放射能標識のための［１８Ｆ］ＳＦＢの単純化ワンポット合成
【課題】［18Ｆ］ＳＦＢ合成を改良し簡略化する。
【解決手段】［18Ｆ］ＳＦＢの非水性単一ポット合成が説明される。この方法で生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次に例えばペプチドまたは改変抗体断片（ダイアボディ）を標識し、これは注射可能な組成物としての標識化合物の代表例であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的として、動物またはヒト内の病的組織、具体的には腫瘍を、ＰＥＴスキャンを使用して特定するために使用される。
【解決手段】［18Ｆ］ＳＦＢの非水性単一ポット合成が説明される。この方法で生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次に例えばペプチドまたは改変抗体断片（ダイアボディ）を標識し、これは注射可能な組成物としての標識化合物の代表例であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的として、動物またはヒト内の病的組織、具体的には腫瘍を、ＰＥＴスキャンを使用して特定するために使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００８年９月１６日に提出された米国仮出願シリアル番号６１／０９７，４６３および２００８年１１月２０日に提出された米国仮出願シリアル番号６１／１１６，５２７からの利益が請求される。この発明は、エネルギー省（ＤＯＥ）によって与えられた許可番号ＤＥ−ＦＧ０２−０６ＥＲ６４２４９および国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた許可番号Ｐ５０ＣＡ０８６３０６の政府支援でなされた。連邦政府エネルギー省（ＤＯＥ）および国立衛生研究所（ＮＩＨ）は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
無水鹸化法を使用した18Ｆ標識部分、および人体を含む動物内の病変組織を標的にする際に使用される、Ｆ−１８で標識された生体分子の調製が説明される。
【背景技術】
【０００３】
ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）は、強力な非侵襲性分子撮像技術であり、これは、体積および標的深さに独立した方式で、体内での生理学的相互作用を視覚化および定量化するのに十分な感度を提供する。ＰＥＴは、癌、心血管疾患、および神経変性病等の種々の疾患を非侵襲的に検出するのに臨床的に広く使用されている。特定の陽電子放射標識された分子プローブを用いて、ＰＥＴは生命体の特定の生理学的および生化学的機能の状態を解明することができる。このシステムは、陽電子放出の場合に、互いに約１８０度で放射されたガンマ線の対を検出する。得られた情報により、トレーサー位置および濃度の三次元画像が数学的に再構築されて、対象となる体内の生物学的システムの生理学的および機能的変化を視覚化することが可能である。
【０００４】
ＰＥＴトレーサーは、短命の陽電子放出同位体で標識された化学的および／または生物学的分子である。ＰＥＴトレーサーは、スキャンの直前に動物または人間に注射される。トレーサーは体内を通って標的部位に到達し、その放射位置は、標的受容体濃度、標的タンパク質分布または放射能標識された分子の代謝のような特定の生物学的機能についての情報を解明する。体内での生物学的メカニズムに従って異なる生物学的標的と相互作用する種々のＰＥＴトレーサーが開発されている。それらの幾つかは、臨床的に利用可能となっており、18Ｆ−標識されたＰＥＴトレーサー（例えば［18Ｆ］ＦＤＧ、［18Ｆ］ＦＬＴ、および［18Ｆ］ＦＤＯＰＡ）および11Ｃ−標識されたＰＥＴトレーサー（例えば［11Ｃ］アセテート、［11Ｃ］コリン、および［11Ｃ］メチオニン）のように、病気の診断および治療効果の監視に有益であることが分かっている。
【０００５】
入手可能なＰＥＴ放射性核種の中で、フッ素−１８（Ｆ−１８）が臨床の場で最も広く使用されている。Ｃ−１１の半減期は非常に短い（２０．４分間しかない）が、Ｆ−１８はより長い半減期（１１０分間）を有する。Ｆ−１８標識された化合物がより望ましい。なぜなら、このより長い半減期が、数時間続くことのある生体内の生物学的研究だけでなく、多工程の放射化学的操作をも可能にするからである。これらの特有の構成は、生物医学的サイクロトロンを使用したその大量生成の容易性、Ｆ−１８を所望の構造内に組み込むための十分に確立された合成方法、およびその低い陽電子エネルギーによる結果画像の高い空間分解能ゆえに、フッ素−１８をＰＥＴ撮像にとって非常に魅力的な同位体にする。加えて、その多量の陽電子存在量および準単色放射は、単純化された検出、データ加工およびより高感度につながる。Ｆ−１８は新規なＰＥＴトレーサーの開発にも好ましい。なぜなら、それが高い比活性度で利用可能だからである。フッ素−１８化学の汎用性は、少量の有機分子を起源とした大量の有用なＰＥＴトレーサーをもたらすだけでなく、タンパク質またはペプチド（アネキシンＶ、ＶＩＰ、ＲＧＤ、抗−ＣＥＡダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）等）等の一定の高特異性標的生体分子を貴重なＰＥＴトレーサーに変換する可能性をも有する。
【０００６】
ペプチド、タンパク質、抗体、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）およびその他のような生体分子は、ＰＥＴトレーサーの役割として重要性を獲得している。それらは、例えばＦ−１８等の陽電子放射体で一度標識されると、潜在的な治療としてだけでなく、ＰＥＴ撮像プローブとしても役立つ。放射能標識された生体分子を生体内の標的受容体−（過剰）発現組織に適用する概念は、腫瘍病巣を可視化するための非常に有益な診断ツールとして免疫（Ｉｍｍｕｎｏ）ＰＥＴに新しいアプローチを開いている。しかしながら、通常は大抵の生物学的試料と相容れない直接的な放射性フッ化法を伴う過酷な化学的条件のため、放射性核種でタグを付けられた補欠分子族を生体分子内に組み込むことが選択法となる。
【０００７】
しかしながら、図面において［18Ｆ］４としても同定されているＮ−スクシンイミジル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）等の適当な標識タグの利用可能性が制限されていることにより、18Ｆ−標識されたペプチドおよびタンパク質のような生体分子の、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）への幅広い使用が妨げられている。［18Ｆ］ＳＦＢは、生体分子の一級アミンと反応することができるため、それは、生体内での安定性および放射能標識収量の観点で、ペプチド、タンパク質、および抗体を放射能標識するための適当かつ万能な18Ｆ−補欠分子族であることが実証されている。しかしながら、先行技術で説明されているこの化合物を得るための長々とした合成法は、生体分子をＰＥＴプローブとして放射能標識するためのその幅広い使用を妨げている。［18Ｆ］ＳＦＢを調製する幾つかの先行する利用可能な代表的方法が、表１にまとめられている（図１）。
【０００８】
文献で説明されている［18Ｆ］ＳＦＢの放射化学合成のほとんどは、２から３の反応器および多重ＳＰＥまたはＨＰＬＣ精製を必要とする。図２を参照して、２つの先に説明された前駆体、（４−エトキシカルボニル−フェニル）トリメチルアンモニウムトリフラート（１ａ）（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）および（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−フェニル）トリメチルアンモニウムトリフラート（１ｂ）（非特許文献４；非特許文献５）が、放射化学的収量（ＲＣＹ）および放射化学的純度と同様に化学的純度の観点で比較された。この比較は、両方の経路における脱保護工程の後で繰り返された。１ａの使用が１ｂよりも優れていることが見出された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｅｓｔｅｒ ＨＪ、Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ Ｍ．ペプチドおよびタンパク質のフッ素−１８標識）．ＰＥＴ化学−分子撮影における推進力、Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ ＰＡ（ｅｄ）、Ｌｅｈｍａｎｎ Ｌ（ｅｄ）、Ｆｉｅｂｅ Ｍ（ｅｄ）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、（２００７）
【非特許文献２】Ｈａｋａ ＭＳ、Ｋｉｌｂｏｕｒｎ ＭＲ、Ｗａｔｋｉｎｓ ＧＬ、Ｔｏｏｒｏｎｇｉａｎ ＳＡ．Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ；７：ｐ８２３−８３３（１９８９）
【非特許文献３】Ｇｕｈｌｋｅ Ｓ、Ｃｏｅｎｅｎ ＨＨ、Ｓｔｏｃｋｌｉｎ Ｇ．Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔ；４５、ｐ７１５−７２７（１９９４）
【非特許文献４】Ｗｅｓｔｅｒ ＨＪ、Ｈａｍａｃｈｅｒ Ｋ、Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ Ｇ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ２３、ｐ３６５−３７２（１９９６）
【非特許文献５】Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ ＥＤ、Ｅｄｗａｒｄｓ ＷＢ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＣＪ、Ｗｅｌｃｈ ＭＪ Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、４２、ｐＳ７２０−Ｓ７２２（１９９９）
【非特許文献６】Ｋａｂａｌｋａ Ｇ、Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、５１、ｐ６８−７１（２００８）
【非特許文献７】Ｃａｒｒｏｌｌ Ｍ、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ、４９（Ｓ）：ｐ２９８Ｐ（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
種々の半自動化合成器でモジュール補助された［18Ｆ］ＳＦＢ生成が報告されているが、その一般的な使用には未だ幾つかの欠点がある。特に、Ｗｅｓｔｅｒら６．（非特許文献１；非特許文献４）により公にされているように、２つの固相抽出（ＳＰＥ）工程を３つの異なるカートリッジで行うために必要なものは、非常に多くのことを要求する。種々の実施は、ＳＰＥ工程を行う市販の合成器の修正を含む。これらのハードウェアおよびソフトウェアの変更は、エンジニアリングの専門知識を欠いている研究所および工場がその方法を繰り返すことを困難にしている。近時、Ｋａｂａｌｋａら（非特許文献６）は、３工程、ワンポット法に基づく［18Ｆ］ＳＦＢの効率的な調製を説明した。その全工程は約６０分間で行われ、脱保護／加水分解工程は水性テトラプロピルアンモニウム水酸化物溶液で行われる。続いて時間消費する共沸乾燥が水性試薬の利用のため必要である。Ｃａｒｒｏｌｌらによって公にされたもう１つのアプローチ（非特許文献７）は、ヨードニウム塩前駆体を利用して［18Ｆ］ＳＦＢを１工程、ワンポット法で調製することである。これは非常に魅力的な経路であるが、全収量が低く前駆体も不安定である。それゆえ、［18Ｆ］ＳＦＢ合成の更なる改良および単純化は、自動化法での使用に非常に有益となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
［18Ｆ］ＳＦＢの非水性単一ポット合成が説明される。この方法で生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次に例えばペプチドまたは改変抗体断片（ダイアボディ）を標識し、これは注射可能な組成物としての標識化合物の代表例であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的として、動物またはヒト内の病的組織、具体的には腫瘍を、ＰＥＴスキャンを使用して特定するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５つの異なる前駆体を異なる調製工程で用いた先行技術の反応の特徴を比較した表である。
【図２】［18Ｆ］ＳＦＢを調製するために使用される４つの代表的な反応スキームを示す。
【図３】本発明の特徴を組み込んだワンポット法を使用した［18Ｆ］ＳＦＢの合成の反応を説明している。
【図４】図３に示された合成に従って調製された［18Ｆ］ＳＦＢの分析を描いた液体ＨＰＬＣおよび放射−ＴＬＣ（より小さい挿入グラフ）クロマトグラムを示す。
【図５】［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢ−標識されたＨＥＲ２−標的ペプチドの反応混合物のＵＶ（上方のグラフ）および放射性ＨＰＬＣ（下方のグラフ）図を示す。
【図６】マイクロスピンカラム精製前の［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢ−標識された抗−ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラムである。放射能は上方の曲線で示されている；下方の曲線はＵＶ−トレースである。
【図７】マイクロスピンカラム精製後の［18Ｆ］ＦＢ−標識された抗−ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラムである。放射能は上方の曲線で示されている；下方の曲線はＵＶ−トレースである。
【図８】ＭＣＦ７−ＨＥＲ２異種移植片中で［18Ｆ］ＦＢ−標識されたＨＥＲ２標的ペプチド（左側の像）（２時間注射後）および抗−ＨＥＲ２ダイアボディ（右側の像）（４時間注射後）を使用したマウスの免疫ＰＥＴ／ＣＴである。
【図９】ＭＣＦ７−ＨＥＲ２異種移植片（冠状（頂部）および横断（底部））を担持したヌードマウスの１時間動的スキャンのマイクロ−ＰＥＴ／ＣＴ像の各セットの時系列である。像枠の時間が秒で示されている。三角形の印は腫瘍の位置を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
典型的な先行技術の［18Ｆ］ＳＦＢ放射能合成は、約９０〜１２０分間の全合成時間で３つの工程を含む。最終的な生体分子トレーサーの追加的な標識および精製は、全工程を時間消費させるとともに非常に複雑にする。放射化学設備にアクセスできる個人および放射化学の専門知識を有する職員だけが、［18Ｆ］ＳＦＢを日常的に使用して研究を行うことができる。［18Ｆ］ＳＦＢの合成への先行技術の一般的なアプローチは、１または２の反応器で行われ得る。しかしながら、公にされている方法のほとんどは、幾つかのカートリッジまたはＨＰＬＣ精製工程を必要とする。加えて、共沸蒸留乾燥工程がたいていの方法に必要となるが、これは水溶液が脱保護／鹸化反応のために一般に使用されるからである。Ｋａｂａｌｋａらにより説明された単一容器の方法において、容器は、活性／Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル形成の前に、共沸乾燥を使用して洗浄され湿気除去されなければならない。短い合成時間および同等の放射化学的収量での［18Ｆ］ＳＦＢの単純合成がそれゆえ非常に望ましい。
【００１４】
従来説明されている全ての放射能合成は、主たる中間アルキル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートの脱保護のために、水性塩基性溶液を使用して、対応する４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを得ている。この溶液中の水は、次に続く［18Ｆ］ＳＦＢを形成するために使用されるＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）との反応と相容れない。それゆえ反応混合物は乾燥させなければならない。これはＳＰＥの溶出液の共沸蒸留またはそれを硫酸ナトリウムカートリッジに通すことにより通常達成される。
【００１５】
ここで説明されるのは、これらの全てのアプローチに適用され得るエチル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（「18Ｆ」２）の脱保護戦略のための無水系である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）の利用は、水の必要性を無くし、得られた溶液の最終的な塩基性は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分とＴＳＴＵとのカップリングを触媒するのに十分である。
【００１６】
生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次にＭｅｒｃｋ ＥＮカートリッジでＳＰＥにより精製され、ジエチルエーテルで溶出され得る。溶媒の蒸発の後、［18Ｆ］ＳＦＢは水性緩衝液内で溶解され、ペプチドまたはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）の溶液が標識用に添加される。ここで説明される発明に従って標識された短ペプチドのために、放射性トレーサーの精製が逆相ＨＰＬＣを介して標準的な分取用Ｃ１８カラムで行われ、生成物溶液の体積が回転蒸留によって減少される。ダイアボディのために、精製はマイクロスピンカラムを使用して行われる。溶出は体内または体外の研究に直接使用される。
【００１７】
従来の水性反応スキームとは対照的に、本発明は効率的な無水脱保護方法を含み、［18Ｆ］ＳＦＢ合成は、中間の共沸乾燥の必要性無しで単一の反応器内で行われ得るようになっている。加えて、適用された塩基は、［18Ｆ］３の最終的な活性化をすぐに触媒することができる。本発明によって改良された先に公にされた方法の幾つかの特徴は、（１）無水試薬を脱保護工程に適用し、これにより中間化合物のＳＰＥ分離および蒸発による溶媒の対応する除去の必要性を排除し、（２）マイクロ波エネルギーを使用して反応を促進し合成時間を短縮することである。
【００１８】
本発明の特徴を組み入れた放射能合成方法は、図３に示された反応スキームで描かれる方法に従う。炭酸イオンが塩基として存在する状態で、エチル４−トリメチル−アンモニウム−ベンゾアートトリフラート１ａのようなアルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート前駆体を、［18Ｆ］フッ化物の乾燥カリウム−クリプトフィクス（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）−２．２．２錯塩とＤＭＳＯ中で１００℃で１５分間反応させる。適当なアルキル基の例は、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ベンジル等を含むがこれらに限定されず、適当なアリール基の例は、フェニルまたは置換フェニルを含むがこれらに限定されない。クリプトフィクス系の代替として、炭酸セシウムを［18Ｆ］フッ化物のための活性対イオンの源として使用することができ、それは塩基としても働いて標識および活性反応を可能にすることができる。放射性フッ化が完了した後、塩基性無水／非プロトン性溶媒を添加し、反応容器を再加熱する。適当な無水／非プロトン性溶媒の例は、無水ＤＭＳＯ中のｔ−ＢｕＯＫ、ＤＭＦまたはピリジン中のＬｉＣｌ、ＤＭＳＯ中のＮａＣＮ、ＫＯ2、ベンゼン中の１８−クラウン−６、ＥｔＯＡｃ中のＬｉＩ、ＭｅＣＮ中のＴＭＳＣｌまたはＮａＩ、トルエン中のＭｇＩ2、およびベンゼン中の（Ｂｕ3Ｓｎ）2Ｏを含むがこれらに限定されない。脱保護工程を１００℃で１０分間行う。最後に、活性化剤、たとえばアセトニトリル中のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、（ＭｅＣＮ中のＴＳＴＵ）の溶液を、反応混合物を含んだ４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートに添加する。９０℃で１０分間加熱した後、［18Ｆ］ＳＦＢを得る。加えて、全工程がマイクロ波エネルギー／加熱を利用することによりさらに短縮化し高速化される（図３のスキーム（ｂ）を参照）。
【００１９】
一度［18Ｆ］ＳＦＢを形成すると、それはペプチドまたはタンパク質を標識するのに使用され得る。例として、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的にする短ペプチドの標識が以下に説明される。
【００２０】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、重要な生体指標化合物である。なぜなら、それが乳癌に顕著な割合で過剰発現されるからである。文献で報告されているのは、短ペプチド鎖（ＫＣＣＹＳＬ）が体内および体外の両方でＨＥＲ２に特定的に結合し得ることである。この場合ペプチドを、マウス内での単格子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のため、インジウム−１１１を具備したキレートリンカーにより放射能標識した。ＨＥＲ２を［18Ｆ］ＳＦＢで標識するために、アミノ酸鎖ＫＧＳＧを結合部分ＫＣＣＹＳＬに添加して、フッ素−１８標識のためのアンカーを提供した。フッ素−１８は、［18Ｆ］ＳＦＢと分子内のレジンの一級アミンとの反応によりこのアンカーに結合して、アミド結合を形成することができる。この反応は生体分子の放射性フッ化のための選択法であることがわかった。
【００２１】
説明された［18Ｆ］ＳＦＢの放射能合成の新規な特徴は、２つのＳＰＥユニットおよび中間の１つの乾燥工程を置き換えてその全体の複雑化を大幅に減少させる無水脱保護戦略である。短縮された全合成時間は、増加した比放射能を有する最終的なプローブともなり、これは標識されたプローブで行われる分析または撮像の質に影響を与える重要な変数である。放射化学者は、かなり低いレベルの開始放射能で作業をすることも可能であり、それでも同じ最終活性レベルを達成することができる（放射性崩壊の時間が減少されるからである）。減少した複雑性は、広い層の調査員がこのプローブをルーチンベースで使用することも可能にする。更に、より単純な合成は、自動化するのにさらにより容易である。加えて、マイクロ波モジュールの使用は、この重要なフッ素−１８標識タグの迅速かつ高い信頼性の自動化生成を可能にする。
【００２２】
修正された方法が最適化された条件で操作されることは、［18Ｆ］ＳＦＢのＲＣＹおよび放射化学的純度につながり、これは従来の工程のために文献で説明されたものと少なくとも同等である。加えて、［18Ｆ］ＳＦＢの化学的純度が最適化されて、図４に示されたＵＶ吸収曲線および高性能液体（ＨＰＬ）クロマトグラムを提供する。放射化学的収量および純度の改善の他に、工程の自動化は、使用される放射能の量の増大を可能とし、［18Ｆ］ＳＦＢをよりアクセスしやすくする。より多くの放射能の量が必要であるのは、［18Ｆ］ＳＦＢが生体分子の放射能標識のための唯一の18Ｆタグであり、生体分子の最終的な標識工程がしばしば低い放射化学的収量を示すからである。加えて、説明された工程は、顕著な再現性を有し、［18Ｆ］ＳＦＢルーチン生成のために高い信頼性で使用され得る。
【００２３】
改良され簡略化された合成は、［18Ｆ］ＳＦＢのルーチン生成を放射化学者でない者にとって更により実用的かつ魅力的にする。もし［18Ｆ］ＳＦＢがより広く利用可能で使用され得るなら、18Ｆで標識された生体分子を研究ツールとして使用した生物学的発見および臨床研究は、活発になると思われる。多くの生物学者および臨床家は、様々な生体分子に18Ｆ−標識を組み込む能力から利益を得ることができるだろう。加えて、ＰＥＴＮＥＴのような市販の放射性医薬は、既に安価なＦ−１８イオンのネットワーク源を提供しており、ここで説明された方法から［18Ｆ］ＳＦＢを作製する自動化されたアプローチと組み合わせて、その使用は大幅に拡大され得る。ここで説明された方法は、［18Ｆ］ＳＦＢ合成を行う全自動化システムに適用されることが可能であり、動物または人間の臨床前および臨床研究のための種々の18Ｆ−標識された生物学的プローブの開発に繋がり得る。
【実施例】
【００２４】
実施例１：慣習的な加熱を使用したＮ−スクシンイミジル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）のワンポット合成
キャリア未添加の［18Ｆ］フッ化物を、ＲＤＳ−１１２サイクロトロン（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用した１１ＭｅＶプロトン線の９７％18Ｏ濃縮水の放射により、核反応18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆから生成した。［18Ｏ］Ｈ2Ｏ内の水性［18Ｆ］フッ化物溶液１０から５０μｌ（３７〜３７０ＭＢｑ）を、クリプトフィクス２２２（Ｋ222）１０ｍｇ（２６．６μｍｏｌ）と混合し、１Ｍ水性Ｋ2ＣＯ3溶液１３μｌおよび無水ＭｅＣＮ（ｂｉｏｔｅｃｈ ｇｒａｄｅ：生物工学品質）１ｍｌを、次に９０℃に余熱された油浴内のシリコン隔壁で閉鎖されたＶ−バイアル瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ））内に添加した。混合溶液を９０℃で５分間加熱し、真空吸引（８００ｍｂａｒ）を行って混合物が乾くまで共沸蒸発により水を取り除いた。室温まで冷却した後、無水ＭｅＣＮ１ｍｌをバイアル瓶内に添加し、上記と同じ条件を使用して共沸蒸発を繰り返して、無水（［Ｋ⊂２．２．２］18［Ｆ］Ｆ塩を生成した。この標識工程の放射化学的収量は、２０分の蒸発の後で８０および９０％の間である。
【００２５】
室温に冷却した後、無水ＤＭＳＯ（３００μｌ）０．３ｍｌのエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート３ｍｇを、乾燥したＫ222／［18Ｆ］Ｆを含むバイアル瓶内に添加し、その混合物を１００℃で１５分間加熱してエチル４［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した。冷却後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌ内のｔ−ＢｕＯＫ１０ｍｇ（８９．１μｍｏｌ)をバイアル瓶中に添加して、１００℃で１０分間加熱し、エチルエステルの脱保護を行ってカリウム４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した(脱保護工程)。冷却後、無水ＭｅＣＮ２．５ｍｌ中のＴＳＴＵ２０ｍｇの溶液を添加し、次に９０℃で１０分間加熱して、［18Ｆ］ＳＦＢを生成した(カップリング工程)。冷却後、５％水性酢酸１ｍｌを、バイアル瓶内に注入して反応を停止させ、次に全反応混合物を、５％水性ＡｃＯＨ８ｍｌを含んだ２５ｍｌの注入器へ、正圧(１５〜２０ｐｓｉ)の窒素下で移送して、混合物を希釈した。希釈された溶液を、正圧（５〜１０ｐｓｉ）のＮ2下で、ＥｔＯＨ１０ｍｌおよび５％水性ＡｃＯＨ１０ｍｌであらかじめ調製されたＭｅｒｃｋ ＥＮカートリッジ（２００ｍｇ）を通過させた。カートリッジを、次にＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ／（ｖ／ｖ、１／２)１０ｍｌの混合溶媒を使用して洗浄した。最後に、捕捉された［18Ｆ］ＳＦＢを、エチルエーテル３ｍｌを使用してカートリッジから溶出し、水浴（３０℃）内に置いたもう１つのＶ−バイアル瓶内に収集した。エーテル溶媒をＮ2の軟風および攪拌で除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００から２００μｌをエーテル除去後に残っている組成物に添加して［18Ｆ］ＳＦＢを再溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の［18Ｆ］ＳＦＢの最終的な溶液を、ＨＥＲ−２標的ペプチドまたはＨＥＲ−２ダイアボディのその後の標識のために直接使用した。
【００２６】
上記の記載は、複数の操作条件うちの１組を説明している。当業者は、これらの複数の操作条件が変更されて反応の各工程を最適化することが可能であり、これらの操作条件の変更は最終生成物の収量および品質に僅かな相違しかもたらさないことを理解するだろう。例えば、この実施例１の操作条件に関して、代替的な反応温度および時間は、標識について５〜１５分間で９０〜１００℃であり、脱保護は約５〜１０分間で約９０℃から約１００℃であり、カップリング工程は約９〜１０分間で８５℃〜９０℃で行われる。更に、他の弱酸性水溶液を５％水性酢酸に変えて使用することが可能であり、溶出剤はエチルエーテル以外の有機溶媒とすることができる。
【００２７】
実施例２：マイクロ波加熱からの［18Ｆ］ＳＦＢのワンポット合成
市場で入手可能なマイクロ波システム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ；ＣＥＭ，Ｍａｔｔｈｅｗ，ＮＣ）のマイクロ波空洞を、５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎ Ｖ−バイアル瓶を受容するように修正した。このバイアル瓶は、磁気攪拌棒およびバイアル瓶内に延在する管類の接続部を備えたＰＥＥＫ蓋を具備している。この遠隔制御された放射化学的設備は、７つの電気的にスイッチされるソレノイド弁を利用しており、これらを１／１６”テフロン管類を通したＰＥＥＫアダプタによってＶ−バイアル瓶に接続した。３つの弁を使用して、ルアーアダプタを具備した管類を通して試薬の搬送を制御した。溶液出口として役立つ１つのポートが管類を具備していて、そのポートがバイアル瓶の底に延在した。もう１つのポートはバイアル瓶の通気を提供する。残りのポートの１つは圧力下の窒素に接続されていて、第２の残りのポートが真空ポンプに接続されている。マイクロ波空洞を制御するために、ＣＥＭ Ｓｙｎｅｒｇｙソフトウェアを使用した。
【００２８】
［18Ｈ2Ｏ］内の水性［18Ｆ］フッ化物溶液１０から５０μｌを、クリプトフィクス２２２（Ｋ222）１０ｍｇ（２６．６μｍｏｌ）、１Ｍ水性Ｋ2ＣＯ3溶液１３μｌおよび無水ＭｅＣＮ１ｍｌと混合し、次にマイクロ波空洞内に置いたＶ−バイアル瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ）内に移送した。真空を混合溶液に与えて、これを、マイクロ波合成器（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）を使用して３分間２０Ｗ出力にさらして、共沸蒸発により水を除去した。冷却空気の強風を使用して室温に冷却した後、無水ＭｅＣＮ１ｍｌをバイアル瓶に添加した。共沸蒸発を、同じ条件を使用して再度繰り返して、無水Ｋ222／［18Ｆ］Ｆ錯体を生成した。
【００２９】
室温に冷却した後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌ内のエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート３ｍｇを乾燥したＫ222／［18Ｆ］Ｆのバイアル瓶内に添加し、その混合物を１分間５０Ｗのマイクロ波エネルギーにさらしてエチル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した（標識工程）。冷却後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌに溶解されたｔ−ＢｕＯＫ１０ｍｇ（８９．１μｍｏｌ）をバイアル瓶に添加し、１分間４０Ｗ出力にさらして脱保護工程を行い、カリウム４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した。冷却後、無水ＭｅＣＮ２．５ｍｌ内のＴＳＴＵ２０ｍｇの溶液をバイアル瓶に添加し、次に２分間３０Ｗ出力にさらしてカップリング反応を行い、［18Ｆ］ＳＦＢを生成した。冷却後、５％水性酢酸１ｍｌをバイアル瓶内に注入して反応を停止させ、次に混合物を希釈し、全反応混合物を正圧（１５〜２０ｐｓｉ）の窒素下で５％水性ＡｃＯＨ８ｍｌをも含む２５ｍｌ注入容器内に移送した。希釈された溶液を、正圧（５〜１０ｐｓｉ）のＮ2下で、ＥｔＯＨ１０ｍｌおよび５％水性ＡｃＯＨ１０ｍｌであらかじめ調製されたＥＮカートリッジ（Ｍｅｒｃｋ）を通過させた。カートリッジをＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ，１／２）混合溶媒１０ｍｌを使用して洗浄した。最後に、カートリッジに捕捉された［18Ｆ］ＳＦＢを、エチルエーテル３ｍｌを使用して溶出し、水浴（３０℃）内に置いたもう１つのＶ−バイアル瓶内に収集した。エーテル溶媒をＮ2の軟風および攪拌により除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００から２００μｌをエーテルの除去後に残っている残渣に添加して［18Ｆ］ＳＦＢを再溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の［18Ｆ］ＳＦＢの最終溶液を、次にペプチドまたはダイアボディの後続の標識のために使用した。
【００３０】
上記の説明は、複数の操作条件のうちの１つの組を説明したものである。当業者は、これらの条件が変更されて反応の各工程を最適化し得ること、およびこれらの操作条件の変更は最終生成物の収量および品質に僅かな相違しかもたらし得ないことを理解するだろう。例えば、この実施例２の操作条件に関して、反応容器に与えられるマイクロ波エネルギーおよび時間の代替的なレベルは、標識工程について１〜３分間で２０Ｗ〜６０Ｗであり、脱保護工程について約１分間で約４０Ｗ〜５０Ｗであり、カップリング工程は約２分間約３０〜４０Ｗで行われる。
【００３１】
実施例３：ＳＰＥ−精製された［18Ｆ］ＳＦＢを使用したＨＥＲ−２標的ペプチドの放射能標識
ペプチド標識のために、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）中の［18Ｆ］ＳＦＢを、ｐＨ８．５ホウ酸ナトリウム緩衝液内のＨＥＲ２標的ペプチド（ＫＧＳＧＫＣＣＹＳＬ、５ｍｇ／ｍＬ）またはそのスクランブルバージョン（ＫＧＳＧＫＹＬＣＳＣ）の溶液に、２つの溶液の体積比５：１で添加した。標識反応は４５分間行われた。最終生成物の放射‐ＨＰＬクロマトグラムに基づいて、対応する18Ｆ標識されたペプチドの全標識収量は約６０から約８０％である（図５）。反応混合物の一部を、次に半調製逆相放射性ＨＰＬＣシステム内に更なる精製のために注入した。ペプチド保持時間に相当する放射能トレース（ｒａｄｉｏｔｒａｃｅ）のピークを収集した。その後、溶液の全体積を遠隔制御されたマイクロロータリー蒸発器内で減少させて、それをマイクロＰＥＴ調査のために用意された食塩水で希釈した。
【００３２】
実施例４：ＳＰＥ−精製された［18Ｆ］ＳＦＢを使用した抗ＨＲＥ２ダイアボディの放射能標識
［18Ｆ］ＳＦＢを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５、５０ｍＭ）内の抗ＨＥＲ２ダイアボディ溶液（６００μＬ）に添加し、その反応を４５分間進行させた。放射能標識された複合体を、Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏｓｐｉｎ ６クロマトグラフィカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ホウ酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡状態に置いた遊離［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢＡから分離した。マイクロスピンカラム精製の前および後の、［18Ｆ］ＦＢ標識された抗ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラフィーが、それぞれ図６および図７に示されている。放射能が上方の曲線で示されており、下方の曲線はＵＶ−トレースである。スピンカラム分離を７５μＬ分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で行ったが、これは最大カラム体積であった。放射能標識されたダイアボディの追加の分割量を、Ｊｕｐｉｔｅｒ３００（Ｃ１８；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を使用して、サイズ排除ＨＰＬＣ精製にかけた。インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ；Ｂｉｏｄｅｘ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）を使用して、精製された［18Ｆ］ＦＢ標識されたダイアボディのマイクロリットルあたりの放射化学的収量および比活性度を決定した。１μＬの複合体をインスタント薄層クロマトグラフィーによって評価し、続いて生理食塩水内で流動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ストリップが半分（ボトム−バウンド放射能標識、トップ−フリー放射能標識）に切断され、ガンマカウンタ（Ｗｉｚａｒｄ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でカウントされた。
【００３３】
実施例５：マイクロ−ＰＥＴ調査
マイクロ−ＰＥＴ調査のために、複数の雌のヌードマウス（生後４から５週間）にエストラジオールペレットを２ヶ月間投与し、次にそれらの右脇腹の皮下に腫瘍細胞（ＭＣＦ−７およそ１０7細胞）を注射した。腫瘍がおよそ１０００ｍｍ3に成長した後、この異種移植片担持マウスに、麻酔ベッドにおいて酸素中のイソフルランで麻酔をかけ、次に上述の実施例３に従って生成された18Ｆ標識ＨＥＲ−２ペプチド、そのスクランブル類似体または上記実施例４に従って精製された18Ｆ標識されたダイアボディ（１００μＬ中４０〜８０μＣｉ）を、側尾静脈を介して注射した。ヌードマウスを、麻酔下でＭｉｃｒｏＰＥＴ Ｆｏｃｕｓ ２２０スキャナまたはＩｎｖｅｏｎ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）で撮影した。図８は注射後２時間および４時間で１０分間の静的捕捉を用いて得られた像を示す。腫瘍が囲まれて矢印で示されている。
【００３４】
図９に示されているのは、放射性トレーサーの尾静脈注射の直前に開始された１０ｓ時間枠を使用した動的撮像である。動的１０ｓ時間枠が注射後１０分間にわたって継続された。これらの次に、注射後１０分間で９回の５分間時間枠が開始された。像はフィルター逆投影またはＭＡＰ双方向再構築（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を使用して再構築された。実験の最後に、動物は７分間のスキャンのためにマイクロＣＴスキャナに移送された。
【００３５】
上記に説明されたように、Ｎ−スクシンイミジルエステル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）は、ＰＥＴスキャンのような診断法において放射能標識標的リガンドに潜在的に使用されて、人間を含む動物の体内の病変細胞を特定することが可能である化合物として良く知られている。このような例において、［18Ｆ］ＳＦＢはタンパク質のような生体分子に付着され、これは具体的には標的組織に付着される。一般的に言えば、［18Ｆ］ＳＦＢはアミノ酸の一級アミン残基と反応する。この［18Ｆ］ＳＦＢ標識された生体分子は、体内、典型的には血管内に、通常は注射により導入され、標的組織の部位に移動することを可能にし、これは次に放射能となり、放射能検出スキャンまたはプローブを使用して検知され得る。このように標識された生体分子の主たる使用は、ＰＥＴスキャンによる特定のために癌組織を標的にすることであるが、このような放射線放出生体分子の使用は制限されていない。体内の標的組織は、一度このように放射能標識された生体分子で標識されると、腹腔鏡法により導入されたまたはカテーテルチップ上の相互操作放射能検出プローブおよび低侵襲性プローブにより特定され得る。加えて、放射能標識された組織は癌組織に限定されず、アテローム硬化（ａｔｈｅｒｏｓｌｅｒｏｔｉｃ）プラークの堆積のような他の異常な生理条件と同様に、良性腫瘍および神経変性病と同様に血塊の特定を含んで良い。
【００３６】
ここで説明された発明は、［18Ｆ］ＳＦＢの調製、それに続くペプチドまたは組み換え型抗体断片の［18Ｆ］ＳＦＢによる標識、および体内の１または複数の腫瘍を特定するための18Ｆ標識された生体分子の使用の発明の特徴を組み入れた２つの実施例を提供するが、ここで説明された発明はそのように限定されない。
【００３７】
ペプチドまたはＨＥＲ２の標識は、標識された生体分子の例として提供されるが、他の生体分子は同様なやり方で［18Ｆ］ＳＦＢで標識され得る。例えば、［18Ｆ］ＳＦＢは、ウイルス、細胞、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、糖質、ポリマー、ナノワイヤおよびナノロッドを含むナノ粒子、および例えば一級アミンを含有する薬剤である小分子を標識するのに使用され得る。具体例は以下のものを含むがこれらに限定されない：
ａ）タンパク質− 抗−ＨＥＲ２／抗−ＥＧＦＲアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、抗ＨＥＲ２／抗−ＨＥＲ３ダイアボディ、アネキシンＶおよび抗−ＣＥＡダイアボディおよび抗−ＣＤ６６抗体；
ｂ）ペプチド− プロインスリン架橋ペプチド、Ｃ−ペプチド、エンドセリン−１、α−ＭＳＨ（α−メラニン細胞刺激ホルモン）およびその類似体、ニューロテンシン、ボンベシン（ＢＢＮ）およびその類似体、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）およびその類似体、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、ＢＢＮ−ＲＧＤヘテロ二量体、およびその類似体、δ―オピオイド受容体作動薬およびウロテンシン−ＩＩ；
ｃ）小分子− 前立腺特異的膜抗原および（ＰＳＭＡ）阻害剤
更に、実施例は［18Ｆ］ＳＦＢを調製するための非水性鹸化方法を説明しているが、当業者は、ここでの教示に基づいて他の放射能標識化合物が同様な調製技術を使用して調製されることが可能であり、これらの代替的な放射性化合物が次に使用されて上記されたのと同じやり方で生体分子を標識できることを理解するだろう。
【技術分野】
【０００１】
２００８年９月１６日に提出された米国仮出願シリアル番号６１／０９７，４６３および２００８年１１月２０日に提出された米国仮出願シリアル番号６１／１１６，５２７からの利益が請求される。この発明は、エネルギー省（ＤＯＥ）によって与えられた許可番号ＤＥ−ＦＧ０２−０６ＥＲ６４２４９および国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた許可番号Ｐ５０ＣＡ０８６３０６の政府支援でなされた。連邦政府エネルギー省（ＤＯＥ）および国立衛生研究所（ＮＩＨ）は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
無水鹸化法を使用した18Ｆ標識部分、および人体を含む動物内の病変組織を標的にする際に使用される、Ｆ−１８で標識された生体分子の調製が説明される。
【背景技術】
【０００３】
ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）は、強力な非侵襲性分子撮像技術であり、これは、体積および標的深さに独立した方式で、体内での生理学的相互作用を視覚化および定量化するのに十分な感度を提供する。ＰＥＴは、癌、心血管疾患、および神経変性病等の種々の疾患を非侵襲的に検出するのに臨床的に広く使用されている。特定の陽電子放射標識された分子プローブを用いて、ＰＥＴは生命体の特定の生理学的および生化学的機能の状態を解明することができる。このシステムは、陽電子放出の場合に、互いに約１８０度で放射されたガンマ線の対を検出する。得られた情報により、トレーサー位置および濃度の三次元画像が数学的に再構築されて、対象となる体内の生物学的システムの生理学的および機能的変化を視覚化することが可能である。
【０００４】
ＰＥＴトレーサーは、短命の陽電子放出同位体で標識された化学的および／または生物学的分子である。ＰＥＴトレーサーは、スキャンの直前に動物または人間に注射される。トレーサーは体内を通って標的部位に到達し、その放射位置は、標的受容体濃度、標的タンパク質分布または放射能標識された分子の代謝のような特定の生物学的機能についての情報を解明する。体内での生物学的メカニズムに従って異なる生物学的標的と相互作用する種々のＰＥＴトレーサーが開発されている。それらの幾つかは、臨床的に利用可能となっており、18Ｆ−標識されたＰＥＴトレーサー（例えば［18Ｆ］ＦＤＧ、［18Ｆ］ＦＬＴ、および［18Ｆ］ＦＤＯＰＡ）および11Ｃ−標識されたＰＥＴトレーサー（例えば［11Ｃ］アセテート、［11Ｃ］コリン、および［11Ｃ］メチオニン）のように、病気の診断および治療効果の監視に有益であることが分かっている。
【０００５】
入手可能なＰＥＴ放射性核種の中で、フッ素−１８（Ｆ−１８）が臨床の場で最も広く使用されている。Ｃ−１１の半減期は非常に短い（２０．４分間しかない）が、Ｆ−１８はより長い半減期（１１０分間）を有する。Ｆ−１８標識された化合物がより望ましい。なぜなら、このより長い半減期が、数時間続くことのある生体内の生物学的研究だけでなく、多工程の放射化学的操作をも可能にするからである。これらの特有の構成は、生物医学的サイクロトロンを使用したその大量生成の容易性、Ｆ−１８を所望の構造内に組み込むための十分に確立された合成方法、およびその低い陽電子エネルギーによる結果画像の高い空間分解能ゆえに、フッ素−１８をＰＥＴ撮像にとって非常に魅力的な同位体にする。加えて、その多量の陽電子存在量および準単色放射は、単純化された検出、データ加工およびより高感度につながる。Ｆ−１８は新規なＰＥＴトレーサーの開発にも好ましい。なぜなら、それが高い比活性度で利用可能だからである。フッ素−１８化学の汎用性は、少量の有機分子を起源とした大量の有用なＰＥＴトレーサーをもたらすだけでなく、タンパク質またはペプチド（アネキシンＶ、ＶＩＰ、ＲＧＤ、抗−ＣＥＡダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）等）等の一定の高特異性標的生体分子を貴重なＰＥＴトレーサーに変換する可能性をも有する。
【０００６】
ペプチド、タンパク質、抗体、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）およびその他のような生体分子は、ＰＥＴトレーサーの役割として重要性を獲得している。それらは、例えばＦ−１８等の陽電子放射体で一度標識されると、潜在的な治療としてだけでなく、ＰＥＴ撮像プローブとしても役立つ。放射能標識された生体分子を生体内の標的受容体−（過剰）発現組織に適用する概念は、腫瘍病巣を可視化するための非常に有益な診断ツールとして免疫（Ｉｍｍｕｎｏ）ＰＥＴに新しいアプローチを開いている。しかしながら、通常は大抵の生物学的試料と相容れない直接的な放射性フッ化法を伴う過酷な化学的条件のため、放射性核種でタグを付けられた補欠分子族を生体分子内に組み込むことが選択法となる。
【０００７】
しかしながら、図面において［18Ｆ］４としても同定されているＮ−スクシンイミジル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）等の適当な標識タグの利用可能性が制限されていることにより、18Ｆ−標識されたペプチドおよびタンパク質のような生体分子の、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）への幅広い使用が妨げられている。［18Ｆ］ＳＦＢは、生体分子の一級アミンと反応することができるため、それは、生体内での安定性および放射能標識収量の観点で、ペプチド、タンパク質、および抗体を放射能標識するための適当かつ万能な18Ｆ−補欠分子族であることが実証されている。しかしながら、先行技術で説明されているこの化合物を得るための長々とした合成法は、生体分子をＰＥＴプローブとして放射能標識するためのその幅広い使用を妨げている。［18Ｆ］ＳＦＢを調製する幾つかの先行する利用可能な代表的方法が、表１にまとめられている（図１）。
【０００８】
文献で説明されている［18Ｆ］ＳＦＢの放射化学合成のほとんどは、２から３の反応器および多重ＳＰＥまたはＨＰＬＣ精製を必要とする。図２を参照して、２つの先に説明された前駆体、（４−エトキシカルボニル−フェニル）トリメチルアンモニウムトリフラート（１ａ）（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）および（４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−フェニル）トリメチルアンモニウムトリフラート（１ｂ）（非特許文献４；非特許文献５）が、放射化学的収量（ＲＣＹ）および放射化学的純度と同様に化学的純度の観点で比較された。この比較は、両方の経路における脱保護工程の後で繰り返された。１ａの使用が１ｂよりも優れていることが見出された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｅｓｔｅｒ ＨＪ、Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ Ｍ．ペプチドおよびタンパク質のフッ素−１８標識）．ＰＥＴ化学−分子撮影における推進力、Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ ＰＡ（ｅｄ）、Ｌｅｈｍａｎｎ Ｌ（ｅｄ）、Ｆｉｅｂｅ Ｍ（ｅｄ）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、（２００７）
【非特許文献２】Ｈａｋａ ＭＳ、Ｋｉｌｂｏｕｒｎ ＭＲ、Ｗａｔｋｉｎｓ ＧＬ、Ｔｏｏｒｏｎｇｉａｎ ＳＡ．Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ；７：ｐ８２３−８３３（１９８９）
【非特許文献３】Ｇｕｈｌｋｅ Ｓ、Ｃｏｅｎｅｎ ＨＨ、Ｓｔｏｃｋｌｉｎ Ｇ．Ａｐｐｌ Ｒａｄｉａｔ Ｉｓｏｔ；４５、ｐ７１５−７２７（１９９４）
【非特許文献４】Ｗｅｓｔｅｒ ＨＪ、Ｈａｍａｃｈｅｒ Ｋ、Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ Ｇ．Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ２３、ｐ３６５−３７２（１９９６）
【非特許文献５】Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒ ＥＤ、Ｅｄｗａｒｄｓ ＷＢ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＣＪ、Ｗｅｌｃｈ ＭＪ Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、４２、ｐＳ７２０−Ｓ７２２（１９９９）
【非特許文献６】Ｋａｂａｌｋａ Ｇ、Ｊ Ｌａｂｅｌ Ｃｏｍｐｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、５１、ｐ６８−７１（２００８）
【非特許文献７】Ｃａｒｒｏｌｌ Ｍ、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ、４９（Ｓ）：ｐ２９８Ｐ（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
種々の半自動化合成器でモジュール補助された［18Ｆ］ＳＦＢ生成が報告されているが、その一般的な使用には未だ幾つかの欠点がある。特に、Ｗｅｓｔｅｒら６．（非特許文献１；非特許文献４）により公にされているように、２つの固相抽出（ＳＰＥ）工程を３つの異なるカートリッジで行うために必要なものは、非常に多くのことを要求する。種々の実施は、ＳＰＥ工程を行う市販の合成器の修正を含む。これらのハードウェアおよびソフトウェアの変更は、エンジニアリングの専門知識を欠いている研究所および工場がその方法を繰り返すことを困難にしている。近時、Ｋａｂａｌｋａら（非特許文献６）は、３工程、ワンポット法に基づく［18Ｆ］ＳＦＢの効率的な調製を説明した。その全工程は約６０分間で行われ、脱保護／加水分解工程は水性テトラプロピルアンモニウム水酸化物溶液で行われる。続いて時間消費する共沸乾燥が水性試薬の利用のため必要である。Ｃａｒｒｏｌｌらによって公にされたもう１つのアプローチ（非特許文献７）は、ヨードニウム塩前駆体を利用して［18Ｆ］ＳＦＢを１工程、ワンポット法で調製することである。これは非常に魅力的な経路であるが、全収量が低く前駆体も不安定である。それゆえ、［18Ｆ］ＳＦＢ合成の更なる改良および単純化は、自動化法での使用に非常に有益となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
［18Ｆ］ＳＦＢの非水性単一ポット合成が説明される。この方法で生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次に例えばペプチドまたは改変抗体断片（ダイアボディ）を標識し、これは注射可能な組成物としての標識化合物の代表例であるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的として、動物またはヒト内の病的組織、具体的には腫瘍を、ＰＥＴスキャンを使用して特定するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５つの異なる前駆体を異なる調製工程で用いた先行技術の反応の特徴を比較した表である。
【図２】［18Ｆ］ＳＦＢを調製するために使用される４つの代表的な反応スキームを示す。
【図３】本発明の特徴を組み込んだワンポット法を使用した［18Ｆ］ＳＦＢの合成の反応を説明している。
【図４】図３に示された合成に従って調製された［18Ｆ］ＳＦＢの分析を描いた液体ＨＰＬＣおよび放射−ＴＬＣ（より小さい挿入グラフ）クロマトグラムを示す。
【図５】［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢ−標識されたＨＥＲ２−標的ペプチドの反応混合物のＵＶ（上方のグラフ）および放射性ＨＰＬＣ（下方のグラフ）図を示す。
【図６】マイクロスピンカラム精製前の［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢ−標識された抗−ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラムである。放射能は上方の曲線で示されている；下方の曲線はＵＶ−トレースである。
【図７】マイクロスピンカラム精製後の［18Ｆ］ＦＢ−標識された抗−ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラムである。放射能は上方の曲線で示されている；下方の曲線はＵＶ−トレースである。
【図８】ＭＣＦ７−ＨＥＲ２異種移植片中で［18Ｆ］ＦＢ−標識されたＨＥＲ２標的ペプチド（左側の像）（２時間注射後）および抗−ＨＥＲ２ダイアボディ（右側の像）（４時間注射後）を使用したマウスの免疫ＰＥＴ／ＣＴである。
【図９】ＭＣＦ７−ＨＥＲ２異種移植片（冠状（頂部）および横断（底部））を担持したヌードマウスの１時間動的スキャンのマイクロ−ＰＥＴ／ＣＴ像の各セットの時系列である。像枠の時間が秒で示されている。三角形の印は腫瘍の位置を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
典型的な先行技術の［18Ｆ］ＳＦＢ放射能合成は、約９０〜１２０分間の全合成時間で３つの工程を含む。最終的な生体分子トレーサーの追加的な標識および精製は、全工程を時間消費させるとともに非常に複雑にする。放射化学設備にアクセスできる個人および放射化学の専門知識を有する職員だけが、［18Ｆ］ＳＦＢを日常的に使用して研究を行うことができる。［18Ｆ］ＳＦＢの合成への先行技術の一般的なアプローチは、１または２の反応器で行われ得る。しかしながら、公にされている方法のほとんどは、幾つかのカートリッジまたはＨＰＬＣ精製工程を必要とする。加えて、共沸蒸留乾燥工程がたいていの方法に必要となるが、これは水溶液が脱保護／鹸化反応のために一般に使用されるからである。Ｋａｂａｌｋａらにより説明された単一容器の方法において、容器は、活性／Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル形成の前に、共沸乾燥を使用して洗浄され湿気除去されなければならない。短い合成時間および同等の放射化学的収量での［18Ｆ］ＳＦＢの単純合成がそれゆえ非常に望ましい。
【００１４】
従来説明されている全ての放射能合成は、主たる中間アルキル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートの脱保護のために、水性塩基性溶液を使用して、対応する４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを得ている。この溶液中の水は、次に続く［18Ｆ］ＳＦＢを形成するために使用されるＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＳＴＵ）との反応と相容れない。それゆえ反応混合物は乾燥させなければならない。これはＳＰＥの溶出液の共沸蒸留またはそれを硫酸ナトリウムカートリッジに通すことにより通常達成される。
【００１５】
ここで説明されるのは、これらの全てのアプローチに適用され得るエチル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（「18Ｆ」２）の脱保護戦略のための無水系である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）の利用は、水の必要性を無くし、得られた溶液の最終的な塩基性は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分とＴＳＴＵとのカップリングを触媒するのに十分である。
【００１６】
生成された［18Ｆ］ＳＦＢは、次にＭｅｒｃｋ ＥＮカートリッジでＳＰＥにより精製され、ジエチルエーテルで溶出され得る。溶媒の蒸発の後、［18Ｆ］ＳＦＢは水性緩衝液内で溶解され、ペプチドまたはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）の溶液が標識用に添加される。ここで説明される発明に従って標識された短ペプチドのために、放射性トレーサーの精製が逆相ＨＰＬＣを介して標準的な分取用Ｃ１８カラムで行われ、生成物溶液の体積が回転蒸留によって減少される。ダイアボディのために、精製はマイクロスピンカラムを使用して行われる。溶出は体内または体外の研究に直接使用される。
【００１７】
従来の水性反応スキームとは対照的に、本発明は効率的な無水脱保護方法を含み、［18Ｆ］ＳＦＢ合成は、中間の共沸乾燥の必要性無しで単一の反応器内で行われ得るようになっている。加えて、適用された塩基は、［18Ｆ］３の最終的な活性化をすぐに触媒することができる。本発明によって改良された先に公にされた方法の幾つかの特徴は、（１）無水試薬を脱保護工程に適用し、これにより中間化合物のＳＰＥ分離および蒸発による溶媒の対応する除去の必要性を排除し、（２）マイクロ波エネルギーを使用して反応を促進し合成時間を短縮することである。
【００１８】
本発明の特徴を組み入れた放射能合成方法は、図３に示された反応スキームで描かれる方法に従う。炭酸イオンが塩基として存在する状態で、エチル４−トリメチル−アンモニウム−ベンゾアートトリフラート１ａのようなアルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート前駆体を、［18Ｆ］フッ化物の乾燥カリウム−クリプトフィクス（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）−２．２．２錯塩とＤＭＳＯ中で１００℃で１５分間反応させる。適当なアルキル基の例は、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ベンジル等を含むがこれらに限定されず、適当なアリール基の例は、フェニルまたは置換フェニルを含むがこれらに限定されない。クリプトフィクス系の代替として、炭酸セシウムを［18Ｆ］フッ化物のための活性対イオンの源として使用することができ、それは塩基としても働いて標識および活性反応を可能にすることができる。放射性フッ化が完了した後、塩基性無水／非プロトン性溶媒を添加し、反応容器を再加熱する。適当な無水／非プロトン性溶媒の例は、無水ＤＭＳＯ中のｔ−ＢｕＯＫ、ＤＭＦまたはピリジン中のＬｉＣｌ、ＤＭＳＯ中のＮａＣＮ、ＫＯ2、ベンゼン中の１８−クラウン−６、ＥｔＯＡｃ中のＬｉＩ、ＭｅＣＮ中のＴＭＳＣｌまたはＮａＩ、トルエン中のＭｇＩ2、およびベンゼン中の（Ｂｕ3Ｓｎ）2Ｏを含むがこれらに限定されない。脱保護工程を１００℃で１０分間行う。最後に、活性化剤、たとえばアセトニトリル中のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート、（ＭｅＣＮ中のＴＳＴＵ）の溶液を、反応混合物を含んだ４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートに添加する。９０℃で１０分間加熱した後、［18Ｆ］ＳＦＢを得る。加えて、全工程がマイクロ波エネルギー／加熱を利用することによりさらに短縮化し高速化される（図３のスキーム（ｂ）を参照）。
【００１９】
一度［18Ｆ］ＳＦＢを形成すると、それはペプチドまたはタンパク質を標識するのに使用され得る。例として、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を標的にする短ペプチドの標識が以下に説明される。
【００２０】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）は、重要な生体指標化合物である。なぜなら、それが乳癌に顕著な割合で過剰発現されるからである。文献で報告されているのは、短ペプチド鎖（ＫＣＣＹＳＬ）が体内および体外の両方でＨＥＲ２に特定的に結合し得ることである。この場合ペプチドを、マウス内での単格子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のため、インジウム−１１１を具備したキレートリンカーにより放射能標識した。ＨＥＲ２を［18Ｆ］ＳＦＢで標識するために、アミノ酸鎖ＫＧＳＧを結合部分ＫＣＣＹＳＬに添加して、フッ素−１８標識のためのアンカーを提供した。フッ素−１８は、［18Ｆ］ＳＦＢと分子内のレジンの一級アミンとの反応によりこのアンカーに結合して、アミド結合を形成することができる。この反応は生体分子の放射性フッ化のための選択法であることがわかった。
【００２１】
説明された［18Ｆ］ＳＦＢの放射能合成の新規な特徴は、２つのＳＰＥユニットおよび中間の１つの乾燥工程を置き換えてその全体の複雑化を大幅に減少させる無水脱保護戦略である。短縮された全合成時間は、増加した比放射能を有する最終的なプローブともなり、これは標識されたプローブで行われる分析または撮像の質に影響を与える重要な変数である。放射化学者は、かなり低いレベルの開始放射能で作業をすることも可能であり、それでも同じ最終活性レベルを達成することができる（放射性崩壊の時間が減少されるからである）。減少した複雑性は、広い層の調査員がこのプローブをルーチンベースで使用することも可能にする。更に、より単純な合成は、自動化するのにさらにより容易である。加えて、マイクロ波モジュールの使用は、この重要なフッ素−１８標識タグの迅速かつ高い信頼性の自動化生成を可能にする。
【００２２】
修正された方法が最適化された条件で操作されることは、［18Ｆ］ＳＦＢのＲＣＹおよび放射化学的純度につながり、これは従来の工程のために文献で説明されたものと少なくとも同等である。加えて、［18Ｆ］ＳＦＢの化学的純度が最適化されて、図４に示されたＵＶ吸収曲線および高性能液体（ＨＰＬ）クロマトグラムを提供する。放射化学的収量および純度の改善の他に、工程の自動化は、使用される放射能の量の増大を可能とし、［18Ｆ］ＳＦＢをよりアクセスしやすくする。より多くの放射能の量が必要であるのは、［18Ｆ］ＳＦＢが生体分子の放射能標識のための唯一の18Ｆタグであり、生体分子の最終的な標識工程がしばしば低い放射化学的収量を示すからである。加えて、説明された工程は、顕著な再現性を有し、［18Ｆ］ＳＦＢルーチン生成のために高い信頼性で使用され得る。
【００２３】
改良され簡略化された合成は、［18Ｆ］ＳＦＢのルーチン生成を放射化学者でない者にとって更により実用的かつ魅力的にする。もし［18Ｆ］ＳＦＢがより広く利用可能で使用され得るなら、18Ｆで標識された生体分子を研究ツールとして使用した生物学的発見および臨床研究は、活発になると思われる。多くの生物学者および臨床家は、様々な生体分子に18Ｆ−標識を組み込む能力から利益を得ることができるだろう。加えて、ＰＥＴＮＥＴのような市販の放射性医薬は、既に安価なＦ−１８イオンのネットワーク源を提供しており、ここで説明された方法から［18Ｆ］ＳＦＢを作製する自動化されたアプローチと組み合わせて、その使用は大幅に拡大され得る。ここで説明された方法は、［18Ｆ］ＳＦＢ合成を行う全自動化システムに適用されることが可能であり、動物または人間の臨床前および臨床研究のための種々の18Ｆ−標識された生物学的プローブの開発に繋がり得る。
【実施例】
【００２４】
実施例１：慣習的な加熱を使用したＮ−スクシンイミジル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）のワンポット合成
キャリア未添加の［18Ｆ］フッ化物を、ＲＤＳ−１１２サイクロトロン（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用した１１ＭｅＶプロトン線の９７％18Ｏ濃縮水の放射により、核反応18Ｏ（ｐ，ｎ）18Ｆから生成した。［18Ｏ］Ｈ2Ｏ内の水性［18Ｆ］フッ化物溶液１０から５０μｌ（３７〜３７０ＭＢｑ）を、クリプトフィクス２２２（Ｋ222）１０ｍｇ（２６．６μｍｏｌ）と混合し、１Ｍ水性Ｋ2ＣＯ3溶液１３μｌおよび無水ＭｅＣＮ（ｂｉｏｔｅｃｈ ｇｒａｄｅ：生物工学品質）１ｍｌを、次に９０℃に余熱された油浴内のシリコン隔壁で閉鎖されたＶ−バイアル瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ））内に添加した。混合溶液を９０℃で５分間加熱し、真空吸引（８００ｍｂａｒ）を行って混合物が乾くまで共沸蒸発により水を取り除いた。室温まで冷却した後、無水ＭｅＣＮ１ｍｌをバイアル瓶内に添加し、上記と同じ条件を使用して共沸蒸発を繰り返して、無水（［Ｋ⊂２．２．２］18［Ｆ］Ｆ塩を生成した。この標識工程の放射化学的収量は、２０分の蒸発の後で８０および９０％の間である。
【００２５】
室温に冷却した後、無水ＤＭＳＯ（３００μｌ）０．３ｍｌのエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート３ｍｇを、乾燥したＫ222／［18Ｆ］Ｆを含むバイアル瓶内に添加し、その混合物を１００℃で１５分間加熱してエチル４［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した。冷却後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌ内のｔ−ＢｕＯＫ１０ｍｇ（８９．１μｍｏｌ)をバイアル瓶中に添加して、１００℃で１０分間加熱し、エチルエステルの脱保護を行ってカリウム４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した(脱保護工程)。冷却後、無水ＭｅＣＮ２．５ｍｌ中のＴＳＴＵ２０ｍｇの溶液を添加し、次に９０℃で１０分間加熱して、［18Ｆ］ＳＦＢを生成した(カップリング工程)。冷却後、５％水性酢酸１ｍｌを、バイアル瓶内に注入して反応を停止させ、次に全反応混合物を、５％水性ＡｃＯＨ８ｍｌを含んだ２５ｍｌの注入器へ、正圧(１５〜２０ｐｓｉ)の窒素下で移送して、混合物を希釈した。希釈された溶液を、正圧（５〜１０ｐｓｉ）のＮ2下で、ＥｔＯＨ１０ｍｌおよび５％水性ＡｃＯＨ１０ｍｌであらかじめ調製されたＭｅｒｃｋ ＥＮカートリッジ（２００ｍｇ）を通過させた。カートリッジを、次にＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ／（ｖ／ｖ、１／２)１０ｍｌの混合溶媒を使用して洗浄した。最後に、捕捉された［18Ｆ］ＳＦＢを、エチルエーテル３ｍｌを使用してカートリッジから溶出し、水浴（３０℃）内に置いたもう１つのＶ−バイアル瓶内に収集した。エーテル溶媒をＮ2の軟風および攪拌で除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００から２００μｌをエーテル除去後に残っている組成物に添加して［18Ｆ］ＳＦＢを再溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の［18Ｆ］ＳＦＢの最終的な溶液を、ＨＥＲ−２標的ペプチドまたはＨＥＲ−２ダイアボディのその後の標識のために直接使用した。
【００２６】
上記の記載は、複数の操作条件うちの１組を説明している。当業者は、これらの複数の操作条件が変更されて反応の各工程を最適化することが可能であり、これらの操作条件の変更は最終生成物の収量および品質に僅かな相違しかもたらさないことを理解するだろう。例えば、この実施例１の操作条件に関して、代替的な反応温度および時間は、標識について５〜１５分間で９０〜１００℃であり、脱保護は約５〜１０分間で約９０℃から約１００℃であり、カップリング工程は約９〜１０分間で８５℃〜９０℃で行われる。更に、他の弱酸性水溶液を５％水性酢酸に変えて使用することが可能であり、溶出剤はエチルエーテル以外の有機溶媒とすることができる。
【００２７】
実施例２：マイクロ波加熱からの［18Ｆ］ＳＦＢのワンポット合成
市場で入手可能なマイクロ波システム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ；ＣＥＭ，Ｍａｔｔｈｅｗ，ＮＣ）のマイクロ波空洞を、５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎ Ｖ−バイアル瓶を受容するように修正した。このバイアル瓶は、磁気攪拌棒およびバイアル瓶内に延在する管類の接続部を備えたＰＥＥＫ蓋を具備している。この遠隔制御された放射化学的設備は、７つの電気的にスイッチされるソレノイド弁を利用しており、これらを１／１６”テフロン管類を通したＰＥＥＫアダプタによってＶ−バイアル瓶に接続した。３つの弁を使用して、ルアーアダプタを具備した管類を通して試薬の搬送を制御した。溶液出口として役立つ１つのポートが管類を具備していて、そのポートがバイアル瓶の底に延在した。もう１つのポートはバイアル瓶の通気を提供する。残りのポートの１つは圧力下の窒素に接続されていて、第２の残りのポートが真空ポンプに接続されている。マイクロ波空洞を制御するために、ＣＥＭ Ｓｙｎｅｒｇｙソフトウェアを使用した。
【００２８】
［18Ｈ2Ｏ］内の水性［18Ｆ］フッ化物溶液１０から５０μｌを、クリプトフィクス２２２（Ｋ222）１０ｍｇ（２６．６μｍｏｌ）、１Ｍ水性Ｋ2ＣＯ3溶液１３μｌおよび無水ＭｅＣＮ１ｍｌと混合し、次にマイクロ波空洞内に置いたＶ−バイアル瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ）内に移送した。真空を混合溶液に与えて、これを、マイクロ波合成器（ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）を使用して３分間２０Ｗ出力にさらして、共沸蒸発により水を除去した。冷却空気の強風を使用して室温に冷却した後、無水ＭｅＣＮ１ｍｌをバイアル瓶に添加した。共沸蒸発を、同じ条件を使用して再度繰り返して、無水Ｋ222／［18Ｆ］Ｆ錯体を生成した。
【００２９】
室温に冷却した後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌ内のエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラート３ｍｇを乾燥したＫ222／［18Ｆ］Ｆのバイアル瓶内に添加し、その混合物を１分間５０Ｗのマイクロ波エネルギーにさらしてエチル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した（標識工程）。冷却後、無水ＤＭＳＯ０．３ｍｌに溶解されたｔ−ＢｕＯＫ１０ｍｇ（８９．１μｍｏｌ）をバイアル瓶に添加し、１分間４０Ｗ出力にさらして脱保護工程を行い、カリウム４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを生成した。冷却後、無水ＭｅＣＮ２．５ｍｌ内のＴＳＴＵ２０ｍｇの溶液をバイアル瓶に添加し、次に２分間３０Ｗ出力にさらしてカップリング反応を行い、［18Ｆ］ＳＦＢを生成した。冷却後、５％水性酢酸１ｍｌをバイアル瓶内に注入して反応を停止させ、次に混合物を希釈し、全反応混合物を正圧（１５〜２０ｐｓｉ）の窒素下で５％水性ＡｃＯＨ８ｍｌをも含む２５ｍｌ注入容器内に移送した。希釈された溶液を、正圧（５〜１０ｐｓｉ）のＮ2下で、ＥｔＯＨ１０ｍｌおよび５％水性ＡｃＯＨ１０ｍｌであらかじめ調製されたＥＮカートリッジ（Ｍｅｒｃｋ）を通過させた。カートリッジをＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ（ｖ／ｖ，１／２）混合溶媒１０ｍｌを使用して洗浄した。最後に、カートリッジに捕捉された［18Ｆ］ＳＦＢを、エチルエーテル３ｍｌを使用して溶出し、水浴（３０℃）内に置いたもう１つのＶ−バイアル瓶内に収集した。エーテル溶媒をＮ2の軟風および攪拌により除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００から２００μｌをエーテルの除去後に残っている残渣に添加して［18Ｆ］ＳＦＢを再溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の［18Ｆ］ＳＦＢの最終溶液を、次にペプチドまたはダイアボディの後続の標識のために使用した。
【００３０】
上記の説明は、複数の操作条件のうちの１つの組を説明したものである。当業者は、これらの条件が変更されて反応の各工程を最適化し得ること、およびこれらの操作条件の変更は最終生成物の収量および品質に僅かな相違しかもたらし得ないことを理解するだろう。例えば、この実施例２の操作条件に関して、反応容器に与えられるマイクロ波エネルギーおよび時間の代替的なレベルは、標識工程について１〜３分間で２０Ｗ〜６０Ｗであり、脱保護工程について約１分間で約４０Ｗ〜５０Ｗであり、カップリング工程は約２分間約３０〜４０Ｗで行われる。
【００３１】
実施例３：ＳＰＥ−精製された［18Ｆ］ＳＦＢを使用したＨＥＲ−２標的ペプチドの放射能標識
ペプチド標識のために、ＰＢＳバッファ（ｐＨ７．４）中の［18Ｆ］ＳＦＢを、ｐＨ８．５ホウ酸ナトリウム緩衝液内のＨＥＲ２標的ペプチド（ＫＧＳＧＫＣＣＹＳＬ、５ｍｇ／ｍＬ）またはそのスクランブルバージョン（ＫＧＳＧＫＹＬＣＳＣ）の溶液に、２つの溶液の体積比５：１で添加した。標識反応は４５分間行われた。最終生成物の放射‐ＨＰＬクロマトグラムに基づいて、対応する18Ｆ標識されたペプチドの全標識収量は約６０から約８０％である（図５）。反応混合物の一部を、次に半調製逆相放射性ＨＰＬＣシステム内に更なる精製のために注入した。ペプチド保持時間に相当する放射能トレース（ｒａｄｉｏｔｒａｃｅ）のピークを収集した。その後、溶液の全体積を遠隔制御されたマイクロロータリー蒸発器内で減少させて、それをマイクロＰＥＴ調査のために用意された食塩水で希釈した。
【００３２】
実施例４：ＳＰＥ−精製された［18Ｆ］ＳＦＢを使用した抗ＨＲＥ２ダイアボディの放射能標識
［18Ｆ］ＳＦＢを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５、５０ｍＭ）内の抗ＨＥＲ２ダイアボディ溶液（６００μＬ）に添加し、その反応を４５分間進行させた。放射能標識された複合体を、Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏｓｐｉｎ ６クロマトグラフィカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ホウ酸ナトリウム緩衝液であらかじめ平衡状態に置いた遊離［18Ｆ］ＳＦＢおよび［18Ｆ］ＦＢＡから分離した。マイクロスピンカラム精製の前および後の、［18Ｆ］ＦＢ標識された抗ＨＥＲ２ダイアボディの反応混合物のサイズ排除クロマトグラフィーが、それぞれ図６および図７に示されている。放射能が上方の曲線で示されており、下方の曲線はＵＶ−トレースである。スピンカラム分離を７５μＬ分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）で行ったが、これは最大カラム体積であった。放射能標識されたダイアボディの追加の分割量を、Ｊｕｐｉｔｅｒ３００（Ｃ１８；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を使用して、サイズ排除ＨＰＬＣ精製にかけた。インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ；Ｂｉｏｄｅｘ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）を使用して、精製された［18Ｆ］ＦＢ標識されたダイアボディのマイクロリットルあたりの放射化学的収量および比活性度を決定した。１μＬの複合体をインスタント薄層クロマトグラフィーによって評価し、続いて生理食塩水内で流動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ストリップが半分（ボトム−バウンド放射能標識、トップ−フリー放射能標識）に切断され、ガンマカウンタ（Ｗｉｚａｒｄ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でカウントされた。
【００３３】
実施例５：マイクロ−ＰＥＴ調査
マイクロ−ＰＥＴ調査のために、複数の雌のヌードマウス（生後４から５週間）にエストラジオールペレットを２ヶ月間投与し、次にそれらの右脇腹の皮下に腫瘍細胞（ＭＣＦ−７およそ１０7細胞）を注射した。腫瘍がおよそ１０００ｍｍ3に成長した後、この異種移植片担持マウスに、麻酔ベッドにおいて酸素中のイソフルランで麻酔をかけ、次に上述の実施例３に従って生成された18Ｆ標識ＨＥＲ−２ペプチド、そのスクランブル類似体または上記実施例４に従って精製された18Ｆ標識されたダイアボディ（１００μＬ中４０〜８０μＣｉ）を、側尾静脈を介して注射した。ヌードマウスを、麻酔下でＭｉｃｒｏＰＥＴ Ｆｏｃｕｓ ２２０スキャナまたはＩｎｖｅｏｎ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）で撮影した。図８は注射後２時間および４時間で１０分間の静的捕捉を用いて得られた像を示す。腫瘍が囲まれて矢印で示されている。
【００３４】
図９に示されているのは、放射性トレーサーの尾静脈注射の直前に開始された１０ｓ時間枠を使用した動的撮像である。動的１０ｓ時間枠が注射後１０分間にわたって継続された。これらの次に、注射後１０分間で９回の５分間時間枠が開始された。像はフィルター逆投影またはＭＡＰ双方向再構築（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を使用して再構築された。実験の最後に、動物は７分間のスキャンのためにマイクロＣＴスキャナに移送された。
【００３５】
上記に説明されたように、Ｎ−スクシンイミジルエステル４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート（［18Ｆ］ＳＦＢ）は、ＰＥＴスキャンのような診断法において放射能標識標的リガンドに潜在的に使用されて、人間を含む動物の体内の病変細胞を特定することが可能である化合物として良く知られている。このような例において、［18Ｆ］ＳＦＢはタンパク質のような生体分子に付着され、これは具体的には標的組織に付着される。一般的に言えば、［18Ｆ］ＳＦＢはアミノ酸の一級アミン残基と反応する。この［18Ｆ］ＳＦＢ標識された生体分子は、体内、典型的には血管内に、通常は注射により導入され、標的組織の部位に移動することを可能にし、これは次に放射能となり、放射能検出スキャンまたはプローブを使用して検知され得る。このように標識された生体分子の主たる使用は、ＰＥＴスキャンによる特定のために癌組織を標的にすることであるが、このような放射線放出生体分子の使用は制限されていない。体内の標的組織は、一度このように放射能標識された生体分子で標識されると、腹腔鏡法により導入されたまたはカテーテルチップ上の相互操作放射能検出プローブおよび低侵襲性プローブにより特定され得る。加えて、放射能標識された組織は癌組織に限定されず、アテローム硬化（ａｔｈｅｒｏｓｌｅｒｏｔｉｃ）プラークの堆積のような他の異常な生理条件と同様に、良性腫瘍および神経変性病と同様に血塊の特定を含んで良い。
【００３６】
ここで説明された発明は、［18Ｆ］ＳＦＢの調製、それに続くペプチドまたは組み換え型抗体断片の［18Ｆ］ＳＦＢによる標識、および体内の１または複数の腫瘍を特定するための18Ｆ標識された生体分子の使用の発明の特徴を組み入れた２つの実施例を提供するが、ここで説明された発明はそのように限定されない。
【００３７】
ペプチドまたはＨＥＲ２の標識は、標識された生体分子の例として提供されるが、他の生体分子は同様なやり方で［18Ｆ］ＳＦＢで標識され得る。例えば、［18Ｆ］ＳＦＢは、ウイルス、細胞、ペプチド、タンパク質、抗体、脂質、糖質、ポリマー、ナノワイヤおよびナノロッドを含むナノ粒子、および例えば一級アミンを含有する薬剤である小分子を標識するのに使用され得る。具体例は以下のものを含むがこれらに限定されない：
ａ）タンパク質− 抗−ＨＥＲ２／抗−ＥＧＦＲアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、抗ＨＥＲ２／抗−ＨＥＲ３ダイアボディ、アネキシンＶおよび抗−ＣＥＡダイアボディおよび抗−ＣＤ６６抗体；
ｂ）ペプチド− プロインスリン架橋ペプチド、Ｃ−ペプチド、エンドセリン−１、α−ＭＳＨ（α−メラニン細胞刺激ホルモン）およびその類似体、ニューロテンシン、ボンベシン（ＢＢＮ）およびその類似体、血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）およびその類似体、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、ＢＢＮ−ＲＧＤヘテロ二量体、およびその類似体、δ―オピオイド受容体作動薬およびウロテンシン−ＩＩ；
ｃ）小分子− 前立腺特異的膜抗原および（ＰＳＭＡ）阻害剤
更に、実施例は［18Ｆ］ＳＦＢを調製するための非水性鹸化方法を説明しているが、当業者は、ここでの教示に基づいて他の放射能標識化合物が同様な調製技術を使用して調製されることが可能であり、これらの代替的な放射性化合物が次に使用されて上記されたのと同じやり方で生体分子を標識できることを理解するだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
18Ｆ標識された化合物を調製するための無水方法であって、
炭酸イオンの存在下で、アルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートを、［18Ｆ］フッ化物のための活性カウンターイオン源としての、［18Ｆ］フッ化物の乾燥カリウム−クリプトフィクス−２．２．２．錯塩とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、または炭酸セシウムと反応させて、対応するアルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート溶液を含む反応バイアル瓶を提供し、アルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを含む溶液中の水を除去することを含む標識工程、
アルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを塩基性無水／非プロトン性溶媒に溶解して、４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート塩を含む反応混合物を提供することを含む脱保護工程、および
活性化剤の溶液を４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを含む反応混合物に添加して活性化されたエステルを提供することを含むカップリング工程
を含む、無水方法。
【請求項２】
［18Ｆ］ＳＦＢが溶媒中に溶解されて固相抽出系を使用して精製され、［18Ｆ］ＳＦＢが次に固相抽出系から溶出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶媒が弱酸性水溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
［18Ｆ］ＳＦＢが有機溶媒を使用して溶出される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識工程が、９０〜１００℃で５〜１５分間行われ、脱保護工程が約９０℃から約１００℃で約５〜１０分間行われ、カップリング工程が８５℃〜９０℃で約９〜１０分間行われ、加熱が反応バイアル瓶の外にある熱源により提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マイクロ波源がエネルギーを反応バイアル瓶に提供し、標識工程が２０Ｗ〜６０Ｗで１〜３分間作動するマイクロ波源で行われ、脱保護工程が約４０Ｗ〜５０Ｗで約１分間作動するマイクロ波源で行われ、カップリング工程が約３０〜４０Ｗで約２分間作動するマイクロ波源で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
［18Ｆ］ＳＦＢを一級アミン含有化合物に反応させて放射線放出化合物を提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
一級アミン含有化合物が、ウイルス、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、ポリマー、ナノ粒子、ナノワイヤ、ナノロッド、小分子または薬剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一級アミン含有化合物が、抗−ＨＥＲ／抗−ＥＧＦＲアフィボディ、抗ＨＥＲ２／抗−ＨＥＲ３ダイアボディ、アネキシンＶおよび抗−ＣＥＡダイアボディおよび抗−ＣＤ６６抗体からなる群から選択されるタンパク質と、プロインスリン架橋ペプチド、Ｃ−ペプチド、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモンおよびその類似体、ニューロテンシン、ボンベシンおよびその類似体、血管作用性腸ペプチドおよびその類似体、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド、ＢＢＮ−ＲＧＤヘテロ二量体およびその類似体、δ−オピオイド受容体アンタゴニストおよびウロテンシン−ＩＩからなる群から選択されるペプチドと；前立腺特異的膜抗原および（ＰＭＳＡ）阻害剤からなる群から選択される小分子とである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アルキル基が、メチル、エチル、ｉ−プロピルまたはベンジルおよびアリール基がフェニルまたは置換フェニルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートがエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
塩基性無水／非プロトン性溶媒が、無水ＤＭＳＯ中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）、ＤＭＦまたはピリジン中のＬｉＣｌ、ＤＭＳＯ中のＮａＣＮ、ＫＯ2、ベンゼン中の１８−クラウン−６、ＥｔＯＡｃ中のＬｉＩ、ＭｅＣＮ中のＴＭＳＣｌまたはＮａＩ、トルエン中のＭｇＩ2またはベンゼン中の（Ｂｕ3Ｓｎ）2Ｏからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
活性化剤がＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
弱酸性水溶液が酢酸溶液である、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
有機溶媒がエチルエーテルである、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
18Ｆ標識された化合物を調製するための無水方法であって、
炭酸イオンの存在下で、アルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートを、［18Ｆ］フッ化物のための活性カウンターイオン源としての、［18Ｆ］フッ化物の乾燥カリウム−クリプトフィクス−２．２．２．錯塩とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、または炭酸セシウムと反応させて、対応するアルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート溶液を含む反応バイアル瓶を提供し、アルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを含む溶液中の水を除去することを含む標識工程、
アルキルまたはアリール４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを塩基性無水／非プロトン性溶媒に溶解して、４−［18Ｆ］フルオロベンゾアート塩を含む反応混合物を提供することを含む脱保護工程、および
活性化剤の溶液を４−［18Ｆ］フルオロベンゾアートを含む反応混合物に添加して活性化されたエステルを提供することを含むカップリング工程
を含む、無水方法。
【請求項２】
［18Ｆ］ＳＦＢが溶媒中に溶解されて固相抽出系を使用して精製され、［18Ｆ］ＳＦＢが次に固相抽出系から溶出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶媒が弱酸性水溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
［18Ｆ］ＳＦＢが有機溶媒を使用して溶出される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標識工程が、９０〜１００℃で５〜１５分間行われ、脱保護工程が約９０℃から約１００℃で約５〜１０分間行われ、カップリング工程が８５℃〜９０℃で約９〜１０分間行われ、加熱が反応バイアル瓶の外にある熱源により提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マイクロ波源がエネルギーを反応バイアル瓶に提供し、標識工程が２０Ｗ〜６０Ｗで１〜３分間作動するマイクロ波源で行われ、脱保護工程が約４０Ｗ〜５０Ｗで約１分間作動するマイクロ波源で行われ、カップリング工程が約３０〜４０Ｗで約２分間作動するマイクロ波源で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
［18Ｆ］ＳＦＢを一級アミン含有化合物に反応させて放射線放出化合物を提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
一級アミン含有化合物が、ウイルス、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、ポリマー、ナノ粒子、ナノワイヤ、ナノロッド、小分子または薬剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一級アミン含有化合物が、抗−ＨＥＲ／抗−ＥＧＦＲアフィボディ、抗ＨＥＲ２／抗−ＨＥＲ３ダイアボディ、アネキシンＶおよび抗−ＣＥＡダイアボディおよび抗−ＣＤ６６抗体からなる群から選択されるタンパク質と、プロインスリン架橋ペプチド、Ｃ−ペプチド、エンドセリン−１、α−メラノサイト刺激ホルモンおよびその類似体、ニューロテンシン、ボンベシンおよびその類似体、血管作用性腸ペプチドおよびその類似体、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド、ＢＢＮ−ＲＧＤヘテロ二量体およびその類似体、δ−オピオイド受容体アンタゴニストおよびウロテンシン−ＩＩからなる群から選択されるペプチドと；前立腺特異的膜抗原および（ＰＭＳＡ）阻害剤からなる群から選択される小分子とである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アルキル基が、メチル、エチル、ｉ−プロピルまたはベンジルおよびアリール基がフェニルまたは置換フェニルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アルキルまたはアリール４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートがエチル４−トリメチルアンモニウムベンゾアートトリフラートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
塩基性無水／非プロトン性溶媒が、無水ＤＭＳＯ中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）、ＤＭＦまたはピリジン中のＬｉＣｌ、ＤＭＳＯ中のＮａＣＮ、ＫＯ2、ベンゼン中の１８−クラウン−６、ＥｔＯＡｃ中のＬｉＩ、ＭｅＣＮ中のＴＭＳＣｌまたはＮａＩ、トルエン中のＭｇＩ2またはベンゼン中の（Ｂｕ3Ｓｎ）2Ｏからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
活性化剤がＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
弱酸性水溶液が酢酸溶液である、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
有機溶媒がエチルエーテルである、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５０２９８９（Ｐ２０１２−５０２９８９Ａ）
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２７８１７（Ｐ２０１１−５２７８１７）
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５１７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３１９６
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１６日（２００９．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５１７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０３３１９６
【国際公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
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