条件的不死化膵臓細胞
４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の存在下で不死であるが、４−ＯＨＴが存在しない場合には通常の膵臓細胞マーカーを発現する条件的不死化膵臓細胞が産生される。従って、前記細胞により、移植またはスクリーニングアッセイに有用な細胞を産生するための細胞株の作製が可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的および商業的な用途のためにスケールアップし得る条件的不死化膵臓細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界で少なくとも２億人があらゆる型の糖尿病に苦しめられており、そしてこの数は、２０２５年までに２倍になると考えられている。１型（インスリン依存性）糖尿病は、通常幼齢で、遺伝的素因のある個体に影響を及ぼす慢性疾患であって、膵ランゲルハンス島内のインスリン分泌β細胞が自己免疫攻撃により選択的かつ不可逆的に破壊されるものである。８０年以上の間、インスリン依存性糖尿病に対する主要な治療手段は、インスリン補充による対症療法に限られてきた。最近の研究においては、その疾患の眼合併症と神経学的合併症と腎合併症とを抑制するために厳しい血糖コントロールが重要であることが強調されている（１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このインスリン依存は、１型糖尿病患者へのヒト初代ランゲルハンス島（primary islets of Langerhans）移植の著しい進歩によりほとんどなくなってきた（２）。しかし、生きているドナーからの初代ヒト膵島の利用可能性は非常に限定されていることから、この治療の実用は限られている。そして、現在必要とされていることは、大きな臨床的効果を得るために初代ヒト膵島の生理的にコンピテントな代替物をほとんど無限に供給することである。１型糖尿病は、そのβ細胞特異的な性質ゆえに、細胞補充療法による治療に特に適している。多能性幹細胞を機能的β細胞に分化させる能力は、１型糖尿病治療の新しい治療可能性をもたらす。ヒト胎児の膵島細胞またはその前駆細胞は、臨床的な移植用インスリン産生組織の代替源となり得る（３）。胎児組織移植の成功は、胎児細胞の増殖能力だけでなく移植部位での成熟能力にも依存する。
【０００４】
胎児の不死化膵臓細胞があれば、初代ヒトランゲルハンス島の生理的にコンピテントな代替物を無限に供給することができる。哺乳類の膵臓におけるランゲルハンス島の発育については、調整された組織形態形成の例として鋭意研究されており、それは、このプロセスの理解により糖尿病の細胞移植治療の開発が容易になると期待されているからである（４、５）。膵臓の内分泌コンパートメントを含む膵島は、４種の細胞型を含み、その各々が別個のホルモンを産生するものであって、α細胞、β細胞および膵ポリペプチド（ＰＰ）細胞は、それぞれグルカゴン、ソマトスタチンおよびＰＰを分泌する。インスリン産生はβ細胞に限定される。β細胞は、成体の膵島細胞の大部分を含み、グルコース恒常性の主要な調節因子である。ヒト胎児の膵臓からの内分泌細胞前駆体の分離は、膵島細胞分化の研究にとって重要になり、ゆくゆくはインスリン依存性糖尿病の島移植にとって重要なものになるであろう。４種の膵内分泌細胞型が発現するこれらの前駆細胞は、胎児の膵導管上皮内に存在する。早期の膵芽はホメオボックス遺伝子ＩＰＦ−１（別名、ＩＤＸ−１、ＳＴＦ−１またはＰＤＸ）の均一な発現を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細胞培養物内に４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）が存在する場合には不死であるが、４−ＯＨＴが存在しない場合には通常の膵臓細胞マーカーを発現する条件的不死化膵細胞の作製に基づく。ｃ−ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合は、膵臓細胞に条件的不死化の性質を付与する要因である。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、哺乳類の膵臓細胞は、単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、条件的に膵臓細胞を不死化する方法は、以下のステップ：
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を膵臓細胞内に発現させること；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成した膵臓細胞にエストロゲンレセプターのリガンドを接触させ、それにより条件的に膵臓細胞を不死化すること、を含む。
【０００８】
本発明による膵臓細胞は、１型糖尿病、２型糖尿病の重症型の治療や薬物候補のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に特に有用である。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、薬物としての使用における化合物の適合性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法は、以下のステップ：
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む膵臓細胞に薬物としての可能性を有する化合物を接触させること；
（ｉｉ）膵臓細胞の応答を測定し、それにより膵臓細胞に対する化合物の効果を決定し、そしてそれにより、薬物としての使用における化合物の適合性を評価すること、を含む。好ましくは、膵臓細胞は培養培地からリガンド（４−ＯＨＴ）を除去することにより増殖が停止するものであり、そして膵臓細胞は完全に分化した表現型を発現させるものである。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、医薬としての、および糖尿病の治療用医薬の製造における本発明の膵臓細胞の使用である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、膵臓の初代培養物内のｍｙｃ／エストロゲン−レセプター融合タンパク質の発現によりそれらが条件的に不死化され、そのことにより膵細胞株が得られることを明らかにするものである。膵臓細胞がエストロゲンレセプターのリガンドの存在下で培養される場合、それらは不死である。その膵臓細胞からリガンドを除去することにより、細胞の不死性が喪失し、ゆえにそれは、膵臓のインサイチューにおける膵臓細胞から期待されるような「通常の」特性と膵細胞のマーカーを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書で用いられる「膵細胞」または「膵臓細胞」という用語は、膵臓が行う１以上の機能を実行し得る膵臓から得られ得る任意の細胞を意味する。いずれの種に由来する膵細胞も本発明の範囲内であるが、膵臓細胞は哺乳動物のものであることが好ましく、最も好ましくはヒトのものである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆体細胞から分化させた膵臓細胞、例えば胚性幹細胞または多能性幹細胞から分化させた膵臓細胞が用いられ得るように、胎児または成体の膵臓を使用してよい。
【００１３】
本発明に記載の膵臓細胞は、通常の膵臓に特徴的なマーカーを保持する。膵臓の内分泌コンパートメントを含む膵島は、４種の細胞型を含み、その各々が別個のホルモンを産生する。α細胞、β細胞および膵ポリペプチド（ＰＰ）細胞は、それぞれグルカゴン、ソマトスタチンおよびＰＰを分泌する。インスリン産生はβ細胞に限定される。ホメオドメイン転写因子の膵臓・十二指腸ホメオボックス−１（ＰＤＸ１）およびインスリンを、ヒト胎児の膵臓クローンのキャラクタリゼーションにおけるマーカーとして使用した。
【００１４】
当初のエドモントンプロトコル（８）によれば、充填組織容積１０ｍＬ未満中にレシピエントの体重1キログラム当たり少なくとも４０００膵島相当物（equivalents)が移植には必要である。同じグループは、後の研究（８）において、少なくとも９０００個／キログラムの膵島移植後に、１７人の患者すべてがインスリン非依存性になったと報告した。本発明による膵臓細胞は、未処理のペトリ皿を使用して培養すると、膵島相当物（本明細書において、凝集体と称される）を形成することが可能である。８ｍＬ培養培地／９０ｍｍペトリ皿の中の３百万個の膵臓細胞は、３万５千個の凝集体を産生し得る。この手法は、Ｓｈａｐｉｒら（２）により記述されているものなど、本技術分野で公知の糖尿病患者のために開発された手法にしたがい、ヒト移植において使用される十分な量の凝集体を産生するためにスケールアップできる。
【００１５】
本明細書で用いられる「不死」という用語は、長期の増殖を起こす能力を有する細胞を指す。本発明の膵臓細胞は、４−ＯＨＴの存在下で増殖する場合に不死である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養組織は、単細胞または細胞のコロニーから大きくなったものであって、当業者ならば周知のように「細胞株」と呼ばれる。これは、初代細胞とは対照的に、老化に達して最終的に細胞が死ぬ前に、限定された回数、一般的には１０〜２０回未満の分裂しかできないものである。本明細書で用いられる場合、条件的不死という用語は、ある特定の増殖条件の下で分裂する未成熟な細胞であって、他の条件の下では完全に成熟して非分裂細胞となる細胞を指す。本発明によれば、細胞の不死化の要因となる環境条件は、エストロゲンレセプターリガンドの存在である。
【００１６】
継続的な膵臓細胞の不死化を可能にし、ゆえに４−ＯＨＴの存在下で不死化される膵臓細胞の特徴は、ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質の存在である。理論に束縛されるものではないが、４−ＯＨＴがエストロゲンレセプターを活性化すると考えられる。エストロゲンレセプターの活性化によって腫瘍性タンパク質ｍｙｃの二量体化および核移行が可能になり、それは核において転写因子として作用し、増殖や遺伝子安定化の発生を可能にする遺伝子の発現を開始する（例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋら、（２００６）；参考文献９参照）。４−ＯＨＴなしでは、ｍｙｃ腫瘍性タンパク質を含む融合タンパク質は依然として発現されるが、それは細胞質内にとどまり、さらなる増殖は起こらない。ゆえに、リガンドは、添加して膵臓細胞を（不死的に）増殖させたり、回収して前記細胞が通常の非増殖性膵臓細胞のように挙動し、機能的膵島細胞に分化し得るようにできる。
【００１７】
本発明の膵臓細胞は、ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質の発現により条件的に不死である。本明細書で用いられる「融合タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖として発現された、天然には別々に発現される２つのタンパク質配列またはペプチド配列を含む組換えタンパク質を指す。
【００１８】
融合タンパク質は、任意のｍｙｃタンパク質および任意のエストロゲンレセプター、または、エストロゲンレセプター４−ＯＨＴにより活性化される能力を保持し、細胞増殖につながる転写を活性化させるこれらタンパク質の任意のフラグメントも含み得る。好ましくは、ｍｙｃタンパク質はｃ−ｍｙｃである。好ましくは、エストロゲンレセプターは、４−ＯＨＴへの高親和性結合には影響を及ぼさずに１７β−エストラジオールへの高親和性結合を妨げる変異を有するものである。この変異は、１または多くのアミノ酸残基の欠失、置換または付加であってよい。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、マウスのエストロゲンレセプターに融合するヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子からなる。より好ましくは、融合タンパク質は、配列番号２として本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む。前述のように、配列番号２のいかなるホモログまたは機能的フラグメントも本発明の範囲内である。
【００１９】
本明細書で用いられる「ホモログ」という用語は、ＤＮＡやＲＮＡやタンパク質配列などの２個以上の生物重合体の間における類似性または同一性を指す。配列同一性の概念は、本技術分野でよく知られており、２つの配列間における同一性のレベルを意味する。類似性の概念は同程度によく知られており、２つの配列の類似点を考慮する場合、構造または機能に大きな影響を及ぼさない２つの配列間の保存的相違が含まれるものである。例えば、グルタミン酸は、タンパク質の構造または機能に大きな影響を及ぼすことのないアスパラギン酸で置換してよい；これらの残基は「類似」している。対照的に、アスパラギン酸残基はフェニルアラニン残基に対して類似性を示さない。本発明の範囲内に含まれるホモログは、本明細書で同定されるマウスのエストロゲンレセプターおよびヒトのｃ−ｍｙｃ配列に高い類似性を有する必要がある。同一性および類似性は、任意のよく知られたアルゴリズム、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを使用して算出され得る。相同性は、核酸またはアミノ酸のレベルで決定され得る。好ましくは、本発明の範囲内のホモログは、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９０；２１５：４０３−４１０）をデフォルト条件で使用して算出した場合、アミノ酸または核酸レベルで少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましく７０％超、最も好ましくは８０％超、例えば９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するものである。
【００２０】
本明細書で用いられる「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」という用語には、配列から、または配列への１つ（以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失または付加が包含される。変異体は、サイレント変化および機能的に等価なポリペプチドを生じる欠失変異、挿入変異または置換変異を有してよい。目的とするアミノ酸置換は、サイズや電荷や疎水性などの類似の生理化学的特性に基づいて行える。保存的置換は、例えば下表に従って行うことができる。２列目の同一のブロック、好ましくは３列目の同一の行のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の膵臓細胞は、ｃ−ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質を発現する。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、本明細書において「融合ポリヌクレオチド」と称されるものであって、任意の形態、例えば膵臓細胞の中のプラスミドとして膵臓細胞内に存在するか、もしくは宿主のゲノム内に組込まれていてもよい。
【００２３】
膵臓細胞は、ゲノム内に融合ポリヌクレオチドを組込むことにより条件的に不死化されることが好ましい。宿主ゲノム内への異種のポリヌクレオチドの組込みのための方法は、本技術分野でよく知られており、任意の適切な方法も用いてよい。好ましくは、レトロウイルス感染を用いて融合ポリヌクレオチドをゲノム内に組込む。異種ゲノム内への遺伝物質の組込みのためのレトロウイルスベクターは、本技術分野でよく知られており、そしていずれを用いてもよい。好ましくは、前記ベクターは両栄養性レトロウイルスであり、最も好ましくは、前記ベクターはｐＬＮＣＸ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
【００２４】
ベクターは、任意の適切なウイルス産生細胞内で融合ポリヌクレオチドと共にパッケージされる。前記ウイルスは、好ましくはＴＥＦＬＹウイルス産生細胞株に由来するＦｌｙ−ＣＯ４２細胞により産生される。
【００２５】
ｐＬＮＣＸベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を駆動するＬＴＲプロモーターを含む。ネオマイシン（別名、ジェネテシンおよびＧ４１８）は、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞のみが生き残るように選択の間に培地内で用いられる。非感染標的細胞に対してネオマイシンの滴定を実施して非感染細胞の除去に必要な濃度を規定することができる。抗生物質耐性は不可欠なものではないが、感染細胞の選択を促進するために任意の抗生物質耐性遺伝子を用いてよい。
【００２６】
融合ポリヌクレオチドの発現を促進するために任意のプロモーターを用い得る。好ましくは、これは、任意の抗生物質耐性遺伝子の発現も促進するために用いられるものとは異なるプロモーターである。好ましくは、ＣＭＶプロモーターは、融合ポリヌクレオチドの発現を駆動する。
【００２７】
適切な融合ポリヌクレオチドの例としては、配列番号１として本明細書において同定されるｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭがあり、これは、合成薬４−ＯＨＴへの高親和性結合に影響を及ぼさずに１７β−エストラジオールに対する高親和性結合を除去するために変異させたマウスのエストロゲンレセプターに融合したヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子を含む。タンパク質におけるこの機能的変化の原因となるポリヌクレオチドに対するいずれの変異も本発明の範囲内であり、その変異としては、付加、置換または欠失が挙げられる。好ましくは、前記変異は点変異である。好ましい実施形態においては、点変異を導入してアミノ酸位６８１の野生型グリシンをアルギニンに変更する。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのホモログおよび機能的フラグメントは本発明の範囲内である。
【００２８】
当業者にとっては明らかなことであるが、膵臓細胞ゲノム内にレトロウイルスベクターが組込まれるためには、膵臓細胞は増殖を必要とする。組込みを最大化するためには、膵臓細胞が高率で増殖しているときにウイルスを添加すべきである。さらに感染の成功率を上昇させるために、感染中に培地に臭化ヘキサジメトリン（別名ポリブレン）などの促進剤を添加してもよい。これは、高濃度では一部の細胞に有毒であり得るが、ヒト胎児の膵臓細胞の感染にはうまく使用されてきた（７）。
【００２９】
本発明によれば、膵臓細胞の増殖シグナルとして４−ＯＨＴを使用することの利点は、この合成化学物質が通常ヒトに存在しないということであり、これにより、本発明に記載の膵臓細胞を医薬として使用することが可能になる。特に、前記膵臓細胞は、移植治療用の治療用細胞株において使用することができる。罹患または損傷した膵臓への健康な膵臓細胞の移植によって疾患により損傷を受けた細胞を置換し得る場合、膵臓細胞の移植は膵臓の疾患を治療するための１つの選択肢であると考えられる。細胞移植は、臓器移植の好ましい変形例と言える。膵臓機能を損なういずれの疾患も、本発明に記載の膵臓細胞または細胞凝集体の移植により治療され得るものであって、その疾患としては糖尿病や癌が挙げられるが、これらに限定されない。膵臓細胞を用いる獣医学的治療もまた、本発明の範囲内である。
【００３０】
本発明の細胞が従来の細胞および島移植技術を用いて移植され得るということは、熟練者には極めて明らかであろう。前記細胞はいかなる適切な技法を用いて導入してもよい。標準的な移植治療において行われるように、従来の免疫抑制剤を投与してもよい。治療に用いるための適切な組成物の調製は、熟練者にとって明らかである。
【００３１】
本発明の細胞、細胞株および細胞凝集体は、薬物の潜在的毒性の評価あるいは特定の治療における薬物の有効性の確認を行うためのスクリーニングアッセイに有用である。適切なスクリーニングアッセイは、熟練者にとって明らかである。前記アッセイは、薬物と接触させる場合における本発明の細胞の機能、形態または遺伝構造に対する変化を評価するために用いてよい。
典型的には、薬物として使用するための化合物の適合性を評価する方法は、以下のステップ：
（ｉ）本発明に記載の細胞または細胞凝集体に薬物としての可能性を有する化合物を接触させること；および
（ｉｉ）細胞または細胞凝集体の応答を測定し、それにより細胞または細胞凝集体に対する化合物の効果を決定し、そして薬物として使用するための化合物の適合性を評価すること、を含む。その意図は、細胞を刺激して、グルコースに応答してインスリンを産生させる作用をする化合物を同定することでもあり得る。あるいは、その意図は、細胞を刺激して細胞移植されると成熟する化合物を同定することであり得る。あるいは、その意図は、膵島細胞を刺激してグルカゴン、ソマトスタチンおよび／または膵臓ポリペプチドを産生させる化合物を同定することであり得る。
【実施例】
【００３２】
ここで、以下の非限定な実施例により本発明をさらに説明する。
特に言及されない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ社から購入した。
組織培養
すべての細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で増殖させた。細胞に対して、標準的な基準で1週間に３回の培地交換を行った。７０〜９５％コンフルエントにおいて細胞の継代を行った。
【００３３】
培地
ヒト胎児の膵臓細胞およびクローンは、以下の代替物からなるヒト膵臓培地（ＨＰＭ）と称する培地内で培養された：
（１）ＭｅｇａＣｅｌｌ（登録商標）ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）混合栄養素ハムＦ−１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ）、１．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および２ｍＭＬ−グルタミン。培地は、１Ｌフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）で無菌濾過し、３７℃で予熱した；または
（２）ＣＭＲＬ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ培地（ＣＭＲＬ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｍｅｄｉａ）；または
（３）ＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ）；
【００３４】
使用前に、以下の成長因子（ＧＦ）：２０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および５０ｎＭのガストリンＩ（Ｇａｓｔｒｉｎ Ｉ）をＨＰＭに添加した。感染後、膵細胞を補助剤：１００ｎＭの４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の存在下で培養した。
【００３５】
コーティング
組織培養処理されたプラスチック製器具（ｐｌａｓｔｉｃｗａｒｅ）またはコーティングしていないプラスチック製器具が用いられた。一部の培養物において、無菌ボトルウォーターで終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈されたフィブロネクチンの溶液でコーティングを行った。プラスチック製器具は、使用前に、最後にＨＢＳＳで洗浄した。他の培養物については、細胞外マトリックス基質を使用しなかった。
【００３６】
膵臓
ヒト胎児の膵臓は妊娠期間終了前に得られた。地域研究倫理委員会（Ｌｏｃａｌ ＮＨＳ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認は、研究開始前に得られた。
【００３７】
解離
出荷後のヒト胎児の膵臓は、ＲＰＭＩ培地内の湿った氷上に移した。膵臓は、４℃の、カルシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。膵臓は、メスで細かく切った。細かく切った胎児の膵臓をコラゲナーゼＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で消化し、３７℃で１５分間培養し、攪拌し、そして２分毎に研和（trituration)した。
【００３８】
解離された膵細胞を計数し、血球計算器を使用して細胞生存率を評価した。一実施例において、細胞付着を防止した未処理のペトリ皿プラスチック製器具上のＨＰＭおよびＧＦ内で細胞を平板培養して、３〜５日間放置して膵島細胞クラスター（ＩＣＣ）形成／凝集体形成をさせ、膵島細胞前駆体を優先的に選択した。別の一実施例においては、この選択を省略し、解離細胞標品を組織培養器具上で直接平板培養した。
【００３９】
ウイルスの採集
いくつかのＴ−１７５フラスコ内の合流箇所でクローンＦｌｙ−Ｃ０４２に由来するウイルス産生細胞を培養した。ＨＰＭ内でウイルスを採収した。コンフルエントのときに、フラスコを３×ＰＢＳで洗浄し、ＨＰＭをウイルス産生細胞に８時間、１８ｍＬ／Ｔ１７５フラスコで添加した。培地を採集し、そして０．４５μｍフィルタで濾過し、５ｍＬ培地／ファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブに等分し、液体窒素内でスナップ凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）して８０℃で保存した。
【００４０】
感染
フィブロネクチンをコーティングした、またはコーティングしていない容器に膵細胞または予め選択された膵臓細胞凝集体を移した。膵臓細胞は、ウイルス上清および４〜８μｇ／ｍＬの臭化ヘキサジメトリンで感染させた。感染から８〜１６時間後に新鮮なＨＰＭを添加し、そして翌日にその感染サイクルを繰り返した。４０％〜７０％コンフルエントで１０ｃｍのペトリ皿内で感染を行った。感染後、４ＯＨＴを培地に添加した。感染完了から２日後に増殖および／または選択のために細胞の継代を行った。
【００４１】
選択
感染した膵臓細胞を１６ｃｍのペトリ皿上に低密度で継代と平板培養を行い、そして２週間１００〜３００μｇ／ｍＬのジェネテシンで選択を行った。選択後、ポジティブ選択した細胞は個々のクローンを形成し、これらのクローンを収集および増殖して膵臓細胞株を発生させた。
【００４２】
継代
細胞をフラスコから継代または除去するたびに、フラスコを３７℃のＨＢＳＳで１回洗浄した。その後、３７℃の１×トリプシン−ヴェルセン混合物（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）を２〜５分間添加し、細胞をプラスチックから剥がした。等量の培地をトリプシン−ヴェルセン混合物に添加してトリプシンを中和し、そして細胞をファルコンチューブ内に５００ｇで５分間スピンした。上清を吸引し、そして１ｍＬの培地内で細胞を再懸濁し、そして細胞計数を血球計算器により行った。新しく新鮮なフィブロネクチンをコーティングしたか、またはコーティングしていない容器内に細胞を継代した。
【００４３】
凍結／融解
細胞を凍結する際、ｃｒｙｏ−ｓａｆｅバイアル（Ｎｕｎｃ社）内の９００μＬの培地と１００μＬのｃｒｙｏｓｕｒｅ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｑｕｅｓｔ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）の中で細胞ペレットを再懸濁した。ミスターフロスティ（Ｍｉｓｔｅｒ Ｆｒｏｓｔｙ）凍結保存容器（Ｎａｌｇｅｎｅ社）内に細胞を２４時間、−８０℃で保存し、温度は約５℃／分で低下させた。２４時間後、細胞を長期保存用液体窒素に移した。解凍の際、細胞を液体窒素から除去して容器内で完全に解凍されるまで３７℃の水槽に配置するか、もしくは直接に平板培養するか、もしくは３７℃の培地１０ｍＬと混合して５００ｇを５分間スピンした。上清を廃棄し、ペレットを新鮮な培地内に静かにピペットで移して再懸濁し、そして新しい容器内で平板培養した。
【００４４】
免疫細胞化学
初期の細胞の評価のために、免疫細胞化学を用いた。発現量の定量化は可能でなかったが、免疫細胞化学の利益は細胞がほとんど必要でないということにあり、何個の細胞が細胞集団内で特異的マーカーを発現したのかを確認することは可能であった。一部の細胞の発現が他よりも高いかどうかを確認することも可能であった。これは、先に進めるべき細胞や細胞株、ならびにどの細胞を廃棄するのかを選択するプロセスにおいて大きな意義がある。
【００４５】
使用した抗体：モルモット抗インスリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｓｉｇｍａ社）およびウサギ抗ＰＤＸ１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）。すべての染色はマルチウェルフォーマットで行い、以下の手法が用いられた。培地を吸引し、そして細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド入りＰＢＳ内において室温（ＲＴ）で１５分間固定した。４％パラホルムアルデヒドを吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。０．１％トリトン×−１００入りＰＢＳ内で細胞を２０分間透過した。それから細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３０分間、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（ベクター社）入りＰＢＳで遮断した。一次抗体を、室温で一晩中、１％ＮＧＳ入りＰＢＳ内に添加した。ウェルをＰＢＳで３×５分洗浄し、二次抗体を、室温で２時間、ＰＢＳ内に添加した。二次抗体は、約４８８ｎｍの波長で励起し、約５２５ｎｍの発光（緑色発光）を得た。２時間の培養後、ウェルを３×５分間ＰＢＳおよびＨｏｅｃｈｓｔ内で洗浄し、ＤＮＡを染色する化学物質を、室温で２分間、ＰＢＳ内に１：２５０００で添加した。Ｈｏｅｃｈｓｔは、約３５０ｎｍで励起し、約４２５ｎｍの発光（青色発光）を得た。最後にウェルを３×５分間ＰＢＳ内で洗浄し、最も新しい洗浄液内に放置した。すべての分析は、蛍光顕微鏡、Ｌｅｉｃａ社のＤＭＲＡと、デジタルカメラ、Ｃ４７４２−９５（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）と、コンピュータソフトウェア、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｉｍａｇｅ ＰＲＯとで行った。
【００４６】
トータルＲＮＡ抽出
トータルＲＮＡ抽出のために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ ７４１０４）を用いた。抽出につき、５×１０６個までの細胞の細胞ペレットを使用した。細胞を、１０μＬ／ｍＬの２−メルカプトエタノール入りの３５０μＬのＲＬＴ緩衝液でバラバラにし、試料を、Ｇｉｌｓｏｎピペットで研和（trituration)して均質化した。無水アルコール（Ｊｏｓｅｐｈ Ｍｉｌｌｓ社）を７０％に希釈し、そして３５０μＬを試料に添加し、ピペッティングにより混合した。試料をＲＮｅａｓｙミニカラムに移し、１５秒間８０００ｇでスピンした。３５０μＬのＲＷ１洗浄緩衝液を添加し、１５秒間８０００ｇでスピンした。１０μＬのＤＮアーゼ１ＲＮアーゼフリー（Ｑｉａｇｅｎ ７９２５４）入りの７０μＬのＲＤＤ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を１５分間ＲＮｅａｓｙミニカラム膜に添加した。３５０μＬのＲＷ１洗浄緩衝液を添加し、１５秒間８０００ｇでスピンし、５００μＬのＲＰＥ緩衝液を２回添加し、試料を８０００ｇでそれぞれ１５秒間と２分間スピンした。最後に、５０μＬのＲＮアーゼフリー水をカラムに添加し、それぞれ８０００ｇで１分間スピンした。ＲＮＡを含有する５０μＬの水をＲｎａｓｅフリーチューブ内に採集し、そして純度および量をスペクトロフォトメータＧｅｎｅＱｕａｎｔ ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）で確認した。試料を−８０℃で保存した。
【００４７】
ｃＤＮＡの作製
ｃＤＮＡを作製するために、抽出されたトータルＲＮＡを氷上で解凍し、５０ｎｇを氷上のＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーのチューブ内の以下のものと混合した：ＲＮａｓｉｎ ＲＮアーゼ阻害剤１００００ｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２１１５）（０．２５μＬ）、１０μＭランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４８１９０−０１１）または１０μＭオリゴｄＴ（２μＬ）および緩衝液ＲＴ１０×（２μＬ）、各５ｍＭのｄＮＴＰ−混合物（２μＬ）、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（１μＬ）およびＲＮアーゼフリーの水（すべてＱｕｉａｇｅｎキット２０５２１３から）を最終量２０μＬに混合した。チューブを３７℃の水槽内に６０分間置き、９３℃の熱ブロックに５分間移し、氷上で急速に冷却した。ｃＤＮＡを２０℃のフリーザー内で保存した。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ
ｃ−ｍｙｃ−ＥＲおよびインスリンのＰＣＲには、ｔｉｔａｎｉｕｍ ｔａｑ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用した。使用したプライマーについては、表２を参照されたい。ＰＣＲ反応条件は、標準的なものであった。使用したＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ２７００であった。分析には、１５μＬのＰＣＲ生成物を５μＬの６×ローディング色素溶液（ＭＢＩ Ｒ０６１１）と混合し、ゲルにロードした。３μｇのＤＮＡを含有する１００ｂｐのＤＮＡラダー（ＭＢＩ ＳＭ０２４１）（６μＬ）もロードした。ゲルは、ＴＡＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５５５８−０３４）、２％のアガロース、臭化エチジウム（２６７μｇ／ｍＬ）からなる２％アガロースゲルであった。ゲルをトレイＨＵ１３（Ｊｅｎｃｏｎｓ）内において電気泳動電源Ｅ８３５（Ｃｏｎｓｏｒｔ）で動かし、そして最後にＦｌｕｏｒ−Ｓ ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）で走査し、ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ）で解析した。定量的ＰＣＲのために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）スピン−カラムを使用してトータルＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、その後Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写して、定量的ＰＣＲの鋳型として使用し得るｃＤＮＡの第１ストランドを合成した。各遺伝子転写物を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０機器（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出される蛍光シグナルを各ＰＣＲサイクルの間集める配列特異的プライマー−プローブの組合せによって検出し；各遺伝子の転写を、多くのハウスキーピング遺伝子を評価することによりローディングレベルに対して正規化し、一部のキャリブレータ試料として発現させた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
凝集体形成
凝集体を生成するための方法は、Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎ（１０、１１）から応用したものである。組織培養処理されたまたは処理されていないプラスチック製器具内で膵臓細胞の増殖および平板培養を、１容器当たり少なくとも８×１０５個の細胞で、必要に応じて以下の条件の内の１つで行った：（ａ）８ｍＬのヒト膵臓培地（ＨＰＭ）、さらに以下の：ガストリンＩ（５０ｎＭ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の内の１つ以上を含む成長因子；（ｂ）８ｍＬの低グルコースＤＭＥＭ、さらに１．５％ＨＳＡおよび成長因子；（ｃ）８ｍＬのＣＭＲＬ、さらにインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、セレニウム（６．７μｇ／Ｌ）、さらに１％ＨＳＡ；（ｄ）ＨＰＭにおける処理組織培養容器内で融合性単層に増殖させ、トリプシンに１〜４分間曝露させ、その後８ｍＬのＣＭＲＬ、さらにインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、セレニウム（６．７μｇ／Ｌ）、さらに１％ＨＳＡを添加する。
【００５１】
凝集体形成を可能にするために、組織培養インキュベーター内で、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも２４時間培養した。
【００５２】
グルコースシフト
少なくとも２４時間後に凝集体を採集し、そして１５ｍＬチューブに移した。５’×１５００ｒｐｍで遠心分離して上清を除去し、そして１０ｍＬの低グルコース培地を用いてペレットを洗浄した。洗浄したペレットを２００μＬのＤＭＥＭ低グルコース、さらに２ｍｇ／ｍＬのＨＳＡおよび１０ｍＭのヘペス内で再懸濁し、そして３７℃で２時間培養した。２時間後、凝集体を遠心分離（５×１５００ｒｐｍ）で採集し、そして２００μＬのＤＭＥＭ高グルコース、さらに２ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ、１０ｍＭのヘペスおよび１０ｍＭのテオフィリンで再懸濁し、そして３７℃で２時間培養した。培養後、凝集体を遠心分離（５×１５００ｒｐｍ）で採集し、そして−８０℃で保存した。
【００５３】
ＥＬＩＳＡによるヒトインスリン検出
ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ、カタログ番号ＥＺＨＩ−２０Ｋ）において２０μＬの膵臓細胞溶解液および対照細胞を用いた。
【００５４】
ＥＬＩＳＡによるヒトプロインスリン検出
ヒトトータルプロインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ、カタログ番号ＥＺＨＩ−１５Ｋ）において２０μＬの膵臓細胞溶解液および対照細胞を用いた。
【００５５】
結果
解離、感染およびクローン選択
妊娠１１〜１９週にヒト胎児の組織に投与して解離させた。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭによる感染後のｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭ感染細胞個体群のクローン生存効率は、同じ組織からの非感染対照細胞よりも有意に高かった（図１参照）。２週間の選択後、個々クローンを選び、増殖させた。事前によい特性を示したクローンに対して、さらなるキャラクタリゼーションを行った。２０代継代における２つのクローンの核型を決定し、正常二倍体細胞であることが示された。
【００５６】
免疫細胞化学
ｃｍｙＥＲＴａｍコンストラクトを含有する細胞において、４−ＯＨＴを添加すると増殖は促進されるが、４−ＯＨＴを除去すると細胞の分化が促進されて成熟した表現型を示す。グルコースシフトステップを経た凝集細胞において成熟した表現型が認められた。あるクローンは、インスリンおよびＰＤＸ１に対してポジティブ染色を示し、そして明確な凝集体を形成した（図２参照）。
【００５７】
ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのためのＰＣＲ、インスリンおよび膵臓に特異的なマーカー
ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのための定量的ＰＣＲおよびヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）により、テストしたすべてのクローンにコンストラクトが集積したことが確認された（図３）。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭは、４−ＯＨＴによるｃ−ｍｙｃ遺伝子標的（テロメラーゼ逆転写酵素）誘導によって機能的になることが示された（図４）。
【００５８】
インスリンのためのプライマーを用いて実行されたＰＣＲによって、グルコースシフトに曝露される凝集したクローンにインスリンの発現が確認された。表２に示されるさらなる膵島マーカーも陽性であることが確認された。
【００５９】
ＥＬＩＳＡにより検出されるインスリンおよびプロインスリンの発現
グルコースシフトに曝露された凝集したＰＩＣ０Ｋ０４細胞の細胞溶解液で行ったプロインスリンＥＬＩＳＡ検出により、プロインスリンの発現が確認された。
【００６０】
グルコースシフトに曝露された凝集したＰＩＣ０Ｋ０４細胞やＰＩＣ０Ｋ２３細胞やＰＩＣ０Ｋ２４細胞の細胞溶解液で行ったインスリンＥＬＩＳＡ検出により、インスリンの発現が確認された。
疑いを避けるため、本明細書で参照されるすべての参考文献は本明細書に引用されたものとする。
【００６１】
参考文献
(1) The Diabetes Control and Complication Trial Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med329:977-986, 1993
(2) Shapiro, A.M.J. et al. (2000) Islet transplantation in seven patients with Type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regime. N. Engl. J. Med. 343, 230-238
(3) Beattie GM, Otonkoski T, Lopez AD, Hayek A. 1997 Functional b-cell mass after transplantation of human fetal pancreatic cells: differentiation or proliferation Diabetes. 46:244 -248.
(4) Orci L, Unger RH 1975, Functional subdivision of islets of Langerhans and possible role of D cells. Lancet 2:1243-1244
(5)Orci L 1982, Macro- and micro-domains in the endocrine pancreas. Diabetes 31:538-565
(6) Otonkoski T, Beattie GM, Mally MI, Ricordi C, Hayek A. 1993 Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.J Clin Invest. 92:1459-1466
(7) Leibowitz G, Bettie GM, Kafri T, Cirulli V, Lopez AD, Hayek A and Levine F.1999 Gene transfer to human pancreatic endocrine cell using viral vectors. Diabetes. 48:745-753
(8) Edmond A. Ryan, Jonathan R.T. Lakey, Breay W. Paty1, Sharleen Imes, Gregory S. Korbutt, Norman M. Kneteman, David Bigam2, Ray V. Rajotte, and A.M. James Shapiro Successful Islet. 2002 Transplantation Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control Diabetes 51:2148-2157.
(9) (10) Gershengorn et al, Science 306:2261-2264.
(11) Hardikar et al, PNAS (USA) 100:7117-7122.
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本発明を添付の図面を参照して説明する：
【図１】ＣｙＱｕａｎｔを使用して自動的に（Ａ）またはマニュアル計数により（Ｂ）細胞計数を行い、非感染性ＧＳＯ８０（１５週齢）組織を使用して産生された細胞の数を、Ｃ−ｍｙＣＥＲＴＡＭを形質導入した同じ組織との比較において示したグラフ図である。
【図２】適切なマーカーを発現する成熟膵細胞に分化する膵細胞株を示す図；（Ａ）は直径約２００μｍの細胞凝集体を示し；（Ｂ）は、マーカー、膵臓ｃ−ペプチド・インスリンに陽性の細胞が染色されていることを示し、（Ｃ）は、マーカー、ＰＤＸ−１に陽性の細胞が染色されていることを示す。
【図３】膵細胞におけるｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭの相対的発現を示すグラフである。
【図４】膵臓細胞における４−ＯＨＴによるテロメラーゼ誘導を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的および商業的な用途のためにスケールアップし得る条件的不死化膵臓細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界で少なくとも２億人があらゆる型の糖尿病に苦しめられており、そしてこの数は、２０２５年までに２倍になると考えられている。１型（インスリン依存性）糖尿病は、通常幼齢で、遺伝的素因のある個体に影響を及ぼす慢性疾患であって、膵ランゲルハンス島内のインスリン分泌β細胞が自己免疫攻撃により選択的かつ不可逆的に破壊されるものである。８０年以上の間、インスリン依存性糖尿病に対する主要な治療手段は、インスリン補充による対症療法に限られてきた。最近の研究においては、その疾患の眼合併症と神経学的合併症と腎合併症とを抑制するために厳しい血糖コントロールが重要であることが強調されている（１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このインスリン依存は、１型糖尿病患者へのヒト初代ランゲルハンス島（primary islets of Langerhans）移植の著しい進歩によりほとんどなくなってきた（２）。しかし、生きているドナーからの初代ヒト膵島の利用可能性は非常に限定されていることから、この治療の実用は限られている。そして、現在必要とされていることは、大きな臨床的効果を得るために初代ヒト膵島の生理的にコンピテントな代替物をほとんど無限に供給することである。１型糖尿病は、そのβ細胞特異的な性質ゆえに、細胞補充療法による治療に特に適している。多能性幹細胞を機能的β細胞に分化させる能力は、１型糖尿病治療の新しい治療可能性をもたらす。ヒト胎児の膵島細胞またはその前駆細胞は、臨床的な移植用インスリン産生組織の代替源となり得る（３）。胎児組織移植の成功は、胎児細胞の増殖能力だけでなく移植部位での成熟能力にも依存する。
【０００４】
胎児の不死化膵臓細胞があれば、初代ヒトランゲルハンス島の生理的にコンピテントな代替物を無限に供給することができる。哺乳類の膵臓におけるランゲルハンス島の発育については、調整された組織形態形成の例として鋭意研究されており、それは、このプロセスの理解により糖尿病の細胞移植治療の開発が容易になると期待されているからである（４、５）。膵臓の内分泌コンパートメントを含む膵島は、４種の細胞型を含み、その各々が別個のホルモンを産生するものであって、α細胞、β細胞および膵ポリペプチド（ＰＰ）細胞は、それぞれグルカゴン、ソマトスタチンおよびＰＰを分泌する。インスリン産生はβ細胞に限定される。β細胞は、成体の膵島細胞の大部分を含み、グルコース恒常性の主要な調節因子である。ヒト胎児の膵臓からの内分泌細胞前駆体の分離は、膵島細胞分化の研究にとって重要になり、ゆくゆくはインスリン依存性糖尿病の島移植にとって重要なものになるであろう。４種の膵内分泌細胞型が発現するこれらの前駆細胞は、胎児の膵導管上皮内に存在する。早期の膵芽はホメオボックス遺伝子ＩＰＦ−１（別名、ＩＤＸ−１、ＳＴＦ−１またはＰＤＸ）の均一な発現を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細胞培養物内に４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）が存在する場合には不死であるが、４−ＯＨＴが存在しない場合には通常の膵臓細胞マーカーを発現する条件的不死化膵細胞の作製に基づく。ｃ−ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合は、膵臓細胞に条件的不死化の性質を付与する要因である。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、哺乳類の膵臓細胞は、単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、条件的に膵臓細胞を不死化する方法は、以下のステップ：
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を膵臓細胞内に発現させること；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成した膵臓細胞にエストロゲンレセプターのリガンドを接触させ、それにより条件的に膵臓細胞を不死化すること、を含む。
【０００８】
本発明による膵臓細胞は、１型糖尿病、２型糖尿病の重症型の治療や薬物候補のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に特に有用である。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、薬物としての使用における化合物の適合性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法は、以下のステップ：
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む膵臓細胞に薬物としての可能性を有する化合物を接触させること；
（ｉｉ）膵臓細胞の応答を測定し、それにより膵臓細胞に対する化合物の効果を決定し、そしてそれにより、薬物としての使用における化合物の適合性を評価すること、を含む。好ましくは、膵臓細胞は培養培地からリガンド（４−ＯＨＴ）を除去することにより増殖が停止するものであり、そして膵臓細胞は完全に分化した表現型を発現させるものである。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、医薬としての、および糖尿病の治療用医薬の製造における本発明の膵臓細胞の使用である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、膵臓の初代培養物内のｍｙｃ／エストロゲン−レセプター融合タンパク質の発現によりそれらが条件的に不死化され、そのことにより膵細胞株が得られることを明らかにするものである。膵臓細胞がエストロゲンレセプターのリガンドの存在下で培養される場合、それらは不死である。その膵臓細胞からリガンドを除去することにより、細胞の不死性が喪失し、ゆえにそれは、膵臓のインサイチューにおける膵臓細胞から期待されるような「通常の」特性と膵細胞のマーカーを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書で用いられる「膵細胞」または「膵臓細胞」という用語は、膵臓が行う１以上の機能を実行し得る膵臓から得られ得る任意の細胞を意味する。いずれの種に由来する膵細胞も本発明の範囲内であるが、膵臓細胞は哺乳動物のものであることが好ましく、最も好ましくはヒトのものである。ｉｎ ｖｉｔｒｏで前駆体細胞から分化させた膵臓細胞、例えば胚性幹細胞または多能性幹細胞から分化させた膵臓細胞が用いられ得るように、胎児または成体の膵臓を使用してよい。
【００１３】
本発明に記載の膵臓細胞は、通常の膵臓に特徴的なマーカーを保持する。膵臓の内分泌コンパートメントを含む膵島は、４種の細胞型を含み、その各々が別個のホルモンを産生する。α細胞、β細胞および膵ポリペプチド（ＰＰ）細胞は、それぞれグルカゴン、ソマトスタチンおよびＰＰを分泌する。インスリン産生はβ細胞に限定される。ホメオドメイン転写因子の膵臓・十二指腸ホメオボックス−１（ＰＤＸ１）およびインスリンを、ヒト胎児の膵臓クローンのキャラクタリゼーションにおけるマーカーとして使用した。
【００１４】
当初のエドモントンプロトコル（８）によれば、充填組織容積１０ｍＬ未満中にレシピエントの体重1キログラム当たり少なくとも４０００膵島相当物（equivalents)が移植には必要である。同じグループは、後の研究（８）において、少なくとも９０００個／キログラムの膵島移植後に、１７人の患者すべてがインスリン非依存性になったと報告した。本発明による膵臓細胞は、未処理のペトリ皿を使用して培養すると、膵島相当物（本明細書において、凝集体と称される）を形成することが可能である。８ｍＬ培養培地／９０ｍｍペトリ皿の中の３百万個の膵臓細胞は、３万５千個の凝集体を産生し得る。この手法は、Ｓｈａｐｉｒら（２）により記述されているものなど、本技術分野で公知の糖尿病患者のために開発された手法にしたがい、ヒト移植において使用される十分な量の凝集体を産生するためにスケールアップできる。
【００１５】
本明細書で用いられる「不死」という用語は、長期の増殖を起こす能力を有する細胞を指す。本発明の膵臓細胞は、４−ＯＨＴの存在下で増殖する場合に不死である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養組織は、単細胞または細胞のコロニーから大きくなったものであって、当業者ならば周知のように「細胞株」と呼ばれる。これは、初代細胞とは対照的に、老化に達して最終的に細胞が死ぬ前に、限定された回数、一般的には１０〜２０回未満の分裂しかできないものである。本明細書で用いられる場合、条件的不死という用語は、ある特定の増殖条件の下で分裂する未成熟な細胞であって、他の条件の下では完全に成熟して非分裂細胞となる細胞を指す。本発明によれば、細胞の不死化の要因となる環境条件は、エストロゲンレセプターリガンドの存在である。
【００１６】
継続的な膵臓細胞の不死化を可能にし、ゆえに４−ＯＨＴの存在下で不死化される膵臓細胞の特徴は、ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質の存在である。理論に束縛されるものではないが、４−ＯＨＴがエストロゲンレセプターを活性化すると考えられる。エストロゲンレセプターの活性化によって腫瘍性タンパク質ｍｙｃの二量体化および核移行が可能になり、それは核において転写因子として作用し、増殖や遺伝子安定化の発生を可能にする遺伝子の発現を開始する（例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋら、（２００６）；参考文献９参照）。４−ＯＨＴなしでは、ｍｙｃ腫瘍性タンパク質を含む融合タンパク質は依然として発現されるが、それは細胞質内にとどまり、さらなる増殖は起こらない。ゆえに、リガンドは、添加して膵臓細胞を（不死的に）増殖させたり、回収して前記細胞が通常の非増殖性膵臓細胞のように挙動し、機能的膵島細胞に分化し得るようにできる。
【００１７】
本発明の膵臓細胞は、ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質の発現により条件的に不死である。本明細書で用いられる「融合タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖として発現された、天然には別々に発現される２つのタンパク質配列またはペプチド配列を含む組換えタンパク質を指す。
【００１８】
融合タンパク質は、任意のｍｙｃタンパク質および任意のエストロゲンレセプター、または、エストロゲンレセプター４−ＯＨＴにより活性化される能力を保持し、細胞増殖につながる転写を活性化させるこれらタンパク質の任意のフラグメントも含み得る。好ましくは、ｍｙｃタンパク質はｃ−ｍｙｃである。好ましくは、エストロゲンレセプターは、４−ＯＨＴへの高親和性結合には影響を及ぼさずに１７β−エストラジオールへの高親和性結合を妨げる変異を有するものである。この変異は、１または多くのアミノ酸残基の欠失、置換または付加であってよい。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、マウスのエストロゲンレセプターに融合するヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子からなる。より好ましくは、融合タンパク質は、配列番号２として本明細書において同定されるアミノ酸配列を含む。前述のように、配列番号２のいかなるホモログまたは機能的フラグメントも本発明の範囲内である。
【００１９】
本明細書で用いられる「ホモログ」という用語は、ＤＮＡやＲＮＡやタンパク質配列などの２個以上の生物重合体の間における類似性または同一性を指す。配列同一性の概念は、本技術分野でよく知られており、２つの配列間における同一性のレベルを意味する。類似性の概念は同程度によく知られており、２つの配列の類似点を考慮する場合、構造または機能に大きな影響を及ぼさない２つの配列間の保存的相違が含まれるものである。例えば、グルタミン酸は、タンパク質の構造または機能に大きな影響を及ぼすことのないアスパラギン酸で置換してよい；これらの残基は「類似」している。対照的に、アスパラギン酸残基はフェニルアラニン残基に対して類似性を示さない。本発明の範囲内に含まれるホモログは、本明細書で同定されるマウスのエストロゲンレセプターおよびヒトのｃ−ｍｙｃ配列に高い類似性を有する必要がある。同一性および類似性は、任意のよく知られたアルゴリズム、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを使用して算出され得る。相同性は、核酸またはアミノ酸のレベルで決定され得る。好ましくは、本発明の範囲内のホモログは、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９０；２１５：４０３−４１０）をデフォルト条件で使用して算出した場合、アミノ酸または核酸レベルで少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましく７０％超、最も好ましくは８０％超、例えば９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するものである。
【００２０】
本明細書で用いられる「変異体」、「ホモログ」、「誘導体」または「フラグメント」という用語には、配列から、または配列への１つ（以上）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換、欠失または付加が包含される。変異体は、サイレント変化および機能的に等価なポリペプチドを生じる欠失変異、挿入変異または置換変異を有してよい。目的とするアミノ酸置換は、サイズや電荷や疎水性などの類似の生理化学的特性に基づいて行える。保存的置換は、例えば下表に従って行うことができる。２列目の同一のブロック、好ましくは３列目の同一の行のアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の膵臓細胞は、ｃ−ｍｙｃ／エストロゲンレセプター融合タンパク質を発現する。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、本明細書において「融合ポリヌクレオチド」と称されるものであって、任意の形態、例えば膵臓細胞の中のプラスミドとして膵臓細胞内に存在するか、もしくは宿主のゲノム内に組込まれていてもよい。
【００２３】
膵臓細胞は、ゲノム内に融合ポリヌクレオチドを組込むことにより条件的に不死化されることが好ましい。宿主ゲノム内への異種のポリヌクレオチドの組込みのための方法は、本技術分野でよく知られており、任意の適切な方法も用いてよい。好ましくは、レトロウイルス感染を用いて融合ポリヌクレオチドをゲノム内に組込む。異種ゲノム内への遺伝物質の組込みのためのレトロウイルスベクターは、本技術分野でよく知られており、そしていずれを用いてもよい。好ましくは、前記ベクターは両栄養性レトロウイルスであり、最も好ましくは、前記ベクターはｐＬＮＣＸ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
【００２４】
ベクターは、任意の適切なウイルス産生細胞内で融合ポリヌクレオチドと共にパッケージされる。前記ウイルスは、好ましくはＴＥＦＬＹウイルス産生細胞株に由来するＦｌｙ−ＣＯ４２細胞により産生される。
【００２５】
ｐＬＮＣＸベクターは、ネオマイシン耐性遺伝子を駆動するＬＴＲプロモーターを含む。ネオマイシン（別名、ジェネテシンおよびＧ４１８）は、ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞のみが生き残るように選択の間に培地内で用いられる。非感染標的細胞に対してネオマイシンの滴定を実施して非感染細胞の除去に必要な濃度を規定することができる。抗生物質耐性は不可欠なものではないが、感染細胞の選択を促進するために任意の抗生物質耐性遺伝子を用いてよい。
【００２６】
融合ポリヌクレオチドの発現を促進するために任意のプロモーターを用い得る。好ましくは、これは、任意の抗生物質耐性遺伝子の発現も促進するために用いられるものとは異なるプロモーターである。好ましくは、ＣＭＶプロモーターは、融合ポリヌクレオチドの発現を駆動する。
【００２７】
適切な融合ポリヌクレオチドの例としては、配列番号１として本明細書において同定されるｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭがあり、これは、合成薬４−ＯＨＴへの高親和性結合に影響を及ぼさずに１７β−エストラジオールに対する高親和性結合を除去するために変異させたマウスのエストロゲンレセプターに融合したヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子を含む。タンパク質におけるこの機能的変化の原因となるポリヌクレオチドに対するいずれの変異も本発明の範囲内であり、その変異としては、付加、置換または欠失が挙げられる。好ましくは、前記変異は点変異である。好ましい実施形態においては、点変異を導入してアミノ酸位６８１の野生型グリシンをアルギニンに変更する。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのホモログおよび機能的フラグメントは本発明の範囲内である。
【００２８】
当業者にとっては明らかなことであるが、膵臓細胞ゲノム内にレトロウイルスベクターが組込まれるためには、膵臓細胞は増殖を必要とする。組込みを最大化するためには、膵臓細胞が高率で増殖しているときにウイルスを添加すべきである。さらに感染の成功率を上昇させるために、感染中に培地に臭化ヘキサジメトリン（別名ポリブレン）などの促進剤を添加してもよい。これは、高濃度では一部の細胞に有毒であり得るが、ヒト胎児の膵臓細胞の感染にはうまく使用されてきた（７）。
【００２９】
本発明によれば、膵臓細胞の増殖シグナルとして４−ＯＨＴを使用することの利点は、この合成化学物質が通常ヒトに存在しないということであり、これにより、本発明に記載の膵臓細胞を医薬として使用することが可能になる。特に、前記膵臓細胞は、移植治療用の治療用細胞株において使用することができる。罹患または損傷した膵臓への健康な膵臓細胞の移植によって疾患により損傷を受けた細胞を置換し得る場合、膵臓細胞の移植は膵臓の疾患を治療するための１つの選択肢であると考えられる。細胞移植は、臓器移植の好ましい変形例と言える。膵臓機能を損なういずれの疾患も、本発明に記載の膵臓細胞または細胞凝集体の移植により治療され得るものであって、その疾患としては糖尿病や癌が挙げられるが、これらに限定されない。膵臓細胞を用いる獣医学的治療もまた、本発明の範囲内である。
【００３０】
本発明の細胞が従来の細胞および島移植技術を用いて移植され得るということは、熟練者には極めて明らかであろう。前記細胞はいかなる適切な技法を用いて導入してもよい。標準的な移植治療において行われるように、従来の免疫抑制剤を投与してもよい。治療に用いるための適切な組成物の調製は、熟練者にとって明らかである。
【００３１】
本発明の細胞、細胞株および細胞凝集体は、薬物の潜在的毒性の評価あるいは特定の治療における薬物の有効性の確認を行うためのスクリーニングアッセイに有用である。適切なスクリーニングアッセイは、熟練者にとって明らかである。前記アッセイは、薬物と接触させる場合における本発明の細胞の機能、形態または遺伝構造に対する変化を評価するために用いてよい。
典型的には、薬物として使用するための化合物の適合性を評価する方法は、以下のステップ：
（ｉ）本発明に記載の細胞または細胞凝集体に薬物としての可能性を有する化合物を接触させること；および
（ｉｉ）細胞または細胞凝集体の応答を測定し、それにより細胞または細胞凝集体に対する化合物の効果を決定し、そして薬物として使用するための化合物の適合性を評価すること、を含む。その意図は、細胞を刺激して、グルコースに応答してインスリンを産生させる作用をする化合物を同定することでもあり得る。あるいは、その意図は、細胞を刺激して細胞移植されると成熟する化合物を同定することであり得る。あるいは、その意図は、膵島細胞を刺激してグルカゴン、ソマトスタチンおよび／または膵臓ポリペプチドを産生させる化合物を同定することであり得る。
【実施例】
【００３２】
ここで、以下の非限定な実施例により本発明をさらに説明する。
特に言及されない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ社から購入した。
組織培養
すべての細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内において３７℃で増殖させた。細胞に対して、標準的な基準で1週間に３回の培地交換を行った。７０〜９５％コンフルエントにおいて細胞の継代を行った。
【００３３】
培地
ヒト胎児の膵臓細胞およびクローンは、以下の代替物からなるヒト膵臓培地（ＨＰＭ）と称する培地内で培養された：
（１）ＭｅｇａＣｅｌｌ（登録商標）ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）混合栄養素ハムＦ−１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ Ｈａｍ）、１．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ）および２ｍＭＬ−グルタミン。培地は、１Ｌフィルターユニット（Ｎａｌｇｅｎｅ）で無菌濾過し、３７℃で予熱した；または
（２）ＣＭＲＬ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ培地（ＣＭＲＬ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｍｅｄｉａ）；または
（３）ＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｅｘ）；
【００３４】
使用前に、以下の成長因子（ＧＦ）：２０ｎｇ／ｍＬの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および５０ｎＭのガストリンＩ（Ｇａｓｔｒｉｎ Ｉ）をＨＰＭに添加した。感染後、膵細胞を補助剤：１００ｎＭの４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の存在下で培養した。
【００３５】
コーティング
組織培養処理されたプラスチック製器具（ｐｌａｓｔｉｃｗａｒｅ）またはコーティングしていないプラスチック製器具が用いられた。一部の培養物において、無菌ボトルウォーターで終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈されたフィブロネクチンの溶液でコーティングを行った。プラスチック製器具は、使用前に、最後にＨＢＳＳで洗浄した。他の培養物については、細胞外マトリックス基質を使用しなかった。
【００３６】
膵臓
ヒト胎児の膵臓は妊娠期間終了前に得られた。地域研究倫理委員会（Ｌｏｃａｌ ＮＨＳ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認は、研究開始前に得られた。
【００３７】
解離
出荷後のヒト胎児の膵臓は、ＲＰＭＩ培地内の湿った氷上に移した。膵臓は、４℃の、カルシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。膵臓は、メスで細かく切った。細かく切った胎児の膵臓をコラゲナーゼＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で消化し、３７℃で１５分間培養し、攪拌し、そして２分毎に研和（trituration)した。
【００３８】
解離された膵細胞を計数し、血球計算器を使用して細胞生存率を評価した。一実施例において、細胞付着を防止した未処理のペトリ皿プラスチック製器具上のＨＰＭおよびＧＦ内で細胞を平板培養して、３〜５日間放置して膵島細胞クラスター（ＩＣＣ）形成／凝集体形成をさせ、膵島細胞前駆体を優先的に選択した。別の一実施例においては、この選択を省略し、解離細胞標品を組織培養器具上で直接平板培養した。
【００３９】
ウイルスの採集
いくつかのＴ−１７５フラスコ内の合流箇所でクローンＦｌｙ−Ｃ０４２に由来するウイルス産生細胞を培養した。ＨＰＭ内でウイルスを採収した。コンフルエントのときに、フラスコを３×ＰＢＳで洗浄し、ＨＰＭをウイルス産生細胞に８時間、１８ｍＬ／Ｔ１７５フラスコで添加した。培地を採集し、そして０．４５μｍフィルタで濾過し、５ｍＬ培地／ファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブに等分し、液体窒素内でスナップ凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）して８０℃で保存した。
【００４０】
感染
フィブロネクチンをコーティングした、またはコーティングしていない容器に膵細胞または予め選択された膵臓細胞凝集体を移した。膵臓細胞は、ウイルス上清および４〜８μｇ／ｍＬの臭化ヘキサジメトリンで感染させた。感染から８〜１６時間後に新鮮なＨＰＭを添加し、そして翌日にその感染サイクルを繰り返した。４０％〜７０％コンフルエントで１０ｃｍのペトリ皿内で感染を行った。感染後、４ＯＨＴを培地に添加した。感染完了から２日後に増殖および／または選択のために細胞の継代を行った。
【００４１】
選択
感染した膵臓細胞を１６ｃｍのペトリ皿上に低密度で継代と平板培養を行い、そして２週間１００〜３００μｇ／ｍＬのジェネテシンで選択を行った。選択後、ポジティブ選択した細胞は個々のクローンを形成し、これらのクローンを収集および増殖して膵臓細胞株を発生させた。
【００４２】
継代
細胞をフラスコから継代または除去するたびに、フラスコを３７℃のＨＢＳＳで１回洗浄した。その後、３７℃の１×トリプシン−ヴェルセン混合物（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）を２〜５分間添加し、細胞をプラスチックから剥がした。等量の培地をトリプシン−ヴェルセン混合物に添加してトリプシンを中和し、そして細胞をファルコンチューブ内に５００ｇで５分間スピンした。上清を吸引し、そして１ｍＬの培地内で細胞を再懸濁し、そして細胞計数を血球計算器により行った。新しく新鮮なフィブロネクチンをコーティングしたか、またはコーティングしていない容器内に細胞を継代した。
【００４３】
凍結／融解
細胞を凍結する際、ｃｒｙｏ−ｓａｆｅバイアル（Ｎｕｎｃ社）内の９００μＬの培地と１００μＬのｃｒｙｏｓｕｒｅ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｑｕｅｓｔ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）の中で細胞ペレットを再懸濁した。ミスターフロスティ（Ｍｉｓｔｅｒ Ｆｒｏｓｔｙ）凍結保存容器（Ｎａｌｇｅｎｅ社）内に細胞を２４時間、−８０℃で保存し、温度は約５℃／分で低下させた。２４時間後、細胞を長期保存用液体窒素に移した。解凍の際、細胞を液体窒素から除去して容器内で完全に解凍されるまで３７℃の水槽に配置するか、もしくは直接に平板培養するか、もしくは３７℃の培地１０ｍＬと混合して５００ｇを５分間スピンした。上清を廃棄し、ペレットを新鮮な培地内に静かにピペットで移して再懸濁し、そして新しい容器内で平板培養した。
【００４４】
免疫細胞化学
初期の細胞の評価のために、免疫細胞化学を用いた。発現量の定量化は可能でなかったが、免疫細胞化学の利益は細胞がほとんど必要でないということにあり、何個の細胞が細胞集団内で特異的マーカーを発現したのかを確認することは可能であった。一部の細胞の発現が他よりも高いかどうかを確認することも可能であった。これは、先に進めるべき細胞や細胞株、ならびにどの細胞を廃棄するのかを選択するプロセスにおいて大きな意義がある。
【００４５】
使用した抗体：モルモット抗インスリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｓｉｇｍａ社）およびウサギ抗ＰＤＸ１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）。すべての染色はマルチウェルフォーマットで行い、以下の手法が用いられた。培地を吸引し、そして細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド入りＰＢＳ内において室温（ＲＴ）で１５分間固定した。４％パラホルムアルデヒドを吸引し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。０．１％トリトン×−１００入りＰＢＳ内で細胞を２０分間透過した。それから細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３０分間、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（ベクター社）入りＰＢＳで遮断した。一次抗体を、室温で一晩中、１％ＮＧＳ入りＰＢＳ内に添加した。ウェルをＰＢＳで３×５分洗浄し、二次抗体を、室温で２時間、ＰＢＳ内に添加した。二次抗体は、約４８８ｎｍの波長で励起し、約５２５ｎｍの発光（緑色発光）を得た。２時間の培養後、ウェルを３×５分間ＰＢＳおよびＨｏｅｃｈｓｔ内で洗浄し、ＤＮＡを染色する化学物質を、室温で２分間、ＰＢＳ内に１：２５０００で添加した。Ｈｏｅｃｈｓｔは、約３５０ｎｍで励起し、約４２５ｎｍの発光（青色発光）を得た。最後にウェルを３×５分間ＰＢＳ内で洗浄し、最も新しい洗浄液内に放置した。すべての分析は、蛍光顕微鏡、Ｌｅｉｃａ社のＤＭＲＡと、デジタルカメラ、Ｃ４７４２−９５（Ｈａｍａｍａｔｓｕ社）と、コンピュータソフトウェア、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｉｍａｇｅ ＰＲＯとで行った。
【００４６】
トータルＲＮＡ抽出
トータルＲＮＡ抽出のために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ ７４１０４）を用いた。抽出につき、５×１０６個までの細胞の細胞ペレットを使用した。細胞を、１０μＬ／ｍＬの２−メルカプトエタノール入りの３５０μＬのＲＬＴ緩衝液でバラバラにし、試料を、Ｇｉｌｓｏｎピペットで研和（trituration)して均質化した。無水アルコール（Ｊｏｓｅｐｈ Ｍｉｌｌｓ社）を７０％に希釈し、そして３５０μＬを試料に添加し、ピペッティングにより混合した。試料をＲＮｅａｓｙミニカラムに移し、１５秒間８０００ｇでスピンした。３５０μＬのＲＷ１洗浄緩衝液を添加し、１５秒間８０００ｇでスピンした。１０μＬのＤＮアーゼ１ＲＮアーゼフリー（Ｑｉａｇｅｎ ７９２５４）入りの７０μＬのＲＤＤ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を１５分間ＲＮｅａｓｙミニカラム膜に添加した。３５０μＬのＲＷ１洗浄緩衝液を添加し、１５秒間８０００ｇでスピンし、５００μＬのＲＰＥ緩衝液を２回添加し、試料を８０００ｇでそれぞれ１５秒間と２分間スピンした。最後に、５０μＬのＲＮアーゼフリー水をカラムに添加し、それぞれ８０００ｇで１分間スピンした。ＲＮＡを含有する５０μＬの水をＲｎａｓｅフリーチューブ内に採集し、そして純度および量をスペクトロフォトメータＧｅｎｅＱｕａｎｔ ｐｒｏ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）で確認した。試料を−８０℃で保存した。
【００４７】
ｃＤＮＡの作製
ｃＤＮＡを作製するために、抽出されたトータルＲＮＡを氷上で解凍し、５０ｎｇを氷上のＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーのチューブ内の以下のものと混合した：ＲＮａｓｉｎ ＲＮアーゼ阻害剤１００００ｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎ２１１５）（０．２５μＬ）、１０μＭランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ４８１９０−０１１）または１０μＭオリゴｄＴ（２μＬ）および緩衝液ＲＴ１０×（２μＬ）、各５ｍＭのｄＮＴＰ−混合物（２μＬ）、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（１μＬ）およびＲＮアーゼフリーの水（すべてＱｕｉａｇｅｎキット２０５２１３から）を最終量２０μＬに混合した。チューブを３７℃の水槽内に６０分間置き、９３℃の熱ブロックに５分間移し、氷上で急速に冷却した。ｃＤＮＡを２０℃のフリーザー内で保存した。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ
ｃ−ｍｙｃ−ＥＲおよびインスリンのＰＣＲには、ｔｉｔａｎｉｕｍ ｔａｑ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用した。使用したプライマーについては、表２を参照されたい。ＰＣＲ反応条件は、標準的なものであった。使用したＰＣＲ装置は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ２７００であった。分析には、１５μＬのＰＣＲ生成物を５μＬの６×ローディング色素溶液（ＭＢＩ Ｒ０６１１）と混合し、ゲルにロードした。３μｇのＤＮＡを含有する１００ｂｐのＤＮＡラダー（ＭＢＩ ＳＭ０２４１）（６μＬ）もロードした。ゲルは、ＴＡＥ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５５５８−０３４）、２％のアガロース、臭化エチジウム（２６７μｇ／ｍＬ）からなる２％アガロースゲルであった。ゲルをトレイＨＵ１３（Ｊｅｎｃｏｎｓ）内において電気泳動電源Ｅ８３５（Ｃｏｎｓｏｒｔ）で動かし、そして最後にＦｌｕｏｒ−Ｓ ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）で走査し、ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ）で解析した。定量的ＰＣＲのために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）スピン−カラムを使用してトータルＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、その後Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写して、定量的ＰＣＲの鋳型として使用し得るｃＤＮＡの第１ストランドを合成した。各遺伝子転写物を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０機器（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出される蛍光シグナルを各ＰＣＲサイクルの間集める配列特異的プライマー−プローブの組合せによって検出し；各遺伝子の転写を、多くのハウスキーピング遺伝子を評価することによりローディングレベルに対して正規化し、一部のキャリブレータ試料として発現させた。
【００４９】
【表２】
【００５０】
凝集体形成
凝集体を生成するための方法は、Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎ（１０、１１）から応用したものである。組織培養処理されたまたは処理されていないプラスチック製器具内で膵臓細胞の増殖および平板培養を、１容器当たり少なくとも８×１０５個の細胞で、必要に応じて以下の条件の内の１つで行った：（ａ）８ｍＬのヒト膵臓培地（ＨＰＭ）、さらに以下の：ガストリンＩ（５０ｎＭ）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の内の１つ以上を含む成長因子；（ｂ）８ｍＬの低グルコースＤＭＥＭ、さらに１．５％ＨＳＡおよび成長因子；（ｃ）８ｍＬのＣＭＲＬ、さらにインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、セレニウム（６．７μｇ／Ｌ）、さらに１％ＨＳＡ；（ｄ）ＨＰＭにおける処理組織培養容器内で融合性単層に増殖させ、トリプシンに１〜４分間曝露させ、その後８ｍＬのＣＭＲＬ、さらにインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、セレニウム（６．７μｇ／Ｌ）、さらに１％ＨＳＡを添加する。
【００５１】
凝集体形成を可能にするために、組織培養インキュベーター内で、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも２４時間培養した。
【００５２】
グルコースシフト
少なくとも２４時間後に凝集体を採集し、そして１５ｍＬチューブに移した。５’×１５００ｒｐｍで遠心分離して上清を除去し、そして１０ｍＬの低グルコース培地を用いてペレットを洗浄した。洗浄したペレットを２００μＬのＤＭＥＭ低グルコース、さらに２ｍｇ／ｍＬのＨＳＡおよび１０ｍＭのヘペス内で再懸濁し、そして３７℃で２時間培養した。２時間後、凝集体を遠心分離（５×１５００ｒｐｍ）で採集し、そして２００μＬのＤＭＥＭ高グルコース、さらに２ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ、１０ｍＭのヘペスおよび１０ｍＭのテオフィリンで再懸濁し、そして３７℃で２時間培養した。培養後、凝集体を遠心分離（５×１５００ｒｐｍ）で採集し、そして−８０℃で保存した。
【００５３】
ＥＬＩＳＡによるヒトインスリン検出
ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ、カタログ番号ＥＺＨＩ−２０Ｋ）において２０μＬの膵臓細胞溶解液および対照細胞を用いた。
【００５４】
ＥＬＩＳＡによるヒトプロインスリン検出
ヒトトータルプロインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ、カタログ番号ＥＺＨＩ−１５Ｋ）において２０μＬの膵臓細胞溶解液および対照細胞を用いた。
【００５５】
結果
解離、感染およびクローン選択
妊娠１１〜１９週にヒト胎児の組織に投与して解離させた。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭによる感染後のｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭ感染細胞個体群のクローン生存効率は、同じ組織からの非感染対照細胞よりも有意に高かった（図１参照）。２週間の選択後、個々クローンを選び、増殖させた。事前によい特性を示したクローンに対して、さらなるキャラクタリゼーションを行った。２０代継代における２つのクローンの核型を決定し、正常二倍体細胞であることが示された。
【００５６】
免疫細胞化学
ｃｍｙＥＲＴａｍコンストラクトを含有する細胞において、４−ＯＨＴを添加すると増殖は促進されるが、４−ＯＨＴを除去すると細胞の分化が促進されて成熟した表現型を示す。グルコースシフトステップを経た凝集細胞において成熟した表現型が認められた。あるクローンは、インスリンおよびＰＤＸ１に対してポジティブ染色を示し、そして明確な凝集体を形成した（図２参照）。
【００５７】
ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのためのＰＣＲ、インスリンおよび膵臓に特異的なマーカー
ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭのための定量的ＰＣＲおよびヌクレアーゼプロテクションアッセイ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）により、テストしたすべてのクローンにコンストラクトが集積したことが確認された（図３）。ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭは、４−ＯＨＴによるｃ−ｍｙｃ遺伝子標的（テロメラーゼ逆転写酵素）誘導によって機能的になることが示された（図４）。
【００５８】
インスリンのためのプライマーを用いて実行されたＰＣＲによって、グルコースシフトに曝露される凝集したクローンにインスリンの発現が確認された。表２に示されるさらなる膵島マーカーも陽性であることが確認された。
【００５９】
ＥＬＩＳＡにより検出されるインスリンおよびプロインスリンの発現
グルコースシフトに曝露された凝集したＰＩＣ０Ｋ０４細胞の細胞溶解液で行ったプロインスリンＥＬＩＳＡ検出により、プロインスリンの発現が確認された。
【００６０】
グルコースシフトに曝露された凝集したＰＩＣ０Ｋ０４細胞やＰＩＣ０Ｋ２３細胞やＰＩＣ０Ｋ２４細胞の細胞溶解液で行ったインスリンＥＬＩＳＡ検出により、インスリンの発現が確認された。
疑いを避けるため、本明細書で参照されるすべての参考文献は本明細書に引用されたものとする。
【００６１】
参考文献
(1) The Diabetes Control and Complication Trial Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med329:977-986, 1993
(2) Shapiro, A.M.J. et al. (2000) Islet transplantation in seven patients with Type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regime. N. Engl. J. Med. 343, 230-238
(3) Beattie GM, Otonkoski T, Lopez AD, Hayek A. 1997 Functional b-cell mass after transplantation of human fetal pancreatic cells: differentiation or proliferation Diabetes. 46:244 -248.
(4) Orci L, Unger RH 1975, Functional subdivision of islets of Langerhans and possible role of D cells. Lancet 2:1243-1244
(5)Orci L 1982, Macro- and micro-domains in the endocrine pancreas. Diabetes 31:538-565
(6) Otonkoski T, Beattie GM, Mally MI, Ricordi C, Hayek A. 1993 Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.J Clin Invest. 92:1459-1466
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(8) Edmond A. Ryan, Jonathan R.T. Lakey, Breay W. Paty1, Sharleen Imes, Gregory S. Korbutt, Norman M. Kneteman, David Bigam2, Ray V. Rajotte, and A.M. James Shapiro Successful Islet. 2002 Transplantation Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control Diabetes 51:2148-2157.
(9) (10) Gershengorn et al, Science 306:2261-2264.
(11) Hardikar et al, PNAS (USA) 100:7117-7122.
【図面の簡単な説明】
【００６２】
本発明を添付の図面を参照して説明する：
【図１】ＣｙＱｕａｎｔを使用して自動的に（Ａ）またはマニュアル計数により（Ｂ）細胞計数を行い、非感染性ＧＳＯ８０（１５週齢）組織を使用して産生された細胞の数を、Ｃ−ｍｙＣＥＲＴＡＭを形質導入した同じ組織との比較において示したグラフ図である。
【図２】適切なマーカーを発現する成熟膵細胞に分化する膵細胞株を示す図；（Ａ）は直径約２００μｍの細胞凝集体を示し；（Ｂ）は、マーカー、膵臓ｃ−ペプチド・インスリンに陽性の細胞が染色されていることを示し、（Ｃ）は、マーカー、ＰＤＸ−１に陽性の細胞が染色されていることを示す。
【図３】膵細胞におけるｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭの相対的発現を示すグラフである。
【図４】膵臓細胞における４−ＯＨＴによるテロメラーゼ誘導を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のポリペプチド鎖として、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む哺乳類の膵臓細胞。
【請求項２】
腫瘍性タンパク質がｃ−ｍｙｃである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
培地内の、請求項１または請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ヒト細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれている、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
融合タンパク質がマウスのエストロゲンレセプターとヒトのｃ−ｍｙｃタンパク質とを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
エストロゲンレセプターが１７β−エストラジオールへの高親和性結合を妨げる変異を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
配列番号１として本明細書で同定されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓細胞に特徴的なマーカーを発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
マーカーが以下のＩＰＦ１、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ、ＩＳＬ１、ＮＫＸ２．２、グルカゴンおよび膵臓ポリペプチドの組合せを含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞がエストロゲンレセプターのリガンドを接触させると条件的に不死化されるものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１３】
リガンドが４−ヒドロキシタモキシフェンである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞凝集体を形成するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の膵臓細胞の使用。
【請求項１５】
コーティングされていない面に細胞凝集体が形成される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、請求項１、２、７または８のいずれかに規定される融合タンパク質を細胞内で発現させるステップ；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成した前記細胞にエストロゲンレセプターのリガンドを接触させ、それにより条件的に前記細胞を不死化するステップ、を含む、条件的に細胞を不死化する方法。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞、または請求項１４または請求項１５に記載の細胞凝集体に薬物としての可能性を有する化合物を接触させるステップ；および
（ｉｉ）前記細胞または前記細胞凝集体の応答を測定し、それにより細胞または細胞凝集体に対する前記化合物の効果を決定し、そして薬物としての使用における該化合物の適合性を評価するステップ、を含む、薬物としての使用における化合物の適合性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法。
【請求項１８】
化合物がグルコースに応答して前記細胞を刺激してインスリンを産生させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
移植の際に化合物が前記細胞を刺激して成熟させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が膵島細胞を刺激する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が膵臓細胞に対するその毒性により評価される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
医薬として使用するための請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項２３】
膵臓の障害を治療するための医薬の製造における請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２４】
膵臓の障害を治療するための医薬の製造における請求項１５に記載の細胞凝集体の使用。
【請求項２５】
前記障害が糖尿病を包含する、請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項１】
単一のポリペプチド鎖として、ｍｙｃファミリーの腫瘍性タンパク質およびエストロゲンレセプター、またはその機能的フラグメントを含む融合タンパク質を含む哺乳類の膵臓細胞。
【請求項２】
腫瘍性タンパク質がｃ−ｍｙｃである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
培地内の、請求項１または請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ヒト細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれている、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
融合タンパク質がマウスのエストロゲンレセプターとヒトのｃ−ｍｙｃタンパク質とを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
エストロゲンレセプターが１７β−エストラジオールへの高親和性結合を妨げる変異を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
配列番号１として本明細書で同定されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓細胞に特徴的なマーカーを発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
マーカーが以下のＩＰＦ１、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ、ＩＳＬ１、ＮＫＸ２．２、グルカゴンおよび膵臓ポリペプチドの組合せを含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞がエストロゲンレセプターのリガンドを接触させると条件的に不死化されるものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１３】
リガンドが４−ヒドロキシタモキシフェンである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞凝集体を形成するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の膵臓細胞の使用。
【請求項１５】
コーティングされていない面に細胞凝集体が形成される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
（ｉ）単一のポリペプチド鎖として発現された、請求項１、２、７または８のいずれかに規定される融合タンパク質を細胞内で発現させるステップ；および
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成した前記細胞にエストロゲンレセプターのリガンドを接触させ、それにより条件的に前記細胞を不死化するステップ、を含む、条件的に細胞を不死化する方法。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞、または請求項１４または請求項１５に記載の細胞凝集体に薬物としての可能性を有する化合物を接触させるステップ；および
（ｉｉ）前記細胞または前記細胞凝集体の応答を測定し、それにより細胞または細胞凝集体に対する前記化合物の効果を決定し、そして薬物としての使用における該化合物の適合性を評価するステップ、を含む、薬物としての使用における化合物の適合性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価する方法。
【請求項１８】
化合物がグルコースに応答して前記細胞を刺激してインスリンを産生させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
移植の際に化合物が前記細胞を刺激して成熟させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
化合物が膵島細胞を刺激する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が膵臓細胞に対するその毒性により評価される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
医薬として使用するための請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞。
【請求項２３】
膵臓の障害を治療するための医薬の製造における請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項２４】
膵臓の障害を治療するための医薬の製造における請求項１５に記載の細胞凝集体の使用。
【請求項２５】
前記障害が糖尿病を包含する、請求項２３または２４に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５１４５１７（Ｐ２００９−５１４５１７Ａ）
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３８４１４（Ｐ２００８−５３８４１４）
【出願日】平成１８年１１月３日（２００６．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０３６
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０４１６４６０８）リニューロン・リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月９日（２００９．４．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月３日（２００６．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４１０３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５２０３６
【国際公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【出願人】（５０４１６４６０８）リニューロン・リミテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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