新規ペプチド
【課題】 Ｔ細胞が関与している又はリクルートされている障害の治療手段を提供すること。
【解決手段】 式：Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ（式中、Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、Ｂは、正に荷電したアミノ酸、Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、Ｄは、正に荷電したアミノ酸、およびＥは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチド。
【解決手段】 式：Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ（式中、Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、Ｂは、正に荷電したアミノ酸、Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、Ｄは、正に荷電したアミノ酸、およびＥは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、おそらくＴ細胞抗原受容体に対する作用によりＴ細胞に作用するペプチドに関する。さらに本発明は、このペプチドの使用を含む種々の炎症性および自己免疫疾患状態の治療に関する。特に、該ペプチドは、Ｔ細胞が関与している又はリクルートされている障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、他の免疫細胞型（多形核、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と共に免疫系の細胞成分を構成する細胞のサブグループである。生理的条件下で、Ｔ細胞は免疫監視および外来抗原排除において機能する。しかしながら、病理的条件下で、Ｔ細胞が疾患の発生および伝達に大きな役割を果たしているという確固たる証拠がある。これらの疾患では、中枢的または末梢的のいずれかのＴ細胞免疫トレランスの破綻が、自己免疫疾患の発生の基本的な過程となっている。
【０００３】
中枢的トレランスには、自己反応性細胞の胸腺除去（負の選択）および自己主要組織適合複合体抗原（ＭＨＣ）に対して低い親和性を有するＴ細胞の正の選択が関与している。これに対して、組織特異的自己免疫疾患の予防に関与している末梢的Ｔ細胞トレランスを説明するために提案されている４つの非相互排除仮説（non-mutually exclusive hypotheses）がある。これらには、アネルギー（共刺激シグナルの喪失、Ｔ細胞活性化のために重要な受容体のダウンレギュレーション）、反応性Ｔ細胞の除去、免疫系による抗原の非認識、および自己反応性Ｔ細胞の抑制が含まれる。一旦誘導されたトレランスは、必ずしも無限に持続するわけではない。これらのメカニズムのいずれかの破綻により、自己免疫疾患が生じることがある。
【０００４】
自己免疫疾患および他のＴ細胞媒介性障害は、炎症部位へのＴ細胞のリクルートメント（recruitment）により特徴づけられる。この部位のＴ細胞は、サイトカインを産生し調節してＢ細胞機能に影響を及ぼす能力を有し、免疫応答を調整し、最終的な臨床結果を形成する。したがって、抗原認識およびそれに続く、Ｔ細胞の増殖および分化につながるＴ細胞活性化の過程を理解することは、健康および疾患の両方を考える上で非常に重要である。Ｔ細胞表面上の抗原認識に非常に重要な成分は、複合体抗原受容体（ＴＣＲ）であり、これは、抗原提示細胞表面上のＭＨＣ−コード化タンパク質との関連において抗原を認識する多サブユニット構造を有する。抗原認識とＴ細胞活性化とを統合するＴＣＲのこの複雑な構造−機能関係を妨害することにより、炎症およびＴ細胞媒介性疾患を治療する手段が得られるかもしれない。
【０００５】
ＴＣＲは、少なくとも７つの膜貫通タンパク質よりなる。ジスルフィド結合で連結した（αβ−Ｔi）ヘテロ二量体がクロノタイプ抗原認識単位を形成し、一方、ε、γ、δおよびζおよびη鎖よりなるＣＤ３の非変異鎖は、Ｔ細胞活性化および細胞性免疫応答の修飾を起こすシグナル伝達経路に該リガンド結合を結び付ける。ＴＣＲ鎖の遺伝子多様性にもかかわらず、２つの構造的特徴がすべての公知サブユニットに共通している。第１に、それらは、単一の膜貫通伸長ドメイン（おそらくα−ヘリカル）を有する膜貫通タンパク質である。第２に、該ＴＣＲ鎖のすべては、予想される膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を有するという独特の特徴を有する。該非変異鎖は、マウスとヒトとの間で保存されている単一の負電荷を有し、該非変異鎖は１つの（ＴＣＲ−β）または２つの（ＴＣＲ−α）正電荷を有する。以下の表１に、いくつかの種のＴＣＲ−αの膜貫通配列を示す。これは、系統発生的にこの領域が高度に保存されていることを示し、重要な機能的役割を果たしていることを示す。種間の置換は非常に保存的である。
【０００６】
【表１】
ＴＣＲ−αとＣＤ３−δ、およびＴＣＲ−αとＣＤ３−εとの間の安定な相互作用がＴＣＲ−αの膜貫通ドメイン内の８つのアミノ酸（前記において太字で示している）に局在し、この過程に非常に重要なのは荷電アミノ酸であるアルギニンおよびリジンであることが、Manoliosら（1990、 1991、 1994）による多成分ＴＣＲの集合に関する研究で示された。この知見は、該膜貫通ドメイン内のアミノ酸がアンカータンパク質に対して作用するだけでなく、サブユニット複合体の集合およびタンパク質−タンパク質相互作用において重要であるという事実を例示するものである。
【０００７】
前記の系は、多数のタンパク質突然変異体をつくる相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の修飾に依存的であった。キメラｃＤＮＡ分子をＣＯＳ（繊維芽細胞系）細胞中にトランスフェクションして、必要なタンパク質を発現させた。これらのキメラタンパク質の同時発現により相互作用領域を評価した。前記を再度説明すると、その技術はｃＤＮＡ操作、代謝標識、免疫沈降法およびゲル電気泳動を含むものであった。
【０００８】
膜貫通ドメインは小さく、この領域を横切るタンパク質は、通常、α−ヘリックス立体配置に拘束される。膜貫通荷電基を介したタンパク質−タンパク質相互作用の操作が可能であることと、これらの生物物理学的特徴とは、ＴＣＲ機能に影響を及ぼしそれを潜在的に妨害するための可能な新しいアプローチを本発明者に示唆した。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、この非常に重要な受容体の機能の阻害剤（おそらく、集合の阻害によるのであろう）である一連のペプチドを開発した。また、本発明者は、これらのペプチドがＴ細胞媒介性炎症に作用し、カルボキシ末端結合によっても該ペプチドの機能が改変されないことを見いだした。このことは、作用を増大させるが機能を喪失させない脂質担体系にペプチドを結合させることにより例示される。さらに、本発明者は、該ペプチドは単独で細胞内輸送能を有し、潜在的に有効な薬物送達系となりうることを見いだした。例えば関節炎のアジュバントモデルにおける関節炎の減少により示されるとおり、該投与ペプチドの有効な臨床的発現は炎症の減少であろう。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、式：
A-B-C-D-E
（式中、
Ａは、不存在または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸よりなるペプチド、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
で示されるペプチドである。
【００１１】
また本発明は、式：
Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ
（式中、
Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチドを提供する。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様では、Ｃは３〜４個の疎水性アミノ酸である。
【００１３】
さらに本発明の好ましい実施態様では、Ａは２個の疎水性アミノ酸であり、Ｅは１〜３個、好ましくは１個の疎水性アミノ酸である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様では、ＢがアルギニンでありＤがリシンである、またはＢがリシンでありＤがアルギニンである。ＢおよびＤは、Arg、LysおよびHisからなる群より選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、該ペプチドは、Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val、Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val、Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val、またはPhe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Valである。
【００１６】
本発明の第２の態様は、本発明の第１態様のペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物（治療用組成物）である。該組成物は、Ｔ細胞が媒介する障害を治療するために用いることができる。
【００１７】
本発明の第３の態様は、Ｔ細胞が関与している又はリクルート（recruited、動員、補充）されている障害に罹患した患者の治療方法であって、本発明の第２態様の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含んでなる方法である。
【００１８】
該治療用組成物は、当業者に認識されるいずれの適当な経路により投与してもよい。かかる経路としては、経口、経皮、鼻内、非経口、関節内、眼内などが挙げられる。
【００１９】
本発明の第４の態様は、化学的部分を細胞へ輸送する方法であって、上記ペプチド（好ましくは、そのカルボキシ末端）に結合した化学的部分に細胞をさらすことを含んでなる方法である。
【００２０】
Ｔ細胞が関与している／リクルートされている障害としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：
アレルギー素質、例えば遅延型過敏症、接触皮膚炎、
自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、
胃腸病状態、例えば炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、
皮膚問題、例えば乾癬、尋常性天疱瘡、
感染性疾患、例えばエイズ、単純／帯状ヘルペス、
呼吸状態、例えばアレルギー性肺胞炎、
心臓血管問題、例えば自己免疫心膜炎、
臓器移植、
炎症状態、例えば筋炎、強直性脊椎炎。
【００２１】
また本発明は、Ｔ細胞が媒介する障害を治療するための医薬の製造における、上記ペプチドの使用に関する。
【００２２】
本明細書中で用いる「患者」なる語は、ヒトおよびヒト以外の動物の両方を包含する意である。
【００２３】
前記の考察からわかるとおり、本発明のペプチドは、ＴＣＲ−αの膜貫通ドメインの一部に基づく。この部分の完全なマウス配列は、
であり、一方、対応するヒト配列は、
である。本発明のペプチドの基礎となっている配列（太字で示している）の遠位にあるＴＣＲ−α鎖の最後の１５個のアミノ酸においては、様々な種の間で、完全な配列の相同性がある。これらの追加的な１５個の残基を含むペプチドは、本発明のペプチドと同様の活性を有するかもしれない。その本質的特徴は、該ペプチドが、３〜５個の疎水性アミノ酸により分離された２個の正に荷電したアミノ酸を含むことである。さらに、以下の実施例から明らかとなるように、本発明のペプチドは、活性の喪失を伴うことなくカルボキシ末端を修飾しうる。したがって、本発明のペプチドの「コア」配列に対する追加的アミノ酸を含みＴ細胞抗原受容体に作用するペプチドも、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００２４】
以下の実施例で示すとおり、本発明のペプチドは細胞に侵入する能力を有する。したがって、本発明のペプチドは、それが有する他の用途以外に、他の治療剤を細胞へ輸送する「担体」として使用できると考えられる。これは、例えば、細胞内へ輸送しようとする治療剤を本発明のペプチドに結合させることにより行うことができる。
【００２５】
当業者であれば容易に理解できるように、疎水性アミノ酸は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、TyrおよびMetであり、一方、正に荷電したアミノ酸はLys、Arg、およびHisである。
【００２６】
本発明の性質の理解がより明確となるように、以下、実施例により本発明の好ましい態様を説明する。
【実施例１】
【００２７】
ペプチドの合成
第１工程においては、前もって決定されている集合配列に対応する短い疎水性ペプチドを合成した。競合ペプチドのアミノ酸配列は、NH２-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OHであり、以下これを「コアペプチド」と称する。ついで、表２に挙げるいくつかの他のペプチドを合成し（純度は９５％以上、Auspep Australia, Melbourne, Australiaによる）、Ｔ細胞機能および炎症に対するそれらの効果を調べた。
【００２８】
【表２】
【実施例２】
【００２９】
溶解性
コアペプチドおよび上に挙げた他のペプチドは、疎水性であり水溶液に不溶性であることが判明した。種々の溶媒および担体を試験した。これらには、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、スクアラン油（２,６,１０,１５,１９,２３−ヘキサメチルテトラコサン）、およびトリス結合（TRIS-conjugation; Whittaker R.G., Bender V. J. 1991）を介してコアペプチドにパルミチン酸を付加させることによる溶解性を増大させるための脂質結合が含まれていた。好ましい溶媒はＤＭＳＯであり、細胞培養で用いた最終濃度は０.１％〜０.２％であった。ＤＭＳＯ濃度が１％を越えると、細胞に対する毒性が生じた。ペプチドおよびリポペプチド複合体の保存溶液をＤＭＳＯに溶解し、１／１０００希釈で使用した。
【００３０】
ＤＭＳＯ中のペプチド／リポペプチドを水溶液に加えることにより、組織培養フラスコの底に沈降する難溶性の「脂肪」または「結晶」粒を得た。これらの粒子は位相差顕微鏡で見ることができたが、脂質複合体についてはそれほど明白ではなかった。
【００３１】
Ｃ１４−グリシン（Ｃ１４−ペプチド）を含有するコアペプチドをAuspep Australiaにより合成し、溶解性を調べるのに使用した。ＤＭＳＯに溶解／懸濁したＣ１４−ペプチドを、Ｔ細胞培地（１０％ウシ胎仔血清および０.３％メルカプトエタノールで補充したＲＰＭＩ１６４０；ＴＣＭ）に最終濃度が１００μMになるまで加え、振盪した。該培地を遠心分離し、上清を０.２μMフィルターで濾過するか又は未分離のまま放置した。未分離培地中の全放射活性は２０,０００cpmであり、培地を遠心分離した後は１０００cpmであり、培地を濾過した後は５００cpmであった。これらの実験はin vitroでのペプチドの不溶性を強調するものであり、約５％が溶解することを示唆する。
【実施例３】
【００３２】
細胞中へのペプチドの侵入
ペプチドが細胞へ侵入するか否かを調べるために、最終濃度が１００μMの５×１０６個の２Ｂ４.１１細胞（シトクロームｃに特異的なＴ細胞ハイブリドーマ）および０.２％ＤＭＳＯのフラスコにＣ１４−ペプチドを加え、一晩インキュベーションした。付着細胞をフラスコ中でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄し、トリトン含有緩衝液で可溶化し、放射活性を計数した。上清中の放射活性量は７０,０００cpmであり、可溶化細胞中では５０００cpmであった。
【００３３】
前記実験の変法においては、２Ｂ４.１１細胞（７.５×１０４個）を、２mlのＴＣＭを含有するペトリ皿中で成長させ、０.４μMの膜を有する「トランスウェル（Transwell）」をペトリ皿中に入れた。最終濃度１００μMのＣ１４−ペプチドおよび０.１％ＤＭＳＯを該「トランスウェル」に加え、２４時間および４８時間のインキュベーションの後、フィルターの両面上および細胞中の計数を測定した。放射活性の約８５％が「トランスウェル」中に、８％がペトリ皿中に、７％が細胞内にそれぞれ保持された。前記実験は、ペプチドが細胞に侵入する能力を有することを示した。ペプチドの溶解性が低い（５％〜１０％）ことを考慮すると、溶解している可能なペプチドのすべてが細胞に侵入したことになる（７％）。
【実施例４】
【００３４】
Ｔ細胞中におけるフルオレセイン結合ペプチドの細胞内局在
溶解する僅かのペプチドが細胞に侵入または取り込まれうることが実験から示唆された。このことを確認するために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に共有結合したコアペプチドをＴ細胞に加え、共焦点または通常の紫外線顕微鏡を用いて可視化することにより細胞内局在を判定した。
【００３５】
フルオレセイン結合標識コアペプチドを以下のとおり調製した。コアペプチド１０.２５mgをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０.５mlに溶解し、ＤＭＦ０.５ml中のＦＩＴＣ２μMを室温で撹拌しながら滴下した。Ｎ−メチル,Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミンでpＨを９に調整し、反応を１時間進行させた。ついで、Ｃ−４カラム（６ml/分; 緩衝液Ａ、０.１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、８０％アセトニトリル、２０％水；０.１％ＴＦＡ；Ｂが４０％〜１００％である直線勾配）を用いる半分取ＨＰＬＣにより、遊離ＦＩＴＣからＦＩＴＣ−ペプチドを分離した。分析用ＨＰＬＣにより画分をモニターし、純粋なフルオレセイン結合コアペプチド（ＦＩＴＣ−ペプチド）を含有する画分をプールした。
【００３６】
２つのフラスコの培養２Ｂ４.１１細胞（５×１０６個）を遠心沈殿させ、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＰＢＳに再懸濁した。１つのフラスコへは、ＤＭＳＯに溶解したＦＩＴＣを最終濃度が１０μMになるまで加え、もう一方のフラスコへはＦＩＴＣ−ペプチド１０μMを加えた。両フラスコ中のＤＭＳＯの最終濃度は、Ｔ細胞に影響を及ぼさないことが既に示されている０.１％であった。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションし、ついで共焦点顕微鏡下で検査した。
【００３７】
その観察は以下のとおり要約することができる：（ｉ）ＦＩＴＣおよびＦＩＴＣ−ペプチドは細胞に侵入した；（ii）細胞中、遊離ＦＩＴＣはＦＩＴＣ−ペプチドより明るい蛍光を示した；（iii）細胞内染色パターンは、遊離ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ペプチドとの間で相違せず、核および特に明るい核小体の染色が観察された；（iv）ＦＩＴＣによるペプチドの結合は、細胞内へのペプチドの侵入を妨害しなかった；（ｖ）細胞からのＦＩＴＣ−ペプチドの「浸出」は５時間にわたり全くなかった。これらの実験は、ＦＩＴＣ−ペプチドが細胞に取り込まれ、細胞内に局在しうることを示す。Ｃ１４−ペプチドによる細胞内取り込みを示す既に記載した実験と考え合わせると、細胞侵入を可能にするのは該ペプチド配列に固有の性質であり、その複合体（ＦＩＴＣ、Ｃ１４）の性質ではないことが明らかである。
【実施例５】
【００３８】
コアペプチドカルボキシル末端のトリス−脂肪結合
脂質結合で例示したのと同様にして、この非常に重要な受容体の機能を競合的に阻害するペプチドの能力に対してコアペプチドのカルボキシル結合が与える影響を調べた。投与リポペプチドの有効臨床発現は、例えば、ペプチドの場合に観察され、関節炎のアジュバントモデルにおける関節炎の減少により示されるのと同様、炎症の減少であろう。コアペプチドを脂質結合させたほか、いくつかの他のリポペプチドを合成し、後続の実験の対照として使用した。該リポペプチドは、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J. (1993) Peptide Research 6, 125および豪州特許第649242号に記載の方法により合成した。これらに文献の開示は、クロスレファレンスにより本明細書の一部とする。
【００３９】
フルオレセイン標識されたGly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Gly-トリス-モノ−およびトリ−パルミテートの調製。ＤＣＭ（１ml）中の脱保護されたリポペプチド（１５および６mg）のそれぞれの溶液へ、撹拌しながらＦＩＴＣ（４mg１０μモル）のＤＭＦ（５００μl）溶液を加えた。トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えることにより、反応の見かけpＨを９.０に維持した。ペプチドのフルオレセイン−標識モノおよびトリ−パルミトイル誘導体を、半分取ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、System B）により精製した。精製化合物を蒸発乾固させ、tert-ブチルアルコールから凍結乾燥して、フルオレセイン標識ペプチドモノパルミテート（ＲｔＢ、７.８３）およびトリパルミテート（ＲｔＢ、９.８５）を得、これらを以下のとおり試験した。
【００４０】
フルオレセイン標識リポペプチドのＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭeＯＨ, ９５：５）は、遊離ＦＩＴＣおよび遊離Gly-トリス−モノパルミテートおよびGly-トリス−トリパルミテート（リポペプチド合成で使用したもの）の不存在を示した（ニンヒドリン染色による）。
【００４１】
固相ペプチド合成。Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val（コアペプチド）およびその完全保護形態であるBoc-Gly-Leu-Arg(PMC)-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Val-OH（およびＣ１４−標識ペプチド）をAuspep Pty Ltd.より入手した。両方とも、手動形式のＦＭＯＣ−化学法により合成した。
【００４２】
また、カルボキシル基を有する化合物（例、ペプチド）をアミノ基に結合させるのに使用できる多数のよく知られたリンカーがあることは、当業者であれば容易に理解できるであろう。これらには、以下のものが挙げられる。
ａ）該化合物に対するアミノ基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するカルボキシル基を有するリンカー、例えばアミノ酸または抗生物質。
ｂ）該化合物に対するアミノ基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するスルホン酸基を有するリンカー、例えば２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）。
ｃ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するカルボキシル基を有するリンカー、例えばグリコール酸、乳酸など。
ｄ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するスルホン酸基を有するリンカー、例えば２−ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）。
ｅ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対する反応性ハライド基を有するリンカー、例えば２−クロロエタノール。
ｆ）反応性カルボキシルを有する化合物とトリス（または存在するのであればアミノ酸）のアミノ基との間の潜在的に適当なリンカーの他の具体例としては、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、２−クロロ酢酸、１,２−ジブロモエタン、エチレンオキシドなどの化合物群が挙げられる。
【００４３】
また、リンカーは、還元されて修飾ペプチドを細胞内に遊離させるジスルフィド基を含有していてもよい。
【実施例６】
【００４４】
ＣＯＳ細胞におけるＦＩＴＣ結合リポペプチドの局在
共焦点顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ結合リポペプチドが非Ｔ細胞（ＣＯＳ細胞−繊維芽細胞）へ侵入する能力を調べた。
【００４５】
材料：
ＤＭＳＯ中の保存濃度− コアペプチド.トリス.モノパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量１８６２）１０mM; コアペプチド.トリス.ジパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量２３３４）１０mM; コアペプチド.トリス.トリパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量２８０６）１０mM; グリシン.トリス.モノパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量８０５）１０mM; グリシン.トリス.トリパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量１２８６）１０mM; ＦＩＴＣ（分子量３９０）６.４mM。
【００４６】
方法：
ＣＯＳ細胞をカバーグラス上で８０％密集まで成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合リポペプチドと共に１５分間または２時間インキュベーションした。リポペプチドの最終濃度は、それぞれの時点でＦＩＴＣについて１０μMおよび６.４μMであった。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／グリセロールと共にスライドに載せ、共焦点顕微鏡で検査した。
【００４７】
結果：
実験が示したところによると、フルオレセイン結合リポペプチドは細胞膜を横切って移動し細胞質内に局在でき、タンパク質合成の場である小胞体（ＥＲ）にまで到達する。細胞貫通の程度は、ペプチドに結合している脂質部分により影響された。前記リポペプチドのうち、モノパルミテートの場合には、これまで検査した繊維芽細胞およびＴ細胞内で浸潤する能力がより大きかった。ＥＲは、集合を試行し実施する最良の部位である。すべての鎖が集合し、細胞表面まで輸送されたら、細胞表面膜にて受容体を破壊することは一層困難となるであろう。ペプチドの標的となるＥＲは、ＴＣＲ複合体を破壊する理想的な部位である。
【実施例７】
【００４８】
ＦＩＴＣ結合リポペプチドのＴ細胞における局在
共焦点顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ結合リポペプチドがＴ細胞に侵入する能力を調べた。
【００４９】
材料：
前記のリポペプチド。２Ｂ４.１１Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞系。
【００５０】
方法：
２Ｂ４.１１Ｔ細胞をＴＣＭ中で成長させ、８×１０５細胞／mlの濃度で再懸濁した。生存度＞９５％（トリパンブルーを使用）。細胞１mlをポリプロピレン管に加え、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、１マイクロリットルの保存ＦＩＴＣ結合リポペプチドを３０分間加えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／グリセロールと共にスライドに載せ、共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００５１】
結果：
ＣＯＳ細胞（前記）と同様であった。結果は、リポペプチドがＴ細胞へ侵入する能力を有することを示した。ペプチドの脂質結合は、細胞へのペプチドの侵入を妨害しない。そして、それは、溶解性を増大させる担体ビヒクルとしての潜在的な用途を有する。
【実施例８】
【００５２】
フローサイトメトリー分析を用いた場合のＴ細胞上でのＴＣＲの集合および細胞表面発現に対するペプチドおよびリポペプチドの効果
材料：
完全ＴＣＲを細胞表面上で発現するＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４.１１を陽性対照として使用して、ＴＣＲ発現に対するペプチドの効果を評価した。該細胞をＴＣＭ中で成長させた。２Ｂ４.１１細胞の反復サブクローニング（Sussmanら,1988）およびＴＣＲ発現の喪失により誘導したβ−欠陥変異体２１.２.２並びにβ−およびζ−欠陥細胞系３.１２.２９を陰性対照として使用した。
【００５３】
被検ペプチドには、コアペプチド、リポペプチドおよび５５８と称される腫瘍壊死因子受容体からのペプチド（陰性対照として使用）が含まれた。インキュベーションで使用した各物質の最終濃度は、１０μMであった。
【００５４】
抗体
免疫沈降法およびフローサイトメトリー分析には以下の抗体を使用した：Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４（Ａ２Ｂ４−２, Samelsonら, 1983）のＴＣＲ−α鎖に対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、２Ｂ４.１１ＴＣＲ−β鎖（ＫＪ２５）に対するＭＡｂ、ハムスターＩｇＧ抗ＣＤ３−εＭＡｂ（１４５−２Ｃ１１[２Ｃ１１], Leoら, 1987）、精製マウスＣＤ３−εに対して産生させたウサギ抗ＣＤ３−εポリクローナル抗血清（127, Minamiら, 1987）、マウスＣＤ３−δ鎖のＣＯＯＨ末端ペプチドで免疫したヤギで産生させた抗ＣＤ３−δポリクローナル抗体（Ｒ９）（Samelsonら, 1986）。
【００５５】
方法：
ＦＡＣＳ分析：１×１０６個の（２Ｂ４.１１，２１.２.２）細胞を、最終濃度１０μMのいくつかの別々のペプチドおよびリポペプチドと共に一晩インキュベーションした。ついで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μlの一次抗体（Ａ２Ｂ４または２Ｃ１１）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳおよび０.１％ＢＳＡ中で２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識二次抗体と共に４℃でさらに３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳおよび０.１％ＢＳＡでさらに２回洗浄した後、Becton-Dickson FACS AnalyserまたはBecton-Dickson FACSScan上で分析した。
【００５６】
結果
コアペプチド対照ペプチドまたはリポペプチドで処理した２Ｂ４.１１細胞上でのＴＣＲの発現は、受容体の細胞表面発現を変化させなかった。より高濃度（１００μM）のコアペプチドを用い、より長時間のインキュベーション時間（１〜１０日間）をかけてこれらの実験を繰り返したところ、結果は同じであり、Ｔ細胞表面抗原受容体発現の変化は示されなかった。
【００５７】
以下の実験は、Ｔ細胞機能に対するペプチド／リポペプチドのin vitro効果を評価するために行った。
【実施例９】
【００５８】
抗原提示アッセイＩ
抗原提示アッセイ（以下に記載）では、Ｔ細胞活性化産物であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）を定量することにより、抗原認識後にいくつかのペプチドがＴ細胞活性化を阻害する能力を調べた。
【００５９】
材料
以下の細胞系を使用した：２Ｂ４.１１、完全抗原受容体を細胞表面上で発現し（Samelsonら, 1983）、抗原認識後にＩＬ−２を産生するＴ細胞ハイブリドーマ（シトクロームｃ）、通常の生物学的ＩＬ−２アッセイのためのインターロイキン−２依存性Ｔ細胞系（ＣＴＬＬ）、および抗原提示細胞として作用するＢ細胞ハイブリドーマ細胞系ＬＫ３５.２（ＬＫ、Ｉ−ＥＫ担持；Kapplerら, 1982）。ハイブリドーマをＴＣＭ中で成長させた。シトクロームｃ（Sigma, USA）を培地に加えて、抗原提示アッセイにおける５０μMの最終濃度を得た。
【００６０】
調べたペプチドには以下のものが含まれていた：コアペプチド、コアペプチドと同等の長さを有する種々の起源からの７個の他の対照ペプチド並びにペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ。抗原提示アッセイにおけるペプチドの最終濃度を、１０μM〜１００μMのいくつかのレベルで調べた。
【００６１】
方法
Ｔ細胞抗原刺激のために、２×１０４個のＬＫ３５．２細胞を、ＰＢＳに溶解した５０μMのハトのシトクロームｃおよび２×１０４の２Ｂ４.１１Ｔ細胞と共に１６時間共培養した。アッセイは３つ組で行った。上清を回収し、ＩＬ−２含量をＣＴＬＬ増殖により測定した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、上清中に存在するＩＬ−２量と正比例する。種々のペプチドのＩＬ−２産生阻害能を調べた。３Ｈ−チミジン取り込み量の測定に加えて、ＩＬ−２量（IU/ml）も測定した。
【００６２】
結果
シトクロームｃ（抗原）またはＬＫ細胞（抗原提示細胞）のいずれかの不存在下でのアッセイでは、ＩＬ−２産生は生じなかった。このような条件下でＴ細胞活性化が生じないことは、非特異的にＴ細胞を活性化している可能性がある溶液中にリポ多糖（ＬＰＳ）もエンドトキシンも存在しないことを示すものであった。ＣＴＬＬ細胞による高い３Ｈ−チミジン取り込み（２２,０００cpm）により測定したところ、前記濃度でのアッセイ成分の３個すべての組み合わせによりＩＬ−２の産生が生じた。コアペプチドまたは他の類似体を該アッセイ系に加えた場合、ＩＬ−２の産生量はそれぞれで異なっていた。１０μMのすべての被検ペプチドは、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。最良の効果は、１００μMのコアペプチドおよびペプチドＣ（１００μM）で認められ、対照と比較してＩＬ−２産生の１５％〜３０％の減少につながった。これは少なくとも３つの独立した場合で再現性があった。ペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦのＴ細胞活性化に対する影響は、一定せず小さかった。該ペプチドに対して同等の長さを有するが配列相同性を有さない７個の対照ペプチドは、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。
【００６３】
抗原提示アッセイに加える前にコアペプチドおよび他のペプチドをＴＣＭ中３７℃で前インキュベーションすると、溶解性および活性が向上した。これは、新たに調製されたペプチドで認められる基準活性を越える追加的増加として示された。
【実施例１０】
【００６４】
抗原提示アッセイII
Ｔ細胞機能に対するリポペプチドのin vitro効果を評価するために以下の実験を行った。
【００６５】
材料
被検リポペプチドには、コアペプチドトリス−モノパルミタート（１００μMおよび０.１％ＤＭＳＯ）およびコアペプチドトリス−トリパルミタート（１００μMおよび０.２％ＤＭＳＯ）が含まれていた。抗原刺激アッセイにおけるその２つのリポペプチドの最終濃度を、括弧内に示す。
【００６６】
方法
実施例９で示したとおりである。
【００６７】
結果
まず、コアペプチドトリス−トリパルミタート（１００μMおよび０.２％ＤＭＳＯ）を加えた場合、Ｔ細胞活性化は７５％減少した（最高計数５,１９０cpm。対照の２２,０００と比較されたし）。コアペプチドトリス−モノパルミタート（１００μMおよび０.１％ＤＭＳＯ）の添加は、ＩＬ−２産生に対して顕著な効果を示し、わずか１３７cpm（バックグラウンドと同等）が記録されたにすぎなかった。試験系で用いた０.１％ＤＭＳＯおよび０.２％ＤＭＳＯの濃度に関して調べたが、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさないことが判明した。後続の実験によりこれらの知見が確認され、対照と比較して８６％〜９２％のＩＬ−２産生が示された。抗原提示アッセイ系に加えた、ペプチドに結合させるのに用いたパルミチン酸（１００μM）は、単独ではＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。
【００６８】
以下の実験では、コアペプチドが投与後に動物体内を循環する能力および実験的に誘導された炎症に対する効果を調べた。
【実施例１１】
【００６９】
Ｃ１４−コアペプチドの分布
皮下注射したペプチドのマウスにおける分布を調べるために、Ｃ１４−コアペプチド（５mg/マウス）を１５０マイクロリットルのスクアラン油に溶解し、Balb/cマウスの尾の基部に注射した。２４時間後に、パルプ化（pulped）器官から計数を測定した。該ペプチドの分布は、胸腺（５％）、脾臓（７％）、血液（３％）で、またリンパ節（２８％）、腎臓（３０％）および肝臓（２８％）では大きな比率で認められた。
【００７０】
実験をさらに拡大して、コアペプチドが炎症の動物モデルで疾患を予防する能力についても調べた。ラットにおけるアジュバント誘導関節炎、ＮＯＤマウスにおけるシクロホスファミド誘導糖尿病およびラットにおける実験アレルギー性神経炎を含むin vivoでの３つの実験モデルを用いた。２つの種を含むこれらのモデルでは、コアペプチドは炎症の程度に影響を及ぼす能力を有していた。
【実施例１２】
【００７１】
実施例１２（ａ） ラットにおけるアジュバント誘導関節炎
ラットアジュバント関節炎モデルは、疾患の進行およびそれに対する潜在的な新規抗炎症薬の効果を研究するために多数の研究所でここ３０年間にわたり広範に用いられている、炎症の古典的なモデルである（Pearsonら, 1961; Cremerら, 1990; HomdahlおよびKvick, 1992; Cannonら, 1993）。また、このモデルは、Royal North Shore Hospitalの研究者によりここ１０年にわたり広範に用いられており、この炎症モデルの研究のための方法は確立している。動物に対するすべての操作は、ハロタン／酸素／一酸化二窒素麻酔（１リットル/分Ｏ２および２リットル/分Ｎ２Ｏ中の２％ v/vハロタン）下で行った。ラットの尾の基部に最小アジュバント量（１００μlのスクアラン中の１mgの熱不活化結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス, Mycobacterium tuberculosis（ＭＴＢ）））を１回および１回だけ皮内注射した。試験サンプルをＭＴＢと共投与する方法は、Whitehouseら（1990）が最初に記載している。０〜２８日の一定の間隔で、動物を秤量し、最大の尾の太さおよび後脚の太さを測定することにより（マイクロメーターねじゲージ）、その関節炎状態を評価した。最初の尾注射後、ラットを保存箱に収容し、水および固形飼料に自由に近づけるようにした。２９日目に、該動物を殺した。
【００７２】
材料
第１の実験では、Perth Animal Resource Centre（ARC）より購入しGore Hill Animal House施設で飼育した体重が約１９０〜２１０グラムの１２匹のラットを使用した。アジュバント（７mgＭＴＢを含有する０.６mlスクアラン）に懸濁したコアペプチド（３０mg）、０.６mlのアジュバントに懸濁したコアペプチドトリス−モノパルミタート（１５mg）、コアペプチドトリス−トリパルミタート２０mg（０.６mlのアジュバントあたり）を使用した。
【００７３】
ラットを、それぞれ３匹のラットを含む４群に分けた。第１群には、アジュバントのみ（陽性対照）を、第２群にはアジュバントおよびコアペプチドを、第３群にはアジュバントに懸濁したコアペプチド.トリス.モノパルミタートを、そして最後の群にはアジュバントに懸濁したコアペプチド.トリス.トリパルミタートをそれぞれ投与した。ラットの尾の基部に、０.１ml容量中の前記化合物を注射した。ラットの体重、脚の太さおよび尾の直径の基準測定を、０日目、およびついで４、７、９、１４、１６、１８、２１、２５および２８日目に行った。顕著な膨潤、発赤および明らかな不快感があれば、関節炎を等級付けし、動物を殺した。ＭＴＢを投与したすべてのラットが関節炎を発症したわけではなかった。一般に、対照ラットの８０％以上が関節炎を発症した。
【００７４】
結果
１８日後、アジュバントのみを投与したすべての対照動物が関節炎を発症し、殺さなければならなかった。３匹のコアペプチド処理動物のうちの２匹（２／３）は、関節炎の徴候を示さなかった。同様に、コアペプチド.トリス.トリパルミタートを投与した３匹の動物のうちの２匹は、関節炎の徴候を示さなかった。コアペプチド.トリス.モノパルミタートおよびアジュバントを投与した動物はすべて関節炎を発症した。しかしながら、この最後の群における関節炎の発現および発症は、対照と比べて３〜４日遅延し、臨床的重症度ははるかに減少した（関節数、脚膨潤、体重減少）。
【００７５】
ラットにおけるアジュバント誘導関節炎を用いる実験は、ペプチドおよびその脂質複合体が、この動物モデルにおける関節炎の誘導に対して防御的効果を有することを示した。いくつかの異なるペプチド（７mg/ラット）および薬物を用いる反復的なその後の実験の結果を、表３に要約する。
【００７６】
【表３】
【００７７】
前記実験の結果は、コアペプチドが炎症に影響を及ぼして、その発現を遅延させ、重症度を減少させ、そして疾患の発現を防ぐことを示した。これらの効果は、シクロスポリンとアジュバントとの共投与で得たものと同様であった。シクロスポリンは、よく知られ広く使用されている免疫抑制剤である。ペプチド作用の無差別な効果はなかった。コアペプチド、ペプチドＣおよびＦで最良の結果が認められた。コアペプチドおよびペプチドＣはそれぞれ、同じ部位に荷電アミノ酸基を有するが、アミノ酸は逆になっている。このことは、重要なのは特定のアミノ酸ではなく荷電基であることを示すものであった。これに対して、それぞれ荷電基を有さないか又は負の荷電基を有するペプチドＢまたはＤでは効果は認められなかった。アミノ酸をカルボキシ末端へ下流に伸長させても、負の効果は生じなかった。この観察は、カルボキシ修飾を行っても生物学的活性が喪失しないことを証明するものである。したがって、これらのペプチドは、他の化学的部分の輸送のための担体ペプチドとして使用することができる。その２つの極性荷電基の間のアミノ酸数を増加させると（ペプチドＥ）、効力が減少した。荷電基の間のアミノ酸数を減少させても（ペプチドＦ）、負の効果は生じなかった。
【００７８】
実施例１２（ｂ） コアペプチドの用量効果
Whitehouseら（個人的書信）により既に行われている実験に基づき、初期投与量
を５〜７mg/ラットとした。下限を評価するために、いくつかの異なるコアペプチド濃度を調べた。その結果（表４）は、それは、コアペプチドの特異的作用に加えて、投与量によるその効果により制限されることを示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
実施例１２（ｃ） 尾の直径の測定
アジュバント誘導関節炎の特徴は、尾における炎症の発症である。生理食塩水を注射したラットとコアペプチドで処理したラットとの間の尾の測定値差（mm）は統計学的に有意ではなかった。しかしながら、ＭＴＢ処理ラットの尾の直径は、生理食塩水およびコアペプチド処理ラット（ｐ＜０.００１）に比べて有意に増加した（ｐ＜０.００１）（表５）。
【００８１】
【表５】
【００８２】
ＭＴＢのみをラットに投与した場合、尾に浮腫が認められたほか、注射部位に潰瘍および炎症が生じた。これは、コアペプチドまたは生理食塩水を投与したラットには存在しなかった。
【実施例１３】
【００８３】
実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）
Ｔ細胞により誘導された疾患の重症化を遅延させ抑制するコアペプチドの能力をさらに確認するために、異なる施設（University of Sydney）での独立した実験者（Pollard準教授およびJ Taylor氏）により「盲検的」に、異なるモデル（実験アレルギー性神経炎）を試験した。
【００８４】
材料および方法
動物
体重２３９〜４５１グラムの雄LewisラットをBosch Animal House, University of SydneyのコロニーまたはＡＲＣ, Perthから入手した。すべての実験は、University of SydneyのAnimal Care and Ethics Committeeにより承認されている実験ガイドラインに従って行った。
【００８５】
ＥＡＮの誘導
完全フロインドアジュバント中に乳化した５０〜７５μlのウシ末梢神経ミエリン（ＰＮＭ）を、Lewisラットのそれぞれの後足蹠に免疫した。免疫エマルションは、等容量の生理食塩水および不完全フロインドアジュバント（Sigma, USA）にそれぞれ１５mg/mlおよび５mg/mlのウシＰＮＭおよびＭＴＢ（Ｈ３７ＲＡ株, DIFCO）を加えて混合したものよりなるものであった。動物に卵アルブミン／ペプチドを投与する場合は、ペプチドを７０mg/mlにて免疫エマルションへ加えた。これらの実験は、免疫エマルション中のペプチドの種類を伏せた実験と共に行った。
【００８６】
動物は、臨床徴候に関して免疫後少なくとも２日おきに観察し、以下の分類によりスコア化した：０、正常；０.５、弱っている尾；１、弛緩性の尾；１.５、しまりのない尾および後脚の運動失調；２、不全対麻痺；２.５、しまりのない尾および重篤な不全対麻痺；３、対麻痺；３.５、しまりのない尾および対麻痺および前肢不全麻痺；４、四肢麻痺(quadraparesis)；４.５、しまりのない尾および四肢麻痺（quadraplegia）；５、死亡。
【００８７】
末梢神経ミエリンの単離
ウシＰＮＭは、本質的にNortonおよびPodulso（1973）の記載のとおりに調製した。
【００８８】
結果
代表例を図１に示す。この実験では、コアペプチドは疾患の誘導および臨床的重症化を遅延させた。ペプチドＣについても同様のデータを得た。これらのデータは、コアペプチドおよびペプチドＣの一般的な免疫抑制剤としての有効性を証明するものである。
【実施例１４】
【００８９】
ＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウスにおける糖尿病
Ｔ細胞媒介性疾患のさらに別のモデルでは、ＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウスにおける糖尿病の誘導に対する皮下注射コアペプチドの効果を、独立した実験者（L Harrison教授, WEHI, Melbourne）により「盲検的」に試験した。
【００９０】
膵島β細胞を選択的に破壊する細胞性自己免疫過程は、ヒトおよびＮＯＤマウス（Leiterら, 1987）などの自発性動物モデルにおけるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発症の原因となると考えられている。ＩＤＤＭの発症に関連した共通の組織病理学的特徴は、インスリン炎、すなわち主としてＴリンパ球およびそれより少量のマクロファージよりなる単核細胞が島内部および周辺部に存在することである（Foulisら, 1986）。新生児の胸腺摘出、シクロスポリンＡの投与、抗Ｔリンパ球抗体の投与などの細胞性自己免疫を抑制するための実験戦略により、糖尿病の発症が予防される（Campbellら, 1991）。
【００９１】
動物
実験初日（０日目）に１０週齢のＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウス。これは、糖尿病の動物モデルとして一般に使用される高発生系統である。
【００９２】
材料
保存濃度が３.３３mg/mlの、スクアランに溶解したコアペプチド。対照として使用する卵アルブミンを、保存濃度が３.３３mg/mlとなるようスクアランに懸濁した。ペプチドおよび卵アルブミンを、注射直前にボルテックスして可溶化した。合計２５０μg（７５μl）を右脇に−１、０および１日目に皮下注射した。０日目に、水中のシクロホスファミドを３００mg/kgでマウスに腹腔内投与した。０、１０、１４および２１日目に、血液グルコースの測定を行った。処理群には１６匹のマウスを、卵アルブミン対照群には１６匹のマウスを用いた。
【００９３】
結果
実験は、糖尿病として発現される自己免疫β細胞破壊の誘導に対するコアペプチドの防御的効果を示す（表６）。この場合もまた、この知見は、異なるＴ細胞媒介性疾患モデルにおけるコアペプチドの一般的な免疫抑制能を証明するものである。
【００９４】
【表６】
【００９５】
要約
近年、ＴＣＲ、ＭＨＣまたは抗原（三分子複合体）の間の相互作用を妨害し、それにより免疫応答に影響を与えるための非常に多くの種々の方法が使用され工夫されてきている。これらの着想および適用方法の開発に関連した治療的潜在性が見落とされているわけではない。その戦略としては、ＭＨＣまたはＴＣＲの相互作用を遮断するモノクローナル抗体、Ｔ細胞表面上の重要な共刺激または調節タンパク質に対する遮断抗体の使用、疾患誘導Ｔ細胞またはＴＣＲエピトープによるワクチン接種、競合抗原、サイトカインまたはその受容体の阻害などが挙げられる。集合に影響を及ぼすように設計された特異的競合ペプチドによりＴＣＲ機能を破壊しうることについては、これまで報告も検討もなされていない。本発明者は、本発明のペプチドが、これまで報告されていないメカニズムにより少なくとも３つの異なるモデルでＴ細胞媒介性免疫応答を阻害する能力を有することを明確に示した。
【００９６】
本明細書中に記載の実験は、マウスおよびラットのＴＣＲα鎖の公知配列と相同となるように故意に選択したコアペプチドを主に用いて行った。しかしながら、ヒトの臨床的治療においては、該コアペプチドのアミノ末端のロイシンの代わりにフェニルアラニン残基を含有するペプチドが、公知のヒト配列との相同性を最大にするのに好ましいかもしれない（表１）。
【００９７】
広く記載している本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様で示している本発明に対して多数の変形および／または修飾を施してもよいと当業者には理解されるであろう。したがって、本実施態様は、すべての点において、限定的ではなく例示とみなされるべきである。
【００９８】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）を誘導したラット（対照、ペプチド処理）の疾患重症度の経時的変化を示す。
【図１Ｂ】実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）を誘導したラット（対照、ペプチド処理）の平均重量の経時的変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、おそらくＴ細胞抗原受容体に対する作用によりＴ細胞に作用するペプチドに関する。さらに本発明は、このペプチドの使用を含む種々の炎症性および自己免疫疾患状態の治療に関する。特に、該ペプチドは、Ｔ細胞が関与している又はリクルートされている障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、他の免疫細胞型（多形核、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と共に免疫系の細胞成分を構成する細胞のサブグループである。生理的条件下で、Ｔ細胞は免疫監視および外来抗原排除において機能する。しかしながら、病理的条件下で、Ｔ細胞が疾患の発生および伝達に大きな役割を果たしているという確固たる証拠がある。これらの疾患では、中枢的または末梢的のいずれかのＴ細胞免疫トレランスの破綻が、自己免疫疾患の発生の基本的な過程となっている。
【０００３】
中枢的トレランスには、自己反応性細胞の胸腺除去（負の選択）および自己主要組織適合複合体抗原（ＭＨＣ）に対して低い親和性を有するＴ細胞の正の選択が関与している。これに対して、組織特異的自己免疫疾患の予防に関与している末梢的Ｔ細胞トレランスを説明するために提案されている４つの非相互排除仮説（non-mutually exclusive hypotheses）がある。これらには、アネルギー（共刺激シグナルの喪失、Ｔ細胞活性化のために重要な受容体のダウンレギュレーション）、反応性Ｔ細胞の除去、免疫系による抗原の非認識、および自己反応性Ｔ細胞の抑制が含まれる。一旦誘導されたトレランスは、必ずしも無限に持続するわけではない。これらのメカニズムのいずれかの破綻により、自己免疫疾患が生じることがある。
【０００４】
自己免疫疾患および他のＴ細胞媒介性障害は、炎症部位へのＴ細胞のリクルートメント（recruitment）により特徴づけられる。この部位のＴ細胞は、サイトカインを産生し調節してＢ細胞機能に影響を及ぼす能力を有し、免疫応答を調整し、最終的な臨床結果を形成する。したがって、抗原認識およびそれに続く、Ｔ細胞の増殖および分化につながるＴ細胞活性化の過程を理解することは、健康および疾患の両方を考える上で非常に重要である。Ｔ細胞表面上の抗原認識に非常に重要な成分は、複合体抗原受容体（ＴＣＲ）であり、これは、抗原提示細胞表面上のＭＨＣ−コード化タンパク質との関連において抗原を認識する多サブユニット構造を有する。抗原認識とＴ細胞活性化とを統合するＴＣＲのこの複雑な構造−機能関係を妨害することにより、炎症およびＴ細胞媒介性疾患を治療する手段が得られるかもしれない。
【０００５】
ＴＣＲは、少なくとも７つの膜貫通タンパク質よりなる。ジスルフィド結合で連結した（αβ−Ｔi）ヘテロ二量体がクロノタイプ抗原認識単位を形成し、一方、ε、γ、δおよびζおよびη鎖よりなるＣＤ３の非変異鎖は、Ｔ細胞活性化および細胞性免疫応答の修飾を起こすシグナル伝達経路に該リガンド結合を結び付ける。ＴＣＲ鎖の遺伝子多様性にもかかわらず、２つの構造的特徴がすべての公知サブユニットに共通している。第１に、それらは、単一の膜貫通伸長ドメイン（おそらくα−ヘリカル）を有する膜貫通タンパク質である。第２に、該ＴＣＲ鎖のすべては、予想される膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を有するという独特の特徴を有する。該非変異鎖は、マウスとヒトとの間で保存されている単一の負電荷を有し、該非変異鎖は１つの（ＴＣＲ−β）または２つの（ＴＣＲ−α）正電荷を有する。以下の表１に、いくつかの種のＴＣＲ−αの膜貫通配列を示す。これは、系統発生的にこの領域が高度に保存されていることを示し、重要な機能的役割を果たしていることを示す。種間の置換は非常に保存的である。
【０００６】
【表１】
ＴＣＲ−αとＣＤ３−δ、およびＴＣＲ−αとＣＤ３−εとの間の安定な相互作用がＴＣＲ−αの膜貫通ドメイン内の８つのアミノ酸（前記において太字で示している）に局在し、この過程に非常に重要なのは荷電アミノ酸であるアルギニンおよびリジンであることが、Manoliosら（1990、 1991、 1994）による多成分ＴＣＲの集合に関する研究で示された。この知見は、該膜貫通ドメイン内のアミノ酸がアンカータンパク質に対して作用するだけでなく、サブユニット複合体の集合およびタンパク質−タンパク質相互作用において重要であるという事実を例示するものである。
【０００７】
前記の系は、多数のタンパク質突然変異体をつくる相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の修飾に依存的であった。キメラｃＤＮＡ分子をＣＯＳ（繊維芽細胞系）細胞中にトランスフェクションして、必要なタンパク質を発現させた。これらのキメラタンパク質の同時発現により相互作用領域を評価した。前記を再度説明すると、その技術はｃＤＮＡ操作、代謝標識、免疫沈降法およびゲル電気泳動を含むものであった。
【０００８】
膜貫通ドメインは小さく、この領域を横切るタンパク質は、通常、α−ヘリックス立体配置に拘束される。膜貫通荷電基を介したタンパク質−タンパク質相互作用の操作が可能であることと、これらの生物物理学的特徴とは、ＴＣＲ機能に影響を及ぼしそれを潜在的に妨害するための可能な新しいアプローチを本発明者に示唆した。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、この非常に重要な受容体の機能の阻害剤（おそらく、集合の阻害によるのであろう）である一連のペプチドを開発した。また、本発明者は、これらのペプチドがＴ細胞媒介性炎症に作用し、カルボキシ末端結合によっても該ペプチドの機能が改変されないことを見いだした。このことは、作用を増大させるが機能を喪失させない脂質担体系にペプチドを結合させることにより例示される。さらに、本発明者は、該ペプチドは単独で細胞内輸送能を有し、潜在的に有効な薬物送達系となりうることを見いだした。例えば関節炎のアジュバントモデルにおける関節炎の減少により示されるとおり、該投与ペプチドの有効な臨床的発現は炎症の減少であろう。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、式：
A-B-C-D-E
（式中、
Ａは、不存在または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸よりなるペプチド、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
で示されるペプチドである。
【００１１】
また本発明は、式：
Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ
（式中、
Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチドを提供する。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様では、Ｃは３〜４個の疎水性アミノ酸である。
【００１３】
さらに本発明の好ましい実施態様では、Ａは２個の疎水性アミノ酸であり、Ｅは１〜３個、好ましくは１個の疎水性アミノ酸である。
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様では、ＢがアルギニンでありＤがリシンである、またはＢがリシンでありＤがアルギニンである。ＢおよびＤは、Arg、LysおよびHisからなる群より選択されることが好ましい。
【００１５】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、該ペプチドは、Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val、Leu-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Val、Gly-Phe-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val、またはPhe-Lys-Ile-Leu-Leu-Leu-Arg-Valである。
【００１６】
本発明の第２の態様は、本発明の第１態様のペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物（治療用組成物）である。該組成物は、Ｔ細胞が媒介する障害を治療するために用いることができる。
【００１７】
本発明の第３の態様は、Ｔ細胞が関与している又はリクルート（recruited、動員、補充）されている障害に罹患した患者の治療方法であって、本発明の第２態様の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含んでなる方法である。
【００１８】
該治療用組成物は、当業者に認識されるいずれの適当な経路により投与してもよい。かかる経路としては、経口、経皮、鼻内、非経口、関節内、眼内などが挙げられる。
【００１９】
本発明の第４の態様は、化学的部分を細胞へ輸送する方法であって、上記ペプチド（好ましくは、そのカルボキシ末端）に結合した化学的部分に細胞をさらすことを含んでなる方法である。
【００２０】
Ｔ細胞が関与している／リクルートされている障害としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：
アレルギー素質、例えば遅延型過敏症、接触皮膚炎、
自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、
胃腸病状態、例えば炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、
皮膚問題、例えば乾癬、尋常性天疱瘡、
感染性疾患、例えばエイズ、単純／帯状ヘルペス、
呼吸状態、例えばアレルギー性肺胞炎、
心臓血管問題、例えば自己免疫心膜炎、
臓器移植、
炎症状態、例えば筋炎、強直性脊椎炎。
【００２１】
また本発明は、Ｔ細胞が媒介する障害を治療するための医薬の製造における、上記ペプチドの使用に関する。
【００２２】
本明細書中で用いる「患者」なる語は、ヒトおよびヒト以外の動物の両方を包含する意である。
【００２３】
前記の考察からわかるとおり、本発明のペプチドは、ＴＣＲ−αの膜貫通ドメインの一部に基づく。この部分の完全なマウス配列は、
であり、一方、対応するヒト配列は、
である。本発明のペプチドの基礎となっている配列（太字で示している）の遠位にあるＴＣＲ−α鎖の最後の１５個のアミノ酸においては、様々な種の間で、完全な配列の相同性がある。これらの追加的な１５個の残基を含むペプチドは、本発明のペプチドと同様の活性を有するかもしれない。その本質的特徴は、該ペプチドが、３〜５個の疎水性アミノ酸により分離された２個の正に荷電したアミノ酸を含むことである。さらに、以下の実施例から明らかとなるように、本発明のペプチドは、活性の喪失を伴うことなくカルボキシ末端を修飾しうる。したがって、本発明のペプチドの「コア」配列に対する追加的アミノ酸を含みＴ細胞抗原受容体に作用するペプチドも、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００２４】
以下の実施例で示すとおり、本発明のペプチドは細胞に侵入する能力を有する。したがって、本発明のペプチドは、それが有する他の用途以外に、他の治療剤を細胞へ輸送する「担体」として使用できると考えられる。これは、例えば、細胞内へ輸送しようとする治療剤を本発明のペプチドに結合させることにより行うことができる。
【００２５】
当業者であれば容易に理解できるように、疎水性アミノ酸は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、TyrおよびMetであり、一方、正に荷電したアミノ酸はLys、Arg、およびHisである。
【００２６】
本発明の性質の理解がより明確となるように、以下、実施例により本発明の好ましい態様を説明する。
【実施例１】
【００２７】
ペプチドの合成
第１工程においては、前もって決定されている集合配列に対応する短い疎水性ペプチドを合成した。競合ペプチドのアミノ酸配列は、NH２-Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-OHであり、以下これを「コアペプチド」と称する。ついで、表２に挙げるいくつかの他のペプチドを合成し（純度は９５％以上、Auspep Australia, Melbourne, Australiaによる）、Ｔ細胞機能および炎症に対するそれらの効果を調べた。
【００２８】
【表２】
【実施例２】
【００２９】
溶解性
コアペプチドおよび上に挙げた他のペプチドは、疎水性であり水溶液に不溶性であることが判明した。種々の溶媒および担体を試験した。これらには、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、スクアラン油（２,６,１０,１５,１９,２３−ヘキサメチルテトラコサン）、およびトリス結合（TRIS-conjugation; Whittaker R.G., Bender V. J. 1991）を介してコアペプチドにパルミチン酸を付加させることによる溶解性を増大させるための脂質結合が含まれていた。好ましい溶媒はＤＭＳＯであり、細胞培養で用いた最終濃度は０.１％〜０.２％であった。ＤＭＳＯ濃度が１％を越えると、細胞に対する毒性が生じた。ペプチドおよびリポペプチド複合体の保存溶液をＤＭＳＯに溶解し、１／１０００希釈で使用した。
【００３０】
ＤＭＳＯ中のペプチド／リポペプチドを水溶液に加えることにより、組織培養フラスコの底に沈降する難溶性の「脂肪」または「結晶」粒を得た。これらの粒子は位相差顕微鏡で見ることができたが、脂質複合体についてはそれほど明白ではなかった。
【００３１】
Ｃ１４−グリシン（Ｃ１４−ペプチド）を含有するコアペプチドをAuspep Australiaにより合成し、溶解性を調べるのに使用した。ＤＭＳＯに溶解／懸濁したＣ１４−ペプチドを、Ｔ細胞培地（１０％ウシ胎仔血清および０.３％メルカプトエタノールで補充したＲＰＭＩ１６４０；ＴＣＭ）に最終濃度が１００μMになるまで加え、振盪した。該培地を遠心分離し、上清を０.２μMフィルターで濾過するか又は未分離のまま放置した。未分離培地中の全放射活性は２０,０００cpmであり、培地を遠心分離した後は１０００cpmであり、培地を濾過した後は５００cpmであった。これらの実験はin vitroでのペプチドの不溶性を強調するものであり、約５％が溶解することを示唆する。
【実施例３】
【００３２】
細胞中へのペプチドの侵入
ペプチドが細胞へ侵入するか否かを調べるために、最終濃度が１００μMの５×１０６個の２Ｂ４.１１細胞（シトクロームｃに特異的なＴ細胞ハイブリドーマ）および０.２％ＤＭＳＯのフラスコにＣ１４−ペプチドを加え、一晩インキュベーションした。付着細胞をフラスコ中でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄し、トリトン含有緩衝液で可溶化し、放射活性を計数した。上清中の放射活性量は７０,０００cpmであり、可溶化細胞中では５０００cpmであった。
【００３３】
前記実験の変法においては、２Ｂ４.１１細胞（７.５×１０４個）を、２mlのＴＣＭを含有するペトリ皿中で成長させ、０.４μMの膜を有する「トランスウェル（Transwell）」をペトリ皿中に入れた。最終濃度１００μMのＣ１４−ペプチドおよび０.１％ＤＭＳＯを該「トランスウェル」に加え、２４時間および４８時間のインキュベーションの後、フィルターの両面上および細胞中の計数を測定した。放射活性の約８５％が「トランスウェル」中に、８％がペトリ皿中に、７％が細胞内にそれぞれ保持された。前記実験は、ペプチドが細胞に侵入する能力を有することを示した。ペプチドの溶解性が低い（５％〜１０％）ことを考慮すると、溶解している可能なペプチドのすべてが細胞に侵入したことになる（７％）。
【実施例４】
【００３４】
Ｔ細胞中におけるフルオレセイン結合ペプチドの細胞内局在
溶解する僅かのペプチドが細胞に侵入または取り込まれうることが実験から示唆された。このことを確認するために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に共有結合したコアペプチドをＴ細胞に加え、共焦点または通常の紫外線顕微鏡を用いて可視化することにより細胞内局在を判定した。
【００３５】
フルオレセイン結合標識コアペプチドを以下のとおり調製した。コアペプチド１０.２５mgをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）０.５mlに溶解し、ＤＭＦ０.５ml中のＦＩＴＣ２μMを室温で撹拌しながら滴下した。Ｎ−メチル,Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミンでpＨを９に調整し、反応を１時間進行させた。ついで、Ｃ−４カラム（６ml/分; 緩衝液Ａ、０.１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、８０％アセトニトリル、２０％水；０.１％ＴＦＡ；Ｂが４０％〜１００％である直線勾配）を用いる半分取ＨＰＬＣにより、遊離ＦＩＴＣからＦＩＴＣ−ペプチドを分離した。分析用ＨＰＬＣにより画分をモニターし、純粋なフルオレセイン結合コアペプチド（ＦＩＴＣ−ペプチド）を含有する画分をプールした。
【００３６】
２つのフラスコの培養２Ｂ４.１１細胞（５×１０６個）を遠心沈殿させ、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＰＢＳに再懸濁した。１つのフラスコへは、ＤＭＳＯに溶解したＦＩＴＣを最終濃度が１０μMになるまで加え、もう一方のフラスコへはＦＩＴＣ−ペプチド１０μMを加えた。両フラスコ中のＤＭＳＯの最終濃度は、Ｔ細胞に影響を及ぼさないことが既に示されている０.１％であった。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションし、ついで共焦点顕微鏡下で検査した。
【００３７】
その観察は以下のとおり要約することができる：（ｉ）ＦＩＴＣおよびＦＩＴＣ−ペプチドは細胞に侵入した；（ii）細胞中、遊離ＦＩＴＣはＦＩＴＣ−ペプチドより明るい蛍光を示した；（iii）細胞内染色パターンは、遊離ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ペプチドとの間で相違せず、核および特に明るい核小体の染色が観察された；（iv）ＦＩＴＣによるペプチドの結合は、細胞内へのペプチドの侵入を妨害しなかった；（ｖ）細胞からのＦＩＴＣ−ペプチドの「浸出」は５時間にわたり全くなかった。これらの実験は、ＦＩＴＣ−ペプチドが細胞に取り込まれ、細胞内に局在しうることを示す。Ｃ１４−ペプチドによる細胞内取り込みを示す既に記載した実験と考え合わせると、細胞侵入を可能にするのは該ペプチド配列に固有の性質であり、その複合体（ＦＩＴＣ、Ｃ１４）の性質ではないことが明らかである。
【実施例５】
【００３８】
コアペプチドカルボキシル末端のトリス−脂肪結合
脂質結合で例示したのと同様にして、この非常に重要な受容体の機能を競合的に阻害するペプチドの能力に対してコアペプチドのカルボキシル結合が与える影響を調べた。投与リポペプチドの有効臨床発現は、例えば、ペプチドの場合に観察され、関節炎のアジュバントモデルにおける関節炎の減少により示されるのと同様、炎症の減少であろう。コアペプチドを脂質結合させたほか、いくつかの他のリポペプチドを合成し、後続の実験の対照として使用した。該リポペプチドは、Whittaker, R.G., Hayes, P.J.およびBender, V.J. (1993) Peptide Research 6, 125および豪州特許第649242号に記載の方法により合成した。これらに文献の開示は、クロスレファレンスにより本明細書の一部とする。
【００３９】
フルオレセイン標識されたGly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Gly-トリス-モノ−およびトリ−パルミテートの調製。ＤＣＭ（１ml）中の脱保護されたリポペプチド（１５および６mg）のそれぞれの溶液へ、撹拌しながらＦＩＴＣ（４mg１０μモル）のＤＭＦ（５００μl）溶液を加えた。トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えることにより、反応の見かけpＨを９.０に維持した。ペプチドのフルオレセイン−標識モノおよびトリ−パルミトイル誘導体を、半分取ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、System B）により精製した。精製化合物を蒸発乾固させ、tert-ブチルアルコールから凍結乾燥して、フルオレセイン標識ペプチドモノパルミテート（ＲｔＢ、７.８３）およびトリパルミテート（ＲｔＢ、９.８５）を得、これらを以下のとおり試験した。
【００４０】
フルオレセイン標識リポペプチドのＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭeＯＨ, ９５：５）は、遊離ＦＩＴＣおよび遊離Gly-トリス−モノパルミテートおよびGly-トリス−トリパルミテート（リポペプチド合成で使用したもの）の不存在を示した（ニンヒドリン染色による）。
【００４１】
固相ペプチド合成。Gly-Leu-Arg-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val（コアペプチド）およびその完全保護形態であるBoc-Gly-Leu-Arg(PMC)-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Val-OH（およびＣ１４−標識ペプチド）をAuspep Pty Ltd.より入手した。両方とも、手動形式のＦＭＯＣ−化学法により合成した。
【００４２】
また、カルボキシル基を有する化合物（例、ペプチド）をアミノ基に結合させるのに使用できる多数のよく知られたリンカーがあることは、当業者であれば容易に理解できるであろう。これらには、以下のものが挙げられる。
ａ）該化合物に対するアミノ基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するカルボキシル基を有するリンカー、例えばアミノ酸または抗生物質。
ｂ）該化合物に対するアミノ基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するスルホン酸基を有するリンカー、例えば２−アミノエタンスルホン酸（タウリン）。
ｃ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するカルボキシル基を有するリンカー、例えばグリコール酸、乳酸など。
ｄ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対するスルホン酸基を有するリンカー、例えば２−ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）。
ｅ）該化合物に対するヒドロキシル基およびトリス（または存在するのであればアミノ酸）に対する反応性ハライド基を有するリンカー、例えば２−クロロエタノール。
ｆ）反応性カルボキシルを有する化合物とトリス（または存在するのであればアミノ酸）のアミノ基との間の潜在的に適当なリンカーの他の具体例としては、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、２−クロロ酢酸、１,２−ジブロモエタン、エチレンオキシドなどの化合物群が挙げられる。
【００４３】
また、リンカーは、還元されて修飾ペプチドを細胞内に遊離させるジスルフィド基を含有していてもよい。
【実施例６】
【００４４】
ＣＯＳ細胞におけるＦＩＴＣ結合リポペプチドの局在
共焦点顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ結合リポペプチドが非Ｔ細胞（ＣＯＳ細胞−繊維芽細胞）へ侵入する能力を調べた。
【００４５】
材料：
ＤＭＳＯ中の保存濃度− コアペプチド.トリス.モノパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量１８６２）１０mM; コアペプチド.トリス.ジパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量２３３４）１０mM; コアペプチド.トリス.トリパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量２８０６）１０mM; グリシン.トリス.モノパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量８０５）１０mM; グリシン.トリス.トリパルミテート.ＦＩＴＣ（分子量１２８６）１０mM; ＦＩＴＣ（分子量３９０）６.４mM。
【００４６】
方法：
ＣＯＳ細胞をカバーグラス上で８０％密集まで成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ結合リポペプチドと共に１５分間または２時間インキュベーションした。リポペプチドの最終濃度は、それぞれの時点でＦＩＴＣについて１０μMおよび６.４μMであった。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ／グリセロールと共にスライドに載せ、共焦点顕微鏡で検査した。
【００４７】
結果：
実験が示したところによると、フルオレセイン結合リポペプチドは細胞膜を横切って移動し細胞質内に局在でき、タンパク質合成の場である小胞体（ＥＲ）にまで到達する。細胞貫通の程度は、ペプチドに結合している脂質部分により影響された。前記リポペプチドのうち、モノパルミテートの場合には、これまで検査した繊維芽細胞およびＴ細胞内で浸潤する能力がより大きかった。ＥＲは、集合を試行し実施する最良の部位である。すべての鎖が集合し、細胞表面まで輸送されたら、細胞表面膜にて受容体を破壊することは一層困難となるであろう。ペプチドの標的となるＥＲは、ＴＣＲ複合体を破壊する理想的な部位である。
【実施例７】
【００４８】
ＦＩＴＣ結合リポペプチドのＴ細胞における局在
共焦点顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ結合リポペプチドがＴ細胞に侵入する能力を調べた。
【００４９】
材料：
前記のリポペプチド。２Ｂ４.１１Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞系。
【００５０】
方法：
２Ｂ４.１１Ｔ細胞をＴＣＭ中で成長させ、８×１０５細胞／mlの濃度で再懸濁した。生存度＞９５％（トリパンブルーを使用）。細胞１mlをポリプロピレン管に加え、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、１マイクロリットルの保存ＦＩＴＣ結合リポペプチドを３０分間加えた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／グリセロールと共にスライドに載せ、共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００５１】
結果：
ＣＯＳ細胞（前記）と同様であった。結果は、リポペプチドがＴ細胞へ侵入する能力を有することを示した。ペプチドの脂質結合は、細胞へのペプチドの侵入を妨害しない。そして、それは、溶解性を増大させる担体ビヒクルとしての潜在的な用途を有する。
【実施例８】
【００５２】
フローサイトメトリー分析を用いた場合のＴ細胞上でのＴＣＲの集合および細胞表面発現に対するペプチドおよびリポペプチドの効果
材料：
完全ＴＣＲを細胞表面上で発現するＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４.１１を陽性対照として使用して、ＴＣＲ発現に対するペプチドの効果を評価した。該細胞をＴＣＭ中で成長させた。２Ｂ４.１１細胞の反復サブクローニング（Sussmanら,1988）およびＴＣＲ発現の喪失により誘導したβ−欠陥変異体２１.２.２並びにβ−およびζ−欠陥細胞系３.１２.２９を陰性対照として使用した。
【００５３】
被検ペプチドには、コアペプチド、リポペプチドおよび５５８と称される腫瘍壊死因子受容体からのペプチド（陰性対照として使用）が含まれた。インキュベーションで使用した各物質の最終濃度は、１０μMであった。
【００５４】
抗体
免疫沈降法およびフローサイトメトリー分析には以下の抗体を使用した：Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４（Ａ２Ｂ４−２, Samelsonら, 1983）のＴＣＲ−α鎖に対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、２Ｂ４.１１ＴＣＲ−β鎖（ＫＪ２５）に対するＭＡｂ、ハムスターＩｇＧ抗ＣＤ３−εＭＡｂ（１４５−２Ｃ１１[２Ｃ１１], Leoら, 1987）、精製マウスＣＤ３−εに対して産生させたウサギ抗ＣＤ３−εポリクローナル抗血清（127, Minamiら, 1987）、マウスＣＤ３−δ鎖のＣＯＯＨ末端ペプチドで免疫したヤギで産生させた抗ＣＤ３−δポリクローナル抗体（Ｒ９）（Samelsonら, 1986）。
【００５５】
方法：
ＦＡＣＳ分析：１×１０６個の（２Ｂ４.１１，２１.２.２）細胞を、最終濃度１０μMのいくつかの別々のペプチドおよびリポペプチドと共に一晩インキュベーションした。ついで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μlの一次抗体（Ａ２Ｂ４または２Ｃ１１）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳおよび０.１％ＢＳＡ中で２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識二次抗体と共に４℃でさらに３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳおよび０.１％ＢＳＡでさらに２回洗浄した後、Becton-Dickson FACS AnalyserまたはBecton-Dickson FACSScan上で分析した。
【００５６】
結果
コアペプチド対照ペプチドまたはリポペプチドで処理した２Ｂ４.１１細胞上でのＴＣＲの発現は、受容体の細胞表面発現を変化させなかった。より高濃度（１００μM）のコアペプチドを用い、より長時間のインキュベーション時間（１〜１０日間）をかけてこれらの実験を繰り返したところ、結果は同じであり、Ｔ細胞表面抗原受容体発現の変化は示されなかった。
【００５７】
以下の実験は、Ｔ細胞機能に対するペプチド／リポペプチドのin vitro効果を評価するために行った。
【実施例９】
【００５８】
抗原提示アッセイＩ
抗原提示アッセイ（以下に記載）では、Ｔ細胞活性化産物であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）を定量することにより、抗原認識後にいくつかのペプチドがＴ細胞活性化を阻害する能力を調べた。
【００５９】
材料
以下の細胞系を使用した：２Ｂ４.１１、完全抗原受容体を細胞表面上で発現し（Samelsonら, 1983）、抗原認識後にＩＬ−２を産生するＴ細胞ハイブリドーマ（シトクロームｃ）、通常の生物学的ＩＬ−２アッセイのためのインターロイキン−２依存性Ｔ細胞系（ＣＴＬＬ）、および抗原提示細胞として作用するＢ細胞ハイブリドーマ細胞系ＬＫ３５.２（ＬＫ、Ｉ−ＥＫ担持；Kapplerら, 1982）。ハイブリドーマをＴＣＭ中で成長させた。シトクロームｃ（Sigma, USA）を培地に加えて、抗原提示アッセイにおける５０μMの最終濃度を得た。
【００６０】
調べたペプチドには以下のものが含まれていた：コアペプチド、コアペプチドと同等の長さを有する種々の起源からの７個の他の対照ペプチド並びにペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ。抗原提示アッセイにおけるペプチドの最終濃度を、１０μM〜１００μMのいくつかのレベルで調べた。
【００６１】
方法
Ｔ細胞抗原刺激のために、２×１０４個のＬＫ３５．２細胞を、ＰＢＳに溶解した５０μMのハトのシトクロームｃおよび２×１０４の２Ｂ４.１１Ｔ細胞と共に１６時間共培養した。アッセイは３つ組で行った。上清を回収し、ＩＬ−２含量をＣＴＬＬ増殖により測定した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、上清中に存在するＩＬ−２量と正比例する。種々のペプチドのＩＬ−２産生阻害能を調べた。３Ｈ−チミジン取り込み量の測定に加えて、ＩＬ−２量（IU/ml）も測定した。
【００６２】
結果
シトクロームｃ（抗原）またはＬＫ細胞（抗原提示細胞）のいずれかの不存在下でのアッセイでは、ＩＬ−２産生は生じなかった。このような条件下でＴ細胞活性化が生じないことは、非特異的にＴ細胞を活性化している可能性がある溶液中にリポ多糖（ＬＰＳ）もエンドトキシンも存在しないことを示すものであった。ＣＴＬＬ細胞による高い３Ｈ−チミジン取り込み（２２,０００cpm）により測定したところ、前記濃度でのアッセイ成分の３個すべての組み合わせによりＩＬ−２の産生が生じた。コアペプチドまたは他の類似体を該アッセイ系に加えた場合、ＩＬ−２の産生量はそれぞれで異なっていた。１０μMのすべての被検ペプチドは、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。最良の効果は、１００μMのコアペプチドおよびペプチドＣ（１００μM）で認められ、対照と比較してＩＬ−２産生の１５％〜３０％の減少につながった。これは少なくとも３つの独立した場合で再現性があった。ペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦのＴ細胞活性化に対する影響は、一定せず小さかった。該ペプチドに対して同等の長さを有するが配列相同性を有さない７個の対照ペプチドは、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。
【００６３】
抗原提示アッセイに加える前にコアペプチドおよび他のペプチドをＴＣＭ中３７℃で前インキュベーションすると、溶解性および活性が向上した。これは、新たに調製されたペプチドで認められる基準活性を越える追加的増加として示された。
【実施例１０】
【００６４】
抗原提示アッセイII
Ｔ細胞機能に対するリポペプチドのin vitro効果を評価するために以下の実験を行った。
【００６５】
材料
被検リポペプチドには、コアペプチドトリス−モノパルミタート（１００μMおよび０.１％ＤＭＳＯ）およびコアペプチドトリス−トリパルミタート（１００μMおよび０.２％ＤＭＳＯ）が含まれていた。抗原刺激アッセイにおけるその２つのリポペプチドの最終濃度を、括弧内に示す。
【００６６】
方法
実施例９で示したとおりである。
【００６７】
結果
まず、コアペプチドトリス−トリパルミタート（１００μMおよび０.２％ＤＭＳＯ）を加えた場合、Ｔ細胞活性化は７５％減少した（最高計数５,１９０cpm。対照の２２,０００と比較されたし）。コアペプチドトリス−モノパルミタート（１００μMおよび０.１％ＤＭＳＯ）の添加は、ＩＬ−２産生に対して顕著な効果を示し、わずか１３７cpm（バックグラウンドと同等）が記録されたにすぎなかった。試験系で用いた０.１％ＤＭＳＯおよび０.２％ＤＭＳＯの濃度に関して調べたが、ＩＬ−２産生に影響を及ぼさないことが判明した。後続の実験によりこれらの知見が確認され、対照と比較して８６％〜９２％のＩＬ−２産生が示された。抗原提示アッセイ系に加えた、ペプチドに結合させるのに用いたパルミチン酸（１００μM）は、単独ではＩＬ−２産生に影響を及ぼさなかった。
【００６８】
以下の実験では、コアペプチドが投与後に動物体内を循環する能力および実験的に誘導された炎症に対する効果を調べた。
【実施例１１】
【００６９】
Ｃ１４−コアペプチドの分布
皮下注射したペプチドのマウスにおける分布を調べるために、Ｃ１４−コアペプチド（５mg/マウス）を１５０マイクロリットルのスクアラン油に溶解し、Balb/cマウスの尾の基部に注射した。２４時間後に、パルプ化（pulped）器官から計数を測定した。該ペプチドの分布は、胸腺（５％）、脾臓（７％）、血液（３％）で、またリンパ節（２８％）、腎臓（３０％）および肝臓（２８％）では大きな比率で認められた。
【００７０】
実験をさらに拡大して、コアペプチドが炎症の動物モデルで疾患を予防する能力についても調べた。ラットにおけるアジュバント誘導関節炎、ＮＯＤマウスにおけるシクロホスファミド誘導糖尿病およびラットにおける実験アレルギー性神経炎を含むin vivoでの３つの実験モデルを用いた。２つの種を含むこれらのモデルでは、コアペプチドは炎症の程度に影響を及ぼす能力を有していた。
【実施例１２】
【００７１】
実施例１２（ａ） ラットにおけるアジュバント誘導関節炎
ラットアジュバント関節炎モデルは、疾患の進行およびそれに対する潜在的な新規抗炎症薬の効果を研究するために多数の研究所でここ３０年間にわたり広範に用いられている、炎症の古典的なモデルである（Pearsonら, 1961; Cremerら, 1990; HomdahlおよびKvick, 1992; Cannonら, 1993）。また、このモデルは、Royal North Shore Hospitalの研究者によりここ１０年にわたり広範に用いられており、この炎症モデルの研究のための方法は確立している。動物に対するすべての操作は、ハロタン／酸素／一酸化二窒素麻酔（１リットル/分Ｏ２および２リットル/分Ｎ２Ｏ中の２％ v/vハロタン）下で行った。ラットの尾の基部に最小アジュバント量（１００μlのスクアラン中の１mgの熱不活化結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス, Mycobacterium tuberculosis（ＭＴＢ）））を１回および１回だけ皮内注射した。試験サンプルをＭＴＢと共投与する方法は、Whitehouseら（1990）が最初に記載している。０〜２８日の一定の間隔で、動物を秤量し、最大の尾の太さおよび後脚の太さを測定することにより（マイクロメーターねじゲージ）、その関節炎状態を評価した。最初の尾注射後、ラットを保存箱に収容し、水および固形飼料に自由に近づけるようにした。２９日目に、該動物を殺した。
【００７２】
材料
第１の実験では、Perth Animal Resource Centre（ARC）より購入しGore Hill Animal House施設で飼育した体重が約１９０〜２１０グラムの１２匹のラットを使用した。アジュバント（７mgＭＴＢを含有する０.６mlスクアラン）に懸濁したコアペプチド（３０mg）、０.６mlのアジュバントに懸濁したコアペプチドトリス−モノパルミタート（１５mg）、コアペプチドトリス−トリパルミタート２０mg（０.６mlのアジュバントあたり）を使用した。
【００７３】
ラットを、それぞれ３匹のラットを含む４群に分けた。第１群には、アジュバントのみ（陽性対照）を、第２群にはアジュバントおよびコアペプチドを、第３群にはアジュバントに懸濁したコアペプチド.トリス.モノパルミタートを、そして最後の群にはアジュバントに懸濁したコアペプチド.トリス.トリパルミタートをそれぞれ投与した。ラットの尾の基部に、０.１ml容量中の前記化合物を注射した。ラットの体重、脚の太さおよび尾の直径の基準測定を、０日目、およびついで４、７、９、１４、１６、１８、２１、２５および２８日目に行った。顕著な膨潤、発赤および明らかな不快感があれば、関節炎を等級付けし、動物を殺した。ＭＴＢを投与したすべてのラットが関節炎を発症したわけではなかった。一般に、対照ラットの８０％以上が関節炎を発症した。
【００７４】
結果
１８日後、アジュバントのみを投与したすべての対照動物が関節炎を発症し、殺さなければならなかった。３匹のコアペプチド処理動物のうちの２匹（２／３）は、関節炎の徴候を示さなかった。同様に、コアペプチド.トリス.トリパルミタートを投与した３匹の動物のうちの２匹は、関節炎の徴候を示さなかった。コアペプチド.トリス.モノパルミタートおよびアジュバントを投与した動物はすべて関節炎を発症した。しかしながら、この最後の群における関節炎の発現および発症は、対照と比べて３〜４日遅延し、臨床的重症度ははるかに減少した（関節数、脚膨潤、体重減少）。
【００７５】
ラットにおけるアジュバント誘導関節炎を用いる実験は、ペプチドおよびその脂質複合体が、この動物モデルにおける関節炎の誘導に対して防御的効果を有することを示した。いくつかの異なるペプチド（７mg/ラット）および薬物を用いる反復的なその後の実験の結果を、表３に要約する。
【００７６】
【表３】
【００７７】
前記実験の結果は、コアペプチドが炎症に影響を及ぼして、その発現を遅延させ、重症度を減少させ、そして疾患の発現を防ぐことを示した。これらの効果は、シクロスポリンとアジュバントとの共投与で得たものと同様であった。シクロスポリンは、よく知られ広く使用されている免疫抑制剤である。ペプチド作用の無差別な効果はなかった。コアペプチド、ペプチドＣおよびＦで最良の結果が認められた。コアペプチドおよびペプチドＣはそれぞれ、同じ部位に荷電アミノ酸基を有するが、アミノ酸は逆になっている。このことは、重要なのは特定のアミノ酸ではなく荷電基であることを示すものであった。これに対して、それぞれ荷電基を有さないか又は負の荷電基を有するペプチドＢまたはＤでは効果は認められなかった。アミノ酸をカルボキシ末端へ下流に伸長させても、負の効果は生じなかった。この観察は、カルボキシ修飾を行っても生物学的活性が喪失しないことを証明するものである。したがって、これらのペプチドは、他の化学的部分の輸送のための担体ペプチドとして使用することができる。その２つの極性荷電基の間のアミノ酸数を増加させると（ペプチドＥ）、効力が減少した。荷電基の間のアミノ酸数を減少させても（ペプチドＦ）、負の効果は生じなかった。
【００７８】
実施例１２（ｂ） コアペプチドの用量効果
Whitehouseら（個人的書信）により既に行われている実験に基づき、初期投与量
を５〜７mg/ラットとした。下限を評価するために、いくつかの異なるコアペプチド濃度を調べた。その結果（表４）は、それは、コアペプチドの特異的作用に加えて、投与量によるその効果により制限されることを示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
実施例１２（ｃ） 尾の直径の測定
アジュバント誘導関節炎の特徴は、尾における炎症の発症である。生理食塩水を注射したラットとコアペプチドで処理したラットとの間の尾の測定値差（mm）は統計学的に有意ではなかった。しかしながら、ＭＴＢ処理ラットの尾の直径は、生理食塩水およびコアペプチド処理ラット（ｐ＜０.００１）に比べて有意に増加した（ｐ＜０.００１）（表５）。
【００８１】
【表５】
【００８２】
ＭＴＢのみをラットに投与した場合、尾に浮腫が認められたほか、注射部位に潰瘍および炎症が生じた。これは、コアペプチドまたは生理食塩水を投与したラットには存在しなかった。
【実施例１３】
【００８３】
実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）
Ｔ細胞により誘導された疾患の重症化を遅延させ抑制するコアペプチドの能力をさらに確認するために、異なる施設（University of Sydney）での独立した実験者（Pollard準教授およびJ Taylor氏）により「盲検的」に、異なるモデル（実験アレルギー性神経炎）を試験した。
【００８４】
材料および方法
動物
体重２３９〜４５１グラムの雄LewisラットをBosch Animal House, University of SydneyのコロニーまたはＡＲＣ, Perthから入手した。すべての実験は、University of SydneyのAnimal Care and Ethics Committeeにより承認されている実験ガイドラインに従って行った。
【００８５】
ＥＡＮの誘導
完全フロインドアジュバント中に乳化した５０〜７５μlのウシ末梢神経ミエリン（ＰＮＭ）を、Lewisラットのそれぞれの後足蹠に免疫した。免疫エマルションは、等容量の生理食塩水および不完全フロインドアジュバント（Sigma, USA）にそれぞれ１５mg/mlおよび５mg/mlのウシＰＮＭおよびＭＴＢ（Ｈ３７ＲＡ株, DIFCO）を加えて混合したものよりなるものであった。動物に卵アルブミン／ペプチドを投与する場合は、ペプチドを７０mg/mlにて免疫エマルションへ加えた。これらの実験は、免疫エマルション中のペプチドの種類を伏せた実験と共に行った。
【００８６】
動物は、臨床徴候に関して免疫後少なくとも２日おきに観察し、以下の分類によりスコア化した：０、正常；０.５、弱っている尾；１、弛緩性の尾；１.５、しまりのない尾および後脚の運動失調；２、不全対麻痺；２.５、しまりのない尾および重篤な不全対麻痺；３、対麻痺；３.５、しまりのない尾および対麻痺および前肢不全麻痺；４、四肢麻痺(quadraparesis)；４.５、しまりのない尾および四肢麻痺（quadraplegia）；５、死亡。
【００８７】
末梢神経ミエリンの単離
ウシＰＮＭは、本質的にNortonおよびPodulso（1973）の記載のとおりに調製した。
【００８８】
結果
代表例を図１に示す。この実験では、コアペプチドは疾患の誘導および臨床的重症化を遅延させた。ペプチドＣについても同様のデータを得た。これらのデータは、コアペプチドおよびペプチドＣの一般的な免疫抑制剤としての有効性を証明するものである。
【実施例１４】
【００８９】
ＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウスにおける糖尿病
Ｔ細胞媒介性疾患のさらに別のモデルでは、ＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウスにおける糖尿病の誘導に対する皮下注射コアペプチドの効果を、独立した実験者（L Harrison教授, WEHI, Melbourne）により「盲検的」に試験した。
【００９０】
膵島β細胞を選択的に破壊する細胞性自己免疫過程は、ヒトおよびＮＯＤマウス（Leiterら, 1987）などの自発性動物モデルにおけるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の発症の原因となると考えられている。ＩＤＤＭの発症に関連した共通の組織病理学的特徴は、インスリン炎、すなわち主としてＴリンパ球およびそれより少量のマクロファージよりなる単核細胞が島内部および周辺部に存在することである（Foulisら, 1986）。新生児の胸腺摘出、シクロスポリンＡの投与、抗Ｔリンパ球抗体の投与などの細胞性自己免疫を抑制するための実験戦略により、糖尿病の発症が予防される（Campbellら, 1991）。
【００９１】
動物
実験初日（０日目）に１０週齢のＮＯＤ／Ｌt(Ｆ)マウス。これは、糖尿病の動物モデルとして一般に使用される高発生系統である。
【００９２】
材料
保存濃度が３.３３mg/mlの、スクアランに溶解したコアペプチド。対照として使用する卵アルブミンを、保存濃度が３.３３mg/mlとなるようスクアランに懸濁した。ペプチドおよび卵アルブミンを、注射直前にボルテックスして可溶化した。合計２５０μg（７５μl）を右脇に−１、０および１日目に皮下注射した。０日目に、水中のシクロホスファミドを３００mg/kgでマウスに腹腔内投与した。０、１０、１４および２１日目に、血液グルコースの測定を行った。処理群には１６匹のマウスを、卵アルブミン対照群には１６匹のマウスを用いた。
【００９３】
結果
実験は、糖尿病として発現される自己免疫β細胞破壊の誘導に対するコアペプチドの防御的効果を示す（表６）。この場合もまた、この知見は、異なるＴ細胞媒介性疾患モデルにおけるコアペプチドの一般的な免疫抑制能を証明するものである。
【００９４】
【表６】
【００９５】
要約
近年、ＴＣＲ、ＭＨＣまたは抗原（三分子複合体）の間の相互作用を妨害し、それにより免疫応答に影響を与えるための非常に多くの種々の方法が使用され工夫されてきている。これらの着想および適用方法の開発に関連した治療的潜在性が見落とされているわけではない。その戦略としては、ＭＨＣまたはＴＣＲの相互作用を遮断するモノクローナル抗体、Ｔ細胞表面上の重要な共刺激または調節タンパク質に対する遮断抗体の使用、疾患誘導Ｔ細胞またはＴＣＲエピトープによるワクチン接種、競合抗原、サイトカインまたはその受容体の阻害などが挙げられる。集合に影響を及ぼすように設計された特異的競合ペプチドによりＴＣＲ機能を破壊しうることについては、これまで報告も検討もなされていない。本発明者は、本発明のペプチドが、これまで報告されていないメカニズムにより少なくとも３つの異なるモデルでＴ細胞媒介性免疫応答を阻害する能力を有することを明確に示した。
【００９６】
本明細書中に記載の実験は、マウスおよびラットのＴＣＲα鎖の公知配列と相同となるように故意に選択したコアペプチドを主に用いて行った。しかしながら、ヒトの臨床的治療においては、該コアペプチドのアミノ末端のロイシンの代わりにフェニルアラニン残基を含有するペプチドが、公知のヒト配列との相同性を最大にするのに好ましいかもしれない（表１）。
【００９７】
広く記載している本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的な実施態様で示している本発明に対して多数の変形および／または修飾を施してもよいと当業者には理解されるであろう。したがって、本実施態様は、すべての点において、限定的ではなく例示とみなされるべきである。
【００９８】
参照文献
Bansalら (1993). Curr Ther Res 54:1
Bevins C.L., Zasloff M.(1990). Am Rev Biochem. 59, 395
Campbell, I.L., Kay, T., Oxbrow,L., Harrison, L. (1991). J.Clin.Invest.87, 739.
Cannonら (1993). Arthritis and Rheum. 36:126
Clevers H., Alarcon B., Wileman T., Terhorst C. (1988). Am Rev. Immunol.6,629
Cosson P., Lankford S.P., Bonifacino J.S., Klausner R., (1991). Nature 351, 414
Cremerら (1990). Clin Exp Immunol 82:307
DeGrado W.F., Musso G.F., Lieber M., Kaiser E.T., Kezdy F.J., (1982). Biophys J. 37,329
Foulis, A., Liddle, C.N., Farquharson, M., Richmond, J. (1986). Diabetologia. 29, 267.
Francisら (1989). Arthritis and Rheum. 32:608.
Hartら (1993). Eur. J. Immunol. 23:1588
Hashidaら (1991). Agents Actions 34:242.
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Manolios N. (1992). Todays Life Sciences 4,32
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Whittaker,R.G., Hayes,P.J.およびBender,V.J. (1993) Peptide Research 6, 125および豪州特許第649242号.
Zhangら (1990). J.Immunol 145:2489
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）を誘導したラット（対照、ペプチド処理）の疾患重症度の経時的変化を示す。
【図１Ｂ】実験アレルギー性神経炎（ＥＡＮ）を誘導したラット（対照、ペプチド処理）の平均重量の経時的変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ
（式中、
Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチド。
【請求項２】
ＢおよびＤがArg、LysおよびHisからなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｅが１〜３個の疎水性アミノ酸である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物。
【請求項５】
Ｔ細胞が媒介する障害を治療するために用いられる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
障害が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性肺胞炎、自己免疫心膜炎、筋炎、および脊椎炎からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｔ細胞が媒介する障害を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
障害が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性肺胞炎、自己免疫心膜炎、筋炎、および脊椎炎からなる群より選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項１】
式：
Ａ-Ｂ-Ｃ-Ｄ-Ｅ
（式中、
Ａは、不存在、または１個若しくは２個の疎水性アミノ酸、
Ｂは、正に荷電したアミノ酸、
Ｃは、３〜５個の疎水性アミノ酸、
Ｄは、正に荷電したアミノ酸、および
Ｅは、不存在または８個以下の疎水性アミノ酸である）
を含む、５〜１７個のアミノ酸を有するペプチド。
【請求項２】
ＢおよびＤがArg、LysおよびHisからなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｅが１〜３個の疎水性アミノ酸である、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドと医薬上許容される担体とを含んでなる組成物。
【請求項５】
Ｔ細胞が媒介する障害を治療するために用いられる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
障害が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性肺胞炎、自己免疫心膜炎、筋炎、および脊椎炎からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｔ細胞が媒介する障害を治療するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項８】
障害が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、ギヤン−バレー症候群、橋本病、悪性貧血、炎症性腸疾患、クローン病気、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎、乾癬、尋常性天疱瘡、アレルギー性肺胞炎、自己免疫心膜炎、筋炎、および脊椎炎からなる群より選択される、請求項７に記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【公開番号】特開２００６−１１７６９７（Ｐ２００６−１１７６９７Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６３３（Ｐ２００６−２６３３）
【出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【分割の表示】特願２００５−３４０５３（Ｐ２００５−３４０５３）の分割
【原出願日】平成８年１月１６日（１９９６．１．１６）
【出願人】（５０５０１３１０３）ノーザン シドニー エリア ヘルス サービス (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【分割の表示】特願２００５−３４０５３（Ｐ２００５−３４０５３）の分割
【原出願日】平成８年１月１６日（１９９６．１．１６）
【出願人】（５０５０１３１０３）ノーザン シドニー エリア ヘルス サービス (3)
【Ｆターム（参考）】
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