新規癌関連遺伝子
新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む癌関連遺伝子、該ＤＮＡにコードされる組換え蛋白質、該蛋白質に結合する抗体、該抗体を含む抗癌剤、該蛋白質に結合する低分子化合物、スクリーニング系の提供。以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む癌関連遺伝子、該ＤＮＡにコードされる組換え蛋白質、該蛋白質に結合する抗体、該抗体を含む抗癌剤、該蛋白質に結合する低分子化合物、スクリーニング系、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡに関する。
背景の技術
ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、ヒトゲノムの塩基配列に関する情報が日々産出されている。ヒトゲノム計画の最終目的は単にゲノム全塩基配列を決定することではなく、その構造情報、即ち、ＤＮＡの塩基配列情報からヒトのさまざまな生命現象を読み解くことにあろう。ヒトゲノム配列中で蛋白質をコードしている領域はその極一部であり、現在は、ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルと呼ばれる情報科学の手法を用いて、そのコード領域の予測が行われている。しかしながら、それらの予測精度はまだ充分なものではなく、ヒトゲノムの塩基配列に関する情報が蓄積している現在であっても、コード領域の解明は途上であるし、ましては各コード領域がコードする蛋白質の機能の解明はこれからの課題である。今後、例えば、ある特定の疾患、例えば癌に関連した遺伝子を解析し、それを癌の検出や治療に利用することが望まれる。
例えば、従来より糖蛋白質のＮ型糖鎖が癌に関連していることが報告されている。糖蛋白質のＮ型糖鎖は、種々の生命現象、受精、発生、免疫、細胞内輸送、老化、癌などに関与しており、糖鎖異常によってさまざまな病態が引き起こされる。特に、癌細胞では糖鎖の高分岐化が見られ、癌細胞の転移能などの生物活性との関与が示されている。高分岐化糖鎖構造の形成はある特定な糖転移酵素の活性化により決定され、Ｎアセチルグルコサミン転移酵素は糖鎖構造の決定に重要な酵素として知られている。Ｎアセチルグルコサミン転移酵素Ｉ、ＩＩ（ＧｎＴ−Ｉ，−ＩＩ）は基本となるコア構造の決定に、ＧｎＴ−ＩＩＩ，−ＩＶ，−Ｖ，−ＶＩの各酵素は糖鎖のどの部分にＮアセチルグルコサミンを転移させるかに関わっており、高分岐化に大きく影響をもっている。また、シアル酸転移酵素やフコース転移酵素は糖鎖の末端構造の決定に重要な酵素である。
ＧｎＴ−ＩＩＩ，−ＩＶ，−Ｖ，−ＶＩは共通の基質を認識するにも関わらずｃＤＮＡの構造にホモロジーはほとんど認められない。ＧｎＴ−ＩＩＩはＮ型結合糖鎖のコアのマンノースにＮアセチルグルコサミンを転移し二分岐ＧｌｃＮＡｃを形成する。ＧｎＴ−ＩＶ，−ＶＩはＮグリカンのβ１−４鎖の生合成に関与する酵素であり、ＧｎＴ−ＶはＮグリカンのβ１−６鎖の生合成に関与している酵素である。これらＮ−アセチルグルコサミン転移酵素が癌化と関連している例としてＧｎＴ−Ｖが挙げられる。
ＧｎＴ−Ｖは癌の転移に関与することが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。Ｇｒａｎｏｖｓｋｙらは、ＧｎＴ−Ｖのノックアウトマウスを用いた実験で、癌の転移とともに癌の増殖にもＧｎＴ−Ｖが必須であることを示している。また、村田らはＧｎＴ−Ｖが大腸癌の転移と相関があることを報告している（非特許文献３参照）。
【非特許文献１】 Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３０、（１９９５）、３８３
【非特許文献２】 Ｇｒａｎｏｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、６、（２０００）、３０６
【非特許文献３】 村田ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６、（２０００）、１７７２
【発明の開示】
本発明は、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡを得て、癌に関連する新規な遺伝子すなわち、ＧｎＴ−Ｖに関連した新規な遺伝子を提供することを目的とする。さらに、本発明は該新規な遺伝子断片を用いた癌の検出方法、該新規な遺伝子のコードする蛋白質、該蛋白質に対する抗体、該抗体を含む抗癌剤、ならびに前記蛋白質に結合する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
今回、本発明者は新規な遺伝子を見出すべく、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、蛋白質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングすることに成功し、それらの塩基配列を決定して本発明を完成させた。
本発明はＧｎＴ−Ｖと４４％の相同性を示す蛋白質をコードする遺伝子であり、新規な糖転移酵素であると考えられる。癌細胞での高い発現が見られ、特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌細胞株で高い遺伝子発現が見られることより、これらの癌に関係した遺伝子であると推測される。ＧｎＴ−Ｖは大腸癌の転移に関与していることが報告され、大腸癌の細胞株でも発現が見られるが、本発明の遺伝子では大腸癌細胞株では発現が見られない。しかしながら、大腸癌のリンパ節に転移から得られた細胞株であるＳＷ６２０細胞では発現が見られることにより、癌の転移にも関与していることが示唆される。
したがって、本発明は特に肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌の癌の診断、治療、予防、あるいは癌の転移に関わる診断に有用である。
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列において、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう。又、本発明はこれらＤＮＡを含む遺伝子にも係る。
更に、本発明の第三の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、及び、本発明遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質に係る。
更に、本発明の第四の態様として、上記蛋白質に結合する各種抗体に係る。
更に、本発明の第五の態様として、抗体を含む各種抗癌剤に係る。
更に、本発明の第六の態様として、上記蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質又はその部分ペプチドに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質又はその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む前記方法、に係る。
更に、本発明の第七の態様として、本発明ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドに係る。
更に、本発明の第八の態様として、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法、に係る。
１．本発明ＤＮＡの取得
本発明ＤＮＡは、市販されている（クロンテック社）ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。
即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．４，５３−５９（１９９７））に従って調製したヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローンをランダムに単離する。
次に、ハイブリダイゼーションにより、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除き、その後インビトロでの転写翻訳を行い５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンについてその両末端の塩基配列を決定する。
更に、こうして得られた末端塩基配列をクエリーとして既知遺伝子のデータベースにて相同性検索を行い、その結果、新規であることが判明したクローンについて全塩基配列を決定する。
また、上記のスクリーニング法に加えて、ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列をヒトのゲノム配列に対応させ、それらが挟む領域に未知の長鎖遺伝子が確認された場合には、そのｃＤＮＡの全長解析をおこなう。
このようにして既知の遺伝子に依存した従来のクローニング方法では得られなかった未知の遺伝子も、システマチックにクローニングを行なうことができる。
又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、本発明ＤＮＡを含むヒト由来遺伝子の全領域を調製することも可能である。
このようにして本発明ＤＮＡを有するクローン（ＦＪ０４４７０）を得ることが出来る。該クローンに含まれる遺伝子にコードされる本発明蛋白質の機能等については、本明細書中に示されている。
本発明ＤＮＡのクローニングの別の手段としては、本発明ポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを作成し、適当なライブラリーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ヒトの脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡ等のいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
２．本発明のポリペプチド
配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列を意味する。本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値あるいは、ＦＡＳＴＡにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
従って、本発明の配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、該アミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性（機能）が性質的に同質であることを示す。活性の高低は、限定されないが好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。本発明蛋白質が持つ生物学的活性とは糖をポリペプチドに転移する活性が挙げられる。本発明タンパク質が持つ生物学的活性は、公知の文献に記載の糖転移酵素の活性測定を用いればよい（例えば、細胞工学別冊 グライコバイオロジー実験プロトコール、秀潤社、谷口直之ら監修、１９９６年）。
又、本発明ポリペプチドには、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１又は複数の（好ましくは、１〜２０個以内、より好ましくは１〜１０個以内、さらに好ましくは１〜５個以内）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドも含まれる。
３．本発明ＤＮＡ
上記の配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同質の生物学的活性を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
更に、本発明ＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡを包含する。
かかる条件下で、配列番号１に示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡを単離を期待しうる。ただし、上記のＳＳＣ，ＳＤＳおよびに温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
クローン化された本発明ＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
４．本発明ポリヌクレオチド
本発明ＤＮＡ（遺伝子）は、以下の実施例で示されるように、癌細胞で高発現していることから、本発明遺伝子を検出することにより、かかる癌の検出に利用することが可能である。
従って、配列番号１に示された塩基配列を含む本発明ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このような癌の検査にプローブとして使用することが出来る。このようなポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上、特に好ましくは１０００塩基以上である。また、本発明の遺伝子を増幅するためにプライマーとして利用することが可能である。
例えば、これらのヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現異常を検査することができる。また、これらのヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより本発明の蛋白質をコードする遺伝子、ＤＮＡ、ｍＲＮＡを増幅し、ＲＦＬＰ解析、ＳＳＣＰ、シークエンシング等の方法により、遺伝子の発現異常を検査・診断することができる。
プライマーとして用いる場合には、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３５塩基の鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のＤＮＡの少なくとも一部もしくは全部の配列を含む少なくとも１５塩基の鎖長のヌクレオチドが用いられる。このようなヌクレオチドは好ましくは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーションの条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号１）とハイブリダイズし、他の蛋白質をコードするＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離、検出を期待しうる。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
具体的には、本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドと本発明のＤＮＡを含むと予想される被験試料とを接触せしめ、前記ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出することにより、被験試料が由来する被検体が癌に罹患しているかどうかを検出することができる。ハイブリダイズ活性は、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るＤＮＡまたはその断片が被験試料中に存在する場合に検出される。
この際、ポリヌクレオチドとして、例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列の相同性が高い蛋白質との間で、部分的に相同性が低い部分をコードするポリヌクレオチドであって少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドを用いることにより、本発明の遺伝子を特異的に検出することができる。例えば、ＧｎＴ−Ｖとアミノ酸配列を比較し、相同性の低い部分をコードするポリヌクレオチドを用いればよい。具体的には、例えば配列番号３または４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは少なくとも１５塩基から成るその断片が挙げられる。
本発明ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子をプローブとして使用することにより、本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
５．本発明蛋白質の取得
本発明蛋白質は、当業者に公知の任意の方法によって、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換させた形質転換体を培養し、本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することによって、容易に調製することが出来る。
上記発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、スキゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
このようにして得られた、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物から本発明ポリペプチド又は蛋白質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
６．本発明抗体
本発明の抗体は、本発明蛋白質と結合する限り特に制限はなく、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの等を含む。尚、本発明抗体は、本発明蛋白質と特異的に結合することが好ましい。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明蛋白質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
本発明蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的の本発明蛋白質を公知の方法で精製する。
次に、この本発明蛋白質を感作抗原として用いる。あるいは、本発明蛋白質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドは本発明蛋白質のアミノ酸配列より当業者に公知の一般的な方法による化学合成により得ることができる。
ここで、本発明の蛋白質の部分ポリペプチドとしては、例えば、本発明蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部分ポリペプチドとしては、例えば、後述するような各機能ドメインを含むものが特に好ましい。又、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明抗体は、本発明蛋白質の検出、精製等に用いることが出来、又、以下の実施例で示されるように本発明遺伝子は癌細胞で高発現しているので、本発明抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、細胞増殖を抑制し得ることから、本発明抗体の認識する本発明蛋白質分子上のエピトープは特定のものに限定されず、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明抗体を作製するための抗原は、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
また、本発明蛋白質に特異的な抗体を得るために、例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列の相同性が高い蛋白質との間で、部分的に相同性が低い部分であって、少なくとも６アミノ酸、好ましくは８アミノ酸、さらに好ましくは１０アミノ酸からなるペプチドを抗体を作製するための抗原として用いればよい。例えば、ＧｎＴ−Ｖとアミノ酸配列を比較し、相同性の低い部分を用いればよい。例えば、配列番号３または４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたは少なくとも６アミノ酸から成るその断片を用いることができる。
本発明の抗体は、上記抗体の作製するための抗原を認識し、結合する抗体であり、該抗体は上記抗原を動物に投与して得ることができる。また、本発明の蛋白質を動物に投与して得られたポリクローナル抗体から、上記抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより得ることもできるし、多数のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから上記抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることにより得ることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明蛋白質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、本発明蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる本発明蛋白質を投与して本発明抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から本発明蛋白質に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、本発明抗体を産生するハイブリドーマから、本発明抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする本発明抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される本発明抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギのカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３号公報、ＷＯ ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず本発明蛋白質に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ． ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ． ＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６）、等）。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した本発明抗体を使用することもできる。抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞障害性物質などを結合することも可能である。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は本発明蛋白質分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体や本発明蛋白質と他の蛋白質を認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が本発明蛋白質を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、本発明蛋白質を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、本発明蛋白質をコーティングしたプレートに、本発明抗体を含む試料、例えば、本発明抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明抗体は細胞障害活性を有していてもよい。本発明における細胞障害活性とは、例えば補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
本発明抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、例えば、細胞障害活性の測定は以下の方法により行うことが可能である。
・エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
・補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
・標的細胞の調製
本発明蛋白質発現細胞（前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、大腸癌細胞など）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
・ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
・ＣＤＣ活性の測定
９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
７．本発明抗癌剤
本発明の抗癌剤（癌治療剤）の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。また、本発明の治療剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。本発明の治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合には、溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。本発明の治療剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
８．本発明蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法
本発明の蛋白質は、これに結合する物質のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、これに結合する化合物を含むと予想される被験試料とを接触せしめ、本発明の蛋白質と被験試料との結合活性を検出し、本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また上記の部分ペプチドであってもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。被験試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、また、膜画分として被験試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質（リガンド等）をスクリーニングする方法としては当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニング方法としては、例えば、免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ．，（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ，６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））、アフィニティクロマトグラフィーを利用した方法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−４６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−１７）などが当業者に公知である。
本発明のスクリーニング方法により単離され得る化合物は、本発明の蛋白質とリガンドとの結合を阻害するための物質となり得る為、抗癌剤への応用が考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法により単離された化合物と薬理学上許容される担体とを混ぜ合わせて抗癌剤を製造することも可能である。
さらには、本発明の蛋白質は糖鎖転移酵素であることが予測されるので、特に糖鎖を認識するレクチンを利用した基質となる蛋白質のスクリーニングが考えられる。「基質となる蛋白質」とは本発明遺伝子がコードする蛋白質の糖転移酵素活性により、糖鎖を付加される蛋白質のことを意味する。
例えば、βマンノースの６位側が分岐したＮ型糖鎖を認識するＰＨＡ−Ｌ４（インゲンマメレクチン）などのレクチンを用いて、本発明の蛋白質が高発現している細胞と低発現の細胞を比較して発現量の差がある蛋白質を解析することから、または本発明蛋白質による糖転移の有無による分子量変化を解析することにより基質となる蛋白質を同定することができる。このようなスクリーニングを行うための方法としては、例えば、乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ ２２）、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１）、膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １４６９）などの本発明遺伝子を高発現している培養細胞株と乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ ２６）、前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）、膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １６８７）などの本発明遺伝子の発現が低い培養細胞株とで発現している糖蛋白質を種々のレクチンを用いたウエスタンブロティングなどを用いて解析することが挙げられる。また、本発明の遺伝子を遺伝子導入した細胞ともとの細胞を比較したり、本発明遺伝子を発現している細胞にアンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡを用いて本発明蛋白質が発現するのを阻害することにより、基質となる蛋白質をスクリーニングする方法も挙げられる。
また、本発明蛋白質の糖転移酵素の活性により付加される糖鎖を同定し、癌の診断や治療に利用することもできる。例えば、本発明遺伝子が発現している前述の細胞から蛋白質を抽出してＮ型結合糖鎖を特異的に切断する酵素、例えばＧｌｙｃｏ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｆなどを用いて糖鎖を切り出すか、あるいは、化学反応、例えばヒドラジン分解、Ｎアセチル化処理後に糖鎖をＨＰＬＣなどにより分析することで癌特異的な糖鎖構造をスクリーニングすることもできる。
これらのスクリーニングにより得られた癌特異的な基質となる蛋白質や糖鎖構造はそれを改変することにより抗癌剤となりうる。
また、これら基質となる蛋白質や糖鎖構造に対する抗体は癌に特異的な反応を示すことが期待され、抗体を含む抗癌剤として有用である。
９．その他
本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）としては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と好ましくは約９０以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）はＥｌｂａｓｈｉｒらにより報告された細胞内の遺伝子の発現を抑制する遺伝子に相補的な２１塩基からなる二本鎖のＲＮＡである（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ Ｗ，Ｙａｌｃｉｎ Ａ，Ｗｅｂｅｒ Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ（２００１）．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８．）。本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するｓｉＲＮＡとしては、当該ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのｓｉＲＮＡであってもよい。ｓｉＲＮＡは３’端にオーバーハングしたＵＵまたはＴＴの２塩基を持ち、本発明の遺伝子に相補的な１９塩基からなるセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡをハイブリダイズした二本鎖のＲＮＡであり、例えばＡｍｂｉｏｎ社のＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃１６２０）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−Ｃｙ３（＃１６３２）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＦＡＭ（＃１６３４）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃１６３０）などのキットのマニュアルに従って作製することができる。あるいは、化学合成によって作製することも挙げられる。ｓｉＲＮＡの鎖長は２１塩基以上が特に好ましいが、２５塩基以上でもよく、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであればいずれの長さのものでもよい。また、ｓｉＲＮＡをＣｙ３、ＦＡＭなどでラベルしたものでも同じ程度の抑制作用があることが報告されており、これらで修飾されたものでもよい。
また、ｓｉＲＮＡを安定に発現するために発現ベクターにより発現させることも挙げられる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲら（２００２）．．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３、Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ＰＪら（２００２）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８、Ｐａｕｌ，ＣＰら．（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８、Ｓｕｉ，Ｇら，（２００２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（６）：５５１５−５５２０、Ｙｕ，Ｊ−Ｙら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（９）：６０４７−６０５２、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ，ａｎｄ Ｔａｉｒａ，Ｋ（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００、Ｌｅｅ，ＮＳら（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５）。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが認識するプロモーターとしてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｈ１ ＲＮＡやＵ６のプロモーターを利用して、転写終結シグナル配列との間に発明遺伝子の２０塩基以上の長さの配列をインバーテッドリピートが形成されるように挿入して発現することが挙がられる。挿入する配列は当該ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれの配列であってもよい。
本発明遺伝子に発現異常がある癌患者に対しては、これらの方法で遺伝子発現を抑制することで該患者の本発明の蛋白質の活性を阻害することができる。アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡを直接該患者体内に導入する方法のほか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療による導入方法も挙げられる。又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
又、本発明のＤＮＡ若しくは遺伝子又はそれらの一部の塩基配列に基づき作成した合成ＤＮＡプライマーを使用し、ヒトの血液又は組織から抽出した染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を決定することにより、本発明のＤＮＡ又は遺伝子中にある個体によって異なる一塩基の変異、即ち、ｃＳＮＰｓを見出すことが出来る。これにより、個体の体質等が予測され、各自に適した医薬の開発等が可能となる。
又、クロスハイブリダイゼーションにより、マウス等のモデル生物における本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対するオルソログ（ホモログ、カウンターパート）遺伝子を単離し、例えば、これら遺伝子をノックアウトすることによってヒトの疾患モデル動物を作成し、ヒトの病因となる遺伝子を探索・同定することも可能である。
尚、本明細書および表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３３８５４９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写により発現させたＦＪ０４４７０の電気泳動を示す図である。
図２は、ＧｎＴ−ＶとＦＪ０４４７０のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
図３は、ＦＪ０４４７０のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載されている方法に従った。
〔実施例１〕 本発明のＤＮＡの取得
（１） ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（インビトロジェン社）をプライマーとして、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来ｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（インビトロジェン社）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋ プラスミドとライゲーションした。大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）にエレクトロポレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。
（２）スクリーニング（その１）
次いで、こうして構築したｃＤＮＡライブラリーからランダムにクローンをピックアップし、メンブランにスポッティングした。次に、これまでに本発明者等によって既に全長の解析が行われている約１，３００個のクローンの塩基配列に基づき作成したオリゴＤＮＡ（各２１塩基）の混合物の各３’末端をターミナルトランスフェラーゼでＤＩＧラベルし、これらをプルーブとして使用してドットハイブリダイゼーション（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））により、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除いた。
次に、インビトロでの転写翻訳（プロメガ社ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を行い、５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンを選択した。
次に、選択したクローンの末端塩基配列を決定し、得られた配列をクエリーとして相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ ２．２．１（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて、ｎｒ（Ａｌｌ ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｂｕｔ ｎｏ ＥＳＴ，ＳＴＳ，ＧＳＳ，ｏｒ ｐｈａｓｅ ０，１ ｏｒ ２ ＨＴＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））データベースに対して相同検索を行った。配列決定には、ＰＥアプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
このようにして新規ＤＮＡ又は遺伝子のスクリーニングを行なった。その結果、ヒト胎児脳由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから作成されたｃＤＮＡよりクローンＦＪ０４４７０を見出した。
（３）本発明遺伝子にコードされる蛋白質の発現
インビトロでの転写翻訳系（プロメガ社，ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｉｏｐｔｉｏｎ ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を用いて、ｃＤＮＡクローンＦＪ０４４７０からの遺伝子産物を発現させた。
３５Ｓ標識メチオニンを取り込ませた産物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ゲルを乾燥させ、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）のシステムでオートラジオグラフィーをおこない、クローンＦＪ０４４７０の遺伝子産物を検出した。ＢＩＯ ＲＡＤのＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｃａｔ．１６１−０３２４）のサイズマーカーで測定したｆｊ０４４７０ ｐｒｏｄｕｃｔのサイズは９０ｋＤａであった。
ＦＪ０４４７０がコードするタンパク質は、最初のメチオニンから数えると７９３アミノ酸残基からなり、分子量は、約８９．４ｋＤａと予想され、実験結果によく一致するものであった。
〔実施例２〕 本発明ＤＮＡの相同性
（４）本発明ＤＮＡの相同性検索
次に、ＢＬＡＳＴＮ ２．１．３，ＢＬＡＳＴＰ ２．１．３（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いてＮＣＢＩ ｎｔ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ），ｎｒ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）、特許配列データーベースｇｅｎｅｓｅｑｎｔ，ｇｅｎｅｓｅｑａａに対してホモロジー検索を行った。
その結果、ＦＪ０４４７０遺伝子が、表１に示した遺伝子と相同性を示すことが明らかになった。ＦＪ０４４７０遺伝子は７９３個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする４４９１ｂｐからなる遺伝子であり、核酸配列の５７５番目から２９５０番目の配列がアミノ酸をコードしている。
高い相同性が見出されたヒト遺伝子ｇｂ：Ｔ５０６０６，ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＫＦＺｐ７６１Ｊ１０７．１と比較するとＮ末端が２５４アミノ酸長く、ＦＪ０４４７０遺伝子は同一遺伝子の全長の遺伝子をコードしていると考えられる。ｇｂ：Ｔ５０６０６はコンピューターで予測されたアミノ酸配列であり、Ｎ末端に存在する膜貫通領域と見られる疎水性領域、４個の糖鎖付加部位をもたない部分配列であり、機能的分子であるとはいえない。
データベースで次にホモロジーのあったｇｂ：ＡＡＣ５２９２５はＣＨＯ細胞で発現しているａｌｐｈａ−１，３（６）−ｍａｎｎｏｓｙｌｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅという糖鎖の転移酵素であり、ＦＪ０４４７０遺伝子はこれと４５．５％の領域にわたって４４％の相同性を有することから糖転移酵素の一つであると考えられる。その次に相同性を有するｇｂ：ＮＰ＿００２４０１．１はｇｂ：ＡＡＣ５２９２５のヒトオルソログであるので、ｇｂ：ＮＰ＿００２４０１．１とＦＪ０４４７０蛋白質のアミノ酸配列を詳細に比較した。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）のＧＡＰを用いた。２１個あるシステイン残基のうち、ＦＪ０４４７０蛋白質の１５７番のシステイン残基以後に存在する１９個のシステイン残基についてはｇｂ：ＡＡＣ５２９２５に２０個あるシステイン残基のうち１個を除いてほぼ配置が似ており、ジスルフィド結合による蛋白質のフォールディングの結果に得られる構造はかなり類似したものであることが予想される。
表１には、該相同遺伝子に関する情報が挙げられている。尚、表１中の各項目の意味は以下の通りである。
「相同領域 クローン」クローンの相同領域の起点及び終点
「相同領域 相同遺伝子」相同遺伝子の相同領域の起点及び終点
「Ｓｃｏｒｅ」この値が高ければ高いほど信頼度が高い
「Ｅ−ｖａｌｕｅ」この値が０に近ければ近いほど信頼度が高い
「相同性」相同領域のアミノ酸残基の一致の割合
「相同範囲率」相同遺伝子中の相同領域の割合
ペプチド配列についてはＨＭＭＥＲ ２．１．１（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：７５５−７６３，（１９９８））によりＰｆａｍ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）に対してモチーフ検索を行ったが、ヒットするモチーフは存在しなかった。
疎水領域、細胞内の局在を推測するプログラムであるＰＳＯＲＴ ＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）による検索の結果、２５番目のアミノ酸から４１番目のアミノ酸が膜貫通領域であり、Ｎ末端が細胞質内に存在する他の糖転移酵素と同じくＩＩ型の膜蛋白質であると予測された。また、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）のＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥを用いて解析したところ、アミノ酸残基９３番、１２７番、２１５番、２３６番、４４７番、６００番、６６６番、６７５番の８箇所にＮ型糖鎖付加部位が存在していることからＦＪ０４４７０蛋白質は糖蛋白質であると考えられる。
（２） ゲノム配列との比較
ＢＬＡＳＴＮ ２．１．３によるホモロジー検索でヒットした ｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７，ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−８７Ｇ２４，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｌｅｎｇｔｈ＝１９３５３７をＦＪ０４４７０遺伝子と比較した。その結果、ゲノム配列のｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の１４７７８８番目から６５８６７番目の位置にＦＪ０４４７０遺伝子は存在しており、ＦＪ０４４７０遺伝子は１９個のエクソンに分かれ、２番目のエクソンから１８番目のエクソンにコーディング領域は分かれている。ＦＪ０４４７０遺伝子とゲノム配列を比較した結果を表とした（表２）。
さらに、Ｗｉｓｅ２−１−２０ｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２）のｇｅｎｅｗｉｓｅプログラムを使用してＦＪ０４４７０蛋白質とｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の核酸配列を比較して、エクソン−イントロンのジャンクション部位を特定した。
ｇｂ：ＸＭ＿０８５５３３，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＬＪ２５１３２（ＦＬＪ２５１３２），ｍＲＮＡはコンピューターで予測された遺伝子として報告されているが、ＦＪ０４４７０遺伝子の３６２番から１４９３番の核酸配列と９９％（１１３２／１１３３）一致している。これは４番目のエクソンまで（コーディングエクソンの１番目から３番目）の配列しか含まない。４番目と５番目のエクソンの間には２０２５５塩基からなる大きなイントロンが存在していることがｇｅｎｅｗｉｓｅによる解析から判明し、この長いイントロンをＮＣＢＩのコンピュータープログラムでは予測できなかったものと考えられる。つまり、ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡのエクソン構造は大きなイントロンを含んでいるためにコンピューターでは予測できない遺伝子であるということを示している。
表２ ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡ配列とゲノム配列の比較
ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡ配列とゲノム配列をｇｅｎｅｗｉｓｅによりエクソン、イントロンの境界を分析し、得られたエクソンのサイズ、イントロンのサイズを表にした。
番号は左のｃＤＮＡの番号に対応するゲノム配列ｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の番号を並べて示した。
（３） 公的なデーターベースにおける遺伝子発現情報
ＦＪ０４４７０遺伝子は、Ｕｎｉｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅに対して行ったホモロジー検索からＨｓ．１４４５３１のＵｎｉｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒに属する。Ｈｓ．１４４５３１に属するＥＳＴクローンは３３個あり、それらのＥＳＴの由来は脳（ｂｒａｉｎ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、膵臓（外分泌）（ｐａｎｃｒｅａｓ，ｅｘｏｃｒｉｎｅ）、生殖細胞（プールされたもの）（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ，ｐｏｏｌｅｄ）、乳房（ｂｒｅａｓｔ）、子宮頸（ｃｅｒｖｉｘ）、肺（ｌｕｎｇ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、眼（ｅｙｅ）、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）、後根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ）、卵巣（ｏｖａｒｙ）であるが、脳由来のｃＤＮＡが多い傾向が見られる（１５／３３）。公的なデーターベースから得られる発現情報では癌に特異的な発現をしているかは不明である。
〔実施例３〕 本発明のＤＮＡの転写解析
（１） リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社）により本発明遺伝子の転写物の量を各種組織のｃＤＮＡを用いて解析した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の解析には、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社＃４３１０８８４Ｅ）を使用した。ＰＣＲ反応の組成は、１．２５μｌ ２０Ｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｉｘ（ＧＡＰＤＨ），ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社＃９９２０）６．２５μｌ，ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０４４３７）１２．５μｌを混合したＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘに対してクロンテック社のＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡ ５μｌを加えて２５μｌとして、ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ＡＢＩ社＃Ｎ８０１−０５６０）上でＡＢＩ社 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて５０度２分、９５度１０分、９５度１５秒−６０度１分を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡはクロンテック社のＨｕｍａｎ ＭＴＣＴＭ Ｐａｎｅｌ Ｉ（Ｋ１４２０−１）、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣＴＭ Ｐａｎｅｌ ＩＩ（Ｋ１４２１−１）、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ ＭＴＣＴＭＰａｎｅｌ Ｉ（Ｋ１４２２−１）を使用した。培養した癌細胞からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収して、これをａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ Ｄｎａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを分解した。方法はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ推奨のマニュアルに従った。ＤＮａｓｅ Ｉで処理したｔｏｔａｌ ＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写してｃＤＮＡとした。
本発明遺伝子の発現量については、ＡＢＩ社のＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ １．５を使用してＲＴ−ＰＣＲに最適なプライマーの配列を検索した。ＦＪ０４４７０遺伝子の配列をゲノム配列と比較したところ、ＡＣ０１６１６８．１８に配列がマッチした。イントロン、エクソンの構造を解析した結果、ＦＪ０４４７０の塩基番号で２１５８番付近に約２２６０塩基からなるイントロンが存在することが予想されたので、この領域を挟む形でプライマーの位置を決定した。プライマー４４７０−２０４３（５’−ＡＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣ−３’）、プライマー４４７０−２２３０（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＣＧ−３’）はｃＤＮＡでは１８８塩基を増幅するが、ゲノムは約２４５０塩基を増幅することになる。０．５μｌの１０μＭのプライマー４４７０−２０４３、０．５μｌの１０μＭのプライマー４４７０−２２３０、６．５μｌのＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ、１２．５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０９１５５）を混合し２０μｌとして、これに対してクロンテック社のＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡ １μｌ及びＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ（処理水）４μｌを加えて２５μｌとした。ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏ Ａｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ＡＢＩ社＃Ｎ８０１−０５６０）上でＡＢＩ社ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて５０度２分、９５度１０分、９５度２０秒−６０度１分を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を内部コントロールとしておいたＧＡＰＤＨアンプリコンをクローニングしたプラスミドを用いて標準曲線を引き、それをもとにして反応液中に存在するコピー数を算出した。本発明遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で割って得られた相対値で、各組織での発現量を比較した結果を以下の表３に示す。
表３において、左側は組織の名前を示し、右側の数値は各々の組織におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を使ってノーマライズしたＦＪ０４４７０遺伝子の発現量を示している。肝臓での値を１として他の組織での発現量を相対値として示した。
この表３から判るように、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、において高値を示した。正常組織では脳、精巣では高い値を示したが、他の組織での発現量はあまり高くはない。
表３ リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析（１）
ＦＪ０４４７０の発現量を比較するために、内部コントロールとして測定したＧＡＰＤＨの発現量で割った値の相対値で比較した。肝臓での相対的な発現量を１として種々の組織での発現量を比較した。
さらに、各種癌細胞株での発現量を比較するために３１種類の癌細胞と４種類の正常細胞のｃＤＮＡを用いてＦＪ０４４７０遺伝子の発現解析を行った。
その結果、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌において高い発現が見られた。以上のことから本発明の遺伝子は肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌で発現が亢進している遺伝子であり、この遺伝子がコードする蛋白質もこれらも組織において高い発現があると考えられる。
また、大腸癌細胞株の項目のなかで、唯一発現が高く見られたＳＷ６２０細胞であるが、この細胞は大腸癌がリンパ節に転移した部位から得られた細胞であるので、本発明の遺伝子は癌の転移とも関わりが示唆される。
表４ リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析（２）
ＦＪ０４４７０の発現量を比較するために、内部コントロールとして測定したＧＡＰＤＨの発現量で割った値の相対値で比較した。乳腺上皮細胞での相対的な発現量を１として種々の癌細胞での発現量を比較した。
〔実施例４〕 ポリクローナル抗体の作製
相同性が一番高いＧｎＴ−Ｖの配列と比較して異なる領域で抗原性の高い領域を２か所選んでポリクローナル抗体を作成した。
図２にＧｎＴ−ＶとＦＪ０４４７０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図中に示した数字はＦＪ０４４７０のアミノ酸番号を示し、アミノ酸は一文字表記した。三段めにＧｎＴ−Ｖとのコンセンサス配列を示す。ペプチド抗体の作製に使用した配列は図中の線で示した部分（１１アミノ酸部分と１５アミノ酸部分）である。その他の下線はＮ型糖鎖の付加が予想される部位を示す。
選んだペプチドＡＧ，ＲＡの配列はＡＧ：ＣＡＧＳＮＴＫＹＲＲＬ（配列番号３），ＲＡ：ＣＲＡＰＤＰＡＬＰＥＡＨＡＰＱ（配列番号４）である。プロメガ（株）にペプチド合成、ウサギポリクローナル抗体の作製を委託した。ペプチドは１１ｍｅｒ（ＡＧ），１５ｍｅｒ（ＲＡ）を８０％以上の精製で合成後、ＫＬＨをコンジュゲートして各２羽のウサギに免疫した。日本白色種雌の２．５〜３．０ｋｇのウサギを使用し、アジュバンドとして初回免疫にはＦＣＡ、追加免疫にはＩＦＣＡを用いて０．５ｍｇを５回免疫した。
ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧをクローニングした発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子導入し、４８時間後にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶解した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）４８ｍｌ，２．９２８ｇ ｇｌｙｃｉｎｅ，２００ｍｌ ＭｔＯＨ／Ｌ）に浸して、ＰＶＤＦ膜Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（日本ミリポア ＩＰＶＨ３０４ Ｆ０）に、ＢｉｏＲａｄ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤを用いて ２０Ｖで６０分間ブロッティングした。蛋白のトランスファーされたメンブレンを２％スキムミルク（雪印）／Ｔ−ＴＢＳで４℃一晩ブロッキングし、１０００倍に希釈したウサギ抗ペプチド抗血清と室温で一時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分、３回振倒しながら洗浄し、次に２次抗体を反応させた。ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ，ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｄｏｎｋｙ）（アマーシャム）を２％ｓｋｉｍｍｉｌｋ（雪印）／Ｔ−ＴＢＳで５０００倍希釈して室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分、４回振倒しながら洗浄し、アマーシャムのＥＣＬ検出キットを使用してペプチド抗体に反応するバンドを検出した。結果、ＲＡ２のウサギにおいて抗ＦＬＡＧ抗体で検出されるバンドと同じサイズの約９０ＫＤａのＦＪ０４４７０のバンドが検出できた。ブロードなバンドとして検出されたことから糖鎖修飾を受けていると考えられる。
図３にウエスタンブロッティングの結果を示す。図３はＣＯＳ７細胞に一過性に発現させたＣ末端にＦＬＡＧタグのついたＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧとＣＯＳ７細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したものをウサギ抗ペプチド抗血清で検出したものである。ＦＬＡＧと記載されたものは抗ＦＬＡＧ抗体で検出したコントロールである。矢印に示したバンドの一がＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧ蛋白のバンドの位置である。ＲＡ２ ０３０２２５のサンプルで特異的なバンドが検出できていることが明らかに見られる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
以上の知見から、本発明遺伝子は癌に関連して遺伝子発現が上昇している新規遺伝子であり、癌の診断に使用することが可能である。特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌などにおいて高発現していることからこれらの癌の診断に有用であると考えられる。方法としてはＤＮＡ診断、抗体を使った免疫組織染色による方法が挙げられる。
さらに、転移した癌の診断にも有用と考えられる。
また、この遺伝子がコードする蛋白質の糖転移酵素としての機能を阻害すること等により癌を抑制できる可能性がある。機能を阻害する方法としては抗体を使った機能阻害、あるいは低分子を使った機能阻害が考えられる。特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌などの癌の治療薬又は予防薬として有用であると考えられる。
さらには、この遺伝子は糖転移酵素として糖鎖の基質となる蛋白質のスクリーニング、基質蛋白質に転移する糖鎖をスクリーニングするための手段として利用することもできる。例えば、癌に関与して本発明蛋白質により糖付加をうける蛋白質や糖鎖は癌の治療薬又は予防薬の標的分子として有用であり、それらに対する抗体や糖の類似体など用いることで癌の治療薬または予防薬の開発がつながる可能性があるため、本発明遺伝子はこれらのスクリーニングに使用することに対しても有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む癌関連遺伝子、該ＤＮＡにコードされる組換え蛋白質、該蛋白質に結合する抗体、該抗体を含む抗癌剤、該蛋白質に結合する低分子化合物、スクリーニング系、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡに関する。
背景の技術
ヒトゲノム計画における大規模シークエンシングによって、ヒトゲノムの塩基配列に関する情報が日々産出されている。ヒトゲノム計画の最終目的は単にゲノム全塩基配列を決定することではなく、その構造情報、即ち、ＤＮＡの塩基配列情報からヒトのさまざまな生命現象を読み解くことにあろう。ヒトゲノム配列中で蛋白質をコードしている領域はその極一部であり、現在は、ニューラルネットワークや隠れマルコフモデルと呼ばれる情報科学の手法を用いて、そのコード領域の予測が行われている。しかしながら、それらの予測精度はまだ充分なものではなく、ヒトゲノムの塩基配列に関する情報が蓄積している現在であっても、コード領域の解明は途上であるし、ましては各コード領域がコードする蛋白質の機能の解明はこれからの課題である。今後、例えば、ある特定の疾患、例えば癌に関連した遺伝子を解析し、それを癌の検出や治療に利用することが望まれる。
例えば、従来より糖蛋白質のＮ型糖鎖が癌に関連していることが報告されている。糖蛋白質のＮ型糖鎖は、種々の生命現象、受精、発生、免疫、細胞内輸送、老化、癌などに関与しており、糖鎖異常によってさまざまな病態が引き起こされる。特に、癌細胞では糖鎖の高分岐化が見られ、癌細胞の転移能などの生物活性との関与が示されている。高分岐化糖鎖構造の形成はある特定な糖転移酵素の活性化により決定され、Ｎアセチルグルコサミン転移酵素は糖鎖構造の決定に重要な酵素として知られている。Ｎアセチルグルコサミン転移酵素Ｉ、ＩＩ（ＧｎＴ−Ｉ，−ＩＩ）は基本となるコア構造の決定に、ＧｎＴ−ＩＩＩ，−ＩＶ，−Ｖ，−ＶＩの各酵素は糖鎖のどの部分にＮアセチルグルコサミンを転移させるかに関わっており、高分岐化に大きく影響をもっている。また、シアル酸転移酵素やフコース転移酵素は糖鎖の末端構造の決定に重要な酵素である。
ＧｎＴ−ＩＩＩ，−ＩＶ，−Ｖ，−ＶＩは共通の基質を認識するにも関わらずｃＤＮＡの構造にホモロジーはほとんど認められない。ＧｎＴ−ＩＩＩはＮ型結合糖鎖のコアのマンノースにＮアセチルグルコサミンを転移し二分岐ＧｌｃＮＡｃを形成する。ＧｎＴ−ＩＶ，−ＶＩはＮグリカンのβ１−４鎖の生合成に関与する酵素であり、ＧｎＴ−ＶはＮグリカンのβ１−６鎖の生合成に関与している酵素である。これらＮ−アセチルグルコサミン転移酵素が癌化と関連している例としてＧｎＴ−Ｖが挙げられる。
ＧｎＴ−Ｖは癌の転移に関与することが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。Ｇｒａｎｏｖｓｋｙらは、ＧｎＴ−Ｖのノックアウトマウスを用いた実験で、癌の転移とともに癌の増殖にもＧｎＴ−Ｖが必須であることを示している。また、村田らはＧｎＴ−Ｖが大腸癌の転移と相関があることを報告している（非特許文献３参照）。
【非特許文献１】 Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ，Ｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３０、（１９９５）、３８３
【非特許文献２】 Ｇｒａｎｏｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、６、（２０００）、３０６
【非特許文献３】 村田ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６、（２０００）、１７７２
【発明の開示】
本発明は、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーから全長ｃＤＮＡを得て、癌に関連する新規な遺伝子すなわち、ＧｎＴ−Ｖに関連した新規な遺伝子を提供することを目的とする。さらに、本発明は該新規な遺伝子断片を用いた癌の検出方法、該新規な遺伝子のコードする蛋白質、該蛋白質に対する抗体、該抗体を含む抗癌剤、ならびに前記蛋白質に結合する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
今回、本発明者は新規な遺伝子を見出すべく、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、蛋白質をコードしている領域を含む新規なＤＮＡを直接クローニングすることに成功し、それらの塩基配列を決定して本発明を完成させた。
本発明はＧｎＴ−Ｖと４４％の相同性を示す蛋白質をコードする遺伝子であり、新規な糖転移酵素であると考えられる。癌細胞での高い発現が見られ、特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌細胞株で高い遺伝子発現が見られることより、これらの癌に関係した遺伝子であると推測される。ＧｎＴ−Ｖは大腸癌の転移に関与していることが報告され、大腸癌の細胞株でも発現が見られるが、本発明の遺伝子では大腸癌細胞株では発現が見られない。しかしながら、大腸癌のリンパ節に転移から得られた細胞株であるＳＷ６２０細胞では発現が見られることにより、癌の転移にも関与していることが示唆される。
したがって、本発明は特に肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌の癌の診断、治療、予防、あるいは癌の転移に関わる診断に有用である。
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡに係る：
（ａ）配列番号１で示される塩基配列において、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明ＤＮＡ」ともいう。又、本発明はこれらＤＮＡを含む遺伝子にも係る。
更に、本発明の第三の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質：
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、及び、本発明遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質に係る。
更に、本発明の第四の態様として、上記蛋白質に結合する各種抗体に係る。
更に、本発明の第五の態様として、抗体を含む各種抗癌剤に係る。
更に、本発明の第六の態様として、上記蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質又はその部分ペプチドに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質又はその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む前記方法、に係る。
更に、本発明の第七の態様として、本発明ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドに係る。
更に、本発明の第八の態様として、上記ポリヌクレオチドをプローブとして使用する癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法、に係る。
１．本発明ＤＮＡの取得
本発明ＤＮＡは、市販されている（クロンテック社）ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳のｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。
即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．４，５３−５９（１９９７））に従って調製したヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来のｃＤＮＡライブラリーからクローンをランダムに単離する。
次に、ハイブリダイゼーションにより、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除き、その後インビトロでの転写翻訳を行い５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンについてその両末端の塩基配列を決定する。
更に、こうして得られた末端塩基配列をクエリーとして既知遺伝子のデータベースにて相同性検索を行い、その結果、新規であることが判明したクローンについて全塩基配列を決定する。
また、上記のスクリーニング法に加えて、ｃＤＮＡの５’および３’の末端配列をヒトのゲノム配列に対応させ、それらが挟む領域に未知の長鎖遺伝子が確認された場合には、そのｃＤＮＡの全長解析をおこなう。
このようにして既知の遺伝子に依存した従来のクローニング方法では得られなかった未知の遺伝子も、システマチックにクローニングを行なうことができる。
又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、本発明ＤＮＡを含むヒト由来遺伝子の全領域を調製することも可能である。
このようにして本発明ＤＮＡを有するクローン（ＦＪ０４４７０）を得ることが出来る。該クローンに含まれる遺伝子にコードされる本発明蛋白質の機能等については、本明細書中に示されている。
本発明ＤＮＡのクローニングの別の手段としては、本発明ポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを作成し、適当なライブラリーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明ポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明ＤＮＡとしては、前述した本発明ポリペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ヒトの脳、又は、それ以外の組織、例えば、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、等の細胞・組織に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡ等のいずれでもよい。
ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
２．本発明のポリペプチド
配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列を意味する。本明細書に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくはＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値あるいは、ＦＡＳＴＡにおいてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。
従って、本発明の配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、該アミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドを挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性（機能）が性質的に同質であることを示す。活性の高低は、限定されないが好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。本発明蛋白質が持つ生物学的活性とは糖をポリペプチドに転移する活性が挙げられる。本発明タンパク質が持つ生物学的活性は、公知の文献に記載の糖転移酵素の活性測定を用いればよい（例えば、細胞工学別冊 グライコバイオロジー実験プロトコール、秀潤社、谷口直之ら監修、１９９６年）。
又、本発明ポリペプチドには、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１又は複数の（好ましくは、１〜２０個以内、より好ましくは１〜１０個以内、さらに好ましくは１〜５個以内）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチドも含まれる。
３．本発明ＤＮＡ
上記の配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同質の生物学的活性を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性として考えられる。又、実質的に同質の生物学的活性の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
更に、本発明ＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と同質の生物学的活性（機能）を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡを包含する。
かかる条件下で、配列番号１に示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡを単離を期待しうる。ただし、上記のＳＳＣ，ＳＤＳおよびに温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
クローン化された本発明ＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
４．本発明ポリヌクレオチド
本発明ＤＮＡ（遺伝子）は、以下の実施例で示されるように、癌細胞で高発現していることから、本発明遺伝子を検出することにより、かかる癌の検出に利用することが可能である。
従って、配列番号１に示された塩基配列を含む本発明ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このような癌の検査にプローブとして使用することが出来る。このようなポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上、特に好ましくは１０００塩基以上である。また、本発明の遺伝子を増幅するためにプライマーとして利用することが可能である。
例えば、これらのヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにより、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現異常を検査することができる。また、これらのヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより本発明の蛋白質をコードする遺伝子、ＤＮＡ、ｍＲＮＡを増幅し、ＲＦＬＰ解析、ＳＳＣＰ、シークエンシング等の方法により、遺伝子の発現異常を検査・診断することができる。
プライマーとして用いる場合には、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３５塩基の鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のＤＮＡの少なくとも一部もしくは全部の配列を含む少なくとも１５塩基の鎖長のヌクレオチドが用いられる。このようなヌクレオチドは好ましくは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーションの条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号１）とハイブリダイズし、他の蛋白質をコードするＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離、検出を期待しうる。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
具体的には、本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドと本発明のＤＮＡを含むと予想される被験試料とを接触せしめ、前記ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出することにより、被験試料が由来する被検体が癌に罹患しているかどうかを検出することができる。ハイブリダイズ活性は、前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るＤＮＡまたはその断片が被験試料中に存在する場合に検出される。
この際、ポリヌクレオチドとして、例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列の相同性が高い蛋白質との間で、部分的に相同性が低い部分をコードするポリヌクレオチドであって少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチドを用いることにより、本発明の遺伝子を特異的に検出することができる。例えば、ＧｎＴ−Ｖとアミノ酸配列を比較し、相同性の低い部分をコードするポリヌクレオチドを用いればよい。具体的には、例えば配列番号３または４に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは少なくとも１５塩基から成るその断片が挙げられる。
本発明ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子をプローブとして使用することにより、本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
５．本発明蛋白質の取得
本発明蛋白質は、当業者に公知の任意の方法によって、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換させた形質転換体を培養し、本発明ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することによって、容易に調製することが出来る。
上記発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））等が用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、スキゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０細胞，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
このようにして得られた、本発明ＤＮＡ又は本発明ＤＮＡを含む遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物から本発明ポリペプチド又は蛋白質を分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。
こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
６．本発明抗体
本発明の抗体は、本発明蛋白質と結合する限り特に制限はなく、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの等を含む。尚、本発明抗体は、本発明蛋白質と特異的に結合することが好ましい。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、本発明蛋白質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
本発明蛋白質をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的の本発明蛋白質を公知の方法で精製する。
次に、この本発明蛋白質を感作抗原として用いる。あるいは、本発明蛋白質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドは本発明蛋白質のアミノ酸配列より当業者に公知の一般的な方法による化学合成により得ることができる。
ここで、本発明の蛋白質の部分ポリペプチドとしては、例えば、本発明蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。本発明の部分ポリペプチドとしては、例えば、後述するような各機能ドメインを含むものが特に好ましい。又、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明抗体は、本発明蛋白質の検出、精製等に用いることが出来、又、以下の実施例で示されるように本発明遺伝子は癌細胞で高発現しているので、本発明抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、細胞増殖を抑制し得ることから、本発明抗体の認識する本発明蛋白質分子上のエピトープは特定のものに限定されず、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明抗体を作製するための抗原は、本発明蛋白質分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
また、本発明蛋白質に特異的な抗体を得るために、例えば、本発明の蛋白質のアミノ酸配列の相同性が高い蛋白質との間で、部分的に相同性が低い部分であって、少なくとも６アミノ酸、好ましくは８アミノ酸、さらに好ましくは１０アミノ酸からなるペプチドを抗体を作製するための抗原として用いればよい。例えば、ＧｎＴ−Ｖとアミノ酸配列を比較し、相同性の低い部分を用いればよい。例えば、配列番号３または４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたは少なくとも６アミノ酸から成るその断片を用いることができる。
本発明の抗体は、上記抗体の作製するための抗原を認識し、結合する抗体であり、該抗体は上記抗原を動物に投与して得ることができる。また、本発明の蛋白質を動物に投与して得られたポリクローナル抗体から、上記抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより得ることもできるし、多数のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから上記抗原に結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることにより得ることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで本発明蛋白質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、本発明蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる本発明蛋白質を投与して本発明抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から本発明蛋白質に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、本発明抗体を産生するハイブリドーマから、本発明抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする本発明抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される本発明抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギのカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３号公報、ＷＯ ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず本発明蛋白質に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ． ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ． ＆ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６）、等）。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した本発明抗体を使用することもできる。抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞障害性物質などを結合することも可能である。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体は本発明蛋白質分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体や本発明蛋白質と他の蛋白質を認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が本発明蛋白質を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、本発明蛋白質を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、本発明蛋白質をコーティングしたプレートに、本発明抗体を含む試料、例えば、本発明抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明抗体は細胞障害活性を有していてもよい。本発明における細胞障害活性とは、例えば補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性、抗体依存性細胞介在性細胞障害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性などを挙げることができる。本発明において、ＣＤＣ活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ＡＤＣＣ活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
本発明抗体がＡＤＣＣ活性を有するか否か、又はＣＤＣ活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９３）等）。
具体的には、例えば、細胞障害活性の測定は以下の方法により行うことが可能である。
・エフェクター細胞の調製
ＣＢＡ／Ｎマウスなどから脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で脾臓細胞を分離する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を５×１０６／ｍｌに調製し、エフェクター細胞を調製する。
・補体溶液の調製
Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を１０％ ＦＢＳ含有培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて１０倍希釈し、補体溶液を調製する。
・標的細胞の調製
本発明蛋白質発現細胞（前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、大腸癌細胞など）を０．２ｍＣｉの５１Ｃｒ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｒｏｍａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とともに、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃にて１時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて３回洗浄し、細胞濃度を２×１０５／ｍｌに調製して、標的細胞を調製する。
・ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、エフェクター細胞１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または１０μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンター（ＣＯＢＲＡＩＩＡＵＴＯ−ＧＭＭＡ、ＭＯＤＥＬ Ｄ５００５、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で放射活性を測定する。細胞障害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により求めることができる。Ａは各試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは１％ＮＰ−４０（半井社製）を加えた試料における放射活性（ｃｐｍ）、Ｃは標的細胞のみを含む試料の放射活性（ｃｐｍ）を示す。
・ＣＤＣ活性の測定
９６ウェル平底プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に、標的細胞と、本発明抗体を５０μｌずつ加え、氷上にて１５分間反応させる。その後、補体溶液１００μｌを加え、炭酸ガスインキュベーター内で４時間培養する。抗体の終濃度は０または３μｇ／ｍｌとする。培養後、１００μｌの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞障害活性はＡＤＣＣ活性の測定と同様にして求めることができる。
７．本発明抗癌剤
本発明の抗癌剤（癌治療剤）の有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。また、本発明の治療剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。本発明の治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合には、溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。本発明の治療剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
８．本発明蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法
本発明の蛋白質は、これに結合する物質のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、これに結合する化合物を含むと予想される被験試料とを接触せしめ、本発明の蛋白質と被験試料との結合活性を検出し、本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことを含む本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また上記の部分ペプチドであってもよい。被験試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。被験試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、また、膜画分として被験試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質（リガンド等）をスクリーニングする方法としては当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニング方法としては、例えば、免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ．，（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ，６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））、アフィニティクロマトグラフィーを利用した方法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−４６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−１７）などが当業者に公知である。
本発明のスクリーニング方法により単離され得る化合物は、本発明の蛋白質とリガンドとの結合を阻害するための物質となり得る為、抗癌剤への応用が考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法により単離された化合物と薬理学上許容される担体とを混ぜ合わせて抗癌剤を製造することも可能である。
さらには、本発明の蛋白質は糖鎖転移酵素であることが予測されるので、特に糖鎖を認識するレクチンを利用した基質となる蛋白質のスクリーニングが考えられる。「基質となる蛋白質」とは本発明遺伝子がコードする蛋白質の糖転移酵素活性により、糖鎖を付加される蛋白質のことを意味する。
例えば、βマンノースの６位側が分岐したＮ型糖鎖を認識するＰＨＡ−Ｌ４（インゲンマメレクチン）などのレクチンを用いて、本発明の蛋白質が高発現している細胞と低発現の細胞を比較して発現量の差がある蛋白質を解析することから、または本発明蛋白質による糖転移の有無による分子量変化を解析することにより基質となる蛋白質を同定することができる。このようなスクリーニングを行うための方法としては、例えば、乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ ２２）、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５、（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１）、膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １４６９）などの本発明遺伝子を高発現している培養細胞株と乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ ２６）、前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）、膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ １６８７）などの本発明遺伝子の発現が低い培養細胞株とで発現している糖蛋白質を種々のレクチンを用いたウエスタンブロティングなどを用いて解析することが挙げられる。また、本発明の遺伝子を遺伝子導入した細胞ともとの細胞を比較したり、本発明遺伝子を発現している細胞にアンチセンスＤＮＡやｓｉＲＮＡを用いて本発明蛋白質が発現するのを阻害することにより、基質となる蛋白質をスクリーニングする方法も挙げられる。
また、本発明蛋白質の糖転移酵素の活性により付加される糖鎖を同定し、癌の診断や治療に利用することもできる。例えば、本発明遺伝子が発現している前述の細胞から蛋白質を抽出してＮ型結合糖鎖を特異的に切断する酵素、例えばＧｌｙｃｏ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｆなどを用いて糖鎖を切り出すか、あるいは、化学反応、例えばヒドラジン分解、Ｎアセチル化処理後に糖鎖をＨＰＬＣなどにより分析することで癌特異的な糖鎖構造をスクリーニングすることもできる。
これらのスクリーニングにより得られた癌特異的な基質となる蛋白質や糖鎖構造はそれを改変することにより抗癌剤となりうる。
また、これら基質となる蛋白質や糖鎖構造に対する抗体は癌に特異的な反応を示すことが期待され、抗体を含む抗癌剤として有用である。
９．その他
本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）としては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と好ましくは約９０以上、より好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）はＥｌｂａｓｈｉｒらにより報告された細胞内の遺伝子の発現を抑制する遺伝子に相補的な２１塩基からなる二本鎖のＲＮＡである（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ，Ｈａｒｂｏｒｔｈ Ｊ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ Ｗ，Ｙａｌｃｉｎ Ａ，Ｗｅｂｅｒ Ｋ，Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ（２００１）．Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８．）。本発明蛋白質又はその部分ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するｓｉＲＮＡとしては、当該ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのｓｉＲＮＡであってもよい。ｓｉＲＮＡは３’端にオーバーハングしたＵＵまたはＴＴの２塩基を持ち、本発明の遺伝子に相補的な１９塩基からなるセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡをハイブリダイズした二本鎖のＲＮＡであり、例えばＡｍｂｉｏｎ社のＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃１６２０）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−Ｃｙ３（＃１６３２）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＦＡＭ（＃１６３４）、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃１６３０）などのキットのマニュアルに従って作製することができる。あるいは、化学合成によって作製することも挙げられる。ｓｉＲＮＡの鎖長は２１塩基以上が特に好ましいが、２５塩基以上でもよく、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであればいずれの長さのものでもよい。また、ｓｉＲＮＡをＣｙ３、ＦＡＭなどでラベルしたものでも同じ程度の抑制作用があることが報告されており、これらで修飾されたものでもよい。
また、ｓｉＲＮＡを安定に発現するために発現ベクターにより発現させることも挙げられる（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲら（２００２）．．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３、Ｐａｄｄｉｓｏｎ，ＰＪら（２００２）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８、Ｐａｕｌ，ＣＰら．（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８、Ｓｕｉ，Ｇら，（２００２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（６）：５５１５−５５２０、Ｙｕ，Ｊ−Ｙら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（９）：６０４７−６０５２、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ，ａｎｄ Ｔａｉｒａ，Ｋ（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００、Ｌｅｅ，ＮＳら（２００２）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５）。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが認識するプロモーターとしてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｈ１ ＲＮＡやＵ６のプロモーターを利用して、転写終結シグナル配列との間に発明遺伝子の２０塩基以上の長さの配列をインバーテッドリピートが形成されるように挿入して発現することが挙がられる。挿入する配列は当該ｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有し、該ｍＲＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれの配列であってもよい。
本発明遺伝子に発現異常がある癌患者に対しては、これらの方法で遺伝子発現を抑制することで該患者の本発明の蛋白質の活性を阻害することができる。アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡを直接該患者体内に導入する方法のほか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療による導入方法も挙げられる。又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
又、本発明のＤＮＡ若しくは遺伝子又はそれらの一部の塩基配列に基づき作成した合成ＤＮＡプライマーを使用し、ヒトの血液又は組織から抽出した染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、その産物の塩基配列を決定することにより、本発明のＤＮＡ又は遺伝子中にある個体によって異なる一塩基の変異、即ち、ｃＳＮＰｓを見出すことが出来る。これにより、個体の体質等が予測され、各自に適した医薬の開発等が可能となる。
又、クロスハイブリダイゼーションにより、マウス等のモデル生物における本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対するオルソログ（ホモログ、カウンターパート）遺伝子を単離し、例えば、これら遺伝子をノックアウトすることによってヒトの疾患モデル動物を作成し、ヒトの病因となる遺伝子を探索・同定することも可能である。
尚、本明細書および表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３３８５４９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写により発現させたＦＪ０４４７０の電気泳動を示す図である。
図２は、ＧｎＴ−ＶとＦＪ０４４７０のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
図３は、ＦＪ０４４７０のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載されている方法に従った。
〔実施例１〕 本発明のＤＮＡの取得
（１） ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（インビトロジェン社）をプライマーとして、ヒト成人全脳、ヒト扁桃、ヒト海馬及びヒト胎児全脳由来ｍＲＮＡ（クローンテック社）を鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（インビトロジェン社）をｃＤＮＡとライゲーションした。その後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。
精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋ プラスミドとライゲーションした。大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社）にエレクトロポレーション法によりこの組換えプラスミドを導入した。
（２）スクリーニング（その１）
次いで、こうして構築したｃＤＮＡライブラリーからランダムにクローンをピックアップし、メンブランにスポッティングした。次に、これまでに本発明者等によって既に全長の解析が行われている約１，３００個のクローンの塩基配列に基づき作成したオリゴＤＮＡ（各２１塩基）の混合物の各３’末端をターミナルトランスフェラーゼでＤＩＧラベルし、これらをプルーブとして使用してドットハイブリダイゼーション（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））により、重複クローン（繰り返し出てくるクローン）を除いた。
次に、インビトロでの転写翻訳（プロメガ社ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を行い、５０ｋＤａ以上の産物が認められるクローンを選択した。
次に、選択したクローンの末端塩基配列を決定し、得られた配列をクエリーとして相同検索プログラムＢＬＡＳＴＮ ２．２．１（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いて、ｎｒ（Ａｌｌ ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｂｕｔ ｎｏ ＥＳＴ，ＳＴＳ，ＧＳＳ，ｏｒ ｐｈａｓｅ ０，１ ｏｒ ２ ＨＴＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ））データベースに対して相同検索を行った。配列決定には、ＰＥアプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
このようにして新規ＤＮＡ又は遺伝子のスクリーニングを行なった。その結果、ヒト胎児脳由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから作成されたｃＤＮＡよりクローンＦＪ０４４７０を見出した。
（３）本発明遺伝子にコードされる蛋白質の発現
インビトロでの転写翻訳系（プロメガ社，ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｉｏｐｔｉｏｎ ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ１１０７）を用いて、ｃＤＮＡクローンＦＪ０４４７０からの遺伝子産物を発現させた。
３５Ｓ標識メチオニンを取り込ませた産物を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ゲルを乾燥させ、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）のシステムでオートラジオグラフィーをおこない、クローンＦＪ０４４７０の遺伝子産物を検出した。ＢＩＯ ＲＡＤのＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｃａｔ．１６１−０３２４）のサイズマーカーで測定したｆｊ０４４７０ ｐｒｏｄｕｃｔのサイズは９０ｋＤａであった。
ＦＪ０４４７０がコードするタンパク質は、最初のメチオニンから数えると７９３アミノ酸残基からなり、分子量は、約８９．４ｋＤａと予想され、実験結果によく一致するものであった。
〔実施例２〕 本発明ＤＮＡの相同性
（４）本発明ＤＮＡの相同性検索
次に、ＢＬＡＳＴＮ ２．１．３，ＢＬＡＳＴＰ ２．１．３（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いてＮＣＢＩ ｎｔ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ），ｎｒ（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）、特許配列データーベースｇｅｎｅｓｅｑｎｔ，ｇｅｎｅｓｅｑａａに対してホモロジー検索を行った。
その結果、ＦＪ０４４７０遺伝子が、表１に示した遺伝子と相同性を示すことが明らかになった。ＦＪ０４４７０遺伝子は７９３個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする４４９１ｂｐからなる遺伝子であり、核酸配列の５７５番目から２９５０番目の配列がアミノ酸をコードしている。
高い相同性が見出されたヒト遺伝子ｇｂ：Ｔ５０６０６，ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＫＦＺｐ７６１Ｊ１０７．１と比較するとＮ末端が２５４アミノ酸長く、ＦＪ０４４７０遺伝子は同一遺伝子の全長の遺伝子をコードしていると考えられる。ｇｂ：Ｔ５０６０６はコンピューターで予測されたアミノ酸配列であり、Ｎ末端に存在する膜貫通領域と見られる疎水性領域、４個の糖鎖付加部位をもたない部分配列であり、機能的分子であるとはいえない。
データベースで次にホモロジーのあったｇｂ：ＡＡＣ５２９２５はＣＨＯ細胞で発現しているａｌｐｈａ−１，３（６）−ｍａｎｎｏｓｙｌｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ−１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅという糖鎖の転移酵素であり、ＦＪ０４４７０遺伝子はこれと４５．５％の領域にわたって４４％の相同性を有することから糖転移酵素の一つであると考えられる。その次に相同性を有するｇｂ：ＮＰ＿００２４０１．１はｇｂ：ＡＡＣ５２９２５のヒトオルソログであるので、ｇｂ：ＮＰ＿００２４０１．１とＦＪ０４４７０蛋白質のアミノ酸配列を詳細に比較した。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）のＧＡＰを用いた。２１個あるシステイン残基のうち、ＦＪ０４４７０蛋白質の１５７番のシステイン残基以後に存在する１９個のシステイン残基についてはｇｂ：ＡＡＣ５２９２５に２０個あるシステイン残基のうち１個を除いてほぼ配置が似ており、ジスルフィド結合による蛋白質のフォールディングの結果に得られる構造はかなり類似したものであることが予想される。
表１には、該相同遺伝子に関する情報が挙げられている。尚、表１中の各項目の意味は以下の通りである。
「相同領域 クローン」クローンの相同領域の起点及び終点
「相同領域 相同遺伝子」相同遺伝子の相同領域の起点及び終点
「Ｓｃｏｒｅ」この値が高ければ高いほど信頼度が高い
「Ｅ−ｖａｌｕｅ」この値が０に近ければ近いほど信頼度が高い
「相同性」相同領域のアミノ酸残基の一致の割合
「相同範囲率」相同遺伝子中の相同領域の割合
ペプチド配列についてはＨＭＭＥＲ ２．１．１（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：７５５−７６３，（１９９８））によりＰｆａｍ ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）に対してモチーフ検索を行ったが、ヒットするモチーフは存在しなかった。
疎水領域、細胞内の局在を推測するプログラムであるＰＳＯＲＴ ＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）による検索の結果、２５番目のアミノ酸から４１番目のアミノ酸が膜貫通領域であり、Ｎ末端が細胞質内に存在する他の糖転移酵素と同じくＩＩ型の膜蛋白質であると予測された。また、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）のＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥを用いて解析したところ、アミノ酸残基９３番、１２７番、２１５番、２３６番、４４７番、６００番、６６６番、６７５番の８箇所にＮ型糖鎖付加部位が存在していることからＦＪ０４４７０蛋白質は糖蛋白質であると考えられる。
（２） ゲノム配列との比較
ＢＬＡＳＴＮ ２．１．３によるホモロジー検索でヒットした ｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １７，ｃｌｏｎｅ ＲＰ１１−８７Ｇ２４，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｌｅｎｇｔｈ＝１９３５３７をＦＪ０４４７０遺伝子と比較した。その結果、ゲノム配列のｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の１４７７８８番目から６５８６７番目の位置にＦＪ０４４７０遺伝子は存在しており、ＦＪ０４４７０遺伝子は１９個のエクソンに分かれ、２番目のエクソンから１８番目のエクソンにコーディング領域は分かれている。ＦＪ０４４７０遺伝子とゲノム配列を比較した結果を表とした（表２）。
さらに、Ｗｉｓｅ２−１−２０ｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｗｉｓｅ２）のｇｅｎｅｗｉｓｅプログラムを使用してＦＪ０４４７０蛋白質とｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の核酸配列を比較して、エクソン−イントロンのジャンクション部位を特定した。
ｇｂ：ＸＭ＿０８５５３３，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＬＪ２５１３２（ＦＬＪ２５１３２），ｍＲＮＡはコンピューターで予測された遺伝子として報告されているが、ＦＪ０４４７０遺伝子の３６２番から１４９３番の核酸配列と９９％（１１３２／１１３３）一致している。これは４番目のエクソンまで（コーディングエクソンの１番目から３番目）の配列しか含まない。４番目と５番目のエクソンの間には２０２５５塩基からなる大きなイントロンが存在していることがｇｅｎｅｗｉｓｅによる解析から判明し、この長いイントロンをＮＣＢＩのコンピュータープログラムでは予測できなかったものと考えられる。つまり、ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡのエクソン構造は大きなイントロンを含んでいるためにコンピューターでは予測できない遺伝子であるということを示している。
表２ ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡ配列とゲノム配列の比較
ＦＪ０４４７０ ｃＤＮＡ配列とゲノム配列をｇｅｎｅｗｉｓｅによりエクソン、イントロンの境界を分析し、得られたエクソンのサイズ、イントロンのサイズを表にした。
番号は左のｃＤＮＡの番号に対応するゲノム配列ｇｂ：ＡＣ０１６１６８．１８の番号を並べて示した。
（３） 公的なデーターベースにおける遺伝子発現情報
ＦＪ０４４７０遺伝子は、Ｕｎｉｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅに対して行ったホモロジー検索からＨｓ．１４４５３１のＵｎｉｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒに属する。Ｈｓ．１４４５３１に属するＥＳＴクローンは３３個あり、それらのＥＳＴの由来は脳（ｂｒａｉｎ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、膵臓（外分泌）（ｐａｎｃｒｅａｓ，ｅｘｏｃｒｉｎｅ）、生殖細胞（プールされたもの）（ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ，ｐｏｏｌｅｄ）、乳房（ｂｒｅａｓｔ）、子宮頸（ｃｅｒｖｉｘ）、肺（ｌｕｎｇ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、眼（ｅｙｅ）、膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓ）、後根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ）、卵巣（ｏｖａｒｙ）であるが、脳由来のｃＤＮＡが多い傾向が見られる（１５／３３）。公的なデーターベースから得られる発現情報では癌に特異的な発現をしているかは不明である。
〔実施例３〕 本発明のＤＮＡの転写解析
（１） リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社）により本発明遺伝子の転写物の量を各種組織のｃＤＮＡを用いて解析した。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の解析には、Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社＃４３１０８８４Ｅ）を使用した。ＰＣＲ反応の組成は、１．２５μｌ ２０Ｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｉｘ（ＧＡＰＤＨ），ＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ社＃９９２０）６．２５μｌ，ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０４４３７）１２．５μｌを混合したＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘに対してクロンテック社のＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡ ５μｌを加えて２５μｌとして、ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ＡＢＩ社＃Ｎ８０１−０５６０）上でＡＢＩ社 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて５０度２分、９５度１０分、９５度１５秒−６０度１分を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡはクロンテック社のＨｕｍａｎ ＭＴＣＴＭ Ｐａｎｅｌ Ｉ（Ｋ１４２０−１）、Ｈｕｍａｎ ＭＴＣＴＭ Ｐａｎｅｌ ＩＩ（Ｋ１４２１−１）、Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ ＭＴＣＴＭＰａｎｅｌ Ｉ（Ｋ１４２２−１）を使用した。培養した癌細胞からＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収して、これをａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ Ｄｎａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを分解した。方法はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ推奨のマニュアルに従った。ＤＮａｓｅ Ｉで処理したｔｏｔａｌ ＲＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにより逆転写してｃＤＮＡとした。
本発明遺伝子の発現量については、ＡＢＩ社のＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ １．５を使用してＲＴ−ＰＣＲに最適なプライマーの配列を検索した。ＦＪ０４４７０遺伝子の配列をゲノム配列と比較したところ、ＡＣ０１６１６８．１８に配列がマッチした。イントロン、エクソンの構造を解析した結果、ＦＪ０４４７０の塩基番号で２１５８番付近に約２２６０塩基からなるイントロンが存在することが予想されたので、この領域を挟む形でプライマーの位置を決定した。プライマー４４７０−２０４３（５’−ＡＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣ−３’）、プライマー４４７０−２２３０（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＧＣＧ−３’）はｃＤＮＡでは１８８塩基を増幅するが、ゲノムは約２４５０塩基を増幅することになる。０．５μｌの１０μＭのプライマー４４７０−２０４３、０．５μｌの１０μＭのプライマー４４７０−２２３０、６．５μｌのＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ、１２．５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社＃４３０９１５５）を混合し２０μｌとして、これに対してクロンテック社のＭＴＣ Ｐａｎｅｌ ｃＤＮＡ １μｌ及びＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ ｗａｔｅｒ（処理水）４μｌを加えて２５μｌとした。ＡＢＩ社のＭｉｃｒｏ Ａｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（ＡＢＩ社＃Ｎ８０１−０５６０）上でＡＢＩ社ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて５０度２分、９５度１０分、９５度２０秒−６０度１分を４０サイクルの遺伝子増幅を行なった。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を内部コントロールとしておいたＧＡＰＤＨアンプリコンをクローニングしたプラスミドを用いて標準曲線を引き、それをもとにして反応液中に存在するコピー数を算出した。本発明遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で割って得られた相対値で、各組織での発現量を比較した結果を以下の表３に示す。
表３において、左側は組織の名前を示し、右側の数値は各々の組織におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を使ってノーマライズしたＦＪ０４４７０遺伝子の発現量を示している。肝臓での値を１として他の組織での発現量を相対値として示した。
この表３から判るように、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、において高値を示した。正常組織では脳、精巣では高い値を示したが、他の組織での発現量はあまり高くはない。
表３ リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析（１）
ＦＪ０４４７０の発現量を比較するために、内部コントロールとして測定したＧＡＰＤＨの発現量で割った値の相対値で比較した。肝臓での相対的な発現量を１として種々の組織での発現量を比較した。
さらに、各種癌細胞株での発現量を比較するために３１種類の癌細胞と４種類の正常細胞のｃＤＮＡを用いてＦＪ０４４７０遺伝子の発現解析を行った。
その結果、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌において高い発現が見られた。以上のことから本発明の遺伝子は肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌で発現が亢進している遺伝子であり、この遺伝子がコードする蛋白質もこれらも組織において高い発現があると考えられる。
また、大腸癌細胞株の項目のなかで、唯一発現が高く見られたＳＷ６２０細胞であるが、この細胞は大腸癌がリンパ節に転移した部位から得られた細胞であるので、本発明の遺伝子は癌の転移とも関わりが示唆される。
表４ リアルタイムＰＣＲによる転写物の解析（２）
ＦＪ０４４７０の発現量を比較するために、内部コントロールとして測定したＧＡＰＤＨの発現量で割った値の相対値で比較した。乳腺上皮細胞での相対的な発現量を１として種々の癌細胞での発現量を比較した。
〔実施例４〕 ポリクローナル抗体の作製
相同性が一番高いＧｎＴ−Ｖの配列と比較して異なる領域で抗原性の高い領域を２か所選んでポリクローナル抗体を作成した。
図２にＧｎＴ−ＶとＦＪ０４４７０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図中に示した数字はＦＪ０４４７０のアミノ酸番号を示し、アミノ酸は一文字表記した。三段めにＧｎＴ−Ｖとのコンセンサス配列を示す。ペプチド抗体の作製に使用した配列は図中の線で示した部分（１１アミノ酸部分と１５アミノ酸部分）である。その他の下線はＮ型糖鎖の付加が予想される部位を示す。
選んだペプチドＡＧ，ＲＡの配列はＡＧ：ＣＡＧＳＮＴＫＹＲＲＬ（配列番号３），ＲＡ：ＣＲＡＰＤＰＡＬＰＥＡＨＡＰＱ（配列番号４）である。プロメガ（株）にペプチド合成、ウサギポリクローナル抗体の作製を委託した。ペプチドは１１ｍｅｒ（ＡＧ），１５ｍｅｒ（ＲＡ）を８０％以上の精製で合成後、ＫＬＨをコンジュゲートして各２羽のウサギに免疫した。日本白色種雌の２．５〜３．０ｋｇのウサギを使用し、アジュバンドとして初回免疫にはＦＣＡ、追加免疫にはＩＦＣＡを用いて０．５ｍｇを５回免疫した。
ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧをクローニングした発現ベクターをＣＯＳ細胞に遺伝子導入し、４８時間後にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶解した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、ゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）４８ｍｌ，２．９２８ｇ ｇｌｙｃｉｎｅ，２００ｍｌ ＭｔＯＨ／Ｌ）に浸して、ＰＶＤＦ膜Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（日本ミリポア ＩＰＶＨ３０４ Ｆ０）に、ＢｉｏＲａｄ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤを用いて ２０Ｖで６０分間ブロッティングした。蛋白のトランスファーされたメンブレンを２％スキムミルク（雪印）／Ｔ−ＴＢＳで４℃一晩ブロッキングし、１０００倍に希釈したウサギ抗ペプチド抗血清と室温で一時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分、３回振倒しながら洗浄し、次に２次抗体を反応させた。ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ Ｉｇ，ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｄｏｎｋｙ）（アマーシャム）を２％ｓｋｉｍｍｉｌｋ（雪印）／Ｔ−ＴＢＳで５０００倍希釈して室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分、４回振倒しながら洗浄し、アマーシャムのＥＣＬ検出キットを使用してペプチド抗体に反応するバンドを検出した。結果、ＲＡ２のウサギにおいて抗ＦＬＡＧ抗体で検出されるバンドと同じサイズの約９０ＫＤａのＦＪ０４４７０のバンドが検出できた。ブロードなバンドとして検出されたことから糖鎖修飾を受けていると考えられる。
図３にウエスタンブロッティングの結果を示す。図３はＣＯＳ７細胞に一過性に発現させたＣ末端にＦＬＡＧタグのついたＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧとＣＯＳ７細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したものをウサギ抗ペプチド抗血清で検出したものである。ＦＬＡＧと記載されたものは抗ＦＬＡＧ抗体で検出したコントロールである。矢印に示したバンドの一がＦＪ０４４７０−ＦＬＡＧ蛋白のバンドの位置である。ＲＡ２ ０３０２２５のサンプルで特異的なバンドが検出できていることが明らかに見られる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
以上の知見から、本発明遺伝子は癌に関連して遺伝子発現が上昇している新規遺伝子であり、癌の診断に使用することが可能である。特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌などにおいて高発現していることからこれらの癌の診断に有用であると考えられる。方法としてはＤＮＡ診断、抗体を使った免疫組織染色による方法が挙げられる。
さらに、転移した癌の診断にも有用と考えられる。
また、この遺伝子がコードする蛋白質の糖転移酵素としての機能を阻害すること等により癌を抑制できる可能性がある。機能を阻害する方法としては抗体を使った機能阻害、あるいは低分子を使った機能阻害が考えられる。特に、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵癌などの癌の治療薬又は予防薬として有用であると考えられる。
さらには、この遺伝子は糖転移酵素として糖鎖の基質となる蛋白質のスクリーニング、基質蛋白質に転移する糖鎖をスクリーニングするための手段として利用することもできる。例えば、癌に関与して本発明蛋白質により糖付加をうける蛋白質や糖鎖は癌の治療薬又は予防薬の標的分子として有用であり、それらに対する抗体や糖の類似体など用いることで癌の治療薬または予防薬の開発がつながる可能性があるため、本発明遺伝子はこれらのスクリーニングに使用することに対しても有用である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号３または配列番号４のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の抗体を含む抗癌剤。
【請求項１２】
癌が肺癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１３】
癌が乳癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１４】
癌が前立腺癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１５】
癌が膵癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１６】
請求項６又は７に記載の蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質又はその部分ペプチドに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質又はその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む前記方法。
【請求項１７】
部分ペプチドが配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１６記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１又は２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする、請求項１８記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドをプローブとして使用する癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子。
【請求項４】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む蛋白質。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの機能と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む遺伝子を発現させることにより得られる組換え蛋白質。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号３または配列番号４のペプチドに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか１項に記載の抗体を含む抗癌剤。
【請求項１２】
癌が肺癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１３】
癌が乳癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１４】
癌が前立腺癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１５】
癌が膵癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１６】
請求項６又は７に記載の蛋白質又はその部分ペプチドに結合する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質又はその部分ペプチドに被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質又はその部分ペプチドと被験試料との結合活性を検出する工程、及び
（ｃ）該蛋白質又はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む前記方法。
【請求項１７】
部分ペプチドが配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１６記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１又は２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、少なくとも１５塩基から成るポリヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする、請求項１８記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のポリヌクレオチドをプローブとして使用する癌の検出方法であって、
（ａ）該ポリヌクレオチドに被験試料を接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチドと被験試料とのハイブリダイズ活性を検出する工程、を含む前記方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４６３５８
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【発行日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５３２１８（Ｐ２００４−５５３２１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４８１２
【国際出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（５９６１７５８１０）財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所 (40)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月３日（２００４．６．３）
【発行日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４８１２
【国際出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【出願人】（５９６１７５８１０）財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所 (40)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]