新規発症自己免疫性糖尿病を予防および／または逆転させるためのマイクロスフィアに基づく組成物
【課題】ＮＯＤマウスにおいて自己免疫性糖尿病状態を予防する、および／または逆転させるためのアンチセンスアプローチを提供すること。
【解決手段】特に非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘発するために、ＡＳ−オリゴヌクレオチドをマイクロスフィア形式で送達する。該マイクロスフィアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを組み込む。プロセスは、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を逆転させるためにアンチセンスアプローチをインビボで使用することを含む。該オリゴヌクレオチドは、一次転写物ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびその組み合わせに結合するよう標的化される。
【解決手段】特に非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘発するために、ＡＳ−オリゴヌクレオチドをマイクロスフィア形式で送達する。該マイクロスフィアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを組み込む。プロセスは、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病状態を逆転させるためにアンチセンスアプローチをインビボで使用することを含む。該オリゴヌクレオチドは、一次転写物ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびその組み合わせに結合するよう標的化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年８月４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３５，７４２号および２００６年１１月８日に出願された同第６０／８６４，９１４号の優先権の利益を主張するものである。前記出願のそれぞれの全ての文言が、本明細書中に参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は一般的に、ＮＯＤマウスにおいて自己免疫性糖尿病状態を予防する、および／または逆転させるためのアンチセンスアプローチに関連する。これは、特に非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、負の調節活性を引き起こす治療効果を達成するために、注射によるＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフィア送達を含む。該マイクロスフィアを、完全に水性の条件を用いて作成し、該マイクロスフィアは１つまたはそれ以上のアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを組み込む。
【０００３】
微粒子、マイクロスフィア、およびマイクロカプセルは、１ミリメートルより小さい直径を有する固体または半固体粒子であり、そしてそれは１００ミクロンより小さくあり得、それを合成ポリマー、タンパク質、および多糖を含む様々な材料から形成し得る。マイクロスフィアは、多くの異なる適用において、主に分離、診断、および薬剤送達において使用されてきた。
【０００４】
合成ポリマー、天然ポリマー、タンパク質、および多糖からこれらの粒子を作成するために、相分離、溶媒蒸発、乳化、およびスプレー乾燥を含む、多くの異なる技術を使用し得る。一般的に、該ポリマーがこれらのマイクロスフィアの支持構造を形成し、そして関心のある薬剤が該ポリマー構造に組み込まれる。マイクロスフィアの形成に使用される代表的なポリマーは、ホモポリマーおよびＲｕｉｚに対する特許文献１、Ｒｅｉｄらに対する特許文献２、Ｔｉｃｅらに対する特許文献３、Ｔｉｃｅらに対する特許文献４、Ｔｉｃｅらに対する特許文献５、Ｓｉｎｇｈらに対する特許文献６、Ｂｏｙｅｓらに対する特許文献７、Ｔｉｃｅらに対する特許文献８、およびＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対する特許文献９において記載されたような、乳酸およびグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）；Ｉｌｌｕｍに対する特許文献１０において記載されたような、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０８およびポロクサマー４０７のようなブロックコポリマー；およびＣｏｈｅｎに対する特許文献１１において記載されたようなポリホスファゼンを含む。これらのようなポリマーを用いて産生されたマイクロスフィアは、低い装填効率を示し、そして多くの場合低いパーセンテージの関心のある薬剤しかポリマー構造に組み込むことができない。従って、多くの場合、治療効果を達成するために、かなりの量のこれらの型のマイクロスフィアを投与しなければならない。それに加えて、これらのポリマーは典型的には疎水性であり、関心のある薬剤の溶解に負の影響を与える。この関係で典型的に使用されるポリマーは、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含む。
【０００５】
医療界の目的は、糖尿病を含む様々な疾患の治療のために、核酸を動物の細胞へ送達することである。多くのアプローチにおいて、トランスフェクション薬剤の添加によって、比較的効率的に、核酸を培養中の細胞に（インビトロで）送達し得る。それに加えて、インビボにおいて、核酸を動物に送達する場合、内因性ヌクレアーゼの存在が、高率の核酸の分解を引き起こす。
【０００６】
核酸をヌクレアーゼ消化から守ることに加えて、核酸送達媒体は、低い毒性を示さなければならず、細胞によって効率的に取り込まれなければならず、そしてよく規定された、容易に製造される処方を有する。臨床試験において示されたように、送達のためのウイルスベクターは、インビボにおいて、非常に有害な、致死的でさえある免疫反応を引き起こし得る。それに加えて、この方法は、インビボにおいて変異原性作用を有する可能性がある。異なる処方の脂質複合体（リポソームまたは陽イオン性脂質複合体のような）中で核酸を複合体化することによる送達は、毒性作用を有し得る。核酸の、様々なポリマーまたはペプチドとの複合体は、一致しない結果を示し、そしてこれらの処方の毒性はまだ解決していない。核酸はまた、送達のためにポリマーマトリックスに封入されたが、これらの場合、粒子は広いサイズ範囲を有し、そして治療的適用の有効性はまだ示されていない。そのような以前のアプローチは、本明細書中で望まれるゴールと反対の免疫系の刺激を含む、効果を生じ得る。例えば、ＰＬＧＡを粒子に組み込む場合、免疫系はＰＬＧＡの存在によって刺激される。
【０００７】
従って、核酸の送達における問題に取り組む必要性が存在し、そしてマイクロスフィアおよびマイクロスフィアを作成する新規方法の開発に対する継続する必要性が存在する。マイクロスフィアに関する詳細、特にその調製および性質に関する詳細は、Ｓｃｏｔｔらに対する特許文献１２、Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏらに対する特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、および特許文献１６、およびＷｏｉｓｚｗｉｌｌｏに対する特許文献１７、およびＢｒｏｗｎらに対する特許文献１８において見出される。本明細書中で同定された、これらおよび全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，２１３，８１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４１７，９８６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５３０，８４０号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８９７，２６８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０７５，１０９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１０２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３８４，１３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６０，６１０号明細書
【特許文献９】欧州特許申請公開番号２４８，５３１明細書
【特許文献１０】米国特許第４，９０４，４７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１４９，５４３号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，４５８，３８７号明細書
【特許文献１３】第６，２６８，０５３号明細書
【特許文献１４】第６，０９０，９２５号明細書
【特許文献１５】第５，９８１，７１９号明細書
【特許文献１６】第５，５９９，７１９号明細書
【特許文献１７】第５，５７８，７０９号明細書
【特許文献１８】米国特許申請公開第２００６／００２４２４０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示によって、オリゴヌクレオチドをマイクロスフィアとして送達する。そのような送達アプローチは、ヌクレアーゼがマイクロスフィア内の核酸に近づくことを妨げると考えられる。アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドのマイクロスフィア送達を、特にＮＯＤマウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘導するために行う。該マイクロスフィアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドが組み込まれるような水性条件を用いて作成する。これらのマイクロスフィアを使用して、遺伝子発現を阻害し、そしてインビボにおいてＮＯＤマウスで自己免疫性糖尿病状態を予防および／または逆転させる。
【００１０】
開示の１つの局面において、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６転写物を標的とした３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを合成し、そしてそのオリゴヌクレオチド混合物の水性溶液を調製し、そして水性ポリマー溶液と組み合わせる。オリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアが形成され、そしてこれらを注射によってＮＯＤマウスに送達する。
【００１１】
開示の１つの局面において、マイクロスフィア組成物を投与することを含む、哺乳動物において１型糖尿病を逆転させる方法を提供し、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドを、配列番号１、配列番号２、または配列番号３およびその組み合わせ、またはさらにＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的とするあらゆる他のオリゴヌクレオチドから成るグループから選択し得る。
【００１２】
開示の別の局面は、哺乳動物にマイクロスフィア組成物を注射することを含む、哺乳動物の膵臓のベータ細胞を、自己免疫性の破壊から保護する方法に向けられ、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
別の局面は、哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含む、哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であり、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここでその組成物を、哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する。より規定された局面において、その組成物を、１型糖尿病の臨床的発症の後に投与する。別の局面において、その組成物を、１型糖尿病の臨床的発症の前に投与する。これらの治療的局面において、その組成物の投与は、投与前の哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する。
【００１４】
前記組成物の投与は、哺乳動物のベータ細胞集団を再生し得るか、またはベータ細胞集団のさらなる劣化を停止させ得るか、またはその両方であり得る。
【００１５】
前記組成物を、あらゆる形式で投与し得、そしてある代表的な局面において、注射可能な形態で投与する。特定の局面において、該組成物を、インスリンと組み合わせて投与する。併用療法を使用する場合、インスリンを、マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与し得る。
【００１６】
さらなる局面は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を被験体に投与することを含む、新規発症または前臨床自己免疫性糖尿病を有する被験体において、残存ベータ細胞塊を保存する方法に向けられ、ここでその組成物の投与は、哺乳動物のベータ細胞塊を、糖尿病の発症前に存在した塊の少なくとも約１５％まで維持する。その被験体はヒト被験体であり得る。その被験体は、ヒト子供であり得る。その治療方法は、組成物の反復投与を含み得、そしてその反復投与は、哺乳動物のベータ細胞塊を増加させる。
【００１７】
特に規定された方法において、マイクロスフィアの３０％および７０％ｗ／ｗ程度がオリゴヌクレオチドである。そのような組成物は、典型的には、マイクロスフィア組成物中に、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比で含み得る。
【００１８】
様々な組み合わせを含む、本開示のこれらおよび他の局面、目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明の考察によって明らかとなり、そして明確に理解される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物において１型糖尿病を逆転させるためのプロセスであって、マイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびそれらの組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む、プロセス。
（項目２）
項目１に記載のプロセスであって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、プロセス。
（項目３）
哺乳動物の膵臓のベータ細胞を自己免疫性の破壊から保護するプロセスであって、前記哺乳動物中にマイクロスフィア組成物を注射する工程を含み、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびそれらの組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む、プロセス。
（項目４）
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であって、該哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中の該マイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで該組成物を、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する、方法。
（項目５）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、方法。
（項目６）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、方法。
（項目７）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物の投与が、投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、方法。
（項目８）
項目１、３、または４に記載の方法であって、ここで該方法が、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を投与することを含む、方法。
（項目９）
項目１、３、または４に記載の方法であって、ここで前記組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団を再生する方法。
（項目１０）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が、注射可能な形態で投与される方法。
（項目１１）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が、インスリンと組み合わせて投与される方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記インスリンが、前記マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与される方法。
（項目１３）
新規発症または前臨床自己免疫性糖尿病を有する被験体において、残存ベータ細胞塊を保存する方法であって、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞塊を少なくとも約１５％まで維持する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、ここで該方法が、前記組成物の反復投与を含み、そして該反復投与が、前記哺乳動物の前記ベータ細胞塊を増加させる、方法。
（項目１５）
項目１、項目３、項目４、または項目１３に記載の方法であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗ 程度がオリゴヌクレオチドである方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記マイクロスフィア組成物中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
この説明の過程では、添付された図を参照するものであって、ここで：
【図１】図１ａおよび１ｂは、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンポリカチオンのマイクロスフィアの走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】図２ａおよび２ｂは、開示によるマイクロスフィア調製物の性質を示すグラフである。図２ａは、マイクロスフィア調製物のサイズ分布を示すグラフである。図２ｂは、マイクロスフィア調製物の表面電荷のグラフを示す。
【図３】図３は、マイクロスフィアの脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア、またはＰＢＳ媒体単独で処置した動物と比較した、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィア（ＡＳ−ＭＳＰ）で複数回処置したＮＯＤマウスにおける、糖尿病の予防を示すプロットである。
【図５】図５は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア、またはＰＢＳ媒体単独で処置した動物と比較した、本開示のＡＳ−ＭＳＰで１回処置したＮＯＤマウスにおける、糖尿病の予防を示すプロットである。
【図６】図６ａ−６ｄは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したか（図６ａおよびｃ；Ｈ＋Ｅ）、またはインスリンに関して染色した（図６ｂおよび６ｄ）、コントロールＮＯＤマウス由来の膵臓組織切片の光学顕微鏡写真である。
【図７】図７ａ−７ｄは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したか（図７ａおよびｃ；Ｈ＋Ｅ）、またはインスリンに関して染色した（図７ｂおよび７ｄ）、ＡＳ−ＭＳＰ処置ＮＯＤマウス由来の膵臓組織切片の光学顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本開示のＡＳ−ＭＳＰで処置したマウス、またはコントロール動物から得られたＴ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図９】図９は、本開示によって、ＡＳ−ＭＳＰで処置した動物由来であり、そして脾臓細胞と培養したＴ細胞の増殖を示す、相対蛍光強度（ＲＦＩ）のプロットを示す。
【図１０】図１０は、インビトロで、同系の照射脾臓細胞および卵白アルブミンの存在下で、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖を示すＲＦＩのプロットを示す。
【図１１】図１１は、インビトロで、同系膵島溶解物の存在下で、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖の抑制を示すＲＦＩのプロットを示す。
【図１２】図１２は、アンチセンスまたはスクランブルオリゴヌクレオチドを含むいずれかのマイクロスフィアで処置した、新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルのプロットである。
【図１３】図１３Ａは、新規発症糖尿病を有するマウスによる実験の予定表を示し、そして図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰまたはコントロールのいずれかで処置した新規発症糖尿病マウスの、平均血中グルコースレベルのプロットである。
【図１４Ａ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１５】自己免疫性糖尿病の治療的逆転を説明するモデル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
必要に応じて、本開示の詳細な実施態様を本明細書中で開示する。しかし、開示された実施態様は、開示の単なる例であり、様々な形式で具体化され得ることが理解される。従って、本明細書中で開示される特定の詳細は限定的と解釈されず、単に請求の基礎として、および実質的にあらゆる適当な方式で本開示を様々に採用することを当業者に教示するための代表的な基礎として解釈される。
【００２１】
１型糖尿病は、膵臓、および特に内分泌インスリン産生ベータ細胞の進行性の炎症が存在する自己免疫疾患である。発症前に、炎症は最初に内分泌ベータ細胞を機能不全にする。マイクロスフィア処方の単回注射は、ヒト自己免疫性（１型）糖尿病の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて疾患の発症をかなり遅らせる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、マイクロスフィアは、注射部位の常在性および遊走性樹状細胞によって取り込まれ、そして次いで疾患の発症前に近位のリンパ節に移動すると考えられる。処置されたレシピエントにおいて、インビトロで推定されるベータ細胞抗原に標的化されたＴ細胞の増殖の減少が起こるとも考えられる。同系Ｔ細胞および樹状細胞で再構築し、そしてマイクロスフィアを投与した、免疫欠損ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋推定Ｔ調節性細胞の普及率の増加が起こり得る。従って、マイクロスフィアに基づく治療的組成物は、樹状細胞活性を調節し、そして予防のために調節性ネットワークを動員し得る。
【００２２】
糖尿病の発症を予防する治療を有することが望ましい。かなりの数のベータ細胞が破壊された、臨床的発症後に、疾患を停止させるか、または逆転する治療的組成物を有することも望ましい。新規発症糖尿病マウスに対する反復投与は、高血糖を正常化し、そして疾患を逆転させる。逆転は、典型的には、ヒトまたは他の哺乳動物のような個体が、血中グルコースレベルのほぼ正常化を示すことを示す。いかなる特定の理論にも拘束されないが、「逆転」の間、疾患に誘発されたＴ細胞性炎症および細胞死は阻止される。
【００２３】
１つの実施態様は、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写物を標的とした、本明細書中で記載されたアンチセンス（ＡＳ）−オリゴヌクレオチドマイクロスフィアを処方および注射することによって、自己免疫性インスリン依存性糖尿病を逆転させる。転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の例が、この実施例において開示される。他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写物への結合に有効であるように設計して、本明細書中で記載される効果を達成し得ることが理解される。そのようなオリゴヌクレオチドは、チオエート化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、メチル化、およびメトキシエチル化を含むがこれらに限らない当該分野で公知の修飾を含み得ること、およびそのような修飾の位置および数は、最適な効果を達成するために変化し得ることも理解される。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫寛容を誘発するように設計され、それはＮＯＤマウスモデルにおいて、インスリン産生ベータ細胞の破壊の逆転を引き起こす。
【００２４】
１型糖尿病は、ＮＯＤマウスおよびヒトにおいて、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫性破壊によって起こる。臨床的発症時に、ヒトは、典型的には１０〜２０％またはそれより少ない残存ベータ細胞塊を有する。この残存塊をいくらかでも残すことが、グルコースレベルを調節するために適当なインスリンレベルの維持を引き起こし得る。それに加えて、ベータ細胞の破壊の逆転は、ベータ細胞集団の部分的な再生を引き起こし得る。本開示のオリゴヌクレオチドを含む微粒子を、ベータ細胞の自己免疫性破壊を阻害するために提供する。
【００２５】
樹状細胞（ＤＣ）を活性化して、全ての組織で見出され、そして皮膚の下に存在する、強力な抗原提示細胞にし得ることが認識される。これらの抗原提示樹状細胞は、特にリンパ節におけるＴ細胞の活性化によって、自己免疫反応を含む免疫反応のトリガーとして機能する。理論に拘束されることを望まないが、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６は、自己免疫反応に重要であると考えられ、そしてこれらの分子のダウンレギュレーションは、自己免疫の反応低下を促進すると考えられる。それに加えて、インターフェロンおよびインターロイキンのようなあるサイトカインが、反応低下の結果として抑制される。
【００２６】
マウスにおける自己免疫性糖尿病の治療に使用されるマイクロスフィアの作成において、１つ、２つまたは３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを水性溶液中に溶解し、そして水溶性のポリマーおよびポリカチオンと組み合わせ得る。その溶液を、典型的には約６０〜７０℃でインキュベートし、約２３℃に冷却し、そして過剰なポリマーを除去する。
【００２７】
その核酸は、典型的にはマイクロスフィアの約３０および約１００重量％の間を構成し、そして約５０ミクロンより小さい、典型的には約２０ミクロンより小さい平均粒子サイズを有し、そして約１０ミクロンより小さくあり得る。典型的には、それらを以下のように調製する。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの水性溶液を調製する。３つのオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを調製する場合、３つのオリゴヌクレオチド溶液からのアリコートを組み合わせる。各溶液は、これら３つのオリゴヌクレオチドの型の１つを含む。オリゴヌクレオチドを含む最終溶液は、典型的には約１０ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２８】
特定の実施例において、そのマイクロスフィア処方は、６５％、７０％、７５％。８０％、８５％、９０％ｗ／ｗまたはそれより多い量のオリゴヌクレオチドを含む。そのような実施態様において、その組成物は、６〜１０％ ｗ／ｗ のポリ−Ｌ−リシン含有量を有する。それに加えて、マイクロスフィアの水分含有量は変動し、そして約４％であり得る。オリゴヌクレオチドは、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比で存在する。
【００２９】
これらを、ポリカチオンの１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液のアリコートと組み合わせる。ポリカチオンの例は、ポリ−リシンおよびポリ−オルニチンである。他は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロラミン、プロタミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアルギニン、ビニルアミン、および陽性荷電キトサンのような陽性荷電多糖の誘導体、およびその組み合わせを含む。そのポリカチオン溶液は、約１：１から約４：１のポリカチオン：オリゴヌクレオチドの容積比であり得る。通常使用されるポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ（７０，０００ダルトンまで、Ｂａｃｈｅｍから入手可能）およびポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒ（例えば１１，９００ダルトン、Ｓｉｇｍａから入手可能）を含む。
【００３０】
ポリマー溶液も調製する。これらは、相分離増強剤として機能し得る。適当なポリマーの例は、直鎖状または分岐ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーを含む。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性、または水混和性溶媒に溶解性であり得る。ポリマーの例は、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００等のような、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポロクサマー１８８、プルロニックＦ１２７またはプルロニックＦ６８のような、様々な分子量のポロクサマーのような、薬剤学的に許容可能な添加物を含む。よく使用されるポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。別のポリマーは、ヒドロキシエチルデンプンである。他の両親媒性のポリマーも、単独または組み合わせて使用し得る。相分離増強剤はまた、プロピレングリコールおよびエタノールの混合物のような、非ポリマーであり得る。
【００３１】
典型的な実施態様において、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリエチレングリコールのポリマー溶液を調製し、そして他の溶液と組み合わせ得る。加熱、冷却、遠心、および複数回の洗浄が水性懸濁液を生じ、それを典型的には凍結および凍結乾燥して、オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンを含むマイクロスフィアの乾燥粉末を形成する。
【００３２】
そのマイクロスフィアは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、動脈内、関節内等を含む、注射可能な経路によるインビボ送達に適当である。実施し得る他の送達経路は、例えば局所、経口、直腸内、鼻腔内、肺、膣内、頬側、舌下、経皮、経粘膜、耳、または眼内を含む。
【００３３】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、本明細書中で例示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアは、細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６をダウンレギュレートすると考えられる。そのマイクロスフィアを注射し、そして樹状細胞がそのオリゴヌクレオチドマイクロスフィアを能動的に取り込むと考えられる。これらのオリゴヌクレオチドは、樹状細胞において、細胞表面細胞分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を抑制する。ＮＯＤマウスの発症後にこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィアを投与することは、糖尿病を有効に逆転させる。
【００３４】
以下の実施例は、開示をさらに説明するために、開示のある特徴および利点を説明する。実施例は、開示を制限しない、または他の点で限定しないと考えられる。
【実施例】
【００３５】
実施例１
ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物を標的とした３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを合成した。この実施例で使用したＡＳ−オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであり、アステリスクはバックボーンのチオエート化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）の部位を示す：
配列番号１：ＣＤ４０−ＡＳ：５’Ｃ＊ＡＣ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＧＡ＊ＧＧ＊Ｃ＊ＡＡ＊ＡＧＡ＊Ｃ＊ＡＣ＊ＣＡ＊Ｔ＊ＧＣ＊ＡＧ＊ＧＧ＊Ｃ＊Ａ−３’
配列番号２：ＣＤ８０−ＡＳ：５’−Ｇ＊ＧＧ＊ＡＡ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＡＧ＊ＧＡ＊ＡＴ＊ＣＴ＊ＡＧ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＡＡ＊ＴＧＧ＊Ａ−３’
配列番号３：ＣＤ８６−ＡＳ：５’−Ｔ＊ＧＧ＊ＧＴ＊ＧＣ＊ＴＴ＊ＣＣ＊ＧＴ＊ＡＡ＊ＧＴ＊ＴＣ＊ＴＧ＊ＧＡ＊ＡＣ＊ＡＣ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−３’
オリゴヌクレオチド混合物の水性溶液を、それぞれ１つの型のオリゴヌクレオチドを含む３つのオリゴヌクレオチド溶液のアリコートを組み合わせることによって調製して、３つの型のオリゴヌクレオチドの１０ｍｇ／ｍｌの溶液を形成した。脱イオン水中でポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒの１０ｍｇ／ｍｌの溶液（Ｂａｃｈｅｍ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡによる、７０，０００ダルトンまでのポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ）を調製した。ポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒを、１：１の容積比で、オリゴヌクレオチド溶液に加えた。その混合物を静かにボルテックスした。１２．５％のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、４０，０００ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）および１２．５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、３，３５０ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）をｐＨ５．５で１Ｍの酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）中に含む２５％のポリマー溶液を、以下のように２：１の容積比で加えた：０．７５ｍｌのＡＳ−オリゴヌクレオチド、０．７５ｍｌのポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ、３．０ｍｌのＰＥＧ／ＰＶＰ、および４．５０ｍｌの全容積。
【００３６】
そのバッチを７０℃で３０分間インキュベートし、そして次いで２３℃に冷却した。冷却時、その溶液は濁り、そしてマイクロスフィアが形成された。次いで懸濁液を遠心し、そして過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを除去した。ペレットを脱イオン水に再懸濁し、続いて遠心および上清を除去することによって、できたペレットを洗浄した。洗浄プロセスを３回繰り返した。水性懸濁液を凍結および凍結乾燥して、オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンを含むマイクロスフィアの乾燥粉末を形成した。
【００３７】
図１ａおよびｂは、２つの異なる倍率における、１：１のポリ−Ｌ−リシン：オリゴヌクレオチド比のマイクロスフィアの、代表的な走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。０．５〜４μｍの大きさで、約２．５μｍの平均粒子サイズのマイクロスフィアを作成した。図２ａは、レーザー光散乱によって明らかになった、本開示によって作成したマイクロスフィアの１つの調製物のサイズ分布を示す。図２ｂは、光散乱による、マイクロスフィア調製物の表面電荷の決定を示す（ゼータ電位）。図３は、添加を定量するために、および脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のマイクロスフィアのアンチセンスオリゴヌクレオチド成分の完全性を評価するために使用した逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを示す。マイクロスフィアを、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ；ＭＷ３０−７０ｋＤ）を用いて処方した。次いでマイクロスフィアを、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）による、ＰＬＬからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの競合的置換を用いて脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｅ）した。ＰＡＡを、２６０ｎｍで吸収せず、そして２６０ｎｍにおけるオリゴヌクレオチドの定量に干渉しないポリアミノ酸試薬として選択した。図３のようなＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルにおいて、各ピーク下面積は、マイクロスフィアに添加された各オリゴヌクレオチドの量に比例する。図３に示すように、ピーク高は、各オリゴヌクレオチドのマイクロスフィアへのほぼ等量の添加を示す。オリゴヌクレオチドのマイクロスフィアへの添加を、重量によって約６５％から約８０％であると計算した。図３はまた、脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のピークの狭い分布によって示されるように、オリゴヌクレオチドの完全性は、マイクロスフィア処方プロセスによって影響を受けなかったことを示す。
【００３８】
実施例２
この実施例において、本開示の予防の局面をカバーする試験の結果を示す。図４に示すように、５〜８週齢におけるＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの単回投与は、糖尿病の発症を遅らせる。２グループのＮＯＤメスマウス（５〜８週齢）に、本開示のマイクロスフィアに処方されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＭＳＰ）の単回皮下注射をした。各アンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０、および抗ＣＤ８６）の１：１：１混合物を５０μｇ含むと考えられる量で、処方を注射した。他のグループのマウスに、スクランブル配列のマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳ媒体（コントロールＮＯＤ）を注射した。尾静脈穿刺によって週１回血中グルコースを測定した。２回続けて＞２８０〜３００ｍｇ／ｄＬを測定した後、糖尿病を確認した。図４は、２つの独立に処置したコホートの累積生存率を示す。
【００３９】
図５は、５〜８週齢におけるＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの複数回投与が、糖尿病の発症を予防することを示す。ＮＯＤメスマウス（５〜８週齢）に、本開示によるマイクロスフィアに処方されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを８回連続で単回皮下注射した（週１回）。注射（各アンチセンスオリゴヌクレオチドの１：１：１混合物またはスクランブルオリゴヌクレオチドを５０μｇ）を、週１回８週間与え、そして１３週で終了した。他のグループのマウスに、スクランブル配列のマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳ媒体（コントロールＮＯＤ）を注射した。図５は、処置した動物の累積生存率を示す。
【００４０】
図６ａおよび６ｂは、処置を受けず、そして従って自然に自己免疫病に進行したマウス（糖尿病ＮＯＤマウス）由来の、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した（Ｈ＋Ｅ；図６ａ）、またはインスリンに関して染色した（図６ｂ）膵臓組織の切片を示す。図６ｃおよび６ｄは、ＳＣＲ−ＭＳＰ処方で処置したマウス由来の膵臓組織の切片を示す（注射を特異的ＡＳ−ＭＳＰで処置したグループと平行して開始した）。これらの切片も、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図６ｃ）またはインスリンに関して染色した（図６ｄ）。ＳＣＲ−ＭＳＰマウスは全て糖尿病を発症した。
【００４１】
図７ａおよび７ｂは、８週齢より若い時に処置し（予防モデル）、そして本開示のアンチセンスマイクロスフィアで処置したマウス由来の、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ａ）またはインスリンに関して染色した（図７ｂ）、膵臓組織の切片を示す。
【００４２】
図８に示すように、ＡＳ−ＭＳＰ処置ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋推定Ｔｒｅｇ細胞の普及率の増加を示す。図８Ａは、ＦＡＣＳ分析に使用したゲーティングを示す。図８Ｂは、脾臓から濃縮されたＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、そして図８ＣはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節由来、またはスクランブル配列マイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）で処置した、またはＰＢＳ媒体で処置した動物由来のパーセンテージを示す。
【００４３】
図９は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞は、同種脾臓細胞と同時培養した場合に増殖することを示す。ＡＳＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞を、濃縮カラムから得て、そしてＢａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ６または同系非糖尿病ＮＯＤマウス（１０週齢）由来のγ線照射した脾臓細胞と同時培養した。Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を用いて、４日後に増殖を測定した。Ｓｐｌは、同種照射脾臓細胞を指す。
【００４４】
図１０に示すように、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、インビトロにおいて同系照射脾臓細胞および卵白アルブミンの存在下で増殖する。Ｔ細胞を脾臓から、またはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節から濃縮した。
【００４５】
図１１は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、インビトロで、同系膵島溶解物の存在下で、増殖の抑制を示すことを示す。図４で記載したように、Ｔ細胞を脾臓から、またはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節から濃縮した。照射ＮＯＤ脾臓細胞（非糖尿病１０週齢ＮＯＤマウス由来）を、抗原提示細胞として使用し、そして平行培養にＮＩＴ−１溶解物（１μｇ／ウェル）（またはＰＢＳ媒体）を適用した。
【００４６】
最終的な糖尿病抑制治療のヒト試験への転換に関する主な懸念は、その治療アプローチの抗原特異性（そして従って細胞特異性）、およびその治療が、全体的および非特異的な抑制を与えるかどうかである。これらの問題に取り組むために、図４に示したコホートから、ランダムに選択した非糖尿病マウスを、安楽死させて、同種抗原、ノミナル抗原（完全な卵白アルブミンの形態で）、およびＮＯＤ由来インスリノーマ細胞系統ＮＩＴ−１の細胞溶解物の形態の同系ベータ細胞由来抗原に対する、脾臓およびリンパ節Ｔ細胞の増殖を確認した。インスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、機構的および目的論的な関与を有する、見込みのある候補自己抗原であるが、自己抗原を惹起する性質はまだ明らかでない。それにも関わらず、それはベータ細胞にあると考えるのが妥当である。従って、ＮＯＤインスリノーマから得られるＮＩＴ−１細胞系統を、ＡＳ−ＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の同時培養において、ベータ細胞抗原の供給源として使用して、抗原特異的反応低下の可能性を決定した。これらの研究から、ノミナルおよび同種抗原に対するＴ細胞増殖は維持されるが、ＮＩＴ−１細胞溶解物との同時培養においてＴ細胞の増殖低下があることが観察された。
【００４７】
さらに、同時培養上清におけるサイトカインプロファイルを確認して、発明者らは、ＮＩＴ−１溶解物の存在下でさえ、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞によるＴＮＦα産生の有意な減少を観察した。ＩＦＮγの産生は、ＡＳ−ＭＳＰ処置マウス由来のＴ細胞の同時培養においてわずかに減少したが、ＮＩＴ−１溶解物存在下におけるＰＢＳ処置マウス由来のＴ細胞との同時培養と統計学的に区別できなかった。最後に、そのアッセイは、上清中にＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＧＦβの存在を検出できなかった。
【００４８】
実施例３
アンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィアの、早期発症ＮＯＤマウスにおける糖尿病の症状を逆転させる能力も試験した。これらの実験の予定表を図１３Ａに示す。早期発症したＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを試験し、そして４００ｍｇ／ｄＬより高い血中グルコースレベルを有する動物を同定することによって選択した。選択した動物に、インスリンペレットを与えて、血中グルコースレベルを３００ｍｇ／ｄＬより低くまで正常化した。インスリンをやめ、そしてマイクロスフィアの一連の非経口注射を開始した。６匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを週２回注射した。さらに１０匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６に向けられていないスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフィアを注射した。両方のグループの動物の各注射は、１００μｌの注射溶液中、マイクロスフィア中に５０μｇのオリゴヌクレオチドを含んでいた。スクランブルグループの動物のうち２匹を、肉体的状態が悪いため、実験の前および終わりに安楽死させた。注射プロトコールの開始後、血中グルコースレベルを１週間に２回サンプリングした。動物は実験の間、非絶食であった。結果を図１２にプロットし、ここでインジケーター（１）は、インスリンペレットの設置を示し、そしてインジケーター（２）は、インスリンペレットの除去および週２回のＭＳＰ注射の開始を示す。図１２で報告された最高血中グルコース値は、７００ｍｇ／ｄＬであり、それは使用した計器の最高の示度であり、７００ｍｇ／ｄＬのデータポイントは、７００ｍｇ／ｄＬまたはそれより高い血中グルコース示度を示すことが理解されることに注意する。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフィア（ＡＳＭＳＰ１からＡＳＭＳＰ６）を投与されたグループの全ての動物は、スクランブルオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィア（ＳＣＲＭＳＰ１からＳＣＲＭＳＰ１０）を投与された動物より、有意に低いグルコースレベルを示した。さらに、このＡＳＭＳＰグループの６匹の動物のうち４匹は、典型的には糖尿病発症の閾値指標と考えられる、４００ｍｇ／ｄＬより低い血中グルコースレベルを示した。
【００４９】
図１３Ａにおいて、実験の予定表を示す。各グループの、平均非空腹時血中グルコース（図１３Ｂ）および平均空腹時血中グルコースレベルをプロットした（図１３Ｃ）（＋／−ＳＥＭ）。図１３Ａに示すように、何匹かのマウスにおいて、ＡＳＭＳＰ投与をやめた。図１３Ｂおよび１３Ｃにおいて示すように、新規発症糖尿病ＮＯＤメスマウスに対する複数回のＡＳ−ＭＳＰ投与は、未処置の動物（コントロール）、ＰＢＳで処置した動物、またはスクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）で処置した動物と比較して、血中グルコースレベルを改善し、そしてＡＳ−ＭＳＰ中止後でさえ安定な空腹時正常血糖を生じる。
【００５０】
図７ｃおよび７ｄは、糖尿病の発症後にアンチセンス処方で処置し、そして疾患の逆転を示したＮＯＤマウス由来の膵臓組織の切片を示す。切片を、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ｃ）またはインスリンに関して染色（図７ｄ）した。
【００５１】
３つの異なるＡＳ−オリゴヌクレオチドを、ＰＲＯＭＡＸＸマイクロスフィアに組み込み得、そしてそのようなマイクロスフィアを、免疫調節性樹状細胞の誘導によって、新規発症自己免疫性糖尿病を予防および／または逆転するための組成物として使用し得る。実際、その組成物の単回注射は、疾患の発症を遅らせ、そして新規発症糖尿病マウスへの反復投与は、高血糖を正常化し、疾患の逆転を示唆した。これらの研究において、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬ以下に低下するまで、インスリンを毎日投与した。次いでインスリンを中止し、そこでＡＳ−ＭＳＰを皮下投与した。代表的な投与レジメにおいて、動物に体重１ｋｇあたり２ｍｇのＡＳ−ＭＳＰを１週間に２回、３〜４週間投与した。非糖尿病マウスをモニターした。
【００５２】
図１４Ａ〜１４Ｃにおいて、ＮＯＤマウスに対するＡＳ−ＭＳＰの投与は、当該マウスの血中グルコースレベルを正常レベルに戻し、そしてその当該血中グルコースレベルの正常化は、延長した期間維持されることを示す。図１４Ｂおよび図１４Ｃにおいて示すように、ＡＳ−ＭＳＰを、インスリン投与を中止した後０〜３０日の間に投与した。血中グルコースレベルは、インスリン中止後１５日までに正常に戻り、そしてモニター期間の終わり（５５日）まで正常レベルで維持された。
【００５３】
自己免疫性糖尿病の治療的逆転の影響を示す図を、図１５に示す。ＰＲＯＭＡＸＸ治療薬を、図１５に示す新規発症「ハネムーン期」に投与した場合、機能的なままである１０〜２０％のベータ細胞の保存が予測され、それによって糖尿病のコントロールを導き、そして患者のインスリンに対する依存を抑制する。
【００５４】
記載された本開示の実施態様は、本開示の原理の適用のいくつかの説明であることが理解される。本開示の真の意図および範囲から離れることなく、当業者によって多くの修飾がなされ得る。本明細書中で記載される様々な特徴を、あらゆる組み合わせで使用され得、そして本明細書中で明確に概略を述べた正確な組み合わせに制限されるものではない。
（配列表）
【数１】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年８月４日に出願された米国仮特許出願第６０／８３５，７４２号および２００６年１１月８日に出願された同第６０／８６４，９１４号の優先権の利益を主張するものである。前記出願のそれぞれの全ての文言が、本明細書中に参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は一般的に、ＮＯＤマウスにおいて自己免疫性糖尿病状態を予防する、および／または逆転させるためのアンチセンスアプローチに関連する。これは、特に非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、負の調節活性を引き起こす治療効果を達成するために、注射によるＡＳ−オリゴヌクレオチドのマイクロスフィア送達を含む。該マイクロスフィアを、完全に水性の条件を用いて作成し、該マイクロスフィアは１つまたはそれ以上のアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドを組み込む。
【０００３】
微粒子、マイクロスフィア、およびマイクロカプセルは、１ミリメートルより小さい直径を有する固体または半固体粒子であり、そしてそれは１００ミクロンより小さくあり得、それを合成ポリマー、タンパク質、および多糖を含む様々な材料から形成し得る。マイクロスフィアは、多くの異なる適用において、主に分離、診断、および薬剤送達において使用されてきた。
【０００４】
合成ポリマー、天然ポリマー、タンパク質、および多糖からこれらの粒子を作成するために、相分離、溶媒蒸発、乳化、およびスプレー乾燥を含む、多くの異なる技術を使用し得る。一般的に、該ポリマーがこれらのマイクロスフィアの支持構造を形成し、そして関心のある薬剤が該ポリマー構造に組み込まれる。マイクロスフィアの形成に使用される代表的なポリマーは、ホモポリマーおよびＲｕｉｚに対する特許文献１、Ｒｅｉｄらに対する特許文献２、Ｔｉｃｅらに対する特許文献３、Ｔｉｃｅらに対する特許文献４、Ｔｉｃｅらに対する特許文献５、Ｓｉｎｇｈらに対する特許文献６、Ｂｏｙｅｓらに対する特許文献７、Ｔｉｃｅらに対する特許文献８、およびＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対する特許文献９において記載されたような、乳酸およびグリコール酸のコポリマー（ＰＬＧＡ）；Ｉｌｌｕｍに対する特許文献１０において記載されたような、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）９０８およびポロクサマー４０７のようなブロックコポリマー；およびＣｏｈｅｎに対する特許文献１１において記載されたようなポリホスファゼンを含む。これらのようなポリマーを用いて産生されたマイクロスフィアは、低い装填効率を示し、そして多くの場合低いパーセンテージの関心のある薬剤しかポリマー構造に組み込むことができない。従って、多くの場合、治療効果を達成するために、かなりの量のこれらの型のマイクロスフィアを投与しなければならない。それに加えて、これらのポリマーは典型的には疎水性であり、関心のある薬剤の溶解に負の影響を与える。この関係で典型的に使用されるポリマーは、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含む。
【０００５】
医療界の目的は、糖尿病を含む様々な疾患の治療のために、核酸を動物の細胞へ送達することである。多くのアプローチにおいて、トランスフェクション薬剤の添加によって、比較的効率的に、核酸を培養中の細胞に（インビトロで）送達し得る。それに加えて、インビボにおいて、核酸を動物に送達する場合、内因性ヌクレアーゼの存在が、高率の核酸の分解を引き起こす。
【０００６】
核酸をヌクレアーゼ消化から守ることに加えて、核酸送達媒体は、低い毒性を示さなければならず、細胞によって効率的に取り込まれなければならず、そしてよく規定された、容易に製造される処方を有する。臨床試験において示されたように、送達のためのウイルスベクターは、インビボにおいて、非常に有害な、致死的でさえある免疫反応を引き起こし得る。それに加えて、この方法は、インビボにおいて変異原性作用を有する可能性がある。異なる処方の脂質複合体（リポソームまたは陽イオン性脂質複合体のような）中で核酸を複合体化することによる送達は、毒性作用を有し得る。核酸の、様々なポリマーまたはペプチドとの複合体は、一致しない結果を示し、そしてこれらの処方の毒性はまだ解決していない。核酸はまた、送達のためにポリマーマトリックスに封入されたが、これらの場合、粒子は広いサイズ範囲を有し、そして治療的適用の有効性はまだ示されていない。そのような以前のアプローチは、本明細書中で望まれるゴールと反対の免疫系の刺激を含む、効果を生じ得る。例えば、ＰＬＧＡを粒子に組み込む場合、免疫系はＰＬＧＡの存在によって刺激される。
【０００７】
従って、核酸の送達における問題に取り組む必要性が存在し、そしてマイクロスフィアおよびマイクロスフィアを作成する新規方法の開発に対する継続する必要性が存在する。マイクロスフィアに関する詳細、特にその調製および性質に関する詳細は、Ｓｃｏｔｔらに対する特許文献１２、Ｗｏｉｓｚｗｉｌｌｏらに対する特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、および特許文献１６、およびＷｏｉｓｚｗｉｌｌｏに対する特許文献１７、およびＢｒｏｗｎらに対する特許文献１８において見出される。本明細書中で同定された、これらおよび全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，２１３，８１２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４１７，９８６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５３０，８４０号明細書
【特許文献４】米国特許第４，８９７，２６８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０７５，１０９号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１０２，８７２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３８４，１３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６０，６１０号明細書
【特許文献９】欧州特許申請公開番号２４８，５３１明細書
【特許文献１０】米国特許第４，９０４，４７９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１４９，５４３号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，４５８，３８７号明細書
【特許文献１３】第６，２６８，０５３号明細書
【特許文献１４】第６，０９０，９２５号明細書
【特許文献１５】第５，９８１，７１９号明細書
【特許文献１６】第５，５９９，７１９号明細書
【特許文献１７】第５，５７８，７０９号明細書
【特許文献１８】米国特許申請公開第２００６／００２４２４０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示によって、オリゴヌクレオチドをマイクロスフィアとして送達する。そのような送達アプローチは、ヌクレアーゼがマイクロスフィア内の核酸に近づくことを妨げると考えられる。アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドのマイクロスフィア送達を、特にＮＯＤマウスモデルにおいて、樹状細胞寛容を誘導するために行う。該マイクロスフィアは、アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドが組み込まれるような水性条件を用いて作成する。これらのマイクロスフィアを使用して、遺伝子発現を阻害し、そしてインビボにおいてＮＯＤマウスで自己免疫性糖尿病状態を予防および／または逆転させる。
【００１０】
開示の１つの局面において、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６転写物を標的とした３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを合成し、そしてそのオリゴヌクレオチド混合物の水性溶液を調製し、そして水性ポリマー溶液と組み合わせる。オリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアが形成され、そしてこれらを注射によってＮＯＤマウスに送達する。
【００１１】
開示の１つの局面において、マイクロスフィア組成物を投与することを含む、哺乳動物において１型糖尿病を逆転させる方法を提供し、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドを、配列番号１、配列番号２、または配列番号３およびその組み合わせ、またはさらにＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を標的とするあらゆる他のオリゴヌクレオチドから成るグループから選択し得る。
【００１２】
開示の別の局面は、哺乳動物にマイクロスフィア組成物を注射することを含む、哺乳動物の膵臓のベータ細胞を、自己免疫性の破壊から保護する方法に向けられ、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
別の局面は、哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含む、哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であり、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここでその組成物を、哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する。より規定された局面において、その組成物を、１型糖尿病の臨床的発症の後に投与する。別の局面において、その組成物を、１型糖尿病の臨床的発症の前に投与する。これらの治療的局面において、その組成物の投与は、投与前の哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する。
【００１４】
前記組成物の投与は、哺乳動物のベータ細胞集団を再生し得るか、またはベータ細胞集団のさらなる劣化を停止させ得るか、またはその両方であり得る。
【００１５】
前記組成物を、あらゆる形式で投与し得、そしてある代表的な局面において、注射可能な形態で投与する。特定の局面において、該組成物を、インスリンと組み合わせて投与する。併用療法を使用する場合、インスリンを、マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与し得る。
【００１６】
さらなる局面は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を被験体に投与することを含む、新規発症または前臨床自己免疫性糖尿病を有する被験体において、残存ベータ細胞塊を保存する方法に向けられ、ここでその組成物の投与は、哺乳動物のベータ細胞塊を、糖尿病の発症前に存在した塊の少なくとも約１５％まで維持する。その被験体はヒト被験体であり得る。その被験体は、ヒト子供であり得る。その治療方法は、組成物の反復投与を含み得、そしてその反復投与は、哺乳動物のベータ細胞塊を増加させる。
【００１７】
特に規定された方法において、マイクロスフィアの３０％および７０％ｗ／ｗ程度がオリゴヌクレオチドである。そのような組成物は、典型的には、マイクロスフィア組成物中に、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比で含み得る。
【００１８】
様々な組み合わせを含む、本開示のこれらおよび他の局面、目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明の考察によって明らかとなり、そして明確に理解される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物において１型糖尿病を逆転させるためのプロセスであって、マイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびそれらの組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む、プロセス。
（項目２）
項目１に記載のプロセスであって、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、プロセス。
（項目３）
哺乳動物の膵臓のベータ細胞を自己免疫性の破壊から保護するプロセスであって、前記哺乳動物中にマイクロスフィア組成物を注射する工程を含み、ここで組成物中のマイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびそれらの組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含む、プロセス。
（項目４）
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であって、該哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中の該マイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで該組成物を、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する、方法。
（項目５）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、方法。
（項目６）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、方法。
（項目７）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物の投与が、投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、方法。
（項目８）
項目１、３、または４に記載の方法であって、ここで該方法が、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を投与することを含む、方法。
（項目９）
項目１、３、または４に記載の方法であって、ここで前記組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団を再生する方法。
（項目１０）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が、注射可能な形態で投与される方法。
（項目１１）
項目１、３、または４に記載の方法であって、前記組成物が、インスリンと組み合わせて投与される方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記インスリンが、前記マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与される方法。
（項目１３）
新規発症または前臨床自己免疫性糖尿病を有する被験体において、残存ベータ細胞塊を保存する方法であって、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを含む組成物を該被験体に投与することを含み、ここで該組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞塊を少なくとも約１５％まで維持する、方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法であって、ここで該方法が、前記組成物の反復投与を含み、そして該反復投与が、前記哺乳動物の前記ベータ細胞塊を増加させる、方法。
（項目１５）
項目１、項目３、項目４、または項目１３に記載の方法であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗ 程度がオリゴヌクレオチドである方法。
（項目１６）
項目１５に記載の方法であって、前記マイクロスフィア組成物中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
この説明の過程では、添付された図を参照するものであって、ここで：
【図１】図１ａおよび１ｂは、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンポリカチオンのマイクロスフィアの走査型電子顕微鏡写真である。
【図２】図２ａおよび２ｂは、開示によるマイクロスフィア調製物の性質を示すグラフである。図２ａは、マイクロスフィア調製物のサイズ分布を示すグラフである。図２ｂは、マイクロスフィア調製物の表面電荷のグラフを示す。
【図３】図３は、マイクロスフィアの脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】図４は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア、またはＰＢＳ媒体単独で処置した動物と比較した、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィア（ＡＳ−ＭＳＰ）で複数回処置したＮＯＤマウスにおける、糖尿病の予防を示すプロットである。
【図５】図５は、スクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア、またはＰＢＳ媒体単独で処置した動物と比較した、本開示のＡＳ−ＭＳＰで１回処置したＮＯＤマウスにおける、糖尿病の予防を示すプロットである。
【図６】図６ａ−６ｄは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したか（図６ａおよびｃ；Ｈ＋Ｅ）、またはインスリンに関して染色した（図６ｂおよび６ｄ）、コントロールＮＯＤマウス由来の膵臓組織切片の光学顕微鏡写真である。
【図７】図７ａ−７ｄは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色したか（図７ａおよびｃ；Ｈ＋Ｅ）、またはインスリンに関して染色した（図７ｂおよび７ｄ）、ＡＳ−ＭＳＰ処置ＮＯＤマウス由来の膵臓組織切片の光学顕微鏡写真である。
【図８】図８は、本開示のＡＳ−ＭＳＰで処置したマウス、またはコントロール動物から得られたＴ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図９】図９は、本開示によって、ＡＳ−ＭＳＰで処置した動物由来であり、そして脾臓細胞と培養したＴ細胞の増殖を示す、相対蛍光強度（ＲＦＩ）のプロットを示す。
【図１０】図１０は、インビトロで、同系の照射脾臓細胞および卵白アルブミンの存在下で、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖を示すＲＦＩのプロットを示す。
【図１１】図１１は、インビトロで、同系膵島溶解物の存在下で、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の増殖の抑制を示すＲＦＩのプロットを示す。
【図１２】図１２は、アンチセンスまたはスクランブルオリゴヌクレオチドを含むいずれかのマイクロスフィアで処置した、新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルのプロットである。
【図１３】図１３Ａは、新規発症糖尿病を有するマウスによる実験の予定表を示し、そして図１３Ｂおよび図１３Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰまたはコントロールのいずれかで処置した新規発症糖尿病マウスの、平均血中グルコースレベルのプロットである。
【図１４Ａ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ−Ｃは、ＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示す。これらの図は、ＡＳ−ＭＳＰの投与時に、哺乳動物の血中グルコースレベルが１５日以内に正常に戻り（正常レベルを約２００ｍｇ／ｄＬにおける点線によって示す）、そしてＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した後でも（３０日目）正常に維持されることを示す。
【図１５】自己免疫性糖尿病の治療的逆転を説明するモデル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
必要に応じて、本開示の詳細な実施態様を本明細書中で開示する。しかし、開示された実施態様は、開示の単なる例であり、様々な形式で具体化され得ることが理解される。従って、本明細書中で開示される特定の詳細は限定的と解釈されず、単に請求の基礎として、および実質的にあらゆる適当な方式で本開示を様々に採用することを当業者に教示するための代表的な基礎として解釈される。
【００２１】
１型糖尿病は、膵臓、および特に内分泌インスリン産生ベータ細胞の進行性の炎症が存在する自己免疫疾患である。発症前に、炎症は最初に内分泌ベータ細胞を機能不全にする。マイクロスフィア処方の単回注射は、ヒト自己免疫性（１型）糖尿病の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて疾患の発症をかなり遅らせる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、マイクロスフィアは、注射部位の常在性および遊走性樹状細胞によって取り込まれ、そして次いで疾患の発症前に近位のリンパ節に移動すると考えられる。処置されたレシピエントにおいて、インビトロで推定されるベータ細胞抗原に標的化されたＴ細胞の増殖の減少が起こるとも考えられる。同系Ｔ細胞および樹状細胞で再構築し、そしてマイクロスフィアを投与した、免疫欠損ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋推定Ｔ調節性細胞の普及率の増加が起こり得る。従って、マイクロスフィアに基づく治療的組成物は、樹状細胞活性を調節し、そして予防のために調節性ネットワークを動員し得る。
【００２２】
糖尿病の発症を予防する治療を有することが望ましい。かなりの数のベータ細胞が破壊された、臨床的発症後に、疾患を停止させるか、または逆転する治療的組成物を有することも望ましい。新規発症糖尿病マウスに対する反復投与は、高血糖を正常化し、そして疾患を逆転させる。逆転は、典型的には、ヒトまたは他の哺乳動物のような個体が、血中グルコースレベルのほぼ正常化を示すことを示す。いかなる特定の理論にも拘束されないが、「逆転」の間、疾患に誘発されたＴ細胞性炎症および細胞死は阻止される。
【００２３】
１つの実施態様は、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写物を標的とした、本明細書中で記載されたアンチセンス（ＡＳ）−オリゴヌクレオチドマイクロスフィアを処方および注射することによって、自己免疫性インスリン依存性糖尿病を逆転させる。転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の例が、この実施例において開示される。他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写物への結合に有効であるように設計して、本明細書中で記載される効果を達成し得ることが理解される。そのようなオリゴヌクレオチドは、チオエート化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、メチル化、およびメトキシエチル化を含むがこれらに限らない当該分野で公知の修飾を含み得ること、およびそのような修飾の位置および数は、最適な効果を達成するために変化し得ることも理解される。これらのオリゴヌクレオチドは、免疫寛容を誘発するように設計され、それはＮＯＤマウスモデルにおいて、インスリン産生ベータ細胞の破壊の逆転を引き起こす。
【００２４】
１型糖尿病は、ＮＯＤマウスおよびヒトにおいて、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫性破壊によって起こる。臨床的発症時に、ヒトは、典型的には１０〜２０％またはそれより少ない残存ベータ細胞塊を有する。この残存塊をいくらかでも残すことが、グルコースレベルを調節するために適当なインスリンレベルの維持を引き起こし得る。それに加えて、ベータ細胞の破壊の逆転は、ベータ細胞集団の部分的な再生を引き起こし得る。本開示のオリゴヌクレオチドを含む微粒子を、ベータ細胞の自己免疫性破壊を阻害するために提供する。
【００２５】
樹状細胞（ＤＣ）を活性化して、全ての組織で見出され、そして皮膚の下に存在する、強力な抗原提示細胞にし得ることが認識される。これらの抗原提示樹状細胞は、特にリンパ節におけるＴ細胞の活性化によって、自己免疫反応を含む免疫反応のトリガーとして機能する。理論に拘束されることを望まないが、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６は、自己免疫反応に重要であると考えられ、そしてこれらの分子のダウンレギュレーションは、自己免疫の反応低下を促進すると考えられる。それに加えて、インターフェロンおよびインターロイキンのようなあるサイトカインが、反応低下の結果として抑制される。
【００２６】
マウスにおける自己免疫性糖尿病の治療に使用されるマイクロスフィアの作成において、１つ、２つまたは３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを水性溶液中に溶解し、そして水溶性のポリマーおよびポリカチオンと組み合わせ得る。その溶液を、典型的には約６０〜７０℃でインキュベートし、約２３℃に冷却し、そして過剰なポリマーを除去する。
【００２７】
その核酸は、典型的にはマイクロスフィアの約３０および約１００重量％の間を構成し、そして約５０ミクロンより小さい、典型的には約２０ミクロンより小さい平均粒子サイズを有し、そして約１０ミクロンより小さくあり得る。典型的には、それらを以下のように調製する。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの水性溶液を調製する。３つのオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを調製する場合、３つのオリゴヌクレオチド溶液からのアリコートを組み合わせる。各溶液は、これら３つのオリゴヌクレオチドの型の１つを含む。オリゴヌクレオチドを含む最終溶液は、典型的には約１０ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２８】
特定の実施例において、そのマイクロスフィア処方は、６５％、７０％、７５％。８０％、８５％、９０％ｗ／ｗまたはそれより多い量のオリゴヌクレオチドを含む。そのような実施態様において、その組成物は、６〜１０％ ｗ／ｗ のポリ−Ｌ−リシン含有量を有する。それに加えて、マイクロスフィアの水分含有量は変動し、そして約４％であり得る。オリゴヌクレオチドは、１：１：１のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比で存在する。
【００２９】
これらを、ポリカチオンの１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液のアリコートと組み合わせる。ポリカチオンの例は、ポリ−リシンおよびポリ−オルニチンである。他は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロラミン、プロタミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアルギニン、ビニルアミン、および陽性荷電キトサンのような陽性荷電多糖の誘導体、およびその組み合わせを含む。そのポリカチオン溶液は、約１：１から約４：１のポリカチオン：オリゴヌクレオチドの容積比であり得る。通常使用されるポリカチオンは、ポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ（７０，０００ダルトンまで、Ｂａｃｈｅｍから入手可能）およびポリ−Ｌ−オルニチン・ＨＢｒ（例えば１１，９００ダルトン、Ｓｉｇｍａから入手可能）を含む。
【００３０】
ポリマー溶液も調製する。これらは、相分離増強剤として機能し得る。適当なポリマーの例は、直鎖状または分岐ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーを含む。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性、または水混和性溶媒に溶解性であり得る。ポリマーの例は、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００等のような、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポロクサマー１８８、プルロニックＦ１２７またはプルロニックＦ６８のような、様々な分子量のポロクサマーのような、薬剤学的に許容可能な添加物を含む。よく使用されるポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。別のポリマーは、ヒドロキシエチルデンプンである。他の両親媒性のポリマーも、単独または組み合わせて使用し得る。相分離増強剤はまた、プロピレングリコールおよびエタノールの混合物のような、非ポリマーであり得る。
【００３１】
典型的な実施態様において、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリエチレングリコールのポリマー溶液を調製し、そして他の溶液と組み合わせ得る。加熱、冷却、遠心、および複数回の洗浄が水性懸濁液を生じ、それを典型的には凍結および凍結乾燥して、オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンを含むマイクロスフィアの乾燥粉末を形成する。
【００３２】
そのマイクロスフィアは、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、動脈内、関節内等を含む、注射可能な経路によるインビボ送達に適当である。実施し得る他の送達経路は、例えば局所、経口、直腸内、鼻腔内、肺、膣内、頬側、舌下、経皮、経粘膜、耳、または眼内を含む。
【００３３】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、本明細書中で例示されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアは、細胞表面分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６をダウンレギュレートすると考えられる。そのマイクロスフィアを注射し、そして樹状細胞がそのオリゴヌクレオチドマイクロスフィアを能動的に取り込むと考えられる。これらのオリゴヌクレオチドは、樹状細胞において、細胞表面細胞分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を抑制する。ＮＯＤマウスの発症後にこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィアを投与することは、糖尿病を有効に逆転させる。
【００３４】
以下の実施例は、開示をさらに説明するために、開示のある特徴および利点を説明する。実施例は、開示を制限しない、または他の点で限定しないと考えられる。
【実施例】
【００３５】
実施例１
ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物を標的とした３つのＡＳ−オリゴヌクレオチドを合成した。この実施例で使用したＡＳ−オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであり、アステリスクはバックボーンのチオエート化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）の部位を示す：
配列番号１：ＣＤ４０−ＡＳ：５’Ｃ＊ＡＣ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＧＡ＊ＧＧ＊Ｃ＊ＡＡ＊ＡＧＡ＊Ｃ＊ＡＣ＊ＣＡ＊Ｔ＊ＧＣ＊ＡＧ＊ＧＧ＊Ｃ＊Ａ−３’
配列番号２：ＣＤ８０−ＡＳ：５’−Ｇ＊ＧＧ＊ＡＡ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＡＧ＊ＧＡ＊ＡＴ＊ＣＴ＊ＡＧ＊ＡＧ＊ＣＣ＊ＡＡ＊ＴＧＧ＊Ａ−３’
配列番号３：ＣＤ８６−ＡＳ：５’−Ｔ＊ＧＧ＊ＧＴ＊ＧＣ＊ＴＴ＊ＣＣ＊ＧＴ＊ＡＡ＊ＧＴ＊ＴＣ＊ＴＧ＊ＧＡ＊ＡＣ＊ＡＣ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ−３’
オリゴヌクレオチド混合物の水性溶液を、それぞれ１つの型のオリゴヌクレオチドを含む３つのオリゴヌクレオチド溶液のアリコートを組み合わせることによって調製して、３つの型のオリゴヌクレオチドの１０ｍｇ／ｍｌの溶液を形成した。脱イオン水中でポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒの１０ｍｇ／ｍｌの溶液（Ｂａｃｈｅｍ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡによる、７０，０００ダルトンまでのポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ）を調製した。ポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒを、１：１の容積比で、オリゴヌクレオチド溶液に加えた。その混合物を静かにボルテックスした。１２．５％のＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、４０，０００ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）および１２．５％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、３，３５０ダルトン、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）をｐＨ５．５で１Ｍの酢酸ナトリウム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）中に含む２５％のポリマー溶液を、以下のように２：１の容積比で加えた：０．７５ｍｌのＡＳ−オリゴヌクレオチド、０．７５ｍｌのポリ−Ｌ−リシン・ＨＢｒ、３．０ｍｌのＰＥＧ／ＰＶＰ、および４．５０ｍｌの全容積。
【００３６】
そのバッチを７０℃で３０分間インキュベートし、そして次いで２３℃に冷却した。冷却時、その溶液は濁り、そしてマイクロスフィアが形成された。次いで懸濁液を遠心し、そして過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを除去した。ペレットを脱イオン水に再懸濁し、続いて遠心および上清を除去することによって、できたペレットを洗浄した。洗浄プロセスを３回繰り返した。水性懸濁液を凍結および凍結乾燥して、オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンを含むマイクロスフィアの乾燥粉末を形成した。
【００３７】
図１ａおよびｂは、２つの異なる倍率における、１：１のポリ−Ｌ−リシン：オリゴヌクレオチド比のマイクロスフィアの、代表的な走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。０．５〜４μｍの大きさで、約２．５μｍの平均粒子サイズのマイクロスフィアを作成した。図２ａは、レーザー光散乱によって明らかになった、本開示によって作成したマイクロスフィアの１つの調製物のサイズ分布を示す。図２ｂは、光散乱による、マイクロスフィア調製物の表面電荷の決定を示す（ゼータ電位）。図３は、添加を定量するために、および脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のマイクロスフィアのアンチセンスオリゴヌクレオチド成分の完全性を評価するために使用した逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを示す。マイクロスフィアを、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ；ＭＷ３０−７０ｋＤ）を用いて処方した。次いでマイクロスフィアを、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）による、ＰＬＬからのＤＮＡオリゴヌクレオチドの競合的置換を用いて脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｅ）した。ＰＡＡを、２６０ｎｍで吸収せず、そして２６０ｎｍにおけるオリゴヌクレオチドの定量に干渉しないポリアミノ酸試薬として選択した。図３のようなＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルにおいて、各ピーク下面積は、マイクロスフィアに添加された各オリゴヌクレオチドの量に比例する。図３に示すように、ピーク高は、各オリゴヌクレオチドのマイクロスフィアへのほぼ等量の添加を示す。オリゴヌクレオチドのマイクロスフィアへの添加を、重量によって約６５％から約８０％であると計算した。図３はまた、脱処方化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のピークの狭い分布によって示されるように、オリゴヌクレオチドの完全性は、マイクロスフィア処方プロセスによって影響を受けなかったことを示す。
【００３８】
実施例２
この実施例において、本開示の予防の局面をカバーする試験の結果を示す。図４に示すように、５〜８週齢におけるＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの単回投与は、糖尿病の発症を遅らせる。２グループのＮＯＤメスマウス（５〜８週齢）に、本開示のマイクロスフィアに処方されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＭＳＰ）の単回皮下注射をした。各アンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８０、および抗ＣＤ８６）の１：１：１混合物を５０μｇ含むと考えられる量で、処方を注射した。他のグループのマウスに、スクランブル配列のマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳ媒体（コントロールＮＯＤ）を注射した。尾静脈穿刺によって週１回血中グルコースを測定した。２回続けて＞２８０〜３００ｍｇ／ｄＬを測定した後、糖尿病を確認した。図４は、２つの独立に処置したコホートの累積生存率を示す。
【００３９】
図５は、５〜８週齢におけるＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの複数回投与が、糖尿病の発症を予防することを示す。ＮＯＤメスマウス（５〜８週齢）に、本開示によるマイクロスフィアに処方されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを８回連続で単回皮下注射した（週１回）。注射（各アンチセンスオリゴヌクレオチドの１：１：１混合物またはスクランブルオリゴヌクレオチドを５０μｇ）を、週１回８週間与え、そして１３週で終了した。他のグループのマウスに、スクランブル配列のマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）またはＰＢＳ媒体（コントロールＮＯＤ）を注射した。図５は、処置した動物の累積生存率を示す。
【００４０】
図６ａおよび６ｂは、処置を受けず、そして従って自然に自己免疫病に進行したマウス（糖尿病ＮＯＤマウス）由来の、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した（Ｈ＋Ｅ；図６ａ）、またはインスリンに関して染色した（図６ｂ）膵臓組織の切片を示す。図６ｃおよび６ｄは、ＳＣＲ−ＭＳＰ処方で処置したマウス由来の膵臓組織の切片を示す（注射を特異的ＡＳ−ＭＳＰで処置したグループと平行して開始した）。これらの切片も、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図６ｃ）またはインスリンに関して染色した（図６ｄ）。ＳＣＲ−ＭＳＰマウスは全て糖尿病を発症した。
【００４１】
図７ａおよび７ｂは、８週齢より若い時に処置し（予防モデル）、そして本開示のアンチセンスマイクロスフィアで処置したマウス由来の、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ａ）またはインスリンに関して染色した（図７ｂ）、膵臓組織の切片を示す。
【００４２】
図８に示すように、ＡＳ−ＭＳＰ処置ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋推定Ｔｒｅｇ細胞の普及率の増加を示す。図８Ａは、ＦＡＣＳ分析に使用したゲーティングを示す。図８Ｂは、脾臓から濃縮されたＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、そして図８ＣはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節由来、またはスクランブル配列マイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）で処置した、またはＰＢＳ媒体で処置した動物由来のパーセンテージを示す。
【００４３】
図９は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞は、同種脾臓細胞と同時培養した場合に増殖することを示す。ＡＳＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞を、濃縮カラムから得て、そしてＢａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ６または同系非糖尿病ＮＯＤマウス（１０週齢）由来のγ線照射した脾臓細胞と同時培養した。Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を用いて、４日後に増殖を測定した。Ｓｐｌは、同種照射脾臓細胞を指す。
【００４４】
図１０に示すように、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、インビトロにおいて同系照射脾臓細胞および卵白アルブミンの存在下で増殖する。Ｔ細胞を脾臓から、またはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節から濃縮した。
【００４５】
図１１は、ＡＳＭＳＰ処置非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞は、インビトロで、同系膵島溶解物の存在下で、増殖の抑制を示すことを示す。図４で記載したように、Ｔ細胞を脾臓から、またはＡＳＭＳＰ非糖尿病コホートからランダムに選択したＡＳＭＳＰ処置非糖尿病マウスのプールしたリンパ節から濃縮した。照射ＮＯＤ脾臓細胞（非糖尿病１０週齢ＮＯＤマウス由来）を、抗原提示細胞として使用し、そして平行培養にＮＩＴ−１溶解物（１μｇ／ウェル）（またはＰＢＳ媒体）を適用した。
【００４６】
最終的な糖尿病抑制治療のヒト試験への転換に関する主な懸念は、その治療アプローチの抗原特異性（そして従って細胞特異性）、およびその治療が、全体的および非特異的な抑制を与えるかどうかである。これらの問題に取り組むために、図４に示したコホートから、ランダムに選択した非糖尿病マウスを、安楽死させて、同種抗原、ノミナル抗原（完全な卵白アルブミンの形態で）、およびＮＯＤ由来インスリノーマ細胞系統ＮＩＴ−１の細胞溶解物の形態の同系ベータ細胞由来抗原に対する、脾臓およびリンパ節Ｔ細胞の増殖を確認した。インスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、機構的および目的論的な関与を有する、見込みのある候補自己抗原であるが、自己抗原を惹起する性質はまだ明らかでない。それにも関わらず、それはベータ細胞にあると考えるのが妥当である。従って、ＮＯＤインスリノーマから得られるＮＩＴ−１細胞系統を、ＡＳ−ＭＳＰで処置した非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞の同時培養において、ベータ細胞抗原の供給源として使用して、抗原特異的反応低下の可能性を決定した。これらの研究から、ノミナルおよび同種抗原に対するＴ細胞増殖は維持されるが、ＮＩＴ−１細胞溶解物との同時培養においてＴ細胞の増殖低下があることが観察された。
【００４７】
さらに、同時培養上清におけるサイトカインプロファイルを確認して、発明者らは、ＮＩＴ−１溶解物の存在下でさえ、ＡＳ−ＭＳＰ処置した、非糖尿病ＮＯＤマウス由来のＴ細胞によるＴＮＦα産生の有意な減少を観察した。ＩＦＮγの産生は、ＡＳ−ＭＳＰ処置マウス由来のＴ細胞の同時培養においてわずかに減少したが、ＮＩＴ−１溶解物存在下におけるＰＢＳ処置マウス由来のＴ細胞との同時培養と統計学的に区別できなかった。最後に、そのアッセイは、上清中にＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはＴＧＦβの存在を検出できなかった。
【００４８】
実施例３
アンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフィアの、早期発症ＮＯＤマウスにおける糖尿病の症状を逆転させる能力も試験した。これらの実験の予定表を図１３Ａに示す。早期発症したＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを試験し、そして４００ｍｇ／ｄＬより高い血中グルコースレベルを有する動物を同定することによって選択した。選択した動物に、インスリンペレットを与えて、血中グルコースレベルを３００ｍｇ／ｄＬより低くまで正常化した。インスリンをやめ、そしてマイクロスフィアの一連の非経口注射を開始した。６匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィアを週２回注射した。さらに１０匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６に向けられていないスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフィアを注射した。両方のグループの動物の各注射は、１００μｌの注射溶液中、マイクロスフィア中に５０μｇのオリゴヌクレオチドを含んでいた。スクランブルグループの動物のうち２匹を、肉体的状態が悪いため、実験の前および終わりに安楽死させた。注射プロトコールの開始後、血中グルコースレベルを１週間に２回サンプリングした。動物は実験の間、非絶食であった。結果を図１２にプロットし、ここでインジケーター（１）は、インスリンペレットの設置を示し、そしてインジケーター（２）は、インスリンペレットの除去および週２回のＭＳＰ注射の開始を示す。図１２で報告された最高血中グルコース値は、７００ｍｇ／ｄＬであり、それは使用した計器の最高の示度であり、７００ｍｇ／ｄＬのデータポイントは、７００ｍｇ／ｄＬまたはそれより高い血中グルコース示度を示すことが理解されることに注意する。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物を含むマイクロスフィア（ＡＳＭＳＰ１からＡＳＭＳＰ６）を投与されたグループの全ての動物は、スクランブルオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフィア（ＳＣＲＭＳＰ１からＳＣＲＭＳＰ１０）を投与された動物より、有意に低いグルコースレベルを示した。さらに、このＡＳＭＳＰグループの６匹の動物のうち４匹は、典型的には糖尿病発症の閾値指標と考えられる、４００ｍｇ／ｄＬより低い血中グルコースレベルを示した。
【００４９】
図１３Ａにおいて、実験の予定表を示す。各グループの、平均非空腹時血中グルコース（図１３Ｂ）および平均空腹時血中グルコースレベルをプロットした（図１３Ｃ）（＋／−ＳＥＭ）。図１３Ａに示すように、何匹かのマウスにおいて、ＡＳＭＳＰ投与をやめた。図１３Ｂおよび１３Ｃにおいて示すように、新規発症糖尿病ＮＯＤメスマウスに対する複数回のＡＳ−ＭＳＰ投与は、未処置の動物（コントロール）、ＰＢＳで処置した動物、またはスクランブルオリゴヌクレオチドマイクロスフィア（ＳＣＲ−ＭＳＰ）で処置した動物と比較して、血中グルコースレベルを改善し、そしてＡＳ−ＭＳＰ中止後でさえ安定な空腹時正常血糖を生じる。
【００５０】
図７ｃおよび７ｄは、糖尿病の発症後にアンチセンス処方で処置し、そして疾患の逆転を示したＮＯＤマウス由来の膵臓組織の切片を示す。切片を、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色（Ｈ＋Ｅ；図７ｃ）またはインスリンに関して染色（図７ｄ）した。
【００５１】
３つの異なるＡＳ−オリゴヌクレオチドを、ＰＲＯＭＡＸＸマイクロスフィアに組み込み得、そしてそのようなマイクロスフィアを、免疫調節性樹状細胞の誘導によって、新規発症自己免疫性糖尿病を予防および／または逆転するための組成物として使用し得る。実際、その組成物の単回注射は、疾患の発症を遅らせ、そして新規発症糖尿病マウスへの反復投与は、高血糖を正常化し、疾患の逆転を示唆した。これらの研究において、血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬ以下に低下するまで、インスリンを毎日投与した。次いでインスリンを中止し、そこでＡＳ−ＭＳＰを皮下投与した。代表的な投与レジメにおいて、動物に体重１ｋｇあたり２ｍｇのＡＳ−ＭＳＰを１週間に２回、３〜４週間投与した。非糖尿病マウスをモニターした。
【００５２】
図１４Ａ〜１４Ｃにおいて、ＮＯＤマウスに対するＡＳ−ＭＳＰの投与は、当該マウスの血中グルコースレベルを正常レベルに戻し、そしてその当該血中グルコースレベルの正常化は、延長した期間維持されることを示す。図１４Ｂおよび図１４Ｃにおいて示すように、ＡＳ−ＭＳＰを、インスリン投与を中止した後０〜３０日の間に投与した。血中グルコースレベルは、インスリン中止後１５日までに正常に戻り、そしてモニター期間の終わり（５５日）まで正常レベルで維持された。
【００５３】
自己免疫性糖尿病の治療的逆転の影響を示す図を、図１５に示す。ＰＲＯＭＡＸＸ治療薬を、図１５に示す新規発症「ハネムーン期」に投与した場合、機能的なままである１０〜２０％のベータ細胞の保存が予測され、それによって糖尿病のコントロールを導き、そして患者のインスリンに対する依存を抑制する。
【００５４】
記載された本開示の実施態様は、本開示の原理の適用のいくつかの説明であることが理解される。本開示の真の意図および範囲から離れることなく、当業者によって多くの修飾がなされ得る。本明細書中で記載される様々な特徴を、あらゆる組み合わせで使用され得、そして本明細書中で明確に概略を述べた正確な組み合わせに制限されるものではない。
（配列表）
【数１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症を減少させるための、オリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフィアを含む組成物であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物ならびにその組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されており、ここで該組成物が、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与される、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、該組成物の投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを前記マイクロスフィアが含む、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、ここで該組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団の再生を引き起こす、組成物。
【請求項７】
前記組成物が注射可能な組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、インスリンと組み合わせて投与される組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記インスリンが、前記マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与される、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗがオリゴヌクレオチドである組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記マイクロスフィア組成物中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である組成物。
【請求項１２】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症を減少させるための医薬の製造における、オリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフィアの使用であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物ならびにその組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されており、ここで前記組成物が、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与される、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、使用。
【請求項１５】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が前記組成物の投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを前記マイクロスフィアが含む、使用。
【請求項１７】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団の再生を引き起こす、使用。
【請求項１８】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬が注射可能な組成物である使用。
【請求項１９】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬が、インスリンと組み合わせて投与される使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用であって、前記インスリンが、前記医薬の投与の前に、同時に、または後に投与される、使用。
【請求項２１】
請求項１２に記載の使用であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗがオリゴヌクレオチドである使用。
【請求項２２】
請求項２１に記載の使用であって、マイクロスフィア医薬中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である使用。
【請求項２３】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であって、該哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中の該マイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで該組成物を、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する、方法。
【請求項１】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症を減少させるための、オリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフィアを含む組成物であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物ならびにその組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されており、ここで該組成物が、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与される、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、該組成物の投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを前記マイクロスフィアが含む、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、ここで該組成物の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団の再生を引き起こす、組成物。
【請求項７】
前記組成物が注射可能な組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、インスリンと組み合わせて投与される組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記インスリンが、前記マイクロスフィア組成物の投与の前に、同時に、または後に投与される、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗがオリゴヌクレオチドである組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記マイクロスフィア組成物中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である組成物。
【請求項１２】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症を減少させるための医薬の製造における、オリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフィアの使用であって、ここで該オリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物ならびにその組み合わせから成る群より選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されており、ここで前記組成物が、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与される、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が１型糖尿病の臨床的発症の後に投与される、使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が１型糖尿病の臨床的発症の前に投与される、使用。
【請求項１５】
請求項１２に記載の使用であって、前記医薬が前記組成物の投与前の前記哺乳動物の血中グルコースレベルと比較して、該哺乳動物における血中グルコースレベルを正常化する、使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の使用であって、ここで、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを前記マイクロスフィアが含む、使用。
【請求項１７】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬の投与が、前記哺乳動物のベータ細胞集団の再生を引き起こす、使用。
【請求項１８】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬が注射可能な組成物である使用。
【請求項１９】
請求項１２に記載の使用であって、ここで前記医薬が、インスリンと組み合わせて投与される使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用であって、前記インスリンが、前記医薬の投与の前に、同時に、または後に投与される、使用。
【請求項２１】
請求項１２に記載の使用であって、前記マイクロスフィアの７０％ ｗ／ｗがオリゴヌクレオチドである使用。
【請求項２２】
請求項２１に記載の使用であって、マイクロスフィア医薬中のアンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が１：１：１である使用。
【請求項２３】
哺乳動物において膵臓のＴ細胞による炎症および／または膵臓ベータ細胞死を減少させる方法であって、該哺乳動物にマイクロスフィア組成物を投与することを含み、ここで該組成物中の該マイクロスフィアは、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６一次転写物およびその組み合わせから成るグループから選択される一次転写物のアンチセンスであり、そしてそれらに結合するよう標的化されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで該組成物を、該哺乳動物において１型糖尿病の症状を寛解させるために有効な量で投与する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−１８０３７６（Ｐ２０１２−１８０３７６Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１４２１９０（Ｐ２０１２−１４２１９０）
【出願日】平成２４年６月２５日（２０１２．６．２５）
【分割の表示】特願２００９−５２３０８２（Ｐ２００９−５２３０８２）の分割
【原出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【出願人】（５０１１０２９８８）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１４２１９０（Ｐ２０１２−１４２１９０）
【出願日】平成２４年６月２５日（２０１２．６．２５）
【分割の表示】特願２００９−５２３０８２（Ｐ２００９−５２３０８２）の分割
【原出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【出願人】（５０１１０２９８８）ユニバーシティ オブ ピッツバーグ オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション (24)
【Ｆターム（参考）】
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