新規なアミダーゼ及びその遺伝子
【課題】アンモニア耐性が高い、アミダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子の提供。
【解決手段】シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５から新規なアミダーゼを単離し、その遺伝子を同定した。そのアミダーゼは、アンモニア耐性が高く、かつ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して非常に高い比活性を示す。すなわち、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａ、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【解決手段】シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５から新規なアミダーゼを単離し、その遺伝子を同定した。そのアミダーゼは、アンモニア耐性が高く、かつ２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して非常に高い比活性を示す。すなわち、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａ、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニア耐性が高い新規なアミダーゼ、アミダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミダーゼは、アミドを加水分解して対応するカルボン酸に変換する酵素として知られている。アミダーゼを用いることによって、アミドから医農薬原料等に有用なカルボン酸を生成することができる。アミダーゼを用いると、例えば、α−アミノ酸アミドからα−アミノ酸を、α−ヒドロキシ酸アミドからα−ヒドロキシ酸を生産することができる。
【０００３】
微生物由来のアミダーゼは、Arthrobacter sp. J-1、Brevibacterium sp. R 312、Aspergillus nidulans、Pseudomonas chlororaphis B23、及びシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）などから精製されている（例えば非特許文献１〜７参照）。
一方、Pseudomonas aeruginosa、Aspergillus oryzae、Rhodococcus sp.、Pseudomonas chlororaphis B23、Rhodococcus sp. N-774、Brevibacterium sp. R312、Rhodococcus rhodochrous J1、Pseudomonas putida、Bacillus stearothermophilus BR388、Agrobacterium tumefaciens d3、Sulfolobus solfataricus、及びRhodococcus erythropolis MP50などの微生物からは、アミダーゼ遺伝子がクローニングされており、その結果、種々のアミダーゼのアミノ酸配列が明らかになっている（例えば非特許文献８〜１９参照）。
【０００４】
アミダーゼ遺伝子に関する特許文献としては、Brevibacterium R312とRhodococcus（特許文献１）、Comamonas testosteroni NI 1（特許文献２）、Comamonas acidovorans KPO-2771-4（特許文献３）、Rhodococcus rhodochrous IFO 15564（特許文献４）、Enterobacter cloacae（特許文献５）、Pseudomonas putida（特許文献６）、Rhodococcus sp. （特許文献７）、Brevibacillus borstelensis（特許文献８）、Pseudomonas azotoformans IAM 1603（特許文献９）、Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321（特許文献１０）、Thermus sp. （特許文献１１）、Pseudomonas sp. MCI 3434とPseudomonas aeruginosa PAO1（特許文献１２）、Thermococcus GU5L5（特許文献１３）、Variovorax paradoxus DSM 14468（特許文献１４）、及びComamonas testosteroni 5-MGAM-4D（特許文献１５）に関するものなどがある。また、本発明のアミダーゼ遺伝子の採取源であるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のアミダーゼ及びその遺伝子も知られている（特許文献１６）が、このアミダーゼは本発明のアミダーゼとは構造が明確に異なり、また、酵素学的性質も明らかに異なっている。
【０００５】
このように、種々の微生物において、アミダーゼ及びアミダーゼ遺伝子が知られてはいたものの、これらの微生物又は酵素を用いて、工業的に、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドからα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって、アミダーゼ活性が強く阻害され、カルボン酸の生産効率が低下したり、カルボン酸の生産が停止するという問題があった（例えば非特許文献２０参照）。なお、シュードノカルディア・サーモフィラの菌体を利用したＤＬ−メチオニンの製造法は知られていた（特許文献１７参照）が、アンモニア耐性を有するアミダーゼについての知見は全く得られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５２６０２０８号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／１７１９０号パンフレット
【特許文献３】特開平８−２５６７７１号公報
【特許文献４】特開平９−９９７３号公報
【特許文献５】米国特許第６６１７１３９号明細書
【特許文献６】米国特許第６２５１６５０号明細書
【特許文献７】国際公開第０１／３０９９４号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／００８５６９号パンフレット
【特許文献９】特開２００３−２５０５５８号公報
【特許文献１０】国際公開第０３／０１０３１２号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３／０２０９２９号パンフレット
【特許文献１２】特開２００４−１０５１５２号公報
【特許文献１３】国際公開第０３／０２７３１５号パンフレット
【特許文献１４】米国特許出願公開２００３／０１８６４２３号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開２００４／０２２５１１６号明細書
【特許文献１６】国際公開第２００４／０８３４２３号パンフレット
【特許文献１７】特開２００４−２５４６９０号公報
【非特許文献１】Y. Asano et al., 1982, Agric. Biol. Chem. 46:1175-1181
【非特許文献２】A. Thiery et al., 1986, J. Basic Microbiol. 26:299-311
【非特許文献３】J-F. Mayaux et al., 1990, J. Bacteriol. 172:6764-6773
【非特許文献４】C. M. Corrick et al., 1987, Gene 53:63-71
【非特許文献５】J. A. Fraser et al., 2002, Fungal Genet. Biol. 35:135-146
【非特許文献６】L. M. Ciskanik et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:998-1003
【非特許文献７】K. Egorova et al., 2004, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:38-45
【非特許文献８】W. J. Brammar et al., 1987, FEBS Lett. 215:291-294
【非特許文献９】K. Gomi et al., 1991, Gene 108:91-98
【非特許文献１０】J-F. Mayaux et al., 1991, J. Bacteriol. 173:6694-6704
【非特許文献１１】M. Nishiyama et al., 1991, J. Bacteriol. 173:2465-2472
【非特許文献１２】Y. Hashimoto et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:225-233
【非特許文献１３】F. Soubrier et al., 1992, Gene 116:99-104
【非特許文献１４】M. Kobayashi et al., 1993. Eur. J. Biochem. 217:327-336
【非特許文献１５】S. Wu et al., 1998, DNA Cell Biol. 17:915-920
【非特許文献１６】T. K. Cheong and P. J. Oriel, 2000, Enzyme Microb. Technol. 26:152-158
【非特許文献１７】S. Trott et al., 2001, Microbiology 147:1815-1824
【非特許文献１８】A. S. d’Abusco et al., 2001, Extremophiles 5:183-192
【非特許文献１９】S. Trott et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:3279-3286
【非特許文献２０】M. J. Woods et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 567:225-237
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、公知のアミダーゼ活性を示す微生物又はそれから得られたアミダーゼ酵素等を用いて、工業的に、α―アミノ酸アミド又はα―ヒドロキシ酸アミドからα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって、アミダーゼ活性が強く阻害され、カルボン酸の生産効率が低下したり、カルボン酸の生産が停止するという問題があった。本発明の課題は、アンモニア耐性が高い、アミダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５から新規なアミダーゼを単離し、そのアミダーゼのアンモニア耐性が高いことを見出すと共に、その遺伝子を同定することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すアミダーゼや、（２）シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）に由来することを特徴とする上記（１）記載のアミダーゼに関する。
【００１０】
また本発明は、（３）（ｇ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｈ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質や、（４）（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質又は（ｊ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質に関する。また本発明は、（５）（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す上記（３）〜（４）のいずれか記載のタンパク質や、（６）（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す上記（３）〜（５）のいずれか記載のタンパク質や、（７）シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする上記（３）〜（６）のいずれか記載のタンパク質に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（８）前述の（３）〜（７）のいずれか記載のタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（９）（ｋ）配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ又は（ｌ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。また本発明は、（１１）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す性質を有するタンパク質であることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１２）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す性質を有するタンパク質であることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１３）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする上記（９）〜（１２）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。
【００１２】
また本発明は、(１４) 前述の（８）〜（１３）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターに関する。
【００１３】
さらに本発明は、(１５) 前述の（１４）記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換微生物に関する。
【００１４】
また本発明は、(１６) 前述の（１）若しくは（２）記載のアミダーゼ又はその生産菌若しくはその処理物、あるいは、前述の（３）〜（７）のいずれか記載のタンパク質又は上記（１５）記載の形質転換微生物若しくはその処理物を、アミドに作用させることを特徴とするカルボン酸の製造方法や、(１７) アミドがα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドであり、カルボン酸がα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸であることを特徴とする上記（１６）記載のカルボン酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアンモニア耐性が高いアミダーゼを用いると、工業的にアミドからカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって反応速度が低下することが少ないので、効率の良い生産プロセスの構築が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のアミダーゼとしては、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すアミダーゼであれば特に制限されるものではなく、かかるアミダーゼとして、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するアミダーゼを好適に例示することができる。以下、上記本発明のアミダーゼを総称して「本件アミダーゼ」ということがある。
【００１７】
本発明において、「シュードノカルディア・サーモフィラに由来するアミダーゼ」とは、実際にシュードノカルディア・サーモフィラに存在するアミダーゼのほか、そのアミダーゼと同一又は類似である限り、形質転換等の手法を用いてシュードノカルディア・サーモフィラ以外の微生物等によって発現されたアミダーゼも含む意味で用いられる。
【００１８】
また本発明において、「ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す」とは、ｐＨ及びアンモニア濃度以外の条件については好適な条件にした上で、ｐＨ９．０及びアンモニア濃度０．２Ｍとした場合に示す、メチオニンアミドに対するアミダーゼの比活性が、ｐＨ９．０及びアンモニア濃度０Ｍとした場合に示すメチオニンアミドに対するアミダーゼの比活性の５０％以上であることを意味し、例えば後述の実施例６の（６）に記載された方法にしたがって調べることができる。また、「メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す」とは、好適な条件下において、メチオニンアミドに対して示すアミダーゼの比活性と比較して、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して示すアミダーゼの比活性の方が高いことを意味し、さらに、好ましくは、前述の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して示すアミダーゼの比活性が、前述のメチオニンアミドに対して示すアミダーゼの比活性の２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上であることを意味する。
【００１９】
本件アミダーゼの製造方法としては、シュードノカルディア属に属する本件アミダーゼ生産菌を培地で培養し、本件アミダーゼを採取する方法であれば特に制限されず、シュードノカルディア属に属する本件アミダーゼ生産菌としては、シュードノカルディア・サーモフィラを好適に例示することができ、より具体的には、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を挙げることができ、ＪＣＭ３０９５株は Japan Collection of Microorganisms（ＪＣＭ：理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができる。また、培養する培地としては、本微生物が生育できるものであれば何れのものでも良いが、例えば、ε−カプロラクタムやメタクリルアミドなどのようなアミド化合物を添加することによって、アミダーゼが誘導生成される。
【００２０】
本発明のタンパク質としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質、配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されないが、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すものや、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すものが好ましく、これら（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有するものがより好ましく、好適には、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するものを挙げることができる。以下、これら本発明のタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある。
【００２１】
また、本発明のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡとしては、本件タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、又は配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡであれば特に制限されないが、上記アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すものや、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すものが好ましく、これら（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有するものがより好ましく、好適には、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するものを挙げることができる。以下、これら本発明のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡを総称して「本件遺伝子ＤＮＡ」ということがある。
【００２２】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２３】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（以後、モレキュラークローニング第２版と略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２４】
本発明において「アミダーゼ活性を有する」とは、アミドを加水分解し、カルボン酸とアンモニアを生成する酵素活性を有することをいう。得られたそのタンパク質が、アミダーゼ活性を有するかどうかは、例えば後述の実施例２に記載したように、そのタンパク質とアミドを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、カルボン酸の生成を調べることで容易に確認することができる。また、得られたタンパク質が、メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すかどうかは、後述の実施例６の（４）に記載したように、そのタンパク質のメチオニンアミドに対する比活性及び２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対する比活性を測定し、それらの測定値を比較することで容易に確認することができる。
【００２５】
上記「ストリンジェントな条件」とは、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション法においては、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中で６８℃で洗浄することを含む条件等、また、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法においては、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で６８℃で洗浄することを含む条件等である。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８６％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２７】
本件遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号９に示される塩基配列情報又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて例えばシュードノカルディア・サーモフィラや、シュードノカルディア・サーモフィラ以外の生物のゲノムＤＮＡライブラリー等から目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、シュードノカルディア・サーモフィラより、常法に従ってゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本件遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本件遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、ゲノムＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件遺伝子ＤＮＡをゲノムＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、後述の実施例に記載された方法の他、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。また、変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡとホモロジーが高い塩基配列をもつＤＮＡを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２８】
本発明の組換えベクターとしては、本件遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切に組換えることにより構築することができる。例えば、本件遺伝子ＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだ構成を好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子の発現に関与するプロモーター、ターミネーター等の制御配列及び転写制御因子の遺伝子を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２９】
細菌用の発現ベクターとして、例えば、Ｔ７ファージプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を具体的に例示することができる。
【００３０】
また、本発明の形質転換微生物としては、上記本発明の組換えベクターが導入された形質転換微生物であれば特に制限されず、宿主としては、細菌、酵母等の微生物を挙げることができる。そのような細菌として、例えばエシェリヒア属細菌、シュードノカルディア属細菌、ストレプトミセス属細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等を挙げることができる。上記組換えベクターを宿主微生物に導入する方法としては、モレキュラークローニング第２版など多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換等により行うことができる。また、本発明の形質転換微生物を培養することによって、本件タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、さらに、該培養物から該タンパク質を採取することにより、本件タンパク質を大量に製造することができる。
【００３１】
前記本件タンパク質の由来は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質でも何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。例えば、シュードノカルディア・サーモフィラからの本発明のタンパク質の単離・精製は、シュードノカルディア・サーモフィラの菌株を、例えば、ε−カプロラクタムやメタクリルアミドなどのようなアミド化合物を添加した培地を用いて培養し、培養物から集菌し、集菌した菌体を破砕し細胞抽出液を得ること等により行うことができる。菌体の破砕法については特に制限はないが、超音波処理の場合は、菌体懸濁液にガラスビーズを加えて処理すると効果的である。このようにして得られた細胞抽出液から、タンパク質を精製する方法に特に制限はないが、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、上記タンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記タンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、精製タンパク質を得ることができる。
【００３２】
精製の各段階で得られた画分のアミダーゼ活性は、例えば、次のようにして定量することができる。試料液を、適当なバッファー又は塩溶液で希釈し、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミド等のアミドを添加すると、加水分解反応が起こり、α−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸が生成する。反応条件としては、特に制限はないが、４０〜６０℃、ｐＨ６〜９が適している。反応液中に生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、ＨＰＬＣによって定量することができる。また、精製の各段階で得られた画分のタンパク質は、牛血清アルブミンをスタンダードとして用いて、Ｌｏｗｒｙ法（O. H. Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275）などによって定量することができる。各精製段階でのアミダーゼの純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（U. K. Laemmli, 1970, Nature 227:680-685）によって調べることができる。
【００３３】
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００３４】
遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。この遺伝子組換え技術による方法は、比較的容易な操作で、かつ大量に目的のタンパク質を調製することが可能である。
【００３５】
さらに、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８６％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号９に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシュードノカルディア・サーモフィラ以外の生物から得られたＤＮＡを適当な条件下でスクリーニングすることにより、該ＤＮＡとホモロジーの高いＤＮＡを単離することができる。こうして得られた遺伝子ＤＮＡを、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、それによってコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３６】
なお、配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列は、本願で実際に得られたアミダーゼと、国際公開第２００４／０８３４２３号パンフレットで実際に得られたアミダーゼとの間で、大きく異なる部分である（図２参照）。この部分のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質の中にも、本願配列番号１０のアミダーゼと同様の性質を有するタンパク質が存在すると予測される。
【００３７】
本発明のカルボン酸の製造方法としては、本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物をアミドに作用させることを含む方法であれば特に制限はない。ここでいう「形質転換微生物の細胞」は、生細胞であるか死細胞であるかを問わない。また、上記「細胞の処理物」とは、本発明の形質転換微生物の細胞を処理したものであって、アミドからカルボン酸の製造に用いることができる限り特に制限はなく、例えば、本発明の形質転換微生物の細胞について、機械的破砕処理、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、加圧減圧処理及び浸透圧処理などを施したもの、ならびに、細胞又はその処理物をアルギン酸等で固定化した物などが挙げられる。また、本発明の形質転換微生物の細胞抽出液から、例えば硫安塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲル濾過クロマトグラフィーなどによって精製された本発明のタンパク質及びその固定化物も、本発明の「細胞の処理物」に含まれる。なお、本発明のカルボン酸の製造法における、細胞又はその処理物は、固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。固定化されている細胞又は処理物を用いた場合は、細胞又はその処理物と生成物との分離が容易になるからである。このようにして生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、通常の方法によって濃縮精製することができる。
【００３８】
また、本発明のカルボン酸の製造方法に用いる、本発明の形質転換微生物の培養方法又はその処理物の製造方法については、その細胞又はその処理物がカルボン酸の製造方法に用いることができる限り特に制限はなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明のカルボン酸の製造方法では、例えば適当なバッファー又は塩溶液中で、本発明のアミダーゼ等をアミドに作用させることができる。バッファー又は塩は、アミドからカルボン酸への加水分解反応を阻害するものでなければ特に制限はない。
【００４０】
本発明のカルボン酸の製造方法における「アミド」は、本発明のタンパク質が基質とすることができる限り、特に制限はないが、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドが好ましい。本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物を、例えばα−アミノ酸アミド、α−ヒドロキシ酸アミド、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドにそれぞれ作用させた場合は、α−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸がそれぞれ生産される。
【００４１】
本発明のカルボン酸の製造方法における反応液中のアミドの濃度については特に制限はないが、通常は０．１〜３０重量％程度である。また、アミドは連続的又は間欠的に反応系に添加してもよい。本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物の反応系への添加量は、特に制限はないが、乾燥細胞重量換算で、０．１〜６０ｇ／Ｌの範囲で添加することができる。また、反応の温度及びｐＨ等は、アミドからカルボン酸への加水分解反応が生じる限り特に制限はないが、例えば、４０〜６０℃、ｐＨ６〜９とすることができる。生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、ＨＰＬＣによって確認・定量することができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
[シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５の培養]
３０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに、５００ｍｌのＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を仕込み、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Japan Collection of Microorganismsから入手可能）を植菌し、５０℃で２日間振盪培養した。次に、別の３０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに、５００ｍｌのＴＹＣ培地（１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏと０．５％ε−カプロラクタムを含むＴＹ培地）を仕込み、上の前培養の１０ｍｌを加え、５０℃で２日間振盪培養した。遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集菌し、９．１５ｇの湿菌体を得た。コントロールとして、ε−カプロラクタムを含まないＴＹＣ培地を用いて、同様にシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を培養し、集菌し、１４．５ｇの湿菌体を得た。
【実施例２】
【００４４】
[菌体のアミダーゼ活性の測定]
実施例１で得られた湿菌体を２００ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し、同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁し、全量を５０ｍｌにした。この菌体懸濁液の５０から１００μｌをエッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて全量を５００μｌにし、３０℃の水浴中で５分間保温した。これに５０μｌの１Ｍ Ｌ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。ＴＹＣ培地を用いたときのアミダーゼ活性は１９．１Ｕ／ｇ湿菌体であったのに対して、ε−カプロラクタムを含まないＴＹＣ培地を用いたときのアミダーゼ活性は３．１４Ｕ／ｇ湿菌体であった。この結果から、ε−カプロラクタムの添加によって、ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性が約６倍に増加することが分かった。
【実施例３】
【００４５】
[ｐＨ７．５での菌体反応におけるアンモニアの影響]
実施例１と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を培養し、遠心によって菌体を集めた。集めた菌体に生理食塩水（０．８％ＮａＣｌ）を加えて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。一方、Rhodococcus rhodochrous IFO 15564（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門NBRCから入手可能）を、ＣＳＬ培地（２％コーンスティープリカー、１％スクロース、及び０．５％ε−カプロラクタム）を用いて、２８℃で振盪培養し、遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって菌体を集めた。集めた菌体に生理食塩水を加えて懸濁して、菌体懸濁液（コントロール）を調製した。これらの菌体懸濁液の一定量をエッペンドルフチューブにとり、５０μｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）と種々の量の２Ｍアンモニア水（塩酸でｐＨ７．５に調整したもの）を添加し、水を加えて全量を４５０μｌにした。これを３０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。その結果、図１に示したように、アンモニア濃度と菌体活性（アンモニア無添加のときの菌体活性を１００％とした）との関係が求められた。Rhodococcus rhodochrous IFO 15564のアミダーゼ活性は、低濃度のアンモニアによっても強く阻害されたが、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性は、アンモニアによってほとんど影響を受けなかった。
【実施例４】
【００４６】
[ｐＨ９．０での菌体反応におけるアンモニアの影響]
実施例３と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５とRhodococcus rhodochrous IFO 15564の菌体懸濁液を調製した。これらの菌体懸濁液の一定量をエッペンドルフチューブにとり、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）と種々の量の２Ｍアンモニア水（塩酸でｐＨ９．０に調整したもの）を添加し、水を加えて全量を４５０μｌにした。これを３０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。その結果、図３に示したように、アンモニア濃度と菌体活性（アンモニア無添加のときの菌体活性を１００％とした）との関係が求められた。Rhodococcus rhodochrous IFO 15564のアミダーゼ活性は、低濃度のアンモニアによっても強く阻害されたが、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性は、アンモニアによる阻害を受けにくいことが分かった。
【実施例５】
【００４７】
[アミダーゼの精製]
実施例1と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を５００ｍｌのＴＹＣ培地を用いて培養した。遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集菌し、その菌体を２００ｍｌのＴＥＤバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄し、５０ｍｌの同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁した。これに２０ｇのガラスビーズ（粒径５０μｍ）を加えて、超音波ホモジェナイザー（セイコー電子工業；モデル７５００）によって処理（最大出力、実効時間３ｍｉｎ、氷冷）し、遠心（１６ｋｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）によって上清を得た。この上清に、３０％飽和になるように硫安を加え、氷中に１時間以上置いた後、生成した沈殿を遠心（同上）によって除き、上清に６０％飽和になるように硫安を加え、氷中に１時間以上置いた後、生成した沈殿を遠心（同上）によって得た。
【００４８】
上で得られた沈殿を、１Ｍ硫安を含む２０ｍｌのＴＥＤバッファーに溶かし、同じバッファーで平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）のカラム（２．２×１６．５ｃｍ）に負荷した。その後、１Ｍ硫安を含む１５０ｍｌのＴＥＤバッファーでカラムを洗い、１から０Ｍ硫安のグラジェント溶出（全量３００ｍｌ）を行い、最後に、１５０ｍｌのＴＥＤバッファーでの溶出を行った。カラムからの溶出液は、１５ｇずつ分画した。各画分のアミダーゼ活性を、次のようにして測定した。適当量の試料液を、エッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて、全量を５００μｌにした。これを５０℃の水浴中で５分間保温した後、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。アミダーゼ活性は、硫安濃度がほぼ０Ｍになるあたりに溶出された。
【００４９】
上のフェニルセファロースクロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、１０ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、１０００ｍｌのＴＥＤバッファーに対して一晩透析した。これを、ＴＥＤバッファーで平衡化したＤＥＡＥセファロースFast Flow（アマシャムバイオサイエンス）のカラム（１．６×１３ｃｍ）に負荷し、７５ｍｌのＴＥＤバッファーでカラムを洗い、０から０．５Ｍ ＮａＣｌのグラジェント溶出（全量１５０ｍｌ）を行い、最後に、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む７５ｍｌのＴＥＤバッファーでの溶出を行った。カラムからの溶出液を１５ｇずつ分画し、各画分のアミダーゼ活性を、上に述べた方法により測定した。アミダーゼ活性は、約０．２Ｍ濃度のＮａＣｌで溶出された画分に見いだされた。
【００５０】
上のＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、５ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、ＴＥＤバッファーで平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（ＴＯＳＯＨ）のカラム（２．６×８８ｃｍ）に負荷した。カラムからの溶出液を５ｇずつ分画し、各画分のアミダーゼ活性を、上述の方法で測定した。アミダーゼ活性は、１００から２００ｋＤａに相当する画分に溶出された。分子質量マーカーとして、カタラーゼ（２４０ｋＤａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、及びリゾチーム（１４ｋＤａ）を用いた。
【００５１】
上のゲル濾過クロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、２ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、５００ｍｌのＴＥＤバッファーに対して透析（２回）し、−３０℃で凍結保存した。表１に、各精製段階でのアミダーゼ活性画分の比活性等を示した。タンパク質は、牛血清アルブミンをスタンダードとして用いて、Lowry法によって定量した。アミダーゼは１２％の収率で、６．７倍に精製された。最終的に得られた精製アミダーゼの比活性は１４．７Ｕ／ｍｇであった。図４に、各精製段階のアミダーゼ活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した結果を示した。アミダーゼの分子質量は、５３ｋＤａと求められた。上述のゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、アミダーゼ活性が１００から２００ｋＤａに相当する画分に溶出されたことを考え合わせると、自然状態のアミダーゼは２〜４量体であると考えられる。
【００５２】
【表１】
【実施例６】
【００５３】
[精製アミダーゼの酵素的性質]
（１）反応温度
３６μｇの精製アミダーゼを含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、一定温度の水浴中で５分間保温した。これに５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、同じ温度の水浴中で１０から３０分間反応させた。これに１００μｌの２ Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図５に示したように、反応温度と酵素活性との関係が求められた。酵素活性の至適温度は６５℃であった。
【００５４】
（２）熱安定性
３６μｇの精製アミダーゼを含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、一定温度の水浴中で３０分間熱処理した。その後、５０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図６に示したように、熱処理温度と酵素活性との関係が求められた。精製酵素は６０℃まで安定であった。
【００５５】
（３）反応ｐＨ
２５０μｌの２００ｍＭの種々のｐＨのバッファーをエッペンドルフチューブにとり、３６μｇの精製アミダーゼを添加し、水を加えて全量を５００μｌにした。これを５０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図７に示したように、反応ｐＨと酵素活性との関係が求められた。精製酵素はｐＨ５．５から１０の広いｐＨ範囲で高い活性を示した。
【００５６】
（４）基質特異性
１００ｍＭ濃度の各種アミド化合物を含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、５０℃の水浴中で５分間保温し、３６μｇ（２０μｌ）の精製アミダーゼを加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌの酸を生成する酵素量を１Ｕとした。その結果を表２に示した。ＨＭＢ−アミドに対する比活性は、メチオニンアミドに対する比活性の約１２倍であった。
【００５７】
【表２】
【００５８】
(5) 反応速度論的解析
基質として、メチオニンアミド、ＨＭＢ−アミド（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド）、又はクロトンアミドを用いて、反応速度論的解析を行った。種々の濃度のアミド化合物、一定量（０．５から１０μｇ）の精製アミダーゼ、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）からなる５００μｌの反応混合液を、５０℃の水浴中で１から１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。その結果から、Lineweaver-Burkプロットを作成し、表３に示したように、ＫｍとＶｍａｘが求められた。ＨＭＢ−アミド基質のときのＶｍａｘは、メチオニンアミド基質のときのＶｍａｘの約１２倍であった。
【００５９】
【表３】
【００６０】
（６）アンモニアの影響
エッペンドルフチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩、及びいろいろな量の２Ｍアンモニア（塩酸でｐＨを９．０に調整したもの）を入れ、イオン交換水を加えて全量を４９０μｌにした。これを３０、４０、又は５０℃の水浴中で５分間保温し、１０μｌ（１８μｇ）の精製アミダーゼを添加し、同じ温度の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を加えることによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図８に示したように、アンモニア濃度と酵素活性（アンモニア無添加のときの比活性を１００％とした）の関係が求められた。アンモニアによる阻害は、反応温度が高くなると、わずかに増加した。しかしながら、５０℃で０．２Ｍアンモニア存在下でも、本アミダーゼは５７％の酵素活性を保持していた。
【実施例７】
【００６１】
[アミダーゼのN末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列の決定]
実施例５で得られた精製アミダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、エレクトロブロッティングによって、ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）メンブレン（イモビロン−ＰＳＱ；ミリポア）に、タンパク質バンドを移した。その後、ＰＶＤＦメンブレンを水で軽くすすぎ、ＣＢＢ染色液（０．１％クマジーブリリアントブルーＲ−２５０、４５％メタノール、１０％酢酸）中で５分間振盪した。これを脱色液１（４５％メタノール、７％酢酸）中で１５分間振盪し、水で３回すすぎ、脱色液２（９０％メタノール、７％酢酸）中で４０秒間振盪し、風乾した。５３ｋＤａのタンパク質バンドを切り取り、エドマン法によってＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列が得られた。
【００６２】
また、実施例５で得られた精製アミダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、ポリアクリルアミドゲルから５３ｋＤａのタンパク質バンドを切り出した。このゲル切片を用いて、リジルエンドペプチダーゼ消化処理し、生成したペプチドをＨＰＬＣによって分離した。これらのペプチドのいくつかについて、エドマン法によってＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列が得られた。
【実施例８】
【００６３】
[ゲノムＤＮＡの調製]
２５０ｍｌのＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を２０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに入れた。その培地にシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を植菌し、５０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して集菌し、集菌した菌体を１００ｍｌのＴＥＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。ついで、その菌体に同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁し、全量２０ｍｌの懸濁液を得た。
【００６４】
この懸濁液に４０ｍｇのリゾチームを溶かした２００μｌのＴＥＮバッファーを加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。さらに、２ｍｌの１０％ＳＤＳと１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した後、４４０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、さらに１％ＳＤＳと０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加え、それを遠心チューブに移した。これに同容量のバッファー平衡化フェノール（フェノール結晶に約０．１％の８−ヒドロキシキノリンを加え、これに同容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］を加え撹拌し、フェノール結晶を溶解して静置した。上の水層をデカンテーションによって除き、下のフェノール層を０．２％β−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化した。以後、このフェノール層を「バッファー平衡化フェノール」という。）を加えて撹拌し、遠心（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、１／２容量のバッファー平衡化フェノールと１／２容量のイソアミルアルコール含有クロロホルム（４％イソアミルアルコールを含むクロロホルム）を加え撹拌し、遠心（同上）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、同容量のイソアミルアルコール含有クロロホルムを加え撹拌し、遠心（同上）によって二層に分離した（以後、この一連の操作をフェノール／クロロホルム抽出と呼ぶことにする）。上の水層を新しい遠心チューブに移し、２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で撹拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍｌのＴＥＮバッファーに溶解し、１０００ｍｌのＴＥＮバッファーに対して２回透析した。透析後、２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを加え、３７℃で２時間保温した。これに２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間保温した後、５ｍｌのＴＥＮバッファーと２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。水層に２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で撹拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍｌのＴＥＮバッファーに溶解し、１０００ｍｌのＴＥＮバッファーに対して２回透析し、得られたゲノムＤＮＡ溶液を４℃で保存した。このＤＮＡ溶液のＡ２６０は０．２００であったことから、ＤＮＡ濃度は０．５００ｍｇ／ｍｌと求められた。
【実施例９】
【００６５】
[ＰＣＲによるアミダーゼ遺伝子の増幅]
実施例７で得られた配列番号３のアミダーゼの内部アミノ酸配列のうち、Leu-Gly-Ala-Trp-Ala-Val-Gln-Thrの配列に基づいて、配列番号５に示されるＰＣＲのセンスプライマーを合成した。また、配列番号４のアミダーゼの内部アミノ酸配列のうち、Lys-Val-Ala-Asn-Ala-Phe-Glu-Glnの配列（リジルエンドペプチダーゼ消化によって生じたペプチドであるので、Ｎ末端側にLysがあるものとした）に基づいて、配列番号６に示されるＰＣＲのアンチセンスプライマーを合成した。なお、上の２本のＰＣＲプライマーの設計において、コドンの３番目の塩基は、Ｇ又はＣ（Ｓ）とした。
【００６６】
氷冷した０．２ｍｌ容のＰＣＲ用チューブに、０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、１０μｌの１０倍濃度反応バッファー、８μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、４μｌのゲノムＤＮＡ（０．１μｇ／μｌ；実施例７で得られたゲノムＤＮＡ溶液を５倍希釈したもの）、１μｌの配列番号５に示されるセンスプライマー（１００μＭ）、１μｌの配列番号６に示されるアンチセンスプライマー（１００μＭ）、５μｌのジメチルスルホキシド、及び７０．５μｌの水を加えた。これをＰＣＲ装置にセットし、９４℃で５分間の処理によってＤＮＡを変性させた後、３０回の温度サイクル（９４℃で２０秒間の変性ステップ、５９℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び７２℃で１２０秒間の伸長反応ステップ）によってＤＮＡを増幅し、最後に７２℃で２分間の処理によって反応を完結させた。反応終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【実施例１０】
【００６７】
[ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列決定]
実施例９で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、pGEM-T Easy Vector System（プロメガ）を用いて、次のようにしてクローニングした。エッペンドルフチューブに、２倍濃度ラピッドライゲーションバッファーを５μｌ、pGEM-T Easy Vectorを１μｌ（５０ｎｇ）、実施例９のＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを１μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを１μｌ（３Ｕ）、及び、水を２μｌ入れ、室温で１時間反応させた。この反応液を５μｌ取り出して、２００μｌの大腸菌JM103コンピテントセルに加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、８００μｌのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び１％ＮａＣｌ）を加えた後、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの、１００μｌを、選択寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、その選択寒天培地を３７℃で一晩保温した。
【００６８】
上記選択寒天培地上に現れた白色コロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。菌体を遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集めた後、１０ｍｌのＴＥＮバッファーで洗浄し、次いで、２．５ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、５０ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて懸濁した。これに２．５ｍｇのリゾチームを溶かした２５０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、室温に１０分間置いた。次に、新しく調製した５ｍｌの溶液II（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）をその液に加えて良く撹拌した後、それを室温に１０分間置いた。次いで、その溶菌液に氷冷した３．７５ｍｌの溶液III（６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍｌの酢酸、及び２８．５ｍｌの水を混合したもの）を加え良く撹拌し、氷中に１０分間置いた。それを遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）することによって不溶物を除き、上清を別の遠心チューブに移した。その上清に、０．６倍容量のイソプロパノールを加え、室温に１０分間置いた。遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、２０℃）によって得られた沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、７５０μｌのＴＥバッファーを加えて溶かし、エッペンドルフチューブに移した。この溶液に氷冷した７５０μｌの５Ｍ ＬｉＣｌを加え、氷中に１０分間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって不溶物を除き、上清を別のエッペンドルフチューブに移して、同容量のイソプロパノールを加え、室温に１０分間置いた。次いで、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、１２５μｌのＴＥバッファーを加えて溶かした。この溶液に０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを加え、室温に３０分間置いた。これに１３％ＰＥＧ８０００を含む１２５μｌの１．６Ｍ ＮａＣｌを加えて良く撹拌し、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を２００μｌのＴＥバッファーに溶かし、フェノール／クロロホルム抽出を行い、５０μｌの１０Ｍ酢酸アンモニウムと５００μｌのエタノールを加え、室温に１０分間置き、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって沈殿を得た。この沈殿を氷冷した７０％エタノールでリンスし、２００μｌのＴＥバッファーに溶かした。
【００６９】
このようにして調製したプラスミドＤＮＡを用いて、挿入ＤＮＡ部分の塩基配列を、ジデオキシ法によって決定した。その結果、配列番号７に示した塩基配列が得られた。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）について、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のＦＡＳＴＡ（相同性検索ソフトウェア）によってホモロジー検索を行った結果、このアミノ酸配列は、種々の微生物由来のアミダーゼのアミノ酸配列と高いホモロジーがあることが分かった。最も高いホモロジーを示したものは、Rhodococcus rhodochrous J1由来のものであり、それは本願配列番号８のアミノ酸配列に対して６８．７％のホモロジーを示した。以上のことから、実施例９において、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは、アミダーゼ遺伝子の一部であると考えられた。
【実施例１１】
【００７０】
[ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのジゴキシゲニン標識]
実施例９で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにしてジゴキシゲニン標識した。１５μｌ（約３μｇ）のＰＣＲ増幅ＤＮＡをエッペンドルフチューブにとり、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷した。これに２μｌのヘキサヌクレオチド混合液、２μｌのｄＮＴＰラベリング混合液、及び１μｌのクレノウ酵素を加え、３７℃で一晩反応させた。これに２μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え反応を停止させ、これを−２０℃で凍結保存した。
【実施例１２】
【００７１】
[ゲノムＤＮＡの制限酵素消化とアミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの調製]
実施例８で得られたゲノムＤＮＡの５μｌ（２．５μｇ）をエッペンドルフチューブにとり、５μｌの１０倍濃度反応バッファー、５μｌ（５０Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）、及び３５μｌの水を加え、３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で２時間反応させた。これに１μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、１００μｌのエタノールを加え、氷中に１時間以上置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。これを氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、２０μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。このＤＮＡ溶液の５μｌを、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡサイズマーカーとして、ジゴキシゲニンで標識されたλファージＤＮＡのHind III消化物（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。電気泳動後のアガロースゲルを、１００ｍｌの変性溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸し、１５分間ゆっくり振盪し、液を換えて、この操作をもう１回行った。次に、１００ｍｌのサザントランスファー用中和バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ７．５］、３Ｍ ＮａＣｌ）に浸し１５分間ゆっくり振盪し、液を換えて、この操作をもう１回行った。このようにして処理したアガロースゲルから、２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムバイオサイエンス）に、キャピラリー法によって、ＤＮＡを移した。その後、ナイロンメンブレンを風乾し、２枚の濾紙の間に挟んで、８０℃で２時間ベーキングし、ＤＮＡを固定した。
【００７２】
ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡとのハイブリダイゼーション及び検出は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにして行った。上で得られたベーキングしたメンブレンを、ハイブリダイゼーションバッグに入れ、１００μｇ／ｍｌサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む６ｍｌの高濃度ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファー（７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー［ｐＨ７．０］、及び０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）を加え、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、液を捨て、５μｌのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（実施例１１で調製されたものを、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷したもの）を含む１ｍｌの高濃度ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファーを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから取り出し、０．１％ＳＤＳを含む５０ｍｌの２×ＳＳＣを用い、室温で５分間２回洗浄した。続いて、０．１％ＳＤＳを含む５０ｍｌの０．５×ＳＳＣを用い、６８℃で１５分間２回洗浄した。このメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍマレイン酸；１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）で１分間リンスし、３０ｍｌのブロッキング溶液（１％ブロッキング試薬を含むマレイン酸バッファー）に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。次に、４μｌのアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を含む２０ｍｌのブロッキング溶液に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。その後、ナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍｌのマレイン酸バッファーで１５分間２回洗浄し、５０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ９．５］、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に２分間浸し平衡化した。このナイロンメンブレンを、新しく調製した発色基質溶液（２００μｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液を含む１０ｍｌの検出バッファー）に浸し、暗下に１時間静置した。バンドの発色を確認した後、ナイロンメンブレンをＴＥバッファーで洗浄し、暗下で風乾した。実施例９で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡフラグメントの大きさは、Sac I消化では６０１０ｂｐ、Kpn I消化では９８１０ｂｐ、Sma I消化では３７４０ｂｐ、及びBamH I消化では１６９０ｂｐであった。
【００７３】
実施例８で得られたゲノムＤＮＡの８０μｌ（４０μｇ）をエッペンドルフチューブにとり、４０μｌの１０倍濃度反応バッファー、４０μｌ（４００Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）、及び２４０μｌの水を加え、３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で２時間反応させた。これに８μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、８００μｌのエタノールを加え、氷中に１時間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。これを氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、１００μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。このＤＮＡ溶液の全量を、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡサイズマーカーとして、ジゴキシゲニン標識されたλファージＤＮＡのHind III消化物（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。泳動終了後、Sac I消化では６０１０ｂｐ、Kpn I消化では９８１０ｂｐ、Sma I消化では３７４０ｂｐ、及びBamH I消化では１６９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルをそれぞれ切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、切り出したそれぞれのゲルからＤＮＡを抽出した。
【実施例１３】
【００７４】
[アミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントのクローニング]
２．７μｇのプラスミドｐＵＣ１８をエッペンドルフチューブにとり、これに２０μｌの１０倍濃度反応バッファー、５μｌ（５０Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）を添加し、水を加えて全量を２００μｌにした。これを３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で１時間反応させ、６５℃で１５分間熱処理することによって制限酵素を失活させた。これに２７μｌの１０倍濃度ＤＰバッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．５］、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）、３０μｌ（３０Ｕ）のシュリンプアルカリホスファターゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、及び１３μｌの水を加え、３７℃で３０分間反応させ、６５℃で１５分間熱処理することによって酵素を失活させた。これに５．４μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、５４０μｌのエタノールを加え、氷中に１時間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、５０μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。
【００７５】
このようにして調製したクローニングベクターの１μｌと実施例１２で調製したＤＮＡフラグメントの５μｌを混合し、３μｌのLigation high（TOYOBO）を加えて、１６℃で１時間反応させた。このうちの５μｌを、１００μｌの大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、その寒天培地を３５℃で一晩保温した。
【００７６】
コロニーが出現した寒天培地を、４℃に３０分間以上置き冷却した。この寒天培地上に、ピンセットを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムバイオサイエンス）をのせ、１分間経過後にはがし、コロニーに接していた面を上にして、変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に置いた。この状態で１５分間静置した後、ナイロンメンブレンを乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。次に、コロニーハイブリダイゼーション用中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ７．５］、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に、このナイロンメンブレンを、コロニーに接していた面を上にして置いた。この状態で１５分間静置した後、ナイロンメンブレンを乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。その後、２×ＳＳＣ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に、そのナイロンメンブレンを置いた。この状態で１０分間静置した後、そのナイロンメンブレンを乾いた濾紙上で風乾させた後、８０℃で２時間ベーキングすることによってＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。その後、このナイロンメンブレンを２×ＳＳＣに５分間浸し、次に、プレ洗浄液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸し、５０℃で３０分間振盪した。ナイロンメンブレン上のセルデブリスを、プレ洗浄液を浸したキムワイプを用いてふき取った後、ナイロンメンブレンを２×ＳＳＣで２回洗浄した。
【００７７】
前述のナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、そこに５０μｇ／ｍｌサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む１０ｍｌのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファー（５０ｍｌのホルムアミド［脱イオン化済み］、２５ｍｌの２０×ＳＳＣ、２０ｍｌの１０％ブロッキング試薬、１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、０．２ｍｌの１０％ＳＤＳ、及び３．８ｍｌの水を混合したもの）を加えて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、このプレハイブリダイゼーション液を捨てた後、ハイブリダイゼーションバッグに１０μｌのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（実施例１１で調製されたものを、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷したもの）を含む２ｍｌのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファーを加えて、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから取り出し、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用い、室温で５分間２回ナイロンメンブレンを洗浄した。続いて、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用い、６８℃で１５分間２回ナイロンメンブレンを洗浄した。このナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで１分間リンスした後、ブロッキング溶液に浸して３０分間ゆっくり振盪した。次に、このナイロンメンブレンを、１０μｌのアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を含む５０ｍｌのブロッキング溶液に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。その後、このナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで１５分間２回洗浄した後、検出バッファーに２分間浸して平衡化した。このナイロンメンブレンを、コロニーの面を上にしてシャーレに入れ、そこに新しく調製した１０ｍｌの発色基質溶液を加えて、暗下に数時間静置した。コロニーの発色を確認した後、このナイロンメンブレンをＴＥバッファーで洗浄し、暗下で風乾した。
【００７８】
上述のコロニーハイブリダイゼーションによって陽性と判断されたコロニーを、元の寒天培地から拾い上げ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を集め、実施例１０で用いた方法によってプラスミドを調製した。Sac Iを用いて得られたプラスミドをpASC2、Kpn Iを用いて得られたプラスミドをpAKP1、Sma Iを用いて得られたプラスミドをpASM3、及びBamH Iを用いて得られたプラスミドをpABM11と命名した。また、これらのプラスミドの挿入ＤＮＡの向きを変えたプラスミドを作製し、それぞれ、pASC2R、pAKP1R、pASM3R、及びpABM11Rと命名した。
【実施例１４】
【００７９】
[アミダーゼ遺伝子の塩基配列決定]
実施例１３で得られた各種プラスミドを種々の制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析することによって、挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図を作成した。その結果、図９に示したように、クローニングされた各ＤＮＡフラグメントの位置関係が明らかになった。すべてのＤＮＡフラグメントに共通して存在するＤＮＡ領域における制限酵素パターンと実施例１０で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列（配列番号７）から求められた制限酵素パターンを比較することによって、アミダーゼ遺伝子の位置と方向は、図９に示したようであると推定された。そこで、この近傍の塩基配列を決定した結果、配列番号９に示したアミダーゼ遺伝子の全塩基配列が求められた。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）について、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のＦＡＳＴＡ（相同性検索ソフトウェア）によってホモロジー検索を行った結果、最も高いホモロジーを有するものは、Rhodococcus rhodochrous J1由来のアミダーゼであり、このアミダーゼは本願配列番号１０のアミノ酸配列に対して６３．７％のホモロジーを示した。
【００８０】
なお、国際公開２００４／０８３４２３号パンフレットに記載されているシュードノカルディア・サーモフィラのアミダーゼのアミノ酸配列は、本願配列番号１０のアミノ酸配列に対して８５．６％のホモロジーを示した。ただし、図２に示したように、両アミノ酸配列はＮ末端側の約２０アミノ酸残基が一致しているものの、その後の約７０アミノ酸残基の広い領域にわたって、配列が異なっており、別の酵素であることが明らかになった。また、本願配列番号１０のアミノ酸配列中には、タンパク質レベルで決定されたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列が見出された（図２の網掛けを施したアミノ酸配列）。このことから、本願配列番号９の塩基配列が、シュードノカルディア・サーモフィラから精製されたアミダーゼタンパク質をコードするものであることが確認された。
【実施例１５】
【００８１】
[アミダーゼ遺伝子の大腸菌での発現]
上述のクローニングされたアミダーゼ遺伝子を発現ベクターに組み込むために、ＰＣＲのフォワードプライマー（配列番号１１）とリバースプライマー（配列番号１２）を合成した。ＰＣＲは次のようにして行った。氷冷した０．２ｍｌ容のＰＣＲ用チューブに、０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、５μｌの１０倍濃度反応バッファー、４μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、１．８ｎｇのプラスミドｐＡＳＭ３（実施例１３で得られたもの）、１０ｐｍｏｌの上のフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌの上のリバースプライマー及び２．５μｌのジメチルスルホキシドを入れ、水を加えて５０μｌにした。これをＰＣＲ装置にセットし、９４℃で５分間の処理によってＤＮＡを変性させた後、３０回の温度サイクル（９４℃で６０秒間の変性ステップ、４５℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び６８℃で１２０秒間の伸長反応ステップ）によってＤＮＡを増幅し、最後に６８℃で２分間の処理によって反応を完結させた。反応終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、切り出したゲルからＤＮＡを抽出した。
【００８２】
上述のＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、次のようにしてpGEM-T Vector（プロメガ）に組み込んだ。エッペンドルフチューブに、５μｌの２倍濃度ラピッドライゲーションバッファー、１μｌ（５０ｎｇ）のpGEM-T Vector、３μｌの上で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及び１μｌ（３Ｕ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、室温で１時間反応させた。この反応液の５μｌを、１００μｌの大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）を加えた後、それを３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、選択寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、これを３７℃で一晩保温した。選択寒天培地上に現れた白色コロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を集め、実施例１０で用いた方法によってその菌体からプラスミドを調製した。このようにして得られたプラスミドをpGEM-fPTAMと命名した。
【００８３】
プラスミドpGEM-fPTAMをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１００倍希釈し、この１μｌを、１００μｌの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Novagen）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、これを３７℃で一晩保温した。この寒天培地に出現したコロニーを、１００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコ中の５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で振盪培養した。Ａ６００が０．６になった時点で、終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに３７℃で５時間振盪培養した。培養液を遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して集菌し、得られた菌体を１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁した。
【００８４】
前述の菌体懸濁液の適当量をエッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて全量を４８７．５μｌにし、５０℃の水浴中で５分間保温した。これに１２．５μｌの２０％ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を添加し、５０℃の水浴中で２０分間反応させた。１００μｌの２Ｎ塩酸を加えることによって反応を停止させた後、それを遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）することによって得られた上清をＨＰＬＣ（水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。その結果、１ｇの湿菌体当たり２７８Ｕのアミダーゼ活性が得られた。それに対して、元のシュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５の湿菌体１ｇ当たりのアミダーゼ活性は、同じ条件で分析したとき、１３８Ｕであった。すなわち、アミダーゼ遺伝子を大腸菌で高発現させることによって、元の菌の約２倍のアミダーゼ活性を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
国際公開２００４／０８３４２３号パンフレットには、本発明と同じ微生物であるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のアミダーゼが記載されている。しかしながら、このアミダーゼは、構成酵素であるとされ、その酵素活性は、メチオニンアミドを基質としたとき、ＨＭＢ−アミド（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド）よりも約２．５倍高いと記載されている。一方、本発明のアミダーゼは、同じくシュードノカルディア・サーモフィラ由来であるが、誘導酵素であり、その酵素活性は、前者の酵素とは逆に、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド（ＨＭＢ−アミド）を基質としたとき、メチオニンアミドよりも約１２倍も高いことが明らかになった。したがって、本発明のアミダーゼは、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドからの２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸（ＨＭＢＡ）の生産に有利である。
【００８６】
さらに、アミダーゼの遺伝子をクローニングして、塩基配列を決定した結果、両アミダーゼのアミノ酸配列は、Ｎ末端側の約２０アミノ酸残基は一致していたが、その後の約７０アミノ酸残基の広い範囲にわたって、配列が異なっており、別の酵素であることが明らかになった（図２）。
【００８７】
これまでに種々のアミダーゼが、いろいろな微生物において見出されているが、それらのアミダーゼは、アミドの加水分解で生じるアンモニアによって活性が強く阻害される（M.J.Woods et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 567:225-237）という致命的な問題があった。それに対して、本発明のアミダーゼは、アンモニアによって活性が阻害されにくいという性質をもっていることが明らかになった。したがって、本発明のアミダーゼは、アミドからカルボン酸を工業的に生産する場合等に非常に有利であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ｐＨ７．５での菌体反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は本発明のシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５菌体、○はコントロールとして用いたRhodococcus rhodochrous ＩＦＯ １５５６４菌体の場合である。
【図２】本発明のアミダーゼのアミノ酸配列（Nisso）と国際公開２００４／０８３４２３号パンフレット記載のアミダーゼのアミノ酸配列（Degussa）とを比較した図である。網掛けを施したアミノ酸配列は、タンパク質レベルで決定されたＮ末端アミノ酸配列又は内部アミノ酸配列である。
【図３】ｐＨ９．０での菌体反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は本発明のシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５菌体、○はコントロールとして用いたRhodococcus rhodochrous ＩＦＯ １５５６４菌体の場合である。
【図４】アミダーゼの各精製段階での活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した図である。レーン１は細胞抽出液、レーン２は硫安塩析画分、レーン３はフェニルセファロース活性画分、レーン４はＤＥＡＥセファロース活性画分、レーン５はゲル濾過活性画分、及びレーンＭは分子質量マーカーである。
【図５】精製アミダーゼを用いた酵素反応における温度の影響を示す図である。
【図６】精製アミダーゼの熱安定性を示す図である。
【図７】精製アミダーゼを用いた酵素反応におけるｐＨの影響を示す図である。◇は酢酸ナトリウムバッファー、●はリン酸カリウムバッファー、△はＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、及び■は塩化アンモニウムバッファーを用いた場合である。
【図８】精製アミダーゼを用いた酵素反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は３０℃、▲は４０℃、及び■は５０℃の場合である。
【図９】アミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの制限酵素地図である。pAKP1はKpn Iフラグメント、pASM3はSma Iフラグメント、pASC2RはSac Iフラグメント、及びpABM11はBamH Iフラグメントを含むプラスミドである。白抜き矢印はアミダーゼ遺伝子の位置と方向を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンモニア耐性が高い新規なアミダーゼ、アミダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミダーゼは、アミドを加水分解して対応するカルボン酸に変換する酵素として知られている。アミダーゼを用いることによって、アミドから医農薬原料等に有用なカルボン酸を生成することができる。アミダーゼを用いると、例えば、α−アミノ酸アミドからα−アミノ酸を、α−ヒドロキシ酸アミドからα−ヒドロキシ酸を生産することができる。
【０００３】
微生物由来のアミダーゼは、Arthrobacter sp. J-1、Brevibacterium sp. R 312、Aspergillus nidulans、Pseudomonas chlororaphis B23、及びシュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）などから精製されている（例えば非特許文献１〜７参照）。
一方、Pseudomonas aeruginosa、Aspergillus oryzae、Rhodococcus sp.、Pseudomonas chlororaphis B23、Rhodococcus sp. N-774、Brevibacterium sp. R312、Rhodococcus rhodochrous J1、Pseudomonas putida、Bacillus stearothermophilus BR388、Agrobacterium tumefaciens d3、Sulfolobus solfataricus、及びRhodococcus erythropolis MP50などの微生物からは、アミダーゼ遺伝子がクローニングされており、その結果、種々のアミダーゼのアミノ酸配列が明らかになっている（例えば非特許文献８〜１９参照）。
【０００４】
アミダーゼ遺伝子に関する特許文献としては、Brevibacterium R312とRhodococcus（特許文献１）、Comamonas testosteroni NI 1（特許文献２）、Comamonas acidovorans KPO-2771-4（特許文献３）、Rhodococcus rhodochrous IFO 15564（特許文献４）、Enterobacter cloacae（特許文献５）、Pseudomonas putida（特許文献６）、Rhodococcus sp. （特許文献７）、Brevibacillus borstelensis（特許文献８）、Pseudomonas azotoformans IAM 1603（特許文献９）、Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321（特許文献１０）、Thermus sp. （特許文献１１）、Pseudomonas sp. MCI 3434とPseudomonas aeruginosa PAO1（特許文献１２）、Thermococcus GU5L5（特許文献１３）、Variovorax paradoxus DSM 14468（特許文献１４）、及びComamonas testosteroni 5-MGAM-4D（特許文献１５）に関するものなどがある。また、本発明のアミダーゼ遺伝子の採取源であるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のアミダーゼ及びその遺伝子も知られている（特許文献１６）が、このアミダーゼは本発明のアミダーゼとは構造が明確に異なり、また、酵素学的性質も明らかに異なっている。
【０００５】
このように、種々の微生物において、アミダーゼ及びアミダーゼ遺伝子が知られてはいたものの、これらの微生物又は酵素を用いて、工業的に、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドからα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって、アミダーゼ活性が強く阻害され、カルボン酸の生産効率が低下したり、カルボン酸の生産が停止するという問題があった（例えば非特許文献２０参照）。なお、シュードノカルディア・サーモフィラの菌体を利用したＤＬ−メチオニンの製造法は知られていた（特許文献１７参照）が、アンモニア耐性を有するアミダーゼについての知見は全く得られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５２６０２０８号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／１７１９０号パンフレット
【特許文献３】特開平８−２５６７７１号公報
【特許文献４】特開平９−９９７３号公報
【特許文献５】米国特許第６６１７１３９号明細書
【特許文献６】米国特許第６２５１６５０号明細書
【特許文献７】国際公開第０１／３０９９４号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０３／００８５６９号パンフレット
【特許文献９】特開２００３−２５０５５８号公報
【特許文献１０】国際公開第０３／０１０３１２号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３／０２０９２９号パンフレット
【特許文献１２】特開２００４−１０５１５２号公報
【特許文献１３】国際公開第０３／０２７３１５号パンフレット
【特許文献１４】米国特許出願公開２００３／０１８６４２３号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開２００４／０２２５１１６号明細書
【特許文献１６】国際公開第２００４／０８３４２３号パンフレット
【特許文献１７】特開２００４−２５４６９０号公報
【非特許文献１】Y. Asano et al., 1982, Agric. Biol. Chem. 46:1175-1181
【非特許文献２】A. Thiery et al., 1986, J. Basic Microbiol. 26:299-311
【非特許文献３】J-F. Mayaux et al., 1990, J. Bacteriol. 172:6764-6773
【非特許文献４】C. M. Corrick et al., 1987, Gene 53:63-71
【非特許文献５】J. A. Fraser et al., 2002, Fungal Genet. Biol. 35:135-146
【非特許文献６】L. M. Ciskanik et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:998-1003
【非特許文献７】K. Egorova et al., 2004, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:38-45
【非特許文献８】W. J. Brammar et al., 1987, FEBS Lett. 215:291-294
【非特許文献９】K. Gomi et al., 1991, Gene 108:91-98
【非特許文献１０】J-F. Mayaux et al., 1991, J. Bacteriol. 173:6694-6704
【非特許文献１１】M. Nishiyama et al., 1991, J. Bacteriol. 173:2465-2472
【非特許文献１２】Y. Hashimoto et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:225-233
【非特許文献１３】F. Soubrier et al., 1992, Gene 116:99-104
【非特許文献１４】M. Kobayashi et al., 1993. Eur. J. Biochem. 217:327-336
【非特許文献１５】S. Wu et al., 1998, DNA Cell Biol. 17:915-920
【非特許文献１６】T. K. Cheong and P. J. Oriel, 2000, Enzyme Microb. Technol. 26:152-158
【非特許文献１７】S. Trott et al., 2001, Microbiology 147:1815-1824
【非特許文献１８】A. S. d’Abusco et al., 2001, Extremophiles 5:183-192
【非特許文献１９】S. Trott et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:3279-3286
【非特許文献２０】M. J. Woods et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 567:225-237
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、公知のアミダーゼ活性を示す微生物又はそれから得られたアミダーゼ酵素等を用いて、工業的に、α―アミノ酸アミド又はα―ヒドロキシ酸アミドからα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって、アミダーゼ活性が強く阻害され、カルボン酸の生産効率が低下したり、カルボン酸の生産が停止するという問題があった。本発明の課題は、アンモニア耐性が高い、アミダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５から新規なアミダーゼを単離し、そのアミダーゼのアンモニア耐性が高いことを見出すと共に、その遺伝子を同定することにより、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すアミダーゼや、（２）シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）に由来することを特徴とする上記（１）記載のアミダーゼに関する。
【００１０】
また本発明は、（３）（ｇ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は（ｈ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質や、（４）（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質又は（ｊ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質に関する。また本発明は、（５）（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す上記（３）〜（４）のいずれか記載のタンパク質や、（６）（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す上記（３）〜（５）のいずれか記載のタンパク質や、（７）シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする上記（３）〜（６）のいずれか記載のタンパク質に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（８）前述の（３）〜（７）のいずれか記載のタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（９）（ｋ）配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ又は（ｌ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１０）配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。また本発明は、（１１）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す性質を有するタンパク質であることを特徴とする上記（９）又は（１０）記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１２）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す性質を有するタンパク質であることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡや、（１３）アミダーゼ活性を有するタンパク質が、シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする上記（９）〜（１２）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡに関する。
【００１２】
また本発明は、(１４) 前述の（８）〜（１３）のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターに関する。
【００１３】
さらに本発明は、(１５) 前述の（１４）記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換微生物に関する。
【００１４】
また本発明は、(１６) 前述の（１）若しくは（２）記載のアミダーゼ又はその生産菌若しくはその処理物、あるいは、前述の（３）〜（７）のいずれか記載のタンパク質又は上記（１５）記載の形質転換微生物若しくはその処理物を、アミドに作用させることを特徴とするカルボン酸の製造方法や、(１７) アミドがα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドであり、カルボン酸がα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸であることを特徴とする上記（１６）記載のカルボン酸の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアンモニア耐性が高いアミダーゼを用いると、工業的にアミドからカルボン酸を生産しようとする場合、副生するアンモニアによって反応速度が低下することが少ないので、効率の良い生産プロセスの構築が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のアミダーゼとしては、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示し、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すアミダーゼであれば特に制限されるものではなく、かかるアミダーゼとして、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するアミダーゼを好適に例示することができる。以下、上記本発明のアミダーゼを総称して「本件アミダーゼ」ということがある。
【００１７】
本発明において、「シュードノカルディア・サーモフィラに由来するアミダーゼ」とは、実際にシュードノカルディア・サーモフィラに存在するアミダーゼのほか、そのアミダーゼと同一又は類似である限り、形質転換等の手法を用いてシュードノカルディア・サーモフィラ以外の微生物等によって発現されたアミダーゼも含む意味で用いられる。
【００１８】
また本発明において、「ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す」とは、ｐＨ及びアンモニア濃度以外の条件については好適な条件にした上で、ｐＨ９．０及びアンモニア濃度０．２Ｍとした場合に示す、メチオニンアミドに対するアミダーゼの比活性が、ｐＨ９．０及びアンモニア濃度０Ｍとした場合に示すメチオニンアミドに対するアミダーゼの比活性の５０％以上であることを意味し、例えば後述の実施例６の（６）に記載された方法にしたがって調べることができる。また、「メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す」とは、好適な条件下において、メチオニンアミドに対して示すアミダーゼの比活性と比較して、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して示すアミダーゼの比活性の方が高いことを意味し、さらに、好ましくは、前述の２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して示すアミダーゼの比活性が、前述のメチオニンアミドに対して示すアミダーゼの比活性の２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上であることを意味する。
【００１９】
本件アミダーゼの製造方法としては、シュードノカルディア属に属する本件アミダーゼ生産菌を培地で培養し、本件アミダーゼを採取する方法であれば特に制限されず、シュードノカルディア属に属する本件アミダーゼ生産菌としては、シュードノカルディア・サーモフィラを好適に例示することができ、より具体的には、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を挙げることができ、ＪＣＭ３０９５株は Japan Collection of Microorganisms（ＪＣＭ：理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができる。また、培養する培地としては、本微生物が生育できるものであれば何れのものでも良いが、例えば、ε−カプロラクタムやメタクリルアミドなどのようなアミド化合物を添加することによって、アミダーゼが誘導生成される。
【００２０】
本発明のタンパク質としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質、配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されないが、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すものや、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すものが好ましく、これら（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有するものがより好ましく、好適には、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するものを挙げることができる。以下、これら本発明のタンパク質を総称して「本件タンパク質」ということがある。
【００２１】
また、本発明のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡとしては、本件タンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ、又は配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡであれば特に制限されないが、上記アミダーゼ活性を有するタンパク質が、（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示し、（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すものや、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａであり、（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃であり、（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定であり、（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示すものが好ましく、これら（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有するものがより好ましく、好適には、シュードノカルディア・サーモフィラに由来するものを挙げることができる。以下、これら本発明のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡを総称して「本件遺伝子ＤＮＡ」ということがある。
【００２２】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味し、また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００２３】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989（以後、モレキュラークローニング第２版と略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２４】
本発明において「アミダーゼ活性を有する」とは、アミドを加水分解し、カルボン酸とアンモニアを生成する酵素活性を有することをいう。得られたそのタンパク質が、アミダーゼ活性を有するかどうかは、例えば後述の実施例２に記載したように、そのタンパク質とアミドを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、カルボン酸の生成を調べることで容易に確認することができる。また、得られたタンパク質が、メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示すかどうかは、後述の実施例６の（４）に記載したように、そのタンパク質のメチオニンアミドに対する比活性及び２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対する比活性を測定し、それらの測定値を比較することで容易に確認することができる。
【００２５】
上記「ストリンジェントな条件」とは、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション法においては、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中で６８℃で洗浄することを含む条件等、また、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法においては、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で６８℃で洗浄することを含む条件等である。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができ、例えば、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８６％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２７】
本件遺伝子ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号９に示される塩基配列情報又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて例えばシュードノカルディア・サーモフィラや、シュードノカルディア・サーモフィラ以外の生物のゲノムＤＮＡライブラリー等から目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。例えば、シュードノカルディア・サーモフィラより、常法に従ってゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本件遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本件遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、ゲノムＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件遺伝子ＤＮＡをゲノムＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、後述の実施例に記載された方法の他、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。また、変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡとホモロジーが高い塩基配列をもつＤＮＡを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２８】
本発明の組換えベクターとしては、本件遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切に組換えることにより構築することができる。例えば、本件遺伝子ＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだ構成を好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子の発現に関与するプロモーター、ターミネーター等の制御配列及び転写制御因子の遺伝子を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２９】
細菌用の発現ベクターとして、例えば、Ｔ７ファージプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を具体的に例示することができる。
【００３０】
また、本発明の形質転換微生物としては、上記本発明の組換えベクターが導入された形質転換微生物であれば特に制限されず、宿主としては、細菌、酵母等の微生物を挙げることができる。そのような細菌として、例えばエシェリヒア属細菌、シュードノカルディア属細菌、ストレプトミセス属細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等を挙げることができる。上記組換えベクターを宿主微生物に導入する方法としては、モレキュラークローニング第２版など多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換等により行うことができる。また、本発明の形質転換微生物を培養することによって、本件タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、さらに、該培養物から該タンパク質を採取することにより、本件タンパク質を大量に製造することができる。
【００３１】
前記本件タンパク質の由来は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質でも何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。例えば、シュードノカルディア・サーモフィラからの本発明のタンパク質の単離・精製は、シュードノカルディア・サーモフィラの菌株を、例えば、ε−カプロラクタムやメタクリルアミドなどのようなアミド化合物を添加した培地を用いて培養し、培養物から集菌し、集菌した菌体を破砕し細胞抽出液を得ること等により行うことができる。菌体の破砕法については特に制限はないが、超音波処理の場合は、菌体懸濁液にガラスビーズを加えて処理すると効果的である。このようにして得られた細胞抽出液から、タンパク質を精製する方法に特に制限はないが、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、上記タンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記タンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、精製タンパク質を得ることができる。
【００３２】
精製の各段階で得られた画分のアミダーゼ活性は、例えば、次のようにして定量することができる。試料液を、適当なバッファー又は塩溶液で希釈し、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミド等のアミドを添加すると、加水分解反応が起こり、α−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸が生成する。反応条件としては、特に制限はないが、４０〜６０℃、ｐＨ６〜９が適している。反応液中に生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、ＨＰＬＣによって定量することができる。また、精製の各段階で得られた画分のタンパク質は、牛血清アルブミンをスタンダードとして用いて、Ｌｏｗｒｙ法（O. H. Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193:265-275）などによって定量することができる。各精製段階でのアミダーゼの純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（U. K. Laemmli, 1970, Nature 227:680-685）によって調べることができる。
【００３３】
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００３４】
遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。この遺伝子組換え技術による方法は、比較的容易な操作で、かつ大量に目的のタンパク質を調製することが可能である。
【００３５】
さらに、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８６％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号９に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシュードノカルディア・サーモフィラ以外の生物から得られたＤＮＡを適当な条件下でスクリーニングすることにより、該ＤＮＡとホモロジーの高いＤＮＡを単離することができる。こうして得られた遺伝子ＤＮＡを、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、それによってコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３６】
なお、配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列は、本願で実際に得られたアミダーゼと、国際公開第２００４／０８３４２３号パンフレットで実際に得られたアミダーゼとの間で、大きく異なる部分である（図２参照）。この部分のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質の中にも、本願配列番号１０のアミダーゼと同様の性質を有するタンパク質が存在すると予測される。
【００３７】
本発明のカルボン酸の製造方法としては、本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物をアミドに作用させることを含む方法であれば特に制限はない。ここでいう「形質転換微生物の細胞」は、生細胞であるか死細胞であるかを問わない。また、上記「細胞の処理物」とは、本発明の形質転換微生物の細胞を処理したものであって、アミドからカルボン酸の製造に用いることができる限り特に制限はなく、例えば、本発明の形質転換微生物の細胞について、機械的破砕処理、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、加圧減圧処理及び浸透圧処理などを施したもの、ならびに、細胞又はその処理物をアルギン酸等で固定化した物などが挙げられる。また、本発明の形質転換微生物の細胞抽出液から、例えば硫安塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲル濾過クロマトグラフィーなどによって精製された本発明のタンパク質及びその固定化物も、本発明の「細胞の処理物」に含まれる。なお、本発明のカルボン酸の製造法における、細胞又はその処理物は、固定化されていなくてもよいが、固定化されている方が好ましい。固定化されている細胞又は処理物を用いた場合は、細胞又はその処理物と生成物との分離が容易になるからである。このようにして生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、通常の方法によって濃縮精製することができる。
【００３８】
また、本発明のカルボン酸の製造方法に用いる、本発明の形質転換微生物の培養方法又はその処理物の製造方法については、その細胞又はその処理物がカルボン酸の製造方法に用いることができる限り特に制限はなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００３９】
本発明のカルボン酸の製造方法では、例えば適当なバッファー又は塩溶液中で、本発明のアミダーゼ等をアミドに作用させることができる。バッファー又は塩は、アミドからカルボン酸への加水分解反応を阻害するものでなければ特に制限はない。
【００４０】
本発明のカルボン酸の製造方法における「アミド」は、本発明のタンパク質が基質とすることができる限り、特に制限はないが、α−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドが好ましい。本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物を、例えばα−アミノ酸アミド、α−ヒドロキシ酸アミド、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドにそれぞれ作用させた場合は、α−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸、２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸がそれぞれ生産される。
【００４１】
本発明のカルボン酸の製造方法における反応液中のアミドの濃度については特に制限はないが、通常は０．１〜３０重量％程度である。また、アミドは連続的又は間欠的に反応系に添加してもよい。本発明の形質転換微生物の細胞又はその処理物の反応系への添加量は、特に制限はないが、乾燥細胞重量換算で、０．１〜６０ｇ／Ｌの範囲で添加することができる。また、反応の温度及びｐＨ等は、アミドからカルボン酸への加水分解反応が生じる限り特に制限はないが、例えば、４０〜６０℃、ｐＨ６〜９とすることができる。生成したα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸等のカルボン酸は、ＨＰＬＣによって確認・定量することができる。
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
[シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５の培養]
３０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに、５００ｍｌのＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を仕込み、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Japan Collection of Microorganismsから入手可能）を植菌し、５０℃で２日間振盪培養した。次に、別の３０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに、５００ｍｌのＴＹＣ培地（１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏと０．５％ε−カプロラクタムを含むＴＹ培地）を仕込み、上の前培養の１０ｍｌを加え、５０℃で２日間振盪培養した。遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集菌し、９．１５ｇの湿菌体を得た。コントロールとして、ε−カプロラクタムを含まないＴＹＣ培地を用いて、同様にシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を培養し、集菌し、１４．５ｇの湿菌体を得た。
【実施例２】
【００４４】
[菌体のアミダーゼ活性の測定]
実施例１で得られた湿菌体を２００ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄し、同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁し、全量を５０ｍｌにした。この菌体懸濁液の５０から１００μｌをエッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて全量を５００μｌにし、３０℃の水浴中で５分間保温した。これに５０μｌの１Ｍ Ｌ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。ＴＹＣ培地を用いたときのアミダーゼ活性は１９．１Ｕ／ｇ湿菌体であったのに対して、ε−カプロラクタムを含まないＴＹＣ培地を用いたときのアミダーゼ活性は３．１４Ｕ／ｇ湿菌体であった。この結果から、ε−カプロラクタムの添加によって、ＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性が約６倍に増加することが分かった。
【実施例３】
【００４５】
[ｐＨ７．５での菌体反応におけるアンモニアの影響]
実施例１と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を培養し、遠心によって菌体を集めた。集めた菌体に生理食塩水（０．８％ＮａＣｌ）を加えて懸濁し、菌体懸濁液を調製した。一方、Rhodococcus rhodochrous IFO 15564（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門NBRCから入手可能）を、ＣＳＬ培地（２％コーンスティープリカー、１％スクロース、及び０．５％ε−カプロラクタム）を用いて、２８℃で振盪培養し、遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって菌体を集めた。集めた菌体に生理食塩水を加えて懸濁して、菌体懸濁液（コントロール）を調製した。これらの菌体懸濁液の一定量をエッペンドルフチューブにとり、５０μｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）と種々の量の２Ｍアンモニア水（塩酸でｐＨ７．５に調整したもの）を添加し、水を加えて全量を４５０μｌにした。これを３０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。その結果、図１に示したように、アンモニア濃度と菌体活性（アンモニア無添加のときの菌体活性を１００％とした）との関係が求められた。Rhodococcus rhodochrous IFO 15564のアミダーゼ活性は、低濃度のアンモニアによっても強く阻害されたが、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性は、アンモニアによってほとんど影響を受けなかった。
【実施例４】
【００４６】
[ｐＨ９．０での菌体反応におけるアンモニアの影響]
実施例３と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５とRhodococcus rhodochrous IFO 15564の菌体懸濁液を調製した。これらの菌体懸濁液の一定量をエッペンドルフチューブにとり、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）と種々の量の２Ｍアンモニア水（塩酸でｐＨ９．０に調整したもの）を添加し、水を加えて全量を４５０μｌにした。これを３０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、３０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する菌体量を１Ｕとした。その結果、図３に示したように、アンモニア濃度と菌体活性（アンモニア無添加のときの菌体活性を１００％とした）との関係が求められた。Rhodococcus rhodochrous IFO 15564のアミダーゼ活性は、低濃度のアンモニアによっても強く阻害されたが、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のアミダーゼ活性は、アンモニアによる阻害を受けにくいことが分かった。
【実施例５】
【００４７】
[アミダーゼの精製]
実施例1と同様にして、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を５００ｍｌのＴＹＣ培地を用いて培養した。遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集菌し、その菌体を２００ｍｌのＴＥＤバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄し、５０ｍｌの同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁した。これに２０ｇのガラスビーズ（粒径５０μｍ）を加えて、超音波ホモジェナイザー（セイコー電子工業；モデル７５００）によって処理（最大出力、実効時間３ｍｉｎ、氷冷）し、遠心（１６ｋｒｐｍ、３０ｍｉｎ、４℃）によって上清を得た。この上清に、３０％飽和になるように硫安を加え、氷中に１時間以上置いた後、生成した沈殿を遠心（同上）によって除き、上清に６０％飽和になるように硫安を加え、氷中に１時間以上置いた後、生成した沈殿を遠心（同上）によって得た。
【００４８】
上で得られた沈殿を、１Ｍ硫安を含む２０ｍｌのＴＥＤバッファーに溶かし、同じバッファーで平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）のカラム（２．２×１６．５ｃｍ）に負荷した。その後、１Ｍ硫安を含む１５０ｍｌのＴＥＤバッファーでカラムを洗い、１から０Ｍ硫安のグラジェント溶出（全量３００ｍｌ）を行い、最後に、１５０ｍｌのＴＥＤバッファーでの溶出を行った。カラムからの溶出液は、１５ｇずつ分画した。各画分のアミダーゼ活性を、次のようにして測定した。適当量の試料液を、エッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて、全量を５００μｌにした。これを５０℃の水浴中で５分間保温した後、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。アミダーゼ活性は、硫安濃度がほぼ０Ｍになるあたりに溶出された。
【００４９】
上のフェニルセファロースクロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、１０ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、１０００ｍｌのＴＥＤバッファーに対して一晩透析した。これを、ＴＥＤバッファーで平衡化したＤＥＡＥセファロースFast Flow（アマシャムバイオサイエンス）のカラム（１．６×１３ｃｍ）に負荷し、７５ｍｌのＴＥＤバッファーでカラムを洗い、０から０．５Ｍ ＮａＣｌのグラジェント溶出（全量１５０ｍｌ）を行い、最後に、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む７５ｍｌのＴＥＤバッファーでの溶出を行った。カラムからの溶出液を１５ｇずつ分画し、各画分のアミダーゼ活性を、上に述べた方法により測定した。アミダーゼ活性は、約０．２Ｍ濃度のＮａＣｌで溶出された画分に見いだされた。
【００５０】
上のＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、５ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、ＴＥＤバッファーで平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（ＴＯＳＯＨ）のカラム（２．６×８８ｃｍ）に負荷した。カラムからの溶出液を５ｇずつ分画し、各画分のアミダーゼ活性を、上述の方法で測定した。アミダーゼ活性は、１００から２００ｋＤａに相当する画分に溶出された。分子質量マーカーとして、カタラーゼ（２４０ｋＤａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（１４０ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、α−キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）、及びリゾチーム（１４ｋＤａ）を用いた。
【００５１】
上のゲル濾過クロマトグラフィーで得られたアミダーゼ活性画分を硫安塩析（６０％飽和）し、２ｍｌのＴＥＤバッファーを加えて溶かし、５００ｍｌのＴＥＤバッファーに対して透析（２回）し、−３０℃で凍結保存した。表１に、各精製段階でのアミダーゼ活性画分の比活性等を示した。タンパク質は、牛血清アルブミンをスタンダードとして用いて、Lowry法によって定量した。アミダーゼは１２％の収率で、６．７倍に精製された。最終的に得られた精製アミダーゼの比活性は１４．７Ｕ／ｍｇであった。図４に、各精製段階のアミダーゼ活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した結果を示した。アミダーゼの分子質量は、５３ｋＤａと求められた。上述のゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、アミダーゼ活性が１００から２００ｋＤａに相当する画分に溶出されたことを考え合わせると、自然状態のアミダーゼは２〜４量体であると考えられる。
【００５２】
【表１】
【実施例６】
【００５３】
[精製アミダーゼの酵素的性質]
（１）反応温度
３６μｇの精製アミダーゼを含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、一定温度の水浴中で５分間保温した。これに５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、同じ温度の水浴中で１０から３０分間反応させた。これに１００μｌの２ Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図５に示したように、反応温度と酵素活性との関係が求められた。酵素活性の至適温度は６５℃であった。
【００５４】
（２）熱安定性
３６μｇの精製アミダーゼを含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、一定温度の水浴中で３０分間熱処理した。その後、５０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図６に示したように、熱処理温度と酵素活性との関係が求められた。精製酵素は６０℃まで安定であった。
【００５５】
（３）反応ｐＨ
２５０μｌの２００ｍＭの種々のｐＨのバッファーをエッペンドルフチューブにとり、３６μｇの精製アミダーゼを添加し、水を加えて全量を５００μｌにした。これを５０℃の水浴中で５分間保温し、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図７に示したように、反応ｐＨと酵素活性との関係が求められた。精製酵素はｐＨ５．５から１０の広いｐＨ範囲で高い活性を示した。
【００５６】
（４）基質特異性
１００ｍＭ濃度の各種アミド化合物を含む５００μｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）をエッペンドルフチューブにとり、５０℃の水浴中で５分間保温し、３６μｇ（２０μｌ）の精製アミダーゼを加え撹拌し、５０℃の水浴中で１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌの酸を生成する酵素量を１Ｕとした。その結果を表２に示した。ＨＭＢ−アミドに対する比活性は、メチオニンアミドに対する比活性の約１２倍であった。
【００５７】
【表２】
【００５８】
(5) 反応速度論的解析
基質として、メチオニンアミド、ＨＭＢ−アミド（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド）、又はクロトンアミドを用いて、反応速度論的解析を行った。種々の濃度のアミド化合物、一定量（０．５から１０μｇ）の精製アミダーゼ、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）からなる５００μｌの反応混合液を、５０℃の水浴中で１から１０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を添加することによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。その結果から、Lineweaver-Burkプロットを作成し、表３に示したように、ＫｍとＶｍａｘが求められた。ＨＭＢ−アミド基質のときのＶｍａｘは、メチオニンアミド基質のときのＶｍａｘの約１２倍であった。
【００５９】
【表３】
【００６０】
（６）アンモニアの影響
エッペンドルフチューブに、５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）、５０μｌの１Ｍ ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩、及びいろいろな量の２Ｍアンモニア（塩酸でｐＨを９．０に調整したもの）を入れ、イオン交換水を加えて全量を４９０μｌにした。これを３０、４０、又は５０℃の水浴中で５分間保温し、１０μｌ（１８μｇ）の精製アミダーゼを添加し、同じ温度の水浴中で３０分間反応させた。これに１００μｌの２Ｎ塩酸を加えることによって反応を停止させ、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた上清をＨＰＬＣ（イオン交換水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。１分間に１μｍｏｌのメチオニンを生成する酵素量を１Ｕとした。その結果、図８に示したように、アンモニア濃度と酵素活性（アンモニア無添加のときの比活性を１００％とした）の関係が求められた。アンモニアによる阻害は、反応温度が高くなると、わずかに増加した。しかしながら、５０℃で０．２Ｍアンモニア存在下でも、本アミダーゼは５７％の酵素活性を保持していた。
【実施例７】
【００６１】
[アミダーゼのN末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列の決定]
実施例５で得られた精製アミダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、エレクトロブロッティングによって、ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）メンブレン（イモビロン−ＰＳＱ；ミリポア）に、タンパク質バンドを移した。その後、ＰＶＤＦメンブレンを水で軽くすすぎ、ＣＢＢ染色液（０．１％クマジーブリリアントブルーＲ−２５０、４５％メタノール、１０％酢酸）中で５分間振盪した。これを脱色液１（４５％メタノール、７％酢酸）中で１５分間振盪し、水で３回すすぎ、脱色液２（９０％メタノール、７％酢酸）中で４０秒間振盪し、風乾した。５３ｋＤａのタンパク質バンドを切り取り、エドマン法によってＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列が得られた。
【００６２】
また、実施例５で得られた精製アミダーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後、ポリアクリルアミドゲルから５３ｋＤａのタンパク質バンドを切り出した。このゲル切片を用いて、リジルエンドペプチダーゼ消化処理し、生成したペプチドをＨＰＬＣによって分離した。これらのペプチドのいくつかについて、エドマン法によってＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列が得られた。
【実施例８】
【００６３】
[ゲノムＤＮＡの調製]
２５０ｍｌのＴＹ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び４０μｇ／ｍｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を２０００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに入れた。その培地にシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５を植菌し、５０℃で２日間振盪培養した。得られた培養液を遠心（５ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して集菌し、集菌した菌体を１００ｍｌのＴＥＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。ついで、その菌体に同じバッファーを加えてテフロンホモジェナイザーを用いて懸濁し、全量２０ｍｌの懸濁液を得た。
【００６４】
この懸濁液に４０ｍｇのリゾチームを溶かした２００μｌのＴＥＮバッファーを加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。さらに、２ｍｌの１０％ＳＤＳと１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した後、４４０μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、さらに１％ＳＤＳと０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加え、それを遠心チューブに移した。これに同容量のバッファー平衡化フェノール（フェノール結晶に約０．１％の８−ヒドロキシキノリンを加え、これに同容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］を加え撹拌し、フェノール結晶を溶解して静置した。上の水層をデカンテーションによって除き、下のフェノール層を０．２％β−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化した。以後、このフェノール層を「バッファー平衡化フェノール」という。）を加えて撹拌し、遠心（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、１／２容量のバッファー平衡化フェノールと１／２容量のイソアミルアルコール含有クロロホルム（４％イソアミルアルコールを含むクロロホルム）を加え撹拌し、遠心（同上）によって二層に分離した。上の水層を新しい遠心チューブに移し、同容量のイソアミルアルコール含有クロロホルムを加え撹拌し、遠心（同上）によって二層に分離した（以後、この一連の操作をフェノール／クロロホルム抽出と呼ぶことにする）。上の水層を新しい遠心チューブに移し、２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で撹拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍｌのＴＥＮバッファーに溶解し、１０００ｍｌのＴＥＮバッファーに対して２回透析した。透析後、２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを加え、３７℃で２時間保温した。これに２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１時間保温した後、５ｍｌのＴＥＮバッファーと２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った。水層に２倍容量のエタノールを加え、ガラス棒で撹拌することによって、不溶化するＤＮＡを巻き取った。このＤＮＡを５ｍｌのＴＥＮバッファーに溶解し、１０００ｍｌのＴＥＮバッファーに対して２回透析し、得られたゲノムＤＮＡ溶液を４℃で保存した。このＤＮＡ溶液のＡ２６０は０．２００であったことから、ＤＮＡ濃度は０．５００ｍｇ／ｍｌと求められた。
【実施例９】
【００６５】
[ＰＣＲによるアミダーゼ遺伝子の増幅]
実施例７で得られた配列番号３のアミダーゼの内部アミノ酸配列のうち、Leu-Gly-Ala-Trp-Ala-Val-Gln-Thrの配列に基づいて、配列番号５に示されるＰＣＲのセンスプライマーを合成した。また、配列番号４のアミダーゼの内部アミノ酸配列のうち、Lys-Val-Ala-Asn-Ala-Phe-Glu-Glnの配列（リジルエンドペプチダーゼ消化によって生じたペプチドであるので、Ｎ末端側にLysがあるものとした）に基づいて、配列番号６に示されるＰＣＲのアンチセンスプライマーを合成した。なお、上の２本のＰＣＲプライマーの設計において、コドンの３番目の塩基は、Ｇ又はＣ（Ｓ）とした。
【００６６】
氷冷した０．２ｍｌ容のＰＣＲ用チューブに、０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、１０μｌの１０倍濃度反応バッファー、８μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、４μｌのゲノムＤＮＡ（０．１μｇ／μｌ；実施例７で得られたゲノムＤＮＡ溶液を５倍希釈したもの）、１μｌの配列番号５に示されるセンスプライマー（１００μＭ）、１μｌの配列番号６に示されるアンチセンスプライマー（１００μＭ）、５μｌのジメチルスルホキシド、及び７０．５μｌの水を加えた。これをＰＣＲ装置にセットし、９４℃で５分間の処理によってＤＮＡを変性させた後、３０回の温度サイクル（９４℃で２０秒間の変性ステップ、５９℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び７２℃で１２０秒間の伸長反応ステップ）によってＤＮＡを増幅し、最後に７２℃で２分間の処理によって反応を完結させた。反応終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１３２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、ゲルからＤＮＡを抽出した。
【実施例１０】
【００６７】
[ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列決定]
実施例９で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、pGEM-T Easy Vector System（プロメガ）を用いて、次のようにしてクローニングした。エッペンドルフチューブに、２倍濃度ラピッドライゲーションバッファーを５μｌ、pGEM-T Easy Vectorを１μｌ（５０ｎｇ）、実施例９のＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを１μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを１μｌ（３Ｕ）、及び、水を２μｌ入れ、室温で１時間反応させた。この反応液を５μｌ取り出して、２００μｌの大腸菌JM103コンピテントセルに加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、８００μｌのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、及び１％ＮａＣｌ）を加えた後、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの、１００μｌを、選択寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、その選択寒天培地を３７℃で一晩保温した。
【００６８】
上記選択寒天培地上に現れた白色コロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。菌体を遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）によって集めた後、１０ｍｌのＴＥＮバッファーで洗浄し、次いで、２．５ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、５０ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて懸濁した。これに２．５ｍｇのリゾチームを溶かした２５０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、室温に１０分間置いた。次に、新しく調製した５ｍｌの溶液II（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）をその液に加えて良く撹拌した後、それを室温に１０分間置いた。次いで、その溶菌液に氷冷した３．７５ｍｌの溶液III（６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍｌの酢酸、及び２８．５ｍｌの水を混合したもの）を加え良く撹拌し、氷中に１０分間置いた。それを遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）することによって不溶物を除き、上清を別の遠心チューブに移した。その上清に、０．６倍容量のイソプロパノールを加え、室温に１０分間置いた。遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、２０℃）によって得られた沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、７５０μｌのＴＥバッファーを加えて溶かし、エッペンドルフチューブに移した。この溶液に氷冷した７５０μｌの５Ｍ ＬｉＣｌを加え、氷中に１０分間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって不溶物を除き、上清を別のエッペンドルフチューブに移して、同容量のイソプロパノールを加え、室温に１０分間置いた。次いで、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって得られた沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、１２５μｌのＴＥバッファーを加えて溶かした。この溶液に０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを加え、室温に３０分間置いた。これに１３％ＰＥＧ８０００を含む１２５μｌの１．６Ｍ ＮａＣｌを加えて良く撹拌し、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を２００μｌのＴＥバッファーに溶かし、フェノール／クロロホルム抽出を行い、５０μｌの１０Ｍ酢酸アンモニウムと５００μｌのエタノールを加え、室温に１０分間置き、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）によって沈殿を得た。この沈殿を氷冷した７０％エタノールでリンスし、２００μｌのＴＥバッファーに溶かした。
【００６９】
このようにして調製したプラスミドＤＮＡを用いて、挿入ＤＮＡ部分の塩基配列を、ジデオキシ法によって決定した。その結果、配列番号７に示した塩基配列が得られた。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）について、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のＦＡＳＴＡ（相同性検索ソフトウェア）によってホモロジー検索を行った結果、このアミノ酸配列は、種々の微生物由来のアミダーゼのアミノ酸配列と高いホモロジーがあることが分かった。最も高いホモロジーを示したものは、Rhodococcus rhodochrous J1由来のものであり、それは本願配列番号８のアミノ酸配列に対して６８．７％のホモロジーを示した。以上のことから、実施例９において、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは、アミダーゼ遺伝子の一部であると考えられた。
【実施例１１】
【００７０】
[ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのジゴキシゲニン標識]
実施例９で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにしてジゴキシゲニン標識した。１５μｌ（約３μｇ）のＰＣＲ増幅ＤＮＡをエッペンドルフチューブにとり、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷した。これに２μｌのヘキサヌクレオチド混合液、２μｌのｄＮＴＰラベリング混合液、及び１μｌのクレノウ酵素を加え、３７℃で一晩反応させた。これに２μｌの２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え反応を停止させ、これを−２０℃で凍結保存した。
【実施例１２】
【００７１】
[ゲノムＤＮＡの制限酵素消化とアミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの調製]
実施例８で得られたゲノムＤＮＡの５μｌ（２．５μｇ）をエッペンドルフチューブにとり、５μｌの１０倍濃度反応バッファー、５μｌ（５０Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）、及び３５μｌの水を加え、３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で２時間反応させた。これに１μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、１００μｌのエタノールを加え、氷中に１時間以上置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。これを氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、２０μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。このＤＮＡ溶液の５μｌを、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡサイズマーカーとして、ジゴキシゲニンで標識されたλファージＤＮＡのHind III消化物（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。電気泳動後のアガロースゲルを、１００ｍｌの変性溶液（０．５Ｎ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に浸し、１５分間ゆっくり振盪し、液を換えて、この操作をもう１回行った。次に、１００ｍｌのサザントランスファー用中和バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ７．５］、３Ｍ ＮａＣｌ）に浸し１５分間ゆっくり振盪し、液を換えて、この操作をもう１回行った。このようにして処理したアガロースゲルから、２０×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムバイオサイエンス）に、キャピラリー法によって、ＤＮＡを移した。その後、ナイロンメンブレンを風乾し、２枚の濾紙の間に挟んで、８０℃で２時間ベーキングし、ＤＮＡを固定した。
【００７２】
ジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡとのハイブリダイゼーション及び検出は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ＤＮＡ標識及び検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、次のようにして行った。上で得られたベーキングしたメンブレンを、ハイブリダイゼーションバッグに入れ、１００μｇ／ｍｌサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む６ｍｌの高濃度ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファー（７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー［ｐＨ７．０］、及び０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）を加え、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、液を捨て、５μｌのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（実施例１１で調製されたものを、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷したもの）を含む１ｍｌの高濃度ＳＤＳハイブリダイゼーションバッファーを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから取り出し、０．１％ＳＤＳを含む５０ｍｌの２×ＳＳＣを用い、室温で５分間２回洗浄した。続いて、０．１％ＳＤＳを含む５０ｍｌの０．５×ＳＳＣを用い、６８℃で１５分間２回洗浄した。このメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍマレイン酸；１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整したもの）で１分間リンスし、３０ｍｌのブロッキング溶液（１％ブロッキング試薬を含むマレイン酸バッファー）に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。次に、４μｌのアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を含む２０ｍｌのブロッキング溶液に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。その後、ナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍｌのマレイン酸バッファーで１５分間２回洗浄し、５０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ９．５］、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に２分間浸し平衡化した。このナイロンメンブレンを、新しく調製した発色基質溶液（２００μｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰストック溶液を含む１０ｍｌの検出バッファー）に浸し、暗下に１時間静置した。バンドの発色を確認した後、ナイロンメンブレンをＴＥバッファーで洗浄し、暗下で風乾した。実施例９で得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡフラグメントの大きさは、Sac I消化では６０１０ｂｐ、Kpn I消化では９８１０ｂｐ、Sma I消化では３７４０ｂｐ、及びBamH I消化では１６９０ｂｐであった。
【００７３】
実施例８で得られたゲノムＤＮＡの８０μｌ（４０μｇ）をエッペンドルフチューブにとり、４０μｌの１０倍濃度反応バッファー、４０μｌ（４００Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）、及び２４０μｌの水を加え、３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で２時間反応させた。これに８μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、８００μｌのエタノールを加え、氷中に１時間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。これを氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、１００μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。このＤＮＡ溶液の全量を、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡサイズマーカーとして、ジゴキシゲニン標識されたλファージＤＮＡのHind III消化物（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。泳動終了後、Sac I消化では６０１０ｂｐ、Kpn I消化では９８１０ｂｐ、Sma I消化では３７４０ｂｐ、及びBamH I消化では１６９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルをそれぞれ切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、切り出したそれぞれのゲルからＤＮＡを抽出した。
【実施例１３】
【００７４】
[アミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントのクローニング]
２．７μｇのプラスミドｐＵＣ１８をエッペンドルフチューブにとり、これに２０μｌの１０倍濃度反応バッファー、５μｌ（５０Ｕ）の制限酵素（Sac I、Kpn I、Sma I、又はBamH I）を添加し、水を加えて全量を２００μｌにした。これを３７℃（Sma Iの場合は３０℃）で１時間反応させ、６５℃で１５分間熱処理することによって制限酵素を失活させた。これに２７μｌの１０倍濃度ＤＰバッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．５］、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）、３０μｌ（３０Ｕ）のシュリンプアルカリホスファターゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、及び１３μｌの水を加え、３７℃で３０分間反応させ、６５℃で１５分間熱処理することによって酵素を失活させた。これに５．４μｌの５Ｍ ＮａＣｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、５４０μｌのエタノールを加え、氷中に１時間置いた後、遠心（１６ｋｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）によって沈殿を得た。この沈殿を、氷冷した７０％エタノールでリンスし、風乾した後、５０μｌのＴＥバッファーを加えて溶解した。
【００７５】
このようにして調製したクローニングベクターの１μｌと実施例１２で調製したＤＮＡフラグメントの５μｌを混合し、３μｌのLigation high（TOYOBO）を加えて、１６℃で１時間反応させた。このうちの５μｌを、１００μｌの大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）を加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、その寒天培地を３５℃で一晩保温した。
【００７６】
コロニーが出現した寒天培地を、４℃に３０分間以上置き冷却した。この寒天培地上に、ピンセットを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；アマシャムバイオサイエンス）をのせ、１分間経過後にはがし、コロニーに接していた面を上にして、変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に置いた。この状態で１５分間静置した後、ナイロンメンブレンを乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。次に、コロニーハイブリダイゼーション用中和バッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ７．５］、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に、このナイロンメンブレンを、コロニーに接していた面を上にして置いた。この状態で１５分間静置した後、ナイロンメンブレンを乾いた濾紙上に移し、余分な水分を吸い取った。その後、２×ＳＳＣ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ ＮａＣｌ）を浸した２枚の濾紙の上に、そのナイロンメンブレンを置いた。この状態で１０分間静置した後、そのナイロンメンブレンを乾いた濾紙上で風乾させた後、８０℃で２時間ベーキングすることによってＤＮＡをナイロンメンブレンに固定した。その後、このナイロンメンブレンを２×ＳＳＣに５分間浸し、次に、プレ洗浄液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浸し、５０℃で３０分間振盪した。ナイロンメンブレン上のセルデブリスを、プレ洗浄液を浸したキムワイプを用いてふき取った後、ナイロンメンブレンを２×ＳＳＣで２回洗浄した。
【００７７】
前述のナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに入れ、そこに５０μｇ／ｍｌサカナ精子ＤＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を含む１０ｍｌのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファー（５０ｍｌのホルムアミド［脱イオン化済み］、２５ｍｌの２０×ＳＳＣ、２０ｍｌの１０％ブロッキング試薬、１ｍｌの１０％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、０．２ｍｌの１０％ＳＤＳ、及び３．８ｍｌの水を混合したもの）を加えて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、このプレハイブリダイゼーション液を捨てた後、ハイブリダイゼーションバッグに１０μｌのジゴキシゲニン標識ＰＣＲ増幅ＤＮＡ（実施例１１で調製されたものを、沸騰水中で５分間熱変性させた後、氷水中で急冷したもの）を含む２ｍｌのホルムアミド含有標準ハイブリダイゼーションバッファーを加えて、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッグから取り出し、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用い、室温で５分間２回ナイロンメンブレンを洗浄した。続いて、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用い、６８℃で１５分間２回ナイロンメンブレンを洗浄した。このナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで１分間リンスした後、ブロッキング溶液に浸して３０分間ゆっくり振盪した。次に、このナイロンメンブレンを、１０μｌのアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を含む５０ｍｌのブロッキング溶液に浸し、３０分間ゆっくり振盪した。その後、このナイロンメンブレンを、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むマレイン酸バッファーで１５分間２回洗浄した後、検出バッファーに２分間浸して平衡化した。このナイロンメンブレンを、コロニーの面を上にしてシャーレに入れ、そこに新しく調製した１０ｍｌの発色基質溶液を加えて、暗下に数時間静置した。コロニーの発色を確認した後、このナイロンメンブレンをＴＥバッファーで洗浄し、暗下で風乾した。
【００７８】
上述のコロニーハイブリダイゼーションによって陽性と判断されたコロニーを、元の寒天培地から拾い上げ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を集め、実施例１０で用いた方法によってプラスミドを調製した。Sac Iを用いて得られたプラスミドをpASC2、Kpn Iを用いて得られたプラスミドをpAKP1、Sma Iを用いて得られたプラスミドをpASM3、及びBamH Iを用いて得られたプラスミドをpABM11と命名した。また、これらのプラスミドの挿入ＤＮＡの向きを変えたプラスミドを作製し、それぞれ、pASC2R、pAKP1R、pASM3R、及びpABM11Rと命名した。
【実施例１４】
【００７９】
[アミダーゼ遺伝子の塩基配列決定]
実施例１３で得られた各種プラスミドを種々の制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析することによって、挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図を作成した。その結果、図９に示したように、クローニングされた各ＤＮＡフラグメントの位置関係が明らかになった。すべてのＤＮＡフラグメントに共通して存在するＤＮＡ領域における制限酵素パターンと実施例１０で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列（配列番号７）から求められた制限酵素パターンを比較することによって、アミダーゼ遺伝子の位置と方向は、図９に示したようであると推定された。そこで、この近傍の塩基配列を決定した結果、配列番号９に示したアミダーゼ遺伝子の全塩基配列が求められた。この塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）について、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のＦＡＳＴＡ（相同性検索ソフトウェア）によってホモロジー検索を行った結果、最も高いホモロジーを有するものは、Rhodococcus rhodochrous J1由来のアミダーゼであり、このアミダーゼは本願配列番号１０のアミノ酸配列に対して６３．７％のホモロジーを示した。
【００８０】
なお、国際公開２００４／０８３４２３号パンフレットに記載されているシュードノカルディア・サーモフィラのアミダーゼのアミノ酸配列は、本願配列番号１０のアミノ酸配列に対して８５．６％のホモロジーを示した。ただし、図２に示したように、両アミノ酸配列はＮ末端側の約２０アミノ酸残基が一致しているものの、その後の約７０アミノ酸残基の広い領域にわたって、配列が異なっており、別の酵素であることが明らかになった。また、本願配列番号１０のアミノ酸配列中には、タンパク質レベルで決定されたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列が見出された（図２の網掛けを施したアミノ酸配列）。このことから、本願配列番号９の塩基配列が、シュードノカルディア・サーモフィラから精製されたアミダーゼタンパク質をコードするものであることが確認された。
【実施例１５】
【００８１】
[アミダーゼ遺伝子の大腸菌での発現]
上述のクローニングされたアミダーゼ遺伝子を発現ベクターに組み込むために、ＰＣＲのフォワードプライマー（配列番号１１）とリバースプライマー（配列番号１２）を合成した。ＰＣＲは次のようにして行った。氷冷した０．２ｍｌ容のＰＣＲ用チューブに、０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、５μｌの１０倍濃度反応バッファー、４μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、１．８ｎｇのプラスミドｐＡＳＭ３（実施例１３で得られたもの）、１０ｐｍｏｌの上のフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌの上のリバースプライマー及び２．５μｌのジメチルスルホキシドを入れ、水を加えて５０μｌにした。これをＰＣＲ装置にセットし、９４℃で５分間の処理によってＤＮＡを変性させた後、３０回の温度サイクル（９４℃で６０秒間の変性ステップ、４５℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び６８℃で１２０秒間の伸長反応ステップ）によってＤＮＡを増幅し、最後に６８℃で２分間の処理によって反応を完結させた。反応終了後、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲルを切り出し、QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて、切り出したゲルからＤＮＡを抽出した。
【００８２】
上述のＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、次のようにしてpGEM-T Vector（プロメガ）に組み込んだ。エッペンドルフチューブに、５μｌの２倍濃度ラピッドライゲーションバッファー、１μｌ（５０ｎｇ）のpGEM-T Vector、３μｌの上で得られたＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及び１μｌ（３Ｕ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、室温で１時間反応させた。この反応液の５μｌを、１００μｌの大腸菌JM109コンピテントセル（タカラバイオ）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）を加えた後、それを３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、選択寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、これを３７℃で一晩保温した。選択寒天培地上に現れた白色コロニーを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液から菌体を集め、実施例１０で用いた方法によってその菌体からプラスミドを調製した。このようにして得られたプラスミドをpGEM-fPTAMと命名した。
【００８３】
プラスミドpGEM-fPTAMをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー［ｐＨ８．０］、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１００倍希釈し、この１μｌを、１００μｌの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Novagen）に加え、氷中に３０分間置いた後、４２℃で４５秒間の熱処理をした。その後、氷冷し、９００μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間ゆっくり振盪した。このうちの１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、これを３７℃で一晩保温した。この寒天培地に出現したコロニーを、１００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコ中の５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で振盪培養した。Ａ６００が０．６になった時点で、終濃度０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加え、さらに３７℃で５時間振盪培養した。培養液を遠心（１６ｋｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して集菌し、得られた菌体を１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁した。
【００８４】
前述の菌体懸濁液の適当量をエッペンドルフチューブにとり、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を加えて全量を４８７．５μｌにし、５０℃の水浴中で５分間保温した。これに１２．５μｌの２０％ＤＬ−メチオニンアミド塩酸塩を添加し、５０℃の水浴中で２０分間反応させた。１００μｌの２Ｎ塩酸を加えることによって反応を停止させた後、それを遠心（１６ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ、２０℃）することによって得られた上清をＨＰＬＣ（水／アセトニトリル／ＴＦＡ＝９５０／５０／１）によって分析した。その結果、１ｇの湿菌体当たり２７８Ｕのアミダーゼ活性が得られた。それに対して、元のシュードノカルディア・サーモフィラ ＪＣＭ３０９５の湿菌体１ｇ当たりのアミダーゼ活性は、同じ条件で分析したとき、１３８Ｕであった。すなわち、アミダーゼ遺伝子を大腸菌で高発現させることによって、元の菌の約２倍のアミダーゼ活性を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
国際公開２００４／０８３４２３号パンフレットには、本発明と同じ微生物であるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のアミダーゼが記載されている。しかしながら、このアミダーゼは、構成酵素であるとされ、その酵素活性は、メチオニンアミドを基質としたとき、ＨＭＢ−アミド（２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド）よりも約２．５倍高いと記載されている。一方、本発明のアミダーゼは、同じくシュードノカルディア・サーモフィラ由来であるが、誘導酵素であり、その酵素活性は、前者の酵素とは逆に、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミド（ＨＭＢ−アミド）を基質としたとき、メチオニンアミドよりも約１２倍も高いことが明らかになった。したがって、本発明のアミダーゼは、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドからの２−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸（ＨＭＢＡ）の生産に有利である。
【００８６】
さらに、アミダーゼの遺伝子をクローニングして、塩基配列を決定した結果、両アミダーゼのアミノ酸配列は、Ｎ末端側の約２０アミノ酸残基は一致していたが、その後の約７０アミノ酸残基の広い範囲にわたって、配列が異なっており、別の酵素であることが明らかになった（図２）。
【００８７】
これまでに種々のアミダーゼが、いろいろな微生物において見出されているが、それらのアミダーゼは、アミドの加水分解で生じるアンモニアによって活性が強く阻害される（M.J.Woods et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 567:225-237）という致命的な問題があった。それに対して、本発明のアミダーゼは、アンモニアによって活性が阻害されにくいという性質をもっていることが明らかになった。したがって、本発明のアミダーゼは、アミドからカルボン酸を工業的に生産する場合等に非常に有利であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ｐＨ７．５での菌体反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は本発明のシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５菌体、○はコントロールとして用いたRhodococcus rhodochrous ＩＦＯ １５５６４菌体の場合である。
【図２】本発明のアミダーゼのアミノ酸配列（Nisso）と国際公開２００４／０８３４２３号パンフレット記載のアミダーゼのアミノ酸配列（Degussa）とを比較した図である。網掛けを施したアミノ酸配列は、タンパク質レベルで決定されたＮ末端アミノ酸配列又は内部アミノ酸配列である。
【図３】ｐＨ９．０での菌体反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は本発明のシュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５菌体、○はコントロールとして用いたRhodococcus rhodochrous ＩＦＯ １５５６４菌体の場合である。
【図４】アミダーゼの各精製段階での活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した図である。レーン１は細胞抽出液、レーン２は硫安塩析画分、レーン３はフェニルセファロース活性画分、レーン４はＤＥＡＥセファロース活性画分、レーン５はゲル濾過活性画分、及びレーンＭは分子質量マーカーである。
【図５】精製アミダーゼを用いた酵素反応における温度の影響を示す図である。
【図６】精製アミダーゼの熱安定性を示す図である。
【図７】精製アミダーゼを用いた酵素反応におけるｐＨの影響を示す図である。◇は酢酸ナトリウムバッファー、●はリン酸カリウムバッファー、△はＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、及び■は塩化アンモニウムバッファーを用いた場合である。
【図８】精製アミダーゼを用いた酵素反応におけるアンモニアの影響を示す図である。●は３０℃、▲は４０℃、及び■は５０℃の場合である。
【図９】アミダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの制限酵素地図である。pAKP1はKpn Iフラグメント、pASM3はSma Iフラグメント、pASC2RはSac Iフラグメント、及びpABM11はBamH Iフラグメントを含むプラスミドである。白抜き矢印はアミダーゼ遺伝子の位置と方向を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有することを特徴とするアミダーゼ。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項２】
シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）に由来することを特徴とする請求項１記載のアミダーゼ。
【請求項３】
下記（ｇ）又は（ｈ）に示すタンパク質。
（ｇ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｈ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（ｉ）又は（ｊ）に示すタンパク質。
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｊ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有することを特徴とする請求項３〜４のいずれか記載のタンパク質。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
【請求項６】
以下の（ｃ）〜（ｆ）のすべての性質を有することを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のタンパク質。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項７】
シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか記載のタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項９】
下記（ｋ）又は（ｌ）に示すアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｋ）配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｌ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１１】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するタンパク質であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
【請求項１２】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ｃ）〜（ｆ）のすべての性質を有するタンパク質であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項１３】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換微生物。
【請求項１６】
請求項１若しくは２記載のアミダーゼ又はその生産菌若しくはその処理物、あるいは、請求項３〜７のいずれか記載のタンパク質又は請求項１５記載の形質転換微生物若しくはその処理物を、アミドに作用させることを特徴とするカルボン酸の製造方法。
【請求項１７】
アミドがα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドであり、カルボン酸がα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸であることを特徴とする請求項１６記載のカルボン酸の製造方法。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のすべての性質を有することを特徴とするアミダーゼ。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項２】
シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila）に由来することを特徴とする請求項１記載のアミダーゼ。
【請求項３】
下記（ｇ）又は（ｈ）に示すタンパク質。
（ｇ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｈ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
下記（ｉ）又は（ｊ）に示すタンパク質。
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
（ｊ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の２４〜９５位のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有することを特徴とする請求項３〜４のいずれか記載のタンパク質。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
【請求項６】
以下の（ｃ）〜（ｆ）のすべての性質を有することを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載のタンパク質。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項７】
シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか記載のタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項９】
下記（ｋ）又は（ｌ）に示すアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｋ）配列番号９に示される塩基配列からなるアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｌ）配列番号９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１１】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有するタンパク質であることを特徴とする請求項９又は１０記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ａ）ｐＨ９．０の反応条件において、０．２Ｍアンモニア存在下でも、アンモニア非存在下の５０％以上のアミダーゼ活性を示す。
（ｂ）メチオニンアミドよりも、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチルアミドに対して、より高い比活性を示す。
【請求項１２】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、以下の（ｃ）〜（ｆ）のすべての性質を有するタンパク質であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での、みかけの分子質量が５３ｋＤａである。
（ｄ）活性の至適温度が６０から７０℃である。
（ｅ）中性付近のｐＨにおいて、６０℃以下の温度で安定である。
（ｆ）ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．０の広いｐＨ範囲で高い活性を示す。
【請求項１３】
アミダーゼ活性を有するタンパク質が、シュードノカルディア・サーモフィラに由来することを特徴とする請求項９〜１２のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか記載のアミダーゼ遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターが導入されたことを特徴とする形質転換微生物。
【請求項１６】
請求項１若しくは２記載のアミダーゼ又はその生産菌若しくはその処理物、あるいは、請求項３〜７のいずれか記載のタンパク質又は請求項１５記載の形質転換微生物若しくはその処理物を、アミドに作用させることを特徴とするカルボン酸の製造方法。
【請求項１７】
アミドがα−アミノ酸アミド又はα−ヒドロキシ酸アミドであり、カルボン酸がα−アミノ酸又はα−ヒドロキシ酸であることを特徴とする請求項１６記載のカルボン酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−３４０６３０（Ｐ２００６−３４０６３０Ａ）
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１６７５２４（Ｐ２００５−１６７５２４）
【出願日】平成１７年６月７日（２００５．６．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００４３０７）日本曹達株式会社 (434)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月７日（２００５．６．７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（０００００４３０７）日本曹達株式会社 (434)
【Ｆターム（参考）】
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