新規なウイルス増殖方法およびそのためのインターフェロン欠損培養基
【課題】新規なウイルス増殖方法およびそのための培養基を提供する。
【解決手段】IFN欠損培養基およびこうした非慣例的培養基でのウイルスの増殖方法。未成熟の孵化卵、好ましくは６〜９日齢の鶏卵の中でウイルスを増殖させる方法。限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、レスピラトリー・シンシチアルウイルス（RSV）ニューキャッスル病ウイルス（NDV）、小水疱性口内炎ウイルス（VSV）、及びパラインフルエンザウイルス（PIV）の、ワクチンおよび医薬製剤で使用するのに適したウイルスを増殖させるのに特に有利である。
【解決手段】IFN欠損培養基およびこうした非慣例的培養基でのウイルスの増殖方法。未成熟の孵化卵、好ましくは６〜９日齢の鶏卵の中でウイルスを増殖させる方法。限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、レスピラトリー・シンシチアルウイルス（RSV）ニューキャッスル病ウイルス（NDV）、小水疱性口内炎ウイルス（VSV）、及びパラインフルエンザウイルス（PIV）の、ワクチンおよび医薬製剤で使用するのに適したウイルスを増殖させるのに特に有利である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願に反映される研究は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）からの助成による援助を一部受けたものであり、政府は本発明における一定の権利を有するものである。
【０００２】
本出願は、それぞれの全体を参照により本明細書に組み入れる、1999年１月29日に出願された出願番号第60/117,683号、1998年11月18日に出願された出願番号第60/108,832号、及び1998年６月12日に出願された出願番号第60/089,103号の一部継続出願である。
【０００３】
１．序
本発明は、一般に、細胞性インターフェロン（IFN）応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化したマイナス鎖RNAウイルス、及びこうした弱毒化ウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。本発明はまた、こうした弱毒化ウイルスの選択、同定及び増殖のためのIFN-欠損システムの開発及び使用に関する。
【０００４】
特定の実施形態において、本発明はNSl遺伝子産物が細胞性IFN応答に拮抗する能力を低下または消失させるような改変をNSl遺伝子に有する弱毒化インフルエンザウイルスに関する。変異型ウイルスはin vivoで複製するが病原性の低下を示し、従ってウイルス生ワクチン及び医薬製剤における使用に適したものである。
【背景技術】
【０００５】
２．発明の背景
２．１ インフルエンザウイルス
包膜型(-)センスゲノムの一本鎖RNAを有するウイルスファミリーは、は、非セグメントゲノムを有する群（パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナ病ウイルス）、またはセグメントゲノムを有する群（オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科及びアレナウイルス科）に分類される。以下に詳細に記載し、本明細書の実施例において使用するオルトミクソウイルス科ファミリーには、インフルエンザウイルスのＡ、Ｂ及びＣ型ウイルス、並びにトゴト（Thogoto）及びドリ（Dhori）ウイルス及び感染性サケ貧血ウイルス（salmon anemia virus）が含まれる。
【０００６】
インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア（らせん状ヌクレオキャプシド）、及びマトリクスタンパク質（MT）が内側に並んだ外側のリポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザＡウイルスのセグメントゲノムは、１０個のポリペプチドをコードする線状で負の極性を有する一本鎖RNAの８分子（インフルエンザＣでは７個）から構成される。１０個のポリペプチドとしては、ヌクレオキャプシドを形成する核タンパク質（NP）及びRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1及びPA）、マトリクス膜タンパク質（M1、M2）、エンベロープを含む脂質から突き出た２種の表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）、非構造タンパク質（NS1）及び核輸出タンパク質（NEP）が含まれる。ゲノムの転写及び複製は核内で起こり、アセンブリーは原形質膜上の出芽を介して起こる。ウイルスは、混合感染の間に遺伝子の再配列することがあり得る。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質のシアリルオリゴ糖にHAを介して吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスの後、細胞のエンドソーム内でHA分子のコンフォーメーション変化が生じて膜融合が促進され、脱外被を引き起こす。ヌクレオキャプシドが核に移動し、そこでウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ウイルスのエンドヌクレアーゼが細胞の異種mRNAから５’キャップ末端を切断し、次いでこれがウイルスの転写酵素によるウイルスRNA鋳型の転写のためのプライマーとして働くという独特のメカニズムによって転写される。転写物は鋳型の末端から15から22塩基の部位で終わり、オリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）トラクトの添加のためのシグナルとして作用する。産生された８種のウイルスRNA分子のうち、６種がモノシストロン性メッセージであり、HA、NA、NPを示すタンパク質、及びウイルスのポリメラーゼタンパク質、PB2、PB1及びPAに直接翻訳される。他の２種の転写物はスプライシングを受け、それぞれ２種のmRNAとなり、異なるリーディングフレームで翻訳されてM1、M2、NS1及びNEPが産生される。すなわち、８種のウイルスRNAセグメントが１０個のタンパク質、９個の構造タンパク質及び１個の非構造タンパク質をコードしている。インフルエンザウイルスの遺伝子及びそのタンパク質産物の概要を以下の表１に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
インフルエンザＡウイルスゲノムは、負の極性を有する一本鎖RNAの８個のセグメントを含有し、１個の非構造タンパク質及び９個の構造タンパク質をコードしている。非構造タンパク質NS1はインフルエンザウイルス感染細胞中に多量に存在するが、ビリオンでは検出されなかった。NS1は感染初期に核で、またウイルス周期のより後期に細胞質で見られるリンタンパク質である（Kingら、1975、Virology 64:378）。NS遺伝子の温度感受性（ts）インフルエンザ変異体を用いた研究から、NS1タンパク質は、ウイルスが宿主細胞の遺伝子発現を阻害し、ウイルスタンパク質合成を阻害し得るメカニズムの転写及び転写後レギュレーターであることが示唆された。転写後プロセスをレギュレートする他の多くのタンパク質と同様に、NS1タンパク質は特定のRNA配列及び構造と相互作用する。NS1タンパク質は、vRNA、ポリ-Ａ、U6snRNA、ウイルスmRNAの５’非翻訳領域及びds RNA等の種々のRNA種に結合することが報告されている（Qiuら、1995、RNA 1:304; Qiuら、1994、J. Virol. 68:2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen Virol. 73:3325-9）。トランスフェクトした細胞におけるcDNAからのNS1タンパク質の発現は、いくつかの効果：mRNAの核−細胞質間輸送の阻害、プレmRNAのスプライシングの阻害、宿主mRNAポリアデニル化の阻害及びウイルスmRNAの翻訳の刺激、と関係していた（Fortesら, 1994, EMBO J. 13:704; Enamiら, 1994, J. Virol. 68:1432; de la Lunaら, 1995, J. Virol. 69:2427; Luら, 1994, Genes Dev. 8:1817; Parkら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 2B433; Nemeroffら, 1998, Mol. Cell, 1:991; Chenら, 1994 EMBO J. 18:2273-83）。
【００１０】
２．２ 弱毒化ウイルス
不活化ウイルスワクチンは、複製ができなくなるように、例えば熱処理またはホルマリン処理によってウイルス病原体を「殺す」ことによって調製する。不活化ワクチンは、長期間持続する免疫性を与えず、従って制限された防御を与えるものであるため、有用性が制限される。ウイルスワクチンを産生する別のアプローチには、弱毒化したウイルス生ワクチンの使用が含まれる。弱毒化ウイルスは複製能を有するが病原性はなく、従ってより長期間持続する免疫を与え、より大きな防御が得られる。しかしながら、弱毒化ウイルスを産生する伝統的な方法は、その多くが温度感受性である宿主変異体を単離する機会を含む。例えば、ウイルスは天然にない（unnatural）宿主で継代され、免疫原性はあるが、病原性はない子孫のウイルスが選択される。
【００１１】
ワクチンとしての目的のためにインフルエンザウイルスを単離して増殖させるための伝統的な培養基（substrate）は、孵化鶏卵である。インフルエンザウイルスは、典型的には10〜11日齢の卵において37℃で２〜４日間増殖させる。インフルエンザＡ及びＢウイルスのヒト一次単離体のほとんどは胚の羊膜嚢（amniotic sac）中で良く増殖し、２から３回の継代の後、ウイルスは、卵の外側から近づきやすい尿膜腔（allantoic cavity）の細胞中での生育に適するようになる（Murphy, B. R. 及びR. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses p.1397-1445, Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.）。
【００１２】
理論的には、ウイルスゲノムに特定の突然変異を慎重に入れることができるため、組み換えDNA技術及び遺伝子工学技術は弱毒化ウイルスを産生する優れたアプローチを提供し得る。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子の改変は知られておらず、また予測可能なものではない。一般に、組み換えDNA技術を使用してウイルスワクチンを操作しようとする試みのほとんどは、免疫応答に関与し、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等の組み換えウイルスベクターで発現する病原体のタンパク質サブユニットのみを含有するサブユニットワクチンの作製に向けられた。より近年では、組み換えDNA技術は、天然に見られるか、若しくは既知の宿主範囲変異体で見られる弱毒化ウイルスを模倣したヘルペスウイルス欠失変異体またはポリオウイルスを作製する試みで利用された。1990年まで、(-)鎖RNAウイルスは部位特異的な操作が全くできず、従って遺伝子操作することができなかった。
【００１３】
これまでに作製された弱毒化インフルエンザ生ウイルスは、複製する宿主におけるインターフェロン応答を抑制することができない可能性があった。従って、これらのウイルスは、免疫原性がありながら病原性がないために有益であったが、ワクチンを作成する目的のための伝統的な培養基中で増殖することは困難である。更に、弱毒化ウイルスが有する病原性特性は緩和であり、宿主が後のチャレンジに対抗するのに十分な免疫応答を開始できない場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kingら、1975、Virology 64:378
【非特許文献２】Qiuら、1995、RNA 1:304
【非特許文献３】Qiuら、1994、J. Virol. 68:2425
【非特許文献４】Hatada Fukuda 1992, J. Gen Virol. 73:3325-9
【非特許文献５】Fortesら, 1994, EMBO J. 13:704
【非特許文献６】Enamiら, 1994, J. Virol. 68:1432
【非特許文献７】de la Lunaら, 1995, J. Virol. 69:2427
【非特許文献８】Luら, 1994, Genes Dev. 8:1817
【非特許文献９】Parkら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 2B433
【非特許文献１０】Nemeroffら, 1998, Mol. Cell, 1:991
【非特許文献１１】Chenら, 1994 EMBO J. 18:2273-83
【非特許文献１２】Murphy, B. R. 及びR. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses p.1397-1445, Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
３．発明の概要
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化(-)鎖RNAウイルス、及びこうしたウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。IFN拮抗活性が損なわれた変異体ウイルスは弱毒化されている。すなわち、それらは感染性があり、in vivoで複製して準臨床的感染レベルを提供し得るものであり、かつ病原性を有しない。従って、ウイルス生ワクチンとしての理想的な候補である。更に、弱毒化ウイルスは強力なIFN応答を引き起こすことができ、これはその後の感染性疾患に対する防御を与え、及び／または抗腫瘍性応答を引き出すという、in vivoで他の生物学的な結果を有する。従って、弱毒化ウイルスは、他の感染性疾患、ハイリスク個体における癌、及び／またはIFN治療が可能な疾患の予防または治療のために、薬剤として使用することができる。
【００１６】
本発明に従って用いられる(-)鎖RNAウイルスは、セグメントウイルス及び非セグメントウイルスの双方を含む。好ましい実施形態としては、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、レスピラトリー・シンシチアルウイルス（respiratory syncytial virus, RSV）ニューキャッスル病ウイルス（NDV）、小水疱性口内炎ウイルス（VSV）、及びパラインフルエンザウイルス（PIV）が挙げられる。本発明において使用されるウイルスは、天然に生じる株、変異型もしくは変異体；突然変異誘発させたウイルス（例えば突然変異原への暴露、反復継代及び／若しくは非許容宿主における継代によって生成させたもの）；再配列体（reassortants）（セグメントウイルスゲノムの場合）；及び／または所望の表現型を有する、すなわち細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた遺伝子操作されたウイルス（例えば「逆遺伝学」技術を使用したもの）、から選択することができる。変異体または遺伝子操作されたウイルスは、IFN欠損システム対IFN感応システムにおける示差（differential）増殖に基づいて選択することができる。例えば、IFN欠損システムで増殖するが、IFN感応（competent）システムで増殖しないウイルス（またはIFN感応システムでの増殖がずっと少ないウイルス）を選択することができる。
【００１７】
選択された弱毒化ウイルスは、それ自体でワクチンまたは医薬製剤における活性成分として使用することができる。あるいはまた、弱毒化ウイルスは組み換えによって作製されるワクチンのベクターまたは「骨格」として使用することができる。この目的で、「逆遺伝学」技術を使用して突然変異を操作したり、または「親」株として機能する弱毒化ウイルス中に外来性エピトープを導入したりすることができる。この方法において、ワクチンを株の変異型、あるいはまた全く異なる感染性薬剤若しくは疾患の抗原に対する免疫感作のために設計することができる。例えば、弱毒化ウイルスを他の予め選択した株を中和するエピトープを発現するように操作することができる。あるいはまた、(-)鎖RNAウイルス以外のウイルスのエピトープを弱毒化変異体ウイルスの中に組み入れることができる（例えばHIVのgp160、gp120、またはgp41）。あるいはまた、非ウイルス性感染性病原体（例えば寄生虫、細菌、菌類）のエピトープをウイルス中に組み込むことができる。更にまた、例えば弱毒化ワクチン骨格の中に腫瘍抗原を組み込むことによって、癌ワクチンを調製することができる。
【００１８】
セグメントゲノムを有するRNAウイルスに関連する特定の実施形態において、再配列技術を用いて、弱毒化表現型を親のセグメントRNAウイルス株（天然の変異体、突然変異誘発したウイルス、または遺伝子操作したウイルス）から別のウイルス株（野生型ウイルス、天然の変異体、突然変異誘発したウイルス、または遺伝子操作したウイルス）に移すことができる。
【００１９】
宿主において強力なIFN応答を引き起こす弱毒化ウイルスを、他のウイルス感染、またはIFN治療が可能な癌等の疾患の予防または治療のための医薬製剤において使用することもできる。この点において、弱毒化ウイルスの屈性（tropism）を変えて、ウイルスを所望の標的器官、組織または細胞にin vivoまたはex vivoでターゲッティングさせることができる。このアプローチを用い、IFN応答を標的部位で局所的に誘導し、全身的なIFN治療による副作用を避けるか、最小化することができる。この目的で、弱毒化ウイルスを操作して、標的器官、組織または細胞の受容体に対して特異的なリガンドを発現させることができる。
【００２０】
本発明は、その一部が、野生型インフルエンザウイルスのNS1がIFNアンタゴニストとして機能する、すなわちNS1がウイルスに感染した宿主細胞のIFN介在型応答を阻害する、という本出願人の発見に基づいている。NS1活性が欠損したウイルス変異体は細胞性IFN応答の潜在的誘発剤であることが見出され、in vivoにおける弱毒化表現型を示した。すなわち、変異体ウイルスはin vivoで複製するが、病原性の効果は低下していた。本発明がいかに作用するかについてはいかなる理論または説明にも拘束されることを意図するものではないが、本発明のウイルスの弱毒化特性はおそらく強力な細胞性IFN応答を誘導する能力、及び宿主のIFN応答に拮抗する能力が損なわれたことによるものである。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスの有益な特性は、細胞性インターフェロン応答に対する効果のみに帰するものではないかも知れない。事実、NS1に関連する他の活性における変化が所望の弱毒化表現型に寄与し得る。
【００２１】
IFN拮抗活性が損なわれた変異体インフルエンザウイルスは、in vivoで複製して免疫学的サイトカイン応答を引き起こすのに十分な力価を産生することが示された。例えば、弱毒化インフルエンザウイルスによるワクチン接種により、その後野生型インフルエンザウイルスをチャレンジ接種した動物におけるウイルスの力価が低下した。弱毒化インフルエンザウイルスはまた、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を示した。弱毒化インフルエンザウイルスを予め感染させると、野生型インフルエンザウイルスのほかの株、及び孵化卵において重感染した他のウイルス（センダイウイルス等）の複製が阻害された。腫瘍細胞を注射した動物に弱毒化インフルエンザを接種すると、形成する病巣の数が減少した。インフルエンザウイルスはCTL（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導することが知られているため、弱毒化ウイルスは癌ワクチンとして非常に魅力ある候補である。
【００２２】
ワクチン製剤のためには、ウイルスのIFN拮抗活性を低下させるが消失させないような変異が好ましい。こうしたウイルスは、伝統的培養基及び非伝統的培養基の双方での増殖のために、また中間的な病原性のために選択することができる。特に、本出願人は、NS1のＣ末端切断型変異体が、６及び７日齢の孵化鶏卵等のIFN欠損培養基、並びに、全NS1遺伝子が欠損したインフルエンザウイルス変異体（本明細書において「ノックアウト」変異体ともいう）の増殖を許容しないインフルエンザウイルスの伝統的培養基である１０日齢の孵化鶏卵の尿膜において高力価に複製することを示した。しかしながら、NS1-Ｃ末端切断型変異体の複製は、１２日齢の孵化卵において低下する。このアプローチにより、IFN拮抗活性が変化したが消失しておらず、ワクチン調製に好適な培養基における増殖が可能な弱毒化(-)鎖RNA生ウイルスの作製及び同定がはじめて可能なものとなる。このアプローチにより、インターフェロン拮抗活性が変化するが消失しない突然変異を有するインフルエンザウイルスまたは他のウイルスのための効率的な選択・同定システムを初めて可能なものとなる。
【００２３】
本発明はまた、ワクチン作製のために現在使用されている伝統的なシステムで増殖できない弱毒化ウイルスを増殖させるためのIFN欠損システムの使用に関する。本明細書で使用する用語「IFN欠損システム」とは、例えばIFNを産生しないか、若しくは低レベルのIFNを産生する細胞、細胞系及び動物（マウス、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、ラット等）がIFNに対して応答しないか、若しくは低い効率で応答し、及び／またはIFNによって誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損しているシステムを意味する。この目的で、本出願人は、若い孵化卵、IFN欠損細胞系（VERO細胞またはSTAT1ノックアウト等の遺伝子操作した細胞系等）を含むがこれらに限定されない、使用可能な多くのIFN欠損システムを同定し、また設計した。あるいはまた、孵化卵または細胞系を、IFNシステムを阻害する化合物（薬剤、抗体、アンチセンス、リボザイム等を含む）で前処理することができる。更に別の実施形態は、IFNシステムが欠損した卵、例えばSTAT1陰性の鳥類、特にトランスジェニックニワトリ、アヒル若しくは七面鳥を含むがこれらに限定されない家禽類が産む卵の使用を含む。
【００２４】
４．図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】DelNS1ウイルスは卵における野生型インフルエンザＡウイルスの複製を阻害する。１０日齢の孵化鶏卵に図示したpfuのdelNS1ウイルスを接種した。８時間後、卵に１０３pfuのWSNウイルスを感染させた。37℃で２日間インキュベーションした後、尿液（allantoic fluid）を採取し、WSNウイルス力価をMDBK細胞におけるプラークアッセイによって決定した。結果は２個の卵の平均である。
【図２】delNS1ウイルスによる孵化卵における抗ウイルス応答の誘導を示す。１０日齢のニワトリ孵化卵にPBS（無処理）または２×１０４pfuのdelNS1ウイルス（delNS1処理）を接種した。８時間後、卵に１０３pfuのインフルエンザA/WSN/33(H1N1)ウイルス、インフルエンザA/PR8/34（H+N1）ウイルス、インフルエンザA/X-31（H3N2）ウイルス、インフルエンザB/Lee/40ウイルス、またはセンダイウイルスを感染させた。２日間のインキュベーション後、尿液を採取し、ウイルス力価を血球凝集反応アッセイによって決定した。結果は２個の卵の平均である。
【図３】CV1細胞を緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合したIRF-3を発現するプラスミドでトランスフェクトした。これにより、IRF-3の細胞内での局在が蛍光顕微鏡で決定できた。いくつかの場合には、NS1発現プラスミドをIRF-3発現プラスミドと図示した比率で同時トランスフェクトした。トランスフェクション24時間後の細胞に、PR8（WT）またはdelNS1ウイルスを図示するように高い感染多重度で感染させた。感染10時間後、IRF-3-GFPの局在について、蛍光顕微鏡で細胞を解析した。IRF-3の排他的な細胞質での局在（CYT）及び細胞質と核の双方での局在（Nuc+Cyt）を示す細胞のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
５．発明の詳細な説明
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化(-)鎖RNAウイルスの作製、選択及び同定、及びこうしたウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。
【００２７】
ウイルスはセグメントゲノムを有するものであっても、非セグメントゲノムを有するものであっても良く、天然に生じる株、変異型若しくは変異体；突然変異誘発させたウイルス（例えばUV照射、突然変異原への暴露、及び／若しくは継代によるもの）；再配列体（セグメントゲノムを有するウイルスの場合）；及び／または遺伝子操作されたウイルス、から選択することができる。例えば、変異体ウイルスは、自然変化、UV照射への暴露、化学突然変異原への暴露、非許容宿主における継代、再配列（すなわち所望の抗原を有する他の株と弱毒化セグメントウイルスとの同時感染によるもの）、及び／または遺伝子操作（例えば「逆遺伝学」を使用するもの）によって作製することができる。本発明における使用のために選択されるウイルスは防御的IFN拮抗活性を有しており、弱毒化されている。すなわち、感染性があってin vivoで複製できるが、低い力価を産生するのみであって、病原性のない準臨床的感染レベルに至る。こうした弱毒化ウイルスは生ワクチンの理想的な候補である。
【００２８】
好ましい態様において、本発明における使用のために選択される弱毒化ウイルスは、宿主における強力なIFN応答を誘導し得るものである。これは、ワクチンとして使用する場合に強い免疫応答の産生に寄与し、他のウイルス感染症、またはハイリスク個体における腫瘍形成、またはIFNで治療される他の疾患の予防及び／または治療のための薬剤として有用なウイルスを作製するほかの生物学的結果を有する特性である。
【００２９】
本発明は、インフルエンザウイルス変異体で研究した際に本出願人が行った多くの発見及び観察に一部分基づいている。しかしながら、その原理は他のセグメント及び非セグメント(-)鎖RNAウイルスに同様に適用し、推定することができる。他の(-)鎖RNAウイルスとしては、限定されるものではないが、パラミクソウイルス（センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜ、ニューキャッスル病ウイルス）、モルビリウイルス（morbillivirus）（麻疹ウイルス、犬ジステンパーウイルス及び牛疫ウイルス）、ニューモウイルス（pneumovirus）（レスピラトリー・シンシチアルウイルス及びウシレスピラトリーウイルス）、及びラブドウイルス（小水疱性口内炎ウイルス及び狂犬病ウイルス）が挙げられる。
【００３０】
第一に、IFN応答はin vivoでウイルス感染を含むために重要である。本出願人等は、IFN欠損マウス（STAT1-/-マウス）における野生型インフルエンザウイルスA/WSN/33の増殖が全器官感染に至ることを見出した。すなわち、ウイルス感染は、IFN応答を生じる野生型マウスのように、肺に限定されなかった（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Garcia-Sastreら, 1998, J. Virol. 72:8550）。第二に、本出願人等は、インフルエンザウイルスのNS1がIFNアンタゴニストとして機能することを確立した。本出願人等は、全NS1遺伝子を欠失したインフルエンザウイルス変異体（すなわちNS1「ノックアウト」）がIFN感応性宿主細胞において高力価まで増殖できず、IFN欠損宿主においてのみ増殖できることを発見した。NS1ノックアウトウイルスは弱毒表現型を示し（すなわちIFN欠損STAT-/-マウスで致死的であるが、野生型マウスではそうではない）、宿主細胞におけるIFN応答の潜在的誘導剤であることが見出された（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Garcia-Sastreら, 1998, Virology 252:324-330）。NS1ノックアウト変異体ウイルスで予め感染させると孵化卵に重感染させた他のウイルス（例えばセンダイ）及び野生型インフルエンザの力価が低下した。別の実験では、NS1ノックアウト変異体インフルエンザウイルスで感染させると、腫瘍細胞を接種した動物における病巣の形成が低下した。このように、NS1ノックアウトインフルエンザウイルスは興味深い生物学的性質を示した。しかしながら、NS1ノックアウト変異体ウイルスは、ワクチン産生のための伝統的なシステムにおいて増殖できなかった。この問題を克服するために、本出願人等は適度な収量の弱毒化ウイルスの産生を可能とするIFN欠損システムを使用し、開発した。
【００３１】
更に、本出願人等は、全遺伝子を欠失しているのではない、NS1の欠失変異体を設計した。驚くべきことに、これらのNS1変異体は「中間的な」表現型を示すことが見出された。このウイルスは、（より高い力価をあげるIFN欠損システムにおいてより増殖するが）インフルエンザウイルスを増殖させるために使用される伝統的宿主中で増殖できる。より重要なことは、欠失変異体はin vivoで弱毒化され、強力なIFN応答を誘導する。インフルエンザウイルスNS1末端切断型変異体によるワクチン接種によって、その後野生型ウイルスをチャレンジ接種した動物でのウイルス力価が低くなり、疾患に対する防御能が得られた。
【００３２】
本発明はまた、ワクチンの目的のためのウイルスの単離、同定及び増殖のために設計された培養基に関する。特に、インフルエンザウイルス変異体を効率的に増殖させるためのインターフェロン欠損培養基を記載する。本発明において、インターフェロン欠損培養基は、インターフェロンを産生する能力またはインターフェロンに応答する能力を欠くものである。本発明の培養基は、インターフェロン欠損増殖環境を必要とし得るいかなるウイルスの増殖のために使用しても良い。こうしたウイルスとしては、限定されるものではないが、パラミクソウイルス（センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜ、ニューキャッスル病ウイルス）、モルビリウイルス（麻疹ウイルス、犬ジステンパーウイルス及び牛疫ウイルス）、ニューモウイルス（レスピラトリー・シンシチアルウイルス及びウシレスピラトリーウイルス）、及びラブドウイルス（小水疱性口内炎ウイルス及び狂犬病ウイルス）が挙げられる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルスのヒトまたは動物のためのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。特に、弱毒化ウイルスは、限定するものではないが、株変異型、異なるウイルス若しくは他の感染性病原体（例えば細菌、寄生虫、菌類）、または腫瘍特異的抗原を含む、広範囲のウイルス及び／または抗原に対するワクチンとして使用することができる。別の実施形態において、ウイルスの複製及び腫瘍形成を阻害する弱毒化ウイルスは、感染（ウイルス性または非ウイルス性病原体）若しくは腫瘍形成の予防若しくは治療、またはIFNが治療として有益である疾患の治療のために使用することができる。ヒトまたは動物被検体に弱毒化生ウイルス製剤を導入して免疫応答または適当なサイトカイン応答を誘導するために、多くの方法を使用することができる。これらの中には、限定するものではないが、鼻内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下投与が含まれる。好ましい実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、鼻内に送達するために製剤化される。
【００３４】
５．１ IFN拮抗活性が変化した変異体の作製
IFN拮抗活性が低下した変異体ウイルスまたは株はいずれも、本発明に従って選択し、使用することができる。一実施形態において、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた天然に生じる変異体若しくは変異型、すなわち自然突然変異体を選択することができる。別の実施形態において、ウイルスを突然変異原、例えば紫外線照射または化学突然変異原に暴露したり、複数回の継代及び／または非許容宿主における継代によって、変異体ウイルスを作製することができる。示差増殖システムにおけるスクリーニングを使用して、IFN拮抗機能が損なわれた変異体を選択することができる。セグメントゲノムを有するウイルスにおいては、再配列によって（すなわち弱毒化ウイルスと所望の株の同時感染、及び双方の表現型を示す再配列体の選択によって）弱毒表現型を所望の抗原を有する別の株に移すことができる。
【００３５】
別の実施形態において、「逆遺伝学」的アプローチを使用して、突然変異をインフルエンザ、RSV、NDV、VSV及びPIV等の(-)鎖RNAウイルス中に組み入れることができる。この方法では、弱毒表現型を付与する天然または他の突然変異をワクチン株中に組み入れることができる。例えば、IFN拮抗活性に関係する遺伝子（例えばインフルエンザのNS1等）のコード領域の欠失、挿入または置換を操作することができる。IFN拮抗活性に関係する遺伝子の非コード領域における欠失、置換または挿入も考えることができる。この目的のために、IFN拮抗活性に関係する遺伝子の転写、複製、ポリアデニル化、及び／またはパッケージングに関与するシグナルにおける突然変異を操作することができる。例えば、インフルエンザにおいては、以下のような改変が含まれるが、これらに限定されるものではない。インフルエンザＡウイルス遺伝子の非コード領域のインフルエンザＢウイルス遺伝子の非コード領域による置換（Musterら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5177）、インフルエンザウイルス遺伝子の非コード領域における塩基対交換（Fodorら, 1998, J. Virol. 72:6283）、インフルエンザウイルス遺伝子のプロモーター領域における突然変異（Picconeら, 1993, Virus Res. 28:99; Liら, 1992, J. Virol. 66:4331）、ポリアデニル化に影響するインフルエンザウイルス遺伝子の５’末端におけるウリジン残基のストレッチにおける置換及び欠失（Luoら, 1991, J. Virol. 65:2861; Liら, J. Virol. 1994, 68:1245）。例えばプロモーターに対するこうした突然変異は、IFN拮抗活性に関係する遺伝の発現をダウンレギュレートできるだろう。IFN拮抗活性に関係する遺伝子の発現をレギュレートし得るウイルス遺伝子における突然変異も、本発明に従って使用できるウイルスの範囲内にある。
【００３６】
本発明はまた、変化したIFN拮抗活性またはIFN誘導性表現型に至るよりは、変化したウイルス機能及び弱毒表現型（例えばポリ(A)含有mRNAの核輸出阻害の変化、プレmRNAのスプライシング阻害の変化、dsRNAの封鎖（sequestering）によるPKRの活性化阻害の変化、ウイルスRNAの翻訳に対する効果の変化、及び宿主mRNAのポリアデニル化阻害の変化）に至り得るNS1遺伝子セグメントへの突然変異に関する（例えばKrug in Textbook of Influenza, Nicholsonら編, 1998, 82-92、及びこれに引用された参照文献を参照すること）。
【００３７】
逆遺伝学技術としては、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンを産生するために必要なシグナルのパッケージングのために必須である(-)鎖ウイルスRNAのコード領域を含む、合成組み換えウイルスRNAの調製が含まれる。組み換えRNAは組み換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いてin vitroで再構成して、細胞のトランスフェクションに使用できる組み換えリボ核タンパク質（RNP）を形成する。ウイルスポリメラーゼタンパク質がin vitroまたはin vivoでの合成RNAの転写の際に存在する場合には、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組み換えRNPは、感染性ウイルス粒子中に放出する（rescued）ことができる。上記の技術は、それぞれ参照によってその全体を本明細書に組み入れる、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号、1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号、1996年２月20日に公開されたヨーロッパ特許公開EP0702085A1号、米国特許出願No.09/152,845、1997年４月３日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032号、1996年11月７日に公開されたWO96/34625号、ヨーロッパ特許公開EP-A780475号、1999年１月21日に公開されたWO 99/02657号、1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号、1998年１月22日に公開されたWO 98/02530号、1999年４月１日に公開されたWO 99/15672号、1998年４月２日に公開されたWO 98/13501号、1997年２月20日に公開されたWO 97/06270号、及び1997年６月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
【００３８】
逆遺伝学アプローチによって作製された弱毒化ウイルスは、本明細書に記載のワクチン及び医薬製剤において使用することができる。逆遺伝学技術はまた、ワクチン作製のために重要な他のウイルス遺伝子の更なる突然変異の操作のために使用することができる。すなわち、有用なワクチン株変異型のエピトープを弱毒化ウイルス中に組み入れることができる。あるいはまた、他のウイルスまたは非ウイルス病原体由来の抗原を含む、完全に外来性のエピトープを弱毒株中に組み入れることができる。例えば、HIV（gp160、gp120、gp41）等の非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌若しくは菌類の抗原、または腫瘍抗原を、弱毒株中に組み入れることができる。あるいはまた、in vivoにおけるウイルスの向性（tropism）を変えるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化ウイルス中に組み入れることができる。
【００３９】
別の実施形態において、逆遺伝学技術及び再配列技術を組み合わせて使用して、セグメントRNAウイルス中に所望のエピトープを有する弱毒化ウイルスを操作することができる。例えば、（自然選択、突然変異誘発、または逆遺伝学技術によって作製された）弱毒化ウイルス、及び（自然選択、突然変異誘発、または逆遺伝学技術によって作製された）所望のワクチンエピトープを有する株を、セグメントゲノムの再配列を許容する宿主に同時感染させることができる。次いで、弱毒表現型及び所望のエピトープの双方を示す再配列体を選択することができる。
【００４０】
別の実施形態においては、突然変異させるべきウイルスはDNAウイルス（例えばワクシニア、アデノウイルス、バキュロウイルス）または(+)鎖RNAウイルス（例えばポリオウイルス）である。こうした場合、当分野において周知の組み換えDNA技術を使用することができる（例えば、それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Paolettiの米国特許第4,769,330号及びSmithの米国特許第4,215,051号を参照すること）。
【００４１】
本発明に従って、限定するものではないが、以下の表２に示すファミリーを含む、いかなるウイルスに対しても、遺伝子操作を行うことができる。
【００４２】
【表２】
使用した略号：ds＝二本鎖；ss＝一本鎖；包膜型＝宿主細胞膜由来の外部脂質二重膜を有するもの；(+)センスゲノム＝RNAウイルスの場合、リボソームで直接翻訳されるヌクレオチド配列から構成されるゲノム、＝DNAウイルスの場合、mRNAと同じヌクレオチド配列から構成されるゲノム；(-)センスゲノム＝(+)センス鎖に相補的なヌクレオチド配列から構成されるゲノム。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明はNS1遺伝子産物の欠失及び／または末端切断を有する、遺伝子操作されたインフルエンザウイルスに関する。インフルエンザＡ及びＢのNS1変異体が特に好ましい。一つのアプローチにおいては、NS1遺伝子産物のアミノ末端領域部分が保持され、NS1遺伝子産物のＣ末端領域部分が欠失している。特定の望ましい突然変異は、適当なコドンにおける核酸の挿入、欠失、または突然変異によって行うことができる。特に、末端切断型NS1タンパク質は、野生型NS1遺伝子産物の1-60のアミノ酸、1-70のアミノ酸、1-80のアミノ酸、1-90のアミノ酸（Ｎ末端のアミノ酸が１である）、及び好ましくは90個のアミノ酸を有し；1-100のアミノ酸、及び好ましくは99個のアミノ酸；1-110のアミノ酸；1-120のアミノ酸；または1-130のアミノ酸、及び好ましくは124個のアミノ酸を有する。
【００４４】
本発明はまた、NS1タンパク質の末端切断または改変によってNS1遺伝子産物が改変されて変異体ウイルスに以下の表現型：ウイルスが６〜７日齢の鶏卵等の非伝統的培養基において高力価まで増殖する能力、またはウイルスが宿主のインターフェロン応答を誘導する能力、を付与するような、遺伝子操作されたいずれのインフルエンザウイルスにも関する。インフルエンザＡウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、NS1末端切断を有するウイルスが含まれる。
【００４５】
本発明は、弱毒表現型を有する天然の変異体インフルエンザウイルスＡまたはＢ、並びに弱毒表現型に関係するような突然変異を含むように操作されたインフルエンザウイルス株の使用を含む。インフルエンザＡウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、124アミノ酸のNS1を有するウイルスが含まれる（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Nortonら, 1987, Virology 156:204-213）。インフルエンザＢウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、Ｎ末端由来の110アミノ酸を含むNS1末端切断変異体を有するウイルス（B/201）（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Nortonら, 1987, Virology 156:204-213）、及びＮ末端由来の89アミノ酸を含むNS1末端切断変異体を有するウイルス（B/AWBY-234）（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Tobitaら, 1990, Virology 174:314-19）が含まれる。本発明は、NS1/38、NS1/80、NS1/124に類似の天然の突然変異体（Egorovら, 1998, J. Virol. 72(8):6437-41）、並びに天然の突然変異体、A/Turkey/ORE/71、B/201またはB/AWBY-234の使用を包含する。本発明は遺伝子工学的に作製されたＡ型またはＢ型インフルエンザウイルスを含み、当該遺伝子工学的に作製されたウイルスのゲノムはNS1遺伝子内に、天然の突然変異体であるNS1/80、NS1/124、A/Turkey/ORE/71、B/201またはAWBY-234において見受けられるNS1変異に対応する変異を含む。ただし、本発明は以下のインフルエンザ突然変異体を天然にあるがままに含まない：A/Turkey/ORE/71、B/201およびAWBY-234。
【００４６】
弱毒化インフルエンザウイルスを、他のワクチン株の抗原を発現するように更に遺伝子操作することができる（例えば逆遺伝学または再配列を使用して）。あるいはまた、弱毒化インフルエンザウイルスを、遺伝子操作されたウイルスを用いた逆遺伝学または再配列を使用して、完全に外来性のエピトープ（例えば他の感染性病原体の抗原、腫瘍抗原、またはターゲッティング抗原）を発現するように操作することができる。NS RNAセグメントは８種のウイルスRNAの中で最も短いものであるため、NS RNAが他のウイルス遺伝子より長い異種配列の挿入に耐えることは可能である。更に、NS RNAセグメントは感染細胞における高レベルのタンパク質合成を指令するものであり、外来性抗原の挿入に理想的なセグメントとなることが示唆される。しかしながら、本発明に従って、インフルエンザウイルスの８個のセグメントのいずれも、異種配列の挿入に使用することができる。例えば、表面抗原提示が望まれる場合には、例えばHAまたはNA等の構造タンパク質をコードするセグメントを使用することができる。
【００４７】
5.2 宿主限定に基づく選択系
本発明は、天然の変異体、自然発生的変異体（すなわち、ウイルス増殖中に発生した変異体）、突然変異を起こさせた天然の変異体、再配列体（リアソータント(reassortants)）および／または遺伝子工学的に作られたウイルスのいずれから得られたものであろうと、所望の表現型を有するウイルス（すなわち、IFN アンタゴニスト活性を少ししかまたは全く有しないウイルス）を選択する方法を包含する。かかるウイルスはIFN 欠損宿主系対IFN 感応宿主系における増殖を比較する示差増殖アッセイにおいて最も良くスクリーニングされうる。IFN 欠損系対IFN 感応系においてより良好な増殖を示すウイルス、好ましくはIFN 感応系に比較してIFN 欠損系で少なくとも１log より力価が大きくなるまで増殖するウイルスが選択される。
【００４８】
あるいはまた、ウイルスはIFN アッセイ系例えばレポーター遺伝子発現がIFN応答性プロモーターにより制御されるものである転写ベースアッセイ系を用いてスクリーニングされうる。感染細胞対未感染細胞におけるレポーター遺伝子発現を測定して、IFN 応答を効率的に誘導するがしかしIFN 応答に対して拮抗しえないウイルスを同定することができる。しかしながら好ましい実施形態においては、示差増殖アッセイは所望される表現型を有するウイルスを選択するのに使用されるが、これは、用いられる宿主系（IFN 感応対IFN 欠損）は適切な選択圧を適用するからである。
【００４９】
例えば、（力価により測定して）ウイルスの増殖はIFN およびIFN 応答の構成成分を発現する種々の細胞、細胞系または動物モデル系対IFN またはIFN 応答の構成成分を欠く細胞、細胞系または動物モデル系において比較できる。この目的には、（IFN 欠損性である）VERO細胞としての細胞系におけるウイルスの増殖対( IFN 感応である)MDCK細胞におけるウイルスの増殖を比較できる。あるいはまた、IFN 欠損細胞系はIFN 系に欠けるよう品種改良または遺伝子工学的に操作された動物（例えばSTAT1-/-突然変異体マウス）から誘導および樹立できる。かかる細胞系におけるウイルスの増殖を、例えば野性型動物（例えば野性型マウス）に由来するIFN 感応細胞に比較して測定できる。さらにもう一つの実施形態においては、IFN 感応であって野性型ウイルスの増殖を支持することが知られている細胞系を操作してIFN 欠損となすこともできる（例えばSTAT1, IRF3, PKRなどをノックアウトすることによる）。細胞系におけるウイルスの増殖に関して当業界でよく知られた技術を用いることができる（例えば、下記実施例を参照されたい）。標準的なIFN 感応細胞系対IFN 欠損性の遺伝子操作細胞系におけるウイルスの増殖を比較できる。
【００５０】
動物系も使用できる。例えば、インフルエンザに関しては、若い、IFN 欠損性の孵化卵例えば約６〜約８日齢のものにおける増殖を、より年取った、IFN 感応卵例えば約10〜約12日齢のものにおける増殖と比較できる。この目的には、卵における感染および増殖に関して当業界で良く知られた技術を使用できる（例えば、下記実施例を参照されたい）。あるいはまた、IFN 欠損性STAT1-/-マウスにおける増殖をIFN 感応野性型マウスと比較することもできる。さらに他の代替例では、例えばSTAT1-/-トランスジェニック家禽により生産されたIFN欠損性の孵化卵における増殖を野性型家禽により生産されたIFN 感応卵における増殖と比較できる。
【００５１】
しかしながら、スクリーニング目的には、遺伝子操作された系の代わりに一過性IFN 欠損系を使用できる。例えば、宿主系を、IFN 生産および／またはIFN 応答の構成成分を阻害する化合物（例えば、薬物、IFN に対する抗体、IFN レセプターに対する抗体、PKR の阻害剤、アンチセンス分子およびリボザイム等）で処理することができる。ウイルスの増殖はIFN 感応な未処理対照対IFN 欠損性処理系において比較できる。例えば、IFN 感応である、より日齢の高い卵を、スクリーニング予定のウイルスでの感染に先立ちかかる薬物で予め処理することができる。増殖を同じ日齢の未処理対照卵で得られたそれと比較する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法は、IFN アンタゴニスト活性が破壊されたものである突然変異体ウイルスを、突然変異体ウイルスのIFN 欠損環境中での増殖能と比較してその突然変異体ウイルスがIFN 応答性環境中で増殖できないことにより同定するための簡単で容易なスクリーニングを提供するものである。本発明のスクリーニング方法はまた、突然変異体ウイルスの、IFN 応答性例えば10日齢の孵化卵またはMDCK細胞およびIFN 欠損性環境例えば６〜７日齢の孵化卵またはVero細胞の両方における増殖能を測定することにより、IFN 拮抗体活性が変更されてはいるが破壊されてはいない突然変異体ウイルスを同定するのにも使用できる。６〜７日齢の卵に比較して10日齢の卵において少なくとも１log 低い力価を示すインフルエンザウイルスはそれらのIFN 応答阻害能が損なわれていると見なされよう。もう一つの例では、10日齢の卵（これは中程度のIFN 応答に達する）に比較して12日齢の卵（これは高いIFN 応答に達する）で少なくとも１log 低い力価を示すインフルエンザウイルスはそれらのIFN 応答拮抗能が部分的に損なわれていると見なされ、魅力的なワクチン候補と考えられる。
【００５３】
本発明の選択方法はまた、IFN 応答を誘導するこれら突然変異体ウイルスの同定をも包含する。本発明の選択方法によれば、IFN 応答の誘導は、突然変異体ウイルスでの感染またはIFN 発現および／またはIFN 応答に関与するトランスアクチベーターの活性化に続いてIFN により誘導されたIFN 発現または標的遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現のレベルをアッセイすることにより測定できる。
【００５４】
本発明の選択系のさらにもう一つの実施形態においては、IFN 応答の誘導は試験突然変異体ウイルス例えばIRF-3 （これは２本鎖ＲＮＡに応答して燐酸化される）での感染に続くIFN 経路の構成分の燐酸化状態を測定することにより判定できる。I型IFN に応答して、Jak1キナーゼおよびTyK2キナーゼ、IFN レセプターのサブユニット、STAT1 およびSTAT2 が速やかにチロシン燐酸化される。従って、突然変異体ウイルスがIFN 応答を誘導するか否かを判定するためには、細胞例えば293 細胞を試験突然変異体ウイルスで感染させ、感染に続き細胞を溶解させる。Jak1キナーゼまたはTyK2キナーゼのようなIFN 経路構成成分が特異的なポリクローナル血清または抗体を使用して感染細胞溶解物から免疫沈殿され、そしてそのキナーゼのチロシン燐酸化状態が抗ホスホチロシン抗体を用いるイムノブロットアッセイにより判定される( 例えば、Krishnan et. al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305を参照されたい)。突然変異体ウイルスでの感染に続くIFN 経路の構成成分のいずれかの燐酸化状態が増強されていることはその突然変異体ウイルスによるIFN 応答の誘導を示していよう。
【００５５】
本発明のさらにもう一つの実施形態においては、本発明の選択系はウイルス感染例えばIRF3、STAT1 、STAT2 などに応答して誘導された特異的なＤＮＡ配列への結合能または転写因子の転位の測定をも包含する。特に、STAT1 およびSTAT2 はI型IFN に応答して、燐酸化され細胞質から核に転位される。特異的なＤＮＡ配列を結合する能力または転写因子の転位は当業者に知られた技術例えばエレクトロモビリティゲルシフトアッセイ、細胞染色、等により測定できる。
【００５６】
本発明の選択系のさらに他の実施形態においては、IFN 応答の誘導は試験突然変異体ウイルスでの感染に続きIFN 依存性転写活性化を測定することによって判定できる。この実施形態においては、IFN によって誘導されることが知られた遺伝子例えば、Mx, PKR, 2-5- オリゴアデニレートシンセターゼ、主要組織適合遺伝子複合体(MHC) クラスＩ等の発現が当業者に知られた技術（例えばノーザンブロット、ウエスタンブロット、ＰＣＲ等）により分析されうる。あるいはまた、ヒト胎児性腎細胞またはヒト骨肉腫細胞のような試験細胞を操作して、インターフェロン刺激された応答エレメント例えばISG-54K 遺伝子のIFN 刺激プロモーターの制御の下にルシフェラーゼレポーター遺伝子またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT) レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を一時的または構成的に発現させる（Bluyssen et. al., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402)。細胞を試験突然変異ウイルスで感染させ、そしてレポーター遺伝子の発現レベルを未感染細胞または野性型ウイルス感染細胞におけるそれと比較する。試験ウイルスでの感染に続くレポーター遺伝子の発現レベルの増大はその試験突然変異ウイルスがIFN 応答を誘導することを示していよう。
【００５７】
さらにもう一つの実施形態においては、本発明の選択系は試験突然変異ウイルスに感染させた細胞または卵からの抽出物がウイルス感染に対する防御活性を付与しうるかどうか測定することによるIFN 誘導の測定をも包含する。より詳細には、10日齢孵化鶏卵のグループを試験突然変異ウイルスまたは野性型ウイルスで感染させる。感染約15から20時間後、尿液を採取しそして例えばCEF 細胞のような組織培養細胞におけるVSV 感染に対する防御活性のある最大希釈度を測定することによりIFN 活性について試験する。
【００５８】
5.3 インターフェロン欠損増殖培養基におけるウイルスの増殖
本発明はウイルス増殖のための新規方法および培養基(substrate)に関するものである。本発明はIFN 欠損培養基およびかかる培養基中におけるウイルス増殖方法に関する。特に本発明は、それらがか弱い状態にあるゆえおよび尿膜腔が比較的小さいゆえにウイルスの増殖に通常は使用されないものである未成熟の孵化卵例えば10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵においてウイルスを増殖させる方法に関する。本発明によれば、未成熟の孵化卵とは自然の経過として10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵が包含される。本発明の未成熟の孵化卵はまた、例えばインキュベーション温度の変化、薬剤での処理、または卵の発達遅延をもたらしてIFN 系が10から12日齢卵に比較して充分には発達していないような任意の他の変更のような、成長条件を変更した結果として10日齢までかそれより小さい未成熟卵に人工的に擬した卵をも包含する。本発明は、セグメント化または非セグメント化ウイルスを含む（−）鎖ＲＮＡウイルス、例えばパラミクソウイルス（例えばニューカッスル病ウイルス、PIV）、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、オルトミクソウイルス（例えばＡ型およびＢ型インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス（bunyavirus）、アレナウイルス；（＋）鎖ＲＮＡウイルス（例えばレトロウイルス）；ＤＮＡウイルス（例えばポックスウイルス）を包含するがそれらに限定されない任意のウイルスをかかる非慣用の増殖培養基中で増殖させる方法に関する。一実施形態において、ウイルスはＣ型インフルエンザウイルスではない。
【００５９】
本発明の方法によれば、未成熟の孵化卵中で増殖しうるウイルスは天然に存在する株、変異体、突然変異体、突然変異させたウイルス、リアソータント(reassortants)および／または遺伝子工学的に作られたウイルスから選択される。本発明方法は、10日齢まで、６から９日齢の卵中で、好ましくは適切な増殖条件を用いてウイルスを増殖させ（例えば、下記６節に示される増殖条件を参照されたい）そして子孫ウイルスを回収することを包含する。未成熟の孵化卵好ましくは６から９日齢の卵中でのウイルスの増殖を包含する本発明方法は、ワクチン製剤に使用するのに好適なウイルスを増殖させるのに特に魅力的である。
【００６０】
本発明はまた、IFN アンタゴニスト活性が変更された天然に存在するウイルスまたは遺伝子操作された突然変異体ウイルスの増殖および単離のための方法およびIFN 欠損培養基をも包含する。弱毒化された突然変異体ウイルスの増殖を支持するのに使用できるIFN 欠損培養基には、それらに限定されるものではないが、IFN 欠損性の天然に存在する細胞、細胞系、動物または孵化卵例えばベロ(Vero)細胞、若い孵化卵；IFN 欠損であるように操作された組換え細胞または細胞系例えばSTAT1 ノックアウトマウス由来のIFN 欠損細胞系または他の同様に遺伝子操作されたトランスジェニック動物；IFN 欠損性の鳥特にIFN 欠損性であるように品種改良された群れまたはトランスジェニック鳥類（例えばSTAT1 ノックアウト）を含む家禽（例えば鶏、アヒル、七面鳥）から得られた孵化卵が包含される。あるいはまた、宿主系、細胞、細胞系、卵または動物はまた、IFN 系のインヒビターをコードするトランスジーンを発現するように遺伝子操作することもでき、例えばＤＮＡ結合ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、IFN 産生インヒビター、IFN シグナル伝達インヒビターおよび／またはIFN により誘導される抗ウイルス遺伝子のインヒビターを欠くSTAT1 のような優性陰性（dominant-negative）突然変異体である。IFN 欠損性であるように品種改良されたかまたは遺伝子操作された動物は幾分か免疫妥協性であろうしそして制御された無疾病環境中に保たれねばならないことは認識されるべきである。従って、交配中のめんどり、アヒル、七面鳥等の群れのようなトランスジェニックIFN 欠損性動物を感染原因物に曝す危険を制限するために（食餌性抗生物質の使用を含む）適切な手段がとられねばならない。あるいはまた、宿主系例えば細胞、細胞系、卵または動物を、IFN 産生および／またはIFN 経路を阻害する化合物、例えば薬物、抗体、アンチセンス分子、STAT1 遺伝子を標的とするリボザイム分子、および／またはIFN により誘導された抗ウイルス遺伝子で処理することもできる。一実施形態において、インターフェロン欠損培養基はVero細胞でもSTAT1（−）細胞系でもない。
【００６１】
本発明によれば、未成熟孵化鶏卵とは、自然の経過として10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵；および例えばインキュベーション温度の変化、薬剤での処理、または卵の発達遅延をもたらしてその卵のIFN 系が10から12日齢卵に比較して完全には発達していないような任意の他の変更のような、成長条件を変更した結果として10日齢までかそれより小さい未成熟卵に人工的に擬した卵を包含する。
【００６２】
5.3.1 天然のIFN 欠損培養基
一つの実施形態においては、本発明はまだIFN 系を発達させていない未成熟の孵化卵のような非慣用的培養基中で天然に存在するウイルスおよび遺伝子操作した突然変異体ウイルスを増殖させることに関する。未成熟の孵化卵はそれらがか弱い状態にあるゆえおよび尿膜体積が比較的小さいゆえにウイルスの増殖には通常は使用されない。本発明は突然変異体ウイルスを10日齢より小さい孵化卵中で、好ましくは突然変異体ウイルスを８日齢の孵化卵中で、そして最も好ましくは６〜８日齢卵中で増殖させることを包含する。
【００６３】
本発明は自然にはIFN 経路を有しないかまたはIFN 欠損性経路を有するかまたはIFN 系に欠陥のある（例えば野性型細胞に比較してIFN 発現レベルが低い）細胞および細胞系においてIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスを増殖させそして単離する方法をも包含する。特に好ましい実施形態においては、本発明はIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスをVero細胞中で増殖させる方法に関する。
【００６４】
5.3.2 遺伝子操作されたIFN 欠損培養基
本発明はIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスを遺伝子操作されたIFN 欠損培養基中で増殖および単離する方法に関する。本発明は、IFN 欠損卵を生むであろうIFN 系にとって必須である遺伝子例えばSTAT1 が突然変異されたトランスジェニック鳥類を包含する。本発明はさらに、優性陰性の転写因子を発現する鳥類トランスジェニック、例えばＤＮＡ結合ドメイン、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、IFN 産生インヒビター、IFN シグナル伝達インヒビター、およびIFN に応答して誘導される抗ウイルス遺伝子のインヒビターを欠くSTAT1 、をも包含する。IFN 欠損性トランスジェニック鳥類からの卵を使用する利点は、それらのサイズがより大きいゆえにより安定でより大きい容量を有する慣用の10日齢卵をウイルスの増殖に使用できることである。さらにもう一つの実施形態は、細胞系をIFN 欠損性であるように遺伝子操作できることである。本発明は、IFN 合成、IFN 経路にとって必須である遺伝子、および／またはIFN により誘導された抗ウイルス遺伝子（類）が突然変異されている細胞系、例えばSTAT1 、をも包含するものである。
【００６５】
本発明は組換え細胞系または動物、特にIFN 経路にとって必須である遺伝子の１つまたはそれ以上、例えばインターフェロンレセプター、STAT1 などが破壊されている、すなわち「ノックアウト」である鳥類を提供するものである。組換え動物はいずれの動物でもよいが、好ましい実施形態では鳥類例えばニワトリ、七面鳥、めんどり、アヒル、等である。（例えば、鳥類トランスジェニックの生産に関する総説に関しては、Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, et. al., 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol. Immunol 212: 195-206;および Shuman, 1991, Experientia 47: 897を参照されたい。これらのそれぞれはそのすべてがここに参考文献としてとりこまれる）。かかる細胞系または動物はその細胞または動物の染色体上の遺伝子の破壊に関する当業界で知られた任意の方法により生成させることができる。かかる技術には、それらに限定されるものではないが、生殖核マイクロインジェクション(Hoppe& Wagner, 1989, U.S. Pat. No.4,873,191) 、生殖系へのレトロウイルス仲介遺伝子トランスファー(Van der Putten et. al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.., USA 82: 6148-6152)、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング(Thompson et. al., 1989, Cell 56: 313)、胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803)、および精子仲介遺伝子トランスファー(Lavitrano et. al., 1989, Cell 57: 717) 等が包含される。かかる技術の総説に関しては、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171（これはそのすべてがここに参考文献として取り込まれる）を参照されたい。
【００６６】
特に、STAT1 ノックアウト動物はその染色体中のSTAT1 遺伝子と（好ましくは異種配列例えば抗生物質耐性遺伝子の挿入により）生物学的に不活性とされた外因性STAT1 遺伝子との間の相同性組換えを促進することにより生産できる。マウスゲノム中の遺伝子を破壊させる相同性組換え方法は、例えばCapecchi (1989, Science 244:1288) およびMansour ら(1988, Nature 336:348-352)に記載されている。
【００６７】
簡単に言うと、STAT1 ゲノムクローンの全てまたはその一部分をノックアウト細胞または動物と同じ種からのゲノムＤＮＡから単離する。STAT1 ゲノムクローンはゲノムクローンの単離に関して当業界で知られた任意の方法により単離できる（例えば、Meraz ら、1996, Cell 84: 431-442; Durbinら、1996, Cell 84: 443-450参照、およびここに引用されている文献類に記載されている配列のようなSTAT1 配列に由来するプローブを用いてゲノムライブラリーをプローブすることによる）。ゲノムクローンがひとたび単離されると、そのクローンの全てまたはその一部分を組換えベクター中に導入する。ベクター中に導入されたクローンの一部分がSTAT1 遺伝子のエキソンの少なくとも一部分、すなわちSTAT1 タンパク質コード配列、を含有するのが好ましい。STAT1 配列に対して相同性ではない配列、好ましくは陽性の選択マーカー例えば抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子を次にSTAT1 遺伝子エキソン中に導入する。選択マーカーは好ましくはプロモーター、より好ましくは構成性プロモーターに作動可能に連結される。非相同性配列はSTAT1 コード配列のSTAT1 活性を破壊させるであろう任意の場所、例えば点突然変異または他の突然変異がSTAT1 タンパク質機能を不活性化することが証明されている位置に導入される。例えば、それらに限定されるわけではないが、キナーゼドメインの全部または一部分を含有するSTAT1 タンパク質の一部分をコードする配列（例えばキナーゼドメインの少なくとも50, 100, 150, 200 または 250アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）中に非相同性配列を挿入することができる。
【００６８】
陽性の選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子(neo遺伝子) またはハイグロマイシン耐性遺伝子(hygro遺伝子)が好ましい。プロモーターは当業界で知られた任意のプロモーターであることができる。例をあげれば、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼ(PGK) プロモーター(Adra et. al., 1987, Gene 60: 65-74)、PolII プロモーター(Soriano et. al., 1991, Cell 64: 693-701) 、または胚由来幹細胞中での発現用に設計された合成プロモーターであるMC1 プロモーター(Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512) であることができる。抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーの使用により、ターゲティングするベクターを取り込んだ細胞の選択が可能となる（例えば、neo 遺伝子産物の発現によりG418に対する耐性が付与され、そしてhygro 遺伝子産物の発現によりハイグロマイシンに対する耐性が付与される）。
【００６９】
好ましい実施形態においては非相同性と反対に、ベクターの相同組換えのための逆選択工程用の負に選択可能なマーカーがSTAT1 ゲノムクローン挿入物の外側に挿入される。例えば、かかる陰性の選択マーカーはHSV チミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)であり、その発現により細胞がガンシクロビル(ganciclovir) に対して感受性となる。陰性の選択マーカーは、それらに限定されるわけではないがPGK プロモーター、PolII プロモーターまたは MC1プロモーターのようなプロモーターの制御の下にあるのが好ましい。
【００７０】
相同組換えが起こると、STAT1 遺伝子に対して相同性であるベクターの一部分、ならびにSTAT1 遺伝子配列内の非相同性インサートが染色体中のSTAT1 遺伝子中に取り込まれ、そしてベクターの残りは失われる。従って、陰性の選択マーカーはSTAT1 遺伝子と相同性である領域の外側にあるゆえ、相同組換えが起こった細胞（またはそれらの子孫）は負に選択可能なマーカーを含有しないであろう。例えば、もし陰性の選択マーカーがHSV-tk遺伝子である場合は、相同組換えが起こった細胞はチミジンキナーゼを発現せずそしてガンシクロビルへの露出を生き延びるであろう。この操作により、非相同組換え（この場合陰性の選択マーカーもSTAT1 配列および陽性の選択マーカーと共にゲノム中に取り込まれる可能性がある）に比較して相同組換えが起こった細胞の選択が可能となる。従って、非相同組換えが起こった細胞はチミジンキナーゼを発現する可能性が最も高くそしてガンシクロビルに対して感受性であろう。
【００７１】
ひとたびターゲティングベクターが調製されると、ターゲティングベクター中に存在する特有の部位に対する制限酵素を用いてベクターを直線状となし、そしてこの直線状となしたベクターを当業界で知られた任意の方法例えばエレクトロポレーションにより、胚性幹(ES)細胞中に導入する(Gossler et. al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) 。もしターゲティングベクターが陽性の選択マーカーおよび陰性の逆選択マーカーを包含する場合は、相同組換えが起こったES細胞は選択培地中でのインキュベーションにより選択できる。例えば、選択マーカーがneo 耐性遺伝子およびHSV-tk遺伝子である場合、細胞をG418（例えば約300 μg/ml）およびガンシクロビル（例えば、約２μM）に露出させる。
【００７２】
遺伝子分類に関して当業界で知られた任意の技術、例えばそれらに限定されるわけではないが、サザンブロット分析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ES細胞のゲノム中のSTAT1 遺伝子中に破壊したSTAT1 配列が相同的に組換えられていることを確認できる。STAT1 ゲノムクローンの制限地図が知られておりそしてSTAT1 コード配列の配列が知られているので（Meraz et. al., 1996, Cell 84: 431; Durbin et. al., 1996, Cell 84: 443-450、これらに引用されている全ての参考文献を参照されたい。）、個々の制限フラグメントまたは破壊および非破壊対立遺伝子の両方からのＤＮＡから生成されたPCR 増幅産物の寸法を測定できる。従って、制限フラグメントまたはPCR 産物（そのサイズは破壊および非破壊STAT1 遺伝子の間で相違する）をアッセイすることにより、相同組換えが起こってSTAT1 遺伝子を破壊したか否か判定できる。
【００７３】
破壊したSTAT1 遺伝子座を有するES細胞は次にマイクロインジェクションにより胚盤胞中に導入でき、そして次にこの胚盤胞をルーチン技術を用いて偽妊娠（仮親）マウスの子宮中に移植することができる。移植された胚盤胞から発育した動物は破壊した対立遺伝子に関するキメラである。キメラのオスはメスと交配でき、そしてこの交配は対立遺伝子の生殖系遺伝がある特定の皮膚色の遺伝に結びつくように設計することができる。この対立遺伝子の生殖系遺伝は、前記したように、組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロッティングまたはPCR 分析により確認できる。
【００７４】
5.3.3 一過性IFN欠損培養基
前記細胞、細胞系、動物または卵を、IFN系を阻害する化合物で前処理することができる。本発明に従えば、IFNの合成、またはIFN系の成分の活性もしくは発現を阻害する化合物を用いて、宿主を前処理することができる。そのような化合物は、例えば、IFNの合成、またIFN、IFN受容体、IFNシグナル伝達経路中の他の標的の活性を阻害する化合物、またはIFNにより誘導された抗ウイルス遺伝子の活性を阻害する化合物である。本発明に従って用いることができる化合物の例としては、限定されるものではないが、核酸分子、抗体、ペプチド、IFN受容体のアンタゴニスト、STAT1経路の阻害剤、PKRの阻害剤などが挙げられる。本発明に従えば、核酸分子とはSTAT1などのIFN系の必須成分をコードする遺伝子を標的とするアンチセンス分子、リボザイムおよび三重らせん分子を含む。核酸分子はまた、IFN系の成分の優性ネガティブ変異体をコードするヌクレオチドをも包含する。例えば、ウイルス変異体に感染させる前に、IFN受容体のトランケートされたシグナリング不能な変異体をコードするDNAで前記細胞をトランスフェクトすることができる。
【００７５】
IFN経路を阻害するために本発明に従って用いることができる優性ネガティブ変異体としては、Jak1、Tyk2のキナーゼ欠損型、またはDNA結合ドメインを欠損した転写因子STAT1およびSTAT2が挙げられる(例えば、Krishnanら、1997、Eur. J. Biochem. 247:298-305を参照されたい)。
【００７６】
5.4 ワクチン製剤
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれている、弱毒(−)鎖RNAウイルスおよび適当な賦形剤を含むワクチン製剤を包含する。該ワクチン製剤に用いられるウイルスは、天然の突然変異体もしくは変異体、突然変異させたウイルスまたは遺伝子工学的に操作したウイルスから選択することができる。セグメント化RNAウイルスの弱毒株を、再集合技術により、または逆遺伝学的手法と再集合技術の組み合わせにより作製することもできる。天然の変異体としては、自然界から単離されたウイルスならびにウイルスの増殖の間に自然発生的に生じた変異体が挙げられるが、これらは細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれている。該弱毒ウイルス自体を、該ワクチン製剤中の活性成分として用いることもできる。あるいは、該弱毒ウイルスを、組換え製造されたワクチンのベクターまたは「骨格」として用いることができる。この目的のために、逆遺伝学的手法などの組換え技術(または、セグメント化ウイルスのためには、逆遺伝学的手法と再集合技術の組み合わせ)を用いて、突然変異を遺伝子工学的に作製したり、または外来抗原を弱毒ウイルスに導入してワクチン製剤に用いることができる。このようにして、株変異体あるいは完全に別の感染性因子もしくは疾患の抗原に対する免疫感作用にワクチンを設計することができる。
【００７７】
実際には、任意の異種遺伝子配列を本発明のウイルス中へ構築してワクチンに用いることができる。好ましくは、種々のどのような病原体に対しても防御免疫応答を誘導するものであるエピトープ、または中和抗体に結合する抗原を、ウイルスにより、またはその一部として発現させる。例えば、ワクチンに用いるために本発明のウイルス中へ構築することができる異種遺伝子配列としては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、gp120などのヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE)、ポリオウイルスのVP1、細菌および寄生虫などの非ウイルス性病原体の抗原決定基がある。別の実施形態においては、免疫グロブリン遺伝子の全部または一部を発現させることができる。例えば、かかるエピトープを模倣した抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のウイルス中へ構築することができる。さらに別の実施形態においては、腫瘍関連抗原を発現させることができる。
【００７８】
生の組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンを製剤化することができる。生ワクチンが好ましい。何故なら、宿主における増殖は、自然の感染において生ずるのと同様の種類および量の延長された刺激をもたらし、従って実質的な長期間持続する免疫をもたらすからである。かかる生の組換えウイルスワクチン製剤の製造は、細胞培養またはニワトリ胚の尿膜におけるウイルスの増殖およびその後の精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
【００７９】
ワクチン製剤は、NS1または類似遺伝子中に突然変異を有する、遺伝子工学的に作製された(−)鎖RNAウイルス（例えば、限定されるものではないが、下記の実施例に記載されるトランケートされたNS1インフルエンザ変異体）を含んでもよい。それらは、A型インフルエンザのA/turkey/Ore/71天然変異体、またはB型インフルエンザの天然変異体であるB/201およびB/AWBY-234などの天然変異体を用いて製剤化することもできる。生ウイルスワクチンとして製剤化した場合、用量当たり約104 pfu〜約5x106 pfuの範囲を用いるべきである。
【００８０】
様々な方法を用いて上記のワクチン製剤を導入することができる。これらの方法としては、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンを設計する対象の病原体の自然感染経路を通ずるか、または親弱毒ウイルスの自然感染経路を通じてウイルスワクチン製剤を導入するのが好ましい。生のインフルエンザウイルスワクチン調製物を用いる場合、インフルエンザウイルスの自然感染経路を通じて該製剤を導入するのが好ましい。大量の分泌および細胞性免疫応答を誘導するインフルエンザウイルスの能力を有利に利用することができる。例えば、インフルエンザウイルスによる気道感染は、泌尿器系などにおける強力な分泌性免疫応答と共に、特定の疾患を引き起こす因子に対する付随性防御を誘導し得る。
【００８１】
変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、一回投与することができる。あるいは、変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、2〜6ヶ月の投与間隔で2回または3回投与することができる。あるいは、変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに必要な回数だけ投与することができる。
【００８２】
5.5 医薬組成物
本発明は、抗ウイルス剤もしくは抗腫瘍剤またはIFN感受性疾患に対する薬剤として用いられる変化したIFNアンタゴニスト活性を有する変異体ウイルスを含む医薬組成物を包含する。該医薬組成物は、抗ウイルス性予防薬としての有用性を有し、感染の危険のある個体またはウイルスに曝露されることが予想される個体に投与することができる。例えば、子供が、感冒に罹った数人の級友に曝される学校から家に帰ってくるという事象では、親は、本発明の抗ウイルス性医薬組成物を、自分自身、その子供、および家族の他のメンバーに投与して、ウイルス感染およびそれに続く病気を予防できるであろう。特定の感染性疾患(例えば、A型肝炎ウイルス、マラリアなど)が流行している世界の地域に旅行する人を治療することもできる。
【００８３】
あるいは、該医薬組成物を用いて、例えば、癌を有する被験体または新生物もしくは癌を発生する危険性の高い被験体において、腫瘍を治療したり、腫瘍形成を予防することができる。例えば、癌を有する被験体を処置してさらなる腫瘍形成を予防することができる。あるいは、発癌物質に曝露されるか、または曝露されることが予想される被験体を処置することができる。汚染物質(例えば、アスベスト)に曝露され得る環境浄化に関与する個体を処置することもできる。あるいは、放射線に曝露される個体(例えば、高線量の放射線に曝露された被験体または発癌性の薬剤を摂取する必要がある被験体)を、曝露の前後に処置することができる。
【００８４】
抗腫瘍剤としての本発明の弱毒ウイルスの使用は、IFNアンタゴニスト遺伝子に欠失がある弱毒インフルエンザウイルス変異体がマウスにおいて腫瘍形成を減少させることができるという本発明者らの発見に基づくものである。本発明の抗腫瘍特性は、少なくとも部分的にはIFNおよびIFN応答を誘導するそれらの能力に関係し得る。あるいは、本発明の弱毒ウイルスの抗腫瘍特性は、腫瘍細胞中で特異的に増殖し、腫瘍細胞を殺傷するその能力に関係し得るが、腫瘍細胞の多くはIFN系に欠陥を有することが知られている。抗腫瘍特性を担う分子機構に関わりなく、本発明の弱毒ウイルスを用いて、腫瘍を治療したり、腫瘍形成を予防することができる。
【００８５】
本発明はさらに、変化したIFNアンタゴニスト表現型を有する変異体ウイルスを包含し、体内の特定の器官、組織および／または細胞を標的化し、局所的な治療効果または予防効果を誘導することができる。かかる方法の１つの利点は、本発明のIFN誘導性ウイルスは、腫瘍位置などの特定の部位を標的としており、毒性作用を有するIFNを全身的に誘導するのではなく治療効果のために部位特異的な様式でIFNを誘導するということである。
【００８６】
本発明の変異IFN誘導性ウイルスを、本明細書に記載の方法を用いて遺伝子操作して、該ウイルスを特定の部位に標的化するタンパク質またはペプチドを発現させることができる。好ましい実施形態においては、該IFN誘導性ウイルスは腫瘍部位を標的とする。かかる実施形態においては、該変異体ウイルスを遺伝子操作して、腫瘍特異的抗原を認識する抗体の抗原結合部位を発現させ、従ってIFN誘導性ウイルスを腫瘍に標的化することができる。さらに別の実施形態においては、標的化される腫瘍(エストロゲン受容体を発現する乳房腫瘍または卵巣腫瘍など)がホルモン受容体を発現する場合、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、適当なホルモンを発現させることができる。さらに別の実施形態においては、標的化される腫瘍が増殖因子、例えばVEGF、EGFまたはPDGFに対する受容体を発現する場合、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、適当な増殖因子またはその一部を発現させることができる。従って、本発明に従えば、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、酵素、ホルモン、増殖因子、抗原もしくは抗体などのペプチド、タンパク質を含む任意の標的遺伝子産物を発現させることができ、それらは抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗微生物活性、または抗癌活性を必要とする部位に該ウイルスを標的化するように機能する。
【００８７】
導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。本発明の医薬組成物は、任意の好都合な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口粘膜、直腸および腸粘膜など)を通した吸収により投与することができ、また他の生物活性物質と共に投与することができる。投与は全身的または局所的であってよい。さらに、好ましい実施形態においては、本発明の医薬組成物を任意の適当な経路により肺に導入するのが望ましい。例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル剤を含む製剤の使用による肺投与を用いることもできる。
【００８８】
特定の実施形態においては、治療を必要とする領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与するのが望ましい。これは、例えば、限定されるものではないが、外科手術中の局所注入、局所適用（例えば、カテーテル、座剤、または移植片を用いた注入により、外科手術後の創傷包帯と併せて行う）によって達成することができる。この移植片は、多孔性、非多孔性またはゼラチン質の材料であり、シアラスティック(sialastic)膜などの膜、または繊維を含む。１実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性もしくは前新生物性組織の部位(または前部位)に直接注入することにより行ってもよい。
【００８９】
さらに別の実施形態においては、該医薬組成物を制御放出系により送達することができる。１実施形態においては、ポンプを用いることができる(Langer、前掲;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldら、1980, Surgery 88:507; Saudekら、1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall(編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levyら、1985, Science 228:190; Duringら、1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら、1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい)。さらに別の実施形態においては、制御放出系を該組成物の標的すなわち肺の近くに置くことができ、従って全身投与量のほんの一部だけが必要になる(例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138を参照されたい)。他の制御放出系については、Langer(1990, Science 249:1527-1533)による概説中で考察されている。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、治療上有効量の弱毒ウイルスおよび製薬上許容される担体を含む。特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の監督機関により承認されるか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知されている薬局方に記載されることを意味し、動物、特にヒトに用いるものである。用語「担体」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、該医薬組成物と共に投与される。生理食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体、特に注入可能な溶液として用いることができる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。これらの組成物を座剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含有することができる。適当な製薬上の担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。かかる組成物は、好ましくは精製された形態の治療上有効量の治療剤と、適当量の担体とを含有し、被験体に適切に投与するための剤形を提供することができる。該製剤は、投与の様式に適合するべきである。
【００９１】
特定の障害または状態の治療に有効である本発明の医薬組成物の量は、該障害または状態の性質に依存するであろうが、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によってはin vitroアッセイを援用して最適な用量範囲を同定することができる。また該製剤に用いる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存するであろうが、医師の判断および各被験体の環境に応じて決定されるべきである。しかし、適当な投与用量範囲は、一般的には約104〜5x106 pfuであり、一回投与するか、または必要な回数、間隔をあけて複数回投与することができる。変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明の医薬組成物を、鼻腔内、気管内、筋肉内、または皮下投与することができる。in vitroまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から、有効量を推定することができる。
【実施例】
【００９２】
6. 実施例：A型インフルエンザウイルスのNS1トランケーション変異体の作製および特徴づけ
6.1 材料および方法
A/PR/8/34(PR8)型インフルエンザウイルスを、10日齢の孵化鶏卵中で37℃にて増殖させた。A型インフルエンザウイルス25A-1、すなわち寒冷地適合株A/Leningrad/134/47/57由来のNSセグメントおよびPR8ウイルス由来の残りの遺伝子を含む再集合ウイルス(Egorovら、1994, Vopr. Virusol. 39:201-205; Shawら、1996, in Options of the control of influenza III, Brown(編), Hampson Webster (Elsevier Science) pp. 433-436)を、Vero細胞中で34℃にて増殖させた。該25A-1ウイルスは、哺乳動物細胞中で温度感受性であり、NS1/99トランスフェクタントウイルスのレスキューのためのヘルパーウイルスとして用いた。1μg/mlのトリプシンを含有する最少必須培地(MEM)(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)中で維持したVero細胞およびMDCK細胞を、インフルエンザウイルスの増殖のために用いた。Vero細胞は、NS1/99ウイルスの選択、プラーク精製および力価測定のためにも用いた。MDCK細胞は、10％の熱不活化ウシ胎児血清を含有するDMEM(ダルベッコの最少必須培地)中で維持した。Vero細胞は、ATM-V培地(Life Technologies, Grand Island, NY)中で増殖させた。
【００９３】
99アミノ酸のC末端トランケート形態のNS1を含有するプラスミドpT3NS1/99を、以下のように作製した。まず、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびBpuAI制限部位に隣接したPR8ウイルスの完全なNS遺伝子を含有するpPUC19-T3/NS PR8を、適当なプライマーを用いて、逆転写PCR(Ochmanら、1988, Genetics 120: 621-623)により増幅した。次いで、トランケートされたNS1遺伝子を含む得られたcDNAを、リン酸化し、クレノー(Klenow)処理し、自己ライゲーションさせ、大腸菌のTG1株中で増殖させた。精製後に得られた構築物を、pT3NS1/99と命名し、配列決定により確認した。PR8ウイルスのNP、PB1、PB2およびPAタンパク質の発現のためのプラスミド(pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、およびpHMG-PA)については、以前に記載されている(Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)。pPOLI-NS-RBを、pPOLI-CAT-RT (Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)のCATオープンリーディングフレームをインフルエンザA/WSN/33(WSN)ウイルスのNS遺伝子のコード領域に由来するRT-PCR産物に置換することにより作製した。このプラスミドは、トランケートされたヒトポリメラーゼIプロモーターの制御下でWSNウイルスのNS特異的なウイルスRNAセグメントを発現する。
【００９４】
NS1/99ウイルスの作製を、リボ核タンパク質(RNP)トランスフェクション(Luytjesら、1989, Cell 59:1107-1113)により実施した。該RNPは、インフルエンザ25A-1ウイルス(Enamiら、1991, J. Virol. 65:2711-2713)の精製された核タンパク質およびポリメラーゼの存在下でBpuAIにより線状化されたpT3NS1/99からのT3 RNAポリメラーゼ転写により形成されたものである。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスに感染させたVero細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を37℃にて18時間インキュベートし、上清を40℃にてVero細胞中で2回継代し、寒天上層培地で被覆したVero細胞中で37℃にて3回プラーク精製した。単離されたNS1/99ウイルスを、特異的プライマーを用いてRT-PCRにより分析した。野生型トランスフェクタントウイルスを以下のように作製した。35-mmディッシュ中のVero細胞を、以前に記載されたように(Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)、プラスミドpHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PAおよびpPOLI-NS-RBでトランスフェクトした。トランスフェクション後2日目に、細胞を5x104 pfuのdelNS1ウイルスに感染させ、さらに2日間、37℃にてインキュベートした。細胞の上清を、MDCK細胞中で1回、孵化鶏卵中で2回継代した。トランスフェクタントウイルスを、卵中で限界希釈法によりクローニングした。精製したNS1/99トランスフェクタントウイルスに由来するゲノムRNAを、以前に記載されたように(Zhengら、1996, Virology 217:242-251)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。NS1/99ウイルスによるトランケートされたNS1タンパク質の発現を、NS1に対するウサギポリクローナル抗血清を用いて、標識された感染細胞抽出物を免疫沈降させることにより確認した。
【００９５】
孵化鶏卵(6、10および14日齢)の尿膜腔に、約103 pfuのPR8、NS1/99またはdelNS1(NS1遺伝子全体を欠失させた)ウイルスを接種し、37℃にて2日間インキュベートし、尿膜腔液中に存在するウイルスを血球凝集(HA)アッセイにより力価測定した。
【００９６】
5匹のBALB/cマウス(Taconic Farms)の群に、5x106 pfu、1.5x105 pfu、5x103 pfuの野生型A/PR/8/34(PR8)またはNS1/99ウイルスを鼻腔内接種した。接種は、適当なウイルスを適当数のプラーク形成単位で含有する50μlのMEMを用いて麻酔下で実施した。動物を毎日モニターし、極端な状態が観察された時に殺した。その後の実験で、全ての生存しているマウスを、4週間後に100LD50の用量の野生型PR8ウイルスでチャレンジした。全ての方法は実験動物の世話および使用に関するNIHガイドラインに従って行った。
【００９７】
6.2 結果：NS1欠失によるＡ型インフルエンザウイルスの弱毒化
出願人は以前、NS1遺伝子が欠失したＡ型インフルエンザウイルス（delNS1ウイルス）はベロ細胞などのＩ型インターフェロン（IFN）産生に欠陥がある細胞中で約107pfu/mlの力価まで増殖する能力があることを示した。しかし、このウイルスはマウス中では複製および疾病を引き起こす能力が損なわれていた（Garcia-Sastreら、1998,Virology 252:324）。対照的に、STAT1-/-マウス中ではdelNS1ウイルスは増殖してこれを殺傷することができた。これらの結果は、Ａ型インフルエンザウイルスのNS1タンパク質がＩ型IFNによって仲介される宿主の抗ウイルス応答の阻害に関与する毒性因子であることを証明している。NS1遺伝子の一部を欠失させることによって野生型とdelNS1ウイルスの中間の毒性特性を有するインフルエンザウイルスを作製することができるかどうか、そしてこれらのウイルスの中に、インフルエンザウイルスに対する弱毒化生ワクチンとして使用するための最適の特性、すなわち安定性、および弱毒化、免疫原性および孵化鶏卵などのワクチン調製に適した培養基中での増殖の間の適切なバランスを有するものがあるかどうかを判定するため、以下の実験を実施した。
【００９８】
この仮説を試験するために、野生型NS1タンパク質の230アミノ酸と共通のアミノ末端に99アミノ酸のみを含有する末端切断型NS1タンパク質の発現を指令するようにNS1遺伝子が改変されたインフルエンザA/PR/8/34（PR8）ウイルスを作製した。このウイルス（NS1-99）は、既に記載（Garcia-Sastreら、1998,Virology 252:324）されたのように、25A-1ヘルパーウイルスを使用して人工的に操作したNS遺伝子のRNPトランスフェクションによって取得した。ウイルスが感染した細胞中のNS1発現の分析から、NS1-99ウイルスのNS1タンパク質の末端切断の性質が明らかになった。
【００９９】
delNS1、NS1-99および野生型PR8ウイルスの、各種日齢の孵化鶏卵中における増殖能力を分析した。この実験の論理的根拠は、Ｉ型IFNを合成して適切な刺激の下でこれに応答する孵化卵の能力は日齢に依存するという事実に基づいている。実際、IFN誘導性および応答性の両者ともに約10日齢で開始し、その後日齢とともに対数的に増大する（Sekellickら、1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:997；SekellicおよびMarcus,1985,J.Interferon Res.5:657）。したがって、各種日齢の卵の使用は、各種ウイルスについてIFN応答を阻害する能力を試験するための独特の系を象徴する。6日、10日および14日齢の卵に約103pfuのPR8、NS1-99またはdelNS1ウイルスを接種し、37℃で２日間インキュベートし、そして尿膜腔液中に存在するウイルスを血球凝集（HA）アッセイによって力価測定した。表３に示すように、野生型ウイルスは、6日、10日および14日齢の孵化卵において同程度のHA力価まで増殖したのに対して、delNS1は6日齢の卵で検出し得るHA力価まで複製しただけだった。対照してみると、NS1-99ウイルスは、delNS1と野生型ウイルスの中間の挙動を示し、10日齢の卵では野生型ウイルスと同程度のHA力価まで増殖することができたが、14日齢の卵ではできなかった。
［表３］ 孵化鶏卵中のウイルスの複製
血球凝集力価1
ウイルス 卵の日齢： 6日 10日 14日
WT PR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N.D.3 2.048 < 2
delNS1 64 < 2 < 2
1 力価は血球凝集活性を有する最大希釈を表す。
2 野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルス
3 判定されず
【０１００】
次に、NS1-99ウイルスの弱毒化特性をマウス中で判定した。この目的のため、BALB/cマウス5匹のグループに、5×106pfu、1.5×105pfuまたは1.5×103pfuの野生型PR8またはNS1-99ウイルスを鼻腔内感染させた。次にマウスの生存について3週間モニターした。結果を表４に示す。NS1-99ウイルスは野生型ウイルスよりも少なくとも3ログ高いLD50を有していた。
【０１０１】
［表４］ マウス中のNS1-99ウイルスの弱毒化
生存体
ウイルス 感染用量（pfu）： 5×106 1.5×105 1.5×103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 野生型インフルエンザウイルスA/PR/8/34
【０１０２】
７．実施例：Ｂ型インフルエンザウイルスにおけるNS1末端切断突然変異体の作製および特性決定
７．１ 材料および方法
実験の詳細は第6.1節の場合と同様である。抗Ａ（H3N2）ウイルス抗体の存在下で、B/Yamagata/1/73（B/Yam）およびA/Aichi/2/68ウイルスを含む組織培養物中での同時感染実験から、長さがそれぞれ127アミノ酸および90アミノ酸（Ｃ末端切断されたNS1タンパク質）の２種の突然変異Ｂ型インフルエンザウイルス、B/610B5B/201（B/201）およびB/AWBY-234（Nortonら、1987 Virology 156:204；Tobitaら、1990 Virology 174:314）を誘導した。各種日齢の孵化卵中での突然変異インフルエンザウイルスの増殖を、野生型281アミノ酸NS1タンパク質を保有する親ウイルスB/Yamの場合と比較した。6日、10日および14日齢の卵に、約103pfuのB/Yam、B/201またはB/AW/BY-234ウイルスを接種し、35℃で２日間インキュベートし、そして尿膜腔液中に存在するウイルスをHAアッセイによって力価測定した。
【０１０３】
さらに、B/201およびB/AWBY-234ウイルスの弱毒化特性をマウス中で判定した。BALB/cマウス3匹のグループに、3×105pfuの野生型B/Yam、B/201またはB/AWBY-234突然変異ウイルスを鼻腔内感染させ、感染後３日目の肺中のウイルス力価を測定することによって、これらのウイルスの複製能力を判定した。その理由は野生型B/Yamはマウスにおいて外見上わかる疾病症候を誘発しないからである。
【０１０４】
７．２ 結果
［表５］ 孵化鶏卵中のＢ型インフルエンザウイルスの複製
赤血球凝集力価
ウイルス 卵の日齢： 6日 10日 14日
B/Yam 362 256 < 2
B/201 32 < 2 < 2
B/AWBY-234 8 < 2 < 2
【０１０５】
表５に示す孵化鶏卵中での突然変異および野生型Ｂ型インフルエンザウイルスの増殖の結果は、Ａ型インフルエンザウイルスの場合と同様に、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1のカルボキシ末端の切断が、日齢が進んだ孵化鶏卵中で有効なIFN応答が開始するより低い複製能力に関係することを証明している。この知見は、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1もまた宿主のIFN応答の阻害に関与すること、およびＢ型インフルエンザウイルスのNS1遺伝子上の欠失により弱毒化された表現型となることを示している。
【０１０６】
マウス中での複製実験の結果を表６に示す。B/201およびB/AWBY-234ウイルス力価は、B/Yam力価よりも値が約３ログ低く、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1のカルボキシ末端ドメインの切断がマウス中での弱毒化表現型に関係することを示している。
【０１０７】
［表６］ マウス肺中のＢ型インフルエンザウイルスの複製
ウイルス 感染後３日目の肺力価（pfu／肺）
B/Yam 2×104 1×104 3×104
B/201 30 < 10 60
B/AWBY-234 < 10 40 < 10
【０１０８】
８．NS1タンパク質中に欠失を含有するＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスで免疫したマウスにおける野生型インフルエンザウイルス感染に対する防御
末端切断NS1タンパク質を含有する弱毒化Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスで免疫したマウスが、それらに対応する野生型ウイルスによるチャレンジに対して防御されるかどうかを判定するため、以下の実験を実施した。BALB/cマウスをA/NS1-99ウイルスで鼻腔内免疫し、３週間後に野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルスの100LD50を感染させた。免疫した動物は死に対して防御されたが、対照非処置マウスはチャレンジ後に全部死んだ（表７参照）。第２の実験において、末端切断NS1タンパク質を発現するＢ型インフルエンザウイルス B/201またはB/AWBY-234でBALB/cマウスを鼻腔内免疫した。３週間後に該マウスを3×105pfuの野生型インフルエンザB/Yam/1/73ウイルスでチャレンジした。Ｂ型インフルエンザウイルスのこの株はマウス中で疾病症状を誘発しないので、チャレンジ後３日目の肺中のウイルス力価を測定することによって、防御の程度を判定した。非処置対照動物は約104pfu／肺の力価があったが、免疫動物の肺中にはウイルスが検出されなかった（表８参照）。これらの知見は、改変されたNS1遺伝子を含有するＡ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザウイルスはともに、マウスにおいてその後の野生型ウイルスのチャレンジに対して完全に防御する免疫応答を誘発する能力があることを示唆している。
【０１０９】
［表７］ インフルエンザA/NS1-99ウイルスで免疫したマウスの、
100 LD50の野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルスによる
チャレンジ後の生存
A/NS1-99ウイルスの免疫用量 生存体の数／総数
5×106pfu 3/3
1.5×105pfu 4/4
PBS 0/5
【０１１０】
［表８］ インフルエンザB/201およびB/AWBY-234ウイルスで免疫した
マウス中の、3×105pfuの野生型インフルエンザB/Yamagata/73ウイルス
によるチャレンジ後の肺力価
免疫用量 肺力価（pfu／肺）
3×105pfuのB/201 < 101、< 101、< 101、< 101、< 101
3×105pfuのB/AWBY-234 < 101、< 101、< 101、< 101、< 101
PBS 2.5×104、1×104、1.7×104、3×104、5×104
【０１１１】
９．実施例：delNS1ウイルスに感染した孵化卵におけるＩ型インターフェロンの誘導
次に、NS1遺伝子を欠失したＡ型インフルエンザウイルスであるdelNS1ウイルスについて、孵化鶏卵中でＩ型IFN分泌を誘発する能力を判定した。この目的のため、10日齢の孵化鶏卵２個のグループに、delNS1または野生型PR8ウイルスの5×103pfuを感染させた。37℃でインキュベート後18時間で尿膜腔液を採取し、酸性pHに対して一晩透析することによって、感染性ウイルスを不活性化した。酸性pH処置後、サンプルをPBSに対して透析し、そしてCEF細胞中での（約200pfuの）VSV感染に対する防御活性を有する最大希釈を測定することによって、IFN活性についてサンプルを試験した。表９に示す結果は、NS1不在下ではＡ型インフルエンザウイルスの方がより強いIFN誘導因子であることを示している。
【０１１２】
［表９］ 卵中のIFNの誘導
ウイルス IFN（U/ml）
PR8 < 16、< 16
delNS1 400、400
偽（mock） < 16、< 16
【０１１３】
10．実施例：delNS1ウイルスの抗ウイルス活性
Ａ型インフルエンザウイルスからのIFNアンタゴニスト（NS1）遺伝子の除去により、高レベルのIFNを誘導する能力があるウイルスがもたらされるかもしれない。その場合は、delNS1ウイルスがIFN感受性ウイルスの複製を「妨害」することになる。この可能性を試験するため、出願人は、delNS1ウイルスについて、普通使用される実験用インフルエンザウイルス株であるインフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイルスの複製を阻害する能力を卵中で試験した。図１からわかるように、わずかに2pfuのdelNS1での処置により尿膜腔液でのWSNウイルスの最終力価を１ログ低下させることができた。その上、2×104pfuのdelNS1ウイルスでの処置により、卵中でのWSN複製がほとんど完全に阻止された。delNS1ウイルスは、その他のＡ型インフルエンザウイルス株（H1N1およびH3N2）、Ｂ型インフルエンザウイルスならびにSendaiウイルスなどの別種のウイルスの卵中での複製をも妨害することができた（図２）。
【０１１４】
この結果に自信を得て、出願人は次に、delNS1ウイルスについてマウス中で野生型インフルエンザウイルスの複製を妨害する能力を判定した。組織培養物中でのＩ型IFN処置によりＡ型インフルエンザウイルスのin vitroでの複製が妨害されるが、IFNでマウスを処置してもインフルエンザウイルス類の複製を阻害することができない（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。これは、A2Gマウスを除く大部分の近交品種マウスにあてはまる。A2Gマウスと同様に顕著な割合（約75％）の野生マウスが、少なくとも１個の完全長Mx1対立遺伝子を含んでいるのに対し、大部分の実験用品種はMx1-/-である（Haller,1986,Current Top Microbiol Immunol 127:331-337）。ヒトMxAタンパク質の相同体であるMx1タンパク質（Aebi,1989,Mol.Cell.Biol.11:5062）は、インフルエンザウイルス複製の阻害剤である可能性がある（Haller,1980,Nature 283:660）。このタンパク質は構成的に発現されるのではなく、その発現はＩ型IFNによって転写的に誘導される。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス応答を刺激するIFN誘導因子の能力を試験するために、A2Gマウスを使用することができる（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。
【０１１５】
出願人は、4週齢のA2Gマウス8匹に、高度に病原性があるインフルエンザA/PR/8/34ウイルス単離物の5×106pfuを鼻腔内感染させた（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。PR8感染に関して、24時間前に、マウスの半分に5×106pfuのdelNS1を用いて鼻腔内処置した。その他の4匹のマウスはPBSで処置した。体重変化および生存をモニターした。これらの結果から、delNS1処置がインフルエンザウイルスで誘発される死および体重低下に対してA2Gマウスを保護することができることが証明された。Mx1-/-マウスでは同様の処置が有効ではなかったので、ウイルス防御の機構はMx1、すなわちIFNが仲介することが示された。
【０１１６】
11．実施例：マウスにおけるdelNS1ウイルスの抗腫瘍特性
Ｉ型IFNおよび／またはＩ型IFNの誘導因子は抗腫瘍活性を有することが示されている（BelardelliおよびGresser,1996 Immunology Today 17:369-372；Qinら、1998,Proc.Natl.Acad.Sci.95:14411-14416）ので、delNS1ウイルスによる腫瘍の治療が腫瘍の退縮を仲介する可能性がある。あるいは、delNS1ウイルスが腫瘍細胞崩壊特性を有するかもしれない。すなわち、その多くがIFN系に欠陥があることが知られている腫瘍細胞中で特異的に増殖してそれらを死滅させることができるかもしれない。delNS1ウイルスの抗腫瘍活性を試験するため、転移性肺腫瘍のためのマウス腫瘍モデルにおけるマウス癌細胞系 CT26.WTを使用して、以下の実験を実施した（Restifoら、1998 Virology 249:89-97）。6週齢のBALB/cマウス12匹の静脈に5×105個のCT26.WT細胞を注入した。接種後1日、2日および3日目に24時間毎に、マウスの半数を106pfuのdelNS1ウイルスで鼻腔内処置した。腫瘍注入後12日目に、マウスを絶命させて転移性肺腫瘍を数えた。表10に示すように、delNS1処置はマウスの転移性肺腫瘍の有意な退縮を仲介した。
【０１１７】
［表10］ CT26.WT腫瘍細胞を注入したBALB/cマウス中の
delNS1ウイルスの抗腫瘍活性
転移性肺腫瘍の数
PBS処置 delNS1処置
マウス1 > 250 120
マウス2 > 250 28
マウス3 > 250 9
マウス4 > 250 6
マウス5 > 250 2
マウス6 > 250 1
【０１１８】
12．実施例：NS1タンパク質はインフルエンザウイルスの感染中のIRF-3のトランスロケーションを阻害する
本明細書に記載した結果は、インフルエンザウイルスのNS1タンパク質がこのウイルスに対するＩ型IFN応答の阻害に関係すること、およびこのタンパク質の突然変異／欠失により感染中のIFN応答の強化によるウイルスの弱毒化がもたらされることを示唆している。ウイルス感染中のＩ型IFNの合成は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発されうることが知られている。IRF-3は通常哺乳動物細胞の細胞質中で不活性形態で見られる転写因子である。二本鎖RNAは転写因子IRF-3のリン酸化（活性化）を誘導し、その結果これを核にトランスロケーションさせ、そこでＩ型IFNをコードする遺伝子を含む特定の遺伝子の転写を誘導する（Weaverら、1998,Mol.Cell.Biol.18:1359）。インフルエンザのNS1がIRF-3に作用しているかどうかを判定するため、野生型PR8またはdelNS1Ａ型インフルエンザウイルスを感染させたCV1細胞中のIRF-3の局在化をモニターした。図３は、IRF-3のトランスロケーションがPR8を感染させた細胞中で最少（細胞の10％未満）であることを示している。対照的に、delNS1を感染させた細胞の約90％がIRF-3の核への局在化を示した。際立っていたことは、プラスミドの１つからin transでNS1を発現させることによって、delNS1を感染させた細胞中でのIRF-3のトランスロケーションを部分的に阻害することが可能だったことである。この結果から、Ａ型インフルエンザウイルスのNS1がウイルスを感染させた細胞中でのIRF-3のトランスロケーションを阻害することができることが証明される。インフルエンザウイルスのNS1はウイルス感染中に産生されるdsRNAを隔離することによってdsRNAが仲介するIRF-3の活性化を阻止し、この結果IFN合成が阻害されると考えられる。
【０１１９】
本発明は記載した特定の実施形態の範囲内に限定されるベきではなく、それらは本発明の個々の態様の単なる説明として意図するものであり、また機能的に等価なあらゆる構築物またはウイルスは本発明の範囲内である。実際、当業者にとって、前述の記載および添付した図面から、本明細書に示しかつ記載するものの他に、本発明の各種の変更が明らかになるであろう。それらの変更は添付した特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図している。
【０１２０】
本明細書に各種の参照文献を引用したが、それらの開示は参照によりその全文を組み入れる。
【技術分野】
【０００１】
本出願に反映される研究は、米国国立衛生研究所（National Institute of Health）からの助成による援助を一部受けたものであり、政府は本発明における一定の権利を有するものである。
【０００２】
本出願は、それぞれの全体を参照により本明細書に組み入れる、1999年１月29日に出願された出願番号第60/117,683号、1998年11月18日に出願された出願番号第60/108,832号、及び1998年６月12日に出願された出願番号第60/089,103号の一部継続出願である。
【０００３】
１．序
本発明は、一般に、細胞性インターフェロン（IFN）応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化したマイナス鎖RNAウイルス、及びこうした弱毒化ウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。本発明はまた、こうした弱毒化ウイルスの選択、同定及び増殖のためのIFN-欠損システムの開発及び使用に関する。
【０００４】
特定の実施形態において、本発明はNSl遺伝子産物が細胞性IFN応答に拮抗する能力を低下または消失させるような改変をNSl遺伝子に有する弱毒化インフルエンザウイルスに関する。変異型ウイルスはin vivoで複製するが病原性の低下を示し、従ってウイルス生ワクチン及び医薬製剤における使用に適したものである。
【背景技術】
【０００５】
２．発明の背景
２．１ インフルエンザウイルス
包膜型(-)センスゲノムの一本鎖RNAを有するウイルスファミリーは、は、非セグメントゲノムを有する群（パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナ病ウイルス）、またはセグメントゲノムを有する群（オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科及びアレナウイルス科）に分類される。以下に詳細に記載し、本明細書の実施例において使用するオルトミクソウイルス科ファミリーには、インフルエンザウイルスのＡ、Ｂ及びＣ型ウイルス、並びにトゴト（Thogoto）及びドリ（Dhori）ウイルス及び感染性サケ貧血ウイルス（salmon anemia virus）が含まれる。
【０００６】
インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部リボ核タンパク質コア（らせん状ヌクレオキャプシド）、及びマトリクスタンパク質（MT）が内側に並んだ外側のリポタンパク質エンベロープから構成される。インフルエンザＡウイルスのセグメントゲノムは、１０個のポリペプチドをコードする線状で負の極性を有する一本鎖RNAの８分子（インフルエンザＣでは７個）から構成される。１０個のポリペプチドとしては、ヌクレオキャプシドを形成する核タンパク質（NP）及びRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1及びPA）、マトリクス膜タンパク質（M1、M2）、エンベロープを含む脂質から突き出た２種の表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）、非構造タンパク質（NS1）及び核輸出タンパク質（NEP）が含まれる。ゲノムの転写及び複製は核内で起こり、アセンブリーは原形質膜上の出芽を介して起こる。ウイルスは、混合感染の間に遺伝子の再配列することがあり得る。
【０００７】
インフルエンザウイルスは、細胞膜糖タンパク質及び糖脂質のシアリルオリゴ糖にHAを介して吸着する。ビリオンのエンドサイトーシスの後、細胞のエンドソーム内でHA分子のコンフォーメーション変化が生じて膜融合が促進され、脱外被を引き起こす。ヌクレオキャプシドが核に移動し、そこでウイルスmRNAが転写される。ウイルスmRNAは、ウイルスのエンドヌクレアーゼが細胞の異種mRNAから５’キャップ末端を切断し、次いでこれがウイルスの転写酵素によるウイルスRNA鋳型の転写のためのプライマーとして働くという独特のメカニズムによって転写される。転写物は鋳型の末端から15から22塩基の部位で終わり、オリゴ（Ｕ）配列がポリ（Ａ）トラクトの添加のためのシグナルとして作用する。産生された８種のウイルスRNA分子のうち、６種がモノシストロン性メッセージであり、HA、NA、NPを示すタンパク質、及びウイルスのポリメラーゼタンパク質、PB2、PB1及びPAに直接翻訳される。他の２種の転写物はスプライシングを受け、それぞれ２種のmRNAとなり、異なるリーディングフレームで翻訳されてM1、M2、NS1及びNEPが産生される。すなわち、８種のウイルスRNAセグメントが１０個のタンパク質、９個の構造タンパク質及び１個の非構造タンパク質をコードしている。インフルエンザウイルスの遺伝子及びそのタンパク質産物の概要を以下の表１に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
インフルエンザＡウイルスゲノムは、負の極性を有する一本鎖RNAの８個のセグメントを含有し、１個の非構造タンパク質及び９個の構造タンパク質をコードしている。非構造タンパク質NS1はインフルエンザウイルス感染細胞中に多量に存在するが、ビリオンでは検出されなかった。NS1は感染初期に核で、またウイルス周期のより後期に細胞質で見られるリンタンパク質である（Kingら、1975、Virology 64:378）。NS遺伝子の温度感受性（ts）インフルエンザ変異体を用いた研究から、NS1タンパク質は、ウイルスが宿主細胞の遺伝子発現を阻害し、ウイルスタンパク質合成を阻害し得るメカニズムの転写及び転写後レギュレーターであることが示唆された。転写後プロセスをレギュレートする他の多くのタンパク質と同様に、NS1タンパク質は特定のRNA配列及び構造と相互作用する。NS1タンパク質は、vRNA、ポリ-Ａ、U6snRNA、ウイルスmRNAの５’非翻訳領域及びds RNA等の種々のRNA種に結合することが報告されている（Qiuら、1995、RNA 1:304; Qiuら、1994、J. Virol. 68:2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen Virol. 73:3325-9）。トランスフェクトした細胞におけるcDNAからのNS1タンパク質の発現は、いくつかの効果：mRNAの核−細胞質間輸送の阻害、プレmRNAのスプライシングの阻害、宿主mRNAポリアデニル化の阻害及びウイルスmRNAの翻訳の刺激、と関係していた（Fortesら, 1994, EMBO J. 13:704; Enamiら, 1994, J. Virol. 68:1432; de la Lunaら, 1995, J. Virol. 69:2427; Luら, 1994, Genes Dev. 8:1817; Parkら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 2B433; Nemeroffら, 1998, Mol. Cell, 1:991; Chenら, 1994 EMBO J. 18:2273-83）。
【００１０】
２．２ 弱毒化ウイルス
不活化ウイルスワクチンは、複製ができなくなるように、例えば熱処理またはホルマリン処理によってウイルス病原体を「殺す」ことによって調製する。不活化ワクチンは、長期間持続する免疫性を与えず、従って制限された防御を与えるものであるため、有用性が制限される。ウイルスワクチンを産生する別のアプローチには、弱毒化したウイルス生ワクチンの使用が含まれる。弱毒化ウイルスは複製能を有するが病原性はなく、従ってより長期間持続する免疫を与え、より大きな防御が得られる。しかしながら、弱毒化ウイルスを産生する伝統的な方法は、その多くが温度感受性である宿主変異体を単離する機会を含む。例えば、ウイルスは天然にない（unnatural）宿主で継代され、免疫原性はあるが、病原性はない子孫のウイルスが選択される。
【００１１】
ワクチンとしての目的のためにインフルエンザウイルスを単離して増殖させるための伝統的な培養基（substrate）は、孵化鶏卵である。インフルエンザウイルスは、典型的には10〜11日齢の卵において37℃で２〜４日間増殖させる。インフルエンザＡ及びＢウイルスのヒト一次単離体のほとんどは胚の羊膜嚢（amniotic sac）中で良く増殖し、２から３回の継代の後、ウイルスは、卵の外側から近づきやすい尿膜腔（allantoic cavity）の細胞中での生育に適するようになる（Murphy, B. R. 及びR. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses p.1397-1445, Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.）。
【００１２】
理論的には、ウイルスゲノムに特定の突然変異を慎重に入れることができるため、組み換えDNA技術及び遺伝子工学技術は弱毒化ウイルスを産生する優れたアプローチを提供し得る。しかしながら、ウイルスの弱毒化に必要な遺伝子の改変は知られておらず、また予測可能なものではない。一般に、組み換えDNA技術を使用してウイルスワクチンを操作しようとする試みのほとんどは、免疫応答に関与し、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等の組み換えウイルスベクターで発現する病原体のタンパク質サブユニットのみを含有するサブユニットワクチンの作製に向けられた。より近年では、組み換えDNA技術は、天然に見られるか、若しくは既知の宿主範囲変異体で見られる弱毒化ウイルスを模倣したヘルペスウイルス欠失変異体またはポリオウイルスを作製する試みで利用された。1990年まで、(-)鎖RNAウイルスは部位特異的な操作が全くできず、従って遺伝子操作することができなかった。
【００１３】
これまでに作製された弱毒化インフルエンザ生ウイルスは、複製する宿主におけるインターフェロン応答を抑制することができない可能性があった。従って、これらのウイルスは、免疫原性がありながら病原性がないために有益であったが、ワクチンを作成する目的のための伝統的な培養基中で増殖することは困難である。更に、弱毒化ウイルスが有する病原性特性は緩和であり、宿主が後のチャレンジに対抗するのに十分な免疫応答を開始できない場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kingら、1975、Virology 64:378
【非特許文献２】Qiuら、1995、RNA 1:304
【非特許文献３】Qiuら、1994、J. Virol. 68:2425
【非特許文献４】Hatada Fukuda 1992, J. Gen Virol. 73:3325-9
【非特許文献５】Fortesら, 1994, EMBO J. 13:704
【非特許文献６】Enamiら, 1994, J. Virol. 68:1432
【非特許文献７】de la Lunaら, 1995, J. Virol. 69:2427
【非特許文献８】Luら, 1994, Genes Dev. 8:1817
【非特許文献９】Parkら, 1995, J. Biol. Chem. 270, 2B433
【非特許文献１０】Nemeroffら, 1998, Mol. Cell, 1:991
【非特許文献１１】Chenら, 1994 EMBO J. 18:2273-83
【非特許文献１２】Murphy, B. R. 及びR. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses p.1397-1445, Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
３．発明の概要
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化(-)鎖RNAウイルス、及びこうしたウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。IFN拮抗活性が損なわれた変異体ウイルスは弱毒化されている。すなわち、それらは感染性があり、in vivoで複製して準臨床的感染レベルを提供し得るものであり、かつ病原性を有しない。従って、ウイルス生ワクチンとしての理想的な候補である。更に、弱毒化ウイルスは強力なIFN応答を引き起こすことができ、これはその後の感染性疾患に対する防御を与え、及び／または抗腫瘍性応答を引き出すという、in vivoで他の生物学的な結果を有する。従って、弱毒化ウイルスは、他の感染性疾患、ハイリスク個体における癌、及び／またはIFN治療が可能な疾患の予防または治療のために、薬剤として使用することができる。
【００１６】
本発明に従って用いられる(-)鎖RNAウイルスは、セグメントウイルス及び非セグメントウイルスの双方を含む。好ましい実施形態としては、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス、レスピラトリー・シンシチアルウイルス（respiratory syncytial virus, RSV）ニューキャッスル病ウイルス（NDV）、小水疱性口内炎ウイルス（VSV）、及びパラインフルエンザウイルス（PIV）が挙げられる。本発明において使用されるウイルスは、天然に生じる株、変異型もしくは変異体；突然変異誘発させたウイルス（例えば突然変異原への暴露、反復継代及び／若しくは非許容宿主における継代によって生成させたもの）；再配列体（reassortants）（セグメントウイルスゲノムの場合）；及び／または所望の表現型を有する、すなわち細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた遺伝子操作されたウイルス（例えば「逆遺伝学」技術を使用したもの）、から選択することができる。変異体または遺伝子操作されたウイルスは、IFN欠損システム対IFN感応システムにおける示差（differential）増殖に基づいて選択することができる。例えば、IFN欠損システムで増殖するが、IFN感応（competent）システムで増殖しないウイルス（またはIFN感応システムでの増殖がずっと少ないウイルス）を選択することができる。
【００１７】
選択された弱毒化ウイルスは、それ自体でワクチンまたは医薬製剤における活性成分として使用することができる。あるいはまた、弱毒化ウイルスは組み換えによって作製されるワクチンのベクターまたは「骨格」として使用することができる。この目的で、「逆遺伝学」技術を使用して突然変異を操作したり、または「親」株として機能する弱毒化ウイルス中に外来性エピトープを導入したりすることができる。この方法において、ワクチンを株の変異型、あるいはまた全く異なる感染性薬剤若しくは疾患の抗原に対する免疫感作のために設計することができる。例えば、弱毒化ウイルスを他の予め選択した株を中和するエピトープを発現するように操作することができる。あるいはまた、(-)鎖RNAウイルス以外のウイルスのエピトープを弱毒化変異体ウイルスの中に組み入れることができる（例えばHIVのgp160、gp120、またはgp41）。あるいはまた、非ウイルス性感染性病原体（例えば寄生虫、細菌、菌類）のエピトープをウイルス中に組み込むことができる。更にまた、例えば弱毒化ワクチン骨格の中に腫瘍抗原を組み込むことによって、癌ワクチンを調製することができる。
【００１８】
セグメントゲノムを有するRNAウイルスに関連する特定の実施形態において、再配列技術を用いて、弱毒化表現型を親のセグメントRNAウイルス株（天然の変異体、突然変異誘発したウイルス、または遺伝子操作したウイルス）から別のウイルス株（野生型ウイルス、天然の変異体、突然変異誘発したウイルス、または遺伝子操作したウイルス）に移すことができる。
【００１９】
宿主において強力なIFN応答を引き起こす弱毒化ウイルスを、他のウイルス感染、またはIFN治療が可能な癌等の疾患の予防または治療のための医薬製剤において使用することもできる。この点において、弱毒化ウイルスの屈性（tropism）を変えて、ウイルスを所望の標的器官、組織または細胞にin vivoまたはex vivoでターゲッティングさせることができる。このアプローチを用い、IFN応答を標的部位で局所的に誘導し、全身的なIFN治療による副作用を避けるか、最小化することができる。この目的で、弱毒化ウイルスを操作して、標的器官、組織または細胞の受容体に対して特異的なリガンドを発現させることができる。
【００２０】
本発明は、その一部が、野生型インフルエンザウイルスのNS1がIFNアンタゴニストとして機能する、すなわちNS1がウイルスに感染した宿主細胞のIFN介在型応答を阻害する、という本出願人の発見に基づいている。NS1活性が欠損したウイルス変異体は細胞性IFN応答の潜在的誘発剤であることが見出され、in vivoにおける弱毒化表現型を示した。すなわち、変異体ウイルスはin vivoで複製するが、病原性の効果は低下していた。本発明がいかに作用するかについてはいかなる理論または説明にも拘束されることを意図するものではないが、本発明のウイルスの弱毒化特性はおそらく強力な細胞性IFN応答を誘導する能力、及び宿主のIFN応答に拮抗する能力が損なわれたことによるものである。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスの有益な特性は、細胞性インターフェロン応答に対する効果のみに帰するものではないかも知れない。事実、NS1に関連する他の活性における変化が所望の弱毒化表現型に寄与し得る。
【００２１】
IFN拮抗活性が損なわれた変異体インフルエンザウイルスは、in vivoで複製して免疫学的サイトカイン応答を引き起こすのに十分な力価を産生することが示された。例えば、弱毒化インフルエンザウイルスによるワクチン接種により、その後野生型インフルエンザウイルスをチャレンジ接種した動物におけるウイルスの力価が低下した。弱毒化インフルエンザウイルスはまた、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を示した。弱毒化インフルエンザウイルスを予め感染させると、野生型インフルエンザウイルスのほかの株、及び孵化卵において重感染した他のウイルス（センダイウイルス等）の複製が阻害された。腫瘍細胞を注射した動物に弱毒化インフルエンザを接種すると、形成する病巣の数が減少した。インフルエンザウイルスはCTL（細胞障害性Ｔリンパ球）応答を誘導することが知られているため、弱毒化ウイルスは癌ワクチンとして非常に魅力ある候補である。
【００２２】
ワクチン製剤のためには、ウイルスのIFN拮抗活性を低下させるが消失させないような変異が好ましい。こうしたウイルスは、伝統的培養基及び非伝統的培養基の双方での増殖のために、また中間的な病原性のために選択することができる。特に、本出願人は、NS1のＣ末端切断型変異体が、６及び７日齢の孵化鶏卵等のIFN欠損培養基、並びに、全NS1遺伝子が欠損したインフルエンザウイルス変異体（本明細書において「ノックアウト」変異体ともいう）の増殖を許容しないインフルエンザウイルスの伝統的培養基である１０日齢の孵化鶏卵の尿膜において高力価に複製することを示した。しかしながら、NS1-Ｃ末端切断型変異体の複製は、１２日齢の孵化卵において低下する。このアプローチにより、IFN拮抗活性が変化したが消失しておらず、ワクチン調製に好適な培養基における増殖が可能な弱毒化(-)鎖RNA生ウイルスの作製及び同定がはじめて可能なものとなる。このアプローチにより、インターフェロン拮抗活性が変化するが消失しない突然変異を有するインフルエンザウイルスまたは他のウイルスのための効率的な選択・同定システムを初めて可能なものとなる。
【００２３】
本発明はまた、ワクチン作製のために現在使用されている伝統的なシステムで増殖できない弱毒化ウイルスを増殖させるためのIFN欠損システムの使用に関する。本明細書で使用する用語「IFN欠損システム」とは、例えばIFNを産生しないか、若しくは低レベルのIFNを産生する細胞、細胞系及び動物（マウス、ニワトリ、七面鳥、ウサギ、ラット等）がIFNに対して応答しないか、若しくは低い効率で応答し、及び／またはIFNによって誘導される抗ウイルス遺伝子の活性が欠損しているシステムを意味する。この目的で、本出願人は、若い孵化卵、IFN欠損細胞系（VERO細胞またはSTAT1ノックアウト等の遺伝子操作した細胞系等）を含むがこれらに限定されない、使用可能な多くのIFN欠損システムを同定し、また設計した。あるいはまた、孵化卵または細胞系を、IFNシステムを阻害する化合物（薬剤、抗体、アンチセンス、リボザイム等を含む）で前処理することができる。更に別の実施形態は、IFNシステムが欠損した卵、例えばSTAT1陰性の鳥類、特にトランスジェニックニワトリ、アヒル若しくは七面鳥を含むがこれらに限定されない家禽類が産む卵の使用を含む。
【００２４】
４．図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】DelNS1ウイルスは卵における野生型インフルエンザＡウイルスの複製を阻害する。１０日齢の孵化鶏卵に図示したpfuのdelNS1ウイルスを接種した。８時間後、卵に１０３pfuのWSNウイルスを感染させた。37℃で２日間インキュベーションした後、尿液（allantoic fluid）を採取し、WSNウイルス力価をMDBK細胞におけるプラークアッセイによって決定した。結果は２個の卵の平均である。
【図２】delNS1ウイルスによる孵化卵における抗ウイルス応答の誘導を示す。１０日齢のニワトリ孵化卵にPBS（無処理）または２×１０４pfuのdelNS1ウイルス（delNS1処理）を接種した。８時間後、卵に１０３pfuのインフルエンザA/WSN/33(H1N1)ウイルス、インフルエンザA/PR8/34（H+N1）ウイルス、インフルエンザA/X-31（H3N2）ウイルス、インフルエンザB/Lee/40ウイルス、またはセンダイウイルスを感染させた。２日間のインキュベーション後、尿液を採取し、ウイルス力価を血球凝集反応アッセイによって決定した。結果は２個の卵の平均である。
【図３】CV1細胞を緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合したIRF-3を発現するプラスミドでトランスフェクトした。これにより、IRF-3の細胞内での局在が蛍光顕微鏡で決定できた。いくつかの場合には、NS1発現プラスミドをIRF-3発現プラスミドと図示した比率で同時トランスフェクトした。トランスフェクション24時間後の細胞に、PR8（WT）またはdelNS1ウイルスを図示するように高い感染多重度で感染させた。感染10時間後、IRF-3-GFPの局在について、蛍光顕微鏡で細胞を解析した。IRF-3の排他的な細胞質での局在（CYT）及び細胞質と核の双方での局在（Nuc+Cyt）を示す細胞のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
５．発明の詳細な説明
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた弱毒化(-)鎖RNAウイルスの作製、選択及び同定、及びこうしたウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。
【００２７】
ウイルスはセグメントゲノムを有するものであっても、非セグメントゲノムを有するものであっても良く、天然に生じる株、変異型若しくは変異体；突然変異誘発させたウイルス（例えばUV照射、突然変異原への暴露、及び／若しくは継代によるもの）；再配列体（セグメントゲノムを有するウイルスの場合）；及び／または遺伝子操作されたウイルス、から選択することができる。例えば、変異体ウイルスは、自然変化、UV照射への暴露、化学突然変異原への暴露、非許容宿主における継代、再配列（すなわち所望の抗原を有する他の株と弱毒化セグメントウイルスとの同時感染によるもの）、及び／または遺伝子操作（例えば「逆遺伝学」を使用するもの）によって作製することができる。本発明における使用のために選択されるウイルスは防御的IFN拮抗活性を有しており、弱毒化されている。すなわち、感染性があってin vivoで複製できるが、低い力価を産生するのみであって、病原性のない準臨床的感染レベルに至る。こうした弱毒化ウイルスは生ワクチンの理想的な候補である。
【００２８】
好ましい態様において、本発明における使用のために選択される弱毒化ウイルスは、宿主における強力なIFN応答を誘導し得るものである。これは、ワクチンとして使用する場合に強い免疫応答の産生に寄与し、他のウイルス感染症、またはハイリスク個体における腫瘍形成、またはIFNで治療される他の疾患の予防及び／または治療のための薬剤として有用なウイルスを作製するほかの生物学的結果を有する特性である。
【００２９】
本発明は、インフルエンザウイルス変異体で研究した際に本出願人が行った多くの発見及び観察に一部分基づいている。しかしながら、その原理は他のセグメント及び非セグメント(-)鎖RNAウイルスに同様に適用し、推定することができる。他の(-)鎖RNAウイルスとしては、限定されるものではないが、パラミクソウイルス（センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜ、ニューキャッスル病ウイルス）、モルビリウイルス（morbillivirus）（麻疹ウイルス、犬ジステンパーウイルス及び牛疫ウイルス）、ニューモウイルス（pneumovirus）（レスピラトリー・シンシチアルウイルス及びウシレスピラトリーウイルス）、及びラブドウイルス（小水疱性口内炎ウイルス及び狂犬病ウイルス）が挙げられる。
【００３０】
第一に、IFN応答はin vivoでウイルス感染を含むために重要である。本出願人等は、IFN欠損マウス（STAT1-/-マウス）における野生型インフルエンザウイルスA/WSN/33の増殖が全器官感染に至ることを見出した。すなわち、ウイルス感染は、IFN応答を生じる野生型マウスのように、肺に限定されなかった（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Garcia-Sastreら, 1998, J. Virol. 72:8550）。第二に、本出願人等は、インフルエンザウイルスのNS1がIFNアンタゴニストとして機能することを確立した。本出願人等は、全NS1遺伝子を欠失したインフルエンザウイルス変異体（すなわちNS1「ノックアウト」）がIFN感応性宿主細胞において高力価まで増殖できず、IFN欠損宿主においてのみ増殖できることを発見した。NS1ノックアウトウイルスは弱毒表現型を示し（すなわちIFN欠損STAT-/-マウスで致死的であるが、野生型マウスではそうではない）、宿主細胞におけるIFN応答の潜在的誘導剤であることが見出された（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Garcia-Sastreら, 1998, Virology 252:324-330）。NS1ノックアウト変異体ウイルスで予め感染させると孵化卵に重感染させた他のウイルス（例えばセンダイ）及び野生型インフルエンザの力価が低下した。別の実験では、NS1ノックアウト変異体インフルエンザウイルスで感染させると、腫瘍細胞を接種した動物における病巣の形成が低下した。このように、NS1ノックアウトインフルエンザウイルスは興味深い生物学的性質を示した。しかしながら、NS1ノックアウト変異体ウイルスは、ワクチン産生のための伝統的なシステムにおいて増殖できなかった。この問題を克服するために、本出願人等は適度な収量の弱毒化ウイルスの産生を可能とするIFN欠損システムを使用し、開発した。
【００３１】
更に、本出願人等は、全遺伝子を欠失しているのではない、NS1の欠失変異体を設計した。驚くべきことに、これらのNS1変異体は「中間的な」表現型を示すことが見出された。このウイルスは、（より高い力価をあげるIFN欠損システムにおいてより増殖するが）インフルエンザウイルスを増殖させるために使用される伝統的宿主中で増殖できる。より重要なことは、欠失変異体はin vivoで弱毒化され、強力なIFN応答を誘導する。インフルエンザウイルスNS1末端切断型変異体によるワクチン接種によって、その後野生型ウイルスをチャレンジ接種した動物でのウイルス力価が低くなり、疾患に対する防御能が得られた。
【００３２】
本発明はまた、ワクチンの目的のためのウイルスの単離、同定及び増殖のために設計された培養基に関する。特に、インフルエンザウイルス変異体を効率的に増殖させるためのインターフェロン欠損培養基を記載する。本発明において、インターフェロン欠損培養基は、インターフェロンを産生する能力またはインターフェロンに応答する能力を欠くものである。本発明の培養基は、インターフェロン欠損増殖環境を必要とし得るいかなるウイルスの増殖のために使用しても良い。こうしたウイルスとしては、限定されるものではないが、パラミクソウイルス（センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜ、ニューキャッスル病ウイルス）、モルビリウイルス（麻疹ウイルス、犬ジステンパーウイルス及び牛疫ウイルス）、ニューモウイルス（レスピラトリー・シンシチアルウイルス及びウシレスピラトリーウイルス）、及びラブドウイルス（小水疱性口内炎ウイルス及び狂犬病ウイルス）が挙げられる。
【００３３】
本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルスのヒトまたは動物のためのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。特に、弱毒化ウイルスは、限定するものではないが、株変異型、異なるウイルス若しくは他の感染性病原体（例えば細菌、寄生虫、菌類）、または腫瘍特異的抗原を含む、広範囲のウイルス及び／または抗原に対するワクチンとして使用することができる。別の実施形態において、ウイルスの複製及び腫瘍形成を阻害する弱毒化ウイルスは、感染（ウイルス性または非ウイルス性病原体）若しくは腫瘍形成の予防若しくは治療、またはIFNが治療として有益である疾患の治療のために使用することができる。ヒトまたは動物被検体に弱毒化生ウイルス製剤を導入して免疫応答または適当なサイトカイン応答を誘導するために、多くの方法を使用することができる。これらの中には、限定するものではないが、鼻内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下投与が含まれる。好ましい実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、鼻内に送達するために製剤化される。
【００３４】
５．１ IFN拮抗活性が変化した変異体の作製
IFN拮抗活性が低下した変異体ウイルスまたは株はいずれも、本発明に従って選択し、使用することができる。一実施形態において、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれた天然に生じる変異体若しくは変異型、すなわち自然突然変異体を選択することができる。別の実施形態において、ウイルスを突然変異原、例えば紫外線照射または化学突然変異原に暴露したり、複数回の継代及び／または非許容宿主における継代によって、変異体ウイルスを作製することができる。示差増殖システムにおけるスクリーニングを使用して、IFN拮抗機能が損なわれた変異体を選択することができる。セグメントゲノムを有するウイルスにおいては、再配列によって（すなわち弱毒化ウイルスと所望の株の同時感染、及び双方の表現型を示す再配列体の選択によって）弱毒表現型を所望の抗原を有する別の株に移すことができる。
【００３５】
別の実施形態において、「逆遺伝学」的アプローチを使用して、突然変異をインフルエンザ、RSV、NDV、VSV及びPIV等の(-)鎖RNAウイルス中に組み入れることができる。この方法では、弱毒表現型を付与する天然または他の突然変異をワクチン株中に組み入れることができる。例えば、IFN拮抗活性に関係する遺伝子（例えばインフルエンザのNS1等）のコード領域の欠失、挿入または置換を操作することができる。IFN拮抗活性に関係する遺伝子の非コード領域における欠失、置換または挿入も考えることができる。この目的のために、IFN拮抗活性に関係する遺伝子の転写、複製、ポリアデニル化、及び／またはパッケージングに関与するシグナルにおける突然変異を操作することができる。例えば、インフルエンザにおいては、以下のような改変が含まれるが、これらに限定されるものではない。インフルエンザＡウイルス遺伝子の非コード領域のインフルエンザＢウイルス遺伝子の非コード領域による置換（Musterら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5177）、インフルエンザウイルス遺伝子の非コード領域における塩基対交換（Fodorら, 1998, J. Virol. 72:6283）、インフルエンザウイルス遺伝子のプロモーター領域における突然変異（Picconeら, 1993, Virus Res. 28:99; Liら, 1992, J. Virol. 66:4331）、ポリアデニル化に影響するインフルエンザウイルス遺伝子の５’末端におけるウリジン残基のストレッチにおける置換及び欠失（Luoら, 1991, J. Virol. 65:2861; Liら, J. Virol. 1994, 68:1245）。例えばプロモーターに対するこうした突然変異は、IFN拮抗活性に関係する遺伝の発現をダウンレギュレートできるだろう。IFN拮抗活性に関係する遺伝子の発現をレギュレートし得るウイルス遺伝子における突然変異も、本発明に従って使用できるウイルスの範囲内にある。
【００３６】
本発明はまた、変化したIFN拮抗活性またはIFN誘導性表現型に至るよりは、変化したウイルス機能及び弱毒表現型（例えばポリ(A)含有mRNAの核輸出阻害の変化、プレmRNAのスプライシング阻害の変化、dsRNAの封鎖（sequestering）によるPKRの活性化阻害の変化、ウイルスRNAの翻訳に対する効果の変化、及び宿主mRNAのポリアデニル化阻害の変化）に至り得るNS1遺伝子セグメントへの突然変異に関する（例えばKrug in Textbook of Influenza, Nicholsonら編, 1998, 82-92、及びこれに引用された参照文献を参照すること）。
【００３７】
逆遺伝学技術としては、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンを産生するために必要なシグナルのパッケージングのために必須である(-)鎖ウイルスRNAのコード領域を含む、合成組み換えウイルスRNAの調製が含まれる。組み換えRNAは組み換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いてin vitroで再構成して、細胞のトランスフェクションに使用できる組み換えリボ核タンパク質（RNP）を形成する。ウイルスポリメラーゼタンパク質がin vitroまたはin vivoでの合成RNAの転写の際に存在する場合には、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組み換えRNPは、感染性ウイルス粒子中に放出する（rescued）ことができる。上記の技術は、それぞれ参照によってその全体を本明細書に組み入れる、1992年11月24日に発行された米国特許第5,166,057号、1998年12月29日に発行された米国特許第5,854,037号、1996年２月20日に公開されたヨーロッパ特許公開EP0702085A1号、米国特許出願No.09/152,845、1997年４月３日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032号、1996年11月７日に公開されたWO96/34625号、ヨーロッパ特許公開EP-A780475号、1999年１月21日に公開されたWO 99/02657号、1998年11月26日に公開されたWO 98/53078号、1998年１月22日に公開されたWO 98/02530号、1999年４月１日に公開されたWO 99/15672号、1998年４月２日に公開されたWO 98/13501号、1997年２月20日に公開されたWO 97/06270号、及び1997年６月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されている。
【００３８】
逆遺伝学アプローチによって作製された弱毒化ウイルスは、本明細書に記載のワクチン及び医薬製剤において使用することができる。逆遺伝学技術はまた、ワクチン作製のために重要な他のウイルス遺伝子の更なる突然変異の操作のために使用することができる。すなわち、有用なワクチン株変異型のエピトープを弱毒化ウイルス中に組み入れることができる。あるいはまた、他のウイルスまたは非ウイルス病原体由来の抗原を含む、完全に外来性のエピトープを弱毒株中に組み入れることができる。例えば、HIV（gp160、gp120、gp41）等の非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌若しくは菌類の抗原、または腫瘍抗原を、弱毒株中に組み入れることができる。あるいはまた、in vivoにおけるウイルスの向性（tropism）を変えるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化ウイルス中に組み入れることができる。
【００３９】
別の実施形態において、逆遺伝学技術及び再配列技術を組み合わせて使用して、セグメントRNAウイルス中に所望のエピトープを有する弱毒化ウイルスを操作することができる。例えば、（自然選択、突然変異誘発、または逆遺伝学技術によって作製された）弱毒化ウイルス、及び（自然選択、突然変異誘発、または逆遺伝学技術によって作製された）所望のワクチンエピトープを有する株を、セグメントゲノムの再配列を許容する宿主に同時感染させることができる。次いで、弱毒表現型及び所望のエピトープの双方を示す再配列体を選択することができる。
【００４０】
別の実施形態においては、突然変異させるべきウイルスはDNAウイルス（例えばワクシニア、アデノウイルス、バキュロウイルス）または(+)鎖RNAウイルス（例えばポリオウイルス）である。こうした場合、当分野において周知の組み換えDNA技術を使用することができる（例えば、それぞれ参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Paolettiの米国特許第4,769,330号及びSmithの米国特許第4,215,051号を参照すること）。
【００４１】
本発明に従って、限定するものではないが、以下の表２に示すファミリーを含む、いかなるウイルスに対しても、遺伝子操作を行うことができる。
【００４２】
【表２】
使用した略号：ds＝二本鎖；ss＝一本鎖；包膜型＝宿主細胞膜由来の外部脂質二重膜を有するもの；(+)センスゲノム＝RNAウイルスの場合、リボソームで直接翻訳されるヌクレオチド配列から構成されるゲノム、＝DNAウイルスの場合、mRNAと同じヌクレオチド配列から構成されるゲノム；(-)センスゲノム＝(+)センス鎖に相補的なヌクレオチド配列から構成されるゲノム。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明はNS1遺伝子産物の欠失及び／または末端切断を有する、遺伝子操作されたインフルエンザウイルスに関する。インフルエンザＡ及びＢのNS1変異体が特に好ましい。一つのアプローチにおいては、NS1遺伝子産物のアミノ末端領域部分が保持され、NS1遺伝子産物のＣ末端領域部分が欠失している。特定の望ましい突然変異は、適当なコドンにおける核酸の挿入、欠失、または突然変異によって行うことができる。特に、末端切断型NS1タンパク質は、野生型NS1遺伝子産物の1-60のアミノ酸、1-70のアミノ酸、1-80のアミノ酸、1-90のアミノ酸（Ｎ末端のアミノ酸が１である）、及び好ましくは90個のアミノ酸を有し；1-100のアミノ酸、及び好ましくは99個のアミノ酸；1-110のアミノ酸；1-120のアミノ酸；または1-130のアミノ酸、及び好ましくは124個のアミノ酸を有する。
【００４４】
本発明はまた、NS1タンパク質の末端切断または改変によってNS1遺伝子産物が改変されて変異体ウイルスに以下の表現型：ウイルスが６〜７日齢の鶏卵等の非伝統的培養基において高力価まで増殖する能力、またはウイルスが宿主のインターフェロン応答を誘導する能力、を付与するような、遺伝子操作されたいずれのインフルエンザウイルスにも関する。インフルエンザＡウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、NS1末端切断を有するウイルスが含まれる。
【００４５】
本発明は、弱毒表現型を有する天然の変異体インフルエンザウイルスＡまたはＢ、並びに弱毒表現型に関係するような突然変異を含むように操作されたインフルエンザウイルス株の使用を含む。インフルエンザＡウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、124アミノ酸のNS1を有するウイルスが含まれる（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Nortonら, 1987, Virology 156:204-213）。インフルエンザＢウイルスにおいては、これらには、限定するものではないが、Ｎ末端由来の110アミノ酸を含むNS1末端切断変異体を有するウイルス（B/201）（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Nortonら, 1987, Virology 156:204-213）、及びＮ末端由来の89アミノ酸を含むNS1末端切断変異体を有するウイルス（B/AWBY-234）（参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Tobitaら, 1990, Virology 174:314-19）が含まれる。本発明は、NS1/38、NS1/80、NS1/124に類似の天然の突然変異体（Egorovら, 1998, J. Virol. 72(8):6437-41）、並びに天然の突然変異体、A/Turkey/ORE/71、B/201またはB/AWBY-234の使用を包含する。本発明は遺伝子工学的に作製されたＡ型またはＢ型インフルエンザウイルスを含み、当該遺伝子工学的に作製されたウイルスのゲノムはNS1遺伝子内に、天然の突然変異体であるNS1/80、NS1/124、A/Turkey/ORE/71、B/201またはAWBY-234において見受けられるNS1変異に対応する変異を含む。ただし、本発明は以下のインフルエンザ突然変異体を天然にあるがままに含まない：A/Turkey/ORE/71、B/201およびAWBY-234。
【００４６】
弱毒化インフルエンザウイルスを、他のワクチン株の抗原を発現するように更に遺伝子操作することができる（例えば逆遺伝学または再配列を使用して）。あるいはまた、弱毒化インフルエンザウイルスを、遺伝子操作されたウイルスを用いた逆遺伝学または再配列を使用して、完全に外来性のエピトープ（例えば他の感染性病原体の抗原、腫瘍抗原、またはターゲッティング抗原）を発現するように操作することができる。NS RNAセグメントは８種のウイルスRNAの中で最も短いものであるため、NS RNAが他のウイルス遺伝子より長い異種配列の挿入に耐えることは可能である。更に、NS RNAセグメントは感染細胞における高レベルのタンパク質合成を指令するものであり、外来性抗原の挿入に理想的なセグメントとなることが示唆される。しかしながら、本発明に従って、インフルエンザウイルスの８個のセグメントのいずれも、異種配列の挿入に使用することができる。例えば、表面抗原提示が望まれる場合には、例えばHAまたはNA等の構造タンパク質をコードするセグメントを使用することができる。
【００４７】
5.2 宿主限定に基づく選択系
本発明は、天然の変異体、自然発生的変異体（すなわち、ウイルス増殖中に発生した変異体）、突然変異を起こさせた天然の変異体、再配列体（リアソータント(reassortants)）および／または遺伝子工学的に作られたウイルスのいずれから得られたものであろうと、所望の表現型を有するウイルス（すなわち、IFN アンタゴニスト活性を少ししかまたは全く有しないウイルス）を選択する方法を包含する。かかるウイルスはIFN 欠損宿主系対IFN 感応宿主系における増殖を比較する示差増殖アッセイにおいて最も良くスクリーニングされうる。IFN 欠損系対IFN 感応系においてより良好な増殖を示すウイルス、好ましくはIFN 感応系に比較してIFN 欠損系で少なくとも１log より力価が大きくなるまで増殖するウイルスが選択される。
【００４８】
あるいはまた、ウイルスはIFN アッセイ系例えばレポーター遺伝子発現がIFN応答性プロモーターにより制御されるものである転写ベースアッセイ系を用いてスクリーニングされうる。感染細胞対未感染細胞におけるレポーター遺伝子発現を測定して、IFN 応答を効率的に誘導するがしかしIFN 応答に対して拮抗しえないウイルスを同定することができる。しかしながら好ましい実施形態においては、示差増殖アッセイは所望される表現型を有するウイルスを選択するのに使用されるが、これは、用いられる宿主系（IFN 感応対IFN 欠損）は適切な選択圧を適用するからである。
【００４９】
例えば、（力価により測定して）ウイルスの増殖はIFN およびIFN 応答の構成成分を発現する種々の細胞、細胞系または動物モデル系対IFN またはIFN 応答の構成成分を欠く細胞、細胞系または動物モデル系において比較できる。この目的には、（IFN 欠損性である）VERO細胞としての細胞系におけるウイルスの増殖対( IFN 感応である)MDCK細胞におけるウイルスの増殖を比較できる。あるいはまた、IFN 欠損細胞系はIFN 系に欠けるよう品種改良または遺伝子工学的に操作された動物（例えばSTAT1-/-突然変異体マウス）から誘導および樹立できる。かかる細胞系におけるウイルスの増殖を、例えば野性型動物（例えば野性型マウス）に由来するIFN 感応細胞に比較して測定できる。さらにもう一つの実施形態においては、IFN 感応であって野性型ウイルスの増殖を支持することが知られている細胞系を操作してIFN 欠損となすこともできる（例えばSTAT1, IRF3, PKRなどをノックアウトすることによる）。細胞系におけるウイルスの増殖に関して当業界でよく知られた技術を用いることができる（例えば、下記実施例を参照されたい）。標準的なIFN 感応細胞系対IFN 欠損性の遺伝子操作細胞系におけるウイルスの増殖を比較できる。
【００５０】
動物系も使用できる。例えば、インフルエンザに関しては、若い、IFN 欠損性の孵化卵例えば約６〜約８日齢のものにおける増殖を、より年取った、IFN 感応卵例えば約10〜約12日齢のものにおける増殖と比較できる。この目的には、卵における感染および増殖に関して当業界で良く知られた技術を使用できる（例えば、下記実施例を参照されたい）。あるいはまた、IFN 欠損性STAT1-/-マウスにおける増殖をIFN 感応野性型マウスと比較することもできる。さらに他の代替例では、例えばSTAT1-/-トランスジェニック家禽により生産されたIFN欠損性の孵化卵における増殖を野性型家禽により生産されたIFN 感応卵における増殖と比較できる。
【００５１】
しかしながら、スクリーニング目的には、遺伝子操作された系の代わりに一過性IFN 欠損系を使用できる。例えば、宿主系を、IFN 生産および／またはIFN 応答の構成成分を阻害する化合物（例えば、薬物、IFN に対する抗体、IFN レセプターに対する抗体、PKR の阻害剤、アンチセンス分子およびリボザイム等）で処理することができる。ウイルスの増殖はIFN 感応な未処理対照対IFN 欠損性処理系において比較できる。例えば、IFN 感応である、より日齢の高い卵を、スクリーニング予定のウイルスでの感染に先立ちかかる薬物で予め処理することができる。増殖を同じ日齢の未処理対照卵で得られたそれと比較する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法は、IFN アンタゴニスト活性が破壊されたものである突然変異体ウイルスを、突然変異体ウイルスのIFN 欠損環境中での増殖能と比較してその突然変異体ウイルスがIFN 応答性環境中で増殖できないことにより同定するための簡単で容易なスクリーニングを提供するものである。本発明のスクリーニング方法はまた、突然変異体ウイルスの、IFN 応答性例えば10日齢の孵化卵またはMDCK細胞およびIFN 欠損性環境例えば６〜７日齢の孵化卵またはVero細胞の両方における増殖能を測定することにより、IFN 拮抗体活性が変更されてはいるが破壊されてはいない突然変異体ウイルスを同定するのにも使用できる。６〜７日齢の卵に比較して10日齢の卵において少なくとも１log 低い力価を示すインフルエンザウイルスはそれらのIFN 応答阻害能が損なわれていると見なされよう。もう一つの例では、10日齢の卵（これは中程度のIFN 応答に達する）に比較して12日齢の卵（これは高いIFN 応答に達する）で少なくとも１log 低い力価を示すインフルエンザウイルスはそれらのIFN 応答拮抗能が部分的に損なわれていると見なされ、魅力的なワクチン候補と考えられる。
【００５３】
本発明の選択方法はまた、IFN 応答を誘導するこれら突然変異体ウイルスの同定をも包含する。本発明の選択方法によれば、IFN 応答の誘導は、突然変異体ウイルスでの感染またはIFN 発現および／またはIFN 応答に関与するトランスアクチベーターの活性化に続いてIFN により誘導されたIFN 発現または標的遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現のレベルをアッセイすることにより測定できる。
【００５４】
本発明の選択系のさらにもう一つの実施形態においては、IFN 応答の誘導は試験突然変異体ウイルス例えばIRF-3 （これは２本鎖ＲＮＡに応答して燐酸化される）での感染に続くIFN 経路の構成分の燐酸化状態を測定することにより判定できる。I型IFN に応答して、Jak1キナーゼおよびTyK2キナーゼ、IFN レセプターのサブユニット、STAT1 およびSTAT2 が速やかにチロシン燐酸化される。従って、突然変異体ウイルスがIFN 応答を誘導するか否かを判定するためには、細胞例えば293 細胞を試験突然変異体ウイルスで感染させ、感染に続き細胞を溶解させる。Jak1キナーゼまたはTyK2キナーゼのようなIFN 経路構成成分が特異的なポリクローナル血清または抗体を使用して感染細胞溶解物から免疫沈殿され、そしてそのキナーゼのチロシン燐酸化状態が抗ホスホチロシン抗体を用いるイムノブロットアッセイにより判定される( 例えば、Krishnan et. al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305を参照されたい)。突然変異体ウイルスでの感染に続くIFN 経路の構成成分のいずれかの燐酸化状態が増強されていることはその突然変異体ウイルスによるIFN 応答の誘導を示していよう。
【００５５】
本発明のさらにもう一つの実施形態においては、本発明の選択系はウイルス感染例えばIRF3、STAT1 、STAT2 などに応答して誘導された特異的なＤＮＡ配列への結合能または転写因子の転位の測定をも包含する。特に、STAT1 およびSTAT2 はI型IFN に応答して、燐酸化され細胞質から核に転位される。特異的なＤＮＡ配列を結合する能力または転写因子の転位は当業者に知られた技術例えばエレクトロモビリティゲルシフトアッセイ、細胞染色、等により測定できる。
【００５６】
本発明の選択系のさらに他の実施形態においては、IFN 応答の誘導は試験突然変異体ウイルスでの感染に続きIFN 依存性転写活性化を測定することによって判定できる。この実施形態においては、IFN によって誘導されることが知られた遺伝子例えば、Mx, PKR, 2-5- オリゴアデニレートシンセターゼ、主要組織適合遺伝子複合体(MHC) クラスＩ等の発現が当業者に知られた技術（例えばノーザンブロット、ウエスタンブロット、ＰＣＲ等）により分析されうる。あるいはまた、ヒト胎児性腎細胞またはヒト骨肉腫細胞のような試験細胞を操作して、インターフェロン刺激された応答エレメント例えばISG-54K 遺伝子のIFN 刺激プロモーターの制御の下にルシフェラーゼレポーター遺伝子またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT) レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を一時的または構成的に発現させる（Bluyssen et. al., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402)。細胞を試験突然変異ウイルスで感染させ、そしてレポーター遺伝子の発現レベルを未感染細胞または野性型ウイルス感染細胞におけるそれと比較する。試験ウイルスでの感染に続くレポーター遺伝子の発現レベルの増大はその試験突然変異ウイルスがIFN 応答を誘導することを示していよう。
【００５７】
さらにもう一つの実施形態においては、本発明の選択系は試験突然変異ウイルスに感染させた細胞または卵からの抽出物がウイルス感染に対する防御活性を付与しうるかどうか測定することによるIFN 誘導の測定をも包含する。より詳細には、10日齢孵化鶏卵のグループを試験突然変異ウイルスまたは野性型ウイルスで感染させる。感染約15から20時間後、尿液を採取しそして例えばCEF 細胞のような組織培養細胞におけるVSV 感染に対する防御活性のある最大希釈度を測定することによりIFN 活性について試験する。
【００５８】
5.3 インターフェロン欠損増殖培養基におけるウイルスの増殖
本発明はウイルス増殖のための新規方法および培養基(substrate)に関するものである。本発明はIFN 欠損培養基およびかかる培養基中におけるウイルス増殖方法に関する。特に本発明は、それらがか弱い状態にあるゆえおよび尿膜腔が比較的小さいゆえにウイルスの増殖に通常は使用されないものである未成熟の孵化卵例えば10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵においてウイルスを増殖させる方法に関する。本発明によれば、未成熟の孵化卵とは自然の経過として10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵が包含される。本発明の未成熟の孵化卵はまた、例えばインキュベーション温度の変化、薬剤での処理、または卵の発達遅延をもたらしてIFN 系が10から12日齢卵に比較して充分には発達していないような任意の他の変更のような、成長条件を変更した結果として10日齢までかそれより小さい未成熟卵に人工的に擬した卵をも包含する。本発明は、セグメント化または非セグメント化ウイルスを含む（−）鎖ＲＮＡウイルス、例えばパラミクソウイルス（例えばニューカッスル病ウイルス、PIV）、ラブドウイルス、狂犬病ウイルス、オルトミクソウイルス（例えばＡ型およびＢ型インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス（bunyavirus）、アレナウイルス；（＋）鎖ＲＮＡウイルス（例えばレトロウイルス）；ＤＮＡウイルス（例えばポックスウイルス）を包含するがそれらに限定されない任意のウイルスをかかる非慣用の増殖培養基中で増殖させる方法に関する。一実施形態において、ウイルスはＣ型インフルエンザウイルスではない。
【００５９】
本発明の方法によれば、未成熟の孵化卵中で増殖しうるウイルスは天然に存在する株、変異体、突然変異体、突然変異させたウイルス、リアソータント(reassortants)および／または遺伝子工学的に作られたウイルスから選択される。本発明方法は、10日齢まで、６から９日齢の卵中で、好ましくは適切な増殖条件を用いてウイルスを増殖させ（例えば、下記６節に示される増殖条件を参照されたい）そして子孫ウイルスを回収することを包含する。未成熟の孵化卵好ましくは６から９日齢の卵中でのウイルスの増殖を包含する本発明方法は、ワクチン製剤に使用するのに好適なウイルスを増殖させるのに特に魅力的である。
【００６０】
本発明はまた、IFN アンタゴニスト活性が変更された天然に存在するウイルスまたは遺伝子操作された突然変異体ウイルスの増殖および単離のための方法およびIFN 欠損培養基をも包含する。弱毒化された突然変異体ウイルスの増殖を支持するのに使用できるIFN 欠損培養基には、それらに限定されるものではないが、IFN 欠損性の天然に存在する細胞、細胞系、動物または孵化卵例えばベロ(Vero)細胞、若い孵化卵；IFN 欠損であるように操作された組換え細胞または細胞系例えばSTAT1 ノックアウトマウス由来のIFN 欠損細胞系または他の同様に遺伝子操作されたトランスジェニック動物；IFN 欠損性の鳥特にIFN 欠損性であるように品種改良された群れまたはトランスジェニック鳥類（例えばSTAT1 ノックアウト）を含む家禽（例えば鶏、アヒル、七面鳥）から得られた孵化卵が包含される。あるいはまた、宿主系、細胞、細胞系、卵または動物はまた、IFN 系のインヒビターをコードするトランスジーンを発現するように遺伝子操作することもでき、例えばＤＮＡ結合ドメイン、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、IFN 産生インヒビター、IFN シグナル伝達インヒビターおよび／またはIFN により誘導される抗ウイルス遺伝子のインヒビターを欠くSTAT1 のような優性陰性（dominant-negative）突然変異体である。IFN 欠損性であるように品種改良されたかまたは遺伝子操作された動物は幾分か免疫妥協性であろうしそして制御された無疾病環境中に保たれねばならないことは認識されるべきである。従って、交配中のめんどり、アヒル、七面鳥等の群れのようなトランスジェニックIFN 欠損性動物を感染原因物に曝す危険を制限するために（食餌性抗生物質の使用を含む）適切な手段がとられねばならない。あるいはまた、宿主系例えば細胞、細胞系、卵または動物を、IFN 産生および／またはIFN 経路を阻害する化合物、例えば薬物、抗体、アンチセンス分子、STAT1 遺伝子を標的とするリボザイム分子、および／またはIFN により誘導された抗ウイルス遺伝子で処理することもできる。一実施形態において、インターフェロン欠損培養基はVero細胞でもSTAT1（−）細胞系でもない。
【００６１】
本発明によれば、未成熟孵化鶏卵とは、自然の経過として10日齢までかそれより小さい卵、好ましくは６から９日齢の卵；および例えばインキュベーション温度の変化、薬剤での処理、または卵の発達遅延をもたらしてその卵のIFN 系が10から12日齢卵に比較して完全には発達していないような任意の他の変更のような、成長条件を変更した結果として10日齢までかそれより小さい未成熟卵に人工的に擬した卵を包含する。
【００６２】
5.3.1 天然のIFN 欠損培養基
一つの実施形態においては、本発明はまだIFN 系を発達させていない未成熟の孵化卵のような非慣用的培養基中で天然に存在するウイルスおよび遺伝子操作した突然変異体ウイルスを増殖させることに関する。未成熟の孵化卵はそれらがか弱い状態にあるゆえおよび尿膜体積が比較的小さいゆえにウイルスの増殖には通常は使用されない。本発明は突然変異体ウイルスを10日齢より小さい孵化卵中で、好ましくは突然変異体ウイルスを８日齢の孵化卵中で、そして最も好ましくは６〜８日齢卵中で増殖させることを包含する。
【００６３】
本発明は自然にはIFN 経路を有しないかまたはIFN 欠損性経路を有するかまたはIFN 系に欠陥のある（例えば野性型細胞に比較してIFN 発現レベルが低い）細胞および細胞系においてIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスを増殖させそして単離する方法をも包含する。特に好ましい実施形態においては、本発明はIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスをVero細胞中で増殖させる方法に関する。
【００６４】
5.3.2 遺伝子操作されたIFN 欠損培養基
本発明はIFN アンタゴニスト活性が変更された突然変異体ウイルスを遺伝子操作されたIFN 欠損培養基中で増殖および単離する方法に関する。本発明は、IFN 欠損卵を生むであろうIFN 系にとって必須である遺伝子例えばSTAT1 が突然変異されたトランスジェニック鳥類を包含する。本発明はさらに、優性陰性の転写因子を発現する鳥類トランスジェニック、例えばＤＮＡ結合ドメイン、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、IFN 産生インヒビター、IFN シグナル伝達インヒビター、およびIFN に応答して誘導される抗ウイルス遺伝子のインヒビターを欠くSTAT1 、をも包含する。IFN 欠損性トランスジェニック鳥類からの卵を使用する利点は、それらのサイズがより大きいゆえにより安定でより大きい容量を有する慣用の10日齢卵をウイルスの増殖に使用できることである。さらにもう一つの実施形態は、細胞系をIFN 欠損性であるように遺伝子操作できることである。本発明は、IFN 合成、IFN 経路にとって必須である遺伝子、および／またはIFN により誘導された抗ウイルス遺伝子（類）が突然変異されている細胞系、例えばSTAT1 、をも包含するものである。
【００６５】
本発明は組換え細胞系または動物、特にIFN 経路にとって必須である遺伝子の１つまたはそれ以上、例えばインターフェロンレセプター、STAT1 などが破壊されている、すなわち「ノックアウト」である鳥類を提供するものである。組換え動物はいずれの動物でもよいが、好ましい実施形態では鳥類例えばニワトリ、七面鳥、めんどり、アヒル、等である。（例えば、鳥類トランスジェニックの生産に関する総説に関しては、Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, et. al., 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stern, C.D., 1996, Curr Top Microbiol. Immunol 212: 195-206;および Shuman, 1991, Experientia 47: 897を参照されたい。これらのそれぞれはそのすべてがここに参考文献としてとりこまれる）。かかる細胞系または動物はその細胞または動物の染色体上の遺伝子の破壊に関する当業界で知られた任意の方法により生成させることができる。かかる技術には、それらに限定されるものではないが、生殖核マイクロインジェクション(Hoppe& Wagner, 1989, U.S. Pat. No.4,873,191) 、生殖系へのレトロウイルス仲介遺伝子トランスファー(Van der Putten et. al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.., USA 82: 6148-6152)、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング(Thompson et. al., 1989, Cell 56: 313)、胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803)、および精子仲介遺伝子トランスファー(Lavitrano et. al., 1989, Cell 57: 717) 等が包含される。かかる技術の総説に関しては、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171（これはそのすべてがここに参考文献として取り込まれる）を参照されたい。
【００６６】
特に、STAT1 ノックアウト動物はその染色体中のSTAT1 遺伝子と（好ましくは異種配列例えば抗生物質耐性遺伝子の挿入により）生物学的に不活性とされた外因性STAT1 遺伝子との間の相同性組換えを促進することにより生産できる。マウスゲノム中の遺伝子を破壊させる相同性組換え方法は、例えばCapecchi (1989, Science 244:1288) およびMansour ら(1988, Nature 336:348-352)に記載されている。
【００６７】
簡単に言うと、STAT1 ゲノムクローンの全てまたはその一部分をノックアウト細胞または動物と同じ種からのゲノムＤＮＡから単離する。STAT1 ゲノムクローンはゲノムクローンの単離に関して当業界で知られた任意の方法により単離できる（例えば、Meraz ら、1996, Cell 84: 431-442; Durbinら、1996, Cell 84: 443-450参照、およびここに引用されている文献類に記載されている配列のようなSTAT1 配列に由来するプローブを用いてゲノムライブラリーをプローブすることによる）。ゲノムクローンがひとたび単離されると、そのクローンの全てまたはその一部分を組換えベクター中に導入する。ベクター中に導入されたクローンの一部分がSTAT1 遺伝子のエキソンの少なくとも一部分、すなわちSTAT1 タンパク質コード配列、を含有するのが好ましい。STAT1 配列に対して相同性ではない配列、好ましくは陽性の選択マーカー例えば抗生物質耐性遺伝子をコードする遺伝子を次にSTAT1 遺伝子エキソン中に導入する。選択マーカーは好ましくはプロモーター、より好ましくは構成性プロモーターに作動可能に連結される。非相同性配列はSTAT1 コード配列のSTAT1 活性を破壊させるであろう任意の場所、例えば点突然変異または他の突然変異がSTAT1 タンパク質機能を不活性化することが証明されている位置に導入される。例えば、それらに限定されるわけではないが、キナーゼドメインの全部または一部分を含有するSTAT1 タンパク質の一部分をコードする配列（例えばキナーゼドメインの少なくとも50, 100, 150, 200 または 250アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）中に非相同性配列を挿入することができる。
【００６８】
陽性の選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子(neo遺伝子) またはハイグロマイシン耐性遺伝子(hygro遺伝子)が好ましい。プロモーターは当業界で知られた任意のプロモーターであることができる。例をあげれば、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼ(PGK) プロモーター(Adra et. al., 1987, Gene 60: 65-74)、PolII プロモーター(Soriano et. al., 1991, Cell 64: 693-701) 、または胚由来幹細胞中での発現用に設計された合成プロモーターであるMC1 プロモーター(Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512) であることができる。抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーの使用により、ターゲティングするベクターを取り込んだ細胞の選択が可能となる（例えば、neo 遺伝子産物の発現によりG418に対する耐性が付与され、そしてhygro 遺伝子産物の発現によりハイグロマイシンに対する耐性が付与される）。
【００６９】
好ましい実施形態においては非相同性と反対に、ベクターの相同組換えのための逆選択工程用の負に選択可能なマーカーがSTAT1 ゲノムクローン挿入物の外側に挿入される。例えば、かかる陰性の選択マーカーはHSV チミジンキナーゼ遺伝子(HSV-tk)であり、その発現により細胞がガンシクロビル(ganciclovir) に対して感受性となる。陰性の選択マーカーは、それらに限定されるわけではないがPGK プロモーター、PolII プロモーターまたは MC1プロモーターのようなプロモーターの制御の下にあるのが好ましい。
【００７０】
相同組換えが起こると、STAT1 遺伝子に対して相同性であるベクターの一部分、ならびにSTAT1 遺伝子配列内の非相同性インサートが染色体中のSTAT1 遺伝子中に取り込まれ、そしてベクターの残りは失われる。従って、陰性の選択マーカーはSTAT1 遺伝子と相同性である領域の外側にあるゆえ、相同組換えが起こった細胞（またはそれらの子孫）は負に選択可能なマーカーを含有しないであろう。例えば、もし陰性の選択マーカーがHSV-tk遺伝子である場合は、相同組換えが起こった細胞はチミジンキナーゼを発現せずそしてガンシクロビルへの露出を生き延びるであろう。この操作により、非相同組換え（この場合陰性の選択マーカーもSTAT1 配列および陽性の選択マーカーと共にゲノム中に取り込まれる可能性がある）に比較して相同組換えが起こった細胞の選択が可能となる。従って、非相同組換えが起こった細胞はチミジンキナーゼを発現する可能性が最も高くそしてガンシクロビルに対して感受性であろう。
【００７１】
ひとたびターゲティングベクターが調製されると、ターゲティングベクター中に存在する特有の部位に対する制限酵素を用いてベクターを直線状となし、そしてこの直線状となしたベクターを当業界で知られた任意の方法例えばエレクトロポレーションにより、胚性幹(ES)細胞中に導入する(Gossler et. al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069) 。もしターゲティングベクターが陽性の選択マーカーおよび陰性の逆選択マーカーを包含する場合は、相同組換えが起こったES細胞は選択培地中でのインキュベーションにより選択できる。例えば、選択マーカーがneo 耐性遺伝子およびHSV-tk遺伝子である場合、細胞をG418（例えば約300 μg/ml）およびガンシクロビル（例えば、約２μM）に露出させる。
【００７２】
遺伝子分類に関して当業界で知られた任意の技術、例えばそれらに限定されるわけではないが、サザンブロット分析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ES細胞のゲノム中のSTAT1 遺伝子中に破壊したSTAT1 配列が相同的に組換えられていることを確認できる。STAT1 ゲノムクローンの制限地図が知られておりそしてSTAT1 コード配列の配列が知られているので（Meraz et. al., 1996, Cell 84: 431; Durbin et. al., 1996, Cell 84: 443-450、これらに引用されている全ての参考文献を参照されたい。）、個々の制限フラグメントまたは破壊および非破壊対立遺伝子の両方からのＤＮＡから生成されたPCR 増幅産物の寸法を測定できる。従って、制限フラグメントまたはPCR 産物（そのサイズは破壊および非破壊STAT1 遺伝子の間で相違する）をアッセイすることにより、相同組換えが起こってSTAT1 遺伝子を破壊したか否か判定できる。
【００７３】
破壊したSTAT1 遺伝子座を有するES細胞は次にマイクロインジェクションにより胚盤胞中に導入でき、そして次にこの胚盤胞をルーチン技術を用いて偽妊娠（仮親）マウスの子宮中に移植することができる。移植された胚盤胞から発育した動物は破壊した対立遺伝子に関するキメラである。キメラのオスはメスと交配でき、そしてこの交配は対立遺伝子の生殖系遺伝がある特定の皮膚色の遺伝に結びつくように設計することができる。この対立遺伝子の生殖系遺伝は、前記したように、組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡのサザンブロッティングまたはPCR 分析により確認できる。
【００７４】
5.3.3 一過性IFN欠損培養基
前記細胞、細胞系、動物または卵を、IFN系を阻害する化合物で前処理することができる。本発明に従えば、IFNの合成、またはIFN系の成分の活性もしくは発現を阻害する化合物を用いて、宿主を前処理することができる。そのような化合物は、例えば、IFNの合成、またIFN、IFN受容体、IFNシグナル伝達経路中の他の標的の活性を阻害する化合物、またはIFNにより誘導された抗ウイルス遺伝子の活性を阻害する化合物である。本発明に従って用いることができる化合物の例としては、限定されるものではないが、核酸分子、抗体、ペプチド、IFN受容体のアンタゴニスト、STAT1経路の阻害剤、PKRの阻害剤などが挙げられる。本発明に従えば、核酸分子とはSTAT1などのIFN系の必須成分をコードする遺伝子を標的とするアンチセンス分子、リボザイムおよび三重らせん分子を含む。核酸分子はまた、IFN系の成分の優性ネガティブ変異体をコードするヌクレオチドをも包含する。例えば、ウイルス変異体に感染させる前に、IFN受容体のトランケートされたシグナリング不能な変異体をコードするDNAで前記細胞をトランスフェクトすることができる。
【００７５】
IFN経路を阻害するために本発明に従って用いることができる優性ネガティブ変異体としては、Jak1、Tyk2のキナーゼ欠損型、またはDNA結合ドメインを欠損した転写因子STAT1およびSTAT2が挙げられる(例えば、Krishnanら、1997、Eur. J. Biochem. 247:298-305を参照されたい)。
【００７６】
5.4 ワクチン製剤
本発明は、細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれている、弱毒(−)鎖RNAウイルスおよび適当な賦形剤を含むワクチン製剤を包含する。該ワクチン製剤に用いられるウイルスは、天然の突然変異体もしくは変異体、突然変異させたウイルスまたは遺伝子工学的に操作したウイルスから選択することができる。セグメント化RNAウイルスの弱毒株を、再集合技術により、または逆遺伝学的手法と再集合技術の組み合わせにより作製することもできる。天然の変異体としては、自然界から単離されたウイルスならびにウイルスの増殖の間に自然発生的に生じた変異体が挙げられるが、これらは細胞性IFN応答に拮抗する能力が損なわれている。該弱毒ウイルス自体を、該ワクチン製剤中の活性成分として用いることもできる。あるいは、該弱毒ウイルスを、組換え製造されたワクチンのベクターまたは「骨格」として用いることができる。この目的のために、逆遺伝学的手法などの組換え技術(または、セグメント化ウイルスのためには、逆遺伝学的手法と再集合技術の組み合わせ)を用いて、突然変異を遺伝子工学的に作製したり、または外来抗原を弱毒ウイルスに導入してワクチン製剤に用いることができる。このようにして、株変異体あるいは完全に別の感染性因子もしくは疾患の抗原に対する免疫感作用にワクチンを設計することができる。
【００７７】
実際には、任意の異種遺伝子配列を本発明のウイルス中へ構築してワクチンに用いることができる。好ましくは、種々のどのような病原体に対しても防御免疫応答を誘導するものであるエピトープ、または中和抗体に結合する抗原を、ウイルスにより、またはその一部として発現させる。例えば、ワクチンに用いるために本発明のウイルス中へ構築することができる異種遺伝子配列としては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、gp120などのヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)、ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE)、ポリオウイルスのVP1、細菌および寄生虫などの非ウイルス性病原体の抗原決定基がある。別の実施形態においては、免疫グロブリン遺伝子の全部または一部を発現させることができる。例えば、かかるエピトープを模倣した抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のウイルス中へ構築することができる。さらに別の実施形態においては、腫瘍関連抗原を発現させることができる。
【００７８】
生の組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンを製剤化することができる。生ワクチンが好ましい。何故なら、宿主における増殖は、自然の感染において生ずるのと同様の種類および量の延長された刺激をもたらし、従って実質的な長期間持続する免疫をもたらすからである。かかる生の組換えウイルスワクチン製剤の製造は、細胞培養またはニワトリ胚の尿膜におけるウイルスの増殖およびその後の精製を含む従来の方法を用いて達成することができる。
【００７９】
ワクチン製剤は、NS1または類似遺伝子中に突然変異を有する、遺伝子工学的に作製された(−)鎖RNAウイルス（例えば、限定されるものではないが、下記の実施例に記載されるトランケートされたNS1インフルエンザ変異体）を含んでもよい。それらは、A型インフルエンザのA/turkey/Ore/71天然変異体、またはB型インフルエンザの天然変異体であるB/201およびB/AWBY-234などの天然変異体を用いて製剤化することもできる。生ウイルスワクチンとして製剤化した場合、用量当たり約104 pfu〜約5x106 pfuの範囲を用いるべきである。
【００８０】
様々な方法を用いて上記のワクチン製剤を導入することができる。これらの方法としては、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンを設計する対象の病原体の自然感染経路を通ずるか、または親弱毒ウイルスの自然感染経路を通じてウイルスワクチン製剤を導入するのが好ましい。生のインフルエンザウイルスワクチン調製物を用いる場合、インフルエンザウイルスの自然感染経路を通じて該製剤を導入するのが好ましい。大量の分泌および細胞性免疫応答を誘導するインフルエンザウイルスの能力を有利に利用することができる。例えば、インフルエンザウイルスによる気道感染は、泌尿器系などにおける強力な分泌性免疫応答と共に、特定の疾患を引き起こす因子に対する付随性防御を誘導し得る。
【００８１】
変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、一回投与することができる。あるいは、変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、2〜6ヶ月の投与間隔で2回または3回投与することができる。あるいは、変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104 〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明のワクチンを、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに必要な回数だけ投与することができる。
【００８２】
5.5 医薬組成物
本発明は、抗ウイルス剤もしくは抗腫瘍剤またはIFN感受性疾患に対する薬剤として用いられる変化したIFNアンタゴニスト活性を有する変異体ウイルスを含む医薬組成物を包含する。該医薬組成物は、抗ウイルス性予防薬としての有用性を有し、感染の危険のある個体またはウイルスに曝露されることが予想される個体に投与することができる。例えば、子供が、感冒に罹った数人の級友に曝される学校から家に帰ってくるという事象では、親は、本発明の抗ウイルス性医薬組成物を、自分自身、その子供、および家族の他のメンバーに投与して、ウイルス感染およびそれに続く病気を予防できるであろう。特定の感染性疾患(例えば、A型肝炎ウイルス、マラリアなど)が流行している世界の地域に旅行する人を治療することもできる。
【００８３】
あるいは、該医薬組成物を用いて、例えば、癌を有する被験体または新生物もしくは癌を発生する危険性の高い被験体において、腫瘍を治療したり、腫瘍形成を予防することができる。例えば、癌を有する被験体を処置してさらなる腫瘍形成を予防することができる。あるいは、発癌物質に曝露されるか、または曝露されることが予想される被験体を処置することができる。汚染物質(例えば、アスベスト)に曝露され得る環境浄化に関与する個体を処置することもできる。あるいは、放射線に曝露される個体(例えば、高線量の放射線に曝露された被験体または発癌性の薬剤を摂取する必要がある被験体)を、曝露の前後に処置することができる。
【００８４】
抗腫瘍剤としての本発明の弱毒ウイルスの使用は、IFNアンタゴニスト遺伝子に欠失がある弱毒インフルエンザウイルス変異体がマウスにおいて腫瘍形成を減少させることができるという本発明者らの発見に基づくものである。本発明の抗腫瘍特性は、少なくとも部分的にはIFNおよびIFN応答を誘導するそれらの能力に関係し得る。あるいは、本発明の弱毒ウイルスの抗腫瘍特性は、腫瘍細胞中で特異的に増殖し、腫瘍細胞を殺傷するその能力に関係し得るが、腫瘍細胞の多くはIFN系に欠陥を有することが知られている。抗腫瘍特性を担う分子機構に関わりなく、本発明の弱毒ウイルスを用いて、腫瘍を治療したり、腫瘍形成を予防することができる。
【００８５】
本発明はさらに、変化したIFNアンタゴニスト表現型を有する変異体ウイルスを包含し、体内の特定の器官、組織および／または細胞を標的化し、局所的な治療効果または予防効果を誘導することができる。かかる方法の１つの利点は、本発明のIFN誘導性ウイルスは、腫瘍位置などの特定の部位を標的としており、毒性作用を有するIFNを全身的に誘導するのではなく治療効果のために部位特異的な様式でIFNを誘導するということである。
【００８６】
本発明の変異IFN誘導性ウイルスを、本明細書に記載の方法を用いて遺伝子操作して、該ウイルスを特定の部位に標的化するタンパク質またはペプチドを発現させることができる。好ましい実施形態においては、該IFN誘導性ウイルスは腫瘍部位を標的とする。かかる実施形態においては、該変異体ウイルスを遺伝子操作して、腫瘍特異的抗原を認識する抗体の抗原結合部位を発現させ、従ってIFN誘導性ウイルスを腫瘍に標的化することができる。さらに別の実施形態においては、標的化される腫瘍(エストロゲン受容体を発現する乳房腫瘍または卵巣腫瘍など)がホルモン受容体を発現する場合、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、適当なホルモンを発現させることができる。さらに別の実施形態においては、標的化される腫瘍が増殖因子、例えばVEGF、EGFまたはPDGFに対する受容体を発現する場合、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、適当な増殖因子またはその一部を発現させることができる。従って、本発明に従えば、該IFN誘導性ウイルスを遺伝子操作して、酵素、ホルモン、増殖因子、抗原もしくは抗体などのペプチド、タンパク質を含む任意の標的遺伝子産物を発現させることができ、それらは抗ウイルス活性、抗細菌活性、抗微生物活性、または抗癌活性を必要とする部位に該ウイルスを標的化するように機能する。
【００８７】
導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。本発明の医薬組成物は、任意の好都合な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層(例えば、経口粘膜、直腸および腸粘膜など)を通した吸収により投与することができ、また他の生物活性物質と共に投与することができる。投与は全身的または局所的であってよい。さらに、好ましい実施形態においては、本発明の医薬組成物を任意の適当な経路により肺に導入するのが望ましい。例えば、吸入器または噴霧器およびエアロゾル剤を含む製剤の使用による肺投与を用いることもできる。
【００８８】
特定の実施形態においては、治療を必要とする領域に局所的に本発明の医薬組成物を投与するのが望ましい。これは、例えば、限定されるものではないが、外科手術中の局所注入、局所適用（例えば、カテーテル、座剤、または移植片を用いた注入により、外科手術後の創傷包帯と併せて行う）によって達成することができる。この移植片は、多孔性、非多孔性またはゼラチン質の材料であり、シアラスティック(sialastic)膜などの膜、または繊維を含む。１実施形態においては、投与は、悪性腫瘍または新生物性もしくは前新生物性組織の部位(または前部位)に直接注入することにより行ってもよい。
【００８９】
さらに別の実施形態においては、該医薬組成物を制御放出系により送達することができる。１実施形態においては、ポンプを用いることができる(Langer、前掲;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldら、1980, Surgery 88:507; Saudekら、1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。別の実施形態においては、ポリマー材料を用いることができる(Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall(編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levyら、1985, Science 228:190; Duringら、1989, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら、1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい)。さらに別の実施形態においては、制御放出系を該組成物の標的すなわち肺の近くに置くことができ、従って全身投与量のほんの一部だけが必要になる(例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138を参照されたい)。他の制御放出系については、Langer(1990, Science 249:1527-1533)による概説中で考察されている。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、治療上有効量の弱毒ウイルスおよび製薬上許容される担体を含む。特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の監督機関により承認されるか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知されている薬局方に記載されることを意味し、動物、特にヒトに用いるものである。用語「担体」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、該医薬組成物と共に投与される。生理食塩溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体、特に注入可能な溶液として用いることができる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。これらの組成物を座剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含有することができる。適当な製薬上の担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。かかる組成物は、好ましくは精製された形態の治療上有効量の治療剤と、適当量の担体とを含有し、被験体に適切に投与するための剤形を提供することができる。該製剤は、投与の様式に適合するべきである。
【００９１】
特定の障害または状態の治療に有効である本発明の医薬組成物の量は、該障害または状態の性質に依存するであろうが、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によってはin vitroアッセイを援用して最適な用量範囲を同定することができる。また該製剤に用いる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存するであろうが、医師の判断および各被験体の環境に応じて決定されるべきである。しかし、適当な投与用量範囲は、一般的には約104〜5x106 pfuであり、一回投与するか、または必要な回数、間隔をあけて複数回投与することができる。変化したIFNアンタゴニスト活性を有する104〜5x106 pfuの変異体ウイルスを含む本発明の医薬組成物を、鼻腔内、気管内、筋肉内、または皮下投与することができる。in vitroまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から、有効量を推定することができる。
【実施例】
【００９２】
6. 実施例：A型インフルエンザウイルスのNS1トランケーション変異体の作製および特徴づけ
6.1 材料および方法
A/PR/8/34(PR8)型インフルエンザウイルスを、10日齢の孵化鶏卵中で37℃にて増殖させた。A型インフルエンザウイルス25A-1、すなわち寒冷地適合株A/Leningrad/134/47/57由来のNSセグメントおよびPR8ウイルス由来の残りの遺伝子を含む再集合ウイルス(Egorovら、1994, Vopr. Virusol. 39:201-205; Shawら、1996, in Options of the control of influenza III, Brown(編), Hampson Webster (Elsevier Science) pp. 433-436)を、Vero細胞中で34℃にて増殖させた。該25A-1ウイルスは、哺乳動物細胞中で温度感受性であり、NS1/99トランスフェクタントウイルスのレスキューのためのヘルパーウイルスとして用いた。1μg/mlのトリプシンを含有する最少必須培地(MEM)(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)中で維持したVero細胞およびMDCK細胞を、インフルエンザウイルスの増殖のために用いた。Vero細胞は、NS1/99ウイルスの選択、プラーク精製および力価測定のためにも用いた。MDCK細胞は、10％の熱不活化ウシ胎児血清を含有するDMEM(ダルベッコの最少必須培地)中で維持した。Vero細胞は、ATM-V培地(Life Technologies, Grand Island, NY)中で増殖させた。
【００９３】
99アミノ酸のC末端トランケート形態のNS1を含有するプラスミドpT3NS1/99を、以下のように作製した。まず、T3 RNAポリメラーゼプロモーターおよびBpuAI制限部位に隣接したPR8ウイルスの完全なNS遺伝子を含有するpPUC19-T3/NS PR8を、適当なプライマーを用いて、逆転写PCR(Ochmanら、1988, Genetics 120: 621-623)により増幅した。次いで、トランケートされたNS1遺伝子を含む得られたcDNAを、リン酸化し、クレノー(Klenow)処理し、自己ライゲーションさせ、大腸菌のTG1株中で増殖させた。精製後に得られた構築物を、pT3NS1/99と命名し、配列決定により確認した。PR8ウイルスのNP、PB1、PB2およびPAタンパク質の発現のためのプラスミド(pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、およびpHMG-PA)については、以前に記載されている(Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)。pPOLI-NS-RBを、pPOLI-CAT-RT (Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)のCATオープンリーディングフレームをインフルエンザA/WSN/33(WSN)ウイルスのNS遺伝子のコード領域に由来するRT-PCR産物に置換することにより作製した。このプラスミドは、トランケートされたヒトポリメラーゼIプロモーターの制御下でWSNウイルスのNS特異的なウイルスRNAセグメントを発現する。
【００９４】
NS1/99ウイルスの作製を、リボ核タンパク質(RNP)トランスフェクション(Luytjesら、1989, Cell 59:1107-1113)により実施した。該RNPは、インフルエンザ25A-1ウイルス(Enamiら、1991, J. Virol. 65:2711-2713)の精製された核タンパク質およびポリメラーゼの存在下でBpuAIにより線状化されたpT3NS1/99からのT3 RNAポリメラーゼ転写により形成されたものである。RNP複合体を、予め25A-1ウイルスに感染させたVero細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を37℃にて18時間インキュベートし、上清を40℃にてVero細胞中で2回継代し、寒天上層培地で被覆したVero細胞中で37℃にて3回プラーク精製した。単離されたNS1/99ウイルスを、特異的プライマーを用いてRT-PCRにより分析した。野生型トランスフェクタントウイルスを以下のように作製した。35-mmディッシュ中のVero細胞を、以前に記載されたように(Pleschkaら、1996, J. Virol. 70:4188-4192)、プラスミドpHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、pHMG-PAおよびpPOLI-NS-RBでトランスフェクトした。トランスフェクション後2日目に、細胞を5x104 pfuのdelNS1ウイルスに感染させ、さらに2日間、37℃にてインキュベートした。細胞の上清を、MDCK細胞中で1回、孵化鶏卵中で2回継代した。トランスフェクタントウイルスを、卵中で限界希釈法によりクローニングした。精製したNS1/99トランスフェクタントウイルスに由来するゲノムRNAを、以前に記載されたように(Zhengら、1996, Virology 217:242-251)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。NS1/99ウイルスによるトランケートされたNS1タンパク質の発現を、NS1に対するウサギポリクローナル抗血清を用いて、標識された感染細胞抽出物を免疫沈降させることにより確認した。
【００９５】
孵化鶏卵(6、10および14日齢)の尿膜腔に、約103 pfuのPR8、NS1/99またはdelNS1(NS1遺伝子全体を欠失させた)ウイルスを接種し、37℃にて2日間インキュベートし、尿膜腔液中に存在するウイルスを血球凝集(HA)アッセイにより力価測定した。
【００９６】
5匹のBALB/cマウス(Taconic Farms)の群に、5x106 pfu、1.5x105 pfu、5x103 pfuの野生型A/PR/8/34(PR8)またはNS1/99ウイルスを鼻腔内接種した。接種は、適当なウイルスを適当数のプラーク形成単位で含有する50μlのMEMを用いて麻酔下で実施した。動物を毎日モニターし、極端な状態が観察された時に殺した。その後の実験で、全ての生存しているマウスを、4週間後に100LD50の用量の野生型PR8ウイルスでチャレンジした。全ての方法は実験動物の世話および使用に関するNIHガイドラインに従って行った。
【００９７】
6.2 結果：NS1欠失によるＡ型インフルエンザウイルスの弱毒化
出願人は以前、NS1遺伝子が欠失したＡ型インフルエンザウイルス（delNS1ウイルス）はベロ細胞などのＩ型インターフェロン（IFN）産生に欠陥がある細胞中で約107pfu/mlの力価まで増殖する能力があることを示した。しかし、このウイルスはマウス中では複製および疾病を引き起こす能力が損なわれていた（Garcia-Sastreら、1998,Virology 252:324）。対照的に、STAT1-/-マウス中ではdelNS1ウイルスは増殖してこれを殺傷することができた。これらの結果は、Ａ型インフルエンザウイルスのNS1タンパク質がＩ型IFNによって仲介される宿主の抗ウイルス応答の阻害に関与する毒性因子であることを証明している。NS1遺伝子の一部を欠失させることによって野生型とdelNS1ウイルスの中間の毒性特性を有するインフルエンザウイルスを作製することができるかどうか、そしてこれらのウイルスの中に、インフルエンザウイルスに対する弱毒化生ワクチンとして使用するための最適の特性、すなわち安定性、および弱毒化、免疫原性および孵化鶏卵などのワクチン調製に適した培養基中での増殖の間の適切なバランスを有するものがあるかどうかを判定するため、以下の実験を実施した。
【００９８】
この仮説を試験するために、野生型NS1タンパク質の230アミノ酸と共通のアミノ末端に99アミノ酸のみを含有する末端切断型NS1タンパク質の発現を指令するようにNS1遺伝子が改変されたインフルエンザA/PR/8/34（PR8）ウイルスを作製した。このウイルス（NS1-99）は、既に記載（Garcia-Sastreら、1998,Virology 252:324）されたのように、25A-1ヘルパーウイルスを使用して人工的に操作したNS遺伝子のRNPトランスフェクションによって取得した。ウイルスが感染した細胞中のNS1発現の分析から、NS1-99ウイルスのNS1タンパク質の末端切断の性質が明らかになった。
【００９９】
delNS1、NS1-99および野生型PR8ウイルスの、各種日齢の孵化鶏卵中における増殖能力を分析した。この実験の論理的根拠は、Ｉ型IFNを合成して適切な刺激の下でこれに応答する孵化卵の能力は日齢に依存するという事実に基づいている。実際、IFN誘導性および応答性の両者ともに約10日齢で開始し、その後日齢とともに対数的に増大する（Sekellickら、1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:997；SekellicおよびMarcus,1985,J.Interferon Res.5:657）。したがって、各種日齢の卵の使用は、各種ウイルスについてIFN応答を阻害する能力を試験するための独特の系を象徴する。6日、10日および14日齢の卵に約103pfuのPR8、NS1-99またはdelNS1ウイルスを接種し、37℃で２日間インキュベートし、そして尿膜腔液中に存在するウイルスを血球凝集（HA）アッセイによって力価測定した。表３に示すように、野生型ウイルスは、6日、10日および14日齢の孵化卵において同程度のHA力価まで増殖したのに対して、delNS1は6日齢の卵で検出し得るHA力価まで複製しただけだった。対照してみると、NS1-99ウイルスは、delNS1と野生型ウイルスの中間の挙動を示し、10日齢の卵では野生型ウイルスと同程度のHA力価まで増殖することができたが、14日齢の卵ではできなかった。
［表３］ 孵化鶏卵中のウイルスの複製
血球凝集力価1
ウイルス 卵の日齢： 6日 10日 14日
WT PR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N.D.3 2.048 < 2
delNS1 64 < 2 < 2
1 力価は血球凝集活性を有する最大希釈を表す。
2 野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルス
3 判定されず
【０１００】
次に、NS1-99ウイルスの弱毒化特性をマウス中で判定した。この目的のため、BALB/cマウス5匹のグループに、5×106pfu、1.5×105pfuまたは1.5×103pfuの野生型PR8またはNS1-99ウイルスを鼻腔内感染させた。次にマウスの生存について3週間モニターした。結果を表４に示す。NS1-99ウイルスは野生型ウイルスよりも少なくとも3ログ高いLD50を有していた。
【０１０１】
［表４］ マウス中のNS1-99ウイルスの弱毒化
生存体
ウイルス 感染用量（pfu）： 5×106 1.5×105 1.5×103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 野生型インフルエンザウイルスA/PR/8/34
【０１０２】
７．実施例：Ｂ型インフルエンザウイルスにおけるNS1末端切断突然変異体の作製および特性決定
７．１ 材料および方法
実験の詳細は第6.1節の場合と同様である。抗Ａ（H3N2）ウイルス抗体の存在下で、B/Yamagata/1/73（B/Yam）およびA/Aichi/2/68ウイルスを含む組織培養物中での同時感染実験から、長さがそれぞれ127アミノ酸および90アミノ酸（Ｃ末端切断されたNS1タンパク質）の２種の突然変異Ｂ型インフルエンザウイルス、B/610B5B/201（B/201）およびB/AWBY-234（Nortonら、1987 Virology 156:204；Tobitaら、1990 Virology 174:314）を誘導した。各種日齢の孵化卵中での突然変異インフルエンザウイルスの増殖を、野生型281アミノ酸NS1タンパク質を保有する親ウイルスB/Yamの場合と比較した。6日、10日および14日齢の卵に、約103pfuのB/Yam、B/201またはB/AW/BY-234ウイルスを接種し、35℃で２日間インキュベートし、そして尿膜腔液中に存在するウイルスをHAアッセイによって力価測定した。
【０１０３】
さらに、B/201およびB/AWBY-234ウイルスの弱毒化特性をマウス中で判定した。BALB/cマウス3匹のグループに、3×105pfuの野生型B/Yam、B/201またはB/AWBY-234突然変異ウイルスを鼻腔内感染させ、感染後３日目の肺中のウイルス力価を測定することによって、これらのウイルスの複製能力を判定した。その理由は野生型B/Yamはマウスにおいて外見上わかる疾病症候を誘発しないからである。
【０１０４】
７．２ 結果
［表５］ 孵化鶏卵中のＢ型インフルエンザウイルスの複製
赤血球凝集力価
ウイルス 卵の日齢： 6日 10日 14日
B/Yam 362 256 < 2
B/201 32 < 2 < 2
B/AWBY-234 8 < 2 < 2
【０１０５】
表５に示す孵化鶏卵中での突然変異および野生型Ｂ型インフルエンザウイルスの増殖の結果は、Ａ型インフルエンザウイルスの場合と同様に、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1のカルボキシ末端の切断が、日齢が進んだ孵化鶏卵中で有効なIFN応答が開始するより低い複製能力に関係することを証明している。この知見は、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1もまた宿主のIFN応答の阻害に関与すること、およびＢ型インフルエンザウイルスのNS1遺伝子上の欠失により弱毒化された表現型となることを示している。
【０１０６】
マウス中での複製実験の結果を表６に示す。B/201およびB/AWBY-234ウイルス力価は、B/Yam力価よりも値が約３ログ低く、Ｂ型インフルエンザウイルスのNS1のカルボキシ末端ドメインの切断がマウス中での弱毒化表現型に関係することを示している。
【０１０７】
［表６］ マウス肺中のＢ型インフルエンザウイルスの複製
ウイルス 感染後３日目の肺力価（pfu／肺）
B/Yam 2×104 1×104 3×104
B/201 30 < 10 60
B/AWBY-234 < 10 40 < 10
【０１０８】
８．NS1タンパク質中に欠失を含有するＡ型およびＢ型インフルエンザウイルスで免疫したマウスにおける野生型インフルエンザウイルス感染に対する防御
末端切断NS1タンパク質を含有する弱毒化Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスで免疫したマウスが、それらに対応する野生型ウイルスによるチャレンジに対して防御されるかどうかを判定するため、以下の実験を実施した。BALB/cマウスをA/NS1-99ウイルスで鼻腔内免疫し、３週間後に野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルスの100LD50を感染させた。免疫した動物は死に対して防御されたが、対照非処置マウスはチャレンジ後に全部死んだ（表７参照）。第２の実験において、末端切断NS1タンパク質を発現するＢ型インフルエンザウイルス B/201またはB/AWBY-234でBALB/cマウスを鼻腔内免疫した。３週間後に該マウスを3×105pfuの野生型インフルエンザB/Yam/1/73ウイルスでチャレンジした。Ｂ型インフルエンザウイルスのこの株はマウス中で疾病症状を誘発しないので、チャレンジ後３日目の肺中のウイルス力価を測定することによって、防御の程度を判定した。非処置対照動物は約104pfu／肺の力価があったが、免疫動物の肺中にはウイルスが検出されなかった（表８参照）。これらの知見は、改変されたNS1遺伝子を含有するＡ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザウイルスはともに、マウスにおいてその後の野生型ウイルスのチャレンジに対して完全に防御する免疫応答を誘発する能力があることを示唆している。
【０１０９】
［表７］ インフルエンザA/NS1-99ウイルスで免疫したマウスの、
100 LD50の野生型インフルエンザA/PR/8/34ウイルスによる
チャレンジ後の生存
A/NS1-99ウイルスの免疫用量 生存体の数／総数
5×106pfu 3/3
1.5×105pfu 4/4
PBS 0/5
【０１１０】
［表８］ インフルエンザB/201およびB/AWBY-234ウイルスで免疫した
マウス中の、3×105pfuの野生型インフルエンザB/Yamagata/73ウイルス
によるチャレンジ後の肺力価
免疫用量 肺力価（pfu／肺）
3×105pfuのB/201 < 101、< 101、< 101、< 101、< 101
3×105pfuのB/AWBY-234 < 101、< 101、< 101、< 101、< 101
PBS 2.5×104、1×104、1.7×104、3×104、5×104
【０１１１】
９．実施例：delNS1ウイルスに感染した孵化卵におけるＩ型インターフェロンの誘導
次に、NS1遺伝子を欠失したＡ型インフルエンザウイルスであるdelNS1ウイルスについて、孵化鶏卵中でＩ型IFN分泌を誘発する能力を判定した。この目的のため、10日齢の孵化鶏卵２個のグループに、delNS1または野生型PR8ウイルスの5×103pfuを感染させた。37℃でインキュベート後18時間で尿膜腔液を採取し、酸性pHに対して一晩透析することによって、感染性ウイルスを不活性化した。酸性pH処置後、サンプルをPBSに対して透析し、そしてCEF細胞中での（約200pfuの）VSV感染に対する防御活性を有する最大希釈を測定することによって、IFN活性についてサンプルを試験した。表９に示す結果は、NS1不在下ではＡ型インフルエンザウイルスの方がより強いIFN誘導因子であることを示している。
【０１１２】
［表９］ 卵中のIFNの誘導
ウイルス IFN（U/ml）
PR8 < 16、< 16
delNS1 400、400
偽（mock） < 16、< 16
【０１１３】
10．実施例：delNS1ウイルスの抗ウイルス活性
Ａ型インフルエンザウイルスからのIFNアンタゴニスト（NS1）遺伝子の除去により、高レベルのIFNを誘導する能力があるウイルスがもたらされるかもしれない。その場合は、delNS1ウイルスがIFN感受性ウイルスの複製を「妨害」することになる。この可能性を試験するため、出願人は、delNS1ウイルスについて、普通使用される実験用インフルエンザウイルス株であるインフルエンザA/WSN/33（WSN）ウイルスの複製を阻害する能力を卵中で試験した。図１からわかるように、わずかに2pfuのdelNS1での処置により尿膜腔液でのWSNウイルスの最終力価を１ログ低下させることができた。その上、2×104pfuのdelNS1ウイルスでの処置により、卵中でのWSN複製がほとんど完全に阻止された。delNS1ウイルスは、その他のＡ型インフルエンザウイルス株（H1N1およびH3N2）、Ｂ型インフルエンザウイルスならびにSendaiウイルスなどの別種のウイルスの卵中での複製をも妨害することができた（図２）。
【０１１４】
この結果に自信を得て、出願人は次に、delNS1ウイルスについてマウス中で野生型インフルエンザウイルスの複製を妨害する能力を判定した。組織培養物中でのＩ型IFN処置によりＡ型インフルエンザウイルスのin vitroでの複製が妨害されるが、IFNでマウスを処置してもインフルエンザウイルス類の複製を阻害することができない（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。これは、A2Gマウスを除く大部分の近交品種マウスにあてはまる。A2Gマウスと同様に顕著な割合（約75％）の野生マウスが、少なくとも１個の完全長Mx1対立遺伝子を含んでいるのに対し、大部分の実験用品種はMx1-/-である（Haller,1986,Current Top Microbiol Immunol 127:331-337）。ヒトMxAタンパク質の相同体であるMx1タンパク質（Aebi,1989,Mol.Cell.Biol.11:5062）は、インフルエンザウイルス複製の阻害剤である可能性がある（Haller,1980,Nature 283:660）。このタンパク質は構成的に発現されるのではなく、その発現はＩ型IFNによって転写的に誘導される。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス応答を刺激するIFN誘導因子の能力を試験するために、A2Gマウスを使用することができる（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。
【０１１５】
出願人は、4週齢のA2Gマウス8匹に、高度に病原性があるインフルエンザA/PR/8/34ウイルス単離物の5×106pfuを鼻腔内感染させた（Haller,1981,Current Top Microbiol Immunol 92:25-52）。PR8感染に関して、24時間前に、マウスの半分に5×106pfuのdelNS1を用いて鼻腔内処置した。その他の4匹のマウスはPBSで処置した。体重変化および生存をモニターした。これらの結果から、delNS1処置がインフルエンザウイルスで誘発される死および体重低下に対してA2Gマウスを保護することができることが証明された。Mx1-/-マウスでは同様の処置が有効ではなかったので、ウイルス防御の機構はMx1、すなわちIFNが仲介することが示された。
【０１１６】
11．実施例：マウスにおけるdelNS1ウイルスの抗腫瘍特性
Ｉ型IFNおよび／またはＩ型IFNの誘導因子は抗腫瘍活性を有することが示されている（BelardelliおよびGresser,1996 Immunology Today 17:369-372；Qinら、1998,Proc.Natl.Acad.Sci.95:14411-14416）ので、delNS1ウイルスによる腫瘍の治療が腫瘍の退縮を仲介する可能性がある。あるいは、delNS1ウイルスが腫瘍細胞崩壊特性を有するかもしれない。すなわち、その多くがIFN系に欠陥があることが知られている腫瘍細胞中で特異的に増殖してそれらを死滅させることができるかもしれない。delNS1ウイルスの抗腫瘍活性を試験するため、転移性肺腫瘍のためのマウス腫瘍モデルにおけるマウス癌細胞系 CT26.WTを使用して、以下の実験を実施した（Restifoら、1998 Virology 249:89-97）。6週齢のBALB/cマウス12匹の静脈に5×105個のCT26.WT細胞を注入した。接種後1日、2日および3日目に24時間毎に、マウスの半数を106pfuのdelNS1ウイルスで鼻腔内処置した。腫瘍注入後12日目に、マウスを絶命させて転移性肺腫瘍を数えた。表10に示すように、delNS1処置はマウスの転移性肺腫瘍の有意な退縮を仲介した。
【０１１７】
［表10］ CT26.WT腫瘍細胞を注入したBALB/cマウス中の
delNS1ウイルスの抗腫瘍活性
転移性肺腫瘍の数
PBS処置 delNS1処置
マウス1 > 250 120
マウス2 > 250 28
マウス3 > 250 9
マウス4 > 250 6
マウス5 > 250 2
マウス6 > 250 1
【０１１８】
12．実施例：NS1タンパク質はインフルエンザウイルスの感染中のIRF-3のトランスロケーションを阻害する
本明細書に記載した結果は、インフルエンザウイルスのNS1タンパク質がこのウイルスに対するＩ型IFN応答の阻害に関係すること、およびこのタンパク質の突然変異／欠失により感染中のIFN応答の強化によるウイルスの弱毒化がもたらされることを示唆している。ウイルス感染中のＩ型IFNの合成は、二本鎖RNA（dsRNA）によって誘発されうることが知られている。IRF-3は通常哺乳動物細胞の細胞質中で不活性形態で見られる転写因子である。二本鎖RNAは転写因子IRF-3のリン酸化（活性化）を誘導し、その結果これを核にトランスロケーションさせ、そこでＩ型IFNをコードする遺伝子を含む特定の遺伝子の転写を誘導する（Weaverら、1998,Mol.Cell.Biol.18:1359）。インフルエンザのNS1がIRF-3に作用しているかどうかを判定するため、野生型PR8またはdelNS1Ａ型インフルエンザウイルスを感染させたCV1細胞中のIRF-3の局在化をモニターした。図３は、IRF-3のトランスロケーションがPR8を感染させた細胞中で最少（細胞の10％未満）であることを示している。対照的に、delNS1を感染させた細胞の約90％がIRF-3の核への局在化を示した。際立っていたことは、プラスミドの１つからin transでNS1を発現させることによって、delNS1を感染させた細胞中でのIRF-3のトランスロケーションを部分的に阻害することが可能だったことである。この結果から、Ａ型インフルエンザウイルスのNS1がウイルスを感染させた細胞中でのIRF-3のトランスロケーションを阻害することができることが証明される。インフルエンザウイルスのNS1はウイルス感染中に産生されるdsRNAを隔離することによってdsRNAが仲介するIRF-3の活性化を阻止し、この結果IFN合成が阻害されると考えられる。
【０１１９】
本発明は記載した特定の実施形態の範囲内に限定されるベきではなく、それらは本発明の個々の態様の単なる説明として意図するものであり、また機能的に等価なあらゆる構築物またはウイルスは本発明の範囲内である。実際、当業者にとって、前述の記載および添付した図面から、本明細書に示しかつ記載するものの他に、本発明の各種の変更が明らかになるであろう。それらの変更は添付した特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図している。
【０１２０】
本明細書に各種の参照文献を引用したが、それらの開示は参照によりその全文を組み入れる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを増殖させる方法であって、
(a) ウイルスを未成熟の孵化卵の中で増殖させ、
(b) 子孫ウイルスを回収する、
ことを含み、ここで、該ウイルスがＣ型インフルエンザウイルスではないことを条件とする、上記方法。
【請求項２】
前記卵が10日齢未満の孵化鶏卵である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記卵が６〜９日齢の孵化鶏卵である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが(-)鎖RNAウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスがセグメント化された(-)鎖RNAウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスがＡ型またはＢ型インフルエンザである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスがセグメント化されていない(-)鎖RNAウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスがNDV、PIVまたはVSVである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがDNAウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスを増殖させる方法であって、
(a) ウイルスをインターフェロン欠損培養基の中で増殖させ、
(b) 子孫ウイルスを回収する、
ことを含み、ここで、該ウイルスがＣ型インフルエンザウイルスではなく、インターフェロン欠損培養基がベロ細胞でもSTAT1(-)細胞系でもないことを条件とする、上記方法。
【請求項１２】
前記培養基が10日齢未満の孵化鶏卵である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記培養基が６〜９日齢の孵化鶏卵である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが(-)鎖RNAウイルスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスがセグメント化された(-)鎖RNAウイルスである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがＡ型またはＢ型インフルエンザである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスがセグメント化されていない(-)鎖RNAウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスがNDV、PIVまたはVSVである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスがDNAウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
増殖させるウイルスが弱毒表現型を有する、請求項１または１１記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスをワクチン製剤で使用するために増殖させる、請求項１または１１記載の方法。
【請求項１】
ウイルスを増殖させる方法であって、
(a) ウイルスを未成熟の孵化卵の中で増殖させ、
(b) 子孫ウイルスを回収する、
ことを含み、ここで、該ウイルスがＣ型インフルエンザウイルスではないことを条件とする、上記方法。
【請求項２】
前記卵が10日齢未満の孵化鶏卵である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記卵が６〜９日齢の孵化鶏卵である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが(-)鎖RNAウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスがセグメント化された(-)鎖RNAウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスがＡ型またはＢ型インフルエンザである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスがセグメント化されていない(-)鎖RNAウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスがNDV、PIVまたはVSVである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがDNAウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスを増殖させる方法であって、
(a) ウイルスをインターフェロン欠損培養基の中で増殖させ、
(b) 子孫ウイルスを回収する、
ことを含み、ここで、該ウイルスがＣ型インフルエンザウイルスではなく、インターフェロン欠損培養基がベロ細胞でもSTAT1(-)細胞系でもないことを条件とする、上記方法。
【請求項１２】
前記培養基が10日齢未満の孵化鶏卵である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記培養基が６〜９日齢の孵化鶏卵である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが(-)鎖RNAウイルスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスがセグメント化された(-)鎖RNAウイルスである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがＡ型またはＢ型インフルエンザである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスがセグメント化されていない(-)鎖RNAウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスがNDV、PIVまたはVSVである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスがDNAウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスがポックスウイルスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
増殖させるウイルスが弱毒表現型を有する、請求項１または１１記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスをワクチン製剤で使用するために増殖させる、請求項１または１１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−９９０８１（Ｐ２０１０−９９０８１Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８５４６７（Ｐ２００９−２８５４６７）
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５５３５６０（Ｐ２０００−５５３５６０）の分割
【原出願日】平成１１年６月１１日（１９９９．６．１１）
【出願人】（５９６０９７４６４）マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−５５３５６０（Ｐ２０００−５５３５６０）の分割
【原出願日】平成１１年６月１１日（１９９９．６．１１）
【出願人】（５９６０９７４６４）マウント シナイ スクール オブ メディシン オブ ニューヨーク ユニバーシティー (4)
【Ｆターム（参考）】
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