新規微生物、当該新規微生物を用いた廃水処理方法及び廃水処理装置
【課題】グリセロールからエタノールを合成する能力に優れた新規な微生物の提供。
【解決手段】ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有しグリセロールを含む廃水に微生物を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程と水素を回収する工程を更に含むことを特徴するエタノールの製造方法、および、生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする廃水処理装置。
【解決手段】ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有しグリセロールを含む廃水に微生物を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程と水素を回収する工程を更に含むことを特徴するエタノールの製造方法、および、生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする廃水処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば廃水に含まれるグリセロールからエタノールを生成することができる新規微生物に関し、さらに当該新規微生物を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料とは、主に植物の含有油脂を原料としたディーゼルエンジン用の燃料であり、現在使用されている軽油の代替え燃料となりうる。特に、バイオディーゼル燃料は、カーボンニュートラルなエネルギー源として注目されている。バイオディーゼル燃料を精製するには、先ず、パーム油等の油脂にメタノールと触媒（酸触媒あるいはアルカリ触媒）を加えてエステル交換反応を起こし、これに酸あるいはアルカリを加えて中和させたうえで、グリセロールを残査成分として脂肪酸メチルエステルと分離する。分離した脂肪酸メチルエステルから触媒成分を取り除き、さらに蒸留することでメタノールを除去し、脂肪酸メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を精製することができる。
【０００３】
以上のように、バイオディーゼル燃料を精製する工程において、残査成分として必グリセロールが得られるのであるが、この残査成分については特に有用な用途もなく通常は廃棄されている。残査成分として得られたグリセロールを活用する例としては、特許文献１（特開２００６−１８０７８２号公報）に開示されるように、エンテロバクター属細菌を利用してグリセロールから水素とエタノールとを製造するものが挙げられる。
【０００４】
より具体的に特許文献１には、エンテロバクター・アロエゲネス（Enterobacter aerogenes）を多孔質担体に固定しておき、これを用いてグリセロールから水素とエタノールを発酵生産するといった技術が開示されている。ただし、特許文献１には、バイオディーゼル燃料を精製する過程で生ずるグリセロールを含む廃液を原料とする場合、エンテロバクター・アロエゲネスをそのまま使用したのでは発酵効率が著しく低いことが述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１８０７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、特許文献１に記載されたエンテロバクター属細菌ではエタノール生産能が十分ではないといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、グリセロールからエタノールを合成する能力に優れた新規な微生物を提供することを目的とし、更に、当該微生物を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、日本各地の土壌を用いてグリセロールからエタノールを生産する能力を有する微生物について鋭意検討した結果、グリセロールを利用したエタノール生産能を有する新規微生物を単離、同定することができた。本発明は、これら新規微生物が有するグリセロールを利用したエタノール生産能に基づいてなされたものである。単離、同定した新規微生物は従来公知の微生物には分類されない。
【０００８】
本発明に係る新規微生物は、ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する。本発明者らが単離、同定した新規微生物は、以下の表１又は２に記載された菌学的性質を有する。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】
本発明者らが単離、同定した新規微生物に関して16S リボゾーマルリボ核酸をコードする遺伝子（以下、16S rDNAと称する）の塩基配列を決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列をもとにデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）及びホモロジー検索ソフト（BLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号１に示す塩基配列は、Raoultella planticola及びRaoultella ornithinolyticaと非常に高い相同率（ともに99.2%）を示した。また、ホモロジー検索の結果から分子系統樹を作成したところ、本発明者らが単離、同定した新規微生物は、これら公知のRaoultella属細菌との近縁種であることが判明した。また、表3および表4に示した菌学的性質等を総合考慮すると、本発明者らが単離、同定した新規微生物は、ラオウルテラ属に属する新種微生物であることが判明した。
【００１２】
本発明者らが単離、同定した新規微生物は、TB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託した。
【００１３】
一方、本発明に係るエタノールの製造方法は、上述した本発明に係る微生物を使用してグリセロールからエタノールを生産する方法である。すなわち、本発明に係るエタノールの製造方法は、グリセロールを含む廃液を用いるシステムに適用することができる。グリセロールを含む廃液としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で残査成分として産生されるグリセロール廃液を挙げることができる。また、本発明に係るエタノールの製造方法においては、エタノールとともに水素ガスを回収することができる。言い換えると、上述した本発明に係る微生物を利用してグリセロールから水素を製造する方法も提供することができる。
【００１４】
また、本発明に係る廃水処理装置は、グリセロールを含む廃水に上述した本発明に係る微生物を接触させる発酵槽を備えるものである。本発明に係る廃水処理装置において、グリセロールを含む廃水としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で得られる廃水を使用することができる。また、本発明に係る廃水処理装置は、上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールといった有用な物質を得ることができる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明に係る新規な微生物は、エタノール生産能に優れるため、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずる廃液に含まれるグリセロールからエタノールの製造するシステムに適用することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、新規微生物により廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールを製造するといった発酵槽を有する廃液処理装置を提供することができる。本発明に係る廃水処理装置によれば、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずるグリセロール含有廃液を原料として有用なエタノールや水素といった物質を効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】供試菌株（SID6166-04、すなわちTB-82）及び近縁種を含む系統樹図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規微生物は、ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有している。本発明に係る新規微生物は、グリセロールからエタノールを生成する能力を有している点において、従来公知のラオウルテラ属細菌、例えばRaoultella planticola及びRaoultella ornithinolytica等と相違している。
【００１９】
このような特徴的な性質を有する本発明に係る新規微生物は、例えば、土壌から単離することができる。具体的な手法としては、先ず、土壌サンプルに含まれる微生物をグリセロール含有培地で培養し、培養終了後の培地に含まれるエタノールを測定することで評価することができる。次に、当該微生物の16S rDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いて各種の塩基配列データベースを検索し、他のラオウルテラ属細菌と類似するものを新規微生物として選択することができる。
【００２０】
なお、具体的に、本発明においては、茨城県つくば市の土壌から採取したサンプルから本発明に係る新規微生物を単離し、TB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託している。この寄託菌株の菌学的性質を下記表３及び４に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
また、当該寄託菌株の16S rDNAの塩基配列を配列番号１に示す。
なお、本発明に係る新規微生物は、受託番号FERM P-21705で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ属に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本発明に係る新規微生物は、上記表１又は表２に示す菌学的性質を有し、グリセロールからエタノールを生産する能力を有するラオウルテラ属細菌を全て包含する。
【００２４】
以上で説明した本発明に係る新規微生物は、グリセロールからエタノールを生産する能力を有するといった特徴を併有している。特に、本発明に係る新規微生物のアルコール生成能は、従来公知の微生物（例えば、特許文献１に開示されたエンテロバクター属細菌）と比較して非常に優れている。
【００２５】
本発明に係る新規微生物を用いることで、グリセロールを利用したエタノールの製造方法を構築することができる。すなわち、上記微生物を利用することによって、グリセロールを含有する溶液を用いたエタノールの製造システムを構築することができる。グリセロールを含む溶液とは、特に限定されるものではないが、例えば、バイオディーゼル燃料の製造過程に生ずる廃液を挙げることができる。バイオディーゼル燃料を製造する際には、先ず、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステル及びグリセロールを生成する。そして、生成したグリセロールを分離することで、メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を製造することができる。
【００２６】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法等を用いて行なうことができる。
【００２７】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂又はその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。
【００２８】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。
【００２９】
かかるバイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。なお、廃液には、原料として使用した油脂に含まれる成分によって異なるが、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。また、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液は、エタノールの製造方法にそのまま使用しても良いし、適宜、水等の溶媒を添加して所望のグリセロール濃度にしてから使用しても良い。さらに、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、他の物質を添加することもできる。
【００３０】
また、本発明に係る新規微生物を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、溶液中に含まれるグリセロール濃度は、特に限定されないが、10〜200(g/l)とすることができ、特に10〜100(g/l)とすることが好ましく、20〜50(g/l)とすることがより好ましい。なお、本発明に係る新規微生物を培養する際には、上述したグリセロールの他に、炭素源となる物資、窒素源となる物質を含有する培地を適宜選択して使用することができる。また、酵母抽出液やカゼインなどのタンパク質の酵素分解物といった一般に微生物用培地に用いられている培地組成物を使用しても良い。
【００３１】
さらに、本発明に係る新規微生物を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、上記新規微生物の培養時間としては、特に限定されないが、3〜7（日）とすることができ、特に4〜5（日）とすることが好ましい。培養温度としては、特に限定されないが、20〜35（℃）とすることができ、特に25〜30（℃）とすることが好ましい。
【００３２】
一方、上述した新規微生物によれば、グリセロールからエタノールを生成する際に併せて水素が生成される。よって、上述した新規微生物を用いることによって、水素の製造方法及び水素製造システムを構築することもできる。
【００３３】
ところで、本発明の製造方法に使用する培養装置は、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。培養方式としては、回分培養、連続培養、フィード培養のいずれの培養方式であってもよい。培養装置としては、図示しないが、上述した新規微生物によりグリセロールからエタノールを生成するための発酵槽を備えていればその他の構成は特に限定されない。例えば、培養装置には、エタノールを回収するための回収装置や、水素を回収するための水素回収装置を備えていても良い。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕新規微生物の単離、同定
（1）微生物単離
土壌サンプルとしては、日本各地の土壌（例えば、茨城県つくば市の土壌）を用いた。土壌サンプルのなかから、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物を含むものを選抜し、その土壌サンプルから生産菌（細菌）の分離を行い、その性質について検討するとともに、新たな有用菌株のスクリーニングを行った。
【００３５】
有用菌株のスクリーニングにおいて、培地には以下に示す集積用培地（1リットル当たり：KH2PO410.0g、NH4Cl 1.0g、Yeast Extract 0.5g、Glycerol 100.0g）を用いた。ダーラム管を入れた大試験管に液体培地30mlを入れ、土壌サンプルを加えた後、シリコ栓をして30℃、一週間培養した。これを適宜植え継ぎ、気泡発生が見られたものについて上記培地に寒天を加えた平板培地にて菌の単離を行った。これらの中から気泡発生の見られたものを供試菌として以降の実験に供した。
【００３６】
次に、土壌から単離した菌を細菌用の一般的な栄養培地であるNB平板培地に植菌し、30℃で培養した。大試験管に上記液体培地30ml（グリセロール濃度2％に変更し、補助栄養源としてカザミノ酸0.1％を加えたもの）を入れ、1白金耳植菌し、30℃で静置培養した。実験は２連で行った。
【００３７】
７日間培養後に培養液1mlを採取し、遠心分離にかけ、その上清をHPLCを用いて分析した。菌体の生育量は580nmで測定した濁度（OD580）で示した。以上の実験結果を表５に示した。また、上述の選抜試験によって得られたグリセロールからのエタノール生産能を持つ土壌サンプルについても同様に実験を行い、その結果を併せて表５に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】
表５に示したように、土壌サンプル及びM1〜M9については、エタノールのほかに副産物として1,3-プロパンジオール（1,3-PD）の生産が観察された。なお、土壌サンプルを用いた実験において、エタノールの生産は培養５日で最高（0.27％）となったが、その後減少し、７日目には消失した。
【００４０】
一方、M10-M15については、1,3-PDの生成は認められず、エタノールのみの生産が見られた。同時に気体の発生も確認されているので、水素ガスが副成されている可能性もある。
【００４１】
また、M10、M11、M12、M13の４株には特に高いエタノール生産性が見られた。これら４株を、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物として単離することができた。特開２００６−１８０７８２号公報に開示されたEnterobacter aerogenesは、最適条件化においてもエタノール生産能が0.5％以下となっている。これと比較すると、本実施例で同定された４株については、生産条件を更に検討することにより、より効率的なエタノール生産プロセスを構築できる。
【００４２】
(2)微生物の同定
上記(1)で同定した４株のうちM13株について菌株の同定を行った。菌株の同定は、種間でよく保存されている16S rRNAをコードしている塩基配列をデータベース上で比較する方法をとった。また、形態観察及び生理・生化学試験を行い、当該株の帰属分類群を決定した。
【００４３】
ゲノムDNA抽出に使用した試薬
【表６】
【００４４】
ゲノムDNAの抽出
目的とする菌を、12時間、60度で培養し、ペレットにした。567μlのTEを添加し、ピペッティングによってよく懸濁した。30μlの10％SDSと3μlの20mg/mlプロティナーゼKを加え、軽くvortexしてから37度で1時間インキュベートした。5MのNaClを100 ml加え、vortexしてよく混ぜた。CTAB/NaCl溶液を80μl加えてよく混ぜ、65度で10分間インキュベートした。ほぼ等量(700μl程度)のCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、15,000rpmで5分間、室温で遠心した。遠心後、白い界面が現れた。界面部分をとらないように水層を新しいチューブに移した。ほぼ等量(700μl)のPCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、再び15,000rpmで5分間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移した。イソプロパノールを0.6容(450μl程度)加え、白いひも状のDNAがはっきり見えるようになるまでチューブをひっくり返して混ぜた。室温で2-10分間静置し、15,000rpmで10-15分間、室温で遠心してDNAを沈殿させた。10μlのTE bufferに溶解させ、10mg/mlのRNase solutionを1μl加え、37度で1時間程度インキュベートした。等量(100μl)のPCIを加え、20秒間vortexして均一なエマルジョンにし、15,000rpmで15秒間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移し、下層に再度100μlのTEを足してvortex、15,000rpmで15秒間遠心し、上層を先にとったものに加えた。この上層200μlに、3M酢酸ナトリウム溶液を20μl、100％エタノールを500μl加えて、よく混ぜた後、室温で2-10分間放置した。15,000rpmで10-15分間遠心し、DNAをペレットにし、上清を除き、70％エタノールを1ml加え、軽く混ぜてDNAを洗浄した。15,000rpmで5分間遠心して再度沈殿させ、上清を取り除き、真空デシケータで、ペレットを乾燥させた。100μlのTEに溶解させ、260nmの吸光度を測定して濃度を決定するとともに、電気泳動によって得られたDNAの分子量をチェックした。
【００４５】
PCRによる16s rDNA領域の増幅とDNA塩基配列決定
目的とする菌をNutrient agar培地（Oxoid社製）を用いて45℃で24時間培養し、培養した菌体からDNAを抽出し、16s rDNA領域をPCRにより増幅し、その後、配列決定を行った。具体的に、DNA抽出にはInstaGene Matrix（Bio Rad社製）を添付のプロトコールに従って使用した。PCRは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルシークエンスには、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムス社製）を添付のプロトコールに従って使用した。使用したプライマーは、「遺伝子解析法 16s rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定88-117pp、日本学会事務センター（２００１）」に開示された9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R及び1510Rを使用した。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System（アプライドバイオシステムス社製）を添付のプロトコールに従って使用した。配列決定はChromasPro 1.4（Technelysium Pty社製）を添付のプロトコールに従って使用した。
【００４６】
得られた16s rDNA領域の塩基配列を配列番号１に示した。配列番号１の塩基配列に基づいて相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。ソフトウェアとしてはアポロン2.0（テクノスルガ・ラボ社製）を使用し、データベースとしてはアポロンDB-BA3.0及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を使用した。
【００４７】
形態観察及び生理・生化学試験
光学顕微鏡による形態観察及びBARROW et al., "Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria" 3rd edition. 1993. Canibridge University Pressに記載された方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵（O/F）について試験を行った。生理・生化学試験にはAPI50CHB（BioMerieux社製）を使用した。
形態観察及び生理・生化学試験の結果を表７及び８に示した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
【表８】
【００５０】
BLASTを用いたGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果及びアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索の結果をそれぞれ表９及び１０に示した。
【００５１】
【表９】
【００５２】
【表１０】
【００５３】
なお、表９及び１０においてSID6166-04とは、本実施例で供試した微生物（Ｍ13株）に付した記号である。表９及び１０に示した結果から、系統樹を作成した（図1）。供試菌は、Raoultella属あるいはEnterobacter属に近い細菌であると考えられた。さらに形態観察及び生理・生化学試験の結果も考慮して、ラオウルテラ属に属する新種微生物であることが判明した。
【００５４】
本実施例で単離・同定されたグリセロールからエタノールを生成する能力を有するラオウルテラ（Raoultella sp.）の新規菌株をTB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託した。
【受託番号】
【００５５】
FERM P-21705
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば廃水に含まれるグリセロールからエタノールを生成することができる新規微生物に関し、さらに当該新規微生物を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオディーゼル燃料とは、主に植物の含有油脂を原料としたディーゼルエンジン用の燃料であり、現在使用されている軽油の代替え燃料となりうる。特に、バイオディーゼル燃料は、カーボンニュートラルなエネルギー源として注目されている。バイオディーゼル燃料を精製するには、先ず、パーム油等の油脂にメタノールと触媒（酸触媒あるいはアルカリ触媒）を加えてエステル交換反応を起こし、これに酸あるいはアルカリを加えて中和させたうえで、グリセロールを残査成分として脂肪酸メチルエステルと分離する。分離した脂肪酸メチルエステルから触媒成分を取り除き、さらに蒸留することでメタノールを除去し、脂肪酸メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を精製することができる。
【０００３】
以上のように、バイオディーゼル燃料を精製する工程において、残査成分として必グリセロールが得られるのであるが、この残査成分については特に有用な用途もなく通常は廃棄されている。残査成分として得られたグリセロールを活用する例としては、特許文献１（特開２００６−１８０７８２号公報）に開示されるように、エンテロバクター属細菌を利用してグリセロールから水素とエタノールとを製造するものが挙げられる。
【０００４】
より具体的に特許文献１には、エンテロバクター・アロエゲネス（Enterobacter aerogenes）を多孔質担体に固定しておき、これを用いてグリセロールから水素とエタノールを発酵生産するといった技術が開示されている。ただし、特許文献１には、バイオディーゼル燃料を精製する過程で生ずるグリセロールを含む廃液を原料とする場合、エンテロバクター・アロエゲネスをそのまま使用したのでは発酵効率が著しく低いことが述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１８０７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、特許文献１に記載されたエンテロバクター属細菌ではエタノール生産能が十分ではないといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、グリセロールからエタノールを合成する能力に優れた新規な微生物を提供することを目的とし、更に、当該微生物を用いたエタノールの製造方法及び廃水処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成するため、本発明者等は、日本各地の土壌を用いてグリセロールからエタノールを生産する能力を有する微生物について鋭意検討した結果、グリセロールを利用したエタノール生産能を有する新規微生物を単離、同定することができた。本発明は、これら新規微生物が有するグリセロールを利用したエタノール生産能に基づいてなされたものである。単離、同定した新規微生物は従来公知の微生物には分類されない。
【０００８】
本発明に係る新規微生物は、ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する。本発明者らが単離、同定した新規微生物は、以下の表１又は２に記載された菌学的性質を有する。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】
本発明者らが単離、同定した新規微生物に関して16S リボゾーマルリボ核酸をコードする遺伝子（以下、16S rDNAと称する）の塩基配列を決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列をもとにデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）及びホモロジー検索ソフト（BLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号１に示す塩基配列は、Raoultella planticola及びRaoultella ornithinolyticaと非常に高い相同率（ともに99.2%）を示した。また、ホモロジー検索の結果から分子系統樹を作成したところ、本発明者らが単離、同定した新規微生物は、これら公知のRaoultella属細菌との近縁種であることが判明した。また、表3および表4に示した菌学的性質等を総合考慮すると、本発明者らが単離、同定した新規微生物は、ラオウルテラ属に属する新種微生物であることが判明した。
【００１２】
本発明者らが単離、同定した新規微生物は、TB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託した。
【００１３】
一方、本発明に係るエタノールの製造方法は、上述した本発明に係る微生物を使用してグリセロールからエタノールを生産する方法である。すなわち、本発明に係るエタノールの製造方法は、グリセロールを含む廃液を用いるシステムに適用することができる。グリセロールを含む廃液としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で残査成分として産生されるグリセロール廃液を挙げることができる。また、本発明に係るエタノールの製造方法においては、エタノールとともに水素ガスを回収することができる。言い換えると、上述した本発明に係る微生物を利用してグリセロールから水素を製造する方法も提供することができる。
【００１４】
また、本発明に係る廃水処理装置は、グリセロールを含む廃水に上述した本発明に係る微生物を接触させる発酵槽を備えるものである。本発明に係る廃水処理装置において、グリセロールを含む廃水としては、バイオディーゼル燃料を精製する過程で得られる廃水を使用することができる。また、本発明に係る廃水処理装置は、上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールといった有用な物質を得ることができる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明に係る新規な微生物は、エタノール生産能に優れるため、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずる廃液に含まれるグリセロールからエタノールの製造するシステムに適用することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、新規微生物により廃水等に含まれるグリセロールを用いてエタノールを製造するといった発酵槽を有する廃液処理装置を提供することができる。本発明に係る廃水処理装置によれば、例えばバイオディーゼル燃料の精製過程で生ずるグリセロール含有廃液を原料として有用なエタノールや水素といった物質を効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】供試菌株（SID6166-04、すなわちTB-82）及び近縁種を含む系統樹図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規微生物は、ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有している。本発明に係る新規微生物は、グリセロールからエタノールを生成する能力を有している点において、従来公知のラオウルテラ属細菌、例えばRaoultella planticola及びRaoultella ornithinolytica等と相違している。
【００１９】
このような特徴的な性質を有する本発明に係る新規微生物は、例えば、土壌から単離することができる。具体的な手法としては、先ず、土壌サンプルに含まれる微生物をグリセロール含有培地で培養し、培養終了後の培地に含まれるエタノールを測定することで評価することができる。次に、当該微生物の16S rDNAの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いて各種の塩基配列データベースを検索し、他のラオウルテラ属細菌と類似するものを新規微生物として選択することができる。
【００２０】
なお、具体的に、本発明においては、茨城県つくば市の土壌から採取したサンプルから本発明に係る新規微生物を単離し、TB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託している。この寄託菌株の菌学的性質を下記表３及び４に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
また、当該寄託菌株の16S rDNAの塩基配列を配列番号１に示す。
なお、本発明に係る新規微生物は、受託番号FERM P-21705で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ属に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本発明に係る新規微生物は、上記表１又は表２に示す菌学的性質を有し、グリセロールからエタノールを生産する能力を有するラオウルテラ属細菌を全て包含する。
【００２４】
以上で説明した本発明に係る新規微生物は、グリセロールからエタノールを生産する能力を有するといった特徴を併有している。特に、本発明に係る新規微生物のアルコール生成能は、従来公知の微生物（例えば、特許文献１に開示されたエンテロバクター属細菌）と比較して非常に優れている。
【００２５】
本発明に係る新規微生物を用いることで、グリセロールを利用したエタノールの製造方法を構築することができる。すなわち、上記微生物を利用することによって、グリセロールを含有する溶液を用いたエタノールの製造システムを構築することができる。グリセロールを含む溶液とは、特に限定されるものではないが、例えば、バイオディーゼル燃料の製造過程に生ずる廃液を挙げることができる。バイオディーゼル燃料を製造する際には、先ず、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステル及びグリセロールを生成する。そして、生成したグリセロールを分離することで、メチルエステルを主成分とするバイオディーゼル燃料を製造することができる。
【００２６】
なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法等を用いて行なうことができる。
【００２７】
このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂又はその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。
【００２８】
また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。
【００２９】
かかるバイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。なお、廃液には、原料として使用した油脂に含まれる成分によって異なるが、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。また、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液は、エタノールの製造方法にそのまま使用しても良いし、適宜、水等の溶媒を添加して所望のグリセロール濃度にしてから使用しても良い。さらに、バイオディーゼル燃料を分離した後の廃液には、他の物質を添加することもできる。
【００３０】
また、本発明に係る新規微生物を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、溶液中に含まれるグリセロール濃度は、特に限定されないが、10〜200(g/l)とすることができ、特に10〜100(g/l)とすることが好ましく、20〜50(g/l)とすることがより好ましい。なお、本発明に係る新規微生物を培養する際には、上述したグリセロールの他に、炭素源となる物資、窒素源となる物質を含有する培地を適宜選択して使用することができる。また、酵母抽出液やカゼインなどのタンパク質の酵素分解物といった一般に微生物用培地に用いられている培地組成物を使用しても良い。
【００３１】
さらに、本発明に係る新規微生物を用いてグリセロールからエタノールを製造する際には、上記新規微生物の培養時間としては、特に限定されないが、3〜7（日）とすることができ、特に4〜5（日）とすることが好ましい。培養温度としては、特に限定されないが、20〜35（℃）とすることができ、特に25〜30（℃）とすることが好ましい。
【００３２】
一方、上述した新規微生物によれば、グリセロールからエタノールを生成する際に併せて水素が生成される。よって、上述した新規微生物を用いることによって、水素の製造方法及び水素製造システムを構築することもできる。
【００３３】
ところで、本発明の製造方法に使用する培養装置は、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。培養方式としては、回分培養、連続培養、フィード培養のいずれの培養方式であってもよい。培養装置としては、図示しないが、上述した新規微生物によりグリセロールからエタノールを生成するための発酵槽を備えていればその他の構成は特に限定されない。例えば、培養装置には、エタノールを回収するための回収装置や、水素を回収するための水素回収装置を備えていても良い。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕新規微生物の単離、同定
（1）微生物単離
土壌サンプルとしては、日本各地の土壌（例えば、茨城県つくば市の土壌）を用いた。土壌サンプルのなかから、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物を含むものを選抜し、その土壌サンプルから生産菌（細菌）の分離を行い、その性質について検討するとともに、新たな有用菌株のスクリーニングを行った。
【００３５】
有用菌株のスクリーニングにおいて、培地には以下に示す集積用培地（1リットル当たり：KH2PO410.0g、NH4Cl 1.0g、Yeast Extract 0.5g、Glycerol 100.0g）を用いた。ダーラム管を入れた大試験管に液体培地30mlを入れ、土壌サンプルを加えた後、シリコ栓をして30℃、一週間培養した。これを適宜植え継ぎ、気泡発生が見られたものについて上記培地に寒天を加えた平板培地にて菌の単離を行った。これらの中から気泡発生の見られたものを供試菌として以降の実験に供した。
【００３６】
次に、土壌から単離した菌を細菌用の一般的な栄養培地であるNB平板培地に植菌し、30℃で培養した。大試験管に上記液体培地30ml（グリセロール濃度2％に変更し、補助栄養源としてカザミノ酸0.1％を加えたもの）を入れ、1白金耳植菌し、30℃で静置培養した。実験は２連で行った。
【００３７】
７日間培養後に培養液1mlを採取し、遠心分離にかけ、その上清をHPLCを用いて分析した。菌体の生育量は580nmで測定した濁度（OD580）で示した。以上の実験結果を表５に示した。また、上述の選抜試験によって得られたグリセロールからのエタノール生産能を持つ土壌サンプルについても同様に実験を行い、その結果を併せて表５に示した。
【００３８】
【表５】
【００３９】
表５に示したように、土壌サンプル及びM1〜M9については、エタノールのほかに副産物として1,3-プロパンジオール（1,3-PD）の生産が観察された。なお、土壌サンプルを用いた実験において、エタノールの生産は培養５日で最高（0.27％）となったが、その後減少し、７日目には消失した。
【００４０】
一方、M10-M15については、1,3-PDの生成は認められず、エタノールのみの生産が見られた。同時に気体の発生も確認されているので、水素ガスが副成されている可能性もある。
【００４１】
また、M10、M11、M12、M13の４株には特に高いエタノール生産性が見られた。これら４株を、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物として単離することができた。特開２００６−１８０７８２号公報に開示されたEnterobacter aerogenesは、最適条件化においてもエタノール生産能が0.5％以下となっている。これと比較すると、本実施例で同定された４株については、生産条件を更に検討することにより、より効率的なエタノール生産プロセスを構築できる。
【００４２】
(2)微生物の同定
上記(1)で同定した４株のうちM13株について菌株の同定を行った。菌株の同定は、種間でよく保存されている16S rRNAをコードしている塩基配列をデータベース上で比較する方法をとった。また、形態観察及び生理・生化学試験を行い、当該株の帰属分類群を決定した。
【００４３】
ゲノムDNA抽出に使用した試薬
【表６】
【００４４】
ゲノムDNAの抽出
目的とする菌を、12時間、60度で培養し、ペレットにした。567μlのTEを添加し、ピペッティングによってよく懸濁した。30μlの10％SDSと3μlの20mg/mlプロティナーゼKを加え、軽くvortexしてから37度で1時間インキュベートした。5MのNaClを100 ml加え、vortexしてよく混ぜた。CTAB/NaCl溶液を80μl加えてよく混ぜ、65度で10分間インキュベートした。ほぼ等量(700μl程度)のCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、15,000rpmで5分間、室温で遠心した。遠心後、白い界面が現れた。界面部分をとらないように水層を新しいチューブに移した。ほぼ等量(700μl)のPCIを加え、20秒間vortexしてよく混ぜて均一なエマルジョンにし、再び15,000rpmで5分間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移した。イソプロパノールを0.6容(450μl程度)加え、白いひも状のDNAがはっきり見えるようになるまでチューブをひっくり返して混ぜた。室温で2-10分間静置し、15,000rpmで10-15分間、室温で遠心してDNAを沈殿させた。10μlのTE bufferに溶解させ、10mg/mlのRNase solutionを1μl加え、37度で1時間程度インキュベートした。等量(100μl)のPCIを加え、20秒間vortexして均一なエマルジョンにし、15,000rpmで15秒間、室温で遠心した。上層を新しいチューブに移し、下層に再度100μlのTEを足してvortex、15,000rpmで15秒間遠心し、上層を先にとったものに加えた。この上層200μlに、3M酢酸ナトリウム溶液を20μl、100％エタノールを500μl加えて、よく混ぜた後、室温で2-10分間放置した。15,000rpmで10-15分間遠心し、DNAをペレットにし、上清を除き、70％エタノールを1ml加え、軽く混ぜてDNAを洗浄した。15,000rpmで5分間遠心して再度沈殿させ、上清を取り除き、真空デシケータで、ペレットを乾燥させた。100μlのTEに溶解させ、260nmの吸光度を測定して濃度を決定するとともに、電気泳動によって得られたDNAの分子量をチェックした。
【００４５】
PCRによる16s rDNA領域の増幅とDNA塩基配列決定
目的とする菌をNutrient agar培地（Oxoid社製）を用いて45℃で24時間培養し、培養した菌体からDNAを抽出し、16s rDNA領域をPCRにより増幅し、その後、配列決定を行った。具体的に、DNA抽出にはInstaGene Matrix（Bio Rad社製）を添付のプロトコールに従って使用した。PCRは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルシークエンスには、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムス社製）を添付のプロトコールに従って使用した。使用したプライマーは、「遺伝子解析法 16s rRNA遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定88-117pp、日本学会事務センター（２００１）」に開示された9F、339F、785F、1099F、536R、802R、1242R及び1510Rを使用した。シークエンスはABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System（アプライドバイオシステムス社製）を添付のプロトコールに従って使用した。配列決定はChromasPro 1.4（Technelysium Pty社製）を添付のプロトコールに従って使用した。
【００４６】
得られた16s rDNA領域の塩基配列を配列番号１に示した。配列番号１の塩基配列に基づいて相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。ソフトウェアとしてはアポロン2.0（テクノスルガ・ラボ社製）を使用し、データベースとしてはアポロンDB-BA3.0及び国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を使用した。
【００４７】
形態観察及び生理・生化学試験
光学顕微鏡による形態観察及びBARROW et al., "Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria" 3rd edition. 1993. Canibridge University Pressに記載された方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵（O/F）について試験を行った。生理・生化学試験にはAPI50CHB（BioMerieux社製）を使用した。
形態観察及び生理・生化学試験の結果を表７及び８に示した。
【００４８】
【表７】
【００４９】
【表８】
【００５０】
BLASTを用いたGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性検索の結果及びアポロンDB-BA3.0に対する相同性検索の結果をそれぞれ表９及び１０に示した。
【００５１】
【表９】
【００５２】
【表１０】
【００５３】
なお、表９及び１０においてSID6166-04とは、本実施例で供試した微生物（Ｍ13株）に付した記号である。表９及び１０に示した結果から、系統樹を作成した（図1）。供試菌は、Raoultella属あるいはEnterobacter属に近い細菌であると考えられた。さらに形態観察及び生理・生化学試験の結果も考慮して、ラオウルテラ属に属する新種微生物であることが判明した。
【００５４】
本実施例で単離・同定されたグリセロールからエタノールを生成する能力を有するラオウルテラ（Raoultella sp.）の新規菌株をTB-82と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に2008年10月15日に受託番号FERM P-21705として寄託した。
【受託番号】
【００５５】
FERM P-21705
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。
【請求項２】
以下の表１又は２に記載された菌学的性質を有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【表１】
【表２】
【請求項３】
配列番号１に記載された塩基配列を有する16s rDNA又は配列番号１に記載された塩基配列に対して99.3%以上の相同性を有する16s rDNAを有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項４】
受託番号FERM P-21705であることを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項５】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる工程と、
上記微生物を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記微生物を接触させた後、生成された水素を回収する工程を更に含むことを特徴する請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記廃水は、バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有する廃水であることを特徴とする請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる発酵槽を備える廃水処理装置。
【請求項９】
上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする請求項８記載の廃水処理装置。
【請求項１】
ラオウルテラ（Raoultella sp.）に属し、グリセロールからエタノールを生成する能力を有する微生物。
【請求項２】
以下の表１又は２に記載された菌学的性質を有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【表１】
【表２】
【請求項３】
配列番号１に記載された塩基配列を有する16s rDNA又は配列番号１に記載された塩基配列に対して99.3%以上の相同性を有する16s rDNAを有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項４】
受託番号FERM P-21705であることを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項５】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる工程と、
上記微生物を接触させた後、生成されたエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【請求項６】
上記微生物を接触させた後、生成された水素を回収する工程を更に含むことを特徴する請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
上記廃水は、バイオディーゼル燃料を生産した後の残査を含有する廃水であることを特徴とする請求項５記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
グリセロールを含む廃水に請求項１〜４いずれか１項記載の微生物を接触させる発酵槽を備える廃水処理装置。
【請求項９】
上記発酵槽において生成された水素を回収する水素回収装置を備えることを特徴とする請求項８記載の廃水処理装置。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２２６９５９（Ｐ２０１０−２２６９５９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７４８０６（Ｐ２００９−７４８０６）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【出願人】（０００２２０２６２）東京瓦斯株式会社 (1,166)
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【出願人】（０００２２０２６２）東京瓦斯株式会社 (1,166)
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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