新規オリゴ糖及びその製造方法
【課題】 セロデキストリンホスホリラーゼのアクセプターとなりうる化合物を見つけ出し、これまでにない新規なオリゴ糖を提供する。
【解決手段】 アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、マルトースをアクセプターとし、グルコース−１−リン酸の存在下でセロビオースホスホリラーゼを作用させ、前記各単糖類又はマルトースを構成するグルコースに、１個以上のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖を得る。
【解決手段】 アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、マルトースをアクセプターとし、グルコース−１−リン酸の存在下でセロビオースホスホリラーゼを作用させ、前記各単糖類又はマルトースを構成するグルコースに、１個以上のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規オリゴ糖及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌フローラのバランスを改善することによって、宿主の健康に好影響を与えるいわゆる善玉菌を増やす効果を有するプレバイオティクスとして、ガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖などのオリゴ糖が注目されている。オリゴ糖は単糖がグリコシド結合によって結合した２〜数十の糖から構成される糖類である。オリゴ糖の１種であるセロオリゴ糖は、グルコース同士がβ−１,４−結合した複数のグルコースから構成されるオリゴ糖である。ヒトの消化管に常在する腸内細菌は、セロオリゴ糖をはじめとする各種のオリゴ糖を分解・吸収し増殖することができる。しかしながら、ヒトはβ−１,４−結合を分解する酵素を有しないので、ヒトはβ−１,４−グルコシド結合を有するオリゴ糖（以下、少なくとも１つのβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖を「β−グルカンオリゴ糖」という。）を分解・吸収できず資化できない。このためにβ−グルカンオリゴ糖はプレバイオティクスとしての利用価値が高いといえる。また、これらのβ−グルカンオリゴ糖は、プレバイオティクスとしての利用のみならず、甘味料としての使用、抗う触作用や整腸作用、免疫賦活作用等を有する各種機能性食品の素材としての使用が大いに期待されている。
【０００３】
こうしたβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖（β−グルカンオリゴ糖）を製造する方法として、例えば特開平２−１６９９２号公報（特許文献１）には、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰａｓｅ）の加リン酸分解反応の逆反応によって、グルコースやキシロースをアクセプター（プライマー）としてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−１,４−結合を有する二糖類を製造する方法が開示されている。また、特開２００１−１１２４９６号公報（特許文献２）には、セロビオースホスホリラーゼ及びセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰａｓｅ）の加リン酸分解の逆反応によって、グルコースをアクセプターとしてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−１,４−結合を有するセロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。さらに、特開２００８−５４５０６号公報（特許文献３）には、セロビオースホスホリラーゼの加リン酸分解の逆反応によって、グルコースやキシロースのみならず、ガラクトースなどの単糖類をアクセプターとしてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−グルコシド結合を有する二糖類を製造する方法が開示されている。
【０００４】
このような状況下において、本願発明者らは、グルコースのアナログであるデオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）に、グルコースないしα−１,４−グルカンオリゴ糖の還元末端がα−１,４−グルコシド結合したα−グルカンＤＮＪ（α−１,４−グルカン−ＤＮＪオリゴ糖）が、種々のアミラーゼ酵素阻害剤として機能すること、及びその阻害特異性について、阻害する酵素の反応生成物の結合数（重合度）と、α−グルカンＤＮＪのグルコース及びＤＮＪの結合数は同一であることを明らかにしている（非特許文献１、図６参照）。また、セロデキストリンホスホリラーゼが、ＤＮＪにグルコースの還元末端がβ−１,４−結合した４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−ＤＮＪをアクセプターとして、１個ないし数個のグルコースがβ−１,４−結合したβ−グルカンＤＮＪ（β−グルカンＤＮＪオリゴ糖：Ｇｌｃ（ｎ）（β−１,４−）ＤＮＪ、ただしｎは２〜６の整数）を生成することを報告している（非特許文献２）。これらのβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖も各種β−グルカナーゼ（β−グルカン加水分解酵素）に対する阻害剤として機能することが明らかにされている（非特許文献２、図７参照）。これらの化合物も、プレバイオティクスとしての利用のみならず、新たな機能性食品の素材としての使用が期待される。
【０００５】
セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰａｓｅ）は、単糖類であるグルコースをアクセプターとして、これにグルコース−１−リン酸を加リン酸分解の逆反応によって結合させてグルコースがβ−１,４−結合した二単糖であるセロビオースを合成する酵素である。セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰａｓｅ）は、２個以上のグルコースがβ−１,４−結合したβ−グルカンオリゴ糖をアクセプターとして、これにグルコース−１−リン酸のグルコース残基を加リン酸分解の逆反応によって結合させて、グルコース残基が１つ増えたβ−グルカンオリゴ糖を合成する酵素である。これらホスホリラーゼの一方の基質であるグルコース−１−リン酸に対する特異性は非常に高く、また、これらのホスホリラーゼのアクセプターに対する特異性も非常に高いので、アクセプターは上記のβ−グルカンオリゴ糖及び非特許文献２に開示されたβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖に限られると考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−１６９９２号公報
【特許文献２】特開２００１−１１２４９６号公報
【特許文献３】特開２００８−５４５０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arai M., et al, Agric. Biol. Chem., 50, 639-644, 1986
【非特許文献２】Kawaguchi T., et al, J. Ferment. Bioeng., 85, 144-149, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＣＤＰａｓｅ関し、ＤＮＪがグルコースのアナログとして機能し、β−グルカンＤＮＪオリゴ糖がＣＤＰａｓｅのアクセプターとなりえることが明らかにされていたとはいえ、どのような範囲の化合物がβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖と同じくＣＤＰａｓｅのアクセプターとなり得るのかは分からなかった。特にＣＤＰａｓｅは二糖以上のセロオリゴ糖をアクセプターとする酵素である限り、単糖類がアクセプターになり得るとは考えられないことであった。
【０００９】
また、ＣＢＰａｓｅは単糖類のみをアクセプターとするが、キシロースを基質とすることは、Tanaka K.らの論文（Tanaka K., et al, J. Ferment. Bioeng., 79, 212-216, 1995）やAlexanderらの論文（Alexander, JK, J. Biol. Chem., 243, 2899-2904, 1968）において報告されているが、キシロースやグルコース以外の単糖類をアクセプターとして、これらの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合するとの報告は見あたらない。特許文献３においても、キシロース以外の単糖類とグルコースがβ−１,４−結合した二糖類が実際に製造されたとする記載はない。
【００１０】
ここにおいて、ＣＤＰａｓｅがセロビオースや、ＤＮＪがグルコースないしβ−グルカンオリゴ糖とβ−１,４−結合したβ−グルカンＤＮＪ以外のオリゴ糖をアクセプターとするならば、新規なβ−グルカンオリゴ糖が提供され、化学合成などに頼ることなく新規なβ−グルカンオリゴ糖を製造できる。また、これら新規β−グルカンオリゴ糖がプレバイオティクス効果だけでなく、整腸作用や免疫賦活作用を示し、新たな生理活性物質として整腸剤や免疫賦活剤、アレルギー抑制剤などに利用され、ヒトをはじめとする各種動物の疾病の治療や予防に寄与することが大いに期待される。
【００１１】
本願発明は、上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、セロデキストリンホスホリラーゼのアクセプターとなりうる化合物を見つけ出し、これまでにない新規なオリゴ糖を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、単糖類又は二糖類をアクセプターとして、グルコース−１−リン酸の存在下においてセロデキストリンホスホリラーゼの加リン酸分解反応の逆反応（脱リン酸合成反応）によって、当該アクセプターにグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖を製造する方法並びにアラビノース、マンノース、ガラクトースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類、さらにマルトースそのもの、及びガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類からなる群から選ばれる二糖類にグルコースがβ−１,４−結合した三糖類、ないしこれら三糖類にさらにグルコースがβ−１,４−結合することを繰り返した三糖類以上のオリゴ糖である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると新規なオリゴ糖が提供され、プレバイオティクスだけでなく、ヒトや動物に対する新たな機能性素材としての利用が期待される。また、これらの新規オリゴ糖はセロデキストリンホスホリラーゼの作用により生成されるので、化学合成による方法と比べて、目的のβ−グルカンオリゴ糖の光学異性体の生成を伴わず、効率良くこれらのオリゴ糖を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】セロデキストリンホスホリラーゼによる反応を示す図である。
【図２】アラビノースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図３】マルトースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図４】（ａ）はガラクトース、（ｂ）はキシロース、（ｃ）はマンノースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図５】ＣＤＰａｓｅによる反応生成物の薄層クロマトグラムを示す画像である。レーン１はグルコース−１―リン酸、レーン２はアラビノース、レーン３はガラクトース、レーン４はキシロース、レーン５はマンノース、レーン６はフルクトース、レーン７はマンニトール、レーン８はキシリトール、レーン９はソルビトール、レーン１０はマルトース、レーン１１はラクトース、レーン１２はスクロースである。
【図６】ＤＮＪ−α−１,４−グルカンオリゴ糖（α−１,４−ＤＮＪ誘導体）とそれが阻害する酵素との関係を示す図である。
【図７】ＤＮＪ−β−１,４−グルカンオリゴ糖（β−１,４−ＤＮＪ誘導体）とそれが阻害する酵素との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のオリゴ糖は、２ないし数十程度の糖からなる新規なオリゴ糖であって、アラビノース又はマンノースにグルコースがβ−１,４−結合した二糖類、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類及びマルトースからなる群から選ばれる二糖類を構成するグルコースにβ−１,４−結合により１ないし複数個のグルコースが結合した三糖類以上のオリゴ糖である。
【００１６】
これらのオリゴ糖は、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類やマルトースをアクセプターとして、グルコース−１−リン酸の存在下でＣＤＰａｓｅを作用させることにより製造される。アクセプターとなる糖にはＤ体、Ｌ体の何れの糖も存在しうるが、本発明のオリゴ糖ではアラビノースを除く構成糖はＤ体であり、アラビノースはＬ体である。また、アクセプターの構成糖のアノマー水酸基はα配位、β配位の何れの配位も取り得る。
【００１７】
ＣＤＰａｓｅは、図１に示すように、Ｎ個のグルコース（Ｎは正の整数）がβ−１,４−結合したセロデキストリンとグルコース−１−リン酸から（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したセロデキストリンを合成する反応（脱リン酸合成反応）と、その逆反応である加リン酸分解反応を触媒する。生理的な条件下ではこれらの反応の平衡は加リン酸分解反応に傾いており、ＣＤＰａｓｅはセロオリゴ糖の分解に寄与している。しかしながら、これらの反応は可逆的であり、グルコース−１−リン酸の濃度及び／又は無機リン酸（脱リン酸合成反応の生成物）の濃度を調整して、β−グルカンオリゴ糖のグルコース残基を１個の増加させる合成反応を促進させることができる。
【００１８】
すなわち、ＣＤＰａｓｅの存在下で、上記のアクセプターとなる単糖類又は二糖類と過剰量のグルコース−１−リン酸を反応させるか、及び／又は生成したリン酸を中和などにより反応系から除去すれば、平衡は脱リン酸合成反応側に傾くので、目的のオリゴ糖の生成量を増加させることができる。
【００１９】
例えば、Ｌ−アラビノースをアクセプターとした場合には、図２に示すように、Ｌ−アラビノースの４位の水酸基にＤ−グルコースの１位水酸基がβ−グリコシド結合した新規な二糖類（1-β-D-glucopyranosyl-4-α-L-arabinopyranose）が合成される。
【００２０】
また、セロデキストリンホスホリラーゼは、図１に示すように、二糖類だけでなく、三糖類又はそれ以上の糖がβ−１,４−グルコシド結合したβ−グルカンオリゴ糖に対して、β−１,４−結合により１個のグルコース残基をさらに付加する。このため、前記二糖類や三糖類などに対してもＣＤＰａｓｅが作用し、Ｎ個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖にグルコースがさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖が生成される。
【００２１】
マルトースをアクセプターとした場合も、図３に示すように、Ｄ−マルトースを構成する非還元末端側のＤ−グルコースの４位水酸基にβ−１,４−結合により１個のＤ−グルコースがさらに付加されたトリオース（1-β-D-glucopyranosyl-1-α-D-glucopyranosyl-4-α-glucopyranose）が生成される。さらに、この生成したトリオースに対してもＣＤＰａｓｅが作用することが繰り返すと、マルトースにＮ個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖にグルコース残基がさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したマルトースが生成される。
【００２２】
ガラクトースやキシロース、マンノースをアクセプターとした場合も、図４に示すようにアラビノースと同様にＤ−グルコースがβ−１,４−結合によって前記単糖類に結合した二糖類が生成される。また、この二糖類に対してもＣＤＰａｓｅが作用することを繰り返して、Ｎ個のグルコース残基がβ−１,４−結合したアクセプター糖にグルコース残基がさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖が生成される。
【００２３】
酵素反応の条件は上記したようにグルコースの付加反応、即ちオリゴ糖の合成反応が進むように、グルコース−１−リン酸の濃度や無機リン酸（生成物）の濃度、反応系のｐＨ、反応温度は適宜調整されうる。しかしながら、ＣＤＰａｓｅはｐＨ３〜１１の反応系で安定であり、温度安定性も約６０℃までである。また、その至適ｐＨは６〜８、至適温度は約６０℃である。従って、当該至適ｐＨ域及び至適温度である約６０℃付近で反応を行わせるのが好ましい。
【００２４】
これらのβ―グルカンオリゴ糖は、天然に存在する報告例がないオリゴ糖もあり、様々な生理作用を有する可能性が期待される。例えば、腸内細菌の選択的生育促進による整腸作用や免疫賦活作用が期待できる。また、甘味剤などの食品添加物として使用できる。また、これらのオリゴ糖はβ−１,４−グルコシド結合を有するオリゴ糖であるのでヒトの消化管では消化されず、その摂取カロリーは非常に少ない。このため、摂取カロリーが制限されている人のための食品素材、すなわちダイエット食品素材として大変好適に用いられる。
【００２５】
本発明において用いられるＣＤＰａｓｅは、例えばClostridium属に属する細菌などから分離・精製された酵素に限らず、Clostridium属に属する細菌などの細菌からクローニングされたCDPase遺伝子を用いた遺伝子組換え技術により得られた酵素（例えば非特許文献１参照）が利用できる。
【実施例１】
【００２６】
次に下記実施例に基づき本発明についてさらに詳細する。なお、下記実施例は例示であって、本発明は下記の実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００２７】
各種単糖類及び二糖類に対して、グルコース−１−リン酸の存在下にＣＤＰａｓｅを作用させた。用いた単糖類はアラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトールであり、用いた二糖類は、マルトース、ラクトース、スクロースである。これらはそれぞれ市販の試薬を用いた。また、グルコース−１−リン酸も市販の試薬（和光純薬工業社製）を用いた。
【００２８】
ＣＤＰａｓｅは非特許文献２に記載の方法を参考にし、次の方法により調製したものを用いた。Clostridium thermocellum由来のCDPase遺伝子を含む約３.５ｋｂのSsp I - Hind III断片を大腸菌発現ベクターpTrc99A（ファルマシア社製）に挿入することで、trcプロモーター制御下でCDPase遺伝子を発現する発現プラスミドpTEH1を構築した。このpTEH1を大腸菌ＤＨ５αＦ株に形質転換し、２×ＹＴ培地（１.６％ Bacto trypton、１.０％ Yeast Extract、０.５％ ＮａＣｌ）１.５ｍＬに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。遠心分離（１２,０００rpm、１min、４℃）にて菌体を回収し、０.１％の2-mercaptoethanolを含む ５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７.５）５００μＬに懸濁した。これを超音波破砕し、遠心分離（１５,０００rpm、１０min、４℃）して上清を回収した。この上清を無細胞抽出液（４８.５Ｕ/ｍＬ）として、以後の合成実験に供した。なお、１Ｕは、１５分間で１μＭのリン酸Ｐｉを遊離する酵素量と定義する（測定条件は非特許文献１参照）。
【００２９】
ｐＨ７.０のリン酸バッファー溶液に、各糖類を２００ミリモル濃度、グルコース−１−リン酸を５０ミリモル濃度、ＥＤＴＡを１ミリモル濃度、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を１０ミリモル濃度、ＣＤＰａｓｅを２.４ユニット（上記無細胞抽出液５０μＬ）となるように添加し、３７℃で１６時間反応を行った。この反応液５μlを用いて次の条件で薄層クロマトグラフィを行った。その結果を図５に示す。
〔ＴＬＣ条件〕
薄層板：シリカゲル
展開溶媒：n-ブタノール：エタノール：クロロホルム：２５％アンモニア水＝４：５：２：８
検出方法：バニリンを１％になるように濃硫酸に溶かした発色試薬を噴霧し、１２０℃で加熱して発色させた。
【００３０】
この結果、図５から明らかなようにアラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、マルトースからはグルコース残基が結合したオリゴ糖が観察された。スポットの位置から、これらのオリゴ糖はそれぞれアクセプターにグルコースが１個結合した二糖類（アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース）及び三糖類（マルトース）であると確認された。また、これらアクセプターへのグルコース残基の結合位置及び様式は、用いた酵素の特異性から４位にβ−グルコシド結合していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によるとグルコースがβ−グルコシド結合により結合した新規なオリゴ糖が提供される。これにより、このオリゴ糖の機能を活用した新たな医薬品や機能性食品の提供が期待される。また、これらの新規オリゴ糖はＣＤＰａｓｅにより生成されるので、目的外の光学異性体の生成がない、効率的な生産が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規オリゴ糖及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌フローラのバランスを改善することによって、宿主の健康に好影響を与えるいわゆる善玉菌を増やす効果を有するプレバイオティクスとして、ガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖などのオリゴ糖が注目されている。オリゴ糖は単糖がグリコシド結合によって結合した２〜数十の糖から構成される糖類である。オリゴ糖の１種であるセロオリゴ糖は、グルコース同士がβ−１,４−結合した複数のグルコースから構成されるオリゴ糖である。ヒトの消化管に常在する腸内細菌は、セロオリゴ糖をはじめとする各種のオリゴ糖を分解・吸収し増殖することができる。しかしながら、ヒトはβ−１,４−結合を分解する酵素を有しないので、ヒトはβ−１,４−グルコシド結合を有するオリゴ糖（以下、少なくとも１つのβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖を「β−グルカンオリゴ糖」という。）を分解・吸収できず資化できない。このためにβ−グルカンオリゴ糖はプレバイオティクスとしての利用価値が高いといえる。また、これらのβ−グルカンオリゴ糖は、プレバイオティクスとしての利用のみならず、甘味料としての使用、抗う触作用や整腸作用、免疫賦活作用等を有する各種機能性食品の素材としての使用が大いに期待されている。
【０００３】
こうしたβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖（β−グルカンオリゴ糖）を製造する方法として、例えば特開平２−１６９９２号公報（特許文献１）には、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰａｓｅ）の加リン酸分解反応の逆反応によって、グルコースやキシロースをアクセプター（プライマー）としてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−１,４−結合を有する二糖類を製造する方法が開示されている。また、特開２００１−１１２４９６号公報（特許文献２）には、セロビオースホスホリラーゼ及びセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰａｓｅ）の加リン酸分解の逆反応によって、グルコースをアクセプターとしてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−１,４−結合を有するセロオリゴ糖を製造する方法が開示されている。さらに、特開２００８−５４５０６号公報（特許文献３）には、セロビオースホスホリラーゼの加リン酸分解の逆反応によって、グルコースやキシロースのみならず、ガラクトースなどの単糖類をアクセプターとしてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を反応させ、β−グルコシド結合を有する二糖類を製造する方法が開示されている。
【０００４】
このような状況下において、本願発明者らは、グルコースのアナログであるデオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）に、グルコースないしα−１,４−グルカンオリゴ糖の還元末端がα−１,４−グルコシド結合したα−グルカンＤＮＪ（α−１,４−グルカン−ＤＮＪオリゴ糖）が、種々のアミラーゼ酵素阻害剤として機能すること、及びその阻害特異性について、阻害する酵素の反応生成物の結合数（重合度）と、α−グルカンＤＮＪのグルコース及びＤＮＪの結合数は同一であることを明らかにしている（非特許文献１、図６参照）。また、セロデキストリンホスホリラーゼが、ＤＮＪにグルコースの還元末端がβ−１,４−結合した４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−ＤＮＪをアクセプターとして、１個ないし数個のグルコースがβ−１,４−結合したβ−グルカンＤＮＪ（β−グルカンＤＮＪオリゴ糖：Ｇｌｃ（ｎ）（β−１,４−）ＤＮＪ、ただしｎは２〜６の整数）を生成することを報告している（非特許文献２）。これらのβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖も各種β−グルカナーゼ（β−グルカン加水分解酵素）に対する阻害剤として機能することが明らかにされている（非特許文献２、図７参照）。これらの化合物も、プレバイオティクスとしての利用のみならず、新たな機能性食品の素材としての使用が期待される。
【０００５】
セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰａｓｅ）は、単糖類であるグルコースをアクセプターとして、これにグルコース−１−リン酸を加リン酸分解の逆反応によって結合させてグルコースがβ−１,４−結合した二単糖であるセロビオースを合成する酵素である。セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰａｓｅ）は、２個以上のグルコースがβ−１,４−結合したβ−グルカンオリゴ糖をアクセプターとして、これにグルコース−１−リン酸のグルコース残基を加リン酸分解の逆反応によって結合させて、グルコース残基が１つ増えたβ−グルカンオリゴ糖を合成する酵素である。これらホスホリラーゼの一方の基質であるグルコース−１−リン酸に対する特異性は非常に高く、また、これらのホスホリラーゼのアクセプターに対する特異性も非常に高いので、アクセプターは上記のβ−グルカンオリゴ糖及び非特許文献２に開示されたβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖に限られると考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−１６９９２号公報
【特許文献２】特開２００１−１１２４９６号公報
【特許文献３】特開２００８−５４５０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arai M., et al, Agric. Biol. Chem., 50, 639-644, 1986
【非特許文献２】Kawaguchi T., et al, J. Ferment. Bioeng., 85, 144-149, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＣＤＰａｓｅ関し、ＤＮＪがグルコースのアナログとして機能し、β−グルカンＤＮＪオリゴ糖がＣＤＰａｓｅのアクセプターとなりえることが明らかにされていたとはいえ、どのような範囲の化合物がβ−グルカンＤＮＪオリゴ糖と同じくＣＤＰａｓｅのアクセプターとなり得るのかは分からなかった。特にＣＤＰａｓｅは二糖以上のセロオリゴ糖をアクセプターとする酵素である限り、単糖類がアクセプターになり得るとは考えられないことであった。
【０００９】
また、ＣＢＰａｓｅは単糖類のみをアクセプターとするが、キシロースを基質とすることは、Tanaka K.らの論文（Tanaka K., et al, J. Ferment. Bioeng., 79, 212-216, 1995）やAlexanderらの論文（Alexander, JK, J. Biol. Chem., 243, 2899-2904, 1968）において報告されているが、キシロースやグルコース以外の単糖類をアクセプターとして、これらの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合するとの報告は見あたらない。特許文献３においても、キシロース以外の単糖類とグルコースがβ−１,４−結合した二糖類が実際に製造されたとする記載はない。
【００１０】
ここにおいて、ＣＤＰａｓｅがセロビオースや、ＤＮＪがグルコースないしβ−グルカンオリゴ糖とβ−１,４−結合したβ−グルカンＤＮＪ以外のオリゴ糖をアクセプターとするならば、新規なβ−グルカンオリゴ糖が提供され、化学合成などに頼ることなく新規なβ−グルカンオリゴ糖を製造できる。また、これら新規β−グルカンオリゴ糖がプレバイオティクス効果だけでなく、整腸作用や免疫賦活作用を示し、新たな生理活性物質として整腸剤や免疫賦活剤、アレルギー抑制剤などに利用され、ヒトをはじめとする各種動物の疾病の治療や予防に寄与することが大いに期待される。
【００１１】
本願発明は、上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、セロデキストリンホスホリラーゼのアクセプターとなりうる化合物を見つけ出し、これまでにない新規なオリゴ糖を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、単糖類又は二糖類をアクセプターとして、グルコース−１−リン酸の存在下においてセロデキストリンホスホリラーゼの加リン酸分解反応の逆反応（脱リン酸合成反応）によって、当該アクセプターにグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖を製造する方法並びにアラビノース、マンノース、ガラクトースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類、さらにマルトースそのもの、及びガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類からなる群から選ばれる二糖類にグルコースがβ−１,４−結合した三糖類、ないしこれら三糖類にさらにグルコースがβ−１,４−結合することを繰り返した三糖類以上のオリゴ糖である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると新規なオリゴ糖が提供され、プレバイオティクスだけでなく、ヒトや動物に対する新たな機能性素材としての利用が期待される。また、これらの新規オリゴ糖はセロデキストリンホスホリラーゼの作用により生成されるので、化学合成による方法と比べて、目的のβ−グルカンオリゴ糖の光学異性体の生成を伴わず、効率良くこれらのオリゴ糖を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】セロデキストリンホスホリラーゼによる反応を示す図である。
【図２】アラビノースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図３】マルトースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図４】（ａ）はガラクトース、（ｂ）はキシロース、（ｃ）はマンノースをアクセプターとした反応を示す図である。
【図５】ＣＤＰａｓｅによる反応生成物の薄層クロマトグラムを示す画像である。レーン１はグルコース−１―リン酸、レーン２はアラビノース、レーン３はガラクトース、レーン４はキシロース、レーン５はマンノース、レーン６はフルクトース、レーン７はマンニトール、レーン８はキシリトール、レーン９はソルビトール、レーン１０はマルトース、レーン１１はラクトース、レーン１２はスクロースである。
【図６】ＤＮＪ−α−１,４−グルカンオリゴ糖（α−１,４−ＤＮＪ誘導体）とそれが阻害する酵素との関係を示す図である。
【図７】ＤＮＪ−β−１,４−グルカンオリゴ糖（β−１,４−ＤＮＪ誘導体）とそれが阻害する酵素との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のオリゴ糖は、２ないし数十程度の糖からなる新規なオリゴ糖であって、アラビノース又はマンノースにグルコースがβ−１,４−結合した二糖類、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類及びマルトースからなる群から選ばれる二糖類を構成するグルコースにβ−１,４−結合により１ないし複数個のグルコースが結合した三糖類以上のオリゴ糖である。
【００１６】
これらのオリゴ糖は、アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノースの何れかの単糖類やマルトースをアクセプターとして、グルコース−１−リン酸の存在下でＣＤＰａｓｅを作用させることにより製造される。アクセプターとなる糖にはＤ体、Ｌ体の何れの糖も存在しうるが、本発明のオリゴ糖ではアラビノースを除く構成糖はＤ体であり、アラビノースはＬ体である。また、アクセプターの構成糖のアノマー水酸基はα配位、β配位の何れの配位も取り得る。
【００１７】
ＣＤＰａｓｅは、図１に示すように、Ｎ個のグルコース（Ｎは正の整数）がβ−１,４−結合したセロデキストリンとグルコース−１−リン酸から（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したセロデキストリンを合成する反応（脱リン酸合成反応）と、その逆反応である加リン酸分解反応を触媒する。生理的な条件下ではこれらの反応の平衡は加リン酸分解反応に傾いており、ＣＤＰａｓｅはセロオリゴ糖の分解に寄与している。しかしながら、これらの反応は可逆的であり、グルコース−１−リン酸の濃度及び／又は無機リン酸（脱リン酸合成反応の生成物）の濃度を調整して、β−グルカンオリゴ糖のグルコース残基を１個の増加させる合成反応を促進させることができる。
【００１８】
すなわち、ＣＤＰａｓｅの存在下で、上記のアクセプターとなる単糖類又は二糖類と過剰量のグルコース−１−リン酸を反応させるか、及び／又は生成したリン酸を中和などにより反応系から除去すれば、平衡は脱リン酸合成反応側に傾くので、目的のオリゴ糖の生成量を増加させることができる。
【００１９】
例えば、Ｌ−アラビノースをアクセプターとした場合には、図２に示すように、Ｌ−アラビノースの４位の水酸基にＤ−グルコースの１位水酸基がβ−グリコシド結合した新規な二糖類（1-β-D-glucopyranosyl-4-α-L-arabinopyranose）が合成される。
【００２０】
また、セロデキストリンホスホリラーゼは、図１に示すように、二糖類だけでなく、三糖類又はそれ以上の糖がβ−１,４−グルコシド結合したβ−グルカンオリゴ糖に対して、β−１,４−結合により１個のグルコース残基をさらに付加する。このため、前記二糖類や三糖類などに対してもＣＤＰａｓｅが作用し、Ｎ個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖にグルコースがさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖が生成される。
【００２１】
マルトースをアクセプターとした場合も、図３に示すように、Ｄ−マルトースを構成する非還元末端側のＤ−グルコースの４位水酸基にβ−１,４−結合により１個のＤ−グルコースがさらに付加されたトリオース（1-β-D-glucopyranosyl-1-α-D-glucopyranosyl-4-α-glucopyranose）が生成される。さらに、この生成したトリオースに対してもＣＤＰａｓｅが作用することが繰り返すと、マルトースにＮ個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖にグルコース残基がさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したマルトースが生成される。
【００２２】
ガラクトースやキシロース、マンノースをアクセプターとした場合も、図４に示すようにアラビノースと同様にＤ−グルコースがβ−１,４−結合によって前記単糖類に結合した二糖類が生成される。また、この二糖類に対してもＣＤＰａｓｅが作用することを繰り返して、Ｎ個のグルコース残基がβ−１,４−結合したアクセプター糖にグルコース残基がさらに１個付加され、（Ｎ＋１）個のグルコースがβ−１,４−結合したオリゴ糖が生成される。
【００２３】
酵素反応の条件は上記したようにグルコースの付加反応、即ちオリゴ糖の合成反応が進むように、グルコース−１−リン酸の濃度や無機リン酸（生成物）の濃度、反応系のｐＨ、反応温度は適宜調整されうる。しかしながら、ＣＤＰａｓｅはｐＨ３〜１１の反応系で安定であり、温度安定性も約６０℃までである。また、その至適ｐＨは６〜８、至適温度は約６０℃である。従って、当該至適ｐＨ域及び至適温度である約６０℃付近で反応を行わせるのが好ましい。
【００２４】
これらのβ―グルカンオリゴ糖は、天然に存在する報告例がないオリゴ糖もあり、様々な生理作用を有する可能性が期待される。例えば、腸内細菌の選択的生育促進による整腸作用や免疫賦活作用が期待できる。また、甘味剤などの食品添加物として使用できる。また、これらのオリゴ糖はβ−１,４−グルコシド結合を有するオリゴ糖であるのでヒトの消化管では消化されず、その摂取カロリーは非常に少ない。このため、摂取カロリーが制限されている人のための食品素材、すなわちダイエット食品素材として大変好適に用いられる。
【００２５】
本発明において用いられるＣＤＰａｓｅは、例えばClostridium属に属する細菌などから分離・精製された酵素に限らず、Clostridium属に属する細菌などの細菌からクローニングされたCDPase遺伝子を用いた遺伝子組換え技術により得られた酵素（例えば非特許文献１参照）が利用できる。
【実施例１】
【００２６】
次に下記実施例に基づき本発明についてさらに詳細する。なお、下記実施例は例示であって、本発明は下記の実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００２７】
各種単糖類及び二糖類に対して、グルコース−１−リン酸の存在下にＣＤＰａｓｅを作用させた。用いた単糖類はアラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトールであり、用いた二糖類は、マルトース、ラクトース、スクロースである。これらはそれぞれ市販の試薬を用いた。また、グルコース−１−リン酸も市販の試薬（和光純薬工業社製）を用いた。
【００２８】
ＣＤＰａｓｅは非特許文献２に記載の方法を参考にし、次の方法により調製したものを用いた。Clostridium thermocellum由来のCDPase遺伝子を含む約３.５ｋｂのSsp I - Hind III断片を大腸菌発現ベクターpTrc99A（ファルマシア社製）に挿入することで、trcプロモーター制御下でCDPase遺伝子を発現する発現プラスミドpTEH1を構築した。このpTEH1を大腸菌ＤＨ５αＦ株に形質転換し、２×ＹＴ培地（１.６％ Bacto trypton、１.０％ Yeast Extract、０.５％ ＮａＣｌ）１.５ｍＬに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。遠心分離（１２,０００rpm、１min、４℃）にて菌体を回収し、０.１％の2-mercaptoethanolを含む ５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７.５）５００μＬに懸濁した。これを超音波破砕し、遠心分離（１５,０００rpm、１０min、４℃）して上清を回収した。この上清を無細胞抽出液（４８.５Ｕ/ｍＬ）として、以後の合成実験に供した。なお、１Ｕは、１５分間で１μＭのリン酸Ｐｉを遊離する酵素量と定義する（測定条件は非特許文献１参照）。
【００２９】
ｐＨ７.０のリン酸バッファー溶液に、各糖類を２００ミリモル濃度、グルコース−１−リン酸を５０ミリモル濃度、ＥＤＴＡを１ミリモル濃度、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を１０ミリモル濃度、ＣＤＰａｓｅを２.４ユニット（上記無細胞抽出液５０μＬ）となるように添加し、３７℃で１６時間反応を行った。この反応液５μlを用いて次の条件で薄層クロマトグラフィを行った。その結果を図５に示す。
〔ＴＬＣ条件〕
薄層板：シリカゲル
展開溶媒：n-ブタノール：エタノール：クロロホルム：２５％アンモニア水＝４：５：２：８
検出方法：バニリンを１％になるように濃硫酸に溶かした発色試薬を噴霧し、１２０℃で加熱して発色させた。
【００３０】
この結果、図５から明らかなようにアラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース、マルトースからはグルコース残基が結合したオリゴ糖が観察された。スポットの位置から、これらのオリゴ糖はそれぞれアクセプターにグルコースが１個結合した二糖類（アラビノース、ガラクトース、キシロース、マンノース）及び三糖類（マルトース）であると確認された。また、これらアクセプターへのグルコース残基の結合位置及び様式は、用いた酵素の特異性から４位にβ−グルコシド結合していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明によるとグルコースがβ−グルコシド結合により結合した新規なオリゴ糖が提供される。これにより、このオリゴ糖の機能を活用した新たな医薬品や機能性食品の提供が期待される。また、これらの新規オリゴ糖はＣＤＰａｓｅにより生成されるので、目的外の光学異性体の生成がない、効率的な生産が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノース、マンノース、ガラクトースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類であるオリゴ糖。
【請求項２】
アラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロースの何れかの単糖類の４位水酸基にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類及びマルトースからなる群から選ばれる二糖類を構成するグルコースに、β−１,４−結合により１ないし複数個のグルコースが結合した三糖類以上のオリゴ糖。
【請求項３】
グルコース−１−リン酸の存在下において、セロビオースを除く二糖類又は単糖類にセロデキストリンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記単糖類はアラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロースの何れかであり、前記二糖類はマルトースである請求項３に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
セロデキストリンホスホリラーゼが、Clostridium属に属する細菌由来である請求項３又は請求項４に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項１】
アラビノース、マンノース、ガラクトースの何れかの単糖類にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類であるオリゴ糖。
【請求項２】
アラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロースの何れかの単糖類の４位水酸基にグルコースがβ−１,４−結合した二糖類及びマルトースからなる群から選ばれる二糖類を構成するグルコースに、β−１,４−結合により１ないし複数個のグルコースが結合した三糖類以上のオリゴ糖。
【請求項３】
グルコース−１−リン酸の存在下において、セロビオースを除く二糖類又は単糖類にセロデキストリンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記単糖類はアラビノース、マンノース、ガラクトース、キシロースの何れかであり、前記二糖類はマルトースである請求項３に記載のオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
セロデキストリンホスホリラーゼが、Clostridium属に属する細菌由来である請求項３又は請求項４に記載のオリゴ糖の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１５５９１６（Ｐ２０１１−１５５９１６Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０７４６（Ｐ２０１０−２０７４６）
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ａ．産官学連携フェア２００９開催告知書 （１）刊行物名 「大阪府立大学産官学連携フェア２００９」の開催告知書 （２）発行日 平成２１年８月２５日 （３）発行所 （財）大阪市都市型産業振興センター 大阪産業創造館 イベント・セミナー事務局 （４）該当ページ 第２ページ （５）公開者 炭谷順一、片山貴之、谷修治、川口剛司 Ｂ．シーズガイドブック （１）刊行物名 大阪府立大学産官学連携フェア２００９ シーズガイドブック （２）発行日 平成２１年９月２４日 （３）発行所 公立大学法人大阪府立大学 産官学連携機構 （４）該当ページ 第１０〜１２ページ （５）公開者 炭谷順一、片山貴之、谷修治、川口剛司
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ａ．産官学連携フェア２００９開催告知書 （１）刊行物名 「大阪府立大学産官学連携フェア２００９」の開催告知書 （２）発行日 平成２１年８月２５日 （３）発行所 （財）大阪市都市型産業振興センター 大阪産業創造館 イベント・セミナー事務局 （４）該当ページ 第２ページ （５）公開者 炭谷順一、片山貴之、谷修治、川口剛司 Ｂ．シーズガイドブック （１）刊行物名 大阪府立大学産官学連携フェア２００９ シーズガイドブック （２）発行日 平成２１年９月２４日 （３）発行所 公立大学法人大阪府立大学 産官学連携機構 （４）該当ページ 第１０〜１２ページ （５）公開者 炭谷順一、片山貴之、谷修治、川口剛司
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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