え酵母（Ｃａｎｄｉｄａ属）でそれぞれ発現させ得られた酵素を精製したことが記載されている。
【０００７】
また、特許文献２には、それらの酵素の性質試験、および、センサーに適用したときの特性比較についていくつかの事例が開示されている。
【０００８】
しかし本願発明者らは、特許文献２の酵素は、産業上の要請という観点において、その記載内容が十分でなく、その要請を満たしていない可能性があると考えた。例えば、産業上の要請の重要な要件の１つである大量生産に最も適していると思われた大腸菌で発現させた酵素について、同様に極めて重要な要件である温度安定性の記載がない点が挙げられる。そこで本願発明者は、酵素の安定供給という観点から、該酵素を遺伝子組み換えにより生産することを視野に先行技術を再検討した。また、アスペルギルス・オリゼ株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、キシロースに作用性を低下させ、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的に検討を重ねた。
【０００９】
その結果、意外にも、最も大量生産に適していると思われた大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒＦＡＤＧＤＨ）は、熱安定性が野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて大きく劣ることが判明した。
【００１０】
例えば、発明者らが後述の方法によりアスペルギルス・オリゼから取得したａＦＡＤＧＤＨは、５０℃・１５分処理において約７７％の活性を維持していたが、大腸菌で発現させて取得したＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒａＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性は、５０℃・１５分処理において約１３％程度であった。また、アスペルギルス・テレウスＦＡＤＧＤＨ組換え体（ｒｔＦＡＤＧＤＨ）の熱安定性も、５０℃・１５分処理において約２８％程度であった。
【００１１】
特許文献２にその構造や製造方法が記載されている酵素についても、同様に、大腸菌で発現させて取得した酵素は、熱安定性が、野生株から培養・精製して得られた酵素と比べて劣る可能性が高いと考えられる。
【００１２】
これは、遺伝子組み換えにより生産された酵素は、表面に多糖が付加されておらず、熱安定性が低下したからであると考えられた。
【００１３】
血糖センサ用チップの作製工程においては、加熱乾燥処理を施す場合があり、組換え体を利用する場合には、大幅な熱失活をおこす危険性があり、熱安定性を向上させる必要があった。
【００１４】
そこで我々は、大腸菌による遺伝子組み換えにより生産しても十分な熱安定性を有し、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することを目的にさらに検討を重ねた。
【００１５】
その結果、我々は、アスペルギルス・オリゼ株由来またはアスペルギルス・テレウス株由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列を適宜改変することにより、上述のような公知の血糖センサ用酵素の熱安定性に関する欠点を克服して、より実用面において有利な血糖値測定用試薬に使用可能な酵素を提供することができた。
【００１６】
すなわち本発明は以下の通りである。
[項１]
改変することにより熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２]
真核生物由来である項１記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３]
糸状菌由来である項１記載のＦＡＤＧＤＨ。
[項４]
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来である項１記載のＦＡＤＧＤＨ。
[項５]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項６]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項７]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が３５％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項８]
液状において、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が４０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項９]
５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１０]
５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が８０％以上であることを特徴とする項１〜４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１１]
配列表の配列番号２または配列番号４６に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１２]
配列表の配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、配列表の配列番号４６において１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位、５４７位の位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１３]
配列表の配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換が、Ｋ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６０Ｑ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｌ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｔ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６４Ｙ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ａ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ａ１６６Ｃ＋Ｓ１６７Ｐ）、（ Ａ１６６Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｋ＋Ｓ１６７Ｐ） 、（Ａ１６６Ｍ＋Ｓ１６７Ｐ）、 （Ａ１６６Ｐ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ａ１６６Ｓ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７０Ｆ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｓ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ａ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｅ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｓ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｔ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ３２９Ｑ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｃ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｄ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｌ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｍ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ａ３３１Ｖ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、配列表の配列番号４６において少なくとも、アミノ酸置換が、Ｋ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ１１６Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑのうちいずれか、または、他の種における上記と同等の位置におけるアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１４]
改変することによりｐＨ安定性が向上した項１〜１４記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１５]
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上であることを特徴とする項１〜１５記載の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ。
[項１６]
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が９０％以上であることを特徴とする項１〜１５記載の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ。
[項１７]
配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変体ＦＡＤＧＤＨ。
[項１８]
配列表の配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、他の種における上記と同様の配置における位置におけるアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項１９]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
[項２０]
請求項１９に記載の遺伝子を含むベクター。
[項２１]
請求項２０に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
[項２２]
請求項２１に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
[項２３]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
[項２４]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
[項２５]
請求項１〜１８のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
[項２６]
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における５３位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２７]
キシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の５．０％以下である項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２８]
アミノ酸置換を、配列番号２における、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ及びＧ５３Ｃからなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置に有する項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項２９]
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位、１６７位および５５１位からなる群のうちいずれか１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３０]
配列番号２のアミノ酸配列における(Ｇ５３Ｈ+Ｓ１６７Ｐ)、(Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ)、（Ｇ５３Ｈ＋Ｓ１６７Ｐ）および（Ｇ５３Ｎ+Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項２９に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
[項３１]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子であり、さらに、該遺伝子を含むベクターであり、さらに、該ベクターで形質転換された形質転換体であり、さらに、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
[項３２]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
[項３３]
項２６〜３０のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定方法。
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも五炭糖類に対する作用性が低下している。五炭糖としてはキシロースが例示できる。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のＦＡＤＧＤＨよりもキシロースに対する作用性がグルコースに対する作用性の５.０％以下である。なお、キシロースに対する作用性とは、グルコースを基質とした場合とキシロースを基質とした場合の反応速度の相対比％（グルコースを１とする）を意味する。
【００１７】
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上していることが好ましい。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であり、好ましくは４０％以上であり、更に好ましくは７０％以上である。このような安定性を維持することができれば、製剤時に加熱乾燥することが可能となる。
【００１８】
項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりもｐＨ安定性が向上していることが好ましい。項２６に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨは、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．０において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上であるか、または、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上、好ましくは９０％以上である。
[項３４]
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨ。ここで、ＦＡＤＧＤＨは、５０℃、１５分間の熱処理後の活性残存率が２０％以上であることが好ましく、さらには４０％以上であることが好ましく、さらには８０％以上であることが好ましい。
［項３５］
配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するＦＡＤＧＤＨにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加された一次構造を有する改変型ＦＡＤＧＤＨであり、例えば、配列番号２において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。ここで、１６２位、１６３位、１６７位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨがさらに好ましいものとして例示できる。
［項３６］
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３７］
配列番号２のアミノ酸配列における、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６３Ｄ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｌ１６５Ｐ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｌ１６５Ｖ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置において同等のアミノ酸置換を有する、前パラグラフ記載の改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３８］
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位に加えて、さらに、１２０位、１６０位、１６２位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位および４７１位からなる群のうちいずれか１つ以上の位置、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項３９］
野生型のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりもｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、好ましくは真核生物由来、さらに好ましくは糸状菌由来、さらに好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌由来のＦＡＤＧＤＨ
［項４０］。
配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位に加えて、さらに、１６７位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、ｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨである。
［項４１］
配列番号２のアミノ酸配列におけるＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ） からなる群のうちいずれか、もしくは、それと同等の位置において同等のアミノ酸置換を有する、前パラグラフ記載の改変型ＦＡＤＧＤＨである。
［項４２］
ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５において、２５℃、１６時間処理後の残存活性が８０％以上、好ましくは９０％以上である項３４〜４１のいずれかのＦＡＤＧＤＨ。
［項４３］
配列番号２において、１６３位、１６７位、５５１位、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変体ＦＡＤＧＤＨ。
［項４４］
配列番号２において少なくとも、アミノ酸置換がＳ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃ、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）、（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のうちいずれか、または、他の種における上記と同様の配置における位置におけるアミノ酸置換を有するｐＨ安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
［項４５］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
［項４６］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットまたはグルコースセンサー。
［項４７］
項３４〜４４のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法である。
【００１９】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨにおいて、特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００２０】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。また、「（Ｇ１６０Ｅ＋Ｓ１６７Ｐ）」は、１６０位のＧをＥに、１６７位のＳをＰにそれぞれ置換すること、＋はその両方の置換を有する多重（この例では二重）変異体であることを意味する。
【００２１】
加熱乾燥可能なレベルとは、５０℃、１５分処理後の残存活性が２０％以上存在する状態であり、好ましくは４０％以上の残存活性が存在する状態であり、更に好ましくは、６０％以上の残存活性が存在する状態である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アスペルオリゼ由来 WT（野生型）、改変型FADGDH精製標品のpH安定性を示す。ｐＨ３．５〜６．３：酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．８：トリス塩酸バッファー、ｐH６．０〜７．７：リン酸バッファーをそれぞれ用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は組み換えＦＡＤＧＤＨよりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨを含む。
【００２５】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
【００２６】
本発明者らは、National Center for Biotechnology Information（以下ＮＣＢＩと表記）のデータベースを利用し、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を推定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。
【００２７】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、自社保有のアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清から、各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であり、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。しかしながら、我々はPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231株がＧＤＨを生産することを見出し、精製酵素を用いて部分アミノ酸配列の決定に成功した。ついで、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、P.lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。最終的に、この塩基配列を元に、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定、取得した。その概要を以下の＜実験例１＞＜実験例２＞に示す。
＜実験例１＞、
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定］
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる高純度の精製標品を得ることはできなかった。
【００２８】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてPenicillium lilacinoechinulatum NBRC6231を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
［ｃＤＮＡの作製］
Penicillium lilacinoechinulatum NBRC6231について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにReverTra-Plus-TM（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
［ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定］
上記で精製したＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号３７）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号３８）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
［ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定］
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとP.lilacinoechinulatum NBRC6231由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
＜実験例２＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得、大腸菌への導入］
ＡＯＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼＴＩ株の菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号３９、４０に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換体より、常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号４１）。この結果、ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４２）からなることが明らかとなった。データベース予想されるＧＤＨは５８８アミノ酸でありＴＩ株 ＧＤＨとアミノ酸残基数が異なることが示唆された。なお、該遺伝子については、ＴＩ株ゲノムＤＮＡを用いて配列を確認し、遺伝子隣接領域についてもＲＡＣＥ法を用いて確認を行った。また、ＰＣＲ法を用いて、データベースに基づくＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、データベースより推定したＧＤＨの配列を有する形質転換体ではＧＤＨ活性が確認できなかったが、ＴＩ株由来ＧＤＨの配列を有する形質転換体については菌体内に培養液１ｍｌ当たり８．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。尚、実施例１で実施したアスペルギルス・オリゼＴＩ株の培養上清のＧＤＨ活性は、０．２Ｕ／ｍｌであった。
＜実験例３＞
［アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入］
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。
【００２９】
Ｓ２では、配列番号４３のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号４４のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。
【００３０】
なお、この改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
【００３１】
この形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が増大した。
【００３２】
配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨは、以下の方法により入手した。
＜実験例４＞
ｃＤＮＡの調製
アスペルギルス・テレウス NBRC33026（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）Ｌ乾標本をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元させた。５００ｍｌ 坂口フラスコに１．５％大豆ペプチド、２％グルコース、１％マルトエキスｐＨ６．５を５０ｍｌ調製し、復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収して植菌し、３０℃,２４時間振とう培養を行い、菌体を回収した。得られた菌体は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、東洋紡製クールミルを用いて、粉砕した。粉砕菌体より直ちにナカライテスク社製セパゾールＲＮＡ Ｉを用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出し、これをテンプレートに東洋紡製ReverTra-Plus-TMを用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを調製した。
＜実験例５＞
GDH遺伝子の配列決定
我々はAspergillus oryzae、Penicillium lilacinoechinulatum 、およびPenicillium italicum由来 GDH遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。アスペルギルス・テレウスよりGDH遺伝子をクローニングするために、上記３種のGDHの推定アミノ酸配列をアラインさせ、相同性の高い領域の配列をもとに、ディジェネレートプライマーを作製した。＜実験例４＞で作製したゲノムＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ、増幅産物が認められた。増幅産物をサブクローニングし、塩基配列を決定した。決定したＧＤＨ部分配列を元に、該配列部分の５’側および３’側隣接領域をＲＡＣＥ法により決定した。決定した遺伝子領域の開始コドンから終始コドンまでの配列を配列番号４５に、また、本配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４６に示す。なお、特許文献１に示されているアスペルギルス・テレウス FERM BP-08578由来補酵素結合型グルコース脱水素酵素とは、アミノ酸レヘ゛ルで約98.5%と非常に高い相同性をもち、本質的に同等であると考えられる。「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮しうるものである）における、オーバーラップする全アミノ酸に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。このようなアルゴリズムの例としては、非特許文献１〜４に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【非特許文献１】Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) Vol.90 p5873-5877
【非特許文献２】Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) Vol.48 p444-453
【非特許文献３】Myers and Miller, CABIOS Vol.4 p11-17
【非特許文献４】Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) Vol.85 p2444-2448＜実験例６＞GDH組換えプラスミドおよび組換え体の作製 配列番号４５のＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列について、SignalP 3.0 Serverを利用して、シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛予測を行った。この結果を元に、シク゛ナルヘ゜フ゜チト゛を除去すべく、Ｎ末端配列25コドンが削除され、開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列増幅が増幅されるようにＰＣＲプライマーを作製した（配列番号４７、４８）。これらのプライマーを用いて、NBRC33026 ｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）により遺伝子増幅を実施した。増幅断片は制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンＡＴＧに合わせＮｄｅＩ認識配列のＡＴＧを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイト間に挿入し、組換えプラスミドを構築した(pAtGDH-s2-7)。この組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、アスペルギルス・テレウス由来 GDH 組換え体を取得した。該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体培地（Terrific broth）２００ｍｌ中で、３０℃、１６時間振とう培養を行った。菌体破砕液についてＧＤＨ活性を確認したところ、菌体内に培養液１ｍｌ当たり１．０ＵのＧＤＨ活性が得られた。
【００３３】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列番号２または配列番号４６のアミノ酸配列における上記で示されるいずれか位置においてアミノ酸置換を行うことにより得られる。
【００３４】
例えば、「配列番号２のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号２アミノ酸配列と、配列番号２と相同性（好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＧＤＨとを、アラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。
【００３５】
基質特異性、及び/または、熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、５３位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＧ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ｃからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３６】
ここで、「Ｇ５３Ｈ」は、５３位のＧ（Ｇｌy）を(H i s）に置換することを意味する。
特に、Ｇ５３Ｈ、Ｇ５３Ｎ、Ｇ５３Ｋ、Ｇ５３Ｍ、Ｇ５３Ｔ、Ｇ５３Ｖ、Ｇ５３Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性の向上に寄与し、Ｇ５３Ｈ+Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｓ１６７Ｐ、Ｇ５３Ｎ＋Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃのアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの基質特異性、及び/または、安定性の向上に寄与する。
【００３７】
熱安定性の改良された本発明は、配列番号２のアミノ酸配列において、１２０位、１６０位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、１６７位、１６９位、１７０位、１７１位、１７２位、１８０位、３２９位、３３１位、３６９位、４７１位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。上記のうち、１６２位、１６３位、１６７位、位及び５５１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３８】
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１２０Ｅ、Ｇ１６０Ｅ、Ｇ１６０Ｉ、Ｇ１６０Ｐ、Ｇ１６０Ｓ、Ｇ１６０Ｑ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１６２Ｃ、Ｓ１６２Ｄ、Ｓ１６２Ｅ、Ｓ１６２Ｆ、Ｓ１６２Ｈ、Ｓ１６２Ｌ、Ｓ１６２Ｐ、Ｇ１６３Ｄ、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６４Ｆ、Ｓ１６４Ｔ、Ｓ１６４Ｙ、Ｌ１６５Ａ、Ｌ１６５Ｉ、Ｌ１６５Ｎ、Ｌ１６５Ｐ、Ｌ１６５Ｖ、Ａ１６６Ｃ、Ａ１６６Ｉ、Ａ１６６Ｋ、Ａ１６６Ｌ、Ａ１６６Ｍ、Ａ１６６Ｐ、Ａ１６６Ｓ、１６７Ａ、Ｓ１６７Ｐ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ１６７Ｖ、Ｎ１６９Ｋ、Ｎ１６９Ｐ、Ｎ１６９Ｙ、Ｎ１６９Ｗ、Ｌ１７０Ｃ、Ｌ１７０Ｆ、Ｓ１７１Ｉ、Ｓ１７１Ｋ、Ｓ１７１Ｍ、Ｓ１７１Ｑ、Ｓ１７１Ｖ、Ｖ１７２Ａ、Ｖ１７２Ｃ、Ｖ１７２Ｅ、Ｖ１７２Ｉ、Ｖ１７２Ｍ、Ｖ１７２Ｓ、Ｖ１７２Ｗ、Ｖ１７２Ｙ、Ａ１８０Ｇ、Ｖ３２９Ｑ、Ａ３３１Ｃ、Ａ３３１Ｄ、Ａ３３１Ｉ、Ａ３３１Ｋ、Ａ３３１Ｌ、Ａ３３１Ｍ、Ｑ３３１Ｖ、Ｋ３６９Ｒ、Ｋ４７１Ｒ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｔ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【００３９】
ここで、「Ｋ１２０Ｅ」は、１２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。
【００４０】
特に、Ｇ１６３Ｋ、Ｇ１６３Ｌ、Ｇ１６３Ｒ、Ｓ１６７Ｐ、Ｖ５５１Ａ、Ｖ５５１Ｃ、Ｖ５５１Ｑ、Ｖ５５１Ｓ、Ｖ５５１Ｙ、（Ｇ１６０Ｉ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６２Ｆ＋Ｓ１６７Ｐ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｎ１６９Ｙ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｋ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｌ１７１Ｖ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｉ）、（Ｓ１６７Ｐ＋Ｖ１７２Ｗ）、（Ｇ１６３Ｋ＋Ｖ５５１Ｃ）（Ｇ１６３Ｒ＋Ｖ５５１Ｃ）のアミノ酸置換は、改変型ＦＡＤＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。
【００４１】
また、配列番号４６のアミノ酸配列において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有する改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００４２】
好ましくは配列番号４６のアミノ酸配列において、アミノ酸置換がＫ１１６Ｄ、Ｋ１１６Ｇ、Ｋ１１６Ｌ、Ｋ116Ｆ、Ｋ１１６Ｑ、Ｑ１５９Ａ、Ｑ１５９Ｋ、Ｑ１５９Ｎ、Ｑ１５９Ｐ、Ｑ１５９Ｖ、Ｑ１５９Ｌ、Ｅ１６１Ｃ、Ｎ１６４Ｙ、Ｎ１６４Ｖ、Ｎ１６４Ｃ、Ｔ１６６Ｆ、Ｔ１６６Ｙ、Ｔ１６６Ｗ、Ｔ１６７Ｌ、Ｔ１６７Ｖ、Ｔ１６７Ｓ、Ｇ１７５Ｋ、Ｓ３２５Ａ、Ｓ３２５Ｇ、Ｓ３２５Ｋ、Ｓ３２５Ｑ、Ｓ３２５Ｒ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ３２５Ｖ、Ｓ３２５Ｙ、Ｓ３２７Ｅ、Ｑ３６５Ｒ、Ｖ５４７Ｓ、Ｖ５４７Ｃ、Ｖ５４７Ａ、Ｖ５４７Ｑからなる群から選ばれる改変型ＦＡＤＧＤＨが例示される。
【００４３】
ここで、「K116D」は116位のK (Lys)をD (Asp)に置換することを意味する。
【００４４】
配列番号２で示される野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法または、配列番号４６で示される野生型のアスペルギルス・テレウス由来のＦＡＤＧＤＨを改変した改変型ＦＡＤＧＤＨの製造法は特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。ＦＡＤＧＤＨを構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するDNAの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変タンパク質の遺伝情報を有するDNAが作成される。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など)の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)の利用が挙げられる。
【００４５】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するDNAは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物に移入され、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5・、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600などが利用できる。宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイJM109;東洋紡績製）を用いても良い。
【００４６】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変型ＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培地温度は菌が発育し、改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、改変型ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は6〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し改変体タンパク質を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはpH6.0〜9.0程度である。
【００４７】
培養物中の改変型ＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変型ＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、改変タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変型ＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００４８】
このようにして得られた改変型ＦＡＤＧＤＨ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や東電点処理も有効な生成手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変型ＦＡＤＧＤＨを得ることができる。
【００４９】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型FADGDHを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型FADGDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型FADGDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００５０】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型FADGDHを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型FADGDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００５１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型FADGDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００５２】
本発明において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨの活性測定は以下の条件で行う。
［試験例］
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１６３ｍＭ ＰＭＳ溶液
６．８ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．６ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
実施例１：グルコース測定系を用いた改変型FADGDH熱安定性の検討
検討は、先述の試験例のFADGDH活性の測定方法に準じて行った。
まず、アスペルギルス・オリゼまたはアスペルギルス・テレウス由来改変型FADGDHを約２Ｕ／ｍｌになるように酵素希釈液（５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて溶解したものを５０ｍｌ用意した。この酵素溶液を１．０ｍｌとしたものを２本用意した。コントロールには、夫々の改変型FADGDH（各種化合物の代わりに蒸留水０．１ｍｌを添加したものを２本用意した。
【００５３】
２本のうち、１本は４℃で保存し、もう１本は、５０℃、１５分間処理を施した。処理後、夫々のサンプルのＦＡＤＧＤＨ活性を測定した。各々、４℃で保存したものの酵素活性を１００として、５０℃、１５分間処理後の活性値を比較して活性残存率（％）として算出した。
【００５４】
実施例２：アスペルギルス・オリゼ由来FADGDH遺伝子への変異導入
野生型FADGDHをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50mg/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl；pH7.3）を摂取し、30℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として用いDiversifyTMPCR Ramdom Mutagenesis Kit(Clontech社製)を用いた変異処理をそのプロトコールに従って実施し、グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００５５】
実施例３：アスペルギルス・オリゼ由来改変型FADGDHを含む粗酵素液の調整
実施例２で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００５６】
実施例４：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例3の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、3種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら3種の改変体をコードするプラスミドをpAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4と命名した。
【００５７】
pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M1で配列番号２記載の162番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M2では167番目のセリンがプロリンに471番目のリジンがアルギニン、pAOGDH-M3では180番目のアラニンがグリシンに551番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M4では120番目のリジンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリンに369番目のリジンがアルギニンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
pAOGDH-S2のプラスミドを鋳型として、160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号3の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号4の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、162番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号5の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号6の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号7の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、165番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号8の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号9の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、167番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号10の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、168番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号11の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、169番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号12の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、170番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号13の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号14の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、172番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号15の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、329番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号16の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号17の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、331番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号18の合成オリゴヌクレオチド、551番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号19の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調整した。
【００６０】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００６１】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、16種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら16種の改変体をコードするプラスミドを、pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、pAOGDH-M19と命名した。
【００６２】
pAOGDH-M4、pAOGDH-M5、pAOGDH-M6、pAOGDH-M7、pAOGDH-M8、pAOGDH-M9、pAOGDH-M10、pAOGDH-M11、pAOGDH-M12、pAOGDH-M13、pAOGDH-M14、pAOGDH-M15、pAOGDH-M16 、pAOGDH-M17、pAOGDH-M18、pAOGDH-M19の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M5で配列番号２記載の160番目のグリシンがプロリン、pAOGDH-M6では163番目のグリシンがリジン、pAOGDH-M7では163番目のグリシンがロイシン、pAOGDH-M8では163番目のグリシンがアルギニン、pAOGDH-M9では167番目のセリンがアラニン、pAOGDH-M10では167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M11では167番目のセリンがアルギニン、pAOGDH-M12では167番目のセリンがバリン、pAOGDH-M13では171番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M14では551番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M15では551番目のバリンがシステイン、pAOGDH-M16では551番目のバリンがスレオニン、pAOGDH-M17では551番目のバリンがグルタミン、pAOGDH-M18では551番目のバリンがセリン、pAOGDH-M19では551番目のバリンがチロシンに置換されていることが確認された。結果を表2に示す。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例５；多重変異体の作製と熱安定性
pAOGDH-M10のプラスミドを鋳型として、160番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号20の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のトリプトファンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号21の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、162番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号22の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号23の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号24の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、165番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号25の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号26の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、168番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号27の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、169番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号28の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、170番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号29の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、171番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号30の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、172番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号31の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、329番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号32の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、330番目のロイシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号33の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、331番目のアラニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号34の合成オリゴヌクレオチド、551番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号35の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６５】
pAOGDH-M15のプラスミドを鋳型として、163番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号36の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００６６】
実施例４で調整したプラスミドで市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した後、実施例３と同様に粗酵素液を調製した。
【００６７】
上記の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、57種の熱安定性の向上した変異体を取得した。これら57種の改変体をコードするプラスミドを、pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39 pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76と命名した。
【００６８】
pAOGDH-M20、pAOGDH-M21、pAOGDH-M22、pAOGDH-M23、pAOGDH-M24、pAOGDH-M25、pAOGDH-M26、pAOGDH-M27、pAOGDH-M28、pAOGDH-M29、pAOGDH-M30、pAOGDH-M31、pAOGDH-M32、pAOGDH-M33、pAOGDH-M34、pAOGDH-M35、pAOGDH-M36、pAOGDH-M37、pAOGDH-M38、pAOGDH-M39 pAOGDH-M40、pAOGDH-M41、pAOGDH-M42、pAOGDH-M43、pAOGDH-M44、pAOGDH-M45、pAOGDH-M46、pAOGDH-M47、pAOGDH-M48、pAOGDH-M49、pAOGDH-M50、pAOGDH-M51、pAOGDH-M52、pAOGDH-M53、pAOGDH-M54、pAOGDH-M55、pAOGDH-M56、pAOGDH-M57、pAOGDH-M58、pAOGDH-M59、pAOGDH-M60、pAOGDH-M61、pAOGDH-M62、pAOGDH-M63、pAOGDH-M64、pAOGDH-M65、pAOGDH-M66、pAOGDH-M67、pAOGDH-M68、pAOGDH-M69、pAOGDH-M70、pAOGDH-M71、pAOGDH-M72、pAOGDH-M73、pAOGDH-M74、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer ; Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M20で配列番号２記載の160番目のグリシンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M21では160番目のグリシンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M22では160番目のグリシンがセリングルタミンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M23では160番目のグリシンがグルタミンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M24では162番目のセリンがアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M25では162番目のセリンがシステインに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M26では162番目のセリンがアスパラギン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M27では162番目のセリンがグルタミン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M28では162番目のセリンがフェニルアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M29では162番目のセリンがヒスチジンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M30では162番目のセリンがロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M31では163番目のグリシンがアスパラギン酸に167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M32では164番目のセリンがフェニルアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M33では164番目のセリンがスレオニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M34では164番目のセリンがチロシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M35では165番目のロイシンがアラニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M36では165番目のロイシンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M37では165番目のロイシンがアスパラギンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M38では165番目のロイシンがプロリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M39では165番目のロイシンがバリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M40では166番目のアラニンがシステインに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M41では166番目のアラニンがイソロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M42では166番目のアラニンがリジンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M43では166番目のアラニンがロイシンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M44では166番目のアラニンがメチオニンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M45では166番目のアラニンがプロリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M46では166番目のアラニンがセリンに167番目のセリンがプロリン、pAOGDH-M47では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがリジン、pAOGDH-M48では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがプロリン、pAOGDH-M49では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがチロシン、pAOGDH-M50では167番目のセリンがプロリンに169番目のアスパラギンがトリプトファン、pAOGDH-M51では167番目のセリンがプロリンに170番目のロイシンがシステイン、pAOGDH-M52では167番目のセリンがプロリンに170番目のロイシンがフェニルアラニン、pAOGDH-M53では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがイソロイシンに、pAOGDH-M54では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがリジン、pAOGDH-M55では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがメチオニン、pAOGDH-M56では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがグルタミン、pAOGDH-M57では167番目のセリンがプロリンに171番目のロイシンがバリン、pAOGDH-M58では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがアラニン、pAOGDH-M59では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがシステインに、pAOGDH-M60では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがグルタミン酸、pAOGDH-M61では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがイソロイシン、pAOGDH-M62では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがメチオニン、pAOGDH-M63では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがシステイン、pAOGDH-M64では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがグルタミン酸、pAOGDH-M65では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがトリプトファン、pAOGDH-M66では167番目のセリンがプロリンに172番目のバリンがにチロシン、pAOGDH-M67では167番目のセリンがプロリンに329番目のバリンがグルタミン、pAOGDH-M68では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがシステイン、pAOGDH-M69では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがアスパラギン酸、pAOGDH-M70では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがイソロイシン、pAOGDH-M71では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがリジンpAOGDH-M72では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがロイシン、AOGDH-M73では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがメチオニン、pAOGDH-M74では167番目のセリンがプロリンに331番目のアラニンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表3に示す。
【００６９】
【表３】
【００７０】
実施例６：アスペルギルス・オリゼ由来改変型FADGDHの取得
改変型FADGDH生産菌として、pAOGDH-M10、pAOGDH-M15、pAOGDH-M75、pAOGDH-M76で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、TB培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型FADGDHサンプルとした。表４に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００７１】
【表４】
【００７２】
実施例７：ｐＨ安定性
実施例６で得た精製標品についてｐＨ安定性を知るために、ｐＨ３．５〜８．５の範囲の緩衝液（ｐＨ３．５〜６．３：０．１M 酢酸バッファー、ｐＨ６．３〜７．３、０．１M ＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３〜８．５：０．１M トリス塩酸バッファー、ｐH６．０〜７．７：０．１M リン酸バッファー）を調製し、これらを用いて各ＧＤＨを酵素濃度１Ｕ／ｍｌとなるよう希釈した。希釈液を２５℃で１６時間インキュベートしてインキュベート前後の活性を比較した。インキュベート前の活性に対するインキュベート後の活性残存率を示したグラフを図１に示す。図１に示すようにpH安定域の幅が広がっていることが確認された。
【００７３】
実施例８：アスペルギルス・テレウス由来FADGDH遺伝子への変異導入
我々はアスペルギルス・オリゼ由来 GDH遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列情報を取得している。また、熱安定性を指標としたスクリーニングを実施し、熱安定性向上に効果のあるアミノ酸部位を同定している。そこで、アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨの推定アミノ酸配列をアラインさせ、アスペルギルス・テレウス由来ＧＤＨにおいて、アスペルギルス・オリゼＦＡＤＧＤＨで熱安定性向上に効果のあった部位に対応するアミノ残基を同定した。
【００７４】
実験例６で作製した組換えプラスミドpAtGDH-s2-7を鋳型として用い、116番目のリジンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、159番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、161番目のグルタミン酸を複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、164番目のアスパラギンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、166番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、167番目のスレオニンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、175番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、325番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、327番目のセリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、365番目のグルタミンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチド、547番目のバリンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5a；TOYOBO社製)を形質転換し、アンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩培養した。
【００７５】
実施例９：アスペルギルス・テレウス由来改変型FADGDHを含む粗酵素液の調整
得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００７６】
実施例１０：熱安定性が向上した変異体のスクリーニング
実施例９の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【００７７】
これらＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列については、DNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)により配列確認を実施した。加熱処理前の活性に対する加熱処理後の残存活性率（％）を表５に示した。この結果より、組換え体を用いて熱安定性が向上したアスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼを取得すること可能となった。
【００７８】
【表５】
【００７９】
また、種々の糖類に対する基質特異性については、上記の活性測定方法に従い、酵素活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とそれに代えて同じモル濃度の比較対象の糖類（例えばマルトース）を基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。
【００８０】
上記で得られた種々の変異体の基質特異性は良好であった。
【００８１】
実施例１１：FADGDH遺伝子への変異導入
野生型FADGDHをコードする遺伝子（配列番号１）を含む組み換えプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリン(50・g/ml;ナカライテスク社製)を含んだ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl；pH7.3）を摂取し、30℃で一晩振とう培養して得られた菌体から、常法によりプラスミドを調整した。該プラスミドを鋳型として５３番目のグリシンを複数種のアミノ酸に置換するよう設計した配列番号４９の合成オリゴヌクレオチドとそれに相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、QuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って、変異操作を行い、 グルコースデヒドロゲナーゼの生産能を有する、改変型FADGDH変異プラスミドを作製し、上記方法により同様にプラスミドを調製した。
【００８２】
実施例１２：改変型FADGDHを含む粗酵素液の調製
実施例２で調整したプラスミドpAOGDH-S2で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した後、形質転換体をアンピシリンを含んだ寒天培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.5%寒天；pH7.3）に塗布した後、30℃で一晩振とう培養して得られたコロニーをさらにアンピシリン(100μg/ml)を含んだLB液体培地に摂取し、30℃で一晩振とう培養した。その培養液の一部から遠心分離によって得られた菌体を回収し、50mMのリン酸緩衝液(pH7.0)中でガラスビーズで該菌体を破砕することにより粗酵素液を調製した。
【００８３】
実施例１３：基質特異性が向上した変異体のスクリーニング
実施例３の粗酵素液を用いて、上述した活性測定法によりグルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、７種の基質特異性が向上した変異体を取得した。これら７種の改変体をコードするプラスミドをpAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M５、pAOGDH-M６、pAOGDH-M７と命名した。
【００８４】
pAOGDH-M1、pAOGDH-M2、pAOGDH-M3、pAOGDH-M4、pAOGDH-M５、pAOGDH-M６、pAOGDH-M７の変異箇所を同定するためにDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M１で配列番号２記載の５３番目のグリシンがシステイン、pAOGDH-M２で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジン、pAOGDH-M３で配列番号２記載の５３番目のグリシンがリジン、pAOGDH-M４で配列番号２記載の５３番目のグリシンがメチオニン、pAOGDH-M５で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギン、pAOGDH-M６で配列番号２記載の５３番目のグリシンがスレオニン、pAOGDH-M７で配列番号２記載の５３番目のグリシンがバリンに置換されていることが確認された。結果を表１に示す。
【００８５】
【表６】
【００８６】
実施例１４：基質特異性、及び/または、熱安定性が向上した変異体の作製
実施例１３で調整したプラスミドpAOGDH-M2を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH-M５を鋳型として、１６４番目のセリンをプロリンに置換するよう設計した配列番号５０の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、pAOGDH-M2を鋳型として、１６３番目のグリシンをアルギニンに置換するよう設計した配列番号５１の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチド、さらに５５１番目のバリンをシステインに置換するよう設計した配列番号５２の合成オリゴヌクレオチドと、それに相補的な合成オリゴヌクレオチドをもとに実施例２の方法と同様に変異操作を行い、基質特異性、及び/または、熱安定性に優れた改変型FADGDHを作製し上記の方法と同様にプラスミドを調整した。変異箇所を同定するため実施例４の方法と同様にDNAシークエンサー(ABI PRISMTM 3700DNA Analyzer;Perkin-Elmer製)でグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した結果、pAOGDH-M８で配列番号２記載の５３番目のグリシンがヒスチジンに、１６７番目のセリンがプロリンに、pAOGDH-M９で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６７番目のセリンがプロリンに、pAOGDH-M１０で配列番号２記載の５３番目のグリシンがアスパラギンに、１６３番目のグリシンがアルギニンに、５５１番目のバリンがシステインに置換していることが確認された。実施例４と同様の活性測定法により、グルコースならびにキシロースを基質として活性を測定したところ、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０は基質特異性が向上していることが確認された。熱安定性を測定するため実施例３の方法と同様に、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０の粗酵素液を調整し、上述した活性測定法によりグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した。また、同粗酵素液を50℃で15分間加熱処理した後、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定し、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０は熱安定性が向上していることが確認された。結果を表２に示す。
【００８７】
【表７】
【００８８】
実施例１５：改変型FADGDHの取得
改変型FADGDH生産菌として、pAOGDH-M８、pAOGDH-M９、pAOGDH-M１０で市販の大腸菌コンピテントセル(E.coli DH5・；TOYOBO社製)を形質転換した。得られた形質転換体を１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、TB培地に培養温度２５℃で２４時間培養した。培養菌体を遠心分離で集めた後、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に懸濁し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。これに硫酸アンモニウムを飽和量溶解させて目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．５）に再溶解させた。そしてＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過、Ｏｃｔｙｌ−セファロースカラムおよびＰｈｅｎｙｌ−セファロースカラムによる疎水クロマト（溶出条件は共に２５％飽和〜０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ−２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し改変型FADGDHサンプルとした。表３に示すように精製標品においても熱安定性が向上していることが確認された。
【００８９】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、ＦＡＤ−ＧＤＨにおいて熱安定性向上に関与しているアミノ酸残基を見出すことができ、あらゆる属、種のＦＡＤ−ＧＤＨにもあてはまる可能が示された。また、本発明によるＦＡＤＧＤＨの安定性の向上は、グルコース測定試薬、グルコースアッセイキット及びグルコースセンサー作製時の酵素の熱失活を低減して、該酵素の使用量低減や測定精度の向上を可能にし、医療関連分野などの産業に貢献するところ大である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項２】
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における５３位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項３】
野生型のアスペルギルス・テレウス由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号４６において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位、からなる群のうちいずれか、もしくはそれと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
【請求項１】
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における１６３位および／または５５１位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項２】
野生型のアスペルギルス・オリゼ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号２のアミノ酸配列における５３位、もしくは、それと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項３】
野生型のアスペルギルス・テレウス由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）よりも熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨであって、配列番号４６において、１１６位、１５９位、１６１位、１６４位、１６６位、１６７位、１７５位、３２５位、３２７位、３６５位及び５４７位、からなる群のうちいずれか、もしくはそれと同等の位置においてアミノ酸置換を有する、熱安定性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース測定法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２３７２１０（Ｐ２００８−２３７２１０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９３３２５（Ｐ２００７−２９３３２５）
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１２日（２００７．１１．１２）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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