新規糖脂質アジュバント組成物
本発明は、糖脂質、弱酸、アルコール、非イオン性界面活性剤および緩衝液を含む安定なアジュバント希釈剤ストック溶液および最終のアジュバント溶液を調製する組成物および方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質アジュバントの新規組成物、それらを使用するための方法、およびそれらを調製するための方法に関する。本発明の新規組成物は、凝集することなく長期間安定である。本発明の新規組成物は、ワクチンを含む様々な医薬を送達するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、通常、細菌、ウイルス、および寄生生物によって引き起こされる感染性疾患からヒトおよび獣医学動物を守るために使用される。ワクチンにおいて使用される抗原は、任意の様々な作用物質であってよいが、通常、死んだ病原性生物、生きているが修飾または弱毒化されている病原性生物、タンパク質、組換えタンパク質またはそれらの断片からなっている。抗原の源が何であれ、抗原に対する宿主の免疫応答を高めるためにアジュバントを加えることが必要であることが多い。
【０００３】
アジュバントは、２つの目的を達成するために使用され、すなわち、アジュバントは、注射部位からの抗原の放出を遅延させ、アジュバントは、免疫系を刺激する。
【０００４】
文献で報告された最初のアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）であった。ＦＣＡは、油中水型乳剤およびマイコバクテリアの抽出物を含有する。マイコバクテリア抽出物は、粗製の形態で免疫刺激性分子を提供する。油中水型乳剤は、抗原がゆっくりと放出されるデポ効果を生み出す働きをする。残念なことに、ＦＣＡは、耐容性に乏しく、コントロール不良の炎症を引き起こすことがある。８０年以上前のＦＣＡの発見以来、アジュバントの望ましくない副作用を低減するための努力が行われてきた。
【０００５】
現在、アジュバント特性を有する新しい種類の化合物を含む糖脂質類似体が知られている。米国特許第４，８５５，２８３号（以下‘２８３）は、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素、Ｎ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体、具体的には、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート（Ｂａｙ Ｒ１００５として知られている、Ｏ Ｌｏｃｋｈｏｆｆ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）３０：１６１１〜１６２０）の合成を開示している。‘２８３特許に記載されている化合物は、アジュバントとして使用するのに特に適している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖脂質アジュバント製剤は、製造が容易であり、脂質成分の凝集を示すことなく長期間保管した場合に安定である必要がある。糖脂質アミドまたはグリコシルアミドの非アセテート形態は、極めて不溶性であり、通常、室温またはそれ以下の温度で保管すると溶液から凝集する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で提供されるグリコシルアミドを含む溶液およびアジュバントは、ほとんど凝集を示さず、全く安定である。それらは、製造が容易であり、商業規模で調製することができる。液状の糖脂質アジュバント製剤を希釈剤として用い、凍結乾燥抗原調製物を再水和することができる。リアルタイムで、および加速安定性試験プロトコルにより、これらの製剤の安定性を試験する方法も提供される。
【０００８】
本発明は、グリコシルアミドストック溶液と糖脂質アジュバント溶液の両方を作製または製造する組成物および方法を含む。グリコシルアミドストック溶液は、式１の糖脂質をアルコールに溶かし、これを、適切な量の弱酸および「非イオン性」界面活性剤と混ぜ合わせることにより調製される。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰の弱酸として糖脂質アルコール溶液に加える。一実施形態において、糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセテートである。一実施形態において、アルコールは、エタノールである。一実施形態において、弱酸は、酢酸である。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、様々なソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標））またはポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、特に、モノラウレートソルビタン（Ｓｐａｎ２０（登録商標））およびモノラウレートポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））である。糖脂質アジュバント溶液は、適切な量のグリコシルアミドストック溶液を「適当な緩衝液」に導入することにより調製される。本明細書に記載されている最終的な安定な糖脂質アジュバント溶液のｐＨは、約６〜約８とすべきである。約６〜約７の最終ｐＨが好ましい。約６．３〜約６．４の最終ｐＨが記載されている。糖脂質アジュバントの高い塩濃度、すなわち３０ｍＭ ＮａＣｌを超える塩濃度は、避けるべきである。
【０００９】
これらの２つの溶液は、以下の通りさらに詳細に例示される。
グリコシルアミドストック溶液は、
ａ）塩形態である、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【００１０】
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される）である）、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ値を有する任意の酸である）、および
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）を含む組成物である。
糖脂質アジュバント溶液は、
ａ）グリコシルアミドストック溶液、および
ｂ）適当な緩衝液（ここで、緩衝液は、獣医学的または医学的使用に適している緩衝液であり、約６．０〜約８．０の水溶液中での比較的一定したｐＨを維持することができる）を含む組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
特に指定のない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される以下の用語は、以下に示す意味を有する。
【００１２】
用語「アルコール」は、式：ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルの化合物を指す。アルコールは、メタノール、エタノール、またはｎ−プロパノールもしくはイソ−プロパノールなどの任意の形態のプロパノールであってよい。エタノールが好ましい。
【００１３】
用語「アルキル」は、直鎖飽和炭化水素部分と分岐飽和炭化水素部分の両方を指す。
【００１４】
用語「糖脂質」は、以下の式Ｉの化合物を指す。これらの化合物は、米国特許第６，２９０，９７１号、および１９８９年８月８日に出願された米国特許第４，８５５，２８３号に記載されている。米国特許第６，２９０，９７１号と米国特許第４，８５５，２８３号は共に、全体として参照により本明細書に組み込まれるものとする。ここに特に記載されている糖脂質は、そのアセテート形態である場合、商品名Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）、および化学名「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート」を有する。この化合物のアミド形態は、商品名Ｂａｙ １５−１５８３（登録商標）、および化学名「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミド」を有する。
【００１５】
式Ｉの糖脂質は、
【００１６】
【化２】
（式中、
Ｒ１は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体である）、
または薬学的に許容できるそれらの塩である。
【００１７】
別の特定の実施形態は、
Ｒ１が、水素、または飽和Ｃ１２〜１８アルキルであり、
Ｒ２が、水素、または飽和Ｃ７〜１１アルキルであり、
Ｘが、−ＣＨ２であり、
Ｒ４、およびＲ５が、独立して、水素であり、
Ｒ６が、Ｌ−ロイシルから選択される式１の糖脂質について記載している。
【００１８】
式Ｉのための変数は、別個で独立しており、変数のすべての組合せは、本明細書において記載され、特許請求の範囲に記載されている。
【００１９】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩ（ａ）によって示される糖脂質である。
【００２０】
【化３】
【００２１】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩ（ｂ）によって示される糖脂質である。
【００２２】
【化４】
【００２３】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩＩの構造を有する糖脂質である。
【００２４】
【化５】
【００２５】
式ＩＩＩの化合物は、アミド形態かアセテート形態のどちらかで存在することができる。この化合物のアミド形態は、商品名Ｂａｙ １５−１５８３（登録商標）を有する。アセテート形態は、商品名Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）を有する。
【００２６】
式Ｉの糖脂質は、米国特許第４，８５５，２８３号から得られる以下の手順を用いて作製することができる。
【００２７】
式１から分かるように、本発明による化合物は、置換２−アミノ−２−デオキシヘキソースをベースにしている。これらの糖は、常に、Ｃ−１、アノマー炭素原子を介して、アシルアミド、カルバミドまたはアルコキシカルボニルアミド基
【００２８】
【化６】
（Ｒ１、Ｒ２およびＸは、上述の意味を有する）とＮ−グリコシド結合している。
【００２９】
式Ｉの本発明による化合物におけるアミノ糖の２−アミノ基は、α−アミノ酸またはα−アミノ酸誘導体とアミド結合している。
【００３０】
アミノ酸は、グリシン、サルコシン、馬尿酸、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、オルニチン、シトルリン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファンおよびヒスチジンなどの天然Ｌ−アミノ酸である。Ｄ−アラニンなどのＤ−アミノ酸、Ｄ体とＬ体の両方のα−アミノ酪酸、α−アミノ吉草酸、α−アミノカプロン酸もしくはα−アミノヘプタン酸などのアミノカルボン酸も、アミノ糖上の置換基としての役割を果たすと記載されている。
【００３１】
式Ｉによる化合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、アミノ基が保護されている２−アミノ−２−デオキシグリコピラノース誘導体（式ＩＶ）
【００３２】
【化７】
（式中、Ｒ１０は、ペプチドの合成から知られているアミノ基を保護するための保護基を表し、適切な場合、選択的に除去することができる）から出発するものである。
【００３３】
適当な保護基の例は、トリフルオロアセチルまたはトリクロロアセチルなどのアシル基、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、またはメトキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルもしくは２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル基などの、置換されていてもよい低級アルコキシカルボニル基である。適当なＮ−保護アミノ−ヘキソース誘導体が知られている。例えば、Ｍ．ＢｅｒｇｍａｎｎおよびＬ．Ｚｅｒｖａｓ、Ｂｅｒ．６４、９７５（１９３１）；Ｄ．Ｈｏｒｔｏｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２９、１７７６（１９６４）；Ｐ．Ｈ．ＧｒｏｓｓおよびＲ．Ｗ．Ｊｅａｎｌｏｚ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２、２７５９（１９６７）；Ｍ．Ｌ．ＷｏｌｆｒｏｍおよびＨ．Ｂ．Ｂｈａｔ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２、１８２１（１９６７）；一般：Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ（編集者）．Ｐｒｏｔ．Ｇｒｏｕｐｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９７３）；「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第３巻、１〜９９ページ、（１９８１）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中のＧｅｉｇｅｒ；ならびにそこに引用されている文献。式Ｉによる化合物を調製するのに好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣ基（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル）またはＺ基（ベンジルオキシカルボニル）である。
【００３４】
保護アミノ糖誘導体（ＩＶ）を、第１の反応ステップにおいて、アミン（式Ｖ）、
Ｈ２Ｎ−Ｒ１（Ｖ）
（Ｒ１は、上述の意味を有する）と反応させると、グリコシルアミン（式ＶＩ）が得られる。
【００３５】
【化８】
【００３６】
このタイプのグリコシルアミン調製は、原則として知られており（ＥＬＬＩＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、９５（１９５５））、具体的には、ＤＥ−ＯＳ（ドイツ公開明細書（Ｇｅｒｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ））第３，２１３，６５０号に記載されている。
【００３７】
第２の反応ステップにおいて、グリコシルアミン（ＶＩ）を、カルボキシルハライド、またはカルボン酸無水物などの適当なカルボン酸誘導体（式ＶＩＩ）、
Ｒ１１−ＣＯ−ＣＨ２−Ｒ４（ＶＩＩ）
（Ｒ２は、上述の意味を有し、Ｒ１１は、例えば、塩素などのハロゲンを表し、または−Ｏ−ＣＯ−Ｒ２（Ｒ２は、上述の意味を有する）を表し、または−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−低級アルキルを表す）のどれかと反応させる。このようにして、グリコシルアミド（式ＶＩＩＩ）
【００３８】
【化９】
（式中、Ｒ１、およびＲ２は、上述の意味を有し、Ｒ１０は、Ｒ６と同じであり、Ｘは、−ＣＨ２−を表す）が得られる。このタイプのＮ−アシル化の条件は、ＤＥ−ＯＳ（ドイツ公開明細書）第３，２１３，６５０号に示されている。
【００３９】
好ましい実施形態において、式ＶＩのグリコシルアミンを、１〜２当量のカルボニルクロリド（式ＶＩＩ）または文献から知られている方法により、有機補助塩基の存在下、関連するカルボン酸Ｒ２−−ＣＨ２−−ＣＯ２Ｈおよびクロロギ酸エチルまたはクロロギ酸イソブチルから得られた１〜２当量の混合無水物と反応させると、Ｘ＝−ＣＨ２−である式ＶＩＩＩのグリコシルアミドが得られる。
【００４０】
これは、適切な場合に無機または有機塩基の存在下、０℃〜５０℃の有機または水性−有機溶媒中行われる。適当な希釈剤は、メタノール、エタノール、１−プロパノールもしくは２−プロパノールなどのアルコール、またはジエチルエーテル、テトラヒドロフランもしくは１，４−ジオキサンなどのエーテル、またはジクロロメタン、トリクロロメタンもしくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００４１】
第１のステップにおいて得られるグリコシルアミン（ＶＩ）を、ハロゲノギ酸エステル（ＩＸ）
Ｒ１２−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２（ＩＸ）
（Ｒ１２は、例えば、塩素または臭素などのハロゲンを表し、Ｒ２は、上述の意味を有する）と反応させた場合、グリコシルカルバメート（ＶＩＩＩ）が得られ、式ＶＩＩＩにおけるＸは、酸素を表す。
【００４２】
一実施形態において、式ＶＩＩＩのグリコシルアミンを１〜２当量のクロロ炭酸エステルＩＸと反応させると、グリコシルカルバメートが得られる。これは、０℃〜５０℃の温度であるが、特に好ましくは室温において、有機または水性−有機溶媒中で行われることが好ましい。適当な溶媒は、上記で述べたようなアルコール、エーテル、ハロゲン化炭化水素またはジメチルホルムアミドである。
【００４３】
第１のステップにおいて得られるグリコシルアミン（ＶＩ）を、１〜２当量の有機イソシアネート（式Ｘ）
Ｒ２−ＮＣＯ（Ｘ）
（Ｒ２は、上述の意味を有する）と反応させた場合、式ＶＩＩＩのグリコシル尿素が得られ、Ｘは、−ＮＨ−である。このアシル化反応は、上述の反応と同様、−２０℃〜６０℃、好ましくは０℃〜２５℃の反応温度で、有機溶媒中で行われることが好ましい。適当な溶媒は、上述のアルコール、エーテル、ハロゲン化炭化水素、またはジメチルホルムアミドである。
【００４４】
このようにして得られるグリコシルアミド（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−ＣＨ２−）、グリコシルカルバメート（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−Ｏ−）またはグリコシル尿素（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−ＮＨ−）は、それ自体知られているプロセスにより結晶性または非晶質の固体の形態で単離され、必要な場合、再結晶、クロマトグラフィー、抽出などの標準的な手順により精製される。
【００４５】
多くの場合、上述の精製ステップと並行して、またはそれらの代わりに、良好な結晶化特性を有する式ＶＩＩＩのグリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素の誘導体をもたらす化学誘導体化を行うことも有利である。このタイプの化学誘導体化は、本発明によるグリコシルアミド、グリコシルカルバメートおよびグリコシル尿素の場合、例えば、糖残基のヒドロキシル基上のエステル化反応である。適当なエステル基の例は、アセチル、ベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイル基である。
【００４６】
グリコシルアミド、グリコシル尿素またはグリコシルカルバメートのトリ−Ｏ−アセチル誘導体を調製するため、対応するトリオール（式ＶＩＩＩ）を、無機または有機補助塩基の存在下、アシル化剤と反応させる。適当なアシル化剤は、塩化アセチル、塩化ベンゾイルもしくは塩化ｐ−ニトロベンジルなどの酸塩化物、または、例えば、無水酢酸などの無水物である。これにより、式ＸＩによるエステル
【００４７】
【化１０】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１０およびＸは、上述の意味を有し、
Ｒ１３は、アセチル、ベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイルを表す）が生成する。
【００４８】
Ｏ−アシル化反応は、不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。使用することができる溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタンまたは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、テトラヒドロフラン、または１，４−ジオキサンなどのエーテル、酢酸エチルなどのエステル、およびジメチルホルムアミドなどのアミドである。
【００４９】
トリエチルアミンまたはピリジンなどの有機塩基単独を、適当な溶媒として示すことも可能である。使用することができる塩基は、Ｏ−アシル化のために有機化学において使用されるすべての塩基である。トリエチルアミン、ピリジンまたは混合物ピリジン／４−ジメチルアミノピリジンを使用することが好ましい。トリエステル（式ＸＩ）は、有機溶媒から容易に結晶化することができる。結晶化にとって、短鎖アルコール、すなわち、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノールなどの極性溶媒が特に好ましい。トリエステル（式ＸＩ）の結晶化に適している他の溶媒は、有機溶媒と極性の無機または有機溶媒の混合物、例えば、テトラヒドロフラン−メタノール、テトラヒドロフラン−水、エタノール−水、およびイソプロパノール−水である。単回または、適切な場合、複数回の再結晶によって精製されたトリエステル（式ＸＩ）を、３個のＯ−アセチル基の加水分解またはエステル交換によってトリオール（式ＶＩＩＩ）に戻す。有機化学では、多くのタイプのエステル切断が知られている。トリエステル（式ＸＩ）からのトリオール（式ＶＩＩＩ）の調製については、有機化学においてＺＥＭＰＬＥＮ加水分解として知られているメタノールおよび触媒量のナトリウムメタノレートの存在下でのアシル基のエステル交換を挙げることができる。
【００５０】
本発明による式Ｉの化合物の調製における第３の反応ステップは、式ＶＩＩＩの化合物における糖上の２−アミノ基の保護基の選択的切断を含む。この反応において、式ＶＩＩＩの化合物における糖上の１−アミドまたは１−カルバミドまたは１−（アルコキシカルボニルアミド）基が同時に除去されないように特別の注意を払わなければならない。
【００５１】
アミノヘキサンのＣ−２上の使用されることが好ましいベンジルオキシカルボニル基は、水素化分解の条件下で、１−アミド、１−カルバミドまたは１−アルコキシカルボニルアミド基を保持しながら定量的および選択的に切断することができる。この水素化分解は、以下の構造式（ＸＩＩ）
【００５２】
【化１１】
（Ｒ１、Ｒ２およびＸは、上述の意味を有する）の糖上に遊離の２−アミノ基を有するグリコシルアミド、グリコシル尿素またはグリコシルカルバメートを提供する。
【００５３】
水素化分解に適している触媒の例は、活性炭上に吸着されている白金またはパラジウムなどの貴金属である。パラジウム／炭素（５％または１０％）を使用することが好ましい。水素化分解は、適当な圧力容器中で大気圧または高圧下で行うことができる。例えば、メタノール、エタノール、もしくはプロパノールなどのアルコール、テトラヒドロフランもしくは１，４−ジオキサンなどのエーテル、または酢酸などのカルボン酸、またはそれらの混合物などの不活性溶媒が、水素化に適している。適切な場合、溶媒を、水または塩酸もしくは硫酸などの希酸と混ぜる。言うまでもなく、そのような酸を加える場合、式ＸＩＩによる２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、これらの酸のアンモニウム塩として得られる。式ＶＩＩＩの化合物において同様に使用されることが好ましいｔ−ブチルオキシカルボニル保護基は、塩酸または硫酸などの鉱酸を用いる文献から知られている方法により切断することができる。この場合も、式ＸＩＩの２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、切断に使用される酸のアンモニウム塩として選択的に得られる。
【００５４】
本発明による式Ｉの化合物を合成するための第４の反応ステップは、式ＸＩＩによるアミノグリコシルアミド、アミド、−カルバメートもしくは−尿素、またはそれらの塩の、適当なアミノ酸誘導体との連結を含む。 適当なアミノ酸誘導体は、Ｎ−保護アミノ酸（式ＸＩＩＩ）
【００５５】
【化１２】
（Ｒ７は、上述の意味を有し、
Ｒ８は、水素またはメチルを表し、
Ｒ１４は、ペプチド合成において習慣的に使用され、ペプチド結合を保持しながら選択的に再び除去することができる保護基を表す）である。
【００５６】
使用されることが好ましい式ＸＩＩＩにおけるアミノ基のための保護基は、上述の通りであり、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル基が特に好ましい。式ＸＩＩの２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートまたは−尿素の式ＸＩＩＩのアミノ酸誘導体との連結は、ペプチド合成の従来の方法（Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈ他：Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ） ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｒｇ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）（Ｅ．Ｍｕｌｌｅｒ、編集者）、第ＸＶ／Ｉ巻および第ＸＶ／２巻、第４版、Ｔｈｉｅｍｅより発行、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９７４））により行うことができる。
【００５７】
従来のプロセスの例は、水除去剤（ｗａｔｅｒ−ｒｅｍｏｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの存在下での式ＸＩＩの化合物中のアミノ基と式ＸＩＩＩのアミノ酸誘導体との縮合である。
【００５８】
式ＸＩＩの化合物と式ＸＩＩＩの化合物の縮合は、カルボキシル基を活性化する場合にも行うことができる。可能な活性化されたカルボキシル基は、例えば、酸無水物、好ましくは、酸の酢酸エステルなどの混合無水物、またはイミダゾリドなどの酸のアミド、または活性化されたエステルである。活性化されたエステルの例は、シアノメチルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、およびＮ−ヒドロキシフタルイミドエステルである。活性化されたエステルは、カルボジイミドなどの水除去剤の存在下で酸（式ＸＩＩＩ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたは１−ヒドロキシベンゾチアゾールからも得ることができる。アミノ酸の誘導体は、知られており、知られている方法で調製することができる。式ＸＩＩのアミノ化合物と、式ＸＩＩＩの活性化されていてもよいカルボキシル化合物との縮合は、式ＸＩＶのペプチド糖脂質を提供する
【００５９】
【化１３】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１４およびＸは、上述の意味を有する）。
【００６０】
式Ｉによる化合物を調製するための最終プロセスステップにおいて、式ＸＩＶの化合物における保護基Ｒ１４が除去される。式ＸＩＶの化合物中に存在する他のアミド、ウレタンまたは尿素基が切断されないようにこのステップの間は注意を払わなければならない。式ＸＩＶの化合物において使用されることが好ましい保護基Ｒ１４、Ｎ−カルボベンゾキシ基およびＮ−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル基は、アミド、ウレタンまたは尿素基を保持しながら除去することができる。カルボベンゾキシ基は、エタノール、メタノール、氷酢酸またはテトラヒドロフランなどの適当な溶媒中、例えば、活性炭上のパラジウムなどの貴金属の存在下での水素化分解により選択的に除去することができる。溶媒は、純粋な溶媒として使用するか、または、お互いに、もしくは水と混ぜ合わせることができる。反応は、大気圧または高圧下のどちらかで行うことができる。式ＸＩＶの化合物におけるｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル基Ｒ１４は、酸分解プロセスにより除去することができる。適当な条件の例は、室温における、例えば、氷酢酸、ジエチルエーテル、ジオキサンまたは酢酸エチルなどの適当な溶媒中での塩化水素の使用である。ｔ−ブチルカルバメートを切断するためのこのタイプのプロセスは、原則的に知られている。このようにして得られる式Ｉのペプチドグリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、それ自体知られているプロセスにより結晶性または非晶質の固体の形態で単離され、必要な場合、再結晶、クロマトグラフィー、抽出などの標準的な手順により精製される。
【００６１】
式Ｉの本発明による化合物は、同様に良好な結果で、第２の合成経路により調製することもできる。この第２の合成経路は、シントンのアミノ糖アミノ酸、アミンＲ１−ＮＨ２およびカルボン酸Ｒ２−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｈ、または炭酸誘導体Ｒ２−Ｏ−ＣＯ−−ハロゲン、またはＲ２−ＮＣＯ（Ｒ１およびＲ２は、上述の意味を有する）の連結順序が異なるという点で、上記に記載されている第１の合成経路と異なる。この第２の経路において、式ＸＶの適当な２−Ｎ−（アミノアシル）アミノ糖
【００６２】
【化１４】
（Ｒ７およびＲ８は、上述の意味を有し、Ｒ１４は、ペプチド化学において知られているアミノ保護基、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル基を表す）が、出発成分として使用される。次いで、このようにして得られる式ＸＶの化合物を、式ＩＩＩのアミノ化合物と縮合させると、一般式ＸＶＩのグリコシルアミン
【００６３】
【化１５】
（Ｒ１、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１４は、式ＩおよびＲ６の定義と一致する意味を有する）が得られる。
【００６４】
一般式ＶＩの化合物を調製するための上記に記載されているすべてのプロセスは、一般式ＸＶＩの化合物を調製するために使用することができる。次いで、式ＸＶＩの化合物を、上述のカルボン酸誘導体（ＶＩＩ）またはハロゲノギ酸エステル（式ＩＸ）または有機イソシアネート（式Ｘ）のどれかと反応させると、式ＸＩＶの２−（アミノアシル）−アミノグリコシルアミド（Ｘ＝−ＣＨ２−）、または式ＸＩＶの−カルバメート（Ｘ＝−Ｏ−）、または式ＸＩＶの−尿素（Ｘ＝−ＮＨ−）が得られる。これらのアシル化反応は、一般的に、グリコシルアミンとカルボン酸または炭酸誘導体との反応について上記に記載されているプロセスにより行うことができる。
【００６５】
このようにして得られる中間体（式ＸＩＶ）は、上述の物理的精製法により精製することができる。しかしながら、上記に記載されているＯ−アシル化の方法により、式ＸＩＶの化合物を、一般式ＸＶＩＩ
【００６６】
【化１６】
（変数の意味は、式１と一致している）のトリ−Ｏ−アセテートまたはトリ−Ｏ−ベンゾエートに変換することが好ましい。
【００６７】
これらの化合物は、好ましくは、メタノールまたはエタノールなどの極性溶媒から容易に結晶化し、それによって精製することができる。次いで、式ＸＶＩＩの精製された結晶性誘導体は、特に糖化学において広く使用されている上述のエステル加水分解の方法により、式ＸＩＶのトリオールに変換される。式ＸＩＶの化合物におけるアミノ酸中の保護基の最終除去は、式Ｉの化合物の調製について上記にすでに記載されている。本発明は、式Ｉの化合物の塩にも関する。これらは、主に、薬学において習慣的に使用することができる式Ｉの化合物の無毒性の塩、例えば、塩化物、酢酸塩および乳酸塩、または不活性な塩である。
【００６８】
用語「弱酸」は、標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸を意味する。本発明を限定することは意図していないが、弱酸の以下の例を、名前、式、およびおおよそのｐＫａと共に記載する。酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）（ｐＫａ４．７６）；アスコルビン酸（１）、Ｈ２（Ｃ６Ｈ６Ｏ６）（ｐＫａ４．１０）；アセチルサリチル酸、Ｈ８（Ｃ９Ｏ４）、（ｐＫａ３．５）；ブタン酸、Ｈ（Ｃ４Ｈ７Ｏ２）（ｐＫａ４．８３）；炭酸、Ｈ２ＣＯ３、（ｐＫａ４．８３ １形）；クロム酸、ＨＣｒＯ４−、（ｐＫａ６．４９ ２形）；クエン酸、Ｈ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、（ｐＫａ３．１４ １形）；クエン酸、Ｈ２Ｃ６Ｈ５Ｏ７−、（ｐＫａ４．７７ ２形）；クエン酸、（ＨＣ６Ｈ５Ｏ７）＝、（ｐＫａ６．３９ ３形）；ギ酸、Ｈ（ＣＨＯ２）、（ｐＫａ３．７５）；フマル酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ３．０３）；ヘプタン酸、Ｈ（Ｃ７Ｈ１３Ｏ２）、（ｐＫａ４．８９）；ヘキサン酸、Ｈ（Ｃ６Ｈ１１Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；フッ化水素酸、ＨＦ、（ｐＫａ３．２０）；イソシトレート（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）、Ｈ８（Ｃ６Ｏ７）（ｐＫａ３．２９）；乳酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ３）、（ｐＫａ３．０８）；マレイン酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ１．８３）；ニコチン酸、Ｈ５（Ｃ６ＮＯ２）（ｐＫ３．３９）；シュウ酸、Ｈ２（Ｃ２Ｏ４）、（ｐＫａ１．２３ １形）；シュウ酸、（ＨＣ２Ｏ４）−、（ｐＫａ４．１９ ２形）；ペンタン酸、Ｈ（Ｃ５Ｈ９Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；リン酸、Ｈ３ＰＯ４、（ｐＫａ２．１６ １形）；プロパン酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ２）、（ｐＫａ４．８６）；ピルビン酸、Ｈ４（Ｃ３Ｏ３）（ｐＫａ２．３９）；コハク酸Ｈ６（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ４．１９）およびトリクロロ酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｃｌ３Ｏ２）（ｐＫａ０．７０）。これらの酸の任意の組合せも例示される。
【００６９】
酢酸が好ましい。アセチルサリチル酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸、ピルビン酸、コハク酸およびトリクロロ酢酸は、組合せで、およびコレクションとして個別に具体化されている、より一般的な弱酸である。
【００７０】
用語「非イオン性界面活性剤」は、それが溶解している材料の表面張力を下げる物質である界面活性剤を意味し、非イオン性は、電荷を帯びていない極性基を有することを意味する。用語両親媒性界面活性剤は、界面活性剤分子の一部が疎水性であり、一部が親水性である界面活性剤を意味する。適当な界面活性剤は、非イオン性でもあり両親媒性でもあり、獣医学的または医学的使用に許容できるであろう。特定の非イオン性界面活性剤が、医学的または獣医学的使用に許容できるか否かは、当業者によって容易に決定することができる。本発明と共に使用することができる多くの適当な非イオン性界面活性剤が存在し、多数の例を以下に提供する。
【００７１】
本明細書では、２つのよく知られているタイプの非イオン性界面活性剤が具体化されている。これらは、Ｓｐａｎ（登録商標）という商標で一般的に販売されているソルビタン、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）という商標で一般的に販売されているポリオキシエチレンソルビタンとして知られている。具体的には、以下のソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０（登録商標））、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ４０（登録商標））、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ６０（登録商標））、ソルビタントリステアレート（Ｓｐａｎ６５（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０（登録商標））、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート（ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）（Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、およびポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｔｗｅｅｎ８５）が本明細書で具体化されている。これらの記述には、これらの界面活性剤用の供給カタログに列挙されているように、商品名成分、または等価成分が含まれることを意味している。界面活性剤は、個別に、または任意の組合せで使用することができる。
【００７２】
ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０（登録商標））、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｔｗｅｅｎ８５）が、特に記載されている。
【００７３】
用語「適当な緩衝液」は、獣医学的または医学的使用に適しており、約６．０〜約８．０の水溶液中での比較的一定したｐＨを維持することができる緩衝液を意味する。リン酸緩衝液は、本明細書に記載されている一実施形態である。リン酸緩衝液は、異なる比率でリン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウムの一塩基塩および二塩基塩を混ぜることにより、広い範囲で特定のｐＨにおいて作製することができる。様々なナトリウムおよびカリウム緩衝液の作製および使用は、当業者によく知られている。
【００７４】
緩衝液の他の例は、以下の
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、
［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）
である。
【００７５】
パートＩ。溶液の調製。
本明細書に開示されている新規製剤は、１）グリコシルアミドストック溶液および２）糖脂質アジュバント溶液である。
【００７６】
１）グリコシルアミドストック溶液は、糖脂質をアルコールに溶かし、適切な量の弱酸と混ぜ合わせることにより調製される。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰の弱酸として、糖脂質アルコール溶液に加える。非イオン性界面活性剤を、糖脂質アルコール酸混合物に加え、グリコシルアミドストック溶液を作製する。例示される糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドアセテートである。例示されるアルコールは、エタノールである。例示される弱酸は、酢酸である。非イオン性界面活性剤は、上記に記載されている通りである。
【００７７】
グリコシルアミドストック溶液の調製。弱酸を、糖脂質を含有するアルコール溶液に加える。弱酸は、糖脂質含有量に関してモル過剰で加える。弱酸成分は、糖脂質に対するモル当量で、糖脂質の１．２５〜５倍量を加えるべきである。特定の実施形態において、酸の以下の相対量が推奨される。弱酸は、２．０倍、２．５倍、２．７倍、３．０倍、および５．０倍とすべきであり、酸が、糖脂質のモルの２．７倍のモルであることが最も好ましい。
【００７８】
非イオン性界面活性剤を、弱酸を加える前、または弱酸を加えた後に、上記のアルコール糖脂質混合物に加え、最終グリコシルアミドストック溶液を作製する。
【００７９】
弱酸の存在下で、グリコシルアミドは、糖脂質のアセテート形態に変換される。式Ｉの糖脂質は、緩衝水溶液に直接単に導入される場合、十分に可溶性ではない。式Ｉの糖脂質を緩衝水溶液に溶かして通常得られる溶液は、乳状の混合物である。以前の研究者は、乳状の溶液を超音波処理することにより、そのような混合物の溶液を均一にしようと試みてきた。しかしながら、超音波処理は、溶液が保管中に均一のままであることを保証しない。これらの化合物を懸濁するための化学的アプローチは、適切なｐＨにおいて、水性緩衝糖脂質の十分に可溶性で、ほぼ光学的に澄明な溶液をもたらす。弱酸が、糖脂質と比較して過剰量で加えられる場合、すべての糖脂質が可溶形態に変換され、元の非可溶形態への復帰が妨げられることが保証される。
【００８０】
弱酸は、糖脂質を薬学的に許容できる塩に変換する。好ましい塩は、薬学的および生物学的調製物において習慣的に使用される無毒性の塩である。例えば、式Ｉの化合物の塩化物、酢酸塩、乳酸塩、および不活性な塩が、本明細書に記載されている弱酸で得られる。
【００８１】
糖脂質を溶かすのに使用されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールの任意の異性形態、またはそれらの任意の組合せであってよい。得られる糖脂質アルコール溶液は、光学的に澄明であろう。糖脂質のアセテート形態を元の非アセテート形態に変換することができる任意の化学反応は、水溶液の中で糖脂質の凝集を引き起こすであろう。糖脂質の凝集が起こる場合、糖脂質分子は、薄片として溶液から現れ、容器の底にたまる。糖脂質およびアルコールのグリコシルアミドストック溶液における弱酸の初期濃度は、糖脂質の凝集があるか否か決定する。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰とし、凝集を避けるべきである。
【００８２】
２）糖脂質アジュバント溶液は、適切な量のグリコシルアミドストック溶液を「適当な緩衝液」に導入することにより調製される。本明細書に記載されている最終の安定な糖脂質アジュバント溶液のｐＨは、約６〜約８とすべきである。約６〜約７の最終ｐＨが好ましい。約６．３〜約６．４の最終ｐＨが記載されている。
【００８３】
グリコシルアミドストック溶液は、過剰の酸を含有するため、アジュバントとして使用するために緩衝化すべきである。例えば、リン酸緩衝液は、異なる比率でリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムの一塩基塩および二塩基塩を混ぜることにより、広い範囲で特定のｐＨにおいて作製することができる。リン酸緩衝液が使用される場合、約２０ｍＭにおいて作製することができ、これは、約７．８のｐＨを有する。グリコシルアミドストック溶液を緩衝液に加える場合、緩衝液のｐＨは低下する。ｐＨ７．８のリン酸緩衝溶液は、ｐＨが約６．４の最終糖脂質アジュバント溶液をもたらす。最終的なｐＨ調整を行うことができるが、通常は必要でない。
【００８４】
弱酸および糖脂質を含有するグリコシルアミドストック溶液は、極めて低いｐＨを有する。ｐＨを許容できるレベルまで上げることが必要であることがある。強塩基は、強塩基の添加が、糖脂質の塩形態を元の非塩形態に変換し、水性環境において非塩形態の沈殿（凝集）をもたらすことがあるため、この目的には避けるべきである。しかしながら、強塩基が望まれる場合、ほんの少量を使用すべきである。例えば、１００ｍＭ以下のＮａＯＨを使用することが推奨されるが、４．０ｍＭ以下が最適である。
【００８５】
緩衝溶液には、いくらかのＮａＣｌが含まれていてもよいが、必要ではない。ＮａＣｌ濃度は、約１〜約５０ｍＭの範囲であってよい。より少量のＮａＣｌは、より大量より好ましい。本明細書の実施例は、ＮａＣｌを有しないか、または１５ｍＭ ＮａＣｌを有するかのどちらかである。１００ｍＭ ＮａＣｌは、凝集が起きることから適当ではない。１５ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。３０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。５０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。
【００８６】
パートＩＩ。糖脂質アジュバント溶液の特徴付け。
保管中の糖脂質アジュバント溶液の安定性は、単純な目視観察により、または適切な分析機器を用いることによりモニターすることができる。糖脂質分子は、水溶液中にある場合、ミセルを形成し、レーザー回折計で正確にミセルのサイズを決定することが可能である。そのような測定を用い、糖脂質分子の凝集があるか否かを決定することができる。
【００８７】
リアルタイムの安定性測定への代替アプローチは、加速安定性試験を行うことである。加速安定性試験では、アジュバント溶液を、約７日間にわたり約３７℃の温度と、続いて、絶え間ないかき混ぜ下で約２日間にわたり約４℃におけるインキュベーションにさらす。約７日間の約３７℃におけるインキュベーションは、約１年間の約４℃における保管に相当する。絶えずかき混ぜながらの約２日間の約４℃におけるインキュベーションは、糖脂質アジュバント溶液が輸送中に直面する可能性があるストレス条件に相当する。
【００８８】
糖脂質アジュバント溶液が細胞質と等張であるか否かを決定するため、浸透圧を決定することができる。様々な濃度の塩化ナトリウムを加え、浸透圧計を用いて、得られる溶液の浸透圧を決定することができる。塩化ナトリウムの濃度を増加させることは、浸透圧を増加させることに加えて、溶液をより濁らせる傾向がある。濁りは、ミセルが集合してより大きな粒子を形成することによって引き起こされると考えられる。０．２μｍのフィルターを用いて濾過することが困難であるか、または不可能である溶液が、一般的に、商業使用に許容できないのは、商業規模で調製されるアジュバント溶液の無菌性を保証するために最終的な濾過が用いられることが多いためである。電子顕微鏡分析を用い、過剰な塩の結果としてのミセルの集合があるか否かを決定することができる。
【００８９】
上記に記載されているアジュバントと合わせ、追加の非糖脂質アジュバントを糖脂質アジュバント溶液において使用することができる。本発明の別の実施形態において、追加の免疫刺激性分子を、糖脂質アジュバント溶液に加える。免疫刺激性分子は、当技術分野においてよく知られており、それらには、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）およびカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）が含まれる。
【００９０】
Ｑｕｉｌ Ａは、南米の木キラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から精製された抽出物である。Ｑｕｉｌ Ａは、体液性応答と細胞性応答の両方を誘発する。Ｑｕｉｌ Ａがコレステロールと一緒に使用されることが多いのは、コレステロールが、適切な比率で加えられた場合、あまり望ましくない副作用を除去するためである。コレステロールは、Ｑｕｉｌ Ａと不溶性の複合体を形成し、コレステロールがＱｕｉｌ Ａと結合するにつれてラセン状構造を形成するため、分子の糖単位を露出させ、免疫応答を刺激する助けになる。
【００９１】
臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、ＤＤＡは、１８個の炭素アルキル鎖を有する陽イオン性界面活性剤である。ＤＤＡは、両親媒性四級アミンである。最適な免疫応答を得るためにＤＤＡと抗原の直接的相互作用が必要なのは、ＤＤＡが、油／水界面における抗原の直接結合を介して抗原の担体としての役割を果たすためである。ＤＤＡは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を刺激する。
【００９２】
カルボポールは、本発明で使用することができる別の有用な免疫刺激性分子である。カルボポールは、ポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸ホモポリマーである。
【００９３】
パートＩＩＩ。糖脂質アジュバント溶液の使用。
糖脂質アジュバント溶液は、薬学的に許容できる塩形態で、抗原と混ぜることができる。好都合な抗原には、微生物病原体タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、トキソイド、炭水化物、および腫瘍特異性抗原が含まれる。抗原は、様々な源から誘導することができる。微生物病原体由来の抗原には、疾患を引き起こす細菌、ウイルス、および寄生生物が含まれる。２種以上の抗原の混合物を用いることができる。抗原は、死んでいる、自然に弱毒化されている、修飾型生存の（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｖｅ）、またはタンパク質抽出物、組換え的に産生されたタンパク質、化学的に合成されたペプチドまたは免疫応答を刺激する他のいかなるものであってもよい。ペプチド抗原は、遊離のペプチドとして存在するか、または糖脂質にコンジュゲートされているか、または他の知られているＢ細胞もしくはＴ細胞エピトープにコンジュゲートされていてもよい。
【００９４】
安定な糖脂質アジュバント溶液は、アジュバント特性を有することが知られている追加のアジュバントまたは構成成分と組み合わせることができる。糖脂質アジュバント溶液と組み合わせることができる追加のアジュバントには、ポリマー、それらの粗製または部分精製された形態の天然に存在するテルペノイド化合物、両親媒性四級アミン、細菌の細胞壁材料の誘導体および細菌の細胞壁またはＤＮＡ成分の合成類似体が含まれる。糖脂質アジュバント溶液は、抗生物質または様々な抗原などの１種または複数の作用物質と一緒に使用するか、それらと組み合わせることができる。細菌またはウイルス抗原は、死んでいるか、または修飾型生存のどちらかであってよい。死んだウイルスの抗原は、組織培養においてウイルスを増殖させ、化学的処理によりウイルスを不活性化することにより調製される。一部のウイルスは、孵化卵において増殖させることができる。死んだウイルスの抗原は、糖脂質アジュバント溶液を含有する溶液に加えることができ、得られる溶液を使用して動物にワクチン接種し、ウイルス感染に対する防御を実現することができる。
【００９５】
本発明の一実施形態において、糖脂質アジュバント溶液は、修飾型生存ウイルス抗原のための希釈剤として使用することができる。ウイルス病原体は、それらを組織培養で数世代にわたって継代することによるか、またはウイルスゲノムの特異的操作を介して、それらの毒性を弱毒化することができる。ウイルスのそのような弱毒化株は、組織培養で極めて高い力価まで増殖させることができ、ワクチン抗原として使用することができる。弱毒化ウイルス株は、修飾型生存ウイルス抗原と呼ばれる。これらの株は、毒性が少ないが、それらは、ワクチン中の抗原として使用される場合、依然として極めて免疫原性であり、毒性株による感染に対する防御を提供する。糖脂質アジュバント溶液は、修飾型生存ウイルス抗原のための希釈剤として使用すべきであり、糖脂質アジュバント溶液は、関心のある特定のウイルスに対していかなる殺ウイルス効果も有していないことを保証するために試験されるべきである。
【００９６】
修飾型生存ウイルス抗原に対する糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス特性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において決定することができる。凍結乾燥したウイルス抗原を、糖脂質アジュバント溶液または水で再水和する。得られるウイルス溶液を、許容細胞の単層上にプレートする。ウイルス抗原の力価は、単層上に形成されるプラーク数をカウントすることにより決定される。水と糖脂質アジュバント溶液で再水和されたサンプル間で得られるウイルス力価の差を用い、もしあれば、任意の生ウイルスに対する糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス効果を決定することができる。
【００９７】
修飾型生存ウイルス抗原は、凍結乾燥し、商業用のワクチン調製物における凍結乾燥ケーキとして提供することができる。一般に、これらの修飾型生存ウイルス抗原の凍結乾燥ケーキは、希釈剤溶液で再水和され、非経口ワクチン接種のために使用される。希釈剤の例には、リン酸緩衝溶液を含有する水溶液が含まれる。希釈剤溶液が、知られている免疫刺激性分子を含有する場合、修飾型生存ウイルス抗原によるワクチン接種の効率が改善されることがある。本発明の一実施形態において、糖脂質アジュバント溶液は、希釈剤溶液として使用される。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
等濃度のＢａｙ １５−５８３１（登録商標）および酢酸による不溶性のグリコシルアミン組成物の調製
【００９９】
【表１】
【０１００】
Ｂａｙ １５−５８３１（登録商標）は、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙに登録されており、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドの商品名である。この化合物を使用し、酢酸が、糖脂質に対して等モル濃度で使用され、糖脂質が、その遊離の塩基形態である上記の表１に記載されている組成を用いてアジュバント溶液を作製する場合、糖脂質は、不溶性であり、凝集する。
【０１０１】
（実施例２）
実施例１と同じ構成成分を用いるが、糖脂質の濃度に対して酢酸濃度を増加させた可溶性のグリコシルアミドストック溶液は、可溶性のグリコシルアミドストック溶液をもたらす。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
ここでは、６０％エタノール（ｖ／ｖ）を使用した。糖脂質に対する酢酸のモル比は、２．０である。実施例１の２００−プルーフエタノールは、６０％エタノール水で置き換えた。得られたグリコシルアミドストック溶液は、光学的に澄明であり、容器の底に沈殿はなかった。このグリコシルアミドストック溶液を様々な緩衝液に加え、以下の実施例３における糖脂質アジュバント溶液を作製した。
【０１０４】
（実施例３）
糖脂質アジュバント溶液の調製。異なるｐＨでリン酸緩衝液を調製した。一塩基性リン酸ナトリウム溶液の２Ｍストックは、ビーカー中でＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ１３８グラムをＤＩ水２５０ｍＬに溶かし、５００ｍＬの最終容積にすることにより調製した。同様に、二塩基性リン酸ナトリウム溶液の２Ｍストックは、ビーカー中でＮａＨ２ＰＯ４１４２グラムをＤＩ水３００ｍＬに溶かし、５００ｍＬの最終容積にすることにより調製した。両ストック溶液は、０．２ミクロンのフィルターを用いて無菌濾過した。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
表３に示すような一塩基性リン酸ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウム溶液の様々な容積の２Ｍストックを調製し、次いで、様々なｐＨレベルで、リン酸ナトリウム緩衝溶液の１Ｍストック溶液を得た。次いで、１Ｍリン酸緩衝溶液を５０倍に希釈し、２０ｍＭリン酸緩衝液を得た。
【０１０７】
糖脂質アジュバント溶液は、これらのストック緩衝液および実施例２からのグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。
【０１０８】
これらの２０ｍＭリン酸溶液の各々９６ｍＬに、実施例２において調製されたようなグリコシルアミドストック溶液５ｍＬを加えた。得られた糖脂質アジュバント溶液は、１２．５ｍＭ酢酸および６．３３ｍＭ糖脂質を含有していた。糖脂質は、この時点でアセテート形態である。
【０１０９】
（実施例４）
糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨの意義
別の一連の実験において、様々な溶液の最終ｐＨの意義を試験し、ｐＨが凝集にどのように影響するかを評価した。２０ｍＭリン酸緩衝液は、７．８の初期ｐＨにおいて調製した。表４は、糖脂質および酢酸が、等モル濃度で使用された実施例１におけるように調製されたグリコシルアミドを用いて調製された糖脂質アジュバントを示している。最終ｐＨは、極めて大きくは低下せず（表４）、緩衝液の有効性を示していることに留意されたい。ＮａＣｌ濃度を変化させた。表４における６００ｎｍにおける光学密度の読み取り値（Ｏ．Ｄ．）を、糖脂質アジュバント溶液が、実施例２において調製されたような糖脂質に対して２倍のモル比の酢酸を含有するグリコシルアミドストック溶液で調製された表５における類似の読み取り値と比較した。より大きな濃度または量の酢酸を用いると、最低限の凝集が生じる。凝集は、濾過したサンプルにおけるよりも濾過しないサンプルにおいて多かった。さらに、ＮａＣｌ濃度が増加すると、凝集の増加および沈殿さえも認められた。表５に記載されている糖脂質アジュバント溶液は、８．０の初期ｐＨを有するリン酸緩衝液で調製し、糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨは、６．８〜７．０であった。糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨをさらに下げると、濁度の低く凝集のない糖脂質アジュバント溶液が得られることがある。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
０．１未満の光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、半透明の溶液に相当する。０．１〜０．５の光学密度は、濁度がわずかで均一であり、０．５〜１．０の光学密度は、ある程度の濁度を有し、１．０〜１．５の光学密度は、濁っていると見なされる。１．５を超える光学密度は、濁っており、０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過できる可能性はない。後者は、一般的に、商業的に適しているとは見なされないであろう。
【０１１３】
（実施例５）
凝集を示す糖脂質アジュバントの酢酸による滴定は、逆転することができる。凝集を示す糖脂質アジュバントに漸増量の酢酸を加えることが凝集を逆転させるか否かを決定するため、実施例１に記載されているような糖脂質アジュバントを調製した。この糖脂質アジュバントは、ＮａＣｌがなくても凝集を示した。漸増濃度の酢酸を、この凝集した糖脂質アジュバント混合物に加えた。酢酸を水で１６．６倍に希釈し、１モルの作業溶液濃度を得た。次いで、この１Ｍ溶液１５μｌを、糖脂質アジュバント混合物１５ｍｌに加え、酢酸濃度を１ｍＭずつ増加させた。漸増濃度の酢酸で、糖脂質アジュバントのｐＨは下がり、凝集物は溶けた。しかしながら、糖脂質アジュバントは、いくらか濁ったままであった。この知見は、酢酸濃度を増加させることが、Ｂａｙ １５−５３８１の遊離塩基を、水溶液により可溶性であるアセテート形態に変換することを裏付けている。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
（実施例６）
ＮａＣｌを含む、およびＮａＣｌを含まない第２の安定な糖脂質アジュバント溶液の調製。糖脂質溶液の安定性を維持する際の酢酸の量の増加の重要性を証明した後、表８に示す組成を用いてまずグリコシルアミドストック溶液を調製し、次いで、これを用いてＮａＣｌを含む、およびＮａＣｌを含まない別の糖脂質アジュバント溶液を調製することを決定した。このグリコシルアミドストック溶液は、総容積が４倍で比較的大量の酢酸およびＴｗｅｅｎ２０である実施例２における溶液と同様である。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
様々な濃度のＮａＣｌを含む３つの異なる糖脂質アジュバント溶液を、実施例３からのリン酸緩衝液および表８におけるように調製されたグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。
【０１１８】
実施例４、表５における製剤と同様、０ｍＭ、１５ｍＭ、および１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液を作製した。０ｍＭおよび１５ｍＭ ＮａＣｌ溶液は、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過することができた。１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過することができなかった。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
糖脂質アジュバント溶液の各々２０ｍＬを、３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、室温および４℃においてインキュベートした。目視観察を規則的間隔で行った。当初、０ｍＭ ＮａＣｌを含む糖脂質アジュバント溶液は、光学的に澄明であった。１５ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、わずかに濁っており、６００ｎｍにおいて０．０７３のＯ．Ｄ．を有していた。１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、濁っており、６００ｎｍにおいて０．４３９のＯ．Ｄ．を有していた。表９。これらの糖脂質アジュバント溶液のどれも、室温と４℃の両方において凝集のいかなる徴候も示さなかった。これらの糖脂質アジュバント溶液は、外見の変化なしに１年間にわたって観察された。
【０１２１】
（実施例７）
ＮａＯＨによる安定な糖脂質アジュバント溶液の滴定。
最初に、光学的に澄明で安定な糖脂質アジュバント溶液を、ＮａＯＨなしで得た。最少量のＮａＯＨの除去または使用が、凝集を防ぐのに不可欠であることを証明するため、ＮａＯＨの段階的添加が、さもなければ安定な糖脂質混合物において凝集を誘発することを示す必要がある。以下の表１０において調製されるように、適切な容積の１Ｎ ＮａＯＨを、ＮａＣｌを全く加えていない糖脂質アジュバント溶液１５ｍＬに加えた。ＮａＯＨは、１ｍＭから１２ｍＭまで徐々に増加させた（表１０）。この実験において使用される糖脂質アジュバント溶液は、実施例６に記載されているグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。糖脂質アジュバント溶液における漸増濃度のＮａＯＨにより、製剤のｐＨは、凝集の出現を伴って徐々に増加した。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
（実施例８）
ＨＰＬＣを用いる糖脂質成分の定量
以下の方法を、Ｂａｙ １５−５３８１（登録商標）のＨＰＬＣ分析において使用した。表１１に記載されているＨＰＬＣパラメーターを使用した。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
０．１０〜１．０３ｍＭの範囲の標準品を調製し、ＨＰＬＣに注入した。標準品の要約を表１２に示す。サンプルを、室温まで温め、使用する前に５分逆さにした。サンプル１ｍｌを、１０ｍｌのメスフラスコ中のメタノール６ｍｌに加えた。次いで、サンプルを１０分間超音波処理し、次いで、定容積まで希釈し、混ぜた。濃度に対してプロットされたピーク面積で標準品に対して直線回帰を行った。次いで、サンプルを、曲線に対して計算した。
【０１２７】
（実施例９）
３０リットル規模の生産。実施例６に記載されているような組成の３０リットルバッチの糖脂質アジュバント溶液を調製した。このバッチは、１５ｍＭ ＮａＣｌを含有していた。
【０１２８】
この３０Ｌ調製物を用い、５つの異なるサブ溶液を、漸増濃度のＮａＯＨと共に調製した。ＮａＯＨ濃度は、０ｍＭから、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ、および１２ｍＭまで増加させた。各ＮａＯＨ濃度についてのサンプルを、ｐＨ測定および目視観察のために等分した。漸増量のＮａＯＨにより、糖脂質アジュバントのｐＨは、凝集の増加と共に増加した。凝集は、室温において２ｍＭ ＮａＯＨ濃度で現れ始め、４℃において、凝集は、４ｍＭ ＮａＯＨにおいて現れ始めた。
【０１２９】
【表１２】
【０１３０】
表１３に示す６つのサンプルすべてにおけるＢａｙ １５−５３８１の量は、実施例８に記載されているＨＰＬＣ法を用いて定量した。様々なｐＨのサンプルは、同じ濃度のＢａｙ １５−５３８１を示し、アジュバント成分が、ＮａＯＨの添加によるｐＨ増加および付随する凝集の間に分解されないことを示唆していた。
【０１３１】
（実施例１０）
加速ストレス試験を用いる安定性評価。この実施例は、糖脂質アジュバント溶液に対する加速ストレス試験の方法および結果について記載している。実施例６に記載されているような糖脂質アジュバント溶液の３つのバッチを５００Ｌ規模で調製した。３つのバッチはすべて、１５ｍＭ ＮａＣｌを有し、ＮａＯＨは含有していなかった。これら３つの５００Ｌバッチからの糖脂質アジュバント溶液を、加速安定性試験を用いる糖脂質の安定性を研究するために使用した。
【０１３２】
加速ストレス試験の場合、糖脂質アジュバント溶液を、３７℃における７日間にわたるかき混ぜと、続いて、２日間にわたる４℃におけるかき混ぜにさらす。３７℃における７日間のかき混ぜは、１年間の４℃における経年劣化に相当する。２日間の４℃におけるかき混ぜは、輸送中のストレスに相当する。
【０１３３】
１組の糖脂質アジュバント溶液を、７日間にわたり３７℃において静止状態に保ち、次いで、さらに２日間にわたり４℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜた。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３４】
第２組の糖脂質アジュバント溶液を、７日間にわたり３７℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜ、次いで、さらに２日間にわたり４℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜた。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３５】
第３組の糖脂質アジュバント溶液を、対照として、９日間にわたり４℃において静止状態にした。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３６】
ストレス試験の結果として、粒径の変化はなかった。すべてのサンプルは、調製された直後のサンプルにおいて観察されるサブミクロンの粒径を維持した。さらに、７日間にわたり４℃において保たれたか、または３７℃においてストレスにさらされたサンプル中のＢａｙ １５−５３８１（登録商標）成分のＨＰＬＣ測定は、Ｂａｙ １５−５３８１（登録商標）の量に何らの変化も示さなかった。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】
表１５において、対照サンプルは、７日間にわたり４℃において保ち、試験サンプルは、７日間にわたり３７℃においてかき混ぜた。７日間にわたり３７℃においてかき混ぜたサンプルは、４℃において保管したサンプルと同様の濃度を有している。
【０１３９】
（実施例１１）
糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス試験。
殺ウイルス試験は、実施例９において上記に記載されているような３０Ｌ規模で調製された糖脂質アジュバント溶液について行った。この糖脂質アジュバント溶液は、１５ｍＭ ＮａＣｌを含有し、ＮａＯＨは含有していなかった。
【０１４０】
糖脂質アジュバントを、修飾型生存ウイルスと一緒に希釈剤としてそれを使用するための適合性について試験した。修飾型生存ウイルス抗原は、凍結乾燥プラグとして調製される。適当な糖脂質アジュバント溶液でこれらのプラグを再水和すると、使用された糖脂質アジュバント溶液が修飾型生存ウイルスを殺さないことが裏付けられた。糖脂質アジュバント溶液を、３種のウシウイルス抗原、すなわち、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、および伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルスに対して試験した。
【０１４１】
ウイルスプラグを、糖脂質アジュバント溶液を用いて再水和した。１時間にわたる室温（ＲＴ）におけるインキュベーション後、サンプルを、段階希釈で許容細胞系の単層上にプレートした。単層上に現れるウイルスプラグ数をカウントすることにより、滅菌水または糖脂質アジュバント溶液で再水和された各ウイルス抗原について、１ｍｌ当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）値が得られた。このアッセイにおいて、試験糖脂質アジュバント溶液による再水和後の０．７の力価の減少は、殺ウイルス性であるとして扱われた。
【０１４２】
結果を表１６に示す。糖脂質アジュバント溶液は、これらの３種のウシウイルスに対していなかる殺ウイルス効果も示さなかった。
【０１４３】
【表１４】
【０１４４】
この実施例は、糖脂質アジュバント溶液が、Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈワクチンの商業製剤において使用することができることを示している。Ｒｉｓｐｏｖａｌ（登録商標）は、３種の修飾型生存ウイルス抗原を用いる３種の異なるウシウイルス疾患を含有している。これらのウシウイルス抗原は、修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３である。これらのウイルス抗原は、凍結乾燥ケーキとして製造され、本発明により製造される糖脂質アジュバント溶液を、これらの抗原のための希釈剤溶液として使用することができる。使用される糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテートであった。
【０１４５】
実施例は、本発明を例示するために提供される。実施例は、本発明の範囲を限定していると受け止められるべきではない。本発明の多くの変更形態、変形形態、修正形態、ならびに他の用途および応用は、当業者に明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質アジュバントの新規組成物、それらを使用するための方法、およびそれらを調製するための方法に関する。本発明の新規組成物は、凝集することなく長期間安定である。本発明の新規組成物は、ワクチンを含む様々な医薬を送達するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、通常、細菌、ウイルス、および寄生生物によって引き起こされる感染性疾患からヒトおよび獣医学動物を守るために使用される。ワクチンにおいて使用される抗原は、任意の様々な作用物質であってよいが、通常、死んだ病原性生物、生きているが修飾または弱毒化されている病原性生物、タンパク質、組換えタンパク質またはそれらの断片からなっている。抗原の源が何であれ、抗原に対する宿主の免疫応答を高めるためにアジュバントを加えることが必要であることが多い。
【０００３】
アジュバントは、２つの目的を達成するために使用され、すなわち、アジュバントは、注射部位からの抗原の放出を遅延させ、アジュバントは、免疫系を刺激する。
【０００４】
文献で報告された最初のアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）であった。ＦＣＡは、油中水型乳剤およびマイコバクテリアの抽出物を含有する。マイコバクテリア抽出物は、粗製の形態で免疫刺激性分子を提供する。油中水型乳剤は、抗原がゆっくりと放出されるデポ効果を生み出す働きをする。残念なことに、ＦＣＡは、耐容性に乏しく、コントロール不良の炎症を引き起こすことがある。８０年以上前のＦＣＡの発見以来、アジュバントの望ましくない副作用を低減するための努力が行われてきた。
【０００５】
現在、アジュバント特性を有する新しい種類の化合物を含む糖脂質類似体が知られている。米国特許第４，８５５，２８３号（以下‘２８３）は、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素、Ｎ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体、具体的には、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート（Ｂａｙ Ｒ１００５として知られている、Ｏ Ｌｏｃｋｈｏｆｆ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）３０：１６１１〜１６２０）の合成を開示している。‘２８３特許に記載されている化合物は、アジュバントとして使用するのに特に適している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖脂質アジュバント製剤は、製造が容易であり、脂質成分の凝集を示すことなく長期間保管した場合に安定である必要がある。糖脂質アミドまたはグリコシルアミドの非アセテート形態は、極めて不溶性であり、通常、室温またはそれ以下の温度で保管すると溶液から凝集する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で提供されるグリコシルアミドを含む溶液およびアジュバントは、ほとんど凝集を示さず、全く安定である。それらは、製造が容易であり、商業規模で調製することができる。液状の糖脂質アジュバント製剤を希釈剤として用い、凍結乾燥抗原調製物を再水和することができる。リアルタイムで、および加速安定性試験プロトコルにより、これらの製剤の安定性を試験する方法も提供される。
【０００８】
本発明は、グリコシルアミドストック溶液と糖脂質アジュバント溶液の両方を作製または製造する組成物および方法を含む。グリコシルアミドストック溶液は、式１の糖脂質をアルコールに溶かし、これを、適切な量の弱酸および「非イオン性」界面活性剤と混ぜ合わせることにより調製される。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰の弱酸として糖脂質アルコール溶液に加える。一実施形態において、糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセテートである。一実施形態において、アルコールは、エタノールである。一実施形態において、弱酸は、酢酸である。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、様々なソルビタン（Ｓｐａｎ（登録商標））またはポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、特に、モノラウレートソルビタン（Ｓｐａｎ２０（登録商標））およびモノラウレートポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））である。糖脂質アジュバント溶液は、適切な量のグリコシルアミドストック溶液を「適当な緩衝液」に導入することにより調製される。本明細書に記載されている最終的な安定な糖脂質アジュバント溶液のｐＨは、約６〜約８とすべきである。約６〜約７の最終ｐＨが好ましい。約６．３〜約６．４の最終ｐＨが記載されている。糖脂質アジュバントの高い塩濃度、すなわち３０ｍＭ ＮａＣｌを超える塩濃度は、避けるべきである。
【０００９】
これらの２つの溶液は、以下の通りさらに詳細に例示される。
グリコシルアミドストック溶液は、
ａ）塩形態である、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【００１０】
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される）である）、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ値を有する任意の酸である）、および
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）を含む組成物である。
糖脂質アジュバント溶液は、
ａ）グリコシルアミドストック溶液、および
ｂ）適当な緩衝液（ここで、緩衝液は、獣医学的または医学的使用に適している緩衝液であり、約６．０〜約８．０の水溶液中での比較的一定したｐＨを維持することができる）を含む組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
特に指定のない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される以下の用語は、以下に示す意味を有する。
【００１２】
用語「アルコール」は、式：ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルの化合物を指す。アルコールは、メタノール、エタノール、またはｎ−プロパノールもしくはイソ−プロパノールなどの任意の形態のプロパノールであってよい。エタノールが好ましい。
【００１３】
用語「アルキル」は、直鎖飽和炭化水素部分と分岐飽和炭化水素部分の両方を指す。
【００１４】
用語「糖脂質」は、以下の式Ｉの化合物を指す。これらの化合物は、米国特許第６，２９０，９７１号、および１９８９年８月８日に出願された米国特許第４，８５５，２８３号に記載されている。米国特許第６，２９０，９７１号と米国特許第４，８５５，２８３号は共に、全体として参照により本明細書に組み込まれるものとする。ここに特に記載されている糖脂質は、そのアセテート形態である場合、商品名Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）、および化学名「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート」を有する。この化合物のアミド形態は、商品名Ｂａｙ １５−１５８３（登録商標）、および化学名「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミド」を有する。
【００１５】
式Ｉの糖脂質は、
【００１６】
【化２】
（式中、
Ｒ１は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体である）、
または薬学的に許容できるそれらの塩である。
【００１７】
別の特定の実施形態は、
Ｒ１が、水素、または飽和Ｃ１２〜１８アルキルであり、
Ｒ２が、水素、または飽和Ｃ７〜１１アルキルであり、
Ｘが、−ＣＨ２であり、
Ｒ４、およびＲ５が、独立して、水素であり、
Ｒ６が、Ｌ−ロイシルから選択される式１の糖脂質について記載している。
【００１８】
式Ｉのための変数は、別個で独立しており、変数のすべての組合せは、本明細書において記載され、特許請求の範囲に記載されている。
【００１９】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩ（ａ）によって示される糖脂質である。
【００２０】
【化３】
【００２１】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩ（ｂ）によって示される糖脂質である。
【００２２】
【化４】
【００２３】
別の実施形態において、糖脂質は、式ＩＩＩの構造を有する糖脂質である。
【００２４】
【化５】
【００２５】
式ＩＩＩの化合物は、アミド形態かアセテート形態のどちらかで存在することができる。この化合物のアミド形態は、商品名Ｂａｙ １５−１５８３（登録商標）を有する。アセテート形態は、商品名Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）を有する。
【００２６】
式Ｉの糖脂質は、米国特許第４，８５５，２８３号から得られる以下の手順を用いて作製することができる。
【００２７】
式１から分かるように、本発明による化合物は、置換２−アミノ−２−デオキシヘキソースをベースにしている。これらの糖は、常に、Ｃ−１、アノマー炭素原子を介して、アシルアミド、カルバミドまたはアルコキシカルボニルアミド基
【００２８】
【化６】
（Ｒ１、Ｒ２およびＸは、上述の意味を有する）とＮ−グリコシド結合している。
【００２９】
式Ｉの本発明による化合物におけるアミノ糖の２−アミノ基は、α−アミノ酸またはα−アミノ酸誘導体とアミド結合している。
【００３０】
アミノ酸は、グリシン、サルコシン、馬尿酸、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、オルニチン、シトルリン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファンおよびヒスチジンなどの天然Ｌ−アミノ酸である。Ｄ−アラニンなどのＤ−アミノ酸、Ｄ体とＬ体の両方のα−アミノ酪酸、α−アミノ吉草酸、α−アミノカプロン酸もしくはα−アミノヘプタン酸などのアミノカルボン酸も、アミノ糖上の置換基としての役割を果たすと記載されている。
【００３１】
式Ｉによる化合物を調製するためのプロセスも提供される。これは、アミノ基が保護されている２−アミノ−２−デオキシグリコピラノース誘導体（式ＩＶ）
【００３２】
【化７】
（式中、Ｒ１０は、ペプチドの合成から知られているアミノ基を保護するための保護基を表し、適切な場合、選択的に除去することができる）から出発するものである。
【００３３】
適当な保護基の例は、トリフルオロアセチルまたはトリクロロアセチルなどのアシル基、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、またはメトキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルもしくは２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル基などの、置換されていてもよい低級アルコキシカルボニル基である。適当なＮ−保護アミノ−ヘキソース誘導体が知られている。例えば、Ｍ．ＢｅｒｇｍａｎｎおよびＬ．Ｚｅｒｖａｓ、Ｂｅｒ．６４、９７５（１９３１）；Ｄ．Ｈｏｒｔｏｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２９、１７７６（１９６４）；Ｐ．Ｈ．ＧｒｏｓｓおよびＲ．Ｗ．Ｊｅａｎｌｏｚ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２、２７５９（１９６７）；Ｍ．Ｌ．ＷｏｌｆｒｏｍおよびＨ．Ｂ．Ｂｈａｔ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２、１８２１（１９６７）；一般：Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ（編集者）．Ｐｒｏｔ．Ｇｒｏｕｐｓ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９７３）；「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」第３巻、１〜９９ページ、（１９８１）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ中のＧｅｉｇｅｒ；ならびにそこに引用されている文献。式Ｉによる化合物を調製するのに好ましいアミノ保護基は、ＢＯＣ基（ｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル）またはＺ基（ベンジルオキシカルボニル）である。
【００３４】
保護アミノ糖誘導体（ＩＶ）を、第１の反応ステップにおいて、アミン（式Ｖ）、
Ｈ２Ｎ−Ｒ１（Ｖ）
（Ｒ１は、上述の意味を有する）と反応させると、グリコシルアミン（式ＶＩ）が得られる。
【００３５】
【化８】
【００３６】
このタイプのグリコシルアミン調製は、原則として知られており（ＥＬＬＩＳ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、９５（１９５５））、具体的には、ＤＥ−ＯＳ（ドイツ公開明細書（Ｇｅｒｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ））第３，２１３，６５０号に記載されている。
【００３７】
第２の反応ステップにおいて、グリコシルアミン（ＶＩ）を、カルボキシルハライド、またはカルボン酸無水物などの適当なカルボン酸誘導体（式ＶＩＩ）、
Ｒ１１−ＣＯ−ＣＨ２−Ｒ４（ＶＩＩ）
（Ｒ２は、上述の意味を有し、Ｒ１１は、例えば、塩素などのハロゲンを表し、または−Ｏ−ＣＯ−Ｒ２（Ｒ２は、上述の意味を有する）を表し、または−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−低級アルキルを表す）のどれかと反応させる。このようにして、グリコシルアミド（式ＶＩＩＩ）
【００３８】
【化９】
（式中、Ｒ１、およびＲ２は、上述の意味を有し、Ｒ１０は、Ｒ６と同じであり、Ｘは、−ＣＨ２−を表す）が得られる。このタイプのＮ−アシル化の条件は、ＤＥ−ＯＳ（ドイツ公開明細書）第３，２１３，６５０号に示されている。
【００３９】
好ましい実施形態において、式ＶＩのグリコシルアミンを、１〜２当量のカルボニルクロリド（式ＶＩＩ）または文献から知られている方法により、有機補助塩基の存在下、関連するカルボン酸Ｒ２−−ＣＨ２−−ＣＯ２Ｈおよびクロロギ酸エチルまたはクロロギ酸イソブチルから得られた１〜２当量の混合無水物と反応させると、Ｘ＝−ＣＨ２−である式ＶＩＩＩのグリコシルアミドが得られる。
【００４０】
これは、適切な場合に無機または有機塩基の存在下、０℃〜５０℃の有機または水性−有機溶媒中行われる。適当な希釈剤は、メタノール、エタノール、１−プロパノールもしくは２−プロパノールなどのアルコール、またはジエチルエーテル、テトラヒドロフランもしくは１，４−ジオキサンなどのエーテル、またはジクロロメタン、トリクロロメタンもしくは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００４１】
第１のステップにおいて得られるグリコシルアミン（ＶＩ）を、ハロゲノギ酸エステル（ＩＸ）
Ｒ１２−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２（ＩＸ）
（Ｒ１２は、例えば、塩素または臭素などのハロゲンを表し、Ｒ２は、上述の意味を有する）と反応させた場合、グリコシルカルバメート（ＶＩＩＩ）が得られ、式ＶＩＩＩにおけるＸは、酸素を表す。
【００４２】
一実施形態において、式ＶＩＩＩのグリコシルアミンを１〜２当量のクロロ炭酸エステルＩＸと反応させると、グリコシルカルバメートが得られる。これは、０℃〜５０℃の温度であるが、特に好ましくは室温において、有機または水性−有機溶媒中で行われることが好ましい。適当な溶媒は、上記で述べたようなアルコール、エーテル、ハロゲン化炭化水素またはジメチルホルムアミドである。
【００４３】
第１のステップにおいて得られるグリコシルアミン（ＶＩ）を、１〜２当量の有機イソシアネート（式Ｘ）
Ｒ２−ＮＣＯ（Ｘ）
（Ｒ２は、上述の意味を有する）と反応させた場合、式ＶＩＩＩのグリコシル尿素が得られ、Ｘは、−ＮＨ−である。このアシル化反応は、上述の反応と同様、−２０℃〜６０℃、好ましくは０℃〜２５℃の反応温度で、有機溶媒中で行われることが好ましい。適当な溶媒は、上述のアルコール、エーテル、ハロゲン化炭化水素、またはジメチルホルムアミドである。
【００４４】
このようにして得られるグリコシルアミド（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−ＣＨ２−）、グリコシルカルバメート（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−Ｏ−）またはグリコシル尿素（式ＶＩＩＩ、Ｘ＝−ＮＨ−）は、それ自体知られているプロセスにより結晶性または非晶質の固体の形態で単離され、必要な場合、再結晶、クロマトグラフィー、抽出などの標準的な手順により精製される。
【００４５】
多くの場合、上述の精製ステップと並行して、またはそれらの代わりに、良好な結晶化特性を有する式ＶＩＩＩのグリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素の誘導体をもたらす化学誘導体化を行うことも有利である。このタイプの化学誘導体化は、本発明によるグリコシルアミド、グリコシルカルバメートおよびグリコシル尿素の場合、例えば、糖残基のヒドロキシル基上のエステル化反応である。適当なエステル基の例は、アセチル、ベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイル基である。
【００４６】
グリコシルアミド、グリコシル尿素またはグリコシルカルバメートのトリ−Ｏ−アセチル誘導体を調製するため、対応するトリオール（式ＶＩＩＩ）を、無機または有機補助塩基の存在下、アシル化剤と反応させる。適当なアシル化剤は、塩化アセチル、塩化ベンゾイルもしくは塩化ｐ−ニトロベンジルなどの酸塩化物、または、例えば、無水酢酸などの無水物である。これにより、式ＸＩによるエステル
【００４７】
【化１０】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１０およびＸは、上述の意味を有し、
Ｒ１３は、アセチル、ベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイルを表す）が生成する。
【００４８】
Ｏ−アシル化反応は、不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。使用することができる溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタンまたは１，２−ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、テトラヒドロフラン、または１，４−ジオキサンなどのエーテル、酢酸エチルなどのエステル、およびジメチルホルムアミドなどのアミドである。
【００４９】
トリエチルアミンまたはピリジンなどの有機塩基単独を、適当な溶媒として示すことも可能である。使用することができる塩基は、Ｏ−アシル化のために有機化学において使用されるすべての塩基である。トリエチルアミン、ピリジンまたは混合物ピリジン／４−ジメチルアミノピリジンを使用することが好ましい。トリエステル（式ＸＩ）は、有機溶媒から容易に結晶化することができる。結晶化にとって、短鎖アルコール、すなわち、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノールなどの極性溶媒が特に好ましい。トリエステル（式ＸＩ）の結晶化に適している他の溶媒は、有機溶媒と極性の無機または有機溶媒の混合物、例えば、テトラヒドロフラン−メタノール、テトラヒドロフラン−水、エタノール−水、およびイソプロパノール−水である。単回または、適切な場合、複数回の再結晶によって精製されたトリエステル（式ＸＩ）を、３個のＯ−アセチル基の加水分解またはエステル交換によってトリオール（式ＶＩＩＩ）に戻す。有機化学では、多くのタイプのエステル切断が知られている。トリエステル（式ＸＩ）からのトリオール（式ＶＩＩＩ）の調製については、有機化学においてＺＥＭＰＬＥＮ加水分解として知られているメタノールおよび触媒量のナトリウムメタノレートの存在下でのアシル基のエステル交換を挙げることができる。
【００５０】
本発明による式Ｉの化合物の調製における第３の反応ステップは、式ＶＩＩＩの化合物における糖上の２−アミノ基の保護基の選択的切断を含む。この反応において、式ＶＩＩＩの化合物における糖上の１−アミドまたは１−カルバミドまたは１−（アルコキシカルボニルアミド）基が同時に除去されないように特別の注意を払わなければならない。
【００５１】
アミノヘキサンのＣ−２上の使用されることが好ましいベンジルオキシカルボニル基は、水素化分解の条件下で、１−アミド、１−カルバミドまたは１−アルコキシカルボニルアミド基を保持しながら定量的および選択的に切断することができる。この水素化分解は、以下の構造式（ＸＩＩ）
【００５２】
【化１１】
（Ｒ１、Ｒ２およびＸは、上述の意味を有する）の糖上に遊離の２−アミノ基を有するグリコシルアミド、グリコシル尿素またはグリコシルカルバメートを提供する。
【００５３】
水素化分解に適している触媒の例は、活性炭上に吸着されている白金またはパラジウムなどの貴金属である。パラジウム／炭素（５％または１０％）を使用することが好ましい。水素化分解は、適当な圧力容器中で大気圧または高圧下で行うことができる。例えば、メタノール、エタノール、もしくはプロパノールなどのアルコール、テトラヒドロフランもしくは１，４−ジオキサンなどのエーテル、または酢酸などのカルボン酸、またはそれらの混合物などの不活性溶媒が、水素化に適している。適切な場合、溶媒を、水または塩酸もしくは硫酸などの希酸と混ぜる。言うまでもなく、そのような酸を加える場合、式ＸＩＩによる２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、これらの酸のアンモニウム塩として得られる。式ＶＩＩＩの化合物において同様に使用されることが好ましいｔ−ブチルオキシカルボニル保護基は、塩酸または硫酸などの鉱酸を用いる文献から知られている方法により切断することができる。この場合も、式ＸＩＩの２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、切断に使用される酸のアンモニウム塩として選択的に得られる。
【００５４】
本発明による式Ｉの化合物を合成するための第４の反応ステップは、式ＸＩＩによるアミノグリコシルアミド、アミド、−カルバメートもしくは−尿素、またはそれらの塩の、適当なアミノ酸誘導体との連結を含む。 適当なアミノ酸誘導体は、Ｎ−保護アミノ酸（式ＸＩＩＩ）
【００５５】
【化１２】
（Ｒ７は、上述の意味を有し、
Ｒ８は、水素またはメチルを表し、
Ｒ１４は、ペプチド合成において習慣的に使用され、ペプチド結合を保持しながら選択的に再び除去することができる保護基を表す）である。
【００５６】
使用されることが好ましい式ＸＩＩＩにおけるアミノ基のための保護基は、上述の通りであり、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル基が特に好ましい。式ＸＩＩの２−アミノ−２−デオキシ−グリコシルアミド、−カルバメートまたは−尿素の式ＸＩＩＩのアミノ酸誘導体との連結は、ペプチド合成の従来の方法（Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈ他：Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ） ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｒｇ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）（Ｅ．Ｍｕｌｌｅｒ、編集者）、第ＸＶ／Ｉ巻および第ＸＶ／２巻、第４版、Ｔｈｉｅｍｅより発行、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９７４））により行うことができる。
【００５７】
従来のプロセスの例は、水除去剤（ｗａｔｅｒ−ｒｅｍｏｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドの存在下での式ＸＩＩの化合物中のアミノ基と式ＸＩＩＩのアミノ酸誘導体との縮合である。
【００５８】
式ＸＩＩの化合物と式ＸＩＩＩの化合物の縮合は、カルボキシル基を活性化する場合にも行うことができる。可能な活性化されたカルボキシル基は、例えば、酸無水物、好ましくは、酸の酢酸エステルなどの混合無水物、またはイミダゾリドなどの酸のアミド、または活性化されたエステルである。活性化されたエステルの例は、シアノメチルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、およびＮ−ヒドロキシフタルイミドエステルである。活性化されたエステルは、カルボジイミドなどの水除去剤の存在下で酸（式ＸＩＩＩ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたは１−ヒドロキシベンゾチアゾールからも得ることができる。アミノ酸の誘導体は、知られており、知られている方法で調製することができる。式ＸＩＩのアミノ化合物と、式ＸＩＩＩの活性化されていてもよいカルボキシル化合物との縮合は、式ＸＩＶのペプチド糖脂質を提供する
【００５９】
【化１３】
（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１４およびＸは、上述の意味を有する）。
【００６０】
式Ｉによる化合物を調製するための最終プロセスステップにおいて、式ＸＩＶの化合物における保護基Ｒ１４が除去される。式ＸＩＶの化合物中に存在する他のアミド、ウレタンまたは尿素基が切断されないようにこのステップの間は注意を払わなければならない。式ＸＩＶの化合物において使用されることが好ましい保護基Ｒ１４、Ｎ−カルボベンゾキシ基およびＮ−ｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル基は、アミド、ウレタンまたは尿素基を保持しながら除去することができる。カルボベンゾキシ基は、エタノール、メタノール、氷酢酸またはテトラヒドロフランなどの適当な溶媒中、例えば、活性炭上のパラジウムなどの貴金属の存在下での水素化分解により選択的に除去することができる。溶媒は、純粋な溶媒として使用するか、または、お互いに、もしくは水と混ぜ合わせることができる。反応は、大気圧または高圧下のどちらかで行うことができる。式ＸＩＶの化合物におけるｔｅｒｔ．−ブチルオキシカルボニル基Ｒ１４は、酸分解プロセスにより除去することができる。適当な条件の例は、室温における、例えば、氷酢酸、ジエチルエーテル、ジオキサンまたは酢酸エチルなどの適当な溶媒中での塩化水素の使用である。ｔ−ブチルカルバメートを切断するためのこのタイプのプロセスは、原則的に知られている。このようにして得られる式Ｉのペプチドグリコシルアミド、−カルバメートおよび−尿素は、それ自体知られているプロセスにより結晶性または非晶質の固体の形態で単離され、必要な場合、再結晶、クロマトグラフィー、抽出などの標準的な手順により精製される。
【００６１】
式Ｉの本発明による化合物は、同様に良好な結果で、第２の合成経路により調製することもできる。この第２の合成経路は、シントンのアミノ糖アミノ酸、アミンＲ１−ＮＨ２およびカルボン酸Ｒ２−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｈ、または炭酸誘導体Ｒ２−Ｏ−ＣＯ−−ハロゲン、またはＲ２−ＮＣＯ（Ｒ１およびＲ２は、上述の意味を有する）の連結順序が異なるという点で、上記に記載されている第１の合成経路と異なる。この第２の経路において、式ＸＶの適当な２−Ｎ−（アミノアシル）アミノ糖
【００６２】
【化１４】
（Ｒ７およびＲ８は、上述の意味を有し、Ｒ１４は、ペプチド化学において知られているアミノ保護基、好ましくは、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル基を表す）が、出発成分として使用される。次いで、このようにして得られる式ＸＶの化合物を、式ＩＩＩのアミノ化合物と縮合させると、一般式ＸＶＩのグリコシルアミン
【００６３】
【化１５】
（Ｒ１、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１４は、式ＩおよびＲ６の定義と一致する意味を有する）が得られる。
【００６４】
一般式ＶＩの化合物を調製するための上記に記載されているすべてのプロセスは、一般式ＸＶＩの化合物を調製するために使用することができる。次いで、式ＸＶＩの化合物を、上述のカルボン酸誘導体（ＶＩＩ）またはハロゲノギ酸エステル（式ＩＸ）または有機イソシアネート（式Ｘ）のどれかと反応させると、式ＸＩＶの２−（アミノアシル）−アミノグリコシルアミド（Ｘ＝−ＣＨ２−）、または式ＸＩＶの−カルバメート（Ｘ＝−Ｏ−）、または式ＸＩＶの−尿素（Ｘ＝−ＮＨ−）が得られる。これらのアシル化反応は、一般的に、グリコシルアミンとカルボン酸または炭酸誘導体との反応について上記に記載されているプロセスにより行うことができる。
【００６５】
このようにして得られる中間体（式ＸＩＶ）は、上述の物理的精製法により精製することができる。しかしながら、上記に記載されているＯ−アシル化の方法により、式ＸＩＶの化合物を、一般式ＸＶＩＩ
【００６６】
【化１６】
（変数の意味は、式１と一致している）のトリ−Ｏ−アセテートまたはトリ−Ｏ−ベンゾエートに変換することが好ましい。
【００６７】
これらの化合物は、好ましくは、メタノールまたはエタノールなどの極性溶媒から容易に結晶化し、それによって精製することができる。次いで、式ＸＶＩＩの精製された結晶性誘導体は、特に糖化学において広く使用されている上述のエステル加水分解の方法により、式ＸＩＶのトリオールに変換される。式ＸＩＶの化合物におけるアミノ酸中の保護基の最終除去は、式Ｉの化合物の調製について上記にすでに記載されている。本発明は、式Ｉの化合物の塩にも関する。これらは、主に、薬学において習慣的に使用することができる式Ｉの化合物の無毒性の塩、例えば、塩化物、酢酸塩および乳酸塩、または不活性な塩である。
【００６８】
用語「弱酸」は、標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸を意味する。本発明を限定することは意図していないが、弱酸の以下の例を、名前、式、およびおおよそのｐＫａと共に記載する。酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）（ｐＫａ４．７６）；アスコルビン酸（１）、Ｈ２（Ｃ６Ｈ６Ｏ６）（ｐＫａ４．１０）；アセチルサリチル酸、Ｈ８（Ｃ９Ｏ４）、（ｐＫａ３．５）；ブタン酸、Ｈ（Ｃ４Ｈ７Ｏ２）（ｐＫａ４．８３）；炭酸、Ｈ２ＣＯ３、（ｐＫａ４．８３ １形）；クロム酸、ＨＣｒＯ４−、（ｐＫａ６．４９ ２形）；クエン酸、Ｈ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、（ｐＫａ３．１４ １形）；クエン酸、Ｈ２Ｃ６Ｈ５Ｏ７−、（ｐＫａ４．７７ ２形）；クエン酸、（ＨＣ６Ｈ５Ｏ７）＝、（ｐＫａ６．３９ ３形）；ギ酸、Ｈ（ＣＨＯ２）、（ｐＫａ３．７５）；フマル酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ３．０３）；ヘプタン酸、Ｈ（Ｃ７Ｈ１３Ｏ２）、（ｐＫａ４．８９）；ヘキサン酸、Ｈ（Ｃ６Ｈ１１Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；フッ化水素酸、ＨＦ、（ｐＫａ３．２０）；イソシトレート（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）、Ｈ８（Ｃ６Ｏ７）（ｐＫａ３．２９）；乳酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ３）、（ｐＫａ３．０８）；マレイン酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ１．８３）；ニコチン酸、Ｈ５（Ｃ６ＮＯ２）（ｐＫ３．３９）；シュウ酸、Ｈ２（Ｃ２Ｏ４）、（ｐＫａ１．２３ １形）；シュウ酸、（ＨＣ２Ｏ４）−、（ｐＫａ４．１９ ２形）；ペンタン酸、Ｈ（Ｃ５Ｈ９Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；リン酸、Ｈ３ＰＯ４、（ｐＫａ２．１６ １形）；プロパン酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ２）、（ｐＫａ４．８６）；ピルビン酸、Ｈ４（Ｃ３Ｏ３）（ｐＫａ２．３９）；コハク酸Ｈ６（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ４．１９）およびトリクロロ酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｃｌ３Ｏ２）（ｐＫａ０．７０）。これらの酸の任意の組合せも例示される。
【００６９】
酢酸が好ましい。アセチルサリチル酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸、ピルビン酸、コハク酸およびトリクロロ酢酸は、組合せで、およびコレクションとして個別に具体化されている、より一般的な弱酸である。
【００７０】
用語「非イオン性界面活性剤」は、それが溶解している材料の表面張力を下げる物質である界面活性剤を意味し、非イオン性は、電荷を帯びていない極性基を有することを意味する。用語両親媒性界面活性剤は、界面活性剤分子の一部が疎水性であり、一部が親水性である界面活性剤を意味する。適当な界面活性剤は、非イオン性でもあり両親媒性でもあり、獣医学的または医学的使用に許容できるであろう。特定の非イオン性界面活性剤が、医学的または獣医学的使用に許容できるか否かは、当業者によって容易に決定することができる。本発明と共に使用することができる多くの適当な非イオン性界面活性剤が存在し、多数の例を以下に提供する。
【００７１】
本明細書では、２つのよく知られているタイプの非イオン性界面活性剤が具体化されている。これらは、Ｓｐａｎ（登録商標）という商標で一般的に販売されているソルビタン、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）という商標で一般的に販売されているポリオキシエチレンソルビタンとして知られている。具体的には、以下のソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０（登録商標））、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ４０（登録商標））、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ６０（登録商標））、ソルビタントリステアレート（Ｓｐａｎ６５（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０（登録商標））、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート（ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）（Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、およびポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｔｗｅｅｎ８５）が本明細書で具体化されている。これらの記述には、これらの界面活性剤用の供給カタログに列挙されているように、商品名成分、または等価成分が含まれることを意味している。界面活性剤は、個別に、または任意の組合せで使用することができる。
【００７２】
ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０（登録商標））、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｔｗｅｅｎ８５）が、特に記載されている。
【００７３】
用語「適当な緩衝液」は、獣医学的または医学的使用に適しており、約６．０〜約８．０の水溶液中での比較的一定したｐＨを維持することができる緩衝液を意味する。リン酸緩衝液は、本明細書に記載されている一実施形態である。リン酸緩衝液は、異なる比率でリン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウムの一塩基塩および二塩基塩を混ぜることにより、広い範囲で特定のｐＨにおいて作製することができる。様々なナトリウムおよびカリウム緩衝液の作製および使用は、当業者によく知られている。
【００７４】
緩衝液の他の例は、以下の
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、
［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）
である。
【００７５】
パートＩ。溶液の調製。
本明細書に開示されている新規製剤は、１）グリコシルアミドストック溶液および２）糖脂質アジュバント溶液である。
【００７６】
１）グリコシルアミドストック溶液は、糖脂質をアルコールに溶かし、適切な量の弱酸と混ぜ合わせることにより調製される。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰の弱酸として、糖脂質アルコール溶液に加える。非イオン性界面活性剤を、糖脂質アルコール酸混合物に加え、グリコシルアミドストック溶液を作製する。例示される糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドアセテートである。例示されるアルコールは、エタノールである。例示される弱酸は、酢酸である。非イオン性界面活性剤は、上記に記載されている通りである。
【００７７】
グリコシルアミドストック溶液の調製。弱酸を、糖脂質を含有するアルコール溶液に加える。弱酸は、糖脂質含有量に関してモル過剰で加える。弱酸成分は、糖脂質に対するモル当量で、糖脂質の１．２５〜５倍量を加えるべきである。特定の実施形態において、酸の以下の相対量が推奨される。弱酸は、２．０倍、２．５倍、２．７倍、３．０倍、および５．０倍とすべきであり、酸が、糖脂質のモルの２．７倍のモルであることが最も好ましい。
【００７８】
非イオン性界面活性剤を、弱酸を加える前、または弱酸を加えた後に、上記のアルコール糖脂質混合物に加え、最終グリコシルアミドストック溶液を作製する。
【００７９】
弱酸の存在下で、グリコシルアミドは、糖脂質のアセテート形態に変換される。式Ｉの糖脂質は、緩衝水溶液に直接単に導入される場合、十分に可溶性ではない。式Ｉの糖脂質を緩衝水溶液に溶かして通常得られる溶液は、乳状の混合物である。以前の研究者は、乳状の溶液を超音波処理することにより、そのような混合物の溶液を均一にしようと試みてきた。しかしながら、超音波処理は、溶液が保管中に均一のままであることを保証しない。これらの化合物を懸濁するための化学的アプローチは、適切なｐＨにおいて、水性緩衝糖脂質の十分に可溶性で、ほぼ光学的に澄明な溶液をもたらす。弱酸が、糖脂質と比較して過剰量で加えられる場合、すべての糖脂質が可溶形態に変換され、元の非可溶形態への復帰が妨げられることが保証される。
【００８０】
弱酸は、糖脂質を薬学的に許容できる塩に変換する。好ましい塩は、薬学的および生物学的調製物において習慣的に使用される無毒性の塩である。例えば、式Ｉの化合物の塩化物、酢酸塩、乳酸塩、および不活性な塩が、本明細書に記載されている弱酸で得られる。
【００８１】
糖脂質を溶かすのに使用されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールの任意の異性形態、またはそれらの任意の組合せであってよい。得られる糖脂質アルコール溶液は、光学的に澄明であろう。糖脂質のアセテート形態を元の非アセテート形態に変換することができる任意の化学反応は、水溶液の中で糖脂質の凝集を引き起こすであろう。糖脂質の凝集が起こる場合、糖脂質分子は、薄片として溶液から現れ、容器の底にたまる。糖脂質およびアルコールのグリコシルアミドストック溶液における弱酸の初期濃度は、糖脂質の凝集があるか否か決定する。弱酸は、糖脂質に関してモル過剰とし、凝集を避けるべきである。
【００８２】
２）糖脂質アジュバント溶液は、適切な量のグリコシルアミドストック溶液を「適当な緩衝液」に導入することにより調製される。本明細書に記載されている最終の安定な糖脂質アジュバント溶液のｐＨは、約６〜約８とすべきである。約６〜約７の最終ｐＨが好ましい。約６．３〜約６．４の最終ｐＨが記載されている。
【００８３】
グリコシルアミドストック溶液は、過剰の酸を含有するため、アジュバントとして使用するために緩衝化すべきである。例えば、リン酸緩衝液は、異なる比率でリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムの一塩基塩および二塩基塩を混ぜることにより、広い範囲で特定のｐＨにおいて作製することができる。リン酸緩衝液が使用される場合、約２０ｍＭにおいて作製することができ、これは、約７．８のｐＨを有する。グリコシルアミドストック溶液を緩衝液に加える場合、緩衝液のｐＨは低下する。ｐＨ７．８のリン酸緩衝溶液は、ｐＨが約６．４の最終糖脂質アジュバント溶液をもたらす。最終的なｐＨ調整を行うことができるが、通常は必要でない。
【００８４】
弱酸および糖脂質を含有するグリコシルアミドストック溶液は、極めて低いｐＨを有する。ｐＨを許容できるレベルまで上げることが必要であることがある。強塩基は、強塩基の添加が、糖脂質の塩形態を元の非塩形態に変換し、水性環境において非塩形態の沈殿（凝集）をもたらすことがあるため、この目的には避けるべきである。しかしながら、強塩基が望まれる場合、ほんの少量を使用すべきである。例えば、１００ｍＭ以下のＮａＯＨを使用することが推奨されるが、４．０ｍＭ以下が最適である。
【００８５】
緩衝溶液には、いくらかのＮａＣｌが含まれていてもよいが、必要ではない。ＮａＣｌ濃度は、約１〜約５０ｍＭの範囲であってよい。より少量のＮａＣｌは、より大量より好ましい。本明細書の実施例は、ＮａＣｌを有しないか、または１５ｍＭ ＮａＣｌを有するかのどちらかである。１００ｍＭ ＮａＣｌは、凝集が起きることから適当ではない。１５ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。３０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。５０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度では、凝集は予想されない。
【００８６】
パートＩＩ。糖脂質アジュバント溶液の特徴付け。
保管中の糖脂質アジュバント溶液の安定性は、単純な目視観察により、または適切な分析機器を用いることによりモニターすることができる。糖脂質分子は、水溶液中にある場合、ミセルを形成し、レーザー回折計で正確にミセルのサイズを決定することが可能である。そのような測定を用い、糖脂質分子の凝集があるか否かを決定することができる。
【００８７】
リアルタイムの安定性測定への代替アプローチは、加速安定性試験を行うことである。加速安定性試験では、アジュバント溶液を、約７日間にわたり約３７℃の温度と、続いて、絶え間ないかき混ぜ下で約２日間にわたり約４℃におけるインキュベーションにさらす。約７日間の約３７℃におけるインキュベーションは、約１年間の約４℃における保管に相当する。絶えずかき混ぜながらの約２日間の約４℃におけるインキュベーションは、糖脂質アジュバント溶液が輸送中に直面する可能性があるストレス条件に相当する。
【００８８】
糖脂質アジュバント溶液が細胞質と等張であるか否かを決定するため、浸透圧を決定することができる。様々な濃度の塩化ナトリウムを加え、浸透圧計を用いて、得られる溶液の浸透圧を決定することができる。塩化ナトリウムの濃度を増加させることは、浸透圧を増加させることに加えて、溶液をより濁らせる傾向がある。濁りは、ミセルが集合してより大きな粒子を形成することによって引き起こされると考えられる。０．２μｍのフィルターを用いて濾過することが困難であるか、または不可能である溶液が、一般的に、商業使用に許容できないのは、商業規模で調製されるアジュバント溶液の無菌性を保証するために最終的な濾過が用いられることが多いためである。電子顕微鏡分析を用い、過剰な塩の結果としてのミセルの集合があるか否かを決定することができる。
【００８９】
上記に記載されているアジュバントと合わせ、追加の非糖脂質アジュバントを糖脂質アジュバント溶液において使用することができる。本発明の別の実施形態において、追加の免疫刺激性分子を、糖脂質アジュバント溶液に加える。免疫刺激性分子は、当技術分野においてよく知られており、それらには、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）およびカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）が含まれる。
【００９０】
Ｑｕｉｌ Ａは、南米の木キラヤサポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）の樹皮から精製された抽出物である。Ｑｕｉｌ Ａは、体液性応答と細胞性応答の両方を誘発する。Ｑｕｉｌ Ａがコレステロールと一緒に使用されることが多いのは、コレステロールが、適切な比率で加えられた場合、あまり望ましくない副作用を除去するためである。コレステロールは、Ｑｕｉｌ Ａと不溶性の複合体を形成し、コレステロールがＱｕｉｌ Ａと結合するにつれてラセン状構造を形成するため、分子の糖単位を露出させ、免疫応答を刺激する助けになる。
【００９１】
臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、ＤＤＡは、１８個の炭素アルキル鎖を有する陽イオン性界面活性剤である。ＤＤＡは、両親媒性四級アミンである。最適な免疫応答を得るためにＤＤＡと抗原の直接的相互作用が必要なのは、ＤＤＡが、油／水界面における抗原の直接結合を介して抗原の担体としての役割を果たすためである。ＤＤＡは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を刺激する。
【００９２】
カルボポールは、本発明で使用することができる別の有用な免疫刺激性分子である。カルボポールは、ポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸ホモポリマーである。
【００９３】
パートＩＩＩ。糖脂質アジュバント溶液の使用。
糖脂質アジュバント溶液は、薬学的に許容できる塩形態で、抗原と混ぜることができる。好都合な抗原には、微生物病原体タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、トキソイド、炭水化物、および腫瘍特異性抗原が含まれる。抗原は、様々な源から誘導することができる。微生物病原体由来の抗原には、疾患を引き起こす細菌、ウイルス、および寄生生物が含まれる。２種以上の抗原の混合物を用いることができる。抗原は、死んでいる、自然に弱毒化されている、修飾型生存の（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｖｅ）、またはタンパク質抽出物、組換え的に産生されたタンパク質、化学的に合成されたペプチドまたは免疫応答を刺激する他のいかなるものであってもよい。ペプチド抗原は、遊離のペプチドとして存在するか、または糖脂質にコンジュゲートされているか、または他の知られているＢ細胞もしくはＴ細胞エピトープにコンジュゲートされていてもよい。
【００９４】
安定な糖脂質アジュバント溶液は、アジュバント特性を有することが知られている追加のアジュバントまたは構成成分と組み合わせることができる。糖脂質アジュバント溶液と組み合わせることができる追加のアジュバントには、ポリマー、それらの粗製または部分精製された形態の天然に存在するテルペノイド化合物、両親媒性四級アミン、細菌の細胞壁材料の誘導体および細菌の細胞壁またはＤＮＡ成分の合成類似体が含まれる。糖脂質アジュバント溶液は、抗生物質または様々な抗原などの１種または複数の作用物質と一緒に使用するか、それらと組み合わせることができる。細菌またはウイルス抗原は、死んでいるか、または修飾型生存のどちらかであってよい。死んだウイルスの抗原は、組織培養においてウイルスを増殖させ、化学的処理によりウイルスを不活性化することにより調製される。一部のウイルスは、孵化卵において増殖させることができる。死んだウイルスの抗原は、糖脂質アジュバント溶液を含有する溶液に加えることができ、得られる溶液を使用して動物にワクチン接種し、ウイルス感染に対する防御を実現することができる。
【００９５】
本発明の一実施形態において、糖脂質アジュバント溶液は、修飾型生存ウイルス抗原のための希釈剤として使用することができる。ウイルス病原体は、それらを組織培養で数世代にわたって継代することによるか、またはウイルスゲノムの特異的操作を介して、それらの毒性を弱毒化することができる。ウイルスのそのような弱毒化株は、組織培養で極めて高い力価まで増殖させることができ、ワクチン抗原として使用することができる。弱毒化ウイルス株は、修飾型生存ウイルス抗原と呼ばれる。これらの株は、毒性が少ないが、それらは、ワクチン中の抗原として使用される場合、依然として極めて免疫原性であり、毒性株による感染に対する防御を提供する。糖脂質アジュバント溶液は、修飾型生存ウイルス抗原のための希釈剤として使用すべきであり、糖脂質アジュバント溶液は、関心のある特定のウイルスに対していかなる殺ウイルス効果も有していないことを保証するために試験されるべきである。
【００９６】
修飾型生存ウイルス抗原に対する糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス特性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において決定することができる。凍結乾燥したウイルス抗原を、糖脂質アジュバント溶液または水で再水和する。得られるウイルス溶液を、許容細胞の単層上にプレートする。ウイルス抗原の力価は、単層上に形成されるプラーク数をカウントすることにより決定される。水と糖脂質アジュバント溶液で再水和されたサンプル間で得られるウイルス力価の差を用い、もしあれば、任意の生ウイルスに対する糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス効果を決定することができる。
【００９７】
修飾型生存ウイルス抗原は、凍結乾燥し、商業用のワクチン調製物における凍結乾燥ケーキとして提供することができる。一般に、これらの修飾型生存ウイルス抗原の凍結乾燥ケーキは、希釈剤溶液で再水和され、非経口ワクチン接種のために使用される。希釈剤の例には、リン酸緩衝溶液を含有する水溶液が含まれる。希釈剤溶液が、知られている免疫刺激性分子を含有する場合、修飾型生存ウイルス抗原によるワクチン接種の効率が改善されることがある。本発明の一実施形態において、糖脂質アジュバント溶液は、希釈剤溶液として使用される。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
等濃度のＢａｙ １５−５８３１（登録商標）および酢酸による不溶性のグリコシルアミン組成物の調製
【００９９】
【表１】
【０１００】
Ｂａｙ １５−５８３１（登録商標）は、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙに登録されており、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドの商品名である。この化合物を使用し、酢酸が、糖脂質に対して等モル濃度で使用され、糖脂質が、その遊離の塩基形態である上記の表１に記載されている組成を用いてアジュバント溶液を作製する場合、糖脂質は、不溶性であり、凝集する。
【０１０１】
（実施例２）
実施例１と同じ構成成分を用いるが、糖脂質の濃度に対して酢酸濃度を増加させた可溶性のグリコシルアミドストック溶液は、可溶性のグリコシルアミドストック溶液をもたらす。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
ここでは、６０％エタノール（ｖ／ｖ）を使用した。糖脂質に対する酢酸のモル比は、２．０である。実施例１の２００−プルーフエタノールは、６０％エタノール水で置き換えた。得られたグリコシルアミドストック溶液は、光学的に澄明であり、容器の底に沈殿はなかった。このグリコシルアミドストック溶液を様々な緩衝液に加え、以下の実施例３における糖脂質アジュバント溶液を作製した。
【０１０４】
（実施例３）
糖脂質アジュバント溶液の調製。異なるｐＨでリン酸緩衝液を調製した。一塩基性リン酸ナトリウム溶液の２Ｍストックは、ビーカー中でＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ１３８グラムをＤＩ水２５０ｍＬに溶かし、５００ｍＬの最終容積にすることにより調製した。同様に、二塩基性リン酸ナトリウム溶液の２Ｍストックは、ビーカー中でＮａＨ２ＰＯ４１４２グラムをＤＩ水３００ｍＬに溶かし、５００ｍＬの最終容積にすることにより調製した。両ストック溶液は、０．２ミクロンのフィルターを用いて無菌濾過した。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
表３に示すような一塩基性リン酸ナトリウムおよび二塩基性リン酸ナトリウム溶液の様々な容積の２Ｍストックを調製し、次いで、様々なｐＨレベルで、リン酸ナトリウム緩衝溶液の１Ｍストック溶液を得た。次いで、１Ｍリン酸緩衝溶液を５０倍に希釈し、２０ｍＭリン酸緩衝液を得た。
【０１０７】
糖脂質アジュバント溶液は、これらのストック緩衝液および実施例２からのグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。
【０１０８】
これらの２０ｍＭリン酸溶液の各々９６ｍＬに、実施例２において調製されたようなグリコシルアミドストック溶液５ｍＬを加えた。得られた糖脂質アジュバント溶液は、１２．５ｍＭ酢酸および６．３３ｍＭ糖脂質を含有していた。糖脂質は、この時点でアセテート形態である。
【０１０９】
（実施例４）
糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨの意義
別の一連の実験において、様々な溶液の最終ｐＨの意義を試験し、ｐＨが凝集にどのように影響するかを評価した。２０ｍＭリン酸緩衝液は、７．８の初期ｐＨにおいて調製した。表４は、糖脂質および酢酸が、等モル濃度で使用された実施例１におけるように調製されたグリコシルアミドを用いて調製された糖脂質アジュバントを示している。最終ｐＨは、極めて大きくは低下せず（表４）、緩衝液の有効性を示していることに留意されたい。ＮａＣｌ濃度を変化させた。表４における６００ｎｍにおける光学密度の読み取り値（Ｏ．Ｄ．）を、糖脂質アジュバント溶液が、実施例２において調製されたような糖脂質に対して２倍のモル比の酢酸を含有するグリコシルアミドストック溶液で調製された表５における類似の読み取り値と比較した。より大きな濃度または量の酢酸を用いると、最低限の凝集が生じる。凝集は、濾過したサンプルにおけるよりも濾過しないサンプルにおいて多かった。さらに、ＮａＣｌ濃度が増加すると、凝集の増加および沈殿さえも認められた。表５に記載されている糖脂質アジュバント溶液は、８．０の初期ｐＨを有するリン酸緩衝液で調製し、糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨは、６．８〜７．０であった。糖脂質アジュバント溶液の最終ｐＨをさらに下げると、濁度の低く凝集のない糖脂質アジュバント溶液が得られることがある。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
【表５】
【０１１２】
０．１未満の光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、半透明の溶液に相当する。０．１〜０．５の光学密度は、濁度がわずかで均一であり、０．５〜１．０の光学密度は、ある程度の濁度を有し、１．０〜１．５の光学密度は、濁っていると見なされる。１．５を超える光学密度は、濁っており、０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過できる可能性はない。後者は、一般的に、商業的に適しているとは見なされないであろう。
【０１１３】
（実施例５）
凝集を示す糖脂質アジュバントの酢酸による滴定は、逆転することができる。凝集を示す糖脂質アジュバントに漸増量の酢酸を加えることが凝集を逆転させるか否かを決定するため、実施例１に記載されているような糖脂質アジュバントを調製した。この糖脂質アジュバントは、ＮａＣｌがなくても凝集を示した。漸増濃度の酢酸を、この凝集した糖脂質アジュバント混合物に加えた。酢酸を水で１６．６倍に希釈し、１モルの作業溶液濃度を得た。次いで、この１Ｍ溶液１５μｌを、糖脂質アジュバント混合物１５ｍｌに加え、酢酸濃度を１ｍＭずつ増加させた。漸増濃度の酢酸で、糖脂質アジュバントのｐＨは下がり、凝集物は溶けた。しかしながら、糖脂質アジュバントは、いくらか濁ったままであった。この知見は、酢酸濃度を増加させることが、Ｂａｙ １５−５３８１の遊離塩基を、水溶液により可溶性であるアセテート形態に変換することを裏付けている。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
（実施例６）
ＮａＣｌを含む、およびＮａＣｌを含まない第２の安定な糖脂質アジュバント溶液の調製。糖脂質溶液の安定性を維持する際の酢酸の量の増加の重要性を証明した後、表８に示す組成を用いてまずグリコシルアミドストック溶液を調製し、次いで、これを用いてＮａＣｌを含む、およびＮａＣｌを含まない別の糖脂質アジュバント溶液を調製することを決定した。このグリコシルアミドストック溶液は、総容積が４倍で比較的大量の酢酸およびＴｗｅｅｎ２０である実施例２における溶液と同様である。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
様々な濃度のＮａＣｌを含む３つの異なる糖脂質アジュバント溶液を、実施例３からのリン酸緩衝液および表８におけるように調製されたグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。
【０１１８】
実施例４、表５における製剤と同様、０ｍＭ、１５ｍＭ、および１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液を作製した。０ｍＭおよび１５ｍＭ ＮａＣｌ溶液は、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過することができた。１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、０．２ミクロンのフィルターに通して濾過することができなかった。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
糖脂質アジュバント溶液の各々２０ｍＬを、３０ｍｌのガラスバイアルに入れ、室温および４℃においてインキュベートした。目視観察を規則的間隔で行った。当初、０ｍＭ ＮａＣｌを含む糖脂質アジュバント溶液は、光学的に澄明であった。１５ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、わずかに濁っており、６００ｎｍにおいて０．０７３のＯ．Ｄ．を有していた。１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する糖脂質アジュバント溶液は、濁っており、６００ｎｍにおいて０．４３９のＯ．Ｄ．を有していた。表９。これらの糖脂質アジュバント溶液のどれも、室温と４℃の両方において凝集のいかなる徴候も示さなかった。これらの糖脂質アジュバント溶液は、外見の変化なしに１年間にわたって観察された。
【０１２１】
（実施例７）
ＮａＯＨによる安定な糖脂質アジュバント溶液の滴定。
最初に、光学的に澄明で安定な糖脂質アジュバント溶液を、ＮａＯＨなしで得た。最少量のＮａＯＨの除去または使用が、凝集を防ぐのに不可欠であることを証明するため、ＮａＯＨの段階的添加が、さもなければ安定な糖脂質混合物において凝集を誘発することを示す必要がある。以下の表１０において調製されるように、適切な容積の１Ｎ ＮａＯＨを、ＮａＣｌを全く加えていない糖脂質アジュバント溶液１５ｍＬに加えた。ＮａＯＨは、１ｍＭから１２ｍＭまで徐々に増加させた（表１０）。この実験において使用される糖脂質アジュバント溶液は、実施例６に記載されているグリコシルアミドストック溶液を用いて調製した。糖脂質アジュバント溶液における漸増濃度のＮａＯＨにより、製剤のｐＨは、凝集の出現を伴って徐々に増加した。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
（実施例８）
ＨＰＬＣを用いる糖脂質成分の定量
以下の方法を、Ｂａｙ １５−５３８１（登録商標）のＨＰＬＣ分析において使用した。表１１に記載されているＨＰＬＣパラメーターを使用した。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
０．１０〜１．０３ｍＭの範囲の標準品を調製し、ＨＰＬＣに注入した。標準品の要約を表１２に示す。サンプルを、室温まで温め、使用する前に５分逆さにした。サンプル１ｍｌを、１０ｍｌのメスフラスコ中のメタノール６ｍｌに加えた。次いで、サンプルを１０分間超音波処理し、次いで、定容積まで希釈し、混ぜた。濃度に対してプロットされたピーク面積で標準品に対して直線回帰を行った。次いで、サンプルを、曲線に対して計算した。
【０１２７】
（実施例９）
３０リットル規模の生産。実施例６に記載されているような組成の３０リットルバッチの糖脂質アジュバント溶液を調製した。このバッチは、１５ｍＭ ＮａＣｌを含有していた。
【０１２８】
この３０Ｌ調製物を用い、５つの異なるサブ溶液を、漸増濃度のＮａＯＨと共に調製した。ＮａＯＨ濃度は、０ｍＭから、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ、および１２ｍＭまで増加させた。各ＮａＯＨ濃度についてのサンプルを、ｐＨ測定および目視観察のために等分した。漸増量のＮａＯＨにより、糖脂質アジュバントのｐＨは、凝集の増加と共に増加した。凝集は、室温において２ｍＭ ＮａＯＨ濃度で現れ始め、４℃において、凝集は、４ｍＭ ＮａＯＨにおいて現れ始めた。
【０１２９】
【表１２】
【０１３０】
表１３に示す６つのサンプルすべてにおけるＢａｙ １５−５３８１の量は、実施例８に記載されているＨＰＬＣ法を用いて定量した。様々なｐＨのサンプルは、同じ濃度のＢａｙ １５−５３８１を示し、アジュバント成分が、ＮａＯＨの添加によるｐＨ増加および付随する凝集の間に分解されないことを示唆していた。
【０１３１】
（実施例１０）
加速ストレス試験を用いる安定性評価。この実施例は、糖脂質アジュバント溶液に対する加速ストレス試験の方法および結果について記載している。実施例６に記載されているような糖脂質アジュバント溶液の３つのバッチを５００Ｌ規模で調製した。３つのバッチはすべて、１５ｍＭ ＮａＣｌを有し、ＮａＯＨは含有していなかった。これら３つの５００Ｌバッチからの糖脂質アジュバント溶液を、加速安定性試験を用いる糖脂質の安定性を研究するために使用した。
【０１３２】
加速ストレス試験の場合、糖脂質アジュバント溶液を、３７℃における７日間にわたるかき混ぜと、続いて、２日間にわたる４℃におけるかき混ぜにさらす。３７℃における７日間のかき混ぜは、１年間の４℃における経年劣化に相当する。２日間の４℃におけるかき混ぜは、輸送中のストレスに相当する。
【０１３３】
１組の糖脂質アジュバント溶液を、７日間にわたり３７℃において静止状態に保ち、次いで、さらに２日間にわたり４℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜた。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３４】
第２組の糖脂質アジュバント溶液を、７日間にわたり３７℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜ、次いで、さらに２日間にわたり４℃において１００ｒｐｍにてかき混ぜた。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３５】
第３組の糖脂質アジュバント溶液を、対照として、９日間にわたり４℃において静止状態にした。４つの時点、すなわち、Ｔ＝０、３、７、および９日目に、観察および写真を記録した。次いで、２つの時点、すなわち、Ｔ＝０および９日目に、屈折率および粒径分析を行った。
【０１３６】
ストレス試験の結果として、粒径の変化はなかった。すべてのサンプルは、調製された直後のサンプルにおいて観察されるサブミクロンの粒径を維持した。さらに、７日間にわたり４℃において保たれたか、または３７℃においてストレスにさらされたサンプル中のＢａｙ １５−５３８１（登録商標）成分のＨＰＬＣ測定は、Ｂａｙ １５−５３８１（登録商標）の量に何らの変化も示さなかった。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】
表１５において、対照サンプルは、７日間にわたり４℃において保ち、試験サンプルは、７日間にわたり３７℃においてかき混ぜた。７日間にわたり３７℃においてかき混ぜたサンプルは、４℃において保管したサンプルと同様の濃度を有している。
【０１３９】
（実施例１１）
糖脂質アジュバント溶液の殺ウイルス試験。
殺ウイルス試験は、実施例９において上記に記載されているような３０Ｌ規模で調製された糖脂質アジュバント溶液について行った。この糖脂質アジュバント溶液は、１５ｍＭ ＮａＣｌを含有し、ＮａＯＨは含有していなかった。
【０１４０】
糖脂質アジュバントを、修飾型生存ウイルスと一緒に希釈剤としてそれを使用するための適合性について試験した。修飾型生存ウイルス抗原は、凍結乾燥プラグとして調製される。適当な糖脂質アジュバント溶液でこれらのプラグを再水和すると、使用された糖脂質アジュバント溶液が修飾型生存ウイルスを殺さないことが裏付けられた。糖脂質アジュバント溶液を、３種のウシウイルス抗原、すなわち、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、および伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルスに対して試験した。
【０１４１】
ウイルスプラグを、糖脂質アジュバント溶液を用いて再水和した。１時間にわたる室温（ＲＴ）におけるインキュベーション後、サンプルを、段階希釈で許容細胞系の単層上にプレートした。単層上に現れるウイルスプラグ数をカウントすることにより、滅菌水または糖脂質アジュバント溶液で再水和された各ウイルス抗原について、１ｍｌ当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）値が得られた。このアッセイにおいて、試験糖脂質アジュバント溶液による再水和後の０．７の力価の減少は、殺ウイルス性であるとして扱われた。
【０１４２】
結果を表１６に示す。糖脂質アジュバント溶液は、これらの３種のウシウイルスに対していなかる殺ウイルス効果も示さなかった。
【０１４３】
【表１４】
【０１４４】
この実施例は、糖脂質アジュバント溶液が、Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈワクチンの商業製剤において使用することができることを示している。Ｒｉｓｐｏｖａｌ（登録商標）は、３種の修飾型生存ウイルス抗原を用いる３種の異なるウシウイルス疾患を含有している。これらのウシウイルス抗原は、修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３である。これらのウイルス抗原は、凍結乾燥ケーキとして製造され、本発明により製造される糖脂質アジュバント溶液を、これらの抗原のための希釈剤溶液として使用することができる。使用される糖脂質は、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテートであった。
【０１４５】
実施例は、本発明を例示するために提供される。実施例は、本発明の範囲を限定していると受け止められるべきではない。本発明の多くの変更形態、変形形態、修正形態、ならびに他の用途および応用は、当業者に明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）塩形態の、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【化１】
であり、
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される））、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて１．０〜９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸である）、
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）
を含む組成物。
【請求項２】
糖脂質が、式ＩＩ（ａ）の化合物であり、
【化２】
弱酸が、以下の弱酸、酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）（ｐＫａ４．７６）；アスコルビン酸（１）、Ｈ２（Ｃ６Ｈ６Ｏ６）（ｐＫａ４．１０）；アセチルサリチル酸、Ｈ８（Ｃ９Ｏ４）、（ｐＫａ３．５）；ブタン酸、Ｈ（Ｃ４Ｈ７Ｏ２）（ｐＫａ４．８３）；炭酸、１形、Ｈ２ＣＯ３、（ｐＫａ４．８３）；クロム酸、２形、ＨＣｒＯ４−、（ｐＫａ６．４９）；クエン酸１形、Ｈ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、（ｐＫａ３．１４）；クエン酸２形、Ｈ２Ｃ６Ｈ５Ｏ７）−、（ｐＫａ４．７７）；クエン酸３形、（ＨＣ６Ｈ５Ｏ７）＝、（ｐＫａ６．３９）；ギ酸、Ｈ（ＣＨＯ２）、（ｐＫａ３．７５）；フマル酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ３．０３）；ヘプタン酸、Ｈ（Ｃ７Ｈ１３Ｏ２）、（ｐＫａ４．８９）；ヘキサン酸、Ｈ（Ｃ６Ｈ１１Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；フッ化水素酸、ＨＦ、（ｐＫａ３．２０）；イソシトレート、Ｈ８（Ｃ６Ｏ７）（ｐＫａ３．２９）；乳酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ３）、（ｐＫａ３．０８）；マレイン酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ１．８３）；ニコチン酸、Ｈ５（Ｃ６ＮＯ２）（ｐＫ３．３９）；シュウ酸１形、Ｈ２（Ｃ２Ｏ４）、（ｐＫａ１．２３）；シュウ酸２形、（ＨＣ２Ｏ４）−、（ｐＫａ４．１９）；ペンタン酸、Ｈ（Ｃ５Ｈ９Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；リン酸１形、Ｈ３ＰＯ４、（ｐＫａ２．１６）；プロパン酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ２）、（ｐＫａ４．８６）；ピルビン酸、Ｈ４（Ｃ３Ｏ３）（ｐＫａ２．３９）；コハク酸Ｈ６（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ４．１９）およびトリクロロ酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｃｌ３Ｏ２）（ｐＫａ０．７０）のうちの１つまたは任意の組合せから選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
糖脂質が、式ＩＩ（ｂ）の化合物であり、
【化３】
弱酸が、以下の弱酸、すなわち、酢酸、アセチルサリチル酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸、ピルビン酸、コハク酸およびトリクロロ酢酸のうちの１つまたは任意の組合せから選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
糖脂質が、式ＩＩＩの構造を有するＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテートであり、
【化４】
弱酸が、酢酸である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
弱酸が、酢酸、アセチルサリチル酸、クエン酸１形、クエン酸２形、クエン酸３形、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸１形、ピルビン酸、コハク酸、およびトリクロロ酢酸からなる群から選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記弱酸が、糖脂質のモル当量より大きい量であるか、または糖脂質のモル当量より以下の倍数、すなわち
ａ）１．２５倍大きい、
ｂ）２．０倍大きい、
ｃ）２．５倍大きい、
ｄ）２．７倍大きい、
ｅ）３．０倍大きい、
ｆ）５．０倍大きい
量である請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
アルコールが、エチルアルコールである請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ならびにワクチンにおいて一般的に使用される他のソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンからなる群のうちの任意の１つまたは組合せから選択される請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
ａ）塩形態の、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【化５】
であり、
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される））、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸である）、
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）、および
ｅ）水性緩衝液（ここで、適当な緩衝液は、ワクチン使用に適しており、約６〜約８のｐＨ範囲内に他の構成成分のｐＨを維持することができるが、ただし、５０ｍＭ以下のＮａＣｌが使用される）
を含む組成物。
【請求項１０】
溶液のｐＨが、約６〜約７の水溶液中での比較的一定なｐＨに調整され、緩衝液が、同じまたは異なる比率でリン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウムの一塩基性塩と二塩基性塩のどちらかまたは双方を有するリン酸緩衝液からなる群から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記緩衝液が、
ａ）２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
ｂ）３−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
ｃ）ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
ｄ）４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、および
ｅ）［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）の群から選択される、
またはそれらの任意の組合せである請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３からなる群から選択される抗原、またはそれらの任意の組合せをさらに含む請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
ａ）式ＩＩＩの構造を有するＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート、
【化６】
ｂ）エタノール、
ｃ）酢酸、
ｄ）ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートから選択される非イオン性界面活性剤、
ｅ）水性緩衝液（ここで、溶液のｐＨは、約６〜約７の水性緩衝溶液中での比較的一定なｐＨに調整され、緩衝液は、
（ｉ）２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
（ｉｉ）３−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
（ｉｉｉ）ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
（ｉｖ）４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、および
（ｖ）［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）の群から選択される、
またはそれらの任意の組合せであり、
ただし、１５ｍＭ以下のＮａＣｌが使用される）、および
ｆ）本質的に修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３からなる抗原、
を含む組成物。
【請求項１４】
組成物を調製するための方法であって、以下の、
Ａ）式Ｉの糖脂質、
Ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
Ｃ）弱酸（ここで、弱酸の量は、糖脂質含有量に関してモル過剰である）、および
Ｄ）非イオン性界面活性剤
を混ぜ合わせることを含む方法。
【請求項１５】
組成物を調製するための方法であって、以下の、
Ａ）式Ｉの糖脂質、
Ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
Ｃ）弱酸（ここで、弱酸の量は、糖脂質含有量に関してモル過剰である）、
Ｄ）非イオン性界面活性剤
を混ぜ合わせること、次いで、
Ｅ）適当な緩衝液
を加えることを含む方法。
【請求項１】
ａ）塩形態の、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【化１】
であり、
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ２は、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和もしくは不飽和アルキル基であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される））、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて１．０〜９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸である）、
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）
を含む組成物。
【請求項２】
糖脂質が、式ＩＩ（ａ）の化合物であり、
【化２】
弱酸が、以下の弱酸、酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）（ｐＫａ４．７６）；アスコルビン酸（１）、Ｈ２（Ｃ６Ｈ６Ｏ６）（ｐＫａ４．１０）；アセチルサリチル酸、Ｈ８（Ｃ９Ｏ４）、（ｐＫａ３．５）；ブタン酸、Ｈ（Ｃ４Ｈ７Ｏ２）（ｐＫａ４．８３）；炭酸、１形、Ｈ２ＣＯ３、（ｐＫａ４．８３）；クロム酸、２形、ＨＣｒＯ４−、（ｐＫａ６．４９）；クエン酸１形、Ｈ３（Ｃ６Ｈ５Ｏ７）、（ｐＫａ３．１４）；クエン酸２形、Ｈ２Ｃ６Ｈ５Ｏ７）−、（ｐＫａ４．７７）；クエン酸３形、（ＨＣ６Ｈ５Ｏ７）＝、（ｐＫａ６．３９）；ギ酸、Ｈ（ＣＨＯ２）、（ｐＫａ３．７５）；フマル酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ３．０３）；ヘプタン酸、Ｈ（Ｃ７Ｈ１３Ｏ２）、（ｐＫａ４．８９）；ヘキサン酸、Ｈ（Ｃ６Ｈ１１Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；フッ化水素酸、ＨＦ、（ｐＫａ３．２０）；イソシトレート、Ｈ８（Ｃ６Ｏ７）（ｐＫａ３．２９）；乳酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ３）、（ｐＫａ３．０８）；マレイン酸、Ｈ４（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ１．８３）；ニコチン酸、Ｈ５（Ｃ６ＮＯ２）（ｐＫ３．３９）；シュウ酸１形、Ｈ２（Ｃ２Ｏ４）、（ｐＫａ１．２３）；シュウ酸２形、（ＨＣ２Ｏ４）−、（ｐＫａ４．１９）；ペンタン酸、Ｈ（Ｃ５Ｈ９Ｏ２）、（ｐＫａ４．８４）；リン酸１形、Ｈ３ＰＯ４、（ｐＫａ２．１６）；プロパン酸、Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ２）、（ｐＫａ４．８６）；ピルビン酸、Ｈ４（Ｃ３Ｏ３）（ｐＫａ２．３９）；コハク酸Ｈ６（Ｃ４Ｏ４）（ｐＫａ４．１９）およびトリクロロ酢酸、Ｈ（Ｃ２Ｃｌ３Ｏ２）（ｐＫａ０．７０）のうちの１つまたは任意の組合せから選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
糖脂質が、式ＩＩ（ｂ）の化合物であり、
【化３】
弱酸が、以下の弱酸、すなわち、酢酸、アセチルサリチル酸、クエン酸、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸、ピルビン酸、コハク酸およびトリクロロ酢酸のうちの１つまたは任意の組合せから選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
糖脂質が、式ＩＩＩの構造を有するＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテートであり、
【化４】
弱酸が、酢酸である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
弱酸が、酢酸、アセチルサリチル酸、クエン酸１形、クエン酸２形、クエン酸３形、ギ酸、フマル酸、フッ化水素酸、イソシトレート、マレイン酸、ニコチン酸、リン酸１形、ピルビン酸、コハク酸、およびトリクロロ酢酸からなる群から選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記弱酸が、糖脂質のモル当量より大きい量であるか、または糖脂質のモル当量より以下の倍数、すなわち
ａ）１．２５倍大きい、
ｂ）２．０倍大きい、
ｃ）２．５倍大きい、
ｄ）２．７倍大きい、
ｅ）３．０倍大きい、
ｆ）５．０倍大きい
量である請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
アルコールが、エチルアルコールである請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ならびにワクチンにおいて一般的に使用される他のソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンからなる群のうちの任意の１つまたは組合せから選択される請求項１から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
ａ）塩形態の、式Ｉの糖脂質
（ここで、式Ｉは、
【化５】
であり、
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、または２０個までの炭素原子を有する飽和アルキル基であり、
Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、−ＳＯ４２−、−ＰＯ４２−、−ＣＯＣ１〜１０アルキルであり、
Ｒ６は、Ｌ−アラニル、Ｌ−α−アミノブチル、Ｌ−アルギニル、Ｌ−アスパルギニル、Ｌ−アスパルチル、Ｌ−システイニル、Ｌ−グルタミル、Ｌ−グリシル、Ｌ−ヒスチジル、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−イソロイシル、Ｌ−ロイシル、Ｌ−リシル、Ｌ−メチオニル、Ｌ−オルニチニル、Ｌ−フェニルアラニル、Ｌ−プロリル、Ｌ−セリル、Ｌ−スレオニル、Ｌ−チロシル、Ｌ−トリプトファニル、およびＬ−バリルまたはそれらのＤ−異性体であり、塩形態は、弱酸から誘導される））、
ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
ｃ）弱酸（ここで、弱酸は、１）糖脂質含有量に関してモル過剰であり、２）標準的な表または値を用いて約１．０〜約９．５のｐＫａ（Ｋａの−ｌｏｇ）値を有する任意の酸である）、
ｄ）非イオン性界面活性剤（ここで、非イオン性界面活性剤は、それが溶解している材料の表面張力を下げる作用物質であり、疎水性である１構成成分と親水性である別の構成成分を有する）、および
ｅ）水性緩衝液（ここで、適当な緩衝液は、ワクチン使用に適しており、約６〜約８のｐＨ範囲内に他の構成成分のｐＨを維持することができるが、ただし、５０ｍＭ以下のＮａＣｌが使用される）
を含む組成物。
【請求項１０】
溶液のｐＨが、約６〜約７の水溶液中での比較的一定なｐＨに調整され、緩衝液が、同じまたは異なる比率でリン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウムの一塩基性塩と二塩基性塩のどちらかまたは双方を有するリン酸緩衝液からなる群から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記緩衝液が、
ａ）２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
ｂ）３−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
ｃ）ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
ｄ）４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、および
ｅ）［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）の群から選択される、
またはそれらの任意の組合せである請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３からなる群から選択される抗原、またはそれらの任意の組合せをさらに含む請求項１から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
ａ）式ＩＩＩの構造を有するＮ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート、
【化６】
ｂ）エタノール、
ｃ）酢酸、
ｄ）ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートから選択される非イオン性界面活性剤、
ｅ）水性緩衝液（ここで、溶液のｐＨは、約６〜約７の水性緩衝溶液中での比較的一定なｐＨに調整され、緩衝液は、
（ｉ）２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳとしても知られている）、
（ｉｉ）３−Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳとしても知られている）、
（ｉｉｉ）ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳとしても知られている）、
（ｉｖ）４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳとしても知られている）、および
（ｖ）［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＳとしても知られている）の群から選択される、
またはそれらの任意の組合せであり、
ただし、１５ｍＭ以下のＮａＣｌが使用される）、および
ｆ）本質的に修飾型生存ウシヘルペスウイルス、修飾型生存ウシＲＳウイルス、および修飾型生存パラインフルエンザウイルス３からなる抗原、
を含む組成物。
【請求項１４】
組成物を調製するための方法であって、以下の、
Ａ）式Ｉの糖脂質、
Ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
Ｃ）弱酸（ここで、弱酸の量は、糖脂質含有量に関してモル過剰である）、および
Ｄ）非イオン性界面活性剤
を混ぜ合わせることを含む方法。
【請求項１５】
組成物を調製するための方法であって、以下の、
Ａ）式Ｉの糖脂質、
Ｂ）アルコール（ここで、アルコールは、ＨＯ−Ｃ１〜３アルキルである）、
Ｃ）弱酸（ここで、弱酸の量は、糖脂質含有量に関してモル過剰である）、
Ｄ）非イオン性界面活性剤
を混ぜ合わせること、次いで、
Ｅ）適当な緩衝液
を加えることを含む方法。
【公表番号】特表２００９−５２４６３８（Ｐ２００９−５２４６３８Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５１９０４（Ｐ２００８−５５１９０４）
【出願日】平成１９年１月１５日（２００７．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００２５８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８５９６２
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月１５日（２００７．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００２５８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８５９６２
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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