新規ポリビニルアルコール分解菌
【課題】ＰＶＡ分解力に優れた微生物を提供する。
【解決手段】新規ポリビニルアルコール分解菌であって、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、細菌。好ましくは、この細菌は、シュードモナス属またはアシネトバクター属に属する。上記窒素源は、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される。
【解決手段】新規ポリビニルアルコール分解菌であって、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、細菌。好ましくは、この細菌は、シュードモナス属またはアシネトバクター属に属する。上記窒素源は、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ポリビニルアルコール分解菌、およびこれを利用した排水処理プロセスに関する。
【従来の技術】
ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡと記する）は、１９２４年に、西ドイツのウイリー・オー・ヘルマン（Ｗｉｌｌｙ Ｏ Ｈｅｒｍａｎｎ）博士らによって、ポリ酢酸ビニルを鹸化して得られる水溶性の高分子として発見されたポリマー物質である（非特許文献１）。図１４にＰＶＡの構造を示す。その後、日本の倉敷レーヨン（株）が、ビニロンの原料としてＰＶＡの開発および生産を開始し、現在では、ＰＶＡは、織物工業の経糸剤（サイジング剤）、接着剤、フィルム、紙加工材などとして広く用いられている。
ＰＶＡがこれらの原料として用いられるに至った理由は、１）ＰＶＡの重合度を変えることによってＰＶＡ溶液の粘度を変えることができる；２）鹸化度、鹸化方法を変えることによって界面活性、乳化力および分散力に優れた製品が得られる；３）曳糸性、造膜性および接着力に優れる；４）結晶性ポリマーであって、乾燥、熱処理によって結晶化し、適度な耐水性をもたせることが可能である。その一方、結晶性を低下させることによって水溶性を失わないようにすることが可能である；５）形成された皮膜は無色透明で、機械的強度に優れ、適度の吸湿性および透湿性をもつが、酸素、窒素、炭酸ガスなどのガスは通過しにくい；６）耐油性および耐有機薬品性があり、ほとんどの有機溶媒に溶解しない；７）反応性に富む水酸基を多数有し、エーテル化、エステル化、アセタール化などの反応によって特有のポリマーを形成し得る。熱硬化性樹脂と縮合反応を行うことも可能である；９）微生物、日光などに対し比較的安定であって、これらに曝しても強度の低下は少ない、などの優れた特徴を備えているからである。
現在、日本では、年間約２０万トンのＰＶＡが生産され、そのうち約４万トンが繊維用に、残りが非繊維用途に使用されているといわれている（非特許文献２）。経糸糊剤として用いられたＰＶＡは、紡繊後、染色加工工程の前の糊抜き（デサイジング）によってそのほとんどが排水中に含まれることになる。合成高分子の懸濁重合に使用されたＰＶＡもまた同様に排水中に含まれることになる。排水中のＰＶＡは、その他の合成高分子物質同様、水環境保全上、ＣＯＤ／ＢＯＤ比の高い難分解性物質（非特許文献３）となっている。
ＰＶＡを含有する排水は、気泡分離法、凝集沈殿法、限外濾過法、活性炭吸着法、重金属キレート法などの物理化学的方法（非特許文献３）、および活性汚泥法などの生物学的方法で処理されている。しかし物理学的方法は、多量の薬剤を必要とするためコストを要し、また生物学的方法では、用いる活性汚泥中に、ＰＶＡを分解または資化できる菌の割合が低いか、または存在していたとしてもその増殖速度が非常に小さいため、通常の滞留時間では効率良く処理されていない（非特許文献６〜１０）。
そこで、ＰＶＡに対する馴養操作を施した馴養活性汚泥を用いる方法（非特許文献４、５および１１〜１４）、土壌から単離されたＰＶＡ分解菌を混合したＰＶＡ活性汚泥を用いる方法（非特許文献６および７：上述）が研究されているが、いずれの場合においても、ＰＶＡ分解菌を活性汚泥中に高濃度で安定に保持することがプロセス成功の鍵となっている。また、それらＰＶＡ処理の研究と同時に、ＰＶＡ分解菌やＰＶＡ分解酵素に関する知見を得るため、いくつかのＰＶＡ分解菌の分離（非特許文献１５〜１９）およびＰＶＡ分解酵素の精製（非特許文献２０〜２６）が行われている。
鈴木らは、土壌中から、ＰＶＡ分解細菌を初めて分離し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｏ−３と同定した（非特許文献１６：上述）。このＯ−３株は、酵母エキスを添加したＰＶＡ培地で生育したが、ＰＶＡ以外の炭素源を用いて生育させたときＰＶＡを分解しなかった。嶋尾らは、ＰＶＡが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５ＣとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５Ａの二種類の細菌による共生系によって分解されることを見出した（非特許文献１７：上述）。ＶＭ１５Ａ株は、ＶＭ１５Ｃ株の増殖因子であるＰＱＱの生産を担い、ＰＱＱが存在すれば、ＶＭ１５Ｃ株は単独でＰＶＡを分解・資化した（非特許文献２７〜２９）。橋本らは、ＰＶＡを分解する活性汚泥を馴養したが、ＰＶＡ分解細菌の生育速度は遅く、通常の水処理に適用される条件下では、活性汚泥から排除（ｗａｓｈ ｏｕｔ）された（非特許文献１３：上述）。
【非特許文献１】
長野浩一、豊島賢太郎（１９８１）ポバール
【非特許文献２】
通商産業大臣官房調査統計部編（１９９３）化学工業統計年報、（財）通商産業調査会
【非特許文献３】
福永和二、宮本靖、植田晃三（１９７６）ＰＶＡ含有排水の処理、化学工業、２０（１２）、６７〜７０頁
【非特許文献４】
鈴木智雄、市原好博、太宰宙朗、御園光信（１９７３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）含有廃水の活性スラッジ処理の基礎的条件の検討、発酵工学会雑誌、（５１）（９）、６９２〜６９８頁
【非特許文献５】
桑原正章、松原智子（１９８８）高濃度活性スラッジによる有機廃水の好気処理、香川大学農学部学術報告、４０（１）、４７〜５５頁
【非特許文献６】
鈴木智雄、太宰宙朗、福永和二（１９７８）ポリビニルアルコールの微生物分解とその含有排水処理への応用、環境研究、（２２）、２〜８頁
【非特許文献７】
鈴木智雄、太宰宙朗、福永和二（１９７７）ポリビニルアルコールの微生物分解とその含有排水処理への応用、農芸化学会誌、５１（７）、コロニー１３〜５８頁
【非特許文献８】
Ｗｈｅａｔｌｅｙ、Ｑ．Ｄ．＆Ｂａｉｎｅｓ，Ｆ．Ｃ．（１９７６）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ、Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ＆Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、８（２）、２８〜３８頁
【非特許文献９】
Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．＆Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．（１９７５）Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｙ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗ、７（４）、３３〜４１頁
【非特許文献１０】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第２報）、下水道協会誌、１７（１９１）、３０〜３６頁
【非特許文献１１】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第３報）、下水道協会誌、１７（１９２）、１７〜２６頁
【非特許文献１２】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第４報）、下水道協会誌、１７（１９５）、２４〜３３頁
【非特許文献１３】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第５報）、下水道協会誌、１７（１９８）、１９〜２９頁
【非特許文献１４】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第６報）、下水道協会誌、１８（２０１）、１９〜２９頁
【非特許文献１５】
Ｍｏｒｉ，Ｔ．、Ｓａｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．、Ｋａｇｉ，Ｔ．＆Ｓａｋａｉ．Ｔ．（１９９６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）．、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６０（２）、３３０〜３３２頁
【非特許文献１６】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｙ．、Ｙａｍａｄａ，Ｍ．＆Ｋｅｎｚｏ，Ｔ．（１９７３）Ｓｏｍｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｏ−３ ｗｈｉｃｈ ｕｔｉｌｉｚｅｓ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７（４）、７４７〜７５６頁
【非特許文献１７】Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｆｕｋｕｔａ，Ｉ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８４）Ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＶＭ１５Ａ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４８（４）、７５１〜７５４頁
【非特許文献１８】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）−ｄｅｇｒａｄａｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．、科学と工業、６１（９）、３７２〜３７７頁
【非特許文献１９】
Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｓ．、Ｋｕｒｉｔａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｍｏｋｏｂｅ，Ｈ．（１９９３）Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５（７）、７４９〜７５４頁
【非特許文献２０】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、（１９７６）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｏ−３．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３）、４９７〜５０４頁
【非特許文献２１】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、（１９７８）Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｂｙ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｏ−３．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（６）、１１８７〜１１９４頁
【非特許文献２２】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９（３）、８１７〜８２５頁、
【非特許文献２３】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏ）ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｗｉｔｈａｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９（３）、８２７〜８３３頁
【非特許文献２４】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．、Ｓｈｉｋａｔａ，Ｓ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ａ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４４（１）、２８〜３２頁
【非特許文献２５】
Ｈａｔａｎａｋａ，Ｔ．、Ａｓａｈｉ，Ｎ．＆Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．（１９９５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１１３Ｐ３．、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５９（１０）、１８１３〜１８１６頁
【非特許文献２６】
Ｍｉｎｇｊｉｅ，Ｃ．＆Ｙｉｎｓｈａｎ，Ｗ．（１９９５）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＶＡ ｂｙ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＳＢ１ＩＩ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＶＡ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｆ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＳＢ１．、Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｔｉａｅ Ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ、１５（２）、２０８〜２１６頁
【非特許文献２７】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｋ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．、Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．、Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８４）Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｙｍｂｉｏｎｔ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５Ｃ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８（１１）、２８７３〜２８７６頁
【非特許文献２８】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｆｕｊｉｔａ，Ｉ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８５）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＶＭ１５Ａ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ ｗｉｔｈ ｍｉｘｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４９（６）、１３８９〜１３９１頁
【非特許文献２９】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｏｎｉｓｈｉ，Ｓ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８９）Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５５（２）、２７５〜２７８頁
【発明が解決しようとする課題】
上記先行技術は、ＰＶＡを分解できる菌が活性汚泥を含む自然環境中に存在していることを示す。上記先行技術はまた、たとえＰＶＡ分解菌を含んでいたとしても、通常の活性汚泥法でＰＶＡを分解することは非常に困難であることをも示している。従って、これらの菌を含む活性汚泥を用いてＰＶＡを分解するためには、その分解活性を最大限に発揮させるための条件の設定、またはこれらの菌に最も適したプロセスを開発する必要がある。本発明は、このような作業を必要としない、上記従来のＰＶＡ分解菌を凌駕する新規ＰＶＡ分解菌、およびそれを利用した排水処理プロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明は、新規ポリビニルアルコール分解菌に関し、この菌は、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
上記ポリビニルアルコール分解菌は、シュードモナス属に属する細菌であり得る。
上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクター属に属する細菌であり得る。
好ましくは、上記窒素源は、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４であり得る。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクターＩＡＭ−３株であり得る。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクターＩＡＭ−４株であり得る。
本発明はまた、上記の細菌のいずれか１つ、または上記の細菌の複数種を含む微生物製剤に関する。
本発明はまた、上記微生物剤と、この微生物剤に酸素を供給する手段とを備えた、排水処理プロセスに関する。
【発明の実施の形態】
本発明において利用される一般的な分子生物学的手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．および同第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどに記載され、当業者によって容易に実施される。
本明細書で用いる用語は、特に示されなければ、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。また、本明細書で用いる用語は、一般に、特に示されなければ、単数形の表現であってもその複数形の概念をも含む。また、本明細書で用いる「％」は、特に示されなければ重量％を意味する。
本明細書で用いる用語「炭素源」は、一般に、微生物によって吸収利用される炭素を含む化合物（炭素化合物）を意味し、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などの炭水化物、多価アルコール、有機酸類類、およびこれらを含む原材料を包含する。
本明細書で用いる用語「窒素源」は、一般に、微生物がその体を構成するタンパク質、核酸、その他の窒素化合物の原材料として、外界から取り入れられる窒素を含む化合物（窒素化合物）を意味し、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、アミノ酸、アミド、アミン、尿素などの有機窒素化合物、およびこれらを含む、ペプトン類、酵母エキス（以下しばしばＹＥと略記する）、肉エキス、コーンスティープリカーなどの原材料を包含する。
本明細書で用いる用語「好気培養」は、通常は、振盪、攪拌、通気などをおこなって培養液内を好気的に保つ培養をいう。本発明のＰＶＡ分解菌は、簡便には、実験室規模の振盪培養によって評価され得る。
以下、本発明を説明する。本発明の新規ポリビニルアルコール分解菌は、代表的には、グラム陰性の桿状形態の一群の細菌であって、特に、その優れたＰＶＡ分解能力および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列によって既存の細菌と区別され得る。
本発明の新規ポリビニルアルコール分解菌は、自然界、特に下水処理場の新鮮な活性汚泥などから、以下の実施例に代表される手法を用いて分離され得る。
本発明は、新規ポリビニルアルコール分解菌に関し、この菌は、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
本発明のＰＶＡ分解菌は、１０〜０．０１％の範囲、通常５〜０．０２％の範囲、より好ましくは１〜０．０５％の範囲で、ＰＶＡ分解菌が生育する溶液（培養液）に添加されたポリビニルアルコールを分解する。本発明のＰＶＡ分解菌は、窒素源の存在下３０℃１０日間の好気培養で添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を、好ましくは、少なくとも９０％を分解する。
本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
本明細書で用いる用語「ＲＮＡ」は、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の略称であり、当該分野において最も広義に用いられるのと同じ意味で用いられ、（塩基）−（Ｄ−リボース）−（リン酸）からなるヌクレオチドが鎖状に重合したポリヌクレオチドまたはその等価物をいう。本明細書で用いる用語「ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに等価な意味で用いられ、用語「ヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドを含む意味で用いられる。本明細書で用いる用語「リボソームＲＮＡ」または「ｒＲＮＡ」は、通常用いられるように、リボソームを構成するＲＮＡであって、特に「１６Ｓ・ｒＲＮＡ」または「１６ＳリボソームＲＮＡ」は、原核細胞のｒＲＮＡを構成する３０Ｓサブユニットに含まれる分子量０．６×１０６の分子をいう。１６Ｓ・ｒＲＮＡは、その３’末端近傍でｍＲＮＡと結合することが知られている。本明細書で用いる用語「１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子」は、１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡをいう。本明細書で用いる用語「ＤＮＡ」は、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本明細書において用いるヌクレオチドの「相同性」とは、２種類以上のヌクレオチド配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つのヌクレオチド配列の相同性が高いほど、それらのヌクレオチドの配列の同一性または類似性は高い。２種類のヌクレオチド配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって調べることができる。２つのヌクレオチド配列を直接比較する場合、それらのヌクレオチド配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらのヌクレオチド配列は相同性を有している。
ヌクレオチド配列の同一性、類似性および相同性の比較は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴをデフォルトパラメータを用いて算出される。ヌクレオチド配列の相同性は、ＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
あるいは、２つのヌクレオチド配列が相同性を有するか否かは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べることができる。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。
本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列またはその部分配列から選択されたヌクレオチド配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
具体的には、本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で対象ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することによっても保持される１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明のＰＶＡ分解菌は、好気条件下で良好に生育し、そしてＰＶＡを分解する。好気条件は、通常、微生物に酸素を供給する手段によって行われる。
上記微生物剤に酸素を供給する手段は、微生物の生存および増殖に必要な酸素を微生物に提供し得る任意の手段を含み、通常、空気を曝気することによりなされる。曝気方式には、散気装置を用いる散気方式、浸漬タービン曝気方式、ジェットエアレーション法、機械式表面曝気法などを用い得る。散気方式として、旋回流方式、全面曝気方式などを用い得る。空気に代えて高濃度酸素もまた用い得る。
本発明のＰＶＡ分解菌は、微生物剤の形態で用いても良く、それによってＰＶＡ分解効率を向上し得る。ここで、「微生物剤」とは、１種以上のＰＶＡ分解菌と任意の材料とを含む固体または液体の組成物をいい、ＰＶＡ分解菌とともに含まれる材料の例として、土壌に含まれる無機物および有機物のような微生物が存在する天然環境において微生物の周囲に通常近接して存在する材料、微生物の固定化に用いられるバーミキュライト、シリカ、ゼオライト、活性炭、光硬化性樹脂、各種樹脂などの天然または合成の担体材料が挙げられる。
あるいは、本発明のＰＶＡ分解菌を培養した後、当該分野で公知の固定化法によって上記公知の天然または合成の担体材料に固定化して微生物剤として用い得る。
本発明の微生物剤は、通常、既存の浄化槽、グリーストラップ、接触曝気槽、活性汚泥槽などに適当量投入して使用し得る。あるいは、前記浄化槽などに充填し固定床しても使用し得る。
【実施例】
本発明を実施例により説明する。以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。
（実施例１） ＰＶＡ分解菌の分離
分離手順
下水処理場の活性汚泥から、以下の手順（図１３にその概略を示す）によりＰＶＡ分解菌の単離を行った。
（ｉ）ＰＶＡを含有する４種類の培地（表１および図１３にそれぞれ▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼として示される）に活性汚泥を添加し、３０℃で振盪培養した。
（ｉｉ）表２に示す手順でＰＶＡを定量してその分解を測定するとともに、各培養液の液相に含まれていた菌体およびフラスコ面に付着してた菌体をそれぞれ表１に▲１▼および▲２▼で示す培地に再懸濁し、集積培養を行った。
（ｉｉｉ）集積培養を繰り返した培養液６種を適当な希釈倍率でＰＶＡ＋ＹＥ寒天培地（表１の▲２▼）に播種し、コロニーを単離した。その中の４種のコロニーについて表１に示す培地▲２▼に植菌し、表２に示す手順に従ってＰＶＡを定量してＰＶＡの分解を測定した。
（ｉｖ）また、ここまでの培養でＰＶＡの分解能が大きかった集積培養の３種類（集積培養１、２および３）について、窒素源の種類、および酵母エキスの有無（表１に▲１▼▲２▼▲５▼および▲６▼で示される培地）によるＰＶＡ分解能および菌の増殖に対する影響を調べた。さらに、（ｉｉｉ）で単離した４種のコロニーのうちＰＶＡの分解を確認した３種（コロニー１、３および４）についても同様に調べた。
（ｖ）同様に、４種類のコロニーの１６Ｓ・ｒＲＮＡの一部をシーケンスし、ＢＬＡＳＴ検索を行った。
表１．ＰＶＡ分解菌の分離に用いた培地
▲１▼基礎ＰＶＡ培地
ＰＶＡ １０００ｍｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １４００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２７０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ５０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ／Ｌ。
▲２▼ＰＶＡ＋ＹＥ培地
基礎ＰＶＡ培地＋Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０００ｍｇ／Ｌ。
▲３▼原排水
組成不明（染色工場排水）
▲４▼合成廃水
ＰＶＡ ５０ｍｇ／Ｌ、ペプトン ７５ｍｇ／Ｌ、肉エキス ５０ｍｇ／Ｌ、尿素 ２５ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ２５ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ ３．５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ３．５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ２．５ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ７．５ｍｇ／Ｌ。
▲５▼窒素源違い培地組成
基礎ＰＶＡ培地−ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ＋ＮＨ２ＣＯＮＨ２ １００ｍｇ
▲６▼窒素源違い培地組成
ＰＶＡ＋ＹＥ培地−ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ＋ＮＨ２ＣＯＮＨ２ １００ｍｇ
表２．ＰＶＡの定量法
【表２】
結果
今回試験した試料（上記（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の集積培養３種類および単離したコロニー３つ）についての結果を図１〜図１２に示す。図１〜図１２において示されるグラフは、いずれも、培養における菌体量（ＯＤ６６０ｎｍ）およびＰＶＡ量の経時変化を示したものである。いずれのグラフも、横軸は培養時間（日数）を、縦軸はＰＶＡ量（％）または培養液のＯＤ６６０ｎｍ値を示してある。また、各グラフの上には、試験した試料（集積培養１、２、および３、またはコロニー１、３および４）と、用いた培地の炭素源および窒素源を示した。以下に得られた結果を要約する。
−全体−
図１〜図１２に見られるように、今回試験したすべての試料について、基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼：炭素源はＰＶＡのみ）を用いてもＰＶＡの分解が観察された。培養１０日までにＰＶＡを９０％以上分解したものも存在した（図３上、下、図５上、および図７上、中）。
−培地の検討−
基礎培地（▲１▼および▲５▼）に酵母エキスを添加したＰＶＡ＋ＹＥ培地（それぞれ▲２▼および▲６▼）を用いた場合、基礎ＰＶＡ培地に比べ、ＰＶＡ分解能、菌の増殖ともに大きくなった（培養３〜５日目で９０％以上のＰＶＡ分解が観察された場合が多い）（図１と２との比較、図３と４との比較、図５と６との比較、図７と８との比較）。
−集積培養の結果−
集積培養１：基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼）においても、集積培養１は、比較的分解速度が速く、８日目でＰＶＡを９０％以上分解した（図５上および図７上）。ＹＥを加えた場合に分解速度の上昇が観察された（図６上および図８上）。
集積培養２：基礎ＰＶＡ培地において、窒素源が尿素の場合（▲５▼）に１０日目でＰＶＡを９０％以上分解した（図７中）。窒素源が硝酸アンモニウムの場合（▲１▼）は１０日目でＰＶＡの７０％が分解された（図５中）。ＹＥを加えた場合は分解速度の上昇が観察された（図６中および図８中）。
集積培養３：基礎ＰＶＡ培地において、菌の増殖および分解能は比較的低いことが判明した（１０日目にＰＶＡ分解は４０〜６０％、ＯＤ６６０は０．２〜０．３（図５下および図７下））。ＰＶＡ＋ＹＥ培地では、菌の増殖およびＰＶＡの分解は促進されるが、菌の増殖は２〜３日目から減少した（図６下および図８下）。
−単離した菌（コロニー１、３および４）
コロニー１：基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼）においてＰＶＡの分解が観察され、尿素を窒素源として加えた場合にＰＶＡ分解が若干促進された（図１下と図３下との比較）。ＹＥを加えた場合にＰＶＡ分解速度の上昇が観察された（培養４日目にＰＶＡ分解９０％以上）（図２下および図４下）。
コロニー３：コロニー１および４と比較して、いずれの培地においてもＰＶＡ分解活性は低いことが判明した（図１中〜図４中）。
コロニー４：コロニー１とほぼ同程度の分解活性を示したが、基礎ＰＶＡ培地に窒素源として硝酸アンモニウムを加えた場合、増殖およびＰＶＡ分解活性はコロニー１より小さかった（図１上と下との比較）。
次いで、コロニー１およびコロニー４をさらなる解析に供した。
−集積培養とコロニー培養との比較
コロニー１および４は、集積培養２および１からそれぞれ単離したものである。そこで、それぞれのコロニーを用いた培養を、そららが分離された集積培養を用いた培養とを比較した。
コロニー１と集積培養２との比較：コロニー１は、ＰＶＡの分解が基礎ＰＶＡ培地（窒素源として尿素を用いた場合、培養９〜１０日目に９０％以上のＰＶＡ分解が観察された）、およびＰＶＡ＋ＹＥ培地（培養４〜５日目に９０％以上のＰＶＡ分解が観察された）ともに、集積培養２より少し良好であった（図９および図１０）。従って、集積培養２のＰＶＡ分解作用の大部分はコロニー１によることが示唆された。
コロニー４と集積培養１との比較：ＰＶＡ＋ＹＥ培地において、コロニー４は、集積培養１よりも菌の増殖はやや少なかったが、ＰＶＡ分解はほぼ同程度（培養４日目で９０％以上のＰＶＡ分解）であったので、集積培養１においてもコロニー４がＰＶＡの分解に寄与していると考えられた（図１１）。しかし、基礎ＰＶＡ培地では、両者に菌の増殖に差はないものの、ＰＶＡの分解は、コロニー培養よりも集積培養の方が早いため、酵母エキスがない場合、他の菌または他の菌から放出される物質が分解を促進していることが示唆された（図１２）。
−ＢＬＡＳＴ結果（詳細は以下の実施例２に記載する）
コロニー１：Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａなどと相同性を示した。
コロニー２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓと相同性を示した。
コロニー３：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と相同性を示した。コロニー４：Ａｌｖｉｎｅｌｌａ ｐｏｍｐｅｊａｎａ ｓｙｍｂｉｏｎｔ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と相同性を示した。
コロニー３および４から得た菌は、ペア〜短連鎖し、グラム陰性であって、対数増殖期には長さ１．０〜２．５μｍの短桿菌である。増殖の定常期には短くなり球状になる傾向があった。胞子は形成せず、鞭毛は存在しない。オキシダーゼ陰性であり、カタラーゼ陽性であって、アセトイン、インドールおよびＨ２Ｓは産生しない。至適生育温度３０〜３２℃、そして至適生育は約７であり、ペニシリン耐性であった。
なお、コロニー１は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４として、２００３年２月７日付けで産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。また、コロニー３および４は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＩＡＭ−３株およびＩＡＭ−４株として、京都大学工学研究科（京都市左京区吉田本町）に保存され、請求により分譲される。
（実施例２） ＰＶＡ分解菌の特徴付け
１．コロニー１
コロニー１から由来の株は、桿状の細菌であった。グラム染色性は陰性であった。この菌は、カタラーゼおよびオキシダーゼ陽性であった。コロニー１の１６Ｓ・ｒＲＮＡ遺伝子を定法に従い単離し増幅した。要約すれば、１６Ｓ・ｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーとして、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（大腸菌１６Ｓ・ＲＮＡの遺伝子における位置：８〜２７）および５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’（大腸菌１６Ｓ・ｒＲＮＡにおける位置：１５４３〜１５２５）を用い、コロニー１から単離された１６Ｓ・ｒＲＮＡから、コロニーＰＣＲ法により約１．５ｋｂのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の長さの断片を切り出して精製した。このＰＣＲ増幅産物のダイレクトシーケンシングを行い、配列を決定した。
決定されたコロニー１の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。この配列を、既存のデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＵＰＤ）にある配列とＢＬＡＳＴを用いて比較したところ、コロニー１はシュードモナス属の細菌に近縁であることが示された。図１５にコロニー１のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図１６は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
２．コロニー３および４
上記１に記載したコロニー１の場合と同様に、コロニー３および４の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を決定した。決定されたコロニー３および４の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を配列表の配列番号２および３にそれぞれ示す。
図１７にコロニー３のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図１８は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
図１９にコロニー４のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図２０は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
図１７および図１９に示されるように、コロニー３およびコロニー４のいずれもがアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌と最も高い相同性を示した。
（実施例３） ＰＶＡ分解菌を用いたＰＶＡの分解
容量が約１ｍ３のタンクを用い、分離されたコロニー１、３および４を含む活性汚泥を用いてＰＶＡの分解試験を行った。処理水としては、表１に示す▲４▼合成排水を用いた。まず、分離されたコロニー１、３および４を含む小量の種汚泥を、合成廃水で約２日間回分培養して増やした後、倍容量の合成廃水を添加して約２間回分培養した。以後同様の操作を繰り返し、タンク内のＰＶＡの濃度を経時的に測定した。図２１にその結果を示す。
図２１において、横軸は、試験開始からの日数を示す。図中の点線は、タンク内の液の容量を、黒丸は定法に従って測定したＣＤＯを、そして白丸は、表２に示す方法で測定したＰＶＡの濃度を示す。図２１に示されるように、１０日の試験で、液量を約８００Ｌまで増加させた。各回分培養で、ＰＶＡ濃度およびＣＯＤが漸次低下した。得られた結果を、ＰＶＡ負荷およびＣＯＤ負荷に換算すると、それぞれ、０．３８ｋｇ／ｍ３／日および０．８４ｋｇ／ｍ３／日であった。
【発明の効果】
ＰＶＡを含む排水を浄化する能力に優れた細菌、およびこれを用いた排水処理プロセスが提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図２】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図３】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図４】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図５】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図６】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図７】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図８】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図９】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１０】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１１】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１２】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１３】本発明のＰＶＡ分解菌の単離手段の概略を示す図である。
【図１４】ＰＶＡの構造を示す図である。
【図１５】本発明のコロニー１から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図１６】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図１７】本発明のコロニー３から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図１８】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図１９】本発明のコロニー４から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図２０】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図２１】本発明の細菌を含む活性汚泥のＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ポリビニルアルコール分解菌、およびこれを利用した排水処理プロセスに関する。
【従来の技術】
ポリビニルアルコール（以下ＰＶＡと記する）は、１９２４年に、西ドイツのウイリー・オー・ヘルマン（Ｗｉｌｌｙ Ｏ Ｈｅｒｍａｎｎ）博士らによって、ポリ酢酸ビニルを鹸化して得られる水溶性の高分子として発見されたポリマー物質である（非特許文献１）。図１４にＰＶＡの構造を示す。その後、日本の倉敷レーヨン（株）が、ビニロンの原料としてＰＶＡの開発および生産を開始し、現在では、ＰＶＡは、織物工業の経糸剤（サイジング剤）、接着剤、フィルム、紙加工材などとして広く用いられている。
ＰＶＡがこれらの原料として用いられるに至った理由は、１）ＰＶＡの重合度を変えることによってＰＶＡ溶液の粘度を変えることができる；２）鹸化度、鹸化方法を変えることによって界面活性、乳化力および分散力に優れた製品が得られる；３）曳糸性、造膜性および接着力に優れる；４）結晶性ポリマーであって、乾燥、熱処理によって結晶化し、適度な耐水性をもたせることが可能である。その一方、結晶性を低下させることによって水溶性を失わないようにすることが可能である；５）形成された皮膜は無色透明で、機械的強度に優れ、適度の吸湿性および透湿性をもつが、酸素、窒素、炭酸ガスなどのガスは通過しにくい；６）耐油性および耐有機薬品性があり、ほとんどの有機溶媒に溶解しない；７）反応性に富む水酸基を多数有し、エーテル化、エステル化、アセタール化などの反応によって特有のポリマーを形成し得る。熱硬化性樹脂と縮合反応を行うことも可能である；９）微生物、日光などに対し比較的安定であって、これらに曝しても強度の低下は少ない、などの優れた特徴を備えているからである。
現在、日本では、年間約２０万トンのＰＶＡが生産され、そのうち約４万トンが繊維用に、残りが非繊維用途に使用されているといわれている（非特許文献２）。経糸糊剤として用いられたＰＶＡは、紡繊後、染色加工工程の前の糊抜き（デサイジング）によってそのほとんどが排水中に含まれることになる。合成高分子の懸濁重合に使用されたＰＶＡもまた同様に排水中に含まれることになる。排水中のＰＶＡは、その他の合成高分子物質同様、水環境保全上、ＣＯＤ／ＢＯＤ比の高い難分解性物質（非特許文献３）となっている。
ＰＶＡを含有する排水は、気泡分離法、凝集沈殿法、限外濾過法、活性炭吸着法、重金属キレート法などの物理化学的方法（非特許文献３）、および活性汚泥法などの生物学的方法で処理されている。しかし物理学的方法は、多量の薬剤を必要とするためコストを要し、また生物学的方法では、用いる活性汚泥中に、ＰＶＡを分解または資化できる菌の割合が低いか、または存在していたとしてもその増殖速度が非常に小さいため、通常の滞留時間では効率良く処理されていない（非特許文献６〜１０）。
そこで、ＰＶＡに対する馴養操作を施した馴養活性汚泥を用いる方法（非特許文献４、５および１１〜１４）、土壌から単離されたＰＶＡ分解菌を混合したＰＶＡ活性汚泥を用いる方法（非特許文献６および７：上述）が研究されているが、いずれの場合においても、ＰＶＡ分解菌を活性汚泥中に高濃度で安定に保持することがプロセス成功の鍵となっている。また、それらＰＶＡ処理の研究と同時に、ＰＶＡ分解菌やＰＶＡ分解酵素に関する知見を得るため、いくつかのＰＶＡ分解菌の分離（非特許文献１５〜１９）およびＰＶＡ分解酵素の精製（非特許文献２０〜２６）が行われている。
鈴木らは、土壌中から、ＰＶＡ分解細菌を初めて分離し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｏ−３と同定した（非特許文献１６：上述）。このＯ−３株は、酵母エキスを添加したＰＶＡ培地で生育したが、ＰＶＡ以外の炭素源を用いて生育させたときＰＶＡを分解しなかった。嶋尾らは、ＰＶＡが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５ＣとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５Ａの二種類の細菌による共生系によって分解されることを見出した（非特許文献１７：上述）。ＶＭ１５Ａ株は、ＶＭ１５Ｃ株の増殖因子であるＰＱＱの生産を担い、ＰＱＱが存在すれば、ＶＭ１５Ｃ株は単独でＰＶＡを分解・資化した（非特許文献２７〜２９）。橋本らは、ＰＶＡを分解する活性汚泥を馴養したが、ＰＶＡ分解細菌の生育速度は遅く、通常の水処理に適用される条件下では、活性汚泥から排除（ｗａｓｈ ｏｕｔ）された（非特許文献１３：上述）。
【非特許文献１】
長野浩一、豊島賢太郎（１９８１）ポバール
【非特許文献２】
通商産業大臣官房調査統計部編（１９９３）化学工業統計年報、（財）通商産業調査会
【非特許文献３】
福永和二、宮本靖、植田晃三（１９７６）ＰＶＡ含有排水の処理、化学工業、２０（１２）、６７〜７０頁
【非特許文献４】
鈴木智雄、市原好博、太宰宙朗、御園光信（１９７３）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）含有廃水の活性スラッジ処理の基礎的条件の検討、発酵工学会雑誌、（５１）（９）、６９２〜６９８頁
【非特許文献５】
桑原正章、松原智子（１９８８）高濃度活性スラッジによる有機廃水の好気処理、香川大学農学部学術報告、４０（１）、４７〜５５頁
【非特許文献６】
鈴木智雄、太宰宙朗、福永和二（１９７８）ポリビニルアルコールの微生物分解とその含有排水処理への応用、環境研究、（２２）、２〜８頁
【非特許文献７】
鈴木智雄、太宰宙朗、福永和二（１９７７）ポリビニルアルコールの微生物分解とその含有排水処理への応用、農芸化学会誌、５１（７）、コロニー１３〜５８頁
【非特許文献８】
Ｗｈｅａｔｌｅｙ、Ｑ．Ｄ．＆Ｂａｉｎｅｓ，Ｆ．Ｃ．（１９７６）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｉｎ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ、Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ＆Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、８（２）、２８〜３８頁
【非特許文献９】
Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．＆Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．（１９７５）Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｙ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗ、７（４）、３３〜４１頁
【非特許文献１０】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第２報）、下水道協会誌、１７（１９１）、３０〜３６頁
【非特許文献１１】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第３報）、下水道協会誌、１７（１９２）、１７〜２６頁
【非特許文献１２】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第４報）、下水道協会誌、１７（１９５）、２４〜３３頁
【非特許文献１３】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第５報）、下水道協会誌、１７（１９８）、１９〜２９頁
【非特許文献１４】
橋本奨、尾崎保夫（１９８０）活性汚泥法による難分解性物質の処理に関する研究（第６報）、下水道協会誌、１８（２０１）、１９〜２９頁
【非特許文献１５】
Ｍｏｒｉ，Ｔ．、Ｓａｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．、Ｋａｇｉ，Ｔ．＆Ｓａｋａｉ．Ｔ．（１９９６）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）．、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６０（２）、３３０〜３３２頁
【非特許文献１６】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｙ．、Ｙａｍａｄａ，Ｍ．＆Ｋｅｎｚｏ，Ｔ．（１９７３）Ｓｏｍｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｏ−３ ｗｈｉｃｈ ｕｔｉｌｉｚｅｓ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７（４）、７４７〜７５６頁
【非特許文献１７】Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｆｕｋｕｔａ，Ｉ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８４）Ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＶＭ１５Ａ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４８（４）、７５１〜７５４頁
【非特許文献１８】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）−ｄｅｇｒａｄａｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．、科学と工業、６１（９）、３７２〜３７７頁
【非特許文献１９】
Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｓ．、Ｋｕｒｉｔａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｍｏｋｏｂｅ，Ｈ．（１９９３）Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５（７）、７４９〜７５４頁
【非特許文献２０】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、（１９７６）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｏ−３．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（３）、４９７〜５０４頁
【非特許文献２１】
Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．、（１９７８）Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｂｙ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｏ−３．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２（６）、１１８７〜１１９４頁
【非特許文献２２】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｗｉｔｈ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９（３）、８１７〜８２５頁、
【非特許文献２３】
Ｓａｋａｉ，Ｋ．、Ｈａｍａｄａ，Ｎ．＆Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．（１９８５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏ）ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｗｉｔｈａｎ ａｃｉｄｉｃ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９（３）、８２７〜８３３頁
【非特許文献２４】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．、Ｓｈｉｋａｔａ，Ｓ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ａ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４４（１）、２８〜３２頁
【非特許文献２５】
Ｈａｔａｎａｋａ，Ｔ．、Ａｓａｈｉ，Ｎ．＆Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．（１９９５）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１１３Ｐ３．、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５９（１０）、１８１３〜１８１６頁
【非特許文献２６】
Ｍｉｎｇｊｉｅ，Ｃ．＆Ｙｉｎｓｈａｎ，Ｗ．（１９９５）Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＶＡ ｂｙ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＳＢ１ＩＩ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＶＡ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｆ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＳＢ１．、Ａｃｔａ Ｓｃｉｅｎｔｉａｅ Ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ、１５（２）、２０８〜２１６頁
【非特許文献２７】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｎｉｎｏｍｉｙａ，Ｋ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．、Ａｄａｃｈｉ，Ｏ．、Ａｍｅｙａｍａ，Ｍ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８４）Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ａ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｙｍｂｉｏｎｔ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＶＭ１５Ｃ．、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８（１１）、２８７３〜２８７６頁
【非特許文献２８】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｆｕｊｉｔａ，Ｉ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８５）Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＶＭ１５Ａ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ ｗｉｔｈ ｍｉｘｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４９（６）、１３８９〜１３９１頁
【非特許文献２９】
Ｓｈｉｍａｏ，Ｍ．、Ｏｎｉｓｈｉ，Ｓ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．＆Ｓａｋａｚａｗａ，Ｃ．（１９８９）Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＶＭ１５Ｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５５（２）、２７５〜２７８頁
【発明が解決しようとする課題】
上記先行技術は、ＰＶＡを分解できる菌が活性汚泥を含む自然環境中に存在していることを示す。上記先行技術はまた、たとえＰＶＡ分解菌を含んでいたとしても、通常の活性汚泥法でＰＶＡを分解することは非常に困難であることをも示している。従って、これらの菌を含む活性汚泥を用いてＰＶＡを分解するためには、その分解活性を最大限に発揮させるための条件の設定、またはこれらの菌に最も適したプロセスを開発する必要がある。本発明は、このような作業を必要としない、上記従来のＰＶＡ分解菌を凌駕する新規ＰＶＡ分解菌、およびそれを利用した排水処理プロセスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明は、新規ポリビニルアルコール分解菌に関し、この菌は、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
上記ポリビニルアルコール分解菌は、シュードモナス属に属する細菌であり得る。
上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクター属に属する細菌であり得る。
好ましくは、上記窒素源は、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４であり得る。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクターＩＡＭ−３株であり得る。
好ましくは、上記ポリビニルアルコール分解菌は、アシネトバクターＩＡＭ−４株であり得る。
本発明はまた、上記の細菌のいずれか１つ、または上記の細菌の複数種を含む微生物製剤に関する。
本発明はまた、上記微生物剤と、この微生物剤に酸素を供給する手段とを備えた、排水処理プロセスに関する。
【発明の実施の形態】
本発明において利用される一般的な分子生物学的手法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．および同第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどに記載され、当業者によって容易に実施される。
本明細書で用いる用語は、特に示されなければ、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。また、本明細書で用いる用語は、一般に、特に示されなければ、単数形の表現であってもその複数形の概念をも含む。また、本明細書で用いる「％」は、特に示されなければ重量％を意味する。
本明細書で用いる用語「炭素源」は、一般に、微生物によって吸収利用される炭素を含む化合物（炭素化合物）を意味し、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などの炭水化物、多価アルコール、有機酸類類、およびこれらを含む原材料を包含する。
本明細書で用いる用語「窒素源」は、一般に、微生物がその体を構成するタンパク質、核酸、その他の窒素化合物の原材料として、外界から取り入れられる窒素を含む化合物（窒素化合物）を意味し、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、アミノ酸、アミド、アミン、尿素などの有機窒素化合物、およびこれらを含む、ペプトン類、酵母エキス（以下しばしばＹＥと略記する）、肉エキス、コーンスティープリカーなどの原材料を包含する。
本明細書で用いる用語「好気培養」は、通常は、振盪、攪拌、通気などをおこなって培養液内を好気的に保つ培養をいう。本発明のＰＶＡ分解菌は、簡便には、実験室規模の振盪培養によって評価され得る。
以下、本発明を説明する。本発明の新規ポリビニルアルコール分解菌は、代表的には、グラム陰性の桿状形態の一群の細菌であって、特に、その優れたＰＶＡ分解能力および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列によって既存の細菌と区別され得る。
本発明の新規ポリビニルアルコール分解菌は、自然界、特に下水処理場の新鮮な活性汚泥などから、以下の実施例に代表される手法を用いて分離され得る。
本発明は、新規ポリビニルアルコール分解菌に関し、この菌は、ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。
本発明のＰＶＡ分解菌は、１０〜０．０１％の範囲、通常５〜０．０２％の範囲、より好ましくは１〜０．０５％の範囲で、ＰＶＡ分解菌が生育する溶液（培養液）に添加されたポリビニルアルコールを分解する。本発明のＰＶＡ分解菌は、窒素源の存在下３０℃１０日間の好気培養で添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を、好ましくは、少なくとも９０％を分解する。
本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
本明細書で用いる用語「ＲＮＡ」は、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の略称であり、当該分野において最も広義に用いられるのと同じ意味で用いられ、（塩基）−（Ｄ−リボース）−（リン酸）からなるヌクレオチドが鎖状に重合したポリヌクレオチドまたはその等価物をいう。本明細書で用いる用語「ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、互いに等価な意味で用いられ、用語「ヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドを含む意味で用いられる。本明細書で用いる用語「リボソームＲＮＡ」または「ｒＲＮＡ」は、通常用いられるように、リボソームを構成するＲＮＡであって、特に「１６Ｓ・ｒＲＮＡ」または「１６ＳリボソームＲＮＡ」は、原核細胞のｒＲＮＡを構成する３０Ｓサブユニットに含まれる分子量０．６×１０６の分子をいう。１６Ｓ・ｒＲＮＡは、その３’末端近傍でｍＲＮＡと結合することが知られている。本明細書で用いる用語「１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子」は、１６ＳリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡをいう。本明細書で用いる用語「ＤＮＡ」は、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本明細書において用いるヌクレオチドの「相同性」とは、２種類以上のヌクレオチド配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つのヌクレオチド配列の相同性が高いほど、それらのヌクレオチドの配列の同一性または類似性は高い。２種類のヌクレオチド配列が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって調べることができる。２つのヌクレオチド配列を直接比較する場合、それらのヌクレオチド配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらのヌクレオチド配列は相同性を有している。
ヌクレオチド配列の同一性、類似性および相同性の比較は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴをデフォルトパラメータを用いて算出される。ヌクレオチド配列の相同性は、ＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
あるいは、２つのヌクレオチド配列が相同性を有するか否かは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べることができる。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。
本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列またはその部分配列から選択されたヌクレオチド配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
具体的には、本発明のＰＶＡ分解菌は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で対象ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することによっても保持される１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有している。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明のＰＶＡ分解菌は、好気条件下で良好に生育し、そしてＰＶＡを分解する。好気条件は、通常、微生物に酸素を供給する手段によって行われる。
上記微生物剤に酸素を供給する手段は、微生物の生存および増殖に必要な酸素を微生物に提供し得る任意の手段を含み、通常、空気を曝気することによりなされる。曝気方式には、散気装置を用いる散気方式、浸漬タービン曝気方式、ジェットエアレーション法、機械式表面曝気法などを用い得る。散気方式として、旋回流方式、全面曝気方式などを用い得る。空気に代えて高濃度酸素もまた用い得る。
本発明のＰＶＡ分解菌は、微生物剤の形態で用いても良く、それによってＰＶＡ分解効率を向上し得る。ここで、「微生物剤」とは、１種以上のＰＶＡ分解菌と任意の材料とを含む固体または液体の組成物をいい、ＰＶＡ分解菌とともに含まれる材料の例として、土壌に含まれる無機物および有機物のような微生物が存在する天然環境において微生物の周囲に通常近接して存在する材料、微生物の固定化に用いられるバーミキュライト、シリカ、ゼオライト、活性炭、光硬化性樹脂、各種樹脂などの天然または合成の担体材料が挙げられる。
あるいは、本発明のＰＶＡ分解菌を培養した後、当該分野で公知の固定化法によって上記公知の天然または合成の担体材料に固定化して微生物剤として用い得る。
本発明の微生物剤は、通常、既存の浄化槽、グリーストラップ、接触曝気槽、活性汚泥槽などに適当量投入して使用し得る。あるいは、前記浄化槽などに充填し固定床しても使用し得る。
【実施例】
本発明を実施例により説明する。以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。
（実施例１） ＰＶＡ分解菌の分離
分離手順
下水処理場の活性汚泥から、以下の手順（図１３にその概略を示す）によりＰＶＡ分解菌の単離を行った。
（ｉ）ＰＶＡを含有する４種類の培地（表１および図１３にそれぞれ▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼として示される）に活性汚泥を添加し、３０℃で振盪培養した。
（ｉｉ）表２に示す手順でＰＶＡを定量してその分解を測定するとともに、各培養液の液相に含まれていた菌体およびフラスコ面に付着してた菌体をそれぞれ表１に▲１▼および▲２▼で示す培地に再懸濁し、集積培養を行った。
（ｉｉｉ）集積培養を繰り返した培養液６種を適当な希釈倍率でＰＶＡ＋ＹＥ寒天培地（表１の▲２▼）に播種し、コロニーを単離した。その中の４種のコロニーについて表１に示す培地▲２▼に植菌し、表２に示す手順に従ってＰＶＡを定量してＰＶＡの分解を測定した。
（ｉｖ）また、ここまでの培養でＰＶＡの分解能が大きかった集積培養の３種類（集積培養１、２および３）について、窒素源の種類、および酵母エキスの有無（表１に▲１▼▲２▼▲５▼および▲６▼で示される培地）によるＰＶＡ分解能および菌の増殖に対する影響を調べた。さらに、（ｉｉｉ）で単離した４種のコロニーのうちＰＶＡの分解を確認した３種（コロニー１、３および４）についても同様に調べた。
（ｖ）同様に、４種類のコロニーの１６Ｓ・ｒＲＮＡの一部をシーケンスし、ＢＬＡＳＴ検索を行った。
表１．ＰＶＡ分解菌の分離に用いた培地
▲１▼基礎ＰＶＡ培地
ＰＶＡ １０００ｍｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １４００ｍｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２７０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ５０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ５０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ／Ｌ。
▲２▼ＰＶＡ＋ＹＥ培地
基礎ＰＶＡ培地＋Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０００ｍｇ／Ｌ。
▲３▼原排水
組成不明（染色工場排水）
▲４▼合成廃水
ＰＶＡ ５０ｍｇ／Ｌ、ペプトン ７５ｍｇ／Ｌ、肉エキス ５０ｍｇ／Ｌ、尿素 ２５ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ２５ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ ３．５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ３．５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ２．５ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ７．５ｍｇ／Ｌ。
▲５▼窒素源違い培地組成
基礎ＰＶＡ培地−ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ＋ＮＨ２ＣＯＮＨ２ １００ｍｇ
▲６▼窒素源違い培地組成
ＰＶＡ＋ＹＥ培地−ＮＨ４ＮＯ３ １００ｍｇ＋ＮＨ２ＣＯＮＨ２ １００ｍｇ
表２．ＰＶＡの定量法
【表２】
結果
今回試験した試料（上記（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の集積培養３種類および単離したコロニー３つ）についての結果を図１〜図１２に示す。図１〜図１２において示されるグラフは、いずれも、培養における菌体量（ＯＤ６６０ｎｍ）およびＰＶＡ量の経時変化を示したものである。いずれのグラフも、横軸は培養時間（日数）を、縦軸はＰＶＡ量（％）または培養液のＯＤ６６０ｎｍ値を示してある。また、各グラフの上には、試験した試料（集積培養１、２、および３、またはコロニー１、３および４）と、用いた培地の炭素源および窒素源を示した。以下に得られた結果を要約する。
−全体−
図１〜図１２に見られるように、今回試験したすべての試料について、基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼：炭素源はＰＶＡのみ）を用いてもＰＶＡの分解が観察された。培養１０日までにＰＶＡを９０％以上分解したものも存在した（図３上、下、図５上、および図７上、中）。
−培地の検討−
基礎培地（▲１▼および▲５▼）に酵母エキスを添加したＰＶＡ＋ＹＥ培地（それぞれ▲２▼および▲６▼）を用いた場合、基礎ＰＶＡ培地に比べ、ＰＶＡ分解能、菌の増殖ともに大きくなった（培養３〜５日目で９０％以上のＰＶＡ分解が観察された場合が多い）（図１と２との比較、図３と４との比較、図５と６との比較、図７と８との比較）。
−集積培養の結果−
集積培養１：基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼）においても、集積培養１は、比較的分解速度が速く、８日目でＰＶＡを９０％以上分解した（図５上および図７上）。ＹＥを加えた場合に分解速度の上昇が観察された（図６上および図８上）。
集積培養２：基礎ＰＶＡ培地において、窒素源が尿素の場合（▲５▼）に１０日目でＰＶＡを９０％以上分解した（図７中）。窒素源が硝酸アンモニウムの場合（▲１▼）は１０日目でＰＶＡの７０％が分解された（図５中）。ＹＥを加えた場合は分解速度の上昇が観察された（図６中および図８中）。
集積培養３：基礎ＰＶＡ培地において、菌の増殖および分解能は比較的低いことが判明した（１０日目にＰＶＡ分解は４０〜６０％、ＯＤ６６０は０．２〜０．３（図５下および図７下））。ＰＶＡ＋ＹＥ培地では、菌の増殖およびＰＶＡの分解は促進されるが、菌の増殖は２〜３日目から減少した（図６下および図８下）。
−単離した菌（コロニー１、３および４）
コロニー１：基礎ＰＶＡ培地（▲１▼および▲５▼）においてＰＶＡの分解が観察され、尿素を窒素源として加えた場合にＰＶＡ分解が若干促進された（図１下と図３下との比較）。ＹＥを加えた場合にＰＶＡ分解速度の上昇が観察された（培養４日目にＰＶＡ分解９０％以上）（図２下および図４下）。
コロニー３：コロニー１および４と比較して、いずれの培地においてもＰＶＡ分解活性は低いことが判明した（図１中〜図４中）。
コロニー４：コロニー１とほぼ同程度の分解活性を示したが、基礎ＰＶＡ培地に窒素源として硝酸アンモニウムを加えた場合、増殖およびＰＶＡ分解活性はコロニー１より小さかった（図１上と下との比較）。
次いで、コロニー１およびコロニー４をさらなる解析に供した。
−集積培養とコロニー培養との比較
コロニー１および４は、集積培養２および１からそれぞれ単離したものである。そこで、それぞれのコロニーを用いた培養を、そららが分離された集積培養を用いた培養とを比較した。
コロニー１と集積培養２との比較：コロニー１は、ＰＶＡの分解が基礎ＰＶＡ培地（窒素源として尿素を用いた場合、培養９〜１０日目に９０％以上のＰＶＡ分解が観察された）、およびＰＶＡ＋ＹＥ培地（培養４〜５日目に９０％以上のＰＶＡ分解が観察された）ともに、集積培養２より少し良好であった（図９および図１０）。従って、集積培養２のＰＶＡ分解作用の大部分はコロニー１によることが示唆された。
コロニー４と集積培養１との比較：ＰＶＡ＋ＹＥ培地において、コロニー４は、集積培養１よりも菌の増殖はやや少なかったが、ＰＶＡ分解はほぼ同程度（培養４日目で９０％以上のＰＶＡ分解）であったので、集積培養１においてもコロニー４がＰＶＡの分解に寄与していると考えられた（図１１）。しかし、基礎ＰＶＡ培地では、両者に菌の増殖に差はないものの、ＰＶＡの分解は、コロニー培養よりも集積培養の方が早いため、酵母エキスがない場合、他の菌または他の菌から放出される物質が分解を促進していることが示唆された（図１２）。
−ＢＬＡＳＴ結果（詳細は以下の実施例２に記載する）
コロニー１：Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａなどと相同性を示した。
コロニー２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓと相同性を示した。
コロニー３：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と相同性を示した。コロニー４：Ａｌｖｉｎｅｌｌａ ｐｏｍｐｅｊａｎａ ｓｙｍｂｉｏｎｔ、ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と相同性を示した。
コロニー３および４から得た菌は、ペア〜短連鎖し、グラム陰性であって、対数増殖期には長さ１．０〜２．５μｍの短桿菌である。増殖の定常期には短くなり球状になる傾向があった。胞子は形成せず、鞭毛は存在しない。オキシダーゼ陰性であり、カタラーゼ陽性であって、アセトイン、インドールおよびＨ２Ｓは産生しない。至適生育温度３０〜３２℃、そして至適生育は約７であり、ペニシリン耐性であった。
なお、コロニー１は、ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４として、２００３年２月７日付けで産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。また、コロニー３および４は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＩＡＭ−３株およびＩＡＭ−４株として、京都大学工学研究科（京都市左京区吉田本町）に保存され、請求により分譲される。
（実施例２） ＰＶＡ分解菌の特徴付け
１．コロニー１
コロニー１から由来の株は、桿状の細菌であった。グラム染色性は陰性であった。この菌は、カタラーゼおよびオキシダーゼ陽性であった。コロニー１の１６Ｓ・ｒＲＮＡ遺伝子を定法に従い単離し増幅した。要約すれば、１６Ｓ・ｒＲＮＡ増幅用ＰＣＲプライマーとして、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（大腸菌１６Ｓ・ＲＮＡの遺伝子における位置：８〜２７）および５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’（大腸菌１６Ｓ・ｒＲＮＡにおける位置：１５４３〜１５２５）を用い、コロニー１から単離された１６Ｓ・ｒＲＮＡから、コロニーＰＣＲ法により約１．５ｋｂのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の長さの断片を切り出して精製した。このＰＣＲ増幅産物のダイレクトシーケンシングを行い、配列を決定した。
決定されたコロニー１の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を配列表の配列番号１に示す。この配列を、既存のデータベース（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＵＰＤ）にある配列とＢＬＡＳＴを用いて比較したところ、コロニー１はシュードモナス属の細菌に近縁であることが示された。図１５にコロニー１のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図１６は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
２．コロニー３および４
上記１に記載したコロニー１の場合と同様に、コロニー３および４の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を決定した。決定されたコロニー３および４の１６Ｓ・ｒＲＮＡ配列を配列表の配列番号２および３にそれぞれ示す。
図１７にコロニー３のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図１８は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
図１９にコロニー４のＢＬＡＳＴ解析結果を示す。図２０は、ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列の１つを示す。
図１７および図１９に示されるように、コロニー３およびコロニー４のいずれもがアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌と最も高い相同性を示した。
（実施例３） ＰＶＡ分解菌を用いたＰＶＡの分解
容量が約１ｍ３のタンクを用い、分離されたコロニー１、３および４を含む活性汚泥を用いてＰＶＡの分解試験を行った。処理水としては、表１に示す▲４▼合成排水を用いた。まず、分離されたコロニー１、３および４を含む小量の種汚泥を、合成廃水で約２日間回分培養して増やした後、倍容量の合成廃水を添加して約２間回分培養した。以後同様の操作を繰り返し、タンク内のＰＶＡの濃度を経時的に測定した。図２１にその結果を示す。
図２１において、横軸は、試験開始からの日数を示す。図中の点線は、タンク内の液の容量を、黒丸は定法に従って測定したＣＤＯを、そして白丸は、表２に示す方法で測定したＰＶＡの濃度を示す。図２１に示されるように、１０日の試験で、液量を約８００Ｌまで増加させた。各回分培養で、ＰＶＡ濃度およびＣＯＤが漸次低下した。得られた結果を、ＰＶＡ負荷およびＣＯＤ負荷に換算すると、それぞれ、０．３８ｋｇ／ｍ３／日および０．８４ｋｇ／ｍ３／日であった。
【発明の効果】
ＰＶＡを含む排水を浄化する能力に優れた細菌、およびこれを用いた排水処理プロセスが提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図２】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図３】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図４】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図５】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図６】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：硝酸アンモニウム）を使用。
【図７】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。基礎ＰＶＡ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図８】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。ＰＶＡ＋ＹＥ培地（窒素源：尿素）を使用。
【図９】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１０】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１１】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１２】本発明の細菌によるＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。集積培養と単離培養との比較を示す。
【図１３】本発明のＰＶＡ分解菌の単離手段の概略を示す図である。
【図１４】ＰＶＡの構造を示す図である。
【図１５】本発明のコロニー１から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図１６】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図１７】本発明のコロニー３から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図１８】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図１９】本発明のコロニー４から単離された細菌のＢＬＡＳＴ解析結果を示す図である。
【図２０】ＢＬＡＳＴ解析で用いた参照配列を示す図である。
【図２１】本発明の細菌を含む活性汚泥のＰＶＡ分解の経時変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規ポリビニルアルコール分解菌であって、
ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、細菌。
【請求項２】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号２で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
シュードモナス属に属する、請求項２に記載の細菌。
【請求項６】
アシネトバクター属に属する、請求項３または４に記載の細菌。
【請求項７】
前記窒素源が、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４である、請求項５に記載の細菌。
【請求項９】
アシネトバクターＩＡＭ−３株である、請求項６に記載の細菌。
【請求項１０】
アシネトバクターＩＡＭ−４株である、請求項６に記載の細菌。
【請求項１１】
請求項２、３、および４に記載の細菌からなる群から選択される細菌を含む微生物製剤
【請求項１２】
請求項１に記載の細菌を含む微生物剤と、該微生物剤に酸素を供給する手段とを備えた、排水処理プロセス。
【請求項１】
新規ポリビニルアルコール分解菌であって、
ポリビニルアルコールを唯一の炭素源として生育し、窒素源の存在下、３０℃１０日間の好気培養で、添加されたポリビニルアルコールの少なくとも４０％を分解し、そして配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、細菌。
【請求項２】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号２で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
シュードモナス属に属する、請求項２に記載の細菌。
【請求項６】
アシネトバクター属に属する、請求項３または４に記載の細菌。
【請求項７】
前記窒素源が、硝酸アンモニウム、酵母エキス、および尿素からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０４である、請求項５に記載の細菌。
【請求項９】
アシネトバクターＩＡＭ−３株である、請求項６に記載の細菌。
【請求項１０】
アシネトバクターＩＡＭ−４株である、請求項６に記載の細菌。
【請求項１１】
請求項２、３、および４に記載の細菌からなる群から選択される細菌を含む微生物製剤
【請求項１２】
請求項１に記載の細菌を含む微生物剤と、該微生物剤に酸素を供給する手段とを備えた、排水処理プロセス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００６−１８０７０６（Ｐ２００６−１８０７０６Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−６４２０８（Ｐ２００３−６４２０８）
【出願日】平成１５年３月１０日（２００３．３．１０）
【出願人】（５０３０９２７５５）有限会社アイピーバイオ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月１０日（２００３．３．１０）
【出願人】（５０３０９２７５５）有限会社アイピーバイオ (2)
【Ｆターム（参考）】
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