放線菌類グリセロールアシル誘導体抗原を含む医薬組成物、それらの抽出プロセス、及び結核に対するそれらの使用
本発明は抗原としての放線菌類グリセロールモノミコール酸塩誘導体の治療的使用、それらの抽出プロセス、及び結核の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は放線菌類グリセロールアシル誘導体抗原の治療的使用、それらの抽出プロセス及び結核の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、結核は２００万人の死亡原因として見積もられる。この疾患の原因となる病原体は細菌、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であり、世界で３人に１人が感染している。それは感染した人のくしゃみ又は咳により空気感染する。上記細菌は上記疾患をその後も発症しない感染した人により不活性化状態で保有されうる。しかしながら、年齢又は免疫系の減退の如きいくつかの条件下では、上記細菌は活性化し、そして活性結核の発病を引き起こしうる。
【０００３】
マイコバクテリウムのエンベロープがマイコバクテリウム属の細菌の毒性の重要な部分の原因であるように見える。実際に、マイコバクテリウム乾燥重量の４０％までが脂質により構成されている。これらの脂質はホストの免疫応答の調節に関連することが示されている。いくつかの脂質はＣＤ１タンパク質との関係において非構成的αβＴ細胞を刺激する抗原である。マイコバクテリウム脂質抗原の大多数はＣＤ１ｂイソ型により提示される。これはミコール酸、グルコースモノミコール酸塩、スルフォ糖脂質及びフォスファチジル−ミオ−イノシトールマンノシド（ＰＩＭ）の如き構造的に非常に異なる分子の大きなパネルについての場合である。
【０００４】
最も豊富なマイコバクテリウム脂質のいくつかに特異的なＣＤ１拘束性Ｔ細胞の存在は、ＣＤ１タンパク質がヒト結核菌に対するホストの応答において重要であることを強く示唆している。
【０００５】
現在、結核と闘う２の方法がある：抗生物質治療及びワクチン。
【０００６】
結核予防のために使用されるワクチンはウシ結核菌種の生きた弱毒細菌から成る。それは２０世紀初頭にそれを最初に考案した２人の科学者の名をとってＢＣＧ、Ｃａｌｍｅｔｔｅ及びＧｕｅｒｉｎのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｆ Ｃａｌｍｅｔｔｅ ａｎｄ Ｇｕｅｒｉｎ）と名付けられている。現在ワクチンのために使用されているＢＣＧの異なる株がＢｅｈｒ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９） ２８４：１５２０−１５２３中に顕著に示されている。
【０００７】
免疫減退患者にその使用を不可能にする生ワクチンであるという欠点に加えて、結核に対するその予防は問題が多い。したがって、ＢＣＧは成人における最も一般的な疾患型である肺結核に対して予防できないうえに、成人におけるＢＣＧの予防効率はさまざまな研究によると０％〜８０％に及んでいる。
【０００８】
さらに、ヒト結核菌の抗生物質抵抗性株が３５カ国で発見されている。
【０００９】
それゆえ、結核を治療する及び／又は予防するより有効な方法を提供することが本発明の主題である。
【００１０】
したがって、さらなる新規免疫原性化合物を提供することが高く所望される。
【００１１】
本発明は特にｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１拘束性Ｔリンパ球を刺激することが示されている新規抗原を提供する。前記抗原はグリセロールモノミコール酸塩誘導体であり、そしてマイコバクテリウムの如き放線菌類から単離されている。
【００１２】
ミコール酸誘導体の特徴づけは大いに報告されている（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００１， ７３（１８）：４５３７−４５４４； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００５， １７１５（２）：７１−８０； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００７， １７６８（７）：１７１７−１７２６； Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１， １４７（Ｐｔ７）：１８２５−１８３７）。
【００１３】
これらの化合物は既知であるが、それらの治療的使用は開示されても示唆されてもおらず、これは本発明の１つの目的である。さらに、対応するアシル化型及びその還元型並びに上記化合物の特異的（Ｒ）エナンチオマーは本発明のさらなる目的にしたがって、新規である。
【発明の概要】
【００１４】
より詳細には、本発明は以下の一般式（Ｉ）の化合物：
【００１５】
【化１】
【００１６】
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物、並びにそれらの治療的使用に関し、ここで：
Ｒは２０〜９０炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；そして
*は不斉炭素原子を示す。
【００１７】
グリセロール骨格の不斉炭素（*）は好ましくは（Ｒ）配置を示す。
【００１８】
好ましくは、Ｒは式：
【００１９】
【化２】
【００２０】
であり、ここで（Ｉ）は
【００２１】
【化３】
【００２２】
をとおしてＲに結合されている；そして
Ｔはメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシをさらに含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１以上の基でさらに置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖又はその誘導体を示す；
**は不斉炭素を示す；
同一である又は異なるｎ１、ｎ２は独立に整数を示す。
【００２３】
好ましくは、ｎ１は５〜４０；より好ましくは５〜３０の整数である；
好ましくは、ｎ２は５〜３０；より好ましくは１０〜２０の整数である；
好ましくは、両方の**Ｃ不斉炭素は（Ｒ）配置を示す。
【００２４】
好ましくは、Ｔはメチル基又は１〜５個の二重結合（単数又は複数）を任意に含み、そして／又は式：
【００２５】
【化４】
【００２６】
の基を示す有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０、好ましくはＣ１５−Ｃ５０炭化水素鎖から選択され、ここで
Ｘは：
【００２７】
【化５】
【００２８】
から選択され
Ｙは：
【００２９】
【化６】
【００３０】
から選択され、そして同一である又は異なるｎ３、ｎ４は５〜３０の整数を独立に示す；好ましくはｎ３は１２〜１６の整数を示し、そしてｎ４は１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、
ここで、Ｙが
【００３１】
【化７】
【００３２】
であるとき、Ｔは
【００３３】
【化８】
【００３４】
である。
【００３５】
ミコール酸誘導体はＬａｖａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００１， ７３（１８）：４５３７−４５４４； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００５， １７１５（２）：７１−８０； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００７， １７６８（７）：１７１７−１７２６； Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，１４７（Ｐｔ７）：１８２５−１８３７により特徴づけられている。
【００３６】
好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＲ’は
−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基を示す。
【００３７】
上記化合物は一般的に使用されるいずれかの既知のアシル化方法の適用又は適合により、詳細には無水酢酸を反応させることにより、上記に示されている対応する式（Ｉ）の化合物から得られうる。
【００３８】
他の好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＴは：
【００３９】
【化９】
【００４０】
を示し、ここでＹは
【００４１】
【化１０】
【００４２】
である。
【００４３】
上記対応する化合物は本明細書中で「還元化合物」と呼ばれる。
【００４４】
上記化合物は一般的に使用されるいずれかの既知の還元方法の適用又は適合により上記に示されている対応する式（Ｉ）の化合物から得られうる。好ましくは、この反応はＮＡＢＨ4処理の手段により行われうる。
【００４５】
他の好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＣ*は（Ｒ）配置を示す。
【００４６】
ＧｒｏＭＭは本明細書中でグリセロールモノミコール酸塩をいう。
【００４７】
さらなる態様にしたがって、本発明は上記に定義されるような式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
【００４８】
本発明はそれが式（Ｉ）の化合物から選択される化合物の混合物を含む点で特徴づけられる医薬組成物にさらに関する。
【００４９】
本発明は上記に定義される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物又は医薬として許容される賦形剤を伴う上記に定義される組成物にもまた関する。
【００５０】
前記医薬組成物は例えば、ワクチンである。
【００５１】
さらに、本発明は１又は複数の式（Ｉ）の化合物（単数又は複数）とマイコバクテリウムリン脂質、マイコバクテリウムリポグリカン、マイコバクテリウム糖脂質及びリン脂質から成る群から選択される化合物（単数又は複数）の如き、１又は複数のマイコバクテリウム脂質の組み合わせ、及び同様のものを含む医薬組成物にもまた関する。
【００５２】
上記脂質は本分野において既知であり、そしてＮｉｇｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ８５， １５３−１６６中に開示されている。
【００５３】
上記組み合わせは以下の結果から明らかなように相乗的活性を示すことが予想外に発見されている。
【００５４】
医薬として許容される担体は詳細にはリポソームを含む。
【００５５】
前記医薬組成物は結核又は皮膚病の如き、放線菌類、詳細にはマイコバクテリウムによる疾患を治療する及び／又は予防するために有用である。
【００５６】
上記組成物はワクチン補助剤をもまた含みうる。ヒト個体又は動物における使用のためのワクチン補助剤は当業者に周知であり、上記塩のリストは例えば「Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」 ２nd ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．中に見られうる。特定のワクチン補助剤は特に例えば、アルミニウム塩又はＭ５９を含む。
【００５７】
本発明は詳細には、それが経口又は注射経路による投与のために意図される形態で存在する点で特徴づけられる、上記に定義される医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明はより詳細には、それがＢＣＧ又はマイコバクテリウムタンパク質又は放線菌類脂質の如き、結核の治療又は予防に有用な１又は複数の他の製品を含む点で特徴づけられる、上記に定義される医薬組成物に関する。
【００５９】
表現「放線菌類グリセロールアシル誘導体」はコミバクテリウム、マイコバクテリウム、及びノカルジア（ＣＭＮ）属の細菌中に、及び好ましくはウシ結核菌ＢＣＧ、ヒト結核菌、スメグマ菌、マイコバクテリウムガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）、マイコバクテリウムマリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウムフォルツイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、コミバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｍｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びノカルジアアステロイズ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）中に見られる脂質をいう。好ましい態様にしたがって、前記脂質はウシ結核菌ＢＣＧの抗原である。
【００６０】
結核の治療又は予防に有用な他の製品は特にサイトカインの如き免疫調節剤、ヒト結核菌抗原をコードするＤＮＡ断片、毒性遺伝子が欠損されている変異体の如き生きたヒト結核菌の欠損変異体又はヒト結核菌の抗原を発現するＢＣＧの如き生きた組換えＢＣＧを含む。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、結核は細菌ヒト結核菌によりヒトにおいて引き起こされる疾患を、及び動物における対応する疾患をもまたいう。
【００６２】
他の態様にしたがって、本発明は結核の治療又は予防における同時の、別々の又は連続した使用のための混合調製物としての：
−上記に定義される少なくとも１つの化合物、及び
−ＢＣＧ又はマイコバクテリウムタンパク質の如き、結核の治療又は予防に有用な少なくとも１つの他の製品
を含む製品に関する。
【００６３】
本発明は結核の治療又は予防のために所望される医薬、特にワクチンの調製のための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に挙げられる組成物の使用にもまた関する。
【００６４】
本発明は結核の治療又は予防のための医薬としての上記に定義される化合物にもまた関する。
【００６５】
任意に、上記ワクチンは上記に示されるようなワクチン補助剤を含みうる。
【００６６】
本発明は免疫反応アクチベーター、及びより詳細には炎症反応アクチベーターとしての、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義されるような組成物の使用に関する。
【００６７】
「免疫反応アクチベーター」はｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応の成分又はプロセス、詳細にはＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞又はマクロファージの如き抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、単球又は顆粒球の如き免疫系の細胞を活性化する能力を有する化合物を意味する。
【００６８】
「炎症反応アクチベーター」はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで例えば、漏出、毛細管浸透性、マクロファージ活性化又は発熱開始の如き炎症反応の成分又はプロセスを活性化する能力を有する化合物を意味する。
【００６９】
本発明はＴリンパ球、特にＣＤ１拘束性Ｔリンパ球の活性化を誘発するための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義される組成物の使用にもまた関する。上記活性化はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで進行しうる。
【００７０】
Ｔリンパ球の活性化は細胞増殖又は例えば、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、ＩＬ−２（インターロイキン−２）、ＩＬ−４（インターロイキン−４）又はＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカイン生成の計測の如き、いくつかの方法により評価されうる。
【００７１】
ＣＤ１拘束性Ｔリンパ球はＣＤ１分子により提示される抗原により活性化されるＴリンパ球である。
【００７２】
本発明はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成を誘発するための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義される組成物の使用にもまた関する。
【００７３】
この生成誘発はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでなされうる。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成は例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）又はＥＩＡ（酵素免疫分析）の如き免疫分析により計測されうる。
【００７４】
他の態様にしたがって、本発明はそれが以下の段階：
１）抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞をヒト結核菌脂質調製物を除く放線菌類脂質調製物又は式（Ｉ）の化合物とインキュベートすること
２）増殖Ｔ細胞を得るために末梢血単核細胞をエンベロープ抗原ロードＡＰＣｓと接触させること
３）限界希釈し、そして式（Ｉ）の化合物に接触されるときＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を放出するクローンを選択することにより増殖Ｔ細胞をクローニングすること
を含む点で特徴づけられる、式（Ｉ）の化合物に特異的なＴ細胞クローンの作出のためのプロセスに関する。
【００７５】
好ましくは、段階１）において、上記放線菌類脂質調製物はウシ結核菌ＢＣＧ脂質調製物である。
【００７６】
本発明は上記に挙げられるプロセスにより得られるようなＴ細胞クローンにさらに関する。上記Ｔ細胞クローンはＺ５Ｂ７１として実施例中に示されている。
【００７７】
他の態様にしたがって、本発明はそれが以下の段階：
−スクリーニングするべき生成物、特にウシ結核菌ＢＣＧから抽出された放線菌類グリセロールアシル誘導体を負荷された樹状細胞を上記に定義されるＴ細胞クローンと接触させること
−上記Ｔ細胞クローンにより放出されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如き、サイトカインを含む群から選択される分子を検出すること
を含む点で特徴づけられる、マイコバクテリウム、コリネバクテリウム及びノカルジアの如き、放線菌類から抽出される放線菌類グリセロールアシル誘導体の如き、生成物をスクリーニングするためのプロセスに関する。
【００７８】
本発明はそれが以下の段階：
ａ．クロロフォルム／メタノール抽出物を得るためのメタノール及びクロロフォルムの混合物での上記細菌の処理
ｂ．クロロフォルム／メタノール抽出物の濃縮、続いてクロロフォルム相（本明細書中で脂質画分と呼ばれる）及び水相の間でのその分割
ｃ．上記脂質画分を取り去ること
を含む点で特徴づけられるマイコバクテリウム、コリネバクテリウム及びノカルジアの如き、放線菌類からの、上記に定義される化合物の又は上記に定義される組成物の抽出のためのプロセスにもまた関する。
【００７９】
好ましい局面にしたがって、前記プロセスは以下の追加の段階：
ｄ．ほとんどのクロロフォルムの蒸発、続いてそれへのアセトンの添加により沈殿物及び水溶性アセトン相を得ること
ｅ．上記アセトン不溶相を取り去ること、続いてその濃縮、続いてメタノールの添加により沈殿物及びメタノール不溶相を得ること
ｆ．上記メタノール不溶相を取り去ること、続いてその濃縮及び上記濃縮メタノール不溶相の珪酸カラムへの適用
ｇ．クロロフォルム、メタノール及びそれらの混合物による上記に挙げられる珪酸カラムからの画分の溶離（前記画分は上記に定義される組成物に対応する）
ｈ．必要な場合、それぞれ上記に定義される化合物の１つのみを実質的に含む異なる調製物を得るための、上記珪酸カラムから溶離された画分の精製
をさらに含む。
【００８０】
本発明は上記プロセスにより得られる組成物及び同様のものを含む医薬組成物、並びに結核の予防又は治療用の医薬の調製のための前記組成物の使用、免疫反応アクチベーターとしての前記組成物の使用、Ｔリンパ球の活性化を誘発するための前記組成物の使用、上記に定義されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成を誘発するための前記組成物の使用にもまた関する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１はＣＭＮ群のさまざまな細菌種からの脂質画分の抗原性強度を示す。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡにより計測される脂質画分によるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激。棒はＳＤを示す。コリネバクテリウムグルタミカム（黒四角）、ノカルジア（●）、ウシ結核菌ＢＣＧ（黒三角）、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ（◆）、スメグマ菌（□）、マイコバクテリウムフォルツイタム（○）、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ（△）
【図２】図２はウシ結核菌ＢＣＧ「メタノール不溶性」脂質プールの画分化及びＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンで得られる異なる画分の反応性を示す。「メタノール不溶性」画分のシリカクロマトグラフィー精製により得られる８の代表的な画分（画分１、３、５、１０、１８、１９、２８及び３４）のＴＬＣ分析を（Ａ）中に示す。囲まれている化合物は活性化合物に対応する。同じ画分をＩＦＮ−γ放出を計測することによりＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激について試験した（Ｂ）。棒はＳＤを示す。
【図３】図３はウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭ（Ａ）の及びウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの鹸化後に得られたミコール酸（Ｂ）のポジティブモードにおけるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析を示す。アステリスクは汚染物質に対応する。（Ｃ）中に示されている表は異なる予想されるミコール酸型の及び対応するＧｒｏＭＭのナトリウム付加物の計算されたマスを詳述している。
【図４−１】図４は1Ｈ ＮＭＲ分析（δ1Ｈ：−０．７−５．４）によるウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの構造決定を示す（Ａ）。特異的なＧｒｏＭＭプロトンシグナルにａ〜ｋまで注釈をつけ、そして（Ｂ）中に示されているウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの主要な、すなわち、ケトミコール酸によりエステル化された型の構造について割り当てている。ｎ１＝１９、２１又は２３；ｎ２ ｅｔ ｎ４＝１５、１７又は１９；ｎ３＝１２〜１７。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】図５は合成ＧｒｏＭＭ（Ａ）の及び上記合成に使用されるヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸（Ｂ）のポジティブモードにおけるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析を示す。（Ｃ）中に示されている表は異なる予想されるミコール酸型の及び対応するＧｒｏＭＭのナトリウム付加物の計算されたマスを詳述している。
【図６】図６はウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭ（Ｄ）と比較した1Ｈ ＮＭＲ分析（δ1Ｈ：３．０−４．４）による合成ＧｒｏＭＭ（Ｂ及びＣ）の構造決定を示す。（Ａ）中に示されているウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの主要な、すなわち、ケトミコール酸によりエステル化された型の構造。ｎ１＝１９、２１又は２３；ｎ２ ｅｔ ｎ４＝１５、１７又は１９；ｎ３＝１２〜１７、そしてグリセロールプロトンシグナルにａ〜ｃまで注釈を付けている。（Ｂ）及び（Ｃ）中に示されている構造はそれぞれ、（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）及び（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に対応する。Ｒはミコール酸に対応する。
【図７】図７は半合成ＧｒｏＭＭの生物学的活性を示す。Ｃ３２又はＣ８０ ｓ（Ｓ）−又はｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭにおいて、Ｃ３２はコリノミコール酸に、そしてＣ８０はミコール酸に対応する一方で、（Ｓ）は（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に、そして（Ｒ）は（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に対応する。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図８−１】図８はＴＨＰ−１トランスフェクト細胞（Ａ）及びＣＤ１ａ〜ｃ抗体（Ｂ）を用いた、ＧｒｏＭＭのＣＤ１ｂ拘束性及びＣＤ１ｅ非依存性提示を示す。（Ｃ）において、ＴＨＰ−１−ＣＤ１ｂ（黒四角）及びＴＨＰ−１−ＣＤ１ｂ−ＣＤ１ｅ（●）細胞を使用した。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＴＮＦ−α（Ａ及びＢ）又はＩＦＮ−γ（Ｃ）の放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９】図９はＡｃ2ＳＧＬ（Ａ）、ＰＩＭ6（Ｂ）及びＧｒｏＭＭ（Ｃ）に特異的なＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞による熱で殺したヒト結核菌でパルス処理した、及び生きたヒト結核菌に感染した（Ｄ）、ＤＣｓの認識を示す。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図１０】図１０はＰＰＤネガティブ及びＰＰＤポジティブドナーのＧｒｏＭＭに対する反応性を示す：ヒトドナーのＰＢＭＣｓを自己由来の、ＣＤ１を発現するＤＣｓの存在下でＧｒｏＭＭで刺激した。６日後、培養上清を回収し、そしてＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより決定した：（Ａ）ＧｒｏＭＭに対する反応性を未感染（ｎ＝１０）、ＢＣＧ免疫化（２２）又は潜伏感染の健康なドナー（ｎ＝１９）及びＴＢ患者（ｎ＝１１）の間で比較した。（Ｂ）制限エレメントを調査するために、ＧｒｏＭＭ反応性を１０人のＰＰＤポジティブの健康なドナーにおいてＣＤ１ｂブロッキング抗体の存在下又は不在下で試験した。黒丸は個々のドナーを示し、水平な棒は各群についての平均を示す。
【図１１−１】図１１はウシ結核菌ＢＣＧからのＧｒｏＭＭの精製スキームを示す（Ａ）。精製後、脂質画分の抗原強度が続いた（Ｂ及びＣ）。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンにより放出されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。脂質画分はクロロフォルム相をいう。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２−１】図１２は（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）及び（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）の合成スキームを示す。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３】図１３はウシ結核菌ＢＣＧから得られたマイコバクテリウム生成物の及び還元により得られた対応する還元生成物の生物学的活性を示す。
【図１４】図１４はＢＣＧから得られたマイコバクテリウム生成物とさまざまな脂質との混合物の生物学的活性を示す。マイコバクテリウム脂質：ＬＡＭ（リポアラビノマンナン）、ＬＭ（リポマンナン）、ＰＩＭ2及びＰＩＭ6（２又は６のマンノース単位を含むフォスファチヂル−ｍｙｏ−イノシトール−マンノシド）。リン脂質：ＰＳ：フォスファチジルセリン、ＰＥ：フォスファチジルエタノールアミン、ＰＣ：フォスファチジルコリン、ＰＩ：フォスファチジルイノシトール。
【実施例】
【００８２】
材料及び方法
試薬。Ｌ−１，３−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール及びＤ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール、グリセリールトリパルミチン酸塩、１，２ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール及びモノパルミトイルグリセロールをＳｉｇｍａから購入した。カルヂオ脂質をＧｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６， ３４８９６−９０４中に示されているように、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物から精製した。
【００８３】
細菌株及び培養条件。ノカルジアアステロイズ及びコリネバクテリウムグルタミカムをそれぞれ、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ及びＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地上で３２℃で２〜３日間懸濁物中で生育させた。マイコバクテリウムを表面バイオフィルムとしてのＳａｕｔｏｎ’ｓ培地上で３７℃で４〜８週間生育させた。細胞を回収し、培養培地から分離し、そして細菌を殺すために室温のクロロフォルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）中に置いた。
【００８４】
細胞培養。ヒト前骨髄球ＴＨＰ−１をエレクトロポーレーションによりＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏ及び−Ｈｙｇｒｏベクターを用いてヒトＣＤ１Ａ又はＣＤ１Ｂ又はＣＤ１ＣのｃＤＮＡでトランスフェクトし又はＣＤ１Ｂ及びＣＤ１Ｅでダブルトランスフェクトした。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ ＩＩ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸塩（全てＣａｍｂｒｅｘ， Ｂｒｕｓｓｅｌｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍから）及び１００μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で補充したＲＰＭＩ−１６４０中で生育させた。ＤＣｓを以前に示されているように（Ｐｏｒｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ５９３−７）、組換えＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養することにより健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から単離した。Ｔ細胞クローンを示されているように（Ｄｅ Ｌｉｂｅｒｏ（１９９７）， ｅｄ． Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｎ．Ｆ． ａ． Ｇ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ）， ｐｐ．１２３−４０）作出し、そして５％ＡＢヒト血清（Ｓｗｉｓｓ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ ＩＩ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸塩、１００μｇ／ｍｌカナマイシン及び１００ユニット／ｍｌヒト組換えＩＬ−２で補充したＲＰＭＩ−１６４０中で生育させた。
【００８５】
Ｔ細胞活性化分析。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中のＤＣｓ（３×１０4／ウェル）又はＣＤ１トランスフェクトＴＨＰ−１細胞（３×１０4／ウェル）を異なる濃度の超音波処理抗原と共に３７℃で２時間インキュベートし、Ｔ細胞（三重で１０5／ウェル）を添加した。上清を３６時間のインキュベーション後に回収し、そしてサイトカイン放出を酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ， ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのＩＦＮ−γ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｂａｓｅｌ， ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのＴＮＦ−α）を用いることにより計測した。データを三重の平均ｐｇ／ｍｌ±標準偏差（ＳＤ）として表す。
【００８６】
ＣＤ１拘束の分析。ＣＤ１拘束をＴ細胞の添加前に以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を１０μｇ／ｍｌで３０分間用いてＴ細胞活性化を阻害することにより調査した：ＯＫＴ６（抗−ＣＤ１ａ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８０１９）、ＷＭ−２５（抗−ＣＤ１ｂ；Ｉｍｍｕｎｏｋｏｎｔａｋｔ， Ｌｕｇａｎｏ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｌ１６１（抗−ＣＤ１ｃ；Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗ６−３２（抗−ＭＨＣクラスＩ、ＡＴＣＣ）及びＬ２４３（抗−ＭＨＣクラスＩＩ、ＡＴＣＣ）。抗−ＴＣＲＶγ９（Ｂ３）ｍＡｂを関連性のないｍＡｂとして使用した。
【００８７】
ヒト結核菌でのＤＣｓのパルス処理及び感染。ヒト結核菌を８０℃２０分間で殺し、そしてＤＣｓ（３×１０4／ウェル）と共に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃で２時間インキュベートし、Ｔ細胞（三重で１０5／ウェル）を添加した。ＤＣｓを以前に示されているように（Ｄｅ Ｌｉｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２， ７６３−７２）感染させ、そしてＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡによりモニターした。
【００８８】
Ｔ細胞クローンの作出のために使用される脂質画分。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンを以前に得られた（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６， ３４８９６−９０４）ウシ結核菌ＢＣＧ ＰＩＭ2−エンリッチド画分で作出した。簡単に述べると、ウシ結核菌ＢＣＧ細胞をクロロフォルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）中に懸濁し、そして４回フィルターにかけた。上記クロロフォルム／メタノール抽出物を濃縮し、そして脂質画分を構成し、それを水及びクロロフォルムの間でさらに分割した。上記クロロフォルム相を蒸発させ、そして最小限の容量のクロロフォルム中に懸濁した。アセトンを４℃で一晩添加して沈殿物の形成を導き、それを遠心分離し（３，０００ｇ、４℃、１５分間）、「アセトン可溶」相及び「アセトン不溶」相を作出した。上記「アセトン可溶」相をＱＭＡ−Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ Ｍ（ＢｉｏＳｅｐｒａ ＳＡ， Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｏｎｎｅ， Ｆｒａｎｃｅ）カラムに適用し、クロロフォルム、クロロフォルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）、メタノールで連続溶離して中性化合物を溶離し、そしてその後０．１Ｍ酢酸アンモニウムを含むクロロフォルム／メタノール（１：２，ｖ／ｖ）で溶離して負に荷電した化合物を（ＰＩＭ2として）溶離した。
【００８９】
いくつかの放線菌類からの脂質画分。異なる脂質画分をいくつかの放線菌類種から（上記に示されているように）調製し、そしてＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンに対して試験した：スメグマ菌、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ、マイコバクテリウムフォルツイタム、カメ結核菌、マイコバクテリウムゼノピ、ノカルジアアステロイズ及びコリネバクテリウムグルタミカムからの脂質画分、スメグマ菌、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムカンサシイ、マイコバクテリウムマリナム及びウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン可溶」相及びヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムカンサシイ、マイコバクテリウムマリナム及びウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン不溶」相。
【００９０】
ウシ結核菌ＢＣＧからのＧｒｏＭＭの精製。上記に示されているように得られたウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン不溶性」画分をメタノール沈殿にかけ、「メタノール可溶性」及び「メタノール不溶性」画分を得た。上記「メタノール不溶性」画分（１５０ｍｇ）をシリカ酸カラム（１．３×２３ｃｍ）上で画分化し、７×１７５ｍｌのクロロフォルム（画分１−７）、８×２００ｍｌのクロロフォルム−メタノール（９５：５，ｖ／ｖ）（画分８−１５）、９×２２５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（９：１，ｖ／ｖ）（画分１６−２４）、７×１７５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（８５：１５，ｖ／ｖ）（画分２５−３１）及び７×１７５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（７：３，ｖ／ｖ）（画分３２−３８）で溶離した。画分５〜８がＧｒｏＭＭを含むことがわかり、そしてそれらをプールした。
【００９１】
精製をアルミニウム裏打ちシリカゲルプレート（Ａｌｕｇｒａｍ Ｓｉｌ Ｇ； Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）上のＴＬＣにより移動溶媒としてクロロフォルム／メタノール（９５：５，ｖ／ｖ）を用いてチェックした。８５％のＨ2ＳＯ4中に溶解した０．２％のアントロン（９，１０−ジヒドロ−９−オキソ−アントラセン）（Ｓｉｇｍａ）を糖脂質を検出するために使用した。
【００９２】
ＧｒｏＭＭアセチル化。過アセチル化を、２００μｇのＧｒｏＭＭを酢酸無水物／無水ピリジン（１：１，ｖ／ｖ）中に溶解し、そして８０℃で３０分間加熱することにより行った。上記反応混合物を窒素流下で乾燥させ、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析のためにクロロフォルム中に溶解した。ＧｒｏＭＭヒドロキシル官能基の選択的アセチル化のために、１６μｌの酢酸無水物を１５０μｌのピリジン中に溶解した１０ｍｇのＧｒｏＭＭに添加し、そして０℃で３時間保った。モノ−及びヂ−アセチル化ＧｒｏＭＭをＣＨＣｌ3により抽出し、そしてシリカカラム上でＣＨＣｌ3及びＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ ９５／５（ｖ／ｖ）により連続溶離して精製した。アセチル置換基の数及びＧｒｏＭＭ上でのそれらの位置をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ及びＮＭＲ分析により決定した。
【００９３】
ＧｒｏＭＭ鹸化。８００μｌのメトキシエタノール／ＫＯＨ ２０％（７：１，ｖ／ｖ）を５００μｇのＧｒｏＭＭに添加した。上記混合物をその後１００℃のオーブン内で３時間加熱した。冷却及び水性硫酸ｐＨ３による酸性化後、ミコール酸をヂエチルエーテル（ｖ／ｖ）により３回抽出した。エーテル相をプールし、水で５回洗浄し、そして窒素流下で乾燥させた。ミコール酸をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析のために１００μｌクロロフォルム中に再溶解した。
【００９４】
ＧｒｏＭＭ還元。ＢＣＧから精製した１ｍｇのＧｒｏＭＭを１４０μｌＴＨＦ中の１．３ｍｇのＮａＢＨ4と室温で１５分間攪拌下で反応させた。反応を酢酸の添加により停止させた。上記反応混合物を蒸発させ、ヂクロロメタンと共に攪拌し、そして水で２回洗浄した。
【００９５】
ＧｒｏＭＭ合成。反応を無水溶媒中でアルゴン下で行った。
【００９６】
１−Ｏ−（４−メチルベンゼンスルフォニル）−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）：ｐ−トルエンスルフォニル塩化物（０．３ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（０．８ｍｌ）中に溶解した２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（２３０ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。室温で２４時間後、ジエチルエーテルを上記反応混合物に添加し、そして上記有機相を冷１Ｍ塩酸、水、飽和重炭酸ナトリウム溶液及び水で連続して洗浄した。上記エーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ４／１，ｖ／ｖでの溶離）は生成物（約１００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を与えた。同じ様式で、３−Ｏ−（４メチルベンゼンスルフォニル）−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから得た。
【００９７】
ミコール酸カリウム：ミコール酸（Ｍ． Ａ． Ｌａｎｅｅｌｌｅ， ＩＰＢＳ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅから提供された）をＬａｖａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３， ４５３７−４４中に示されている方法にしたがってヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ細胞から放出させた。ミコール酸カリウムを１０ｍＭ塩酸及び５Ｍ水酸化カリウムでのクロロフォルム中に溶解したミコール酸の２の連続洗浄により得た。クロロフォルムでの抽出後、ミコール酸カリウムを硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。
【００９８】
１−Ｏ−ミコールオイル−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（Ｄｅｆａｙｅ ｅｔ ａｌ．（１９５６） Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）３８，１３０１−４）：ミコール酸カリウム（８ｍｇ，約６μｍｏｌ）を無水ジメチルフォルムアミド（０．１５０ｍｌ）中の１−Ｏ−（４メチルベンゼンスルフォニル）−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（２ｍｇ，７μｍｏｌ）に添加し、そして１３５℃で３日間攪拌した。上記反応混合物を１Ｍ塩酸により酸性化し、そしてジエチルエーテルにより抽出した。エーテル抽出物をその後水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（石油エーテル／ジエチルエーテル ５／１，ｖ／ｖでの溶離）は生成物（約４ｍｇ，２．９μｍｏｌ）を与えた。同様の方法で、３−Ｏ−ミコールオイル−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを３−Ｏ−（４−メチルベンゼンスルフォニル）−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから得た。
【００９９】
１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ＧｒｏＭＭ）（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）：１００μｌの濃塩酸（ｄ＝１．０１７）をジエチルエーテル（０．１ｍｌ）中に溶解した１−Ｏ−ミコールオイル−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（４ｍｇ，２．９μｍｏｌ）に添加した。室温で１０分間の攪拌後、水を上記反応混合物に添加し、そして生成物（３ｍｇ，２．３μｍｏｌ）をジエチルエーテルで抽出した。上記エーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。補足精製は必要ではなかった。３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロールもまた３−Ｏ−ミコールオイル−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを用いて得た。
【０１００】
ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳによる分析を（Ｔｏｆ−Ｔｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを伴う）４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｅｒ上でリフレクトロンモードを用いて行った。イオン化をＮｄ：ＹＡＧレーザーからのパルス化ＵＶ光（３５５ｎｍ）での照射により行った。ＧｒｏＭＭサンプルを２０ｎｓに設定された抽出遅延時間を用いてポジティブイオンモードで２０ｋＶで操作する上記装置により分析した。典型的に、１００〜２５０レーザーショットのスペクトルを最終スペクトルを得るために合計した。ＨＡＢＡ（２−［４−ヒドロキシ−フェニルアゾ］−安息香酸）マトリックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をエタノール／水（１：１，ｖ／ｖ）中で約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。その後、０．５μｌサンプル溶液及び０．５μｌの上記マトリックス溶液を標的上に置き、マイクロピペットで混合し、そして暖かい空気のおだやかな流れの下で乾燥させた。計測をマイコバクテリウムＰＩＭで２点で外部較正した。
【０１０１】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析。ＮＭＲスペクトルをＯｒｉｇｉｎ ２００ ＳＧＩで装備したＡｖａｎｃｅ ＤＭＸ５００スペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ）でＸｗｉｎｎｍｘ２．６を用いて記録した。ＧｒｏＭＭをＣＤＣｌ3−ＣＤ3ＯＤ（９：１，ｖ／ｖ）中に溶解し、そして２９８Ｋで２００×５ｍｍ ５３５−ＰＰ ＮＭＲ管中で分析した。プロトン化学シフトをクロロフォルムのシグナルからのｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｏｗｎｆｉｅｌｄで表す（H／ＴＭＳ ７．２７）。使用された相関スペクトロスコピー及び同一核Ｈａｒｔｍａｎｎ−Ｈａｈｎスペクトロスコピーシークエンスに関連する全ての詳細及び実験手順は以前に示されているとおりであった（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８， ２９８８０−９）。
【０１０２】
結核患者及び健康なドナーからのリンパ球によるＧｒｏＭＭの認識。ＰＢＭＣｓをインフォームドコンセントを与えた後に健康なドナー及び結核患者の血液から精製した。この研究に含まれる全ての患者は培養で証明された肺結核を患っており、そして抗結核薬での治療を血液提供の時点で２〜８週間受けていた。ＰＢＭＣｓ（１０5／ウェル）を１０μｇ／ｍｌ ＧｒｏＭＭの存在下又は不在下で自己由来ＤＣｓ（２×１０4／ウェル）と共に培養した。６日後、上清を回収し、そしてサンドウィッチＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γの存在について試験した。ＰＢＭＣｓを補充したＲＰＭＩ １６４０培地（上記を参照のこと）中で３７℃で２日間の自己由来単球のＤＣｓへの分化の間保った。ＧｒｏＭＭと並行して、ＰＢＭＣｓを１０μｇ／ｍｌ ＰＰＤ（Ｃｈｉｒｏｎ）及び組換えＥＳＡＴ６（Ｌｉｏｎｅｘ）で刺激した。ＰＰＤに応答して少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γを放出することにより応答した健康なドナーをＢＣＧ免疫化として得点をつけた。両方の抗原に応答したドナーをヒト結核菌に潜伏感染していると考えた。ＰＰＤに応答しなかったドナーをＰＰＤネガティブとして得点をつけた。個々の実験について、ＣＤ１ｂ及びＣＤ１ｃブロッキング抗体（それぞれＢＣＤ１ｂ３．１及びＦ１０−１０μｇ／ｍｌ）をＣＤ１提示をブロックするためにＧｒｏＭＭの前に３０分間添加した。
【０１０３】
結果
脂質反応性Ｔ細胞クローンの特徴づけ
ヒト結核菌ＣＤ１拘束性Ｔ細胞脂質抗原レパートリーを同定するために、３つの異なる型の粗マイコバクテリウム脂質画分によりそれらの極性及び電荷にしたがって刺激したＴ細胞系の作出に基づく方法を開発した（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９， ６４９−５９）。１人の高いＰＰＤ反応性を有する健康なドナーのＰＢＭＣに由来するこれらの系から、Ｔ細胞クローンを限界希釈により確立し、そしてＣＤ１拘束性であることがわかった１０の個々のクローンをさらに調査した。ＣＤ４+であるＺ５Ｂ７１と呼ばれるこれらのクローンの１を調査した。それはウシ結核菌ＢＣＧ細胞壁抽出物から得られた、フォスファチジル−ｍｙｏ−イノシトールジマンノシド（ＰＩＭ2）が豊富な画分に対して得られた。このクローンは異なるマイコバクテリウム種（ウシ結核菌ＢＣＧ、スメグマ菌、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムマリナム、マイコバクテリウムフォルツイタム、マイコバクテリウムゼノピ、マイコバクテリウムカンサシイ及びヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ）からの及びコリネバクテリウムグルタミカム及びノカルジアアステロイズからの脂質抽出物に反応する（図１）。上記認識された脂質抗原はしたがってマイコバクテリウム属中に明らかに広く分布されており、そしてＣＭＮ群の細菌中にもまた存在している。興味深いことに、試験された脂質抽出物のうち、ウシ結核菌ＢＣＧからのものはいつも最も刺激性であるようであり、それはこの抗原がこれらの細菌においてより豊富であることを示す。
【０１０４】
Ｚ５Ｂ７１細胞を刺激する脂質抗原の精製
脂質抗原の精製を、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物が最も強い刺激活性を示したので、そしてまたこの種の細胞エンベロープ中の糖脂質の多様性はヒト結核菌のそれにおける多様性より低いので、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物を用いて行った。脂質抽出物をリン脂質を沈殿することが知られる溶媒であるアセトン沈殿により分割した。「アセトン可溶性」及び「アセトン不溶性」画分（図１１Ａ）の両方はＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンを刺激し（図１１Ｂ）、それはｉ）上記抗原は１の画分中で優先的に分割しないこと又はｉｉ）共通のエピトープを有する異なる抗原がこれらのＴ細胞により認識されることを示した。より強い反応性が「アセトン不溶性」画分で観察されたので、この画分をメタノールによりさらに沈殿させた。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞は再び両方の相に反応した（図１１Ｃ）が、その応答は「メタノール不溶性」画分でより高かった。
【０１０５】
「メタノール不溶性」画分をその後増加する量のメタノールを含むクロロフォルムにより溶離されるシリカゲルカラム上で画分化した（図１１Ａ）。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞を画分５〜９により刺激し（図２Ｂ）、クロロフォルム又はクロロフォルム／メタノール，９５／５（ｖ／ｖ）により溶離した。ＴＬＣにより分析したとき、上記活性画分は同一の生成物を含むように見えた（図２Ａ）。画分５〜９をプールし、そして合成された画分をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ及びＮＭＲによりさらに分析した。
【０１０６】
新規マイコバクテリウム脂質抗原の化学的特徴づけ
ポジティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルは陽イオン化ナトリウム化分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+に割り当てられたピークの複雑なパターンを示した（図３Ａ）。マッシーフ中の主なピークは２８マス単位の距離であり、それはおそらく脂肪酸の長さにおける不均一さの結果としての、異なる分子種間の２のメチレン単位の差を示す。この仮定を確認するために、上記生成物をアルカリ条件下で加水分解し、そして脂肪酸をＧＣ（データは示されていない）及びＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ（図３Ｂ）により分析した。ポジティブモードＭＡＬＤＩスペクトルはミコール酸に特徴的な１連のピークを強調した（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ７３（１８）：４５３７−４４）。メロミコール鎖上のさまざまな化学官能基の存在にしたがって、ミコール酸はα−ミコール酸、メトキシミコール酸及びケトミコール酸に分けられる（Ｄａｆｆｅ ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ（１９９８） Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ３９：１３１−２０３）。ヒト結核菌は１／１の割合のα−ミコール酸／酸素化ミコール酸（メトキシミコール酸＋ケトミコール酸）を含み、一方でウシ結核菌ＢＣＧは主にケトミコール酸を含む（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７， １８２５−３７）。これらのデータと一致して、ｍ／ｚ １２３２、１２６０、１２７４、１２８８及び１３０２のピーク（図３Ｂ）をケトミコール酸の［Ｍ＋Ｎａ］+型に割り当てた（図３Ｃ）。
【０１０７】
ネイティブ生成物及びアルカリ処理後に生じたミコール酸の間のマス差（Δ７４ａｍｕ）はミコール酸がグリセロール残基をエステル化することを示した。上記分子上のアルコール官能基の数を上記分子の過アセチル化及びＭＡＬＤＩ ＭＳによる上記反応生成物の分析により証明した（示されていない）。１２６マス単位の置換は３のアルコール官能基の存在を証明した。その後、グリセロールモノミコール酸塩（ＧｒｏＭＭ）に対する新規抗原の割当ては１Ｄ 1Ｈ ＮＭＲ分析によりさらに支持された（図４Ａ）。ミコール酸に典型的な共鳴を公開された研究（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７， １８２５−３７； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２９， １６４−７７； Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５０， ７５８−６３）にしたがって割り当てた。メロミコール鎖のプロトンのいくつかは容易に解釈されうる：ＣＯＳＹスペクトル（示されていない）上で共に相関するプロトンｄ（δ２．３１）及びｅ（δ３．５３，多重項）をそれぞれα鎖及びβヒドロキシル基を有するメチンに割り当てた。これもまたＣＯＳＹスペクトル上で共に相関するプロトンｊ（δ２．４１、多重項）及びｋ（δ０．９２、二重項）をそれぞれメロミコール鎖の遠位部分における、メチル基を有するメチンに及びこのメチルに割り当てた。シグナルｌ（δ０．７５、三重項）をα鎖及びメロミコール鎖の末端メチル基のプロトンに割り当てている。ＣＯＳＹスペクトル上で共に相関するδ−０．４６、δ０．４４及びδ０．５２の多重項（ｈと標識される）はシクロプロパン官能基プロトンの特徴的なシグナルである。５ｐｐｍあたりのシグナル（δ５．１６のｇ及びδ４．８３のｆ）はオレフィンプロトンに対応し、それは小さな割合のミコール酸がエチレン基を含むことを示す。ＨＯＨＡＨＡスペクトル上で共に相関する（示されていない）プロトンａ（δ４．１１、４．０６及び３．９９）、ｂ（δ３．７５）及びｃ（δ３．４７）をグリセロールプロトンに割り当てた。しかしながら、プロトンａは２の独立した系ａ１（δ４．１１及び３．９９）及びａ２（δ４．０６）に分けられ、それらの正確な割当ては合成ＧｒｏＭＭアナログのＮＭＲ分析により可能になった。
半合成ＧｒｏＭＭ（ｓＧｒｏＭＭ）は免疫原性である。
【０１０８】
上記抗原の構造を確認するために、ＧｒｏＭＭアナログをヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖから単離したミコール酸を用いて化学合成した（図１２）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸分析（図５Ｂ）は主要な種としてｍ／ｚ １２４８、１２７６、１３０４及び１３３２でメトキシミコール酸の［Ｍ＋Ｎａ］+型を示した。ケトミコール酸（ｍ／ｚ １２６０、１２８８、１３０２及び１３１６のピーク）及びα−ミコール酸（ｍ／ｚ １１６０、１１８８及び１２１６のピーク）に対応するイオンもまた以前に示されているように（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３，４５３７−４４）、より少ない量で観察された。
【０１０９】
化学合成をｐ−トルエン−スルフォニルにより活性化される（Ｒ）−及び（Ｓ）−イソプロピリデン−グリセロールを用いて出発させた（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）（図１２）。ミコール酸によるグリセロールのエステル化をミコール酸カリウムの存在下で（Ｒ）又は（Ｓ）−イソプロピリデン−グリセロールを加熱することにより行った（Ｄｅｆａｙｅ ｅｔ ａｌ． （１９５６） Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）３８， １３０１−４）。両方のイソプロピリデン−ミコールオイル−グリセロールアイソマーをその後酸性条件下で脱保護し、合成（Ｒ）−又は（Ｓ）−ＧｒｏＭＭを得た（それぞれ、ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭ及びｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭ）。両方のｓＧｒｏＭＭのＭＡＬＤＩマススペクトル（図５Ａ）はヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸を有するＧｒｏＭＭの予想されるマス分布と一致した（図５Ｃ）。両方のｓＧｒｏＭＭをその後１Ｄ 1Ｈ ＮＭＲにより分析した（図６Ｂ及びＣ）。１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭ）の分析は４．０５ｐｐｍのａプロトン（ａ１と示されている）（図６Ｂ）を示し、一方で３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭ）の分析は４．００及び４．１２ｐｐｍのａプロトン（ａ２と示されている）（図６Ｃ）を示した。これらのデータはそれから両方のアイソマーの混合物に対応する、天然ＧｒｏＭＭのスペクトル上のグリセロールプロトンａのマッシーフの複雑さを説明することを許容した（図６Ｄ）。ａ１及びａ２共鳴の強度から（図６Ｄ）、天然ＧｒｏＭＭは同じ割合の両方の立体異性体から成ることが推理されうる。
【０１１０】
ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭはｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭより、より効果的にＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞を刺激し、一方で上記精製天然化合物は中間の活性を有している（図７）。まとめて考えると、ＮＭＲ分析及びＴ細胞反応性の両方は天然抗原の構造を確実にした。
【０１１１】
ＧｒｏＭＭはＣＤ１ｂにより提示され、そしてＣＤ１ｅの存在を必要としない。
【０１１２】
ＧｒｏＭＭのＣＤ１拘束エレメントを１パネルのＣＤ１トランスフェクトＡＰＣｓを用いてＴ細胞クローンを刺激することにより調査した。ＣＤ１ｂ発現細胞のみがＴ細胞を刺激することができた（図８Ａ）。さらに、ＣＤ１ｂ拘束はブロッキング実験によりさらに支持され、ここで抗ＣＤ１ｂ ｍＡｂｓのみが上記クローンの反応性を阻害することができた（図８Ｂ）。ＣＤ１ｅがマイコバクテリウム脂質の提示を援助しうることが以前に示されているので（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０（５７５２）：１３２１−４）、ＧｒｏＭＭの抗原性をＣＤ１ｅの参加の可能性を調査するために、ＣＤ１ｂ及びＣＤ１ｅの両方又はＣＤ１ｂのみを発現するＡＰＣｓを用いてもまた試験した。両方のＡＰＣｓは非常に似たＴ細胞応答を誘発し（図８Ｃ）、したがってそれはＧｒｏＭＭの提示におけるＣＤ１ｅの参加を除外した。
【０１１３】
感染細胞におけるＧｒｏＭＭ免疫原性
重要な論点は、マイコバクテリウム脂質抗原は感染の間、すなわち、それらが食胞中の細菌レジデントの細胞壁から放出されるとき、それらの抗原性を維持するかどうかである。このことを熱で殺したヒト結核菌でパルス処理された又は生きた細菌に感染したＤＣｓを用いることにより調査した。熱で殺した細菌でパルス処理されたＤＣｓを３の異なるヒト結核菌脂質抗原、すなわち、ＧｒｏＭＭ（Ｚ５Ｂ７１）、Ａｃ2ＳＧＬ（Ｚ４Ｂ２７）及びＰＩＭ6（Ｚ５Ｂ１１）を認識する３のＴ細胞クローンを刺激するために使用した。ＡＣ2ＳＧＬ及びＰＩＭ6反応性細胞（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０， １３２１−４； Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９， ６４９−５９）は以前に示されている。高い用量の熱で殺された細菌（１００μｇ／ｍｌ）は強いＴ細胞応答を誘発し（図９Ａ−Ｃ）、それは全ての３の脂質は、細菌細胞壁と結合されたときＣＤ１ｂローディングのために使用可能になることを確実にした。ＧｒｏＭＭはＡＰＣｓが生きたヒト結核菌に感染したときもまた高く免疫原性であり、それはＧｒｏＭＭが感染の間にＤＣｓにより提示されることを示した（図９Ｄ）。
【０１１４】
ＰＰＤポジティブの健康なドナーからのＴ細胞はＧｒｏＭＭを認識する。
【０１１５】
ヒトドナーの末梢血中のＴ細胞が新規脂質化合物を認識するかどうかを直接的に試験するために、血液サンプルを結核患者（ｎ＝１１）、ＰＰＤネガティブ（ｎ＝１０）及びＢＣＧ免疫化（ｎ＝２２）及びヒト結核菌潜伏感染（ｎ＝１９）の健康なドナーから回収し、そしてＧｒｏＭＭ刺激後にＩＦＮ−γ放出を計測した。顕著な応答はＢＣＧ免疫化又は潜伏感染の健康なドナーにおいてのみ観察された（それぞれ７３ｐｇ／ｍｌ及び１１７ｐｇ／ｍｌの平均で；図１０Ａ）。結核患者からのＰＢＭＣｓはＰＰＤに対して活発に応答したが（データは示されていない）、ＧｒｏＭＭはこのドナー集団においてバックグラウンド値を超えるＩＦＮ−γ分泌を誘発しなかった。同様に、未感染のＰＰＤネガティブドナーにおいては応答が全く観察されなかった。１型ＣＤ１分子に対して方向づけられたブロッキング抗体はＭＨＣ−Ｉブロッキング抗体と対照的に（データは示されていない）反応性を排除したので（図１０Ｂ）、ＧｒｏＭＭが誘発したＩＦＮ−γ分泌はＣＤ１拘束性であった。ヒトドナーの末梢血中のＧｒｏＭＭ特異的ＣＤ１拘束性Ｔ細胞の存在はそれゆえマイコバクテリウム誘発性Ｔ細胞記憶を示す。しかしながら、このことは健康なドナーについてのみ適用し、一方で活性な結核を伴う患者はＧｒｏＭＭを認識することができなかった。
【０１１６】
還元化合物の増大された活性
上記還元化合物の活性を試験するために、ＧｒｏＭＭ及び還元ＧｒｏＭＭのＩＦＮ−γ放出を計測することによるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激を計測した。図１３中に示されている結果は還元ＧｒｏＭＭの増大された活性を示す。
【０１１７】
マイコバクテリウムＧｒｏＭＭと脂質との組み合わせの相乗的活性
脂質がマイコバクテリウムＧｒｏＭＭの活性を増強しうるかどうかを試験するために、両方の剤単独又は組み合わせのＩＦＮ−γ放出を計測することによるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激をさまざまなマイコバクテリウム脂質（Ａ）又はリン脂質（Ｂ）について計測した。図１４中に示されている結果は相乗効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は放線菌類グリセロールアシル誘導体抗原の治療的使用、それらの抽出プロセス及び結核の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、結核は２００万人の死亡原因として見積もられる。この疾患の原因となる病原体は細菌、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であり、世界で３人に１人が感染している。それは感染した人のくしゃみ又は咳により空気感染する。上記細菌は上記疾患をその後も発症しない感染した人により不活性化状態で保有されうる。しかしながら、年齢又は免疫系の減退の如きいくつかの条件下では、上記細菌は活性化し、そして活性結核の発病を引き起こしうる。
【０００３】
マイコバクテリウムのエンベロープがマイコバクテリウム属の細菌の毒性の重要な部分の原因であるように見える。実際に、マイコバクテリウム乾燥重量の４０％までが脂質により構成されている。これらの脂質はホストの免疫応答の調節に関連することが示されている。いくつかの脂質はＣＤ１タンパク質との関係において非構成的αβＴ細胞を刺激する抗原である。マイコバクテリウム脂質抗原の大多数はＣＤ１ｂイソ型により提示される。これはミコール酸、グルコースモノミコール酸塩、スルフォ糖脂質及びフォスファチジル−ミオ−イノシトールマンノシド（ＰＩＭ）の如き構造的に非常に異なる分子の大きなパネルについての場合である。
【０００４】
最も豊富なマイコバクテリウム脂質のいくつかに特異的なＣＤ１拘束性Ｔ細胞の存在は、ＣＤ１タンパク質がヒト結核菌に対するホストの応答において重要であることを強く示唆している。
【０００５】
現在、結核と闘う２の方法がある：抗生物質治療及びワクチン。
【０００６】
結核予防のために使用されるワクチンはウシ結核菌種の生きた弱毒細菌から成る。それは２０世紀初頭にそれを最初に考案した２人の科学者の名をとってＢＣＧ、Ｃａｌｍｅｔｔｅ及びＧｕｅｒｉｎのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｆ Ｃａｌｍｅｔｔｅ ａｎｄ Ｇｕｅｒｉｎ）と名付けられている。現在ワクチンのために使用されているＢＣＧの異なる株がＢｅｈｒ Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９） ２８４：１５２０−１５２３中に顕著に示されている。
【０００７】
免疫減退患者にその使用を不可能にする生ワクチンであるという欠点に加えて、結核に対するその予防は問題が多い。したがって、ＢＣＧは成人における最も一般的な疾患型である肺結核に対して予防できないうえに、成人におけるＢＣＧの予防効率はさまざまな研究によると０％〜８０％に及んでいる。
【０００８】
さらに、ヒト結核菌の抗生物質抵抗性株が３５カ国で発見されている。
【０００９】
それゆえ、結核を治療する及び／又は予防するより有効な方法を提供することが本発明の主題である。
【００１０】
したがって、さらなる新規免疫原性化合物を提供することが高く所望される。
【００１１】
本発明は特にｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１拘束性Ｔリンパ球を刺激することが示されている新規抗原を提供する。前記抗原はグリセロールモノミコール酸塩誘導体であり、そしてマイコバクテリウムの如き放線菌類から単離されている。
【００１２】
ミコール酸誘導体の特徴づけは大いに報告されている（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００１， ７３（１８）：４５３７−４５４４； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００５， １７１５（２）：７１−８０； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００７， １７６８（７）：１７１７−１７２６； Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１， １４７（Ｐｔ７）：１８２５−１８３７）。
【００１３】
これらの化合物は既知であるが、それらの治療的使用は開示されても示唆されてもおらず、これは本発明の１つの目的である。さらに、対応するアシル化型及びその還元型並びに上記化合物の特異的（Ｒ）エナンチオマーは本発明のさらなる目的にしたがって、新規である。
【発明の概要】
【００１４】
より詳細には、本発明は以下の一般式（Ｉ）の化合物：
【００１５】
【化１】
【００１６】
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物、並びにそれらの治療的使用に関し、ここで：
Ｒは２０〜９０炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；そして
*は不斉炭素原子を示す。
【００１７】
グリセロール骨格の不斉炭素（*）は好ましくは（Ｒ）配置を示す。
【００１８】
好ましくは、Ｒは式：
【００１９】
【化２】
【００２０】
であり、ここで（Ｉ）は
【００２１】
【化３】
【００２２】
をとおしてＲに結合されている；そして
Ｔはメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシをさらに含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１以上の基でさらに置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖又はその誘導体を示す；
**は不斉炭素を示す；
同一である又は異なるｎ１、ｎ２は独立に整数を示す。
【００２３】
好ましくは、ｎ１は５〜４０；より好ましくは５〜３０の整数である；
好ましくは、ｎ２は５〜３０；より好ましくは１０〜２０の整数である；
好ましくは、両方の**Ｃ不斉炭素は（Ｒ）配置を示す。
【００２４】
好ましくは、Ｔはメチル基又は１〜５個の二重結合（単数又は複数）を任意に含み、そして／又は式：
【００２５】
【化４】
【００２６】
の基を示す有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０、好ましくはＣ１５−Ｃ５０炭化水素鎖から選択され、ここで
Ｘは：
【００２７】
【化５】
【００２８】
から選択され
Ｙは：
【００２９】
【化６】
【００３０】
から選択され、そして同一である又は異なるｎ３、ｎ４は５〜３０の整数を独立に示す；好ましくはｎ３は１２〜１６の整数を示し、そしてｎ４は１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、
ここで、Ｙが
【００３１】
【化７】
【００３２】
であるとき、Ｔは
【００３３】
【化８】
【００３４】
である。
【００３５】
ミコール酸誘導体はＬａｖａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００１， ７３（１８）：４５３７−４５４４； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００５， １７１５（２）：７１−８０； Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００７， １７６８（７）：１７１７−１７２６； Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１，１４７（Ｐｔ７）：１８２５−１８３７により特徴づけられている。
【００３６】
好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＲ’は
−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基を示す。
【００３７】
上記化合物は一般的に使用されるいずれかの既知のアシル化方法の適用又は適合により、詳細には無水酢酸を反応させることにより、上記に示されている対応する式（Ｉ）の化合物から得られうる。
【００３８】
他の好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＴは：
【００３９】
【化９】
【００４０】
を示し、ここでＹは
【００４１】
【化１０】
【００４２】
である。
【００４３】
上記対応する化合物は本明細書中で「還元化合物」と呼ばれる。
【００４４】
上記化合物は一般的に使用されるいずれかの既知の還元方法の適用又は適合により上記に示されている対応する式（Ｉ）の化合物から得られうる。好ましくは、この反応はＮＡＢＨ4処理の手段により行われうる。
【００４５】
他の好ましい態様にしたがって、本発明は上記に定義される式（Ｉ）の化合物それ自体に関し、ここでＣ*は（Ｒ）配置を示す。
【００４６】
ＧｒｏＭＭは本明細書中でグリセロールモノミコール酸塩をいう。
【００４７】
さらなる態様にしたがって、本発明は上記に定義されるような式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物に関する。
【００４８】
本発明はそれが式（Ｉ）の化合物から選択される化合物の混合物を含む点で特徴づけられる医薬組成物にさらに関する。
【００４９】
本発明は上記に定義される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物又は医薬として許容される賦形剤を伴う上記に定義される組成物にもまた関する。
【００５０】
前記医薬組成物は例えば、ワクチンである。
【００５１】
さらに、本発明は１又は複数の式（Ｉ）の化合物（単数又は複数）とマイコバクテリウムリン脂質、マイコバクテリウムリポグリカン、マイコバクテリウム糖脂質及びリン脂質から成る群から選択される化合物（単数又は複数）の如き、１又は複数のマイコバクテリウム脂質の組み合わせ、及び同様のものを含む医薬組成物にもまた関する。
【００５２】
上記脂質は本分野において既知であり、そしてＮｉｇｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ８５， １５３−１６６中に開示されている。
【００５３】
上記組み合わせは以下の結果から明らかなように相乗的活性を示すことが予想外に発見されている。
【００５４】
医薬として許容される担体は詳細にはリポソームを含む。
【００５５】
前記医薬組成物は結核又は皮膚病の如き、放線菌類、詳細にはマイコバクテリウムによる疾患を治療する及び／又は予防するために有用である。
【００５６】
上記組成物はワクチン補助剤をもまた含みうる。ヒト個体又は動物における使用のためのワクチン補助剤は当業者に周知であり、上記塩のリストは例えば「Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」 ２nd ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．中に見られうる。特定のワクチン補助剤は特に例えば、アルミニウム塩又はＭ５９を含む。
【００５７】
本発明は詳細には、それが経口又は注射経路による投与のために意図される形態で存在する点で特徴づけられる、上記に定義される医薬組成物に関する。
【００５８】
本発明はより詳細には、それがＢＣＧ又はマイコバクテリウムタンパク質又は放線菌類脂質の如き、結核の治療又は予防に有用な１又は複数の他の製品を含む点で特徴づけられる、上記に定義される医薬組成物に関する。
【００５９】
表現「放線菌類グリセロールアシル誘導体」はコミバクテリウム、マイコバクテリウム、及びノカルジア（ＣＭＮ）属の細菌中に、及び好ましくはウシ結核菌ＢＣＧ、ヒト結核菌、スメグマ菌、マイコバクテリウムガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）、マイコバクテリウムマリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウムフォルツイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウムゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、コミバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｍｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びノカルジアアステロイズ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）中に見られる脂質をいう。好ましい態様にしたがって、前記脂質はウシ結核菌ＢＣＧの抗原である。
【００６０】
結核の治療又は予防に有用な他の製品は特にサイトカインの如き免疫調節剤、ヒト結核菌抗原をコードするＤＮＡ断片、毒性遺伝子が欠損されている変異体の如き生きたヒト結核菌の欠損変異体又はヒト結核菌の抗原を発現するＢＣＧの如き生きた組換えＢＣＧを含む。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、結核は細菌ヒト結核菌によりヒトにおいて引き起こされる疾患を、及び動物における対応する疾患をもまたいう。
【００６２】
他の態様にしたがって、本発明は結核の治療又は予防における同時の、別々の又は連続した使用のための混合調製物としての：
−上記に定義される少なくとも１つの化合物、及び
−ＢＣＧ又はマイコバクテリウムタンパク質の如き、結核の治療又は予防に有用な少なくとも１つの他の製品
を含む製品に関する。
【００６３】
本発明は結核の治療又は予防のために所望される医薬、特にワクチンの調製のための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に挙げられる組成物の使用にもまた関する。
【００６４】
本発明は結核の治療又は予防のための医薬としての上記に定義される化合物にもまた関する。
【００６５】
任意に、上記ワクチンは上記に示されるようなワクチン補助剤を含みうる。
【００６６】
本発明は免疫反応アクチベーター、及びより詳細には炎症反応アクチベーターとしての、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義されるような組成物の使用に関する。
【００６７】
「免疫反応アクチベーター」はｉｎ ｖｉｔｒｏで又はｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応の成分又はプロセス、詳細にはＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞又はマクロファージの如き抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、単球又は顆粒球の如き免疫系の細胞を活性化する能力を有する化合物を意味する。
【００６８】
「炎症反応アクチベーター」はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで例えば、漏出、毛細管浸透性、マクロファージ活性化又は発熱開始の如き炎症反応の成分又はプロセスを活性化する能力を有する化合物を意味する。
【００６９】
本発明はＴリンパ球、特にＣＤ１拘束性Ｔリンパ球の活性化を誘発するための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義される組成物の使用にもまた関する。上記活性化はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで進行しうる。
【００７０】
Ｔリンパ球の活性化は細胞増殖又は例えば、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、ＩＬ−２（インターロイキン−２）、ＩＬ−４（インターロイキン−４）又はＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカイン生成の計測の如き、いくつかの方法により評価されうる。
【００７１】
ＣＤ１拘束性Ｔリンパ球はＣＤ１分子により提示される抗原により活性化されるＴリンパ球である。
【００７２】
本発明はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成を誘発するための、上記に定義される少なくとも１つの化合物の又は上記に定義される組成物の使用にもまた関する。
【００７３】
この生成誘発はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでなされうる。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成は例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）又はＥＩＡ（酵素免疫分析）の如き免疫分析により計測されうる。
【００７４】
他の態様にしたがって、本発明はそれが以下の段階：
１）抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞をヒト結核菌脂質調製物を除く放線菌類脂質調製物又は式（Ｉ）の化合物とインキュベートすること
２）増殖Ｔ細胞を得るために末梢血単核細胞をエンベロープ抗原ロードＡＰＣｓと接触させること
３）限界希釈し、そして式（Ｉ）の化合物に接触されるときＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を放出するクローンを選択することにより増殖Ｔ細胞をクローニングすること
を含む点で特徴づけられる、式（Ｉ）の化合物に特異的なＴ細胞クローンの作出のためのプロセスに関する。
【００７５】
好ましくは、段階１）において、上記放線菌類脂質調製物はウシ結核菌ＢＣＧ脂質調製物である。
【００７６】
本発明は上記に挙げられるプロセスにより得られるようなＴ細胞クローンにさらに関する。上記Ｔ細胞クローンはＺ５Ｂ７１として実施例中に示されている。
【００７７】
他の態様にしたがって、本発明はそれが以下の段階：
−スクリーニングするべき生成物、特にウシ結核菌ＢＣＧから抽出された放線菌類グリセロールアシル誘導体を負荷された樹状細胞を上記に定義されるＴ細胞クローンと接触させること
−上記Ｔ細胞クローンにより放出されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如き、サイトカインを含む群から選択される分子を検出すること
を含む点で特徴づけられる、マイコバクテリウム、コリネバクテリウム及びノカルジアの如き、放線菌類から抽出される放線菌類グリセロールアシル誘導体の如き、生成物をスクリーニングするためのプロセスに関する。
【００７８】
本発明はそれが以下の段階：
ａ．クロロフォルム／メタノール抽出物を得るためのメタノール及びクロロフォルムの混合物での上記細菌の処理
ｂ．クロロフォルム／メタノール抽出物の濃縮、続いてクロロフォルム相（本明細書中で脂質画分と呼ばれる）及び水相の間でのその分割
ｃ．上記脂質画分を取り去ること
を含む点で特徴づけられるマイコバクテリウム、コリネバクテリウム及びノカルジアの如き、放線菌類からの、上記に定義される化合物の又は上記に定義される組成物の抽出のためのプロセスにもまた関する。
【００７９】
好ましい局面にしたがって、前記プロセスは以下の追加の段階：
ｄ．ほとんどのクロロフォルムの蒸発、続いてそれへのアセトンの添加により沈殿物及び水溶性アセトン相を得ること
ｅ．上記アセトン不溶相を取り去ること、続いてその濃縮、続いてメタノールの添加により沈殿物及びメタノール不溶相を得ること
ｆ．上記メタノール不溶相を取り去ること、続いてその濃縮及び上記濃縮メタノール不溶相の珪酸カラムへの適用
ｇ．クロロフォルム、メタノール及びそれらの混合物による上記に挙げられる珪酸カラムからの画分の溶離（前記画分は上記に定義される組成物に対応する）
ｈ．必要な場合、それぞれ上記に定義される化合物の１つのみを実質的に含む異なる調製物を得るための、上記珪酸カラムから溶離された画分の精製
をさらに含む。
【００８０】
本発明は上記プロセスにより得られる組成物及び同様のものを含む医薬組成物、並びに結核の予防又は治療用の医薬の調製のための前記組成物の使用、免疫反応アクチベーターとしての前記組成物の使用、Ｔリンパ球の活性化を誘発するための前記組成物の使用、上記に定義されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの如きサイトカインの生成を誘発するための前記組成物の使用にもまた関する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１はＣＭＮ群のさまざまな細菌種からの脂質画分の抗原性強度を示す。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡにより計測される脂質画分によるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激。棒はＳＤを示す。コリネバクテリウムグルタミカム（黒四角）、ノカルジア（●）、ウシ結核菌ＢＣＧ（黒三角）、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ（◆）、スメグマ菌（□）、マイコバクテリウムフォルツイタム（○）、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ（△）
【図２】図２はウシ結核菌ＢＣＧ「メタノール不溶性」脂質プールの画分化及びＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンで得られる異なる画分の反応性を示す。「メタノール不溶性」画分のシリカクロマトグラフィー精製により得られる８の代表的な画分（画分１、３、５、１０、１８、１９、２８及び３４）のＴＬＣ分析を（Ａ）中に示す。囲まれている化合物は活性化合物に対応する。同じ画分をＩＦＮ−γ放出を計測することによりＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激について試験した（Ｂ）。棒はＳＤを示す。
【図３】図３はウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭ（Ａ）の及びウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの鹸化後に得られたミコール酸（Ｂ）のポジティブモードにおけるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析を示す。アステリスクは汚染物質に対応する。（Ｃ）中に示されている表は異なる予想されるミコール酸型の及び対応するＧｒｏＭＭのナトリウム付加物の計算されたマスを詳述している。
【図４−１】図４は1Ｈ ＮＭＲ分析（δ1Ｈ：−０．７−５．４）によるウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの構造決定を示す（Ａ）。特異的なＧｒｏＭＭプロトンシグナルにａ〜ｋまで注釈をつけ、そして（Ｂ）中に示されているウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの主要な、すなわち、ケトミコール酸によりエステル化された型の構造について割り当てている。ｎ１＝１９、２１又は２３；ｎ２ ｅｔ ｎ４＝１５、１７又は１９；ｎ３＝１２〜１７。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】図５は合成ＧｒｏＭＭ（Ａ）の及び上記合成に使用されるヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸（Ｂ）のポジティブモードにおけるＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析を示す。（Ｃ）中に示されている表は異なる予想されるミコール酸型の及び対応するＧｒｏＭＭのナトリウム付加物の計算されたマスを詳述している。
【図６】図６はウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭ（Ｄ）と比較した1Ｈ ＮＭＲ分析（δ1Ｈ：３．０−４．４）による合成ＧｒｏＭＭ（Ｂ及びＣ）の構造決定を示す。（Ａ）中に示されているウシ結核菌ＢＣＧ ＧｒｏＭＭの主要な、すなわち、ケトミコール酸によりエステル化された型の構造。ｎ１＝１９、２１又は２３；ｎ２ ｅｔ ｎ４＝１５、１７又は１９；ｎ３＝１２〜１７、そしてグリセロールプロトンシグナルにａ〜ｃまで注釈を付けている。（Ｂ）及び（Ｃ）中に示されている構造はそれぞれ、（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）及び（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に対応する。Ｒはミコール酸に対応する。
【図７】図７は半合成ＧｒｏＭＭの生物学的活性を示す。Ｃ３２又はＣ８０ ｓ（Ｓ）−又はｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭにおいて、Ｃ３２はコリノミコール酸に、そしてＣ８０はミコール酸に対応する一方で、（Ｓ）は（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に、そして（Ｒ）は（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）に対応する。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図８−１】図８はＴＨＰ−１トランスフェクト細胞（Ａ）及びＣＤ１ａ〜ｃ抗体（Ｂ）を用いた、ＧｒｏＭＭのＣＤ１ｂ拘束性及びＣＤ１ｅ非依存性提示を示す。（Ｃ）において、ＴＨＰ−１−ＣＤ１ｂ（黒四角）及びＴＨＰ−１−ＣＤ１ｂ−ＣＤ１ｅ（●）細胞を使用した。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＴＮＦ−α（Ａ及びＢ）又はＩＦＮ−γ（Ｃ）の放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９】図９はＡｃ2ＳＧＬ（Ａ）、ＰＩＭ6（Ｂ）及びＧｒｏＭＭ（Ｃ）に特異的なＣＤ１ｂ拘束性Ｔ細胞による熱で殺したヒト結核菌でパルス処理した、及び生きたヒト結核菌に感染した（Ｄ）、ＤＣｓの認識を示す。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。
【図１０】図１０はＰＰＤネガティブ及びＰＰＤポジティブドナーのＧｒｏＭＭに対する反応性を示す：ヒトドナーのＰＢＭＣｓを自己由来の、ＣＤ１を発現するＤＣｓの存在下でＧｒｏＭＭで刺激した。６日後、培養上清を回収し、そしてＩＦＮ−γ濃度をＥＬＩＳＡにより決定した：（Ａ）ＧｒｏＭＭに対する反応性を未感染（ｎ＝１０）、ＢＣＧ免疫化（２２）又は潜伏感染の健康なドナー（ｎ＝１９）及びＴＢ患者（ｎ＝１１）の間で比較した。（Ｂ）制限エレメントを調査するために、ＧｒｏＭＭ反応性を１０人のＰＰＤポジティブの健康なドナーにおいてＣＤ１ｂブロッキング抗体の存在下又は不在下で試験した。黒丸は個々のドナーを示し、水平な棒は各群についての平均を示す。
【図１１−１】図１１はウシ結核菌ＢＣＧからのＧｒｏＭＭの精製スキームを示す（Ａ）。精製後、脂質画分の抗原強度が続いた（Ｂ及びＣ）。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンにより放出されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより計測した。棒はＳＤを示している。脂質画分はクロロフォルム相をいう。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２−１】図１２は（Ｓ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）及び（Ｒ）−１−Ｏ−ミコールオイル−グリセロール（３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール）の合成スキームを示す。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３】図１３はウシ結核菌ＢＣＧから得られたマイコバクテリウム生成物の及び還元により得られた対応する還元生成物の生物学的活性を示す。
【図１４】図１４はＢＣＧから得られたマイコバクテリウム生成物とさまざまな脂質との混合物の生物学的活性を示す。マイコバクテリウム脂質：ＬＡＭ（リポアラビノマンナン）、ＬＭ（リポマンナン）、ＰＩＭ2及びＰＩＭ6（２又は６のマンノース単位を含むフォスファチヂル−ｍｙｏ−イノシトール−マンノシド）。リン脂質：ＰＳ：フォスファチジルセリン、ＰＥ：フォスファチジルエタノールアミン、ＰＣ：フォスファチジルコリン、ＰＩ：フォスファチジルイノシトール。
【実施例】
【００８２】
材料及び方法
試薬。Ｌ−１，３−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール及びＤ−１，２−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール、グリセリールトリパルミチン酸塩、１，２ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール及びモノパルミトイルグリセロールをＳｉｇｍａから購入した。カルヂオ脂質をＧｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６， ３４８９６−９０４中に示されているように、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物から精製した。
【００８３】
細菌株及び培養条件。ノカルジアアステロイズ及びコリネバクテリウムグルタミカムをそれぞれ、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ及びＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地上で３２℃で２〜３日間懸濁物中で生育させた。マイコバクテリウムを表面バイオフィルムとしてのＳａｕｔｏｎ’ｓ培地上で３７℃で４〜８週間生育させた。細胞を回収し、培養培地から分離し、そして細菌を殺すために室温のクロロフォルム／メタノール（２：１，ｖ／ｖ）中に置いた。
【００８４】
細胞培養。ヒト前骨髄球ＴＨＰ−１をエレクトロポーレーションによりＢＣＭＧＳ−Ｎｅｏ及び−Ｈｙｇｒｏベクターを用いてヒトＣＤ１Ａ又はＣＤ１Ｂ又はＣＤ１ＣのｃＤＮＡでトランスフェクトし又はＣＤ１Ｂ及びＣＤ１Ｅでダブルトランスフェクトした。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ ＩＩ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸塩（全てＣａｍｂｒｅｘ， Ｂｒｕｓｓｅｌｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍから）及び１００μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で補充したＲＰＭＩ−１６４０中で生育させた。ＤＣｓを以前に示されているように（Ｐｏｒｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ５９３−７）、組換えＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養することにより健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から単離した。Ｔ細胞クローンを示されているように（Ｄｅ Ｌｉｂｅｒｏ（１９９７）， ｅｄ． Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｎ．Ｆ． ａ． Ｇ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ）， ｐｐ．１２３−４０）作出し、そして５％ＡＢヒト血清（Ｓｗｉｓｓ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ ＩＩ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｎａ−ピルビン酸塩、１００μｇ／ｍｌカナマイシン及び１００ユニット／ｍｌヒト組換えＩＬ−２で補充したＲＰＭＩ−１６４０中で生育させた。
【００８５】
Ｔ細胞活性化分析。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中のＤＣｓ（３×１０4／ウェル）又はＣＤ１トランスフェクトＴＨＰ−１細胞（３×１０4／ウェル）を異なる濃度の超音波処理抗原と共に３７℃で２時間インキュベートし、Ｔ細胞（三重で１０5／ウェル）を添加した。上清を３６時間のインキュベーション後に回収し、そしてサイトカイン放出を酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ， ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのＩＦＮ−γ；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｂａｓｅｌ， ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのＴＮＦ−α）を用いることにより計測した。データを三重の平均ｐｇ／ｍｌ±標準偏差（ＳＤ）として表す。
【００８６】
ＣＤ１拘束の分析。ＣＤ１拘束をＴ細胞の添加前に以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を１０μｇ／ｍｌで３０分間用いてＴ細胞活性化を阻害することにより調査した：ＯＫＴ６（抗−ＣＤ１ａ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８０１９）、ＷＭ−２５（抗−ＣＤ１ｂ；Ｉｍｍｕｎｏｋｏｎｔａｋｔ， Ｌｕｇａｎｏ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｌ１６１（抗−ＣＤ１ｃ；Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗ６−３２（抗−ＭＨＣクラスＩ、ＡＴＣＣ）及びＬ２４３（抗−ＭＨＣクラスＩＩ、ＡＴＣＣ）。抗−ＴＣＲＶγ９（Ｂ３）ｍＡｂを関連性のないｍＡｂとして使用した。
【００８７】
ヒト結核菌でのＤＣｓのパルス処理及び感染。ヒト結核菌を８０℃２０分間で殺し、そしてＤＣｓ（３×１０4／ウェル）と共に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃で２時間インキュベートし、Ｔ細胞（三重で１０5／ウェル）を添加した。ＤＣｓを以前に示されているように（Ｄｅ Ｌｉｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２， ７６３−７２）感染させ、そしてＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡによりモニターした。
【００８８】
Ｔ細胞クローンの作出のために使用される脂質画分。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンを以前に得られた（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６， ３４８９６−９０４）ウシ結核菌ＢＣＧ ＰＩＭ2−エンリッチド画分で作出した。簡単に述べると、ウシ結核菌ＢＣＧ細胞をクロロフォルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）中に懸濁し、そして４回フィルターにかけた。上記クロロフォルム／メタノール抽出物を濃縮し、そして脂質画分を構成し、それを水及びクロロフォルムの間でさらに分割した。上記クロロフォルム相を蒸発させ、そして最小限の容量のクロロフォルム中に懸濁した。アセトンを４℃で一晩添加して沈殿物の形成を導き、それを遠心分離し（３，０００ｇ、４℃、１５分間）、「アセトン可溶」相及び「アセトン不溶」相を作出した。上記「アセトン可溶」相をＱＭＡ−Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ Ｍ（ＢｉｏＳｅｐｒａ ＳＡ， Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ−ｌａ−Ｇａｒｏｎｎｅ， Ｆｒａｎｃｅ）カラムに適用し、クロロフォルム、クロロフォルム／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）、メタノールで連続溶離して中性化合物を溶離し、そしてその後０．１Ｍ酢酸アンモニウムを含むクロロフォルム／メタノール（１：２，ｖ／ｖ）で溶離して負に荷電した化合物を（ＰＩＭ2として）溶離した。
【００８９】
いくつかの放線菌類からの脂質画分。異なる脂質画分をいくつかの放線菌類種から（上記に示されているように）調製し、そしてＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンに対して試験した：スメグマ菌、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ、マイコバクテリウムフォルツイタム、カメ結核菌、マイコバクテリウムゼノピ、ノカルジアアステロイズ及びコリネバクテリウムグルタミカムからの脂質画分、スメグマ菌、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムカンサシイ、マイコバクテリウムマリナム及びウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン可溶」相及びヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムカンサシイ、マイコバクテリウムマリナム及びウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン不溶」相。
【００９０】
ウシ結核菌ＢＣＧからのＧｒｏＭＭの精製。上記に示されているように得られたウシ結核菌ＢＣＧからの「アセトン不溶性」画分をメタノール沈殿にかけ、「メタノール可溶性」及び「メタノール不溶性」画分を得た。上記「メタノール不溶性」画分（１５０ｍｇ）をシリカ酸カラム（１．３×２３ｃｍ）上で画分化し、７×１７５ｍｌのクロロフォルム（画分１−７）、８×２００ｍｌのクロロフォルム−メタノール（９５：５，ｖ／ｖ）（画分８−１５）、９×２２５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（９：１，ｖ／ｖ）（画分１６−２４）、７×１７５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（８５：１５，ｖ／ｖ）（画分２５−３１）及び７×１７５ｍｌのクロロフォルム−メタノール（７：３，ｖ／ｖ）（画分３２−３８）で溶離した。画分５〜８がＧｒｏＭＭを含むことがわかり、そしてそれらをプールした。
【００９１】
精製をアルミニウム裏打ちシリカゲルプレート（Ａｌｕｇｒａｍ Ｓｉｌ Ｇ； Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）上のＴＬＣにより移動溶媒としてクロロフォルム／メタノール（９５：５，ｖ／ｖ）を用いてチェックした。８５％のＨ2ＳＯ4中に溶解した０．２％のアントロン（９，１０−ジヒドロ−９−オキソ−アントラセン）（Ｓｉｇｍａ）を糖脂質を検出するために使用した。
【００９２】
ＧｒｏＭＭアセチル化。過アセチル化を、２００μｇのＧｒｏＭＭを酢酸無水物／無水ピリジン（１：１，ｖ／ｖ）中に溶解し、そして８０℃で３０分間加熱することにより行った。上記反応混合物を窒素流下で乾燥させ、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析のためにクロロフォルム中に溶解した。ＧｒｏＭＭヒドロキシル官能基の選択的アセチル化のために、１６μｌの酢酸無水物を１５０μｌのピリジン中に溶解した１０ｍｇのＧｒｏＭＭに添加し、そして０℃で３時間保った。モノ−及びヂ−アセチル化ＧｒｏＭＭをＣＨＣｌ3により抽出し、そしてシリカカラム上でＣＨＣｌ3及びＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ ９５／５（ｖ／ｖ）により連続溶離して精製した。アセチル置換基の数及びＧｒｏＭＭ上でのそれらの位置をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ及びＮＭＲ分析により決定した。
【００９３】
ＧｒｏＭＭ鹸化。８００μｌのメトキシエタノール／ＫＯＨ ２０％（７：１，ｖ／ｖ）を５００μｇのＧｒｏＭＭに添加した。上記混合物をその後１００℃のオーブン内で３時間加熱した。冷却及び水性硫酸ｐＨ３による酸性化後、ミコール酸をヂエチルエーテル（ｖ／ｖ）により３回抽出した。エーテル相をプールし、水で５回洗浄し、そして窒素流下で乾燥させた。ミコール酸をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ分析のために１００μｌクロロフォルム中に再溶解した。
【００９４】
ＧｒｏＭＭ還元。ＢＣＧから精製した１ｍｇのＧｒｏＭＭを１４０μｌＴＨＦ中の１．３ｍｇのＮａＢＨ4と室温で１５分間攪拌下で反応させた。反応を酢酸の添加により停止させた。上記反応混合物を蒸発させ、ヂクロロメタンと共に攪拌し、そして水で２回洗浄した。
【００９５】
ＧｒｏＭＭ合成。反応を無水溶媒中でアルゴン下で行った。
【００９６】
１−Ｏ−（４−メチルベンゼンスルフォニル）−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）：ｐ−トルエンスルフォニル塩化物（０．３ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（０．８ｍｌ）中に溶解した２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（２３０ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。室温で２４時間後、ジエチルエーテルを上記反応混合物に添加し、そして上記有機相を冷１Ｍ塩酸、水、飽和重炭酸ナトリウム溶液及び水で連続して洗浄した。上記エーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル ４／１，ｖ／ｖでの溶離）は生成物（約１００ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）を与えた。同じ様式で、３−Ｏ−（４メチルベンゼンスルフォニル）−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから得た。
【００９７】
ミコール酸カリウム：ミコール酸（Ｍ． Ａ． Ｌａｎｅｅｌｌｅ， ＩＰＢＳ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅから提供された）をＬａｖａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３， ４５３７−４４中に示されている方法にしたがってヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖ細胞から放出させた。ミコール酸カリウムを１０ｍＭ塩酸及び５Ｍ水酸化カリウムでのクロロフォルム中に溶解したミコール酸の２の連続洗浄により得た。クロロフォルムでの抽出後、ミコール酸カリウムを硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。
【００９８】
１−Ｏ−ミコールオイル−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（Ｄｅｆａｙｅ ｅｔ ａｌ．（１９５６） Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）３８，１３０１−４）：ミコール酸カリウム（８ｍｇ，約６μｍｏｌ）を無水ジメチルフォルムアミド（０．１５０ｍｌ）中の１−Ｏ−（４メチルベンゼンスルフォニル）−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（２ｍｇ，７μｍｏｌ）に添加し、そして１３５℃で３日間攪拌した。上記反応混合物を１Ｍ塩酸により酸性化し、そしてジエチルエーテルにより抽出した。エーテル抽出物をその後水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（石油エーテル／ジエチルエーテル ５／１，ｖ／ｖでの溶離）は生成物（約４ｍｇ，２．９μｍｏｌ）を与えた。同様の方法で、３−Ｏ−ミコールオイル−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを３−Ｏ−（４−メチルベンゼンスルフォニル）−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから得た。
【００９９】
１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ＧｒｏＭＭ）（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）：１００μｌの濃塩酸（ｄ＝１．０１７）をジエチルエーテル（０．１ｍｌ）中に溶解した１−Ｏ−ミコールオイル−２，３−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（４ｍｇ，２．９μｍｏｌ）に添加した。室温で１０分間の攪拌後、水を上記反応混合物に添加し、そして生成物（３ｍｇ，２．３μｍｏｌ）をジエチルエーテルで抽出した。上記エーテル抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして濃縮した。補足精製は必要ではなかった。３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロールもまた３−Ｏ−ミコールオイル−１，２−Ｏ，Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールを用いて得た。
【０１００】
ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳによる分析を（Ｔｏｆ−Ｔｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを伴う）４７００ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｅｒ上でリフレクトロンモードを用いて行った。イオン化をＮｄ：ＹＡＧレーザーからのパルス化ＵＶ光（３５５ｎｍ）での照射により行った。ＧｒｏＭＭサンプルを２０ｎｓに設定された抽出遅延時間を用いてポジティブイオンモードで２０ｋＶで操作する上記装置により分析した。典型的に、１００〜２５０レーザーショットのスペクトルを最終スペクトルを得るために合計した。ＨＡＢＡ（２−［４−ヒドロキシ−フェニルアゾ］−安息香酸）マトリックス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をエタノール／水（１：１，ｖ／ｖ）中で約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。その後、０．５μｌサンプル溶液及び０．５μｌの上記マトリックス溶液を標的上に置き、マイクロピペットで混合し、そして暖かい空気のおだやかな流れの下で乾燥させた。計測をマイコバクテリウムＰＩＭで２点で外部較正した。
【０１０１】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析。ＮＭＲスペクトルをＯｒｉｇｉｎ ２００ ＳＧＩで装備したＡｖａｎｃｅ ＤＭＸ５００スペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ）でＸｗｉｎｎｍｘ２．６を用いて記録した。ＧｒｏＭＭをＣＤＣｌ3−ＣＤ3ＯＤ（９：１，ｖ／ｖ）中に溶解し、そして２９８Ｋで２００×５ｍｍ ５３５−ＰＰ ＮＭＲ管中で分析した。プロトン化学シフトをクロロフォルムのシグナルからのｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｄｏｗｎｆｉｅｌｄで表す（H／ＴＭＳ ７．２７）。使用された相関スペクトロスコピー及び同一核Ｈａｒｔｍａｎｎ−Ｈａｈｎスペクトロスコピーシークエンスに関連する全ての詳細及び実験手順は以前に示されているとおりであった（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８， ２９８８０−９）。
【０１０２】
結核患者及び健康なドナーからのリンパ球によるＧｒｏＭＭの認識。ＰＢＭＣｓをインフォームドコンセントを与えた後に健康なドナー及び結核患者の血液から精製した。この研究に含まれる全ての患者は培養で証明された肺結核を患っており、そして抗結核薬での治療を血液提供の時点で２〜８週間受けていた。ＰＢＭＣｓ（１０5／ウェル）を１０μｇ／ｍｌ ＧｒｏＭＭの存在下又は不在下で自己由来ＤＣｓ（２×１０4／ウェル）と共に培養した。６日後、上清を回収し、そしてサンドウィッチＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γの存在について試験した。ＰＢＭＣｓを補充したＲＰＭＩ １６４０培地（上記を参照のこと）中で３７℃で２日間の自己由来単球のＤＣｓへの分化の間保った。ＧｒｏＭＭと並行して、ＰＢＭＣｓを１０μｇ／ｍｌ ＰＰＤ（Ｃｈｉｒｏｎ）及び組換えＥＳＡＴ６（Ｌｉｏｎｅｘ）で刺激した。ＰＰＤに応答して少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌ ＩＦＮ−γを放出することにより応答した健康なドナーをＢＣＧ免疫化として得点をつけた。両方の抗原に応答したドナーをヒト結核菌に潜伏感染していると考えた。ＰＰＤに応答しなかったドナーをＰＰＤネガティブとして得点をつけた。個々の実験について、ＣＤ１ｂ及びＣＤ１ｃブロッキング抗体（それぞれＢＣＤ１ｂ３．１及びＦ１０−１０μｇ／ｍｌ）をＣＤ１提示をブロックするためにＧｒｏＭＭの前に３０分間添加した。
【０１０３】
結果
脂質反応性Ｔ細胞クローンの特徴づけ
ヒト結核菌ＣＤ１拘束性Ｔ細胞脂質抗原レパートリーを同定するために、３つの異なる型の粗マイコバクテリウム脂質画分によりそれらの極性及び電荷にしたがって刺激したＴ細胞系の作出に基づく方法を開発した（Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９， ６４９−５９）。１人の高いＰＰＤ反応性を有する健康なドナーのＰＢＭＣに由来するこれらの系から、Ｔ細胞クローンを限界希釈により確立し、そしてＣＤ１拘束性であることがわかった１０の個々のクローンをさらに調査した。ＣＤ４+であるＺ５Ｂ７１と呼ばれるこれらのクローンの１を調査した。それはウシ結核菌ＢＣＧ細胞壁抽出物から得られた、フォスファチジル−ｍｙｏ−イノシトールジマンノシド（ＰＩＭ2）が豊富な画分に対して得られた。このクローンは異なるマイコバクテリウム種（ウシ結核菌ＢＣＧ、スメグマ菌、マイコバクテリウムガストリ、マイコバクテリウムマリナム、マイコバクテリウムフォルツイタム、マイコバクテリウムゼノピ、マイコバクテリウムカンサシイ及びヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ）からの及びコリネバクテリウムグルタミカム及びノカルジアアステロイズからの脂質抽出物に反応する（図１）。上記認識された脂質抗原はしたがってマイコバクテリウム属中に明らかに広く分布されており、そしてＣＭＮ群の細菌中にもまた存在している。興味深いことに、試験された脂質抽出物のうち、ウシ結核菌ＢＣＧからのものはいつも最も刺激性であるようであり、それはこの抗原がこれらの細菌においてより豊富であることを示す。
【０１０４】
Ｚ５Ｂ７１細胞を刺激する脂質抗原の精製
脂質抗原の精製を、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物が最も強い刺激活性を示したので、そしてまたこの種の細胞エンベロープ中の糖脂質の多様性はヒト結核菌のそれにおける多様性より低いので、ウシ結核菌ＢＣＧ脂質抽出物を用いて行った。脂質抽出物をリン脂質を沈殿することが知られる溶媒であるアセトン沈殿により分割した。「アセトン可溶性」及び「アセトン不溶性」画分（図１１Ａ）の両方はＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンを刺激し（図１１Ｂ）、それはｉ）上記抗原は１の画分中で優先的に分割しないこと又はｉｉ）共通のエピトープを有する異なる抗原がこれらのＴ細胞により認識されることを示した。より強い反応性が「アセトン不溶性」画分で観察されたので、この画分をメタノールによりさらに沈殿させた。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞は再び両方の相に反応した（図１１Ｃ）が、その応答は「メタノール不溶性」画分でより高かった。
【０１０５】
「メタノール不溶性」画分をその後増加する量のメタノールを含むクロロフォルムにより溶離されるシリカゲルカラム上で画分化した（図１１Ａ）。Ｚ５Ｂ７１ Ｔ細胞を画分５〜９により刺激し（図２Ｂ）、クロロフォルム又はクロロフォルム／メタノール，９５／５（ｖ／ｖ）により溶離した。ＴＬＣにより分析したとき、上記活性画分は同一の生成物を含むように見えた（図２Ａ）。画分５〜９をプールし、そして合成された画分をＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ及びＮＭＲによりさらに分析した。
【０１０６】
新規マイコバクテリウム脂質抗原の化学的特徴づけ
ポジティブモードＭＡＬＤＩマススペクトルは陽イオン化ナトリウム化分子イオン［Ｍ＋Ｎａ］+に割り当てられたピークの複雑なパターンを示した（図３Ａ）。マッシーフ中の主なピークは２８マス単位の距離であり、それはおそらく脂肪酸の長さにおける不均一さの結果としての、異なる分子種間の２のメチレン単位の差を示す。この仮定を確認するために、上記生成物をアルカリ条件下で加水分解し、そして脂肪酸をＧＣ（データは示されていない）及びＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−ＭＳ（図３Ｂ）により分析した。ポジティブモードＭＡＬＤＩスペクトルはミコール酸に特徴的な１連のピークを強調した（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ７３（１８）：４５３７−４４）。メロミコール鎖上のさまざまな化学官能基の存在にしたがって、ミコール酸はα−ミコール酸、メトキシミコール酸及びケトミコール酸に分けられる（Ｄａｆｆｅ ａｎｄ Ｄｒａｐｅｒ（１９９８） Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐｈｙｓｉｏｌ ３９：１３１−２０３）。ヒト結核菌は１／１の割合のα−ミコール酸／酸素化ミコール酸（メトキシミコール酸＋ケトミコール酸）を含み、一方でウシ結核菌ＢＣＧは主にケトミコール酸を含む（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７， １８２５−３７）。これらのデータと一致して、ｍ／ｚ １２３２、１２６０、１２７４、１２８８及び１３０２のピーク（図３Ｂ）をケトミコール酸の［Ｍ＋Ｎａ］+型に割り当てた（図３Ｃ）。
【０１０７】
ネイティブ生成物及びアルカリ処理後に生じたミコール酸の間のマス差（Δ７４ａｍｕ）はミコール酸がグリセロール残基をエステル化することを示した。上記分子上のアルコール官能基の数を上記分子の過アセチル化及びＭＡＬＤＩ ＭＳによる上記反応生成物の分析により証明した（示されていない）。１２６マス単位の置換は３のアルコール官能基の存在を証明した。その後、グリセロールモノミコール酸塩（ＧｒｏＭＭ）に対する新規抗原の割当ては１Ｄ 1Ｈ ＮＭＲ分析によりさらに支持された（図４Ａ）。ミコール酸に典型的な共鳴を公開された研究（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７， １８２５−３７； Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ Ｃｈｅｍ ２９， １６４−７７； Ｑｕｅｍａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５０， ７５８−６３）にしたがって割り当てた。メロミコール鎖のプロトンのいくつかは容易に解釈されうる：ＣＯＳＹスペクトル（示されていない）上で共に相関するプロトンｄ（δ２．３１）及びｅ（δ３．５３，多重項）をそれぞれα鎖及びβヒドロキシル基を有するメチンに割り当てた。これもまたＣＯＳＹスペクトル上で共に相関するプロトンｊ（δ２．４１、多重項）及びｋ（δ０．９２、二重項）をそれぞれメロミコール鎖の遠位部分における、メチル基を有するメチンに及びこのメチルに割り当てた。シグナルｌ（δ０．７５、三重項）をα鎖及びメロミコール鎖の末端メチル基のプロトンに割り当てている。ＣＯＳＹスペクトル上で共に相関するδ−０．４６、δ０．４４及びδ０．５２の多重項（ｈと標識される）はシクロプロパン官能基プロトンの特徴的なシグナルである。５ｐｐｍあたりのシグナル（δ５．１６のｇ及びδ４．８３のｆ）はオレフィンプロトンに対応し、それは小さな割合のミコール酸がエチレン基を含むことを示す。ＨＯＨＡＨＡスペクトル上で共に相関する（示されていない）プロトンａ（δ４．１１、４．０６及び３．９９）、ｂ（δ３．７５）及びｃ（δ３．４７）をグリセロールプロトンに割り当てた。しかしながら、プロトンａは２の独立した系ａ１（δ４．１１及び３．９９）及びａ２（δ４．０６）に分けられ、それらの正確な割当ては合成ＧｒｏＭＭアナログのＮＭＲ分析により可能になった。
半合成ＧｒｏＭＭ（ｓＧｒｏＭＭ）は免疫原性である。
【０１０８】
上記抗原の構造を確認するために、ＧｒｏＭＭアナログをヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖから単離したミコール酸を用いて化学合成した（図１２）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸分析（図５Ｂ）は主要な種としてｍ／ｚ １２４８、１２７６、１３０４及び１３３２でメトキシミコール酸の［Ｍ＋Ｎａ］+型を示した。ケトミコール酸（ｍ／ｚ １２６０、１２８８、１３０２及び１３１６のピーク）及びα−ミコール酸（ｍ／ｚ １１６０、１１８８及び１２１６のピーク）に対応するイオンもまた以前に示されているように（Ｌａｖａｌ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ７３，４５３７−４４）、より少ない量で観察された。
【０１０９】
化学合成をｐ−トルエン−スルフォニルにより活性化される（Ｒ）−及び（Ｓ）−イソプロピリデン−グリセロールを用いて出発させた（Ｓｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９４２） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４２， １２９１−３）（図１２）。ミコール酸によるグリセロールのエステル化をミコール酸カリウムの存在下で（Ｒ）又は（Ｓ）−イソプロピリデン−グリセロールを加熱することにより行った（Ｄｅｆａｙｅ ｅｔ ａｌ． （１９５６） Ｂｕｌｌ Ｓｏｃ Ｃｈｉｍ Ｂｉｏｌ（Ｐａｒｉｓ）３８， １３０１−４）。両方のイソプロピリデン−ミコールオイル−グリセロールアイソマーをその後酸性条件下で脱保護し、合成（Ｒ）−又は（Ｓ）−ＧｒｏＭＭを得た（それぞれ、ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭ及びｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭ）。両方のｓＧｒｏＭＭのＭＡＬＤＩマススペクトル（図５Ａ）はヒト結核菌Ｈ３７Ｒｖミコール酸を有するＧｒｏＭＭの予想されるマス分布と一致した（図５Ｃ）。両方のｓＧｒｏＭＭをその後１Ｄ 1Ｈ ＮＭＲにより分析した（図６Ｂ及びＣ）。１−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭ）の分析は４．０５ｐｐｍのａプロトン（ａ１と示されている）（図６Ｂ）を示し、一方で３−Ｏ−ミコールオイル−ｓｎ−グリセロール（ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭ）の分析は４．００及び４．１２ｐｐｍのａプロトン（ａ２と示されている）（図６Ｃ）を示した。これらのデータはそれから両方のアイソマーの混合物に対応する、天然ＧｒｏＭＭのスペクトル上のグリセロールプロトンａのマッシーフの複雑さを説明することを許容した（図６Ｄ）。ａ１及びａ２共鳴の強度から（図６Ｄ）、天然ＧｒｏＭＭは同じ割合の両方の立体異性体から成ることが推理されうる。
【０１１０】
ｓ（Ｒ）−ＧｒｏＭＭはｓ（Ｓ）−ＧｒｏＭＭより、より効果的にＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞を刺激し、一方で上記精製天然化合物は中間の活性を有している（図７）。まとめて考えると、ＮＭＲ分析及びＴ細胞反応性の両方は天然抗原の構造を確実にした。
【０１１１】
ＧｒｏＭＭはＣＤ１ｂにより提示され、そしてＣＤ１ｅの存在を必要としない。
【０１１２】
ＧｒｏＭＭのＣＤ１拘束エレメントを１パネルのＣＤ１トランスフェクトＡＰＣｓを用いてＴ細胞クローンを刺激することにより調査した。ＣＤ１ｂ発現細胞のみがＴ細胞を刺激することができた（図８Ａ）。さらに、ＣＤ１ｂ拘束はブロッキング実験によりさらに支持され、ここで抗ＣＤ１ｂ ｍＡｂｓのみが上記クローンの反応性を阻害することができた（図８Ｂ）。ＣＤ１ｅがマイコバクテリウム脂質の提示を援助しうることが以前に示されているので（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０（５７５２）：１３２１−４）、ＧｒｏＭＭの抗原性をＣＤ１ｅの参加の可能性を調査するために、ＣＤ１ｂ及びＣＤ１ｅの両方又はＣＤ１ｂのみを発現するＡＰＣｓを用いてもまた試験した。両方のＡＰＣｓは非常に似たＴ細胞応答を誘発し（図８Ｃ）、したがってそれはＧｒｏＭＭの提示におけるＣＤ１ｅの参加を除外した。
【０１１３】
感染細胞におけるＧｒｏＭＭ免疫原性
重要な論点は、マイコバクテリウム脂質抗原は感染の間、すなわち、それらが食胞中の細菌レジデントの細胞壁から放出されるとき、それらの抗原性を維持するかどうかである。このことを熱で殺したヒト結核菌でパルス処理された又は生きた細菌に感染したＤＣｓを用いることにより調査した。熱で殺した細菌でパルス処理されたＤＣｓを３の異なるヒト結核菌脂質抗原、すなわち、ＧｒｏＭＭ（Ｚ５Ｂ７１）、Ａｃ2ＳＧＬ（Ｚ４Ｂ２７）及びＰＩＭ6（Ｚ５Ｂ１１）を認識する３のＴ細胞クローンを刺激するために使用した。ＡＣ2ＳＧＬ及びＰＩＭ6反応性細胞（ｄｅ ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０， １３２１−４； Ｇｉｌｌｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９， ６４９−５９）は以前に示されている。高い用量の熱で殺された細菌（１００μｇ／ｍｌ）は強いＴ細胞応答を誘発し（図９Ａ−Ｃ）、それは全ての３の脂質は、細菌細胞壁と結合されたときＣＤ１ｂローディングのために使用可能になることを確実にした。ＧｒｏＭＭはＡＰＣｓが生きたヒト結核菌に感染したときもまた高く免疫原性であり、それはＧｒｏＭＭが感染の間にＤＣｓにより提示されることを示した（図９Ｄ）。
【０１１４】
ＰＰＤポジティブの健康なドナーからのＴ細胞はＧｒｏＭＭを認識する。
【０１１５】
ヒトドナーの末梢血中のＴ細胞が新規脂質化合物を認識するかどうかを直接的に試験するために、血液サンプルを結核患者（ｎ＝１１）、ＰＰＤネガティブ（ｎ＝１０）及びＢＣＧ免疫化（ｎ＝２２）及びヒト結核菌潜伏感染（ｎ＝１９）の健康なドナーから回収し、そしてＧｒｏＭＭ刺激後にＩＦＮ−γ放出を計測した。顕著な応答はＢＣＧ免疫化又は潜伏感染の健康なドナーにおいてのみ観察された（それぞれ７３ｐｇ／ｍｌ及び１１７ｐｇ／ｍｌの平均で；図１０Ａ）。結核患者からのＰＢＭＣｓはＰＰＤに対して活発に応答したが（データは示されていない）、ＧｒｏＭＭはこのドナー集団においてバックグラウンド値を超えるＩＦＮ−γ分泌を誘発しなかった。同様に、未感染のＰＰＤネガティブドナーにおいては応答が全く観察されなかった。１型ＣＤ１分子に対して方向づけられたブロッキング抗体はＭＨＣ−Ｉブロッキング抗体と対照的に（データは示されていない）反応性を排除したので（図１０Ｂ）、ＧｒｏＭＭが誘発したＩＦＮ−γ分泌はＣＤ１拘束性であった。ヒトドナーの末梢血中のＧｒｏＭＭ特異的ＣＤ１拘束性Ｔ細胞の存在はそれゆえマイコバクテリウム誘発性Ｔ細胞記憶を示す。しかしながら、このことは健康なドナーについてのみ適用し、一方で活性な結核を伴う患者はＧｒｏＭＭを認識することができなかった。
【０１１６】
還元化合物の増大された活性
上記還元化合物の活性を試験するために、ＧｒｏＭＭ及び還元ＧｒｏＭＭのＩＦＮ−γ放出を計測することによるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激を計測した。図１３中に示されている結果は還元ＧｒｏＭＭの増大された活性を示す。
【０１１７】
マイコバクテリウムＧｒｏＭＭと脂質との組み合わせの相乗的活性
脂質がマイコバクテリウムＧｒｏＭＭの活性を増強しうるかどうかを試験するために、両方の剤単独又は組み合わせのＩＦＮ−γ放出を計測することによるＺ５Ｂ７１ Ｔ細胞クローンの刺激をさまざまなマイコバクテリウム脂質（Ａ）又はリン脂質（Ｂ）について計測した。図１４中に示されている結果は相乗効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１の式（Ｉ）の化合物：
【化１】
｛式中、Ｒは２０〜９０の炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；及び
*は不斉炭素原子を示す｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、Ｒが以下の式：
【化２】
のものであり、ここで（Ｉ）が
【化３】
をとおしてＲに結合されている；及び
Ｔがメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシを任意に含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１又は複数の基で任意に置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖を示す；
**が不斉炭素を示す；
ｎ１、ｎ２が互いに独立して同一又は異なる整数を示す、
医薬組成物。
【請求項３】
ｎ１が５〜４０の整数である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｎ２が５〜３０の整数である、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項２、３又は４に記載の医薬組成物であって、Ｔが：
−メチル基；又は
−１〜５の二重結合（単数又は複数）を任意に含む有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０；又は
−式：
【化４】
の基
から選択される
ここで
Ｘが：
【化５】
から選択される
Ｙが：
【化６】
から選択される
そしてｎ３、ｎ４が互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示す、
ここで、Ｙが
【化７】
であるとき、Ｔは
【化８】
である、
医薬組成物。
【請求項６】
ｎ３が１２〜１６の整数を示す、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ｎ４が１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項に定義されるような少なくとも２の異なる式（Ｉ）の化合物を含む前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記請求項のいずれか１項に定義されるような式（Ｉ）の化合物の混合物を含む前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が経口又は注入経路による投与のために意図される形態で提示される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が結核の治療又は予防に有用な１又は複数の他の製品を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
結核の治療又は予防に有用な前記製品がＢＣＧ又はマイコバクテリウム脂質から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記マイコバクテリウム脂質がマイコバクテリウムリン脂質、マイコバクテリウムリポグリカン、マイコバクテリウム糖脂質及びリン脂質から成る群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
結核の治療又は予防における同時の、別々の又は連続した使用のための混合調製物としての請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ワクチンである、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物：
【化９】
｛式中、Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；
*は不斉炭素原子を示す；及び
Ｒは式：
【化１０】
のものであり、ここで（Ｉ）は
【化１１】
をとおしてＲに結合されている；
**は不斉炭素を示す；
同一である又は異なるｎ１、ｎ２は独立に整数を示す；及び
Ｔは式：
【化１２】
の基であり、ここで：
ｎ３、ｎ４は互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示す
Ｘは：
【化１３】
から選択される
及びＹは
【化１４】
である｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物。
【請求項１７】
式（Ｉ）の化合物：
【化１５】
｛Ｒは２０〜９０の炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；及び
*は不斉炭素原子を示す｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の化合物であって、Ｒが式：
【化１６】
のものである、ここで（Ｉ）が
【化１７】
をとおしてＲに結合されている；及び
Ｔがメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシを任意に含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１又は複数の基で任意に置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖を示す；
**が不斉炭素を示す；
ｎ１、ｎ２が互いに独立して同一又は異なる整数を示す、
化合物。
【請求項１９】
ｎ１が５〜４０の整数であり、そしてｎ２が５〜３０の整数である、請求項１６、１７又は１８に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の化合物であって、Ｔが：
−メチル基；又は
−１〜５個の二重結合（単数又は複数）を任意に含む、有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０；又は
−式：
【化１８】
｛Ｘは：
【化１９】
から選択される
Ｙは：
【化２０】
から選択される｝
の基
から選択され、そしてｎ３、ｎ４が互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示し、ここでＹが
【化２１】
であるとき、Ｔは
【化２２】
である、化合物。
【請求項２１】
ｎ３が１２〜１６の整数を示し、そしてｎ４が１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、請求項１６又は２０に記載の化合物。
【請求項２２】
式（Ｉ）においてＣ*が（Ｒ）配置を示す点で特徴づけられる、請求項１〜１５のいずれか１項に定義される化合物。
【請求項２３】
結核の治療又は予防のために意図される医薬の調製のための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２４】
結核の治療又は予防のための医薬としての請求項１〜２２のいずれか１項に定義される化合物。
【請求項２５】
免疫反応アクチベーターとしての請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２６】
Ｔリンパ球の活性化を誘発するための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２７】
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの生成を誘発するための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２８】
請求項１〜２２のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の化合物に特異的なＴ細胞クローンの作出のためのプロセスであって、以下の段階：
１）抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞をヒト結核菌脂質調製物を除く放線菌類脂質調製物又は式（Ｉ）の化合物とインキュベートする、
２）増殖Ｔ細胞を得るために末梢血単核細胞をエンベロープ抗原ロードＡＰＣｓと接触させる、
３）限界希釈し、そして式（Ｉ）の化合物に接触されるときＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を放出するクローンを選択することにより増殖Ｔ細胞をクローニングする
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項２９】
段階１）において、放線菌類脂質調製物がウシ結核菌ＢＣＧ脂質調製物である、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプロセスにより得られるＴ細胞クローン。
【請求項３１】
生成物をスクリーニングするためのプロセスであって、以下の段階：
−スクリーニングする生成物を持っている樹状細胞を請求項３０に記載のＴ細胞クローンと接触させる、
−上記Ｔ細胞クローンにより放出される、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を検出する
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項３２】
放線菌類からの請求項１〜２２のいずれか１項に定義される化合物の抽出のためのプロセスであって、以下の段階：
ａ．クロロフォルム／メタノール抽出物を得るためのメタノール及びクロロフォルムの混合物での上記細菌の処理、
ｂ．上記クロロフォルム／メタノール抽出物の濃縮、続いてクロロフォルム相（本明細書中で脂質画分と呼ばれる）及び水相の間でのその分割、
ｃ．上記脂質画分を取り去ること
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項３３】
請求項３２に記載のプロセスであって、以下の追加の段階：
ｄ．ほとんどのクロロフォルムの蒸発、続いてそれへのアセトンの添加により沈殿物及び可溶性アセトン相を得ること、
ｅ．アセトン不溶相を取ること、続いてその濃縮、続いてメタノールの添加により沈殿物及びメタノール不溶相を得ること、
ｆ．メタノール不溶相を取ること、続いてその濃縮及び濃縮されたメタノール不溶相の珪酸カラムへの適用
ｇ．クロロフォルム、メタノール及びそれらの混合物による上記に挙げられる珪酸カラムからの画分の溶離、ここで前記画分は上記に定義される組成物に対応する、
ｈ．必要な場合、上記珪酸カラムから溶離された画分の精製によりそれぞれ上記に定義される化合物の１つのみを実質的に含む異なる調製物を得ること
をさらに含む、プロセス。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載のプロセスにより得られる組成物。
【請求項１】
少なくとも１の式（Ｉ）の化合物：
【化１】
｛式中、Ｒは２０〜９０の炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；及び
*は不斉炭素原子を示す｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物を含む医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、Ｒが以下の式：
【化２】
のものであり、ここで（Ｉ）が
【化３】
をとおしてＲに結合されている；及び
Ｔがメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシを任意に含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１又は複数の基で任意に置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖を示す；
**が不斉炭素を示す；
ｎ１、ｎ２が互いに独立して同一又は異なる整数を示す、
医薬組成物。
【請求項３】
ｎ１が５〜４０の整数である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｎ２が５〜３０の整数である、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項２、３又は４に記載の医薬組成物であって、Ｔが：
−メチル基；又は
−１〜５の二重結合（単数又は複数）を任意に含む有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０；又は
−式：
【化４】
の基
から選択される
ここで
Ｘが：
【化５】
から選択される
Ｙが：
【化６】
から選択される
そしてｎ３、ｎ４が互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示す、
ここで、Ｙが
【化７】
であるとき、Ｔは
【化８】
である、
医薬組成物。
【請求項６】
ｎ３が１２〜１６の整数を示す、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ｎ４が１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１項に定義されるような少なくとも２の異なる式（Ｉ）の化合物を含む前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記請求項のいずれか１項に定義されるような式（Ｉ）の化合物の混合物を含む前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が経口又は注入経路による投与のために意図される形態で提示される点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が結核の治療又は予防に有用な１又は複数の他の製品を含む点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
結核の治療又は予防に有用な前記製品がＢＣＧ又はマイコバクテリウム脂質から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記マイコバクテリウム脂質がマイコバクテリウムリン脂質、マイコバクテリウムリポグリカン、マイコバクテリウム糖脂質及びリン脂質から成る群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
結核の治療又は予防における同時の、別々の又は連続した使用のための混合調製物としての請求項１１、１２又は１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ワクチンである、前記請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
式（Ｉ）の化合物：
【化９】
｛式中、Ｒ’は水素原子又はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；
*は不斉炭素原子を示す；及び
Ｒは式：
【化１０】
のものであり、ここで（Ｉ）は
【化１１】
をとおしてＲに結合されている；
**は不斉炭素を示す；
同一である又は異なるｎ１、ｎ２は独立に整数を示す；及び
Ｔは式：
【化１２】
の基であり、ここで：
ｎ３、ｎ４は互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示す
Ｘは：
【化１３】
から選択される
及びＹは
【化１４】
である｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物。
【請求項１７】
式（Ｉ）の化合物：
【化１５】
｛Ｒは２０〜９０の炭素原子を含むα−アルキル化、β−ヒドロキシル化カルボン酸の残基である；
Ｒ’はアシル基（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）を示し、ここでアルキルは１〜１０の炭素原子を含む；及び
*は不斉炭素原子を示す｝
及びそのエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、それらの混合物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の化合物であって、Ｒが式：
【化１６】
のものである、ここで（Ｉ）が
【化１７】
をとおしてＲに結合されている；及び
Ｔがメチル基又は１又は複数の二重結合（単数又は複数）、−（Ｃ＝Ｏ）−基、シクロプロピル及び／又はエポキシを任意に含み、そして／又はＯＨ、Ｏメチルから選択される１又は複数の基で任意に置換される有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０炭化水素鎖を示す；
**が不斉炭素を示す；
ｎ１、ｎ２が互いに独立して同一又は異なる整数を示す、
化合物。
【請求項１９】
ｎ１が５〜４０の整数であり、そしてｎ２が５〜３０の整数である、請求項１６、１７又は１８に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の化合物であって、Ｔが：
−メチル基；又は
−１〜５個の二重結合（単数又は複数）を任意に含む、有枝鎖又は直鎖Ｃ１０−Ｃ６０；又は
−式：
【化１８】
｛Ｘは：
【化１９】
から選択される
Ｙは：
【化２０】
から選択される｝
の基
から選択され、そしてｎ３、ｎ４が互いに独立して同一又は異なる５〜３０の整数を示し、ここでＹが
【化２１】
であるとき、Ｔは
【化２２】
である、化合物。
【請求項２１】
ｎ３が１２〜１６の整数を示し、そしてｎ４が１１、１３、１５、１７、１８及び１９から選択される、請求項１６又は２０に記載の化合物。
【請求項２２】
式（Ｉ）においてＣ*が（Ｒ）配置を示す点で特徴づけられる、請求項１〜１５のいずれか１項に定義される化合物。
【請求項２３】
結核の治療又は予防のために意図される医薬の調製のための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２４】
結核の治療又は予防のための医薬としての請求項１〜２２のいずれか１項に定義される化合物。
【請求項２５】
免疫反応アクチベーターとしての請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２６】
Ｔリンパ球の活性化を誘発するための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２７】
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦの生成を誘発するための請求項１〜２２のいずれか１項に定義される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２８】
請求項１〜２２のいずれか１項に定義される式（Ｉ）の化合物に特異的なＴ細胞クローンの作出のためのプロセスであって、以下の段階：
１）抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）、特に樹状細胞をヒト結核菌脂質調製物を除く放線菌類脂質調製物又は式（Ｉ）の化合物とインキュベートする、
２）増殖Ｔ細胞を得るために末梢血単核細胞をエンベロープ抗原ロードＡＰＣｓと接触させる、
３）限界希釈し、そして式（Ｉ）の化合物に接触されるときＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を放出するクローンを選択することにより増殖Ｔ細胞をクローニングする
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項２９】
段階１）において、放線菌類脂質調製物がウシ結核菌ＢＣＧ脂質調製物である、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプロセスにより得られるＴ細胞クローン。
【請求項３１】
生成物をスクリーニングするためのプロセスであって、以下の段階：
−スクリーニングする生成物を持っている樹状細胞を請求項３０に記載のＴ細胞クローンと接触させる、
−上記Ｔ細胞クローンにより放出される、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２又はＩＬ−４の如きサイトカインを含む群から選択される分子を検出する
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項３２】
放線菌類からの請求項１〜２２のいずれか１項に定義される化合物の抽出のためのプロセスであって、以下の段階：
ａ．クロロフォルム／メタノール抽出物を得るためのメタノール及びクロロフォルムの混合物での上記細菌の処理、
ｂ．上記クロロフォルム／メタノール抽出物の濃縮、続いてクロロフォルム相（本明細書中で脂質画分と呼ばれる）及び水相の間でのその分割、
ｃ．上記脂質画分を取り去ること
を含む点で特徴づけられる、プロセス。
【請求項３３】
請求項３２に記載のプロセスであって、以下の追加の段階：
ｄ．ほとんどのクロロフォルムの蒸発、続いてそれへのアセトンの添加により沈殿物及び可溶性アセトン相を得ること、
ｅ．アセトン不溶相を取ること、続いてその濃縮、続いてメタノールの添加により沈殿物及びメタノール不溶相を得ること、
ｆ．メタノール不溶相を取ること、続いてその濃縮及び濃縮されたメタノール不溶相の珪酸カラムへの適用
ｇ．クロロフォルム、メタノール及びそれらの混合物による上記に挙げられる珪酸カラムからの画分の溶離、ここで前記画分は上記に定義される組成物に対応する、
ｈ．必要な場合、上記珪酸カラムから溶離された画分の精製によりそれぞれ上記に定義される化合物の１つのみを実質的に含む異なる調製物を得ること
をさらに含む、プロセス。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載のプロセスにより得られる組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５００５４０（Ｐ２０１１−５００５４０Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８４３１（Ｐ２０１０−５２８４３１）
【出願日】平成２０年１０月１３日（２００８．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３７３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３６３
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１３日（２００８．１０．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３７３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３６３
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
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