斑点米カメムシ忌避物質
【課題】斑点米カメムシ忌避物質の提供。
【解決手段】式（Ｉ）：
（Ｉ）［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤、該化合物を用いるカメムシの忌避方法、ならびにいくつかの式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【解決手段】式（Ｉ）：
（Ｉ）［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤、該化合物を用いるカメムシの忌避方法、ならびにいくつかの式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カメムシの忌避剤および忌避方法、ならびにカメムシの忌避化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、カメムシによる農作物の被害が急増している。特に、斑点米カメムシはイネ種子のデンプン質を消化液で溶かして吸汁する。このとき吸汁された部分は雑菌が繁殖しやすく、吸汁痕の周辺が渇変し、斑点米となる。斑点米が収穫米に混入していると見た目、食感ともに悪くなり、米の商品価値が低下する。そのことから斑点米カメムシは稲作における重要害虫とされている。近年のカメムシの多発生の要因としては、除草されていない休耕田などの面積が増加していることが挙げられる。これにより斑点米カメムシはイネが出穂するまでの間でも繁殖しやすくなり、水田への飛来数が増えていると考えられる。
【０００３】
カメムシ、特に斑点米カメムシの被害への対策としては、殺虫剤の散布や畦畔上の雑草の刈り払いなどが挙げられる。他所から次々と飛来するカメムシを防除するには、これらの対策を頻繁に行う必要がある。カメムシへの対策としては、殺虫剤を含む農薬を散布する方法もある。殺虫剤としては、一般的に有機リン剤のＭＥＰ（フェニトロチオン）、ＰＡＰ（フェントエート）または合成ピレスロイド剤のエトフェンプロックス、シラフルオフェン、あるいはネオニコチノイド系の化合物などが有効とされている（非特許文献１等参照）。しかし、殺虫剤を含む農薬の散布は人体や生態系への影響が懸念される。除草剤の散布も同様に人体や生態系への影響が懸念される。さらに近年は減農薬農業の必要性が叫ばれている。また雑草の刈り払いはカメムシの越冬、繁殖場所を減らす意味があり重要であるが、除草作業は重労働であるうえ、除草時期を間違えると逆に田畑にカメムシを追い込む危険性がある。
【０００４】
このような事情から、殺虫剤、除草剤、あるいは除草に代わる新たなカメムシの防除方法およびそれに用いるカメムシ忌避剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】松崎沙和子・武衛和雄 著 都市害虫百科 朝倉書店（１９９３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、安全で簡便、かつ有効なカメムシの忌避あるいは防除物質を見出すこと、これを用いてカメムシを忌避あるいは防除すること、そしてかかる物質を製造するための方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、イネ科植物からエンドファイトを分離し、その代謝産物中にカメムシ忌避活性を有する化合物を同定し、その誘導体が高いカメムシ忌避活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記（１）〜（８）を提供する。
（１）式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤；
（２）化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である（１）記載のカメムシ忌避剤；
（３）カメムシが斑点米カメムシである（１）または（２）記載の忌避剤；
（４）式（Ｉ）：
【化３】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法；
（５）化合物が、式（ＩＩ）：
【化４】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である（４）記載のカメムシの忌避方法；
（６）カメムシが斑点米カメムシである（４）または（５）記載のカメムシの忌避方法；
（７）式（ＩＩ）：
【化５】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）Biscogniauxia属の菌を培養し；
（ｂ）培養液を有機溶媒にて抽出し；
（ｃ）有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールを得て；次いで
（ｄ）上記（ｃ）で得られた３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールの８位の水酸基をエステル化する
を特徴とする製造方法；
（８）Biscogniauxia属の菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として受領された菌である、（７）記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安全で簡便、かつ有効なカメムシの忌避あるいは防除物質、これを用いるカメムシの忌避あるいは防除方法、そしてかかる物質を製造するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のカメムシ忌避剤の忌避活性測定装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、本発明のカメムシ忌避剤の忌避活性を調べた結果を示す図である。図中のcompound 1、compound 2、compound 3、compound 4はそれぞれ明細書中の誘導体１、誘導体２、誘導体３、誘導体４である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、式（Ｉ）：
【化６】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤を提供する。
【００１２】
本発明のカメムシ忌避剤の有効成分である化合物は上式（Ｉ）で示される化合物である。本発明の好ましい式（Ｉ）の化合物はＲがＣＯＣ１−６アルキルであり、Ｘがメチル、ＹおよびＺが水素である化合物、すなわち式（ＩＩ）：
【化７】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物である。上記の好ましい式（ＩＩ）の化合物のうち、さらに好ましい化合物はＲがＣＯＣ１−３アルキルである化合物である。
【００１３】
本明細書においてＣ１−６アルキルとは炭素数１〜６個のアルキル基を表し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル基、ならびにそれらの幾何異性体を包含する。またＣ１−３アルキルとは炭素数１〜３個のアルキル基を表し、メチル、エチルおよびプロピル、ならびにそれらの幾何異性体を包含する。
【００１４】
合成農薬は作物や土壌への汚染や、人畜を含む環境への残留が問題となっている。そこで本発明においては天然物中のカメムシ忌避物質に着目した。さらに忌避物質の使用は殺虫物質と比べて生態系への影響も少ないと考えられる。また、次々と飛来してくるカメムシに対し、逐一殺虫剤などで防除・駆除するよりも忌避剤を用いてその流入を抑制・防止する方が効果的で、作業効率高いと考えられる。今回の発明では、天然由来の物質を検索するにあたって植物と共生している微生物にも着目した。その結果、イネ科植物に共生しているエンドファイト（植物内で相利共生的に生活している微生物）がカメムシの忌避物質３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（式（ＩＩ）においてＲ＝Ｈである化合物）を産生することを見出した。実施例にて説明するように、このエンドファイトはイネ科のエノコログサから分離されたものである。３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールはそれ自体カメムシ忌避活性を有するが、その誘導体にさらに高い忌避活性を有するものが見出された。
【００１５】
本明細書においてカメムシとは、半翅目・異翅亜目に属する昆虫をいう。このような昆虫には、例えばカメムシ科、カスミカメ科、ナガカメムシ科、ヘリカメムシ科の昆虫が包含される。カメムシはあらゆる農作物を吸汁し、被害を及ぼす。したがって、本発明のカメムシ忌避剤の適用範囲はあらゆる農作物を吸汁するあらゆるカメムシであり、穀類（イネ、ムギ、アワ、ヒエなど）を吸汁するカメムシ（例：アオクサカメ、クロカメムシ、ミナミアオカメムシ、コバネヒョウタンナガカメなど）、果樹類（ミカン、ナシ、リンゴ、モモ、サクランボなど）を吸汁するカメムシ（例：クサギカメ、チャバネアオカメ、ツヤアオカメなど）、野菜類（ナス、トマト、キュウリ、キャベツ、ハクサイなど）を吸汁するカメムシ（例：ナガメやホソヘリカメ、ホオヅキヘリカメなど、ダイズなどのマメ類を吸汁するカメムシ（例：ホソヘリカメムシ、イチモンジカメムシ、アオクサカメムシ、ブチヒゲカメムシなど）などが包含される。特に本発明の忌避剤は、斑点米カメムシに対して好ましく適用される。斑点米カメムシは約６０種が知られており、アカヒゲホソミドリカスミカメ、クモヘリカメムシ、アカスジカスミカメ、クモヘリカメムシ、ミナミアオカメムシなどが挙げられるが、本発明のカメムシ忌避剤の適用範囲はこれらのカメムシに限定されない。
【００１６】
本発明のカメムシ忌避剤の剤形はいずれのものであってもよく、固形（粒状、粉末など）、液状（溶液、懸濁液など）、半固形（ペーストなど）であってもよい。本発明のカメムシ忌避剤の適用様式・手段は、カメムシを忌避させることができればいずれの様式・手段であってもかまわないが、例えば、植物に散布または塗布する、例えば、噴霧器を用いて植物に噴霧する、適切な手段にて植物近辺に設置または散布する、例えば、フェルトやスポンジ等に染みこませたものを植物近傍に設置する、あるいは本発明のカメムシ忌避剤をボトルなどに入れて植物近傍に設置して蒸散させる、本発明のカメムシ忌避剤を染み込ませたシートを植物が栽培されている地面に設置する，地上数１０センチに張り巡らせたヒモにつるす，植物の茎葉に直接掛ける等の様式・手段が例示される。本発明の忌避剤の好ましい適用様式・手段は植物や地面に直接薬剤が触れない等の様式・手段である。
【００１７】
本発明のカメムシ忌避剤の適用量は、カメムシを忌避させることができればいずれの適用量であってもよいが、好ましくは、植物自体、および周囲の環境、人畜に害を及ぼさない程度の適用量とする。このような適用量としては、急性毒性試験から得られるLD50値，慢性毒性試験から得られる無毒性量から算出される量などが例示される。本発明のカメムシ忌避剤の好ましい適用量は、毒性試験や実際のフィールドでの効果を考慮して決定することができる。
【００１８】
本発明のカメムシ忌避剤を単独で用いてもよく、あるいは他の薬剤、例えば、生物忌避剤、殺生物剤、防虫剤、除虫剤、殺虫剤などと併用してもよい。
【００１９】
本発明は、もう１つの態様において、式（Ｉ）で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法を提供する。好ましい式（Ｉ）の化合物、該方法の適用範囲、適用様式、該方法における忌避剤の適用量は上で説明したとおりである。
【００２０】
本発明は、さらなる態様において、式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法を提供する。該方法は、Biscogniauxia属の菌を培養し；培養液を有機溶媒にて抽出し；有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（以下、「ＭＦＰ」と略称）を得て；次いで、前行程で得られたＭＦＰの化合物の８位の水酸基をエステル化することを特徴とする。
【００２１】
使用するBiscogniauxia属の菌はＭＦＰを産生するものであればよく、好ましくは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２００９年８月１３日に受領されている菌株（本明細書においてＨ−ｓ ２５９菌と称する）である。培養条件は液体培養、固体培養いずれであってもよく、大量生産の観点から液体培養が好ましい。培養条件は当業者に公知の糸状菌の培養条件を用いることができる。培養装置等のも当業者が適宜選択できる。Ｈ−ｓ ２５９菌を液体培養する場合には、麦芽浸出培地で２０〜２８℃で１０〜２０日間静置培養してもよい。
【００２２】
得られた培養物を、例えばアセトン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒（あるいは有機溶媒の混合物）にて抽出し、有機抽出画分を得る。これらの操作は当業者に公知である。得られた有機抽出画分からの、ＭＦＰの精製・単離もまた当業者に公知の手段・方法を用いて行うことができる。例えば、アセトン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒、あるいはそれらの混合物を溶出溶媒として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ＭＦＰを精製・単離してもよい。
【００２３】
得られたＭＦＰの８位の水酸基を当業者に公知の手段・方法によりエステル化して、本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ることができる。本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造方法は上記方法に限定されず、当業者に公知の方法により合成することができる。ＭＦＰの化学合成法も当業者に公知である。
【００２４】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２５】
実施例１：エンドファイトの分離および同定
鳥取大学構内各所で採取したイネ科野草を採取した。葉部、葉鞘部を５ｍｍ程度の切片となるよう切断した。これらの切片をクリーンベンチ内で１００％のエタノールに１分浸し、植物組織表面のワックスを溶かした。次いで３〜５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液内で１〜５分撹拌し、表面を殺菌した。これを滅菌水で３回洗い、滅菌したカミソリで細かく刻み、プラスチックシャーレ中に調製した糸状菌探索用の麦芽固体培地（水１Ｌに対し麦芽エキス５０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン３ｇ、寒天２０ｇ、ストレプトマイシン５０ｍｇ）に置床した。これを２４℃で培養した。植物組織の切り口付近から生育してきた菌を順次新しい麦芽固体培地に植え替え、菌が単一になったところで麦芽斜面培地（水１Ｌに対し麦芽エキス５０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン３ｇ、寒天２０ｇ）に分離した。
【００２６】
分離したエンドファイトを麦芽浸出培地に接種し、２４℃で７日間培養した。培養後吸飲濾過により濾液と菌体に濾別し、それぞれから抽出物を得た。これらの抽出物について、実施例２で説明する忌避活性試験を行い、忌避活性の強いものを探索した。その結果、鳥取大学構内で採取したエノコログサから分離されたエンドファイトの培養濾液に、特に強い忌避活性を見出した。このエンドファイトをＨ−ｓ ２５９菌と命名した。
【００２７】
Ｈ−ｓ ２５９菌を麦芽寒天培地およびＰＤＡ寒天培地に接種し、２４℃で７日間培養したところ、白い綿毛状の菌叢を呈し、胞子の形成は見られなかった。Ｈ−ｓ ２５９菌からＤＮＡを抽出し、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域について配列決定を行った。決定された配列についてＤＤＢＪのＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、子のう菌亜門の核菌綱にBiscogniauxia atropunctataに対して９２％の相同性が確認され、Ｈ−ｓ ２５９菌をBiscogniauxia atropunctataの一菌株と同定した。Ｈ−ｓ ２５９菌は、２００９年８月１３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６を与えられた。
【実施例２】
【００２８】
実施例２：Ｈ−ｓ ２５９菌の産生する忌避物質の同定
Ｈ−ｓ ２５９菌を麦芽浸出培地１０Ｌに接種し、２４℃で１４日間静置培養した。この培養濾液を酢酸エチルを用いて抽出し、抽出物を得た。この抽出物について、忌避活性を指標として精製を進めた。溶出溶媒としてアセトン、ｎ−ヘキサンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで抽出物を分画し、ｎ−ヘキサン中１０％アセトンで溶出したフラクションに非常に強い忌避活性が見られた。このフラクションをｎ−ヘキサン中含水酢酸エチルを溶出溶媒としてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、強い忌避活性を示したフラクションをシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、強い忌避活性が見られたフラクションを得た。これをＨＰＬＣにて分取し、無色油状化合物（化合物Ａ）を得た。化合物ＡはＵＶ（２５４ｎｍ）照射下で蛍光を発した。化合物Ａの機器分析データを表１、表２に示す。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲにはＪＯＥＬ ＪＭＮ−ＥＣＰ５００ ＮＭＲスペクトロメーターを、質量分析にはＪＯＥＬ ＡＸ−５０５ＨＡスペクトロメーターを、ＨＰＬＣにはＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ液体クロマトグラフィーを用いた。
【表１】
【表２】
【００２９】
これらの結果から、化合物Ａを３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（ＭＦＰと略称）と同定した。ＭＦＰの構造式を以下に示す。
【化８】
【００３０】
マルシラホシカメムシを用いてＭＦＰの忌避活性を調べた。忌避活性の試験方法を以下に説明する。
（ａ）供試虫
屋外で採取したマルシラホシカメムシは、餌となるスズメノカタビラやオシヒバなどのイネ科植物を植えたデシケーターに入れ、室温で飼育した。
【００３１】
（ｂ）試験装置の組み立て
直径９ｃｍのポリ塩化ビニル管とプラスチックシャーレ（１．５ｘ９ｃｍ）のフタを用意した。ポリ塩化ビニル管は真っ直ぐに２ｃｍ、４ｃｍの高さで輪切りにした。黒画用紙と濾紙を直径９ｃｍの円形に切り抜いたものを用意した。
（ｂ−１）試験装置上部の組み立て
２ｃｍに切ったポリ塩化ビニル管の内壁にカメムシの頭皮を防止するためにシリコングリースを薄く塗った。試験管（φ１ｃｍ）の口をガスバーナーで熱し、プラスチックシャーレの端から１ｃｍの位置に押しつけて穴を開けた。濾紙も端から１ｃｍの位置に直径１ｃｍの穴を開けた。この濾紙を穴が重なるようにプラスチックシャーレの上に敷き、シリコングリースを塗っておいたポリ塩化ビニル管を置いた。そして光が入らないようにプラスチックシャーレの壁にビニールテープを数回巻いた。
（ｂ−２）試験装置下部の組み立て
黒画用紙をプラスチックシャーレに敷き、４ｃｍに切ったポリ塩化ビニル管を置いた。そして光が入らないようにプラスチックシャーレの壁にビニールテープを数回巻いた。
試験装置上部と下部を組合せ、隙間ができないことを確認してから使用した。試験装置の構造を図１に示す。
【００３２】
（ｃ）忌避活性試験法
０．５ｘ４ｃｍに切った濾紙の切片をφ１ｘ３．５ｃｍのサンプル管に挿し、アセトンに溶解させたサンプル５０μＬをシリンジ等を使って滴下し染み込ませた。コントロールとしてアセトンのみを５０μＬ滴下したものも用意し、この二つを３０分風乾させてアセトンを除去した。その後、サンプルと濾紙が入ったサンプル管を試験装置の穴に挿した。次に、シリコングリースを塗ったφ３．５ｘ１ｃｍのシャーレ中に取り分けておいたマルシラホシカメムシ２０匹、試験装置の穴と穴との間に逆さまにして置き、シャーレを除去せずに試験装置を人工気象器内の中央に入れた。人工気象器内の温度を１０℃に設定し、ライトをすべて付けた状態にしておいた。３分間待ってカメムシを安定させ後、シャーレを除去して試験を開始した。１試験３０分のサイクルで両方のサンプル管に入っている虫の数と外に出ている虫の数を記録した。この操作を４回繰り返した。また、条件をそろえるため、サンプル投与側とコントロール側の穴を交互に変えて試験した。忌避度は下式により算出した。
忌避度＝｛［（Ｃ／Ｃ＋Ｔ）Ｘ１００］−５０｝Ｘ２
Ｃ：コントロールのサンプル管に入った虫の数
Ｔ：サンプル投与側のサンプル管に入った虫の数
４回の試験の平均忌避度と標準誤差を算出した。なお、試験終了後にサンプル管内に入っていない虫の数は無視した。
【００３３】
ナフタレンとＭＦＰの忌避活性を表３に示す。ナフタレンは０．５ｍｇでは強い忌避活性を示すが、０．１ｍｇでは全く忌避活性を示さなかった。ＭＦＰは０．１ｍｇでも忌避度５０を超える強い忌避活性を示した。ＭＦＰは０．５ｍｇでもナフタレンよりも強い忌避活性を示した。これらの結果、および各化合物の分子量を考慮すると、ＭＦＰはポジティブコントロールであるナフタレンよりも強い忌避活性を有していることがわかった。
【表３】
【実施例３】
【００３４】
実施例３：ＭＦＰ誘導体の合成
下記の誘導体を合成した。
【化９】
誘導体１（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣＨ３）
【化１０】
誘導体２（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ２Ｈ５）
【化１１】
誘導体３（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ３Ｈ７）
【化１２】
誘導体４（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ６Ｈ５）
【００３５】
（１）ＭＦＰの調製
５００ｍＬ容三角フラスコに２００ｍＬの麦芽浸出培地を調製した。Ｈ−ｓ ２５９菌をこの培地５０本に接種し、２４℃で１４日間静置培養した。培養終了後、ろ液と菌体にろ別した。この培養ろ液１０Ｌを６Ｍ塩酸でｐＨ２付近に調整した。これを酢酸エチルで３回抽出し、抽出液を得た。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて一晩放置して脱水した。これを減圧下で濃縮し、ろ液抽出物を得た。この抽出物をアセトンに溶解し、Ｄａｉｓｏｇｅｌ ＩＲ−６０を３０．５ｇ加えた。抽出物をゲルに吸着させ、これをＤａｉｓｏｇｅｌ ＩＲ−６０（φ８８／１２５μｍ）のカラム（φ６．２×７２ｃｍ）にのせシリカゲルドライカラムクロマトグラフィーを行った。溶出溶媒として０、５、１０、２０、３０、１００％（ｖ／ｖ）のアセトンを含むｎ−ヘキサンを用いた。溶媒はそれぞれ８Ｌ流し、溶出液を減圧下で濃縮した。１０％フラクション２００ｍｇをアセトンに溶解し、１ｇのセライトを加え窒素気流下濃縮して吸着させた。これをＷａｋｏｇｅｌ ＦＣ−４０（φ２０−４０ｃｍ）のカラム（φ３×３９ｃｍ）にのせてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。溶出溶媒として０、５、１０、２０、３０、１００％（ｖ／ｖ）酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを含水にしたものを用いた。溶媒はそれぞれ２００ｍＬ流し、１０ｍＬずつ２０本の試験管に分取し、これを減圧下で濃縮した。得られた各フラクションについて５０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒としてシリカゲル薄層クロマトグラフィーを行った。ＵＶ（２５４ｎｍ）照射下で類似するスポットをもつフラクションをまとめ、２０％フラクション１−９にＭＦＰを得た。またアッセイ用として純度の高いＭＦＰを得るためにＨＰＬＣで分取した。保持時間２９分のフラクションを酢酸エチルで抽出し、純度の高いＭＦＰを得た。ＨＰＬＣの条件を表４に示す。
【表４】
【００３６】
（２）誘導体１の合成
ＭＦＰ（１０．１ｍｇ）をピリジン５００μＬに溶解し、無水酢酸５００μＬを添加し、室温で一晩反応させた。氷を入れた蒸留水をスターラーで撹拌しながら６Ｍ塩酸でｐＨ２に調整し、反応液を滴下し１時間撹拌した。撹拌後、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、Ｒｆ値０．２７を示す無色の油状物質である誘導体１（８．９ｍｇ）を得た。
誘導体１のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表５に示す。
【表５】
【００３７】
（３）誘導体２の合成
ＭＦＰ（９．５ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（２Ｎ，１１．３ｍｇ）を加え、塩化プロピオニル（２Ｎ，１２．９ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（８．１ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．６１のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体２（７．６ｍｇ）を得た。
誘導体２のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表６に示す。
【表６】
【００３８】
（４）誘導体３の合成
ＭＦＰ（９．７ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（４Ｎ，２２．６ｍｇ）を加え、塩化ブチリル（４Ｎ，２９．８ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（１０．６ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．５７のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体３（４．０ｍｇ）を得た。
誘導体３のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表７に示す。
【表７】
【００３９】
（５）誘導体４の合成
ＭＦＰ（１１．５ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（３Ｎ，１８．９ｍｇ）を加え、塩化ブチリル（３Ｎ，３３．７ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（２４．５ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．５７のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体４（７．４ｍｇ）を得た。
誘導体４のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表８に示す。
【表８】
【００４０】
これらのＮＭＲスペクトルおよびＭＳスペクトルのデータから、合成した誘導体１〜４の化学構造の正しさを確認した。
【実施例４】
【００４１】
実施例４：本発明の化合物の忌避活性
実施例３にて合成した誘導体１〜４、ＭＦＰ、ナフタレンについて、実施例２で説明したようにマルシラホシカメムシを用いて忌避活性を調べた。結果を図２に示す。誘導体１、誘導体２、誘導体３はＭＦＰよりも忌避活性が強かった。誘導体１が最も高い忌避活性を示し、次いで誘導体２、誘導体３、ＭＦＰの順で忌避活性が低くなった。これらの結果から、８位の水酸基がエステル化されると忌避活性が強くなる傾向が認められた。このことから８位の水酸基は忌避活性に必須でないことがわかった。しかし、誘導体４はＭＦＰより忌避活性が弱いことから水酸基がベンゾイル化されると忌避活性が弱くなる傾向が認められた。０．１μｍｏｌの投与量においても誘導体１の忌避活性が特に強かったのは、揮発性が高いからではないかと考えられる。
【実施例５】
【００４２】
実施例５：フィールドにおける適用例
厚手の丈夫な濾紙片（１ｘ５ｃｍ）に誘導体１のアセトン溶液（２ｍｇ／Ｌ）を１枚当たり０．１ｍＬを染みこませた。この濾紙片の一端に小さな穴を空け、細い針金を通し輪にした。これを１ｍ２当たり４本程度の登熟初期のイネの茎葉に掛けて斑点米カメムシの防除を図った。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、農業分野、特に野菜や果樹の栽培分野、ならびに農薬分野、特に害虫の忌避剤の製造分野において利用可能である。
【受託番号】
【００４４】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６
独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２００９年８月１３日に受領されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カメムシの忌避剤および忌避方法、ならびにカメムシの忌避化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、カメムシによる農作物の被害が急増している。特に、斑点米カメムシはイネ種子のデンプン質を消化液で溶かして吸汁する。このとき吸汁された部分は雑菌が繁殖しやすく、吸汁痕の周辺が渇変し、斑点米となる。斑点米が収穫米に混入していると見た目、食感ともに悪くなり、米の商品価値が低下する。そのことから斑点米カメムシは稲作における重要害虫とされている。近年のカメムシの多発生の要因としては、除草されていない休耕田などの面積が増加していることが挙げられる。これにより斑点米カメムシはイネが出穂するまでの間でも繁殖しやすくなり、水田への飛来数が増えていると考えられる。
【０００３】
カメムシ、特に斑点米カメムシの被害への対策としては、殺虫剤の散布や畦畔上の雑草の刈り払いなどが挙げられる。他所から次々と飛来するカメムシを防除するには、これらの対策を頻繁に行う必要がある。カメムシへの対策としては、殺虫剤を含む農薬を散布する方法もある。殺虫剤としては、一般的に有機リン剤のＭＥＰ（フェニトロチオン）、ＰＡＰ（フェントエート）または合成ピレスロイド剤のエトフェンプロックス、シラフルオフェン、あるいはネオニコチノイド系の化合物などが有効とされている（非特許文献１等参照）。しかし、殺虫剤を含む農薬の散布は人体や生態系への影響が懸念される。除草剤の散布も同様に人体や生態系への影響が懸念される。さらに近年は減農薬農業の必要性が叫ばれている。また雑草の刈り払いはカメムシの越冬、繁殖場所を減らす意味があり重要であるが、除草作業は重労働であるうえ、除草時期を間違えると逆に田畑にカメムシを追い込む危険性がある。
【０００４】
このような事情から、殺虫剤、除草剤、あるいは除草に代わる新たなカメムシの防除方法およびそれに用いるカメムシ忌避剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】松崎沙和子・武衛和雄 著 都市害虫百科 朝倉書店（１９９３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、安全で簡便、かつ有効なカメムシの忌避あるいは防除物質を見出すこと、これを用いてカメムシを忌避あるいは防除すること、そしてかかる物質を製造するための方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、イネ科植物からエンドファイトを分離し、その代謝産物中にカメムシ忌避活性を有する化合物を同定し、その誘導体が高いカメムシ忌避活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記（１）〜（８）を提供する。
（１）式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤；
（２）化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である（１）記載のカメムシ忌避剤；
（３）カメムシが斑点米カメムシである（１）または（２）記載の忌避剤；
（４）式（Ｉ）：
【化３】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法；
（５）化合物が、式（ＩＩ）：
【化４】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である（４）記載のカメムシの忌避方法；
（６）カメムシが斑点米カメムシである（４）または（５）記載のカメムシの忌避方法；
（７）式（ＩＩ）：
【化５】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）Biscogniauxia属の菌を培養し；
（ｂ）培養液を有機溶媒にて抽出し；
（ｃ）有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールを得て；次いで
（ｄ）上記（ｃ）で得られた３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールの８位の水酸基をエステル化する
を特徴とする製造方法；
（８）Biscogniauxia属の菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として受領された菌である、（７）記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安全で簡便、かつ有効なカメムシの忌避あるいは防除物質、これを用いるカメムシの忌避あるいは防除方法、そしてかかる物質を製造するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明のカメムシ忌避剤の忌避活性測定装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、本発明のカメムシ忌避剤の忌避活性を調べた結果を示す図である。図中のcompound 1、compound 2、compound 3、compound 4はそれぞれ明細書中の誘導体１、誘導体２、誘導体３、誘導体４である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１の態様において、式（Ｉ）：
【化６】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤を提供する。
【００１２】
本発明のカメムシ忌避剤の有効成分である化合物は上式（Ｉ）で示される化合物である。本発明の好ましい式（Ｉ）の化合物はＲがＣＯＣ１−６アルキルであり、Ｘがメチル、ＹおよびＺが水素である化合物、すなわち式（ＩＩ）：
【化７】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物である。上記の好ましい式（ＩＩ）の化合物のうち、さらに好ましい化合物はＲがＣＯＣ１−３アルキルである化合物である。
【００１３】
本明細書においてＣ１−６アルキルとは炭素数１〜６個のアルキル基を表し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル基、ならびにそれらの幾何異性体を包含する。またＣ１−３アルキルとは炭素数１〜３個のアルキル基を表し、メチル、エチルおよびプロピル、ならびにそれらの幾何異性体を包含する。
【００１４】
合成農薬は作物や土壌への汚染や、人畜を含む環境への残留が問題となっている。そこで本発明においては天然物中のカメムシ忌避物質に着目した。さらに忌避物質の使用は殺虫物質と比べて生態系への影響も少ないと考えられる。また、次々と飛来してくるカメムシに対し、逐一殺虫剤などで防除・駆除するよりも忌避剤を用いてその流入を抑制・防止する方が効果的で、作業効率高いと考えられる。今回の発明では、天然由来の物質を検索するにあたって植物と共生している微生物にも着目した。その結果、イネ科植物に共生しているエンドファイト（植物内で相利共生的に生活している微生物）がカメムシの忌避物質３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（式（ＩＩ）においてＲ＝Ｈである化合物）を産生することを見出した。実施例にて説明するように、このエンドファイトはイネ科のエノコログサから分離されたものである。３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールはそれ自体カメムシ忌避活性を有するが、その誘導体にさらに高い忌避活性を有するものが見出された。
【００１５】
本明細書においてカメムシとは、半翅目・異翅亜目に属する昆虫をいう。このような昆虫には、例えばカメムシ科、カスミカメ科、ナガカメムシ科、ヘリカメムシ科の昆虫が包含される。カメムシはあらゆる農作物を吸汁し、被害を及ぼす。したがって、本発明のカメムシ忌避剤の適用範囲はあらゆる農作物を吸汁するあらゆるカメムシであり、穀類（イネ、ムギ、アワ、ヒエなど）を吸汁するカメムシ（例：アオクサカメ、クロカメムシ、ミナミアオカメムシ、コバネヒョウタンナガカメなど）、果樹類（ミカン、ナシ、リンゴ、モモ、サクランボなど）を吸汁するカメムシ（例：クサギカメ、チャバネアオカメ、ツヤアオカメなど）、野菜類（ナス、トマト、キュウリ、キャベツ、ハクサイなど）を吸汁するカメムシ（例：ナガメやホソヘリカメ、ホオヅキヘリカメなど、ダイズなどのマメ類を吸汁するカメムシ（例：ホソヘリカメムシ、イチモンジカメムシ、アオクサカメムシ、ブチヒゲカメムシなど）などが包含される。特に本発明の忌避剤は、斑点米カメムシに対して好ましく適用される。斑点米カメムシは約６０種が知られており、アカヒゲホソミドリカスミカメ、クモヘリカメムシ、アカスジカスミカメ、クモヘリカメムシ、ミナミアオカメムシなどが挙げられるが、本発明のカメムシ忌避剤の適用範囲はこれらのカメムシに限定されない。
【００１６】
本発明のカメムシ忌避剤の剤形はいずれのものであってもよく、固形（粒状、粉末など）、液状（溶液、懸濁液など）、半固形（ペーストなど）であってもよい。本発明のカメムシ忌避剤の適用様式・手段は、カメムシを忌避させることができればいずれの様式・手段であってもかまわないが、例えば、植物に散布または塗布する、例えば、噴霧器を用いて植物に噴霧する、適切な手段にて植物近辺に設置または散布する、例えば、フェルトやスポンジ等に染みこませたものを植物近傍に設置する、あるいは本発明のカメムシ忌避剤をボトルなどに入れて植物近傍に設置して蒸散させる、本発明のカメムシ忌避剤を染み込ませたシートを植物が栽培されている地面に設置する，地上数１０センチに張り巡らせたヒモにつるす，植物の茎葉に直接掛ける等の様式・手段が例示される。本発明の忌避剤の好ましい適用様式・手段は植物や地面に直接薬剤が触れない等の様式・手段である。
【００１７】
本発明のカメムシ忌避剤の適用量は、カメムシを忌避させることができればいずれの適用量であってもよいが、好ましくは、植物自体、および周囲の環境、人畜に害を及ぼさない程度の適用量とする。このような適用量としては、急性毒性試験から得られるLD50値，慢性毒性試験から得られる無毒性量から算出される量などが例示される。本発明のカメムシ忌避剤の好ましい適用量は、毒性試験や実際のフィールドでの効果を考慮して決定することができる。
【００１８】
本発明のカメムシ忌避剤を単独で用いてもよく、あるいは他の薬剤、例えば、生物忌避剤、殺生物剤、防虫剤、除虫剤、殺虫剤などと併用してもよい。
【００１９】
本発明は、もう１つの態様において、式（Ｉ）で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法を提供する。好ましい式（Ｉ）の化合物、該方法の適用範囲、適用様式、該方法における忌避剤の適用量は上で説明したとおりである。
【００２０】
本発明は、さらなる態様において、式（ＩＩ）で示される化合物の製造方法を提供する。該方法は、Biscogniauxia属の菌を培養し；培養液を有機溶媒にて抽出し；有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（以下、「ＭＦＰ」と略称）を得て；次いで、前行程で得られたＭＦＰの化合物の８位の水酸基をエステル化することを特徴とする。
【００２１】
使用するBiscogniauxia属の菌はＭＦＰを産生するものであればよく、好ましくは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２００９年８月１３日に受領されている菌株（本明細書においてＨ−ｓ ２５９菌と称する）である。培養条件は液体培養、固体培養いずれであってもよく、大量生産の観点から液体培養が好ましい。培養条件は当業者に公知の糸状菌の培養条件を用いることができる。培養装置等のも当業者が適宜選択できる。Ｈ−ｓ ２５９菌を液体培養する場合には、麦芽浸出培地で２０〜２８℃で１０〜２０日間静置培養してもよい。
【００２２】
得られた培養物を、例えばアセトン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン等の有機溶媒（あるいは有機溶媒の混合物）にて抽出し、有機抽出画分を得る。これらの操作は当業者に公知である。得られた有機抽出画分からの、ＭＦＰの精製・単離もまた当業者に公知の手段・方法を用いて行うことができる。例えば、アセトン、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒、あるいはそれらの混合物を溶出溶媒として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ＭＦＰを精製・単離してもよい。
【００２３】
得られたＭＦＰの８位の水酸基を当業者に公知の手段・方法によりエステル化して、本発明の式（ＩＩ）の化合物を得ることができる。本発明の式（ＩＩ）の化合物の製造方法は上記方法に限定されず、当業者に公知の方法により合成することができる。ＭＦＰの化学合成法も当業者に公知である。
【００２４】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２５】
実施例１：エンドファイトの分離および同定
鳥取大学構内各所で採取したイネ科野草を採取した。葉部、葉鞘部を５ｍｍ程度の切片となるよう切断した。これらの切片をクリーンベンチ内で１００％のエタノールに１分浸し、植物組織表面のワックスを溶かした。次いで３〜５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液内で１〜５分撹拌し、表面を殺菌した。これを滅菌水で３回洗い、滅菌したカミソリで細かく刻み、プラスチックシャーレ中に調製した糸状菌探索用の麦芽固体培地（水１Ｌに対し麦芽エキス５０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン３ｇ、寒天２０ｇ、ストレプトマイシン５０ｍｇ）に置床した。これを２４℃で培養した。植物組織の切り口付近から生育してきた菌を順次新しい麦芽固体培地に植え替え、菌が単一になったところで麦芽斜面培地（水１Ｌに対し麦芽エキス５０ｇ、グルコース３０ｇ、ペプトン３ｇ、寒天２０ｇ）に分離した。
【００２６】
分離したエンドファイトを麦芽浸出培地に接種し、２４℃で７日間培養した。培養後吸飲濾過により濾液と菌体に濾別し、それぞれから抽出物を得た。これらの抽出物について、実施例２で説明する忌避活性試験を行い、忌避活性の強いものを探索した。その結果、鳥取大学構内で採取したエノコログサから分離されたエンドファイトの培養濾液に、特に強い忌避活性を見出した。このエンドファイトをＨ−ｓ ２５９菌と命名した。
【００２７】
Ｈ−ｓ ２５９菌を麦芽寒天培地およびＰＤＡ寒天培地に接種し、２４℃で７日間培養したところ、白い綿毛状の菌叢を呈し、胞子の形成は見られなかった。Ｈ−ｓ ２５９菌からＤＮＡを抽出し、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域について配列決定を行った。決定された配列についてＤＤＢＪのＢＬＡＳＴによるホモロジー検索を行ったところ、子のう菌亜門の核菌綱にBiscogniauxia atropunctataに対して９２％の相同性が確認され、Ｈ−ｓ ２５９菌をBiscogniauxia atropunctataの一菌株と同定した。Ｈ−ｓ ２５９菌は、２００９年８月１３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６を与えられた。
【実施例２】
【００２８】
実施例２：Ｈ−ｓ ２５９菌の産生する忌避物質の同定
Ｈ−ｓ ２５９菌を麦芽浸出培地１０Ｌに接種し、２４℃で１４日間静置培養した。この培養濾液を酢酸エチルを用いて抽出し、抽出物を得た。この抽出物について、忌避活性を指標として精製を進めた。溶出溶媒としてアセトン、ｎ−ヘキサンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで抽出物を分画し、ｎ−ヘキサン中１０％アセトンで溶出したフラクションに非常に強い忌避活性が見られた。このフラクションをｎ−ヘキサン中含水酢酸エチルを溶出溶媒としてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、強い忌避活性を示したフラクションをシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、強い忌避活性が見られたフラクションを得た。これをＨＰＬＣにて分取し、無色油状化合物（化合物Ａ）を得た。化合物ＡはＵＶ（２５４ｎｍ）照射下で蛍光を発した。化合物Ａの機器分析データを表１、表２に示す。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲにはＪＯＥＬ ＪＭＮ−ＥＣＰ５００ ＮＭＲスペクトロメーターを、質量分析にはＪＯＥＬ ＡＸ−５０５ＨＡスペクトロメーターを、ＨＰＬＣにはＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−６Ａ液体クロマトグラフィーを用いた。
【表１】
【表２】
【００２９】
これらの結果から、化合物Ａを３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オール（ＭＦＰと略称）と同定した。ＭＦＰの構造式を以下に示す。
【化８】
【００３０】
マルシラホシカメムシを用いてＭＦＰの忌避活性を調べた。忌避活性の試験方法を以下に説明する。
（ａ）供試虫
屋外で採取したマルシラホシカメムシは、餌となるスズメノカタビラやオシヒバなどのイネ科植物を植えたデシケーターに入れ、室温で飼育した。
【００３１】
（ｂ）試験装置の組み立て
直径９ｃｍのポリ塩化ビニル管とプラスチックシャーレ（１．５ｘ９ｃｍ）のフタを用意した。ポリ塩化ビニル管は真っ直ぐに２ｃｍ、４ｃｍの高さで輪切りにした。黒画用紙と濾紙を直径９ｃｍの円形に切り抜いたものを用意した。
（ｂ−１）試験装置上部の組み立て
２ｃｍに切ったポリ塩化ビニル管の内壁にカメムシの頭皮を防止するためにシリコングリースを薄く塗った。試験管（φ１ｃｍ）の口をガスバーナーで熱し、プラスチックシャーレの端から１ｃｍの位置に押しつけて穴を開けた。濾紙も端から１ｃｍの位置に直径１ｃｍの穴を開けた。この濾紙を穴が重なるようにプラスチックシャーレの上に敷き、シリコングリースを塗っておいたポリ塩化ビニル管を置いた。そして光が入らないようにプラスチックシャーレの壁にビニールテープを数回巻いた。
（ｂ−２）試験装置下部の組み立て
黒画用紙をプラスチックシャーレに敷き、４ｃｍに切ったポリ塩化ビニル管を置いた。そして光が入らないようにプラスチックシャーレの壁にビニールテープを数回巻いた。
試験装置上部と下部を組合せ、隙間ができないことを確認してから使用した。試験装置の構造を図１に示す。
【００３２】
（ｃ）忌避活性試験法
０．５ｘ４ｃｍに切った濾紙の切片をφ１ｘ３．５ｃｍのサンプル管に挿し、アセトンに溶解させたサンプル５０μＬをシリンジ等を使って滴下し染み込ませた。コントロールとしてアセトンのみを５０μＬ滴下したものも用意し、この二つを３０分風乾させてアセトンを除去した。その後、サンプルと濾紙が入ったサンプル管を試験装置の穴に挿した。次に、シリコングリースを塗ったφ３．５ｘ１ｃｍのシャーレ中に取り分けておいたマルシラホシカメムシ２０匹、試験装置の穴と穴との間に逆さまにして置き、シャーレを除去せずに試験装置を人工気象器内の中央に入れた。人工気象器内の温度を１０℃に設定し、ライトをすべて付けた状態にしておいた。３分間待ってカメムシを安定させ後、シャーレを除去して試験を開始した。１試験３０分のサイクルで両方のサンプル管に入っている虫の数と外に出ている虫の数を記録した。この操作を４回繰り返した。また、条件をそろえるため、サンプル投与側とコントロール側の穴を交互に変えて試験した。忌避度は下式により算出した。
忌避度＝｛［（Ｃ／Ｃ＋Ｔ）Ｘ１００］−５０｝Ｘ２
Ｃ：コントロールのサンプル管に入った虫の数
Ｔ：サンプル投与側のサンプル管に入った虫の数
４回の試験の平均忌避度と標準誤差を算出した。なお、試験終了後にサンプル管内に入っていない虫の数は無視した。
【００３３】
ナフタレンとＭＦＰの忌避活性を表３に示す。ナフタレンは０．５ｍｇでは強い忌避活性を示すが、０．１ｍｇでは全く忌避活性を示さなかった。ＭＦＰは０．１ｍｇでも忌避度５０を超える強い忌避活性を示した。ＭＦＰは０．５ｍｇでもナフタレンよりも強い忌避活性を示した。これらの結果、および各化合物の分子量を考慮すると、ＭＦＰはポジティブコントロールであるナフタレンよりも強い忌避活性を有していることがわかった。
【表３】
【実施例３】
【００３４】
実施例３：ＭＦＰ誘導体の合成
下記の誘導体を合成した。
【化９】
誘導体１（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣＨ３）
【化１０】
誘導体２（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ２Ｈ５）
【化１１】
誘導体３（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ３Ｈ７）
【化１２】
誘導体４（式（ＩＩ）においてＲ＝ＣＯＣ６Ｈ５）
【００３５】
（１）ＭＦＰの調製
５００ｍＬ容三角フラスコに２００ｍＬの麦芽浸出培地を調製した。Ｈ−ｓ ２５９菌をこの培地５０本に接種し、２４℃で１４日間静置培養した。培養終了後、ろ液と菌体にろ別した。この培養ろ液１０Ｌを６Ｍ塩酸でｐＨ２付近に調整した。これを酢酸エチルで３回抽出し、抽出液を得た。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて一晩放置して脱水した。これを減圧下で濃縮し、ろ液抽出物を得た。この抽出物をアセトンに溶解し、Ｄａｉｓｏｇｅｌ ＩＲ−６０を３０．５ｇ加えた。抽出物をゲルに吸着させ、これをＤａｉｓｏｇｅｌ ＩＲ−６０（φ８８／１２５μｍ）のカラム（φ６．２×７２ｃｍ）にのせシリカゲルドライカラムクロマトグラフィーを行った。溶出溶媒として０、５、１０、２０、３０、１００％（ｖ／ｖ）のアセトンを含むｎ−ヘキサンを用いた。溶媒はそれぞれ８Ｌ流し、溶出液を減圧下で濃縮した。１０％フラクション２００ｍｇをアセトンに溶解し、１ｇのセライトを加え窒素気流下濃縮して吸着させた。これをＷａｋｏｇｅｌ ＦＣ−４０（φ２０−４０ｃｍ）のカラム（φ３×３９ｃｍ）にのせてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。溶出溶媒として０、５、１０、２０、３０、１００％（ｖ／ｖ）酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを含水にしたものを用いた。溶媒はそれぞれ２００ｍＬ流し、１０ｍＬずつ２０本の試験管に分取し、これを減圧下で濃縮した。得られた各フラクションについて５０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒としてシリカゲル薄層クロマトグラフィーを行った。ＵＶ（２５４ｎｍ）照射下で類似するスポットをもつフラクションをまとめ、２０％フラクション１−９にＭＦＰを得た。またアッセイ用として純度の高いＭＦＰを得るためにＨＰＬＣで分取した。保持時間２９分のフラクションを酢酸エチルで抽出し、純度の高いＭＦＰを得た。ＨＰＬＣの条件を表４に示す。
【表４】
【００３６】
（２）誘導体１の合成
ＭＦＰ（１０．１ｍｇ）をピリジン５００μＬに溶解し、無水酢酸５００μＬを添加し、室温で一晩反応させた。氷を入れた蒸留水をスターラーで撹拌しながら６Ｍ塩酸でｐＨ２に調整し、反応液を滴下し１時間撹拌した。撹拌後、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、Ｒｆ値０．２７を示す無色の油状物質である誘導体１（８．９ｍｇ）を得た。
誘導体１のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表５に示す。
【表５】
【００３７】
（３）誘導体２の合成
ＭＦＰ（９．５ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（２Ｎ，１１．３ｍｇ）を加え、塩化プロピオニル（２Ｎ，１２．９ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（８．１ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．６１のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体２（７．６ｍｇ）を得た。
誘導体２のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表６に示す。
【表６】
【００３８】
（４）誘導体３の合成
ＭＦＰ（９．７ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（４Ｎ，２２．６ｍｇ）を加え、塩化ブチリル（４Ｎ，２９．８ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（１０．６ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．５７のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体３（４．０ｍｇ）を得た。
誘導体３のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表７に示す。
【表７】
【００３９】
（５）誘導体４の合成
ＭＦＰ（１１．５ｍｇ）をドライアセトン１ｍＬに溶解し、スターラーで撹拌した。そこに、ピリジン（３Ｎ，１８．９ｍｇ）を加え、塩化ブチリル（３Ｎ，３３．７ｍｇ）を滴下し、一晩室温で撹拌しながら反応させた。翌日、酢酸エチルで３回抽出した。抽出後、酢酸エチル層を１Ｍ炭酸水素ナトリウムで洗浄した後、少量の飽和食塩水で３回洗浄した。洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え一晩放置した。翌日減圧濃縮し、抽出物（２４．５ｍｇ）を３０％酢酸エチルを含むｎ−ヘキサンを展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーで分画し、各フラクションを得た。Ｒｆ値０．５７のフラクションを含水酢酸エチルで抽出し、誘導体４（７．４ｍｇ）を得た。
誘導体４のＮＭＲデータおよびＭＳデータを表８に示す。
【表８】
【００４０】
これらのＮＭＲスペクトルおよびＭＳスペクトルのデータから、合成した誘導体１〜４の化学構造の正しさを確認した。
【実施例４】
【００４１】
実施例４：本発明の化合物の忌避活性
実施例３にて合成した誘導体１〜４、ＭＦＰ、ナフタレンについて、実施例２で説明したようにマルシラホシカメムシを用いて忌避活性を調べた。結果を図２に示す。誘導体１、誘導体２、誘導体３はＭＦＰよりも忌避活性が強かった。誘導体１が最も高い忌避活性を示し、次いで誘導体２、誘導体３、ＭＦＰの順で忌避活性が低くなった。これらの結果から、８位の水酸基がエステル化されると忌避活性が強くなる傾向が認められた。このことから８位の水酸基は忌避活性に必須でないことがわかった。しかし、誘導体４はＭＦＰより忌避活性が弱いことから水酸基がベンゾイル化されると忌避活性が弱くなる傾向が認められた。０．１μｍｏｌの投与量においても誘導体１の忌避活性が特に強かったのは、揮発性が高いからではないかと考えられる。
【実施例５】
【００４２】
実施例５：フィールドにおける適用例
厚手の丈夫な濾紙片（１ｘ５ｃｍ）に誘導体１のアセトン溶液（２ｍｇ／Ｌ）を１枚当たり０．１ｍＬを染みこませた。この濾紙片の一端に小さな穴を空け、細い針金を通し輪にした。これを１ｍ２当たり４本程度の登熟初期のイネの茎葉に掛けて斑点米カメムシの防除を図った。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、農業分野、特に野菜や果樹の栽培分野、ならびに農薬分野、特に害虫の忌避剤の製造分野において利用可能である。
【受託番号】
【００４４】
受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６
独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に２００９年８月１３日に受領されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤。
【請求項２】
化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である請求項１記載のカメムシ忌避剤。
【請求項３】
カメムシが斑点米カメムシである請求項１または２記載の忌避剤。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化３】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法。
【請求項５】
化合物が、式（ＩＩ）：
【化４】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である請求項４記載のカメムシの忌避方法。
【請求項６】
カメムシが斑点米カメムシである請求項４または５記載のカメムシの忌避方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）：
【化５】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）Biscogniauxia属の菌を培養し；
（ｂ）培養液を有機溶媒にて抽出し；
（ｃ）有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールを得て；次いで
（ｄ）上記（ｃ）で得られた３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールの８位の水酸基をエステル化する
を特徴とする製造方法。
【請求項８】
Biscogniauxia属の菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として受領された菌である、請求項７記載の製造方法。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物を含む、カメムシ忌避剤。
【請求項２】
化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である請求項１記載のカメムシ忌避剤。
【請求項３】
カメムシが斑点米カメムシである請求項１または２記載の忌避剤。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化３】
（Ｉ）
［式中、ＲはＨ、Ｃ１−６アルキル、ＣＯＣ１−６アルキル、ＣＯＯＨまたはアリールであり、Ｘ、Ｙ、Ｚは独立して水素またはＣ１−３アルキルである］で示される化合物をカメムシに適用することを特徴とする、カメムシの忌避方法。
【請求項５】
化合物が、式（ＩＩ）：
【化４】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−３アルキル］で示される化合物である請求項４記載のカメムシの忌避方法。
【請求項６】
カメムシが斑点米カメムシである請求項４または５記載のカメムシの忌避方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）：
【化５】
（ＩＩ）
［式中、ＲはＣＯＣ１−６アルキルである］で示される化合物の製造方法であって、下記工程：
（ａ）Biscogniauxia属の菌を培養し；
（ｂ）培養液を有機溶媒にて抽出し；
（ｃ）有機抽出画分から３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールを得て；次いで
（ｄ）上記（ｃ）で得られた３−（４−メチル−フラン−３−イル）−プロパン−１−オールの８位の水酸基をエステル化する
を特徴とする製造方法。
【請求項８】
Biscogniauxia属の菌が、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−７９６として受領された菌である、請求項７記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−５１９０２（Ｐ２０１１−５１９０２Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９９５８７（Ｐ２００９−１９９５８７）
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．平成２１年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会講演要旨集」に掲載２．平成２１年３月２８日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会」において発表
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３１日（２００９．８．３１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り １．平成２１年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会講演要旨集」に掲載２．平成２１年３月２８日 社団法人 日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会２００９年度（平成２１年度）大会」において発表
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
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