柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法
【課題】従来のエタノール抽出処理方法に代わり、柑橘類からポリメトキシフラボノイドを比較的高い精製度でしかも比較的短時間で回収できる、新規且つ有用な方法を提供する。
【解決手段】１４０〜１８０℃の亜臨界水に５分以下の時間で柑橘類の果皮を接触させることで前記亜臨界水中にポリメトキシフラボノイド、例えばノビレチンやスダチチンを抽出する。抽出物の全体量、ジエチルエーテルで抽出されるエーテル抽出物の全量、ノビレチンやスダチチンの抽出量のすべての項目において、亜臨界水抽出処理を行った方がエタノール抽出処理を行った場合よりも大きいことが確認された。
【解決手段】１４０〜１８０℃の亜臨界水に５分以下の時間で柑橘類の果皮を接触させることで前記亜臨界水中にポリメトキシフラボノイド、例えばノビレチンやスダチチンを抽出する。抽出物の全体量、ジエチルエーテルで抽出されるエーテル抽出物の全量、ノビレチンやスダチチンの抽出量のすべての項目において、亜臨界水抽出処理を行った方がエタノール抽出処理を行った場合よりも大きいことが確認された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法に係り、特に亜臨界水による抽出作用を利用した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノビレチン（Nobiletin）はミカン等の柑橘類の果皮で含まれるポリメトキシフラボノイドの一種であって以下の化学式に示す構成を有しており、発ガン抑制作用やアルツハイマー型認知症の予防効果が期待されている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
したがって、今後はノビレチンを試薬として使用して動物実験を行い、その効能を客観的に証明した上で、臨床利用への途を開くことが求められている。
ノビレチンの回収方法としては、特許文献１でも教示されているように柑橘類からエタノールを溶媒として使用して抽出することが提案されているが、この方法では脂溶分も一緒に抽出されてしまうので、その後さらに別の有機溶媒で抽出して精製しようとしても純度を高くすることは難しい。而して、試薬は純度が高くないと、その効用を信頼性高く証明したことにはならない。
また、エタノール抽出の場合には抽出時間がかなり長くなってしまうことから、その時間の短縮化も急務の課題となっている。
【０００５】
また、スダチチン（Sudachitin）はスダチ等の柑橘類の果皮で含まれる、やはりポリメトキシフラボノイドの一種であって以下の化学式に示す構成を有しており、ノビレチンの前駆体である。
【０００６】
【化２】
【０００７】
スダチチンの全ての水酸基をメトキシ化してノビレチンに化学変換することが可能と考えられており、スダチチンの抽出は、ノビレチンを生産するための有効な手段と期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１４５８２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した課題を解決するものであり、柑橘類からポリメトキシフラボノイドを比較的高い精製度でしかも比較的短時間で回収できる、新規且つ有用な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、試行錯誤の結果、ポリメトキシフラボノイドは典型的な脂溶性物質ながら、最適条件下での亜臨界水との接触により、水中に抽出させることができることを見出し、それに基づいて一つの回収方法を提案するに至った。
すなわち、本発明のポリメトキシフラボノイドの回収方法は、最適条件下の亜臨界水に柑橘類を接触させることで抽出作用を利用してポリメトキシフラボノイドを回収することを特徴とするものである。
【００１１】
出発原料となる柑橘類としては、みかん、イヨカン、ハッサク、ネーブルオレンジ、シークワーサー、スダチ等が挙げられる。また、本発明における果皮とは、未使用のものだけでなく、ジュース用等に絞った後の搾りカスでもよい。そのため、本発明の方法によれば、生産過剰の果皮を利用できるだけでなく、ジュース加工工場から出される絞りカスも廃棄物とせずに有効活用できる。
【００１２】
亜臨界水の最適条件は、温度が最も重要になっており、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃である。この温度の亜臨界水に柑橘類を接触させて亜臨界水中にノビレチンやスダチチンといったポリメトキシフラボノイドを抽出させる。但し、１８０℃の条件で５分を超えると急速にポリメトキシフラボノイドが分解されていくことが確認されているので、上記した亜臨界水に接触させる時間は安全率を見込んで５分以内とすることを推奨する。
なお、抽出後の亜臨界水抽出液からは有機溶媒を溶離液として、カラムクロマトグラフィーによりポリメトキシフラボノイドを単離精製できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、柑橘類からポリメトキシフラボノイドを水中に抽出することができるのでその時点で脂肪分と分離でき、さらにその後有機溶媒を利用して分液したときに、ポリメトキシフラボノイドを含むその有機溶媒に可溶のものだけ有機溶媒相に抽出することになるので、結果的にポリメトキシフラボノイドを単離精製することができる。しかも、亜臨界水抽出方法によるため、その抽出時間も従来のエタノールを利用した抽出方法による場合に比べて著しく短時間で済む。
また、亜臨界水を利用した抽出装置は比較的単純な構成で設計されており、且つ使用溶媒は安価な水である。
従って、本発明の方法によれば、結果的にノビレチンについて商用ベースへの試薬の製造を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出温度の影響を示すグラフである。
【図２】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出時間の影響を示すグラフである。
【図３】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力の影響を示すグラフである。
【図４】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力(上限側)の影響を示すグラフである。
【図５】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力（下限側）の影響を示すグラフである。
【図６】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力（下限側）の影響を示すグラフである。
【図７】実施例２における、各種溶媒による抽出処理によるノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図８】実施例２における、エーテル抽出物全量とノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図９】実施例３における、種々の溶媒を使用して更に分液した場合のノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図１０】実施例４における、種々の柑橘類からのノビレチンの抽出量を示すグラフである。
【図１１】実施例５における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示すＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析の結果図である。
【図１２】実施例５における、ＭｅＯＨ画分へのスダチチンの溶出を示す結果図である。
【図１３】実施例６における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示す、ＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析の結果図である。
【図１４】実施例６における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示す、ＮＭＲ解析の結果図である。
【図１５】実施例７における、エーテル相と水相の抽出量を比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
亜臨界水抽出は、実験室レベルでは、市販の亜臨界水抽出装置を使用して行うことができる。
この抽出装置では、電熱ヒーターが密閉耐圧容器に取り付けられており、容器内の温度を上げることで圧力も上げるように構成されている。
本発明では、柑橘類、例えば柑橘類の水洗いした果皮やその搾りカスを含水状態のまま、適度な量の水と共に適当な密閉耐圧容器に入れて密閉し、撹拌しながら、容器内に亜臨界状態を作り出している。
【００１６】
２２ＭＰａ、３７５℃が臨界点であり、この臨界点より低いがそれに近い温度、圧力での状態を亜臨界状態という。上記した密閉耐圧容器内を加熱すると、温度上昇とともに内部圧力も上昇し、容器内の水が上記した亜臨界水となる。亜臨界水の存在領域には有る程度は広さがあるが、その領域のどこでも良いわけではなく、最適範囲から外れればポリメトキシフラボノイドが有意量どころか痕跡量も抽出されない。
従って、以下で亜臨界水を利用したポリメトキシフラボノイドの最適な抽出条件について詳細に説明する。
【００１７】
先ず、「抽出温度」は、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃に設定する。ここで、「抽出温度」とは、亜臨界水の温度制御における目標温度のことである。１８０℃を上限としたのでは、それを超えると急激に抽出量が落ちるからである。１４０〜１８０℃と範囲に幅があるが、通常はその中の一点を温度制御の目標温度に設定する。なお、現在使用できる亜臨界水抽出装置の温度制御の精度限界から、±３℃程度は常時温度変動しており、その範囲で上記した抽出温度と実際の温度との間にズレは生じるが、その程度のズレは誤差範囲内であり、目標温度が上記した「抽出温度」に含まれる限り、本発明の方法を実施したことになる。
【００１８】
亜臨界水を利用した抽出処理は既に幾例が提案されており、本出願人も、特開２００９−２４８０４９号公報において、ヘマトコッカス藻からアスタキサンチンを抽出することを提案しているが、その最適な抽出温度は２１０〜２２０℃である。亜臨界水による抽出機構は未だ解明されていないが、上記の場合も含めて殆どが２００℃以上の比較的高温にすることを教示していることから、２００℃未満のかなり低温が最適な抽出温度であったことは予測外であった。
【００１９】
次に、「抽出時間」は、５分以内である。それより長いとポリメトキシフラボノイドの分解が急速に始まるからである。ここで、「抽出時間」とは、亜臨界水を上記した「抽出温度」まで上昇させた後にその温度に保持する時間であり、通常は「抽出温度」は温度制御の目標温度の一点であるから、「抽出時間」は引き続きその目標温度に温度制御している時間となる。
したがって、現在使用できる亜臨界水抽出装置では、抽出温度まで上げるのに２０分程度は掛かるが、その昇温時間は抽出時間に含まれないことになる。抽出時間が０分とは、抽出時間が最も短い場合のことであり、「抽出温度」まで上げた途端に冷却して温度を下げたことを意味する。因みに、冷却は電熱ヒーターをオフにすることで行うが、比較的急速に進み、数分で常温に戻る。
【００２０】
次に、「抽出圧力」は、３〜１０ＭＰａにするのが好ましい。ここで、「抽出圧力」とは、測定の便宜上、窒素ボンベから窒素ガスを供給して容器内を置換したときの初期設定圧力のことであり、水が亜臨界領域まで上げると、それから３ＭＰａ程度は上がるものと思われる。
【００２１】
上記の最適な抽出条件での亜臨界水による抽出処理を行うと、水中にポリメトキシフラボノイドが抽出する。溶媒として水を使用しているので、当然ながら脂肪分は抽出されない。
その後、酢酸エチルやジエチルエーテルで再度抽出すると、それらの有機溶媒に可溶なものが溶媒中に抽出することになる。水相と有機溶媒相の二相に綺麗に分離する。ノビレチンは有機溶媒相に抽出するので、この段階で更に精製度が高まることになる。
したがって、結果として、従来のエタノールを使用した場合より、ポリメトキシフラボノイドを高い精製度で回収でき、しかも収率を高くできる。
【実施例１】
【００２２】
温州みかんの果皮１ｇと水２００ｍＬを上記の市販の亜臨界抽出装置の容器に入れ攪拌してから、抽出条件を変えて抽出処理を行い、それぞれの抽出物をろ紙でろ過した後、ＨＰＬＣで定量して、ノビレチンの抽出量を比較した。
【００２３】
（抽出温度、抽出時間）
図１、図２、図３の結果から、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃の抽出温度と、５分以内の抽出時間の抽出条件下で行うことにより、有意量のノビレチンを抽出できることが確認された。
【００２４】
（抽出圧力）
抽出圧力に関しては、さらに上限側では抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：９ＭＰａと１０ＭＰａのそれぞれの抽出条件で抽出処理を行い、ノビレチンの抽出量を比較したところ、図４に示すように、２つの圧力条件の違いによる差は見られなかったことから１０ＭＰａまでは広げられることが確認された。
一方、下限側では、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：０．１ＭＰａ（常圧相当）と３ＭＰａのそれぞれの抽出条件で抽出処理を行い、ノビレチンの抽出量を比較したところ、図５（ａ）に示すように、２つの圧力条件の違いによる差は見られなかった。しかしながら、図５（ｂ）に示すように、０．１ＭＰａの条件では容器内温度が１８０℃に達するまでの時間が３ＭＰａ以上の条件に比べて２倍以上長くかかった。
【００２５】
そこで３ＭＰａの条件で抽出処理を行い、容器内温度が１８０℃に達する時間を調べ、それと同時間今度は常圧の条件で抽出処理を行ったところ、図６（ａ）に示すように、容器内温度は１６分４３秒の時点で３ＭＰａの条件では１８０℃に達し、常圧の条件ではその時点では未だ１５１℃であった。両者のノビレチンの抽出量を比較したところ、図６（ｂ）で示すように、３ＭＰａの条件の方が多かった。
以上の結果は、亜臨界水抽出処理を行う際、一定の圧力を加えた方が、１８０℃に達する時間が短いこと、さらに同じ時間条件では温度効果により抽出効率が高まることが確認された。
【実施例２】
【００２６】
温州みかんの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）と、その他の攪拌抽出処理（水、エタノール、またはヘキサン：２００ｍＬ、抽出時間：３０分、抽出圧力：常圧）とを行い、それぞれの抽出物をろ紙でろ過した後、抽出物全量とノビレチンの抽出量をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図７に示すように、抽出物全量とノビレチンの抽出量のどちらにおいても、亜臨界水抽出処理を行った場合が最大であった。
さらに、エタノール抽出処理と亜臨界水抽出処理による抽出物に等量のジエチルエーテルを加え、エーテル相を回収した。この抽出を３回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮し、ＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図８に示すように、エーテル抽出物全量とノビレチンの抽出量のどちらにおいても、亜臨界水抽出処理を行った方がより多かった。
以上の結果から、抽出物の全体重量、ジエチルエーテルで抽出されるエーテル抽出物の全量、ノビレチンの抽出量のすべての項目において、亜臨界水抽出処理を行った方がエタノール抽出処理を行った場合よりも大きいことが確認された。
したがって、亜臨界水抽出処理は、目的物質の種類の選択性より、抽出効率の増大、すなわち高い精製度での目的物質の回収により効果があると考えられる。
【実施例３】
【００２７】
温州みかんの絞りカス１０ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、さらに酢酸エチル、ジエチルエーテル、ヘキサンの各種溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーにより分液し、各種溶媒相をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図９に示すように、酢酸エチルとジエチルエーテルを用いた分液ではそれぞれの有機溶媒相にノビレチンがほぼ全量抽出、すなわち回収された。
以上の結果から、分液するときには使用できる溶媒と使用できない溶媒とが有ることが確認された。
【実施例４】
【００２８】
温州みかんの果皮１ｇ、摘果みかんの果皮１ｇ、シークワーサーの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、それぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図１０に示すように、シークワーサーからのノビレチンの抽出量が突出して多かった。
【実施例５】
【００２９】
すだちの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。得られた抽出物をＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析にかけたところ、図１１に示す結果が得られ、質量とＵＶスペクトルから１１．６分のピークをスダチチンと推定した。
さらに、この抽出物を、図１２に示すように、粗分画して、ＭｅＯＨ画分を回収し、濃縮乾固してスペクトルを確認したところ、ＭｅＯＨ画分に目的のピークが含まれていたことが確認された。
【実施例６】
【００３０】
すだちの果皮１２．４１ｇと１３．４５ｇのそれぞれに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。その後、酢酸エチル４００ｍＬを加え分液した後、エーテル相に水を加え、エーテル相を回収した。このエーテル相回収は２回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮乾固したところ、得られた抽出物は１．０２ｇであった。
その抽出物を、カラムクロマトグラフィーにて以下の条件で分析したところ、得られた抽出物は５５．８ｍｇであった。
カラム ： Shiseido Capcell Pak UG-120 C18
(20×250mm)
移動相 ： 50% MeOH
流速 ： 9mL/min
検出 ： UV343nm
さらに、分取ＨＰＬＣにて以下の条件で分取したところ、得られた抽出物は６．０８ｍｇであった。
カラム ： Shiseido Capcell Pak UG-120 C18
(20×250mm)
移動相 ： 30% MeCN（0.1% TFA）
流速 ： 8mL/min
検出 ： UV343nm
この精製物をＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析にかけたところ、図１３に示すように、精製物の質量とＵＶスペクトルは文献値と一致した。また、ＮＭＲ解析をしたところ、図１４に示すように、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られ、その各シグナルを帰属した結果、文献値と一致した。
従って、スダチチンが６．０８ｍｇ抽出できたことが確認された。
すだちの果皮１ｇ当たりに換算すると、約２３５μｇであり、抽出率をノビレチンと比較すると５倍以上多くなっている。
【実施例７】
【００３１】
すだちの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、さらに等量の酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィーにより分液し、各相をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図１５に示すように、エーテル相にスダチチンがほぼ全量抽出、すなわち回収されたことが確認された。
【実施例８】
【００３２】
温州みかんの果皮２０．２２ｇと３３．５０ｇのそれぞれに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。その後、ジエチルエーテル２００ｍＬを加え分液した後、エーテル相に水を加え、エーテル相を回収した。このエーテル相回収は２回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮乾固したところ、得られた抽出物は２５６．１ｍｇであった。
その抽出物を、順相系充填剤（シリカゲル60）をカラム(25×450mm)に充填したカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン：酢酸エチル（３：７）を展開溶媒として分画した。なお、抽出物は展開溶媒と同一組成の溶液に溶解した上で使用した。
画分（各４ｍＬずつ）1〜52が得られ、各画分を薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、画分35〜43にノビレチンが含まれると考えられたため回収し、５．０２ｍｇの精製物が得られた。
ＨＰＬＣを用いた標品との一致により、得られた精製物はノビレチンであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の方法を、柑橘類からのノビレチンやスダチチンの回収に利用すれば、商用ベースでの試薬の製造を可能とするので、ノビレチンの効用の確認に大いに資するものと考える。
代表的な食用柑橘類であるみかん等は、現在生産過剰な場合には未利用で廃棄されたり、ジュース加工工場から搾りカスもその後は廃棄されたりしているが、本発明の利用により、これらの有効活用への途を開くものと期待される。
また、ノビレチンやスダチチンは亜臨界水抽出処理により効率良く抽出でき、さらに容易に単離精製できるので、ノビレチンを大量生産するための有効な手段となるものと思われる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法に係り、特に亜臨界水による抽出作用を利用した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノビレチン（Nobiletin）はミカン等の柑橘類の果皮で含まれるポリメトキシフラボノイドの一種であって以下の化学式に示す構成を有しており、発ガン抑制作用やアルツハイマー型認知症の予防効果が期待されている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
したがって、今後はノビレチンを試薬として使用して動物実験を行い、その効能を客観的に証明した上で、臨床利用への途を開くことが求められている。
ノビレチンの回収方法としては、特許文献１でも教示されているように柑橘類からエタノールを溶媒として使用して抽出することが提案されているが、この方法では脂溶分も一緒に抽出されてしまうので、その後さらに別の有機溶媒で抽出して精製しようとしても純度を高くすることは難しい。而して、試薬は純度が高くないと、その効用を信頼性高く証明したことにはならない。
また、エタノール抽出の場合には抽出時間がかなり長くなってしまうことから、その時間の短縮化も急務の課題となっている。
【０００５】
また、スダチチン（Sudachitin）はスダチ等の柑橘類の果皮で含まれる、やはりポリメトキシフラボノイドの一種であって以下の化学式に示す構成を有しており、ノビレチンの前駆体である。
【０００６】
【化２】
【０００７】
スダチチンの全ての水酸基をメトキシ化してノビレチンに化学変換することが可能と考えられており、スダチチンの抽出は、ノビレチンを生産するための有効な手段と期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１４５８２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した課題を解決するものであり、柑橘類からポリメトキシフラボノイドを比較的高い精製度でしかも比較的短時間で回収できる、新規且つ有用な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、試行錯誤の結果、ポリメトキシフラボノイドは典型的な脂溶性物質ながら、最適条件下での亜臨界水との接触により、水中に抽出させることができることを見出し、それに基づいて一つの回収方法を提案するに至った。
すなわち、本発明のポリメトキシフラボノイドの回収方法は、最適条件下の亜臨界水に柑橘類を接触させることで抽出作用を利用してポリメトキシフラボノイドを回収することを特徴とするものである。
【００１１】
出発原料となる柑橘類としては、みかん、イヨカン、ハッサク、ネーブルオレンジ、シークワーサー、スダチ等が挙げられる。また、本発明における果皮とは、未使用のものだけでなく、ジュース用等に絞った後の搾りカスでもよい。そのため、本発明の方法によれば、生産過剰の果皮を利用できるだけでなく、ジュース加工工場から出される絞りカスも廃棄物とせずに有効活用できる。
【００１２】
亜臨界水の最適条件は、温度が最も重要になっており、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃である。この温度の亜臨界水に柑橘類を接触させて亜臨界水中にノビレチンやスダチチンといったポリメトキシフラボノイドを抽出させる。但し、１８０℃の条件で５分を超えると急速にポリメトキシフラボノイドが分解されていくことが確認されているので、上記した亜臨界水に接触させる時間は安全率を見込んで５分以内とすることを推奨する。
なお、抽出後の亜臨界水抽出液からは有機溶媒を溶離液として、カラムクロマトグラフィーによりポリメトキシフラボノイドを単離精製できる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、柑橘類からポリメトキシフラボノイドを水中に抽出することができるのでその時点で脂肪分と分離でき、さらにその後有機溶媒を利用して分液したときに、ポリメトキシフラボノイドを含むその有機溶媒に可溶のものだけ有機溶媒相に抽出することになるので、結果的にポリメトキシフラボノイドを単離精製することができる。しかも、亜臨界水抽出方法によるため、その抽出時間も従来のエタノールを利用した抽出方法による場合に比べて著しく短時間で済む。
また、亜臨界水を利用した抽出装置は比較的単純な構成で設計されており、且つ使用溶媒は安価な水である。
従って、本発明の方法によれば、結果的にノビレチンについて商用ベースへの試薬の製造を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出温度の影響を示すグラフである。
【図２】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出時間の影響を示すグラフである。
【図３】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力の影響を示すグラフである。
【図４】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力(上限側)の影響を示すグラフである。
【図５】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力（下限側）の影響を示すグラフである。
【図６】実施例１における、ノビレチンの抽出量に及ぼす抽出圧力（下限側）の影響を示すグラフである。
【図７】実施例２における、各種溶媒による抽出処理によるノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図８】実施例２における、エーテル抽出物全量とノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図９】実施例３における、種々の溶媒を使用して更に分液した場合のノビレチンの抽出量を比較して示すグラフである。
【図１０】実施例４における、種々の柑橘類からのノビレチンの抽出量を示すグラフである。
【図１１】実施例５における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示すＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析の結果図である。
【図１２】実施例５における、ＭｅＯＨ画分へのスダチチンの溶出を示す結果図である。
【図１３】実施例６における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示す、ＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析の結果図である。
【図１４】実施例６における、すだちの亜臨界水抽出処理によるスダチチンの抽出を示す、ＮＭＲ解析の結果図である。
【図１５】実施例７における、エーテル相と水相の抽出量を比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
亜臨界水抽出は、実験室レベルでは、市販の亜臨界水抽出装置を使用して行うことができる。
この抽出装置では、電熱ヒーターが密閉耐圧容器に取り付けられており、容器内の温度を上げることで圧力も上げるように構成されている。
本発明では、柑橘類、例えば柑橘類の水洗いした果皮やその搾りカスを含水状態のまま、適度な量の水と共に適当な密閉耐圧容器に入れて密閉し、撹拌しながら、容器内に亜臨界状態を作り出している。
【００１６】
２２ＭＰａ、３７５℃が臨界点であり、この臨界点より低いがそれに近い温度、圧力での状態を亜臨界状態という。上記した密閉耐圧容器内を加熱すると、温度上昇とともに内部圧力も上昇し、容器内の水が上記した亜臨界水となる。亜臨界水の存在領域には有る程度は広さがあるが、その領域のどこでも良いわけではなく、最適範囲から外れればポリメトキシフラボノイドが有意量どころか痕跡量も抽出されない。
従って、以下で亜臨界水を利用したポリメトキシフラボノイドの最適な抽出条件について詳細に説明する。
【００１７】
先ず、「抽出温度」は、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃に設定する。ここで、「抽出温度」とは、亜臨界水の温度制御における目標温度のことである。１８０℃を上限としたのでは、それを超えると急激に抽出量が落ちるからである。１４０〜１８０℃と範囲に幅があるが、通常はその中の一点を温度制御の目標温度に設定する。なお、現在使用できる亜臨界水抽出装置の温度制御の精度限界から、±３℃程度は常時温度変動しており、その範囲で上記した抽出温度と実際の温度との間にズレは生じるが、その程度のズレは誤差範囲内であり、目標温度が上記した「抽出温度」に含まれる限り、本発明の方法を実施したことになる。
【００１８】
亜臨界水を利用した抽出処理は既に幾例が提案されており、本出願人も、特開２００９−２４８０４９号公報において、ヘマトコッカス藻からアスタキサンチンを抽出することを提案しているが、その最適な抽出温度は２１０〜２２０℃である。亜臨界水による抽出機構は未だ解明されていないが、上記の場合も含めて殆どが２００℃以上の比較的高温にすることを教示していることから、２００℃未満のかなり低温が最適な抽出温度であったことは予測外であった。
【００１９】
次に、「抽出時間」は、５分以内である。それより長いとポリメトキシフラボノイドの分解が急速に始まるからである。ここで、「抽出時間」とは、亜臨界水を上記した「抽出温度」まで上昇させた後にその温度に保持する時間であり、通常は「抽出温度」は温度制御の目標温度の一点であるから、「抽出時間」は引き続きその目標温度に温度制御している時間となる。
したがって、現在使用できる亜臨界水抽出装置では、抽出温度まで上げるのに２０分程度は掛かるが、その昇温時間は抽出時間に含まれないことになる。抽出時間が０分とは、抽出時間が最も短い場合のことであり、「抽出温度」まで上げた途端に冷却して温度を下げたことを意味する。因みに、冷却は電熱ヒーターをオフにすることで行うが、比較的急速に進み、数分で常温に戻る。
【００２０】
次に、「抽出圧力」は、３〜１０ＭＰａにするのが好ましい。ここで、「抽出圧力」とは、測定の便宜上、窒素ボンベから窒素ガスを供給して容器内を置換したときの初期設定圧力のことであり、水が亜臨界領域まで上げると、それから３ＭＰａ程度は上がるものと思われる。
【００２１】
上記の最適な抽出条件での亜臨界水による抽出処理を行うと、水中にポリメトキシフラボノイドが抽出する。溶媒として水を使用しているので、当然ながら脂肪分は抽出されない。
その後、酢酸エチルやジエチルエーテルで再度抽出すると、それらの有機溶媒に可溶なものが溶媒中に抽出することになる。水相と有機溶媒相の二相に綺麗に分離する。ノビレチンは有機溶媒相に抽出するので、この段階で更に精製度が高まることになる。
したがって、結果として、従来のエタノールを使用した場合より、ポリメトキシフラボノイドを高い精製度で回収でき、しかも収率を高くできる。
【実施例１】
【００２２】
温州みかんの果皮１ｇと水２００ｍＬを上記の市販の亜臨界抽出装置の容器に入れ攪拌してから、抽出条件を変えて抽出処理を行い、それぞれの抽出物をろ紙でろ過した後、ＨＰＬＣで定量して、ノビレチンの抽出量を比較した。
【００２３】
（抽出温度、抽出時間）
図１、図２、図３の結果から、１４０〜１８０℃、好ましくは１８０℃の抽出温度と、５分以内の抽出時間の抽出条件下で行うことにより、有意量のノビレチンを抽出できることが確認された。
【００２４】
（抽出圧力）
抽出圧力に関しては、さらに上限側では抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：９ＭＰａと１０ＭＰａのそれぞれの抽出条件で抽出処理を行い、ノビレチンの抽出量を比較したところ、図４に示すように、２つの圧力条件の違いによる差は見られなかったことから１０ＭＰａまでは広げられることが確認された。
一方、下限側では、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：０．１ＭＰａ（常圧相当）と３ＭＰａのそれぞれの抽出条件で抽出処理を行い、ノビレチンの抽出量を比較したところ、図５（ａ）に示すように、２つの圧力条件の違いによる差は見られなかった。しかしながら、図５（ｂ）に示すように、０．１ＭＰａの条件では容器内温度が１８０℃に達するまでの時間が３ＭＰａ以上の条件に比べて２倍以上長くかかった。
【００２５】
そこで３ＭＰａの条件で抽出処理を行い、容器内温度が１８０℃に達する時間を調べ、それと同時間今度は常圧の条件で抽出処理を行ったところ、図６（ａ）に示すように、容器内温度は１６分４３秒の時点で３ＭＰａの条件では１８０℃に達し、常圧の条件ではその時点では未だ１５１℃であった。両者のノビレチンの抽出量を比較したところ、図６（ｂ）で示すように、３ＭＰａの条件の方が多かった。
以上の結果は、亜臨界水抽出処理を行う際、一定の圧力を加えた方が、１８０℃に達する時間が短いこと、さらに同じ時間条件では温度効果により抽出効率が高まることが確認された。
【実施例２】
【００２６】
温州みかんの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）と、その他の攪拌抽出処理（水、エタノール、またはヘキサン：２００ｍＬ、抽出時間：３０分、抽出圧力：常圧）とを行い、それぞれの抽出物をろ紙でろ過した後、抽出物全量とノビレチンの抽出量をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図７に示すように、抽出物全量とノビレチンの抽出量のどちらにおいても、亜臨界水抽出処理を行った場合が最大であった。
さらに、エタノール抽出処理と亜臨界水抽出処理による抽出物に等量のジエチルエーテルを加え、エーテル相を回収した。この抽出を３回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮し、ＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図８に示すように、エーテル抽出物全量とノビレチンの抽出量のどちらにおいても、亜臨界水抽出処理を行った方がより多かった。
以上の結果から、抽出物の全体重量、ジエチルエーテルで抽出されるエーテル抽出物の全量、ノビレチンの抽出量のすべての項目において、亜臨界水抽出処理を行った方がエタノール抽出処理を行った場合よりも大きいことが確認された。
したがって、亜臨界水抽出処理は、目的物質の種類の選択性より、抽出効率の増大、すなわち高い精製度での目的物質の回収により効果があると考えられる。
【実施例３】
【００２７】
温州みかんの絞りカス１０ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、さらに酢酸エチル、ジエチルエーテル、ヘキサンの各種溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーにより分液し、各種溶媒相をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図９に示すように、酢酸エチルとジエチルエーテルを用いた分液ではそれぞれの有機溶媒相にノビレチンがほぼ全量抽出、すなわち回収された。
以上の結果から、分液するときには使用できる溶媒と使用できない溶媒とが有ることが確認された。
【実施例４】
【００２８】
温州みかんの果皮１ｇ、摘果みかんの果皮１ｇ、シークワーサーの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、それぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図１０に示すように、シークワーサーからのノビレチンの抽出量が突出して多かった。
【実施例５】
【００２９】
すだちの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。得られた抽出物をＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析にかけたところ、図１１に示す結果が得られ、質量とＵＶスペクトルから１１．６分のピークをスダチチンと推定した。
さらに、この抽出物を、図１２に示すように、粗分画して、ＭｅＯＨ画分を回収し、濃縮乾固してスペクトルを確認したところ、ＭｅＯＨ画分に目的のピークが含まれていたことが確認された。
【実施例６】
【００３０】
すだちの果皮１２．４１ｇと１３．４５ｇのそれぞれに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。その後、酢酸エチル４００ｍＬを加え分液した後、エーテル相に水を加え、エーテル相を回収した。このエーテル相回収は２回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮乾固したところ、得られた抽出物は１．０２ｇであった。
その抽出物を、カラムクロマトグラフィーにて以下の条件で分析したところ、得られた抽出物は５５．８ｍｇであった。
カラム ： Shiseido Capcell Pak UG-120 C18
(20×250mm)
移動相 ： 50% MeOH
流速 ： 9mL/min
検出 ： UV343nm
さらに、分取ＨＰＬＣにて以下の条件で分取したところ、得られた抽出物は６．０８ｍｇであった。
カラム ： Shiseido Capcell Pak UG-120 C18
(20×250mm)
移動相 ： 30% MeCN（0.1% TFA）
流速 ： 8mL/min
検出 ： UV343nm
この精製物をＵＰＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析にかけたところ、図１３に示すように、精製物の質量とＵＶスペクトルは文献値と一致した。また、ＮＭＲ解析をしたところ、図１４に示すように、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られ、その各シグナルを帰属した結果、文献値と一致した。
従って、スダチチンが６．０８ｍｇ抽出できたことが確認された。
すだちの果皮１ｇ当たりに換算すると、約２３５μｇであり、抽出率をノビレチンと比較すると５倍以上多くなっている。
【実施例７】
【００３１】
すだちの果皮１ｇに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行い、ろ紙でろ過した後、さらに等量の酢酸エチルを用いてカラムクロマトグラフィーにより分液し、各相をそれぞれＨＰＬＣで定量して比較した。その結果は、図１５に示すように、エーテル相にスダチチンがほぼ全量抽出、すなわち回収されたことが確認された。
【実施例８】
【００３２】
温州みかんの果皮２０．２２ｇと３３．５０ｇのそれぞれに対して、実施例１の亜臨界水抽出処理（水：２００ｍＬ、抽出温度：１８０℃、抽出時間：０分、抽出圧力：３ＭＰａ）を行った後、ろ紙でろ過を行った。その後、ジエチルエーテル２００ｍＬを加え分液した後、エーテル相に水を加え、エーテル相を回収した。このエーテル相回収は２回行い、回収したエーテル相をすべてあわせて濃縮乾固したところ、得られた抽出物は２５６．１ｍｇであった。
その抽出物を、順相系充填剤（シリカゲル60）をカラム(25×450mm)に充填したカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン：酢酸エチル（３：７）を展開溶媒として分画した。なお、抽出物は展開溶媒と同一組成の溶液に溶解した上で使用した。
画分（各４ｍＬずつ）1〜52が得られ、各画分を薄膜クロマトグラフィーにより分析したところ、画分35〜43にノビレチンが含まれると考えられたため回収し、５．０２ｍｇの精製物が得られた。
ＨＰＬＣを用いた標品との一致により、得られた精製物はノビレチンであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の方法を、柑橘類からのノビレチンやスダチチンの回収に利用すれば、商用ベースでの試薬の製造を可能とするので、ノビレチンの効用の確認に大いに資するものと考える。
代表的な食用柑橘類であるみかん等は、現在生産過剰な場合には未利用で廃棄されたり、ジュース加工工場から搾りカスもその後は廃棄されたりしているが、本発明の利用により、これらの有効活用への途を開くものと期待される。
また、ノビレチンやスダチチンは亜臨界水抽出処理により効率良く抽出でき、さらに容易に単離精製できるので、ノビレチンを大量生産するための有効な手段となるものと思われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法であって、１４０〜１８０℃の亜臨界水に５分以下の抽出時間で前記果皮を接触させることで前記亜臨界水中にポリメトキシフラボノイドを抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項２】
請求項１に記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、１８０℃の亜臨界水に前記果皮を接触させることで抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、３〜１０ＭＰａの抽出圧力下の亜臨界水に前記果皮を接触させることで抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、ノビレチンまたはスダチチンを抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、亜臨界水抽出液から有機溶媒を溶離液として、カラムクロマトグラフィーにより単離精製することを特徴とするポリメトキシフラボノイドの回収方法。
【請求項１】
柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法であって、１４０〜１８０℃の亜臨界水に５分以下の抽出時間で前記果皮を接触させることで前記亜臨界水中にポリメトキシフラボノイドを抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項２】
請求項１に記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、１８０℃の亜臨界水に前記果皮を接触させることで抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、３〜１０ＭＰａの抽出圧力下の亜臨界水に前記果皮を接触させることで抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、ノビレチンまたはスダチチンを抽出することを特徴とする回収方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載した柑橘類の果皮からのポリメトキシフラボノイドの回収方法において、亜臨界水抽出液から有機溶媒を溶離液として、カラムクロマトグラフィーにより単離精製することを特徴とするポリメトキシフラボノイドの回収方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１５３０８４（Ｐ２０１１−１５３０８４Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４２１３（Ｐ２０１０−１４２１３）
【出願日】平成２２年１月２６日（２０１０．１．２６）
【出願人】（３１００１９５９０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２６日（２０１０．１．２６）
【出願人】（３１００１９５９０）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]