核酸と直接的または間接的に会合するタンパク質因子の単離
標的核酸配列と会合するポリペプチドおよびポリペプチド複合体を単離する方法が提供される。本方法は、標的核酸配列ならびに該標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドもしくはタンパク質を含むサンプルを入手するステップと、該サンプルと、該標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的でハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとを接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つの親和性標識（例えば、ビオチン）をさらに含むステップと、該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび該標的核酸配列がプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、該少なくとも１つの親和性標識へ結合する（例えば、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して）分子によって該プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって該プローブ−標的ハイブリッドを該サンプルから単離するステップと、該標的核酸配列と会合している該１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップとを含む。本スクリーニング法において使用するためのプローブ（例えば、長いスペーサーを備える）もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列、特にゲノムＤＮＡおよびクロマチンと会合するタンパク質およびポリペプチド因子についてのアッセイに関する。さらに、本アッセイにより同定された新規なクロマチン会合因子が提供される。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクス（後成学）は、細胞もしくは多細胞生物からその子孫への情報の伝播であって、その情報が遺伝子のヌクレオチド配列内でコード化されない伝播に関する。後成学的メカニズムは、ＤＮＡの化学修飾を通して、またはＤＮＡと会合しているタンパク質およびポリペプチドへの翻訳後修飾を通して機能することができる。
【０００３】
真核細胞のゲノム内では、ＤＮＡは、遺伝子発現の調整、ＤＮＡのパッケージングおよび複製の制御を支援するタンパク質複合体と会合している。ゲノムと会合している無数のタンパク質は、大多数の真核細胞の核内に存在する、クロマチンと命名されている核物質に関与する。細胞周期における相違する時点には、ゲノムＤＮＡのパッケージング（または凝縮）のレベルは、例えばＤＮＡの複製中（Ｓ期）などの低パッケージ化状態とゲノムが染色体内にパッケージ化される細胞分割中（Ｍ期）などの高凝縮状態とで相違する可能性がある。高度に発現した遺伝子もまた低パッケージング状態（いわゆる真正染色質状態）で存在する傾向があるが、他方不活性化された遺伝子は高パッケージング状態（いわゆる異質染色質状態）で存在する。凝縮、凝縮状態の維持、およびヘテロクロマチン（異質染色質）からユークロマチン（真正染色質）への移行の相対状態は、ほとんどが複数の特殊タンパク質およびポリペプチド複合体によって媒介されると考えられている。
【０００４】
基礎レベルでは、クロマチンの大多数の「オープン」形もしくは真正染色質形は、一緒にヌクレオソームを形成する１オクテットのヒストンタンパク質が巻き付けられている短い区間のゲノムＤＮＡを含んでいる。ヌクレオソームは、一列に配列されて数珠玉（ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）構造を形成している。隣接ヌクレオソーム間の相互作用は、より高度に規則的なクロマチン構造の形成を可能にする。ヒストンの翻訳後修飾を触媒する酵素、または物理的に相互作用してこれらのヒストンを一緒に固定することに役立つ構造的タンパク質によって媒介され得るのは、これらの相互作用である。
【０００５】
クロマチンの組織化および安定性への後成的制御は、細胞が正常かつ健常に機能するために不可欠である。異常な後成的修飾およびクロマチン安定性の低下は、老化細胞、アポトーシス細胞もしくは罹患細胞、特にがん細胞において見られることが多い。後成的活性を示すことのできる多数のタンパク質およびポリペプチド、ならびにクロマチンおよびクロマチン会合タンパク質と相互作用できる因子を同定して特性付けることは相当に重要である。さらにまた、特にクロマチン生物学を全体としてより明確に理解することを促進するために、新規なクロマチン会合因子を同定して特性付けることには極めて重要な価値がある。
【０００６】
従来法では、クロマチンに会合したタンパク質の単離は、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）を実施することによって達成されてきた。典型的なＣｈＩＰアッセイでは、クロマチン結合タンパク質は、インビボ（生体内）でホルムアルデヒドを用いてＤＮＡへ架橋結合させられる。その後クロマチンは、小さなフラグメントにせん断され、精製される。精製されたクロマチンフラグメントは、免疫沈降法によって複合体を単離できるように、公知の標的クロマチン結合タンパク質に特異的である抗体を用いて精査される。沈降したクロマチンは、それによって配列分析のためにＤＮＡを遊離させるように、架橋結合を逆転させるために処理される。架橋結合によってプルダウン（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）された付随的会合タンパク質を調査することは可能であるが、この方法は１つのゲノム領域には限定されず、このためには最適化されていない。ＣｈＩＰを実施するためのプロトコールは、Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６）１：１７９−１８５）およびＣｒａｎｅ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．（１９９９）３０４：５３３−５４７）に開示されている。
【０００７】
ＣｈＩＰに基づく技術に関する重要な欠点は、所与の配列については、その配列に会合した少なくとも１つの特定タンパク質が既知でなければならないことである。したがって、規定の標的核酸配列と直接的または間接的に会合するタンパク質因子を単離する方法が必要とされる。実質的に、抗原によって駆動されるのではなく核酸配列によって駆動されるクロマチン会合タンパク質またはポリペプチドを単離する方法が必要である。さらに、ＣｈＩＰでは、免疫沈降の欠如は必ずしも被験因子の欠如を反映する訳ではないので、この技術を用いた場合には常に偽陰性の結果が生じる危険性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、当分野におけるこれらの欠点を、所与の標的核酸配列と直接的または間接的に会合するタンパク質因子を単離するための新規な方法を提供することによって克服する。詳細には、本発明の方法は、新規なクロマチン結合タンパク質およびポリペプチドを単離することに関する上述の問題を克服する。
【０００９】
本発明の第１態様では、標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するための方法であって、
（ａ）標的核酸配列と、該標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
（ｂ）該サンプルと、該標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的でありハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとを接触させるステップと、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つの親和性標識をさらに含み、
（ｃ）該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと該標的核酸配列とがプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）該少なくとも１つの親和性標識に対して結合する分子を介して該プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、該プローブ−標的ハイブリッドを該サンプルから単離するステップと、
（ｅ）該標的核酸配列と会合している該１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
核酸配列は他の遺伝子座から特異的クロマチン遺伝子座を識別する普遍的手段を提供するものであるので、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアプローチを精製戦略のための基礎として利用してきた。よって、クロマチンに適用された場合は、本方法は、特異的クロマチン領域の単離およびそれらの遺伝子座に結合したタンパク質のその後の同定を可能にする。重要なタンパク質−タンパク質およびタンパク質−核酸相互作用が精製手順中に維持されるため、本発明者らは、完全クロマチンのプロテオミクス（ＰＩＣｈ）としてのクロマチンとともに使用するために適用した場合の本発明の極めて広汎な態様について言及してきている。
【００１１】
典型的に、標的核酸配列は、真核または原核細胞核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）を含んでいる。適切には、真核細胞ＤＮＡは哺乳動物ＤＮＡであり、場合により標的核酸配列はクロマチン内に含まれている。後者の場合には、有益にも、本発明の方法は、個別に、または多因子複合体の一部として、ＤＮＡと会合しているポリペプチドを単離することができる。
【００１２】
本発明の方法の特定の実施形態では、標的核酸配列と会合している該１つ以上のポリペプチドは、該１つ以上のポリペプチドの架橋結合を生じさせる条件に曝される。この架橋ステップは、オリゴヌクレオチドプローブにサンプルを曝露させるステップの前（すなわち、ステップ（ｂ）の前）に行われ、その架橋結合は、該１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップの前（すなわち、ステップ（ｅ）の前）に脱架橋される。場合により、本発明の方法は、該溶出された１つ以上のポリペプチドの同一性を決定するために分析するステップをさらに追加する。分析は、当分野において公知の、任意の数の技術によって行うことができるが、典型的に、高スループットのプロテオミクス分析は質量分析法の構成要素、または抗体マイクロアレイ・スクリーンを含む。
【００１３】
本発明の第２態様は、以下に記載する一般式Ｉ：
【化１】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基ＣによってヌクレオチドＸに連結された１つ以上の親和性標識を含み；Ａはハプテンもしくは免疫タグを含み、ヌクレオチドＸは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する少なくとも１つの基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。適切には、ハプテンは、ビオチンもしくはそのアナログ（例えばデスチオビオチン）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールなどから選択される。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の第１および第２基を含むが、該第１基は第１親和性標識Ａを含み、該第２基は第２親和性標識Ａ’を含み、このときＡおよびＡ’は同一ではない。
【００１４】
本発明の第３態様は、以下に記載する一般式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基Ｃによってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結された親和性標識であり、該オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチド、典型的にはヌクレオチドの少なくとも２５％がロックされた核酸ヌクレオチド、場合によりヌクレオチドの１００％までがロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含む）に一致するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。場合により、該炭素スペーサー基は、オリゴヌクレオチドプローブの５’ヌクレオチドに結合されている。
【００１５】
本発明の第４態様は、以下に記載する一般式ＩＩＩ：
【化３】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、該ヌクレオチドＺおよびＷは、長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは、同一または相違し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。適切には、該親和性標識は、ビオチンもしくはビオチンもしくはそのアナログ（例えばデスチオビオチン）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールなどから選択される。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドＺが該オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表すような一般式ＩＩＩの基を含んでいる。
【００１６】
本発明の第５態様は、真核細胞のゲノム内のクロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）該真核細胞内のクロマチンの該特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
（ｂ）該特異的領域内に局在するＤＮＡ配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
（ｃ）クロマチンの該特異的領域と会合している１つ以上のポリペプチドを単離できるように上述した方法において該オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
（ｄ）クロマチンの該特異的領域と会合するポリペプチドを同定できるように該１つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態では、クロマチンの特異的領域はテロメア、セントロメア、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子間領域、遺伝子、反復配列、異種挿入配列、および統合ウイルスゲノムのうちの１つ以上を含んでいる。典型的には、クロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドは、酵素活性についてさらにスクリーニングされる。適切には、クロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドは、該標的が何らかの形態の酵素活性を示す場合は、前途有望な薬物標的であると同定される。
【００１８】
本発明のまた別の態様は、後成的活性の調節因子についてのスクリーニング法であって、
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の１つ以上の化合物と接触させるステップと、
該単離されたポリペプチドに結合してポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子であると同定するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、該単離されたポリペプチドは、Ｈｉｎｔ２、ＧＭＰシンターゼ、Ｐｒｉ２、Ｆｅｎ１、ＵＳＰ７、ＴＩＦ１−β、Ｐｉｎ−１、ＡｕｒｏｒａキナーゼＢ、ＵＳＰ１およびＭＴＡ１のうちの１つから選択される。これらの特異的標的については、以下でより詳細に記載する。
【００２０】
本発明のまた別の態様は、ポリペプチドの生物活性を特性付ける方法であって、
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
該ポリペプチドについての該核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
該真核細胞内の該ポリペプチドの発現を減少させられるように該アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
該ポリペプチドの該生物活性を決定できるように、該真核細胞の表現型を分析するステップとを含む方法を提供する。
【００２１】
適切には、該アンチセンス核酸配列はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（またはｓｈＲＮＡなどの前駆体）を含むことができる。該真核細胞は、哺乳動物細胞であってよい。適切には、該アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップは、該真核細胞内の該ポリペプチドの発現を減少させるためである。これは、該アンチセンス核酸配列をコードする異種配列を該真核細胞のゲノム内へ挿入し、それによって当分野において公知である組換え技術（例えば、遺伝子ターゲティング／相同組換え）によってトランスジェニック細胞を生成することによって達成できる。場合により、真核細胞は、例えば真核幹細胞などの多能性幹細胞である。そのような方法は、「ノックアウト」マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物の産生を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の方法の１つの実施形態の図である。
【図２】２つの相違するタイプのがん細胞間で一般に保持されている、本発明の方法によって同定された新規なテロメアクロマチン会合ポリペプチド因子の比率を示すグラフ表示である。円の中の数は規定細胞タイプにおいて同定された新規なテロメアクロマチン会合ポリペプチド因子の数を示している。
【図３】形質変換されたヒト線維芽細胞系において新規なテロメアクロマチン会合因子であるＣＯＵＰ−ＴＦ２をノックダウンする実験の結果を示す図である。ＰＭＬ抗体（ＰＭＬ）は、細胞内のＰＭＬ体の場所を示している。ＲＡＰ１抗体は、細胞内のテロメアの場所を示している。マージ画像は、テロメア（ＲＡＰ１）がＣＯＵＰ−ＴＦ２ ｓｈＲＮＡの存在下ではＰＭＬ体（ＰＭＬ）の位置を局在化しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で言及した全ての参考文献は、全体として参照して組み込まれる。他に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している意味と同一の意味を有する。本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ）などの標準の参考書において見いだすことのできる、ある範囲の従来型の分子生物学技術の使用を含んでいる。
【００２４】
本発明の詳細な説明を記載するに当たって、本発明の理解に役立つ多数の用語の定義を提供する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、自然に生成されたか、または合成手段によってインビトロ（試験管内）で生成されたかに関わらず、ペプチド結合によって結び付けられたアミノ酸残基のポリマーを意味する。長さがおよそ１２アミノ酸残基未満のポリペプチドは、典型的に「ペプチド」と呼ばれている。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、天然型ポリペプチド、前駆体形もしくは前駆タンパク質の産物を意味する。ポリペプチドは、さらにまたグリコシル化、タンパク質分解性切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化などを含むことができるがそれらに限定されない成熟もしくは翻訳後修飾もまた受ける。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。
【００２６】
本明細書で使用する「ポリペプチド複合体」は、一緒に集合して因子の会合単位を形成するタンパク質およびポリペプチドを説明することが意図されている。ポリペプチド複合体のメンバーは、非共有もしくは共有結合によって相互作用することができる。典型的には、ポリペプチド複合体のメンバーは協働して、ＤＮＡまたは既にＤＮＡと会合もしくは結合しているポリペプチドおよびタンパク質（すなわち、クロマチン）のいずれかへの結合を可能にする。クロマチン会合ポリペプチド複合体は、細胞状態および細胞周期内での位置に依存して、各々がその複合体と永続的に会合できる、または一時的に会合できる他のポリペプチドと相互作用するために機能する複数のタンパク質および／またはポリペプチドを含むことができる。したがって、特定のポリペプチド複合体は、様々な生理学的条件に応答して、または細胞周期の因子として、様々な発達段階でそれらの構成メンバーが変動する可能性がある。例えば、動物では、公知のクロマチンリモデリング活性を備えるポリペプチド複合体には、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ（ポリコーム）群遺伝子サイレンシング複合体ならびにＴｒｉｔｈｏｒａｘ群遺伝子活性化複合体が含まれる。
【００２７】
用語「単離された」は、核酸もしくはポリペプチド配列に適用される場合は、その天然起源生物から取り除かれている配列である。典型的には、単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチド／核酸分子は、それが産生された環境から取り除かれているが、必ずしも精製されている訳ではない。つまり、単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、必ずしも１００％純粋ではなく、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％純粋であってよい。精製されて単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、有益には少なくとも８０％純粋であり、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％純粋（例えば、９９％純粋）である。本発明の状況では、用語「単離された」は、ポリペプチドに適用される場合は、それが天然形、変性形、二量体／多量体形、グリコシル化形、結晶化形、または誘導体化形のいずれであろうと、また別の物理的形態にある同一ポリペプチドを含むことが意図されている。有益には、本発明の核酸分子／ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド（例えば、核酸プローブ、ＲＮＡｉ分子など）、およびポリペプチド／ペプチド（例えば、抗体またはそれらのフラグメント）は単離され、より有益には精製される。
【００２８】
クロマチンは、大多数の真核細胞の核内に存在するゲノムＤＮＡの凝縮構造である。クロマチンはＤＮＡおよび複数のＤＮＡ結合タンパク質ならびに所定のＲＮＡを含んでいる。用語「クロマチン（染色質）」は、この細胞物質が所定の化学染料を用いた染色を維持する容易さ（クロマティシティ）に由来する。クロマチンは主として、塩基性ヌクレオソーム構造を一緒に形成するヒストンタンパク質と会合しているＤＮＡから構成される。ヌクレオソームは、その周囲に長さが１４６ｂｐの一続きの二本鎖ＤＮＡが巻き付けられている１オクテットのヒストンタンパク質を含んでいる。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４はヌクレオソームの一部であるが、ヒストンＨ１は、より高次の構造へ隣接ヌクレオソームと一緒に結合するように作用することができる。より高次の構造への組立ては、ＤＮＡのより大きなパッキング、または凝縮を許容する。クロマチンは、凝縮されていない能動的に転写されたＤＮＡおよび凝縮されたＤＮＡ各々に対応する２つの主要な状態として、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンがみられることがしばしば言及されている。その他の多数のポリペプチドおよびタンパク質複合体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチン状態間の移行を媒介するためにヌクレオソームおよびヒストンと相互作用する。これらの極めて重要なクロマチン会合タンパク質および複合体の多くの同一性および機能的活性は、現時点では未知である。
【００２９】
エピジェネティクス（後成学）は、細胞もしくは多細胞生物からその子孫への情報の伝播であって、その情報が遺伝子のヌクレオチド配列内でコード化されない伝播に関する。後成学的制御は、典型的に、ＤＮＡまたはクロマチン構造の化学修飾によって確立される。遺伝子発現は、一部の場合には、ＤＮＡと会合している、またはＤＮＡに結合することのできるポリペプチドへの化学基の共有結合によって調節することができる。例えば、ヒストン類のメチル化、ＳＵＭＯ化、リン酸化、ユビキチン化および／またはアセチル化は、これらの後成的修飾が発生しているゲノムの領域内での遺伝子発現の活性化または不活性化をもたらすことができる。後成的修飾は、生物の正常発達における様々な時点に、さらにまた正常細胞からがん性細胞への形質変換中にも発生する可能性がある。そのような修飾は、所定の遺伝子の不活性化もしくは活性化を生じさせることが多い。がんでは、腫瘍細胞の大多数が異常なＤＮＡの後成的インプリントを提示することが明確に証明されている（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＡＰ ＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ １（５８９５）：８９−９２）。
【００３０】
本明細書で使用する用語「がん」は、新生物内に所在する、または新生物に関連する特性を備える組織または細胞を意味する。新生物は、典型的に正常組織および正常細胞からそれらを識別する特性を有している。特にそのような特性には、一定の退生、細胞形態の変化、形状の不規則性、細胞付着性の減少、転移する能力、血管形成のレベル上昇、細胞侵襲性の増大、細胞アポトーシスのレベル減少、および細胞悪性度の全般的増加が含まれるがそれらに限定されない。「がん」に関連する、同義であることの多い用語には、肉腫、がん腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、形質転換、新生物などが含まれる。
【００３１】
本発明の１つの実施形態は、特定標的クロマチン部位、遺伝子もしくは一続きの核酸、例えばＤＮＡと会合するタンパク質、ポリペプチドおよびタンパク質複合体を同定するための方法の開発にある。本方法は、プローブ−標的がハイブリダイズした配列の単離を可能にする親和性タグを用いて標識された高特異性核酸プローブを利用する。当該のタンパク質が特異的ゲノム領域に局在するかどうかを決定するために、標準アプローチは、固定された核上で免疫染色法およびＤＮＡ蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（イムノ−ＦＩＳＨ）法を結合してきた。しかし、従来型ＤＮＡ捕捉／ＦＩＳＨプローブおよび標準ＦＩＳＨ試薬を使用して標的クロマチンを回収しようとする以前の試みは、常に極めて低い収率および非特異的タンパク質による高度の汚染に悩まされてきた。本発明の方法は、標的部位に存在する可能性がある、または可能性がないタンパク質のいずれかについての予備知識の必要を伴わずに、規定標的部位での任意および全てのＤＮＡおよび／またはクロマチン会合タンパク質の同定を可能にするという利点を示す。そこで、本発明の方法は、既にＤＮＡに結合している公知のタンパク質抗体標的の存在に依存する、例えばＣｈＩＰなどの免疫沈降法に基づく技術に比して相当に大きな利点をさらに示す。また、まれであるが、抗体が架橋結合した抗原を定量的に沈降させる場合は、ＣｈＩＰは、目的のタンパク質を含有する遺伝子座の混合物以外の単一遺伝子座の精製を許容しない。本発明の方法はさらに、クロマチン／ＤＮＡ会合タンパク質複合体における変化を様々な細胞状態下で同様に監視することもまた可能にする。
【００３２】
図１には本発明の特定の実施形態を概説する。手短には、細胞を固定し、クロマチンを可溶化し、特異的プローブをクロマチンにハイブリダイズさせ、次にハイブリダイズしたクロマチンを磁気ビーズ上で捕捉し、ハイブリッドを溶出させ、タンパク質を同定する。例えばホルムアルデヒドなどの物質を用いた広汎な架橋結合を使用すると、タンパク質−ＤＮＡおよびタンパク質−タンパク質相互作用を維持することができる。抗体抗原親和性に基づく戦略とは相違して、核酸ハイブリダイゼーションはイオン性洗剤の存在に非感受性であるので、汚染を制限するために全体を通してこれらの洗剤の使用を可能にする。プローブ−クロマチン相互作用の安定性を増加させるためには、オリゴヌクレオチドを含有するロックされた核酸（ＬＮＡ）をプローブとして使用するが、これは、ＬＮＡ残基は塩基のスタッキング（積み重ね）に好都合であり、それによってそれらの融点を有意に増加させる変化したバックボーンを有しているためである（Ｖｅｓｔｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３２３３−１３２４１）。クロマチンの固定化後に観察される立体障害（収率にとって有害）を最小限に抑えるために、固定化タグとＬＮＡプローブとの間は極めて長いスペーサー基である。適切なスペーサーには、長鎖脂肪族基が含まれる、またはスペーサーは、例えばＭｏｒｏｃｈｏ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００５）２８８，２２５−２４０）によって記載されたようなメトキシオキサルアミドおよびスクシンイミド前駆体から合成することができる。最後に、非特異的因子の共溶出は、アビジンに対してより弱い親和性を備えるビオチンアナログであり、ビオチンを用いた競合的な穏和な溶出を許容するデスチオビオチンを用いることによって限定される。
【００３３】
本発明のまた別の特定の実施形態では、テロメラーゼ陽性がん細胞およびＡＬＴ（テロメアの選択的伸長）がん細胞タイプにおけるテロメア配列と会合しているタンパク質複合体が本発明の方法によって同定された。テロメア配列中に存在して会合していると予想されるタンパク質およびタンパク質複合体に加えて、驚くべき、そして予想外の数の追加のポリペプチドが同定された。一部のポリペプチドは以前にクロマチンと会合すると予想されていなかった公知のタンパク質を含んでいたが、他の公知のクロマチン会合タンパク質はテロメアに局在すると新規に同定された。そこで本発明は、新規なクロマチン会合活性を備えるポリペプチドの同定および単離をさらに提供する。
【００３４】
したがって、本発明はさらに、クロマチン会合活性を有すると新規に同定される、したがって新規な後成的因子として作用する可能性があるサブセットのポリペプチドを提供することにある。本発明は、また別の後成的因子の同定、および重要にも、公知のポリペプチドにおける新規な後成的活性の同定を促進する。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明は、それによりゲノム内の規定部位でクロマチンと会合しているポリペプチドおよびタンパク質複合体の構成要素を特性付けることのできる方法を提供する。本発明の方法は、単にＤＮＡ結合しているポリペプチドには限定されず、例えばヒストン結合活性を備えるポリペプチドなどの会合したポリペプチドを含むことに留意されたい。
【００３６】
より詳細には、本発明の方法は、親和性標識された核酸プローブ配列が当該のクロマチン標的を含むサンプルの染色体材料の標本に特異的にハイブリダイズする第１ステップを含むことができる。このプローブは、ＤＮＡ内の規定標的配列とハイブリダイズするように設計される。標的配列は、適切には固有の遺伝子配列、反復配列、またはより高次の構造形成における役割を有することが公知の配列を含むことができる。プローブ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列だけが結合されるような濃度およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で導入される。
【００３７】
プローブは、１つ以上の適切な親和性タグで標識される。親和性タグは、免疫タグもしくはハプテンを含むことができる。例えば、プローブ配列内に含有された１つ以上のヌクレオチドは、（ビオチンもしくは例えばデスチオビオチンなどの適切なビオチンアナログのいずれかを用いて）ビオチン化することができる。また別の親和性標識には、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノールもしくはフルオレセイン、ならびに例えばポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＨＡおよびＭｙｃタグなどの抗原性ペプチド「タグ」を含むことができる。当該のサンプル中において高いコピー数で存在する標的配列については、プローブは、典型的には単一タイプの親和性標識しか含まない。例えば生物のゲノム内の単一コピー配列などの低濃度の標的に対しては、場合により本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、１つより多いタイプのタグを含むことができる。例えば、本発明の１つの実施形態では、真核細胞内の単一コピープロモーター領域に向けられたオリゴヌクレオチドプローブは、デスチオビオチンおよびジゴキシゲニンの両方で標識されたＬＮＡヌクレオチドを含んでいる。本発明のプローブ内への１つより多い親和性タグの包含は、低コピー数標的のためのプロセスの感受性を大きく増加させることができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションステップの前に、分解能を増加させ、プローブ−標的配列ハイブリッドの「プルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）」を包含している本方法の次のステップを促進するために、クロマチンは、部分的に酵素的に消化されることができる。または、クロマチンは、例えば超音波処理などの物理的方法によって、もしくは物理的および酵素的アプローチの組み合わせによって断片化することができる。
【００３９】
「プルダウン」ステップは、親和性タグに係合し、ハイブリダイズした配列を単離することを可能にする結合成分の使用によって促進される。ビオチン化プローブ配列の場合には、ハイブリダイズした配列の単離は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロビーズにハイブリダイズした配列を曝露するステップによってインビトロで実行することができる。この方法で、ハイブリダイズした配列はビーズに結合し、単純な微量高速遠心ステップによって溶液から沈降させることができる。または、マイクロビーズが磁場への曝露によってビーズを固定化することを可能にする磁気成分を含むことができる（図１を参照されたい）。また別の単離戦略には、例えばマイクロアレイ支持体もしくはディップスティック（計量棒）などの固体基質上にプローブを含有するＬＮＡの固定化が含まれる。この方法では、「プルダウン」は、表面上の特定領域への局在化によって促進され、これは後に会合したポリペプチドの表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間形質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）において使用するために適するように適切に適応させることができる。
【００４０】
精製された、もしくは「プルダウン」されたハイブリダイズした配列は、標的配列に結合している任意の会合したクロマチンポリペプチド、タンパク質およびポリペプチド複合体と一緒に標的配列にハイブリダイズした親和性標識プローブを含んでいる。これらの会合したクロマチンポリペプチド、タンパク質およびポリペプチド複合体は、プルダウン材料から標準のタンパク質沈降ステップによって単離することができ、そして必要であれば電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー技術（例えば、ＨＰＬＣ）によって分離することができる。
【００４１】
クロマチン会合タンパク質およびポリペプチドは、ペプチド質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）の質量分析法に基づく技術を適切に含む、例えば高スループットポリペプチド同定プロトコールなどによって分析すると、それらの同一性を決定することができる。または、公知のクロマチン会合複合体の組成における質的変化は、当該の複合体の構成メンバーに向けられる抗体アレイ技術を用いて監視することができる。
【００４２】
本発明の方法は、特定タイプのゲノムＤＮＡには限定されないこと、そして会合したタンパク質およびポリペプチドプロファイルを同定するためにゲノム内の実質的にあらゆる標的配列に向けることができることが理解される。さらに、任意の所与の配列については、本方法は発達、細胞周期または細胞の外部刺激への曝露後の様々な時点に使用することができる。したがって、本発明の方法は、特異的標的配列と会合しているタンパク質およびポリペプチドにおける変化の詳細なプロファイリングを監視することを許容できる。さらに、本発明の方法は、新規なＤＮＡおよびクロマチン会合タンパク質およびポリペプチド因子の同定を可能にするが、それらの多くはこれまで後成的活性、ＤＮＡ結合もしくはクロマチン会合活性を有するとは考えられていなかった公知のタンパク質であってよい。遺伝子座に結合したタンパク質の同一性に関する情報を提供することに加えて、本発明は、別個の細胞タイプにおける所与の配列へ結合した豊富なタンパク質の相対レベルに関する情報を提供する。例えば、テロメアについて使用するための本発明の方法を開発する経過において、本発明者らは、ＨｅＬａ−１．２．１１細胞由来のテロメア標本に比較してＨｅＬａ−Ｓ３細胞由来のテロメア標本における方がヒストンの数が少ないことに気付いた。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、ヒトがん細胞中の特定のテロメア反復配列と会合しているタンパク質およびポリペプチドが同定された。脊椎動物では、配列（ＴＴＡＧＧＧ）nは、染色体のテロメア領域（ヒトでは約５〜１５ｋｂ）内で繰り返され、ゲノム全体のおよそ０．０１〜０．０３％を表すことができる。この反復配列は、相対的に高い濃度、したがって核酸プローブを用いてターゲティングすることの相対的容易さのために選択された。核酸プローブはビオチン−アナログ標識ヌクレオチドを含んで、さらに標的テロメア反復配列に対するプローブの特異性を実質的に増加させるように機能したロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドもまた組み込んでいた。複数のタンパク質およびペプチドが、テロメアを損傷から保護すると考えられているタンパク質のｓｈｅｌｔｅｒｉｎ（シェルテリン）ファミリーのメンバーなどの公知の候補を含めて、標的配列と会合していると同定された。公知のテロメア会合タンパク質およびポリペプチドに加えて、以前には染色体のテロメア領域と結合する、もしくは会合することが公知ではなかった驚くべき数のポリペプチドおよびタンパク質が同定された。これらの新規なテロメア会合因子は、今後の研究のための、特に創薬標的として前途有望な標的を表す。表１〜３は、本発明の方法によって同定された新規なテロメア会合クロマチン因子を示している。同定された因子の幾つかは、翻訳後修飾のための標的であることが公知であることを見て取ることができる。
【００４４】
本発明のまた別の実施形態では、低存在度の標的が考察される。例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：ミバエ）では、Ｆａｂ−７領域はＡｂｄｏｍｉｎａｌ−Ｂという名称のホメオティック遺伝子の転写状態の維持に責任を負っている単一コピークロマチンフラグメントを表している。このフラグメントはＰｏｌｙｃｏｍｂ応答エレメントという名称を付けられ、遺伝子のＰｏｌｙｃｏｍｂおよびＴｒｉｔｈｏｒａｘ（トリソラックス）グループの因子を動員する。キイロショウジョウバエにおけるＦａｂ−７部位の機能に関する理解は、高等真核生物における後成的状態の維持を理解するために極めて重要であるが、それは基本的なクロマチン調節は典型的にマウスおよびヒトなどの高等生物において保存されているからである。Ｆａｂ−７に結合する複合体内に含まれるクロマチン会合ポリペプチドおよびタンパク質は、幹細胞療法の有効性を改良するために極めて重要であると考えられ、数種のがんにおいては異常調節される可能性がある。Ｆａｂ−７は、高度に反復性であるテロメアに比較して標的にとってより複雑な配列である。その結果として、Ｆａｂ−７は、重複法もしくは連続法でその領域を被覆するためには数種の別個のプローブの使用を必要とするが、これは標的領域の全長に沿って単一プローブがハイブリダイズできるテロメアとは相違している。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態は、感染したヒトＴ細胞系のゲノム内に統合されているＨＩＶプロモーター（プロウイルスのＬＴＲ内に所在する）を標的とする。このプロモーターの調節に関する理解は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの病因学および分子学的メカニズムを決定する際に極めて重要である。詳細には、プロウイルスはある期間にわたってサイレントのままでいられることは公知であり、感染細胞の保菌者が療法から漏れる理由を理解することが極めて重要であるが、それはそれらの細胞がいわゆる「休眠」ウイルスを含有しているからである。関連する後成的成分およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの領域内でのクロマチンの状態を決定することができれば、疾患のメカニズムに関する詳細な洞察を可能にし、それによりＨＩＶ療法のための新規な候補薬物標的を同定する。本発明は、休眠性または活性の２つの状態をモデリングするヒトＴ細胞系内のＨＩＶ ＬＴＲ領域でのクロマチン組成間の比較を可能にし、これはさらにＨＩＶ／ＡＩＤＳのための新規な薬物療法を設計する際に有用である重要なデータを提供する。
【００４６】
本発明のプローブ核酸配列は、有益にも１つ以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含むことができる。ＬＮＡヌクレオチドは、リボース成分内に２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋を含有する二環式ＲＮＡアナログである。メチレン架橋はリボフラノース環の柔軟性を制限し、この構造を合成Ｃ３−ｅｎｄｏ立体配置内へ「ロック」する。この方法でヌクレオチドの立体配置を変化させることによって、結果として生じるオリゴマー／ポリマープローブは、強化されたハイブリダイゼーション性能および生体内安定性を示す。長さが約１５ヌクレオチド未満であるオリゴマープローブ配列は、適切には１００％までＬＮＡを含むことができる。典型的に、長いプローブ配列は、ＬＮＡおよび従来型ＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレオチドの混合物を含んでいる。ＬＮＡ含有プローブ配列は、ＩＳＨ適用（Ｓｉｌａｈｔｏｒｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １０７：３２−３７）およびＴｏｌｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｌｙ １；３１（１３）：３７５８−３７６２）に記載されたプローブ配列設計のための技術のための特別な適合性を証明した。
【００４７】
本発明の特定の実施形態におけるオリゴヌクレオチドプローブは、以下に記載する一般式Ｉ：
【化４】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基ＣによってヌクレオチドＸに連結された親和性標識を含んでいる）に一致する少なくとも１つの基を含んでいる。典型的には、Ａは、ハプテンを含んでいる。本発明の特定の実施形態では、Ａは、ビオチン、または例えばデスチオビオチン分子などのそのアナログを含んでいる。ヌクレオチドＸは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択することができる。スペーサー基の長さは、ｎが適切には約４０〜約１７０原子、より適切には約７５〜約１３０原子、より典型的に約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子であるような長さである。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、以下に記載する一般式ＩＩ：
【化５】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基Ｃによってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結されている免疫タグもしくはハプテンである）に一致する。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチド、典型的にはヌクレオチドの少なくとも２５％がロックされた核酸ヌクレオチド、場合によりヌクレオチドの１００％までがロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでいる。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが２５ヌクレオチドであり、およそ５０％のＬＮＡおよび５０％のＤＮＡヌクレオチドを含んでいる。スペーサー基Ｃの長さは、ｎが適切には約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子であるような長さである。場合により、スペーサー基はオリゴヌクレオチドＹの５’ヌクレオチドに結合され、５’ヌクレオチドは場合によりロックされた核酸ヌクレオチドである。
【００４９】
本発明のまた別の特定の実施形態は、以下に記載する一般式ＩＩＩ：
【化６】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、該ヌクレオチドＺおよびＷは長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドＺが該オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表すように、一般式ＩＩＩの基を含んでいる。式ＩＩＩの基を含むプローブは、例えば単一コピー数配列などの低発生頻度を有するクロマチン内の配列（例えば、特定遺伝子）をターゲティングするために特に適合する。ヌクレオチドＺとＷとの間の分離は、通例は長さがほぼ０〜４０ヌクレオチド、好ましくは１〜３０ヌクレオチドである介在オリゴヌクレオチド鎖Ｖによって証明される。典型的に、少なくともヌクレオチドＺおよびＷはロックされたリボヌクレオチドである。適切には、スペーサー基ＣおよびＣ’は、長さが同一であっても相違していてもよい。本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、式ＩＩＩの１つ以上の基を含むことができる。
【００５０】
プローブ核酸配列は、例えばゲノムＤＮＡ内で出現する任意の配列に向けることができる。有益にも、本発明は、コーディング配列もしくは非コーディング配列に限定されず、さらにまたゲノムの真正染色質領域とともに使用することにも限定されない。標的配列が例えばテロメア反復配列などの反復配列を含む場合は、プルダウンを実行するためには単一プローブ種で十分であることが多い。固有もしくは低頻度の反復配列が標的とされる場合には、標的遺伝子座の連続する、重複する、もしくは密接して位置する領域へ結合する２つより多いプローブの組合わせを使用することが必要になる場合がある。本発明の使用実施例では、マウス挟動原体ヘテロクロマチンの精製は、標的配列のおよそ２５％までとハイブリダイズする３種のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて達成される。しかし、プルダウン反応を最適化するためには、プローブによってより多くの標的配列がカバーされるほど、収率が大きくなる。
【００５１】
規定標的配列と会合することが見いだされたタンパク質およびポリペプチド因子の同定は、多数の経路を通して達成することができる。典型的には、タンパク質およびポリペプチドは、従来型タンパク質抽出技術によってプローブ−標的配列ハイブリッドから分離される。次にタンパク質／ポリペプチドは、適切には分子量にしたがって大まかに精製される。分離されたタンパク質は、ウエスタンブロッティングを含む、同一性を決定するための数種の方法によって分析できる。しかし、本発明の方法の成果が１つ以上の新規な因子を解明することである場合は、タンパク質同定のための質量分析法に基づく技術が適切に利用される。例えば、タンパク質サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥから抽出することができ、その後に場合により、例えばシステインアミノ酸残基のジスルフィド架橋カルボキシメチル化の減少や、別の化学修飾を受けさせられる。次にタンパク質／ポリペプチドは、例えばトリプシンなどの適切なタンパク質分解酵素を用いて幾つかのフラグメントに切断させられる。タンパク質分解ステップは、典型的に一晩にわたって実施され、次に結果として生じる切断したペプチドはアセトニトリルで抽出され、真空下で乾燥させられる。次にペプチドは、少量の蒸留水中に溶解させられ、これで質量分析法による分析の準備が整う。質量分析法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法による精製されたペプチド切断フラグメントのアリコートについて実施できる。次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦからの成果は、典型的にバイオインフォーマティクスの分析技術を使用してインシリコ（コンピュータ内）で分析され、新規な因子についての配列情報を同定および提供するためにＧｅｎＢａｎｋもしくはＳｗｉｓｓＰｒｏｔなどのオンラインのタンパク質データベースにクエリー（問い合わせ）するために使用される（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．９（１５）：１５４６−５１；ａｎｄ Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ ＆ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：４８７−５１１を参照されたい）。
【００５２】
典型的には、ポリペプチド同定のための質量分析法に基づく技術は、Ｐａｐｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．（１９９３）Ｊｕｎ １；３（６）：３２７−３２）の後にはポリペプチド質量フィンガープリンティング（「ＰＭＦ」）法と呼ばれている。ＰＭＦは、インシリコでペプチドについて生成された理論的ペプチド質量へ構成フラグメントの分子量（ペプチド質量）をマッチさせることによってタンパク質を同定することができる。ＰＭＦの前提は、各ポリペプチドが固有のペプチド質量を各々備える固有セットのペプチドフラグメントを有することである。所与のポリペプチドの同定は、ＰＭＦ配列データベース内に存在する理論的質量へ入手したペプチド質量をマッチさせるステップによって遂行される。ＰＭＦの同定は、その質量が正確に公知である所与のタンパク質から入手した幾つかのペプチドフラグメントが存在する場合に最適化される。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、これらのペプチドフラグメント各々の質量を決定するための特に精度の高い手段を提供する。プロテオミックアプローチを使用すると、質量分析法によって同定されたペプチドおよびタンパク質から構成されるタンパク質複合体の性質を決定することができる（例えば、Ｇｉｎｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００７）Ａｕｇ；８（８）：６４５−５４を参照されたい）。
【００５３】
用語「調節因子」は、標的分子（例えば、遺伝子、酵素など）の活性を変化させる分子（例えば、化学物質／実体）を意味する。活性の変化は、調節因子の非存在下、さもなければ類似の条件下では活性の正常もしくはベースラインレベルに比例し、正常／ベースライン活性の増加または減少を表す場合がある。調節因子は、例えば低分子薬、抗体もしくは核酸などの本明細書で記載する任意の分子であってよい。本発明の状況では、標的は、本発明のスクリーニング法によって同定されている新規なクロマチン会合因子である。クロマチン会合因子の調節は、当業者には公知の任意の手段によって、例えば、クロマチン会合因子によって調節される遺伝子の発現における変化を同定するステップによって評価することができる。
【００５４】
本発明は、本発明の方法によって同定された１つ以上の新規なクロマチン会合因子の修飾された発現に関連する疾患を治療するための方法および組成物にさらに関する。
【００５５】
規定のクロマチン会合因子の発現および／または生物活性を阻害するための試薬には、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡ（もしくはｓｈＲＮＡ）、リボザイム、低分子、および抗体またはそれらの抗原結合部分が含まれるがそれらに限定されない。核酸をベースとする技術を調査するためには、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．（２００３）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−１６４４を参照されたい。クロマチン会合因子を阻害するための試薬は、発現および／または生物活性へ、例えば遺伝子発現に影響を及ぼす、または新規なクロマチン会合因子の生物活性を修飾もしくは阻害する因子に作用することによって、間接的に影響を及ぼすことができる。有益にも、本明細書で同定される新規なクロマチン会合因子の１つの阻害剤として使用するための試薬は、クロマチン会合因子に直接的に作用して、ｍＲＮＡレベル（例えば転写もしくはｍＲＮＡ安定性）、またはタンパク質レベル（例えば、翻訳もしくは生物活性）での遺伝子発現に影響を及ぼす。
【００５６】
所与のｍＲＮＡと相補的であり、インビボでハイブリダイズするアンチセンス核酸配列を設計することができる。アンチセンス核酸配列は、規定のクロマチン会合因子のためのｍＲＮＡの配列の全部もしくは一部へハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の形態にあってよい。典型的には、アンチセンス分子は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであり、選択された標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば１２、１５、１８、２０、３０、４０、５０、１００、２００ヌクレオチド以上などの任意の合理的長さであってく、有益にもその対応する標的ヌクレオチド配列と上述の相補性を有する。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば天然ヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵに似ているが、化学修飾されているヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド（もしくはヌクレオチド誘導体）を含有していてよい。化学修飾は、例えば、インビボでのオリゴヌクレオチドの半減期を増加させるために内因性エキソおよび／またはエンドヌクレアーゼによる分解に改良された抵抗性を提供すること、標的細胞もしくは膜へのオリゴヌクレオチドの送達を強化すること、またはオリゴヌクレオチドの生体内利用率を増加させることに有益な可能性がある。典型的には、アンチセンス分子は、修飾および天然ヌクレオチドの混合物を含有し、および特に、５’最末端および／または３’最末端ヌクレオチド（例えば、鎖の各末端での最外側の２つのヌクレオチド）はインビボでのアンチセンス分子の半減期を増加させるように修飾することができる。さらに、または、アンチセンス分子のバックボーンは、例えばヌクレアーゼによる分解に対する耐性を増加させるために、化学修飾することができる。典型的なバックボーン修飾は、１つ以上のホスホジエステル結合からホスホロチオエート結合への変化である。アンチセンス分子は、適切にはさらにヌクレアーゼの存在下でアンチセンス分子の半減期を増加させるように作用する、５’キャップ構造および／またはポリＡ３’テールをさらに含むことができる。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボの標的組織および細胞内で本発明の方法によって同定された１つ以上のクロマチン会合因子の発現を阻害するために使用できる。または、そのような分子は、エクスビボ（生体外）処置、またはインビトロ診断試験において使用することができる。
【００５９】
特異的標的遺伝子に対するアンチセンス分子を（その対応するＲＮＡ配列によって）設計および合成するための要件、細胞内にアンチセンス分子を導入して発現させるための方法、そしてそのようなアンチセンス分子を修飾するための適切な手段は、当業者には公知である。
【００６０】
例えば、療法において使用するためのアンチセンス分子は、腫瘍の部位で（例えば、腫瘍の細胞塊内への注射によって）直接的に患者へ投与することができる、または腫瘍細胞内へトランスフェクトされるベクターから転写させることができる。遺伝子療法ベクターを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、例えば、適切なリポソーム送達系もしくはウイルスベクターを用いて達成できる（Ｈｕｇｈｅｓ，２００４，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，８５（１）：２８−３５）。
【００６１】
例えばクロマチン会合因子遺伝子などの標的遺伝子を特異的にダウンレギュレートするまた別の手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用することである。当然ながら、ＲＮＡｉは、典型的には、長い二本鎖ＲＮＡ分子によって開始され、この分子はＤｉｃｅｒ酵素によって５’および３’末端で２本のヌクレオチドオーバーハングを有する２１〜２３ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡ内へと処理される。結果として生じる短いｄｓＲＮＡ分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知である。次にこれらの短鎖ｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡを分解するための内因性ヌクレアーゼのためのガイドとして作用するタンパク質−ＲＮＡ複合体であるＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内へ組み込まれると考えられる。
【００６２】
短鎖（例えば、１９〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）はＲＮＡｉを開始することができること、そしてそのような分子は、例えばＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８）に記載されたように、インビボでの遺伝子機能の選択的不活性化を可能にすることが証明されている。そこで、この技術は、インビボでの細胞内のクロマチン会合因子をコードするｍＲＮＡの効果的および特異的なターゲティングおよび分解のための手段を提供する。したがって、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子、および本発明の方法によって同定された１つ以上のクロマチン会合因子の細胞内での発現を特異的に減少または排除するためのそれらの使用を提供する。
【００６３】
アンチセンスおよびリボザイム技術の場合と同様に、インビボ使用のためのｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子は、有益にも１つ以上の化学修飾ヌクレオチドおよび／または１つ以上の修飾バックボーン連鎖を含有している。
【００６４】
本発明の医薬製剤は、規制基準に適合するように調製され、経口、静脈内、局所、またはその他の標準的経路によって投与することができる。本医薬製剤は、錠剤、ピル剤、ローション剤、ジェル剤、液剤、散剤、坐剤、懸濁剤、リポソーム、微粒子または当分野において公知の他の適切な調製物の形態にあってよい。
【００６５】
そこで、本発明は、疾患を治療するために本発明の新規なクロマチン会合因子の活性または発現を調節もしくは変調することのできる分子の使用を含んでいる。典型的にクロマチン会合因子の異常な活性もしくは発現に関連する疾患には、がん、早期老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス誘導性疾患ならびに感染症および不妊症が含まれる。
【００６６】
本発明の方法によって同定された新規なクロマチン会合因子（ポリペプチドもしくはそのフラグメント）は、薬物スクリーニングにおいて使用するためのトランスジェニック細胞系および精製因子を作製するために、個別に、または組合わせて組換え発現させることができる。クロマチン会合因子もしくはそのフラグメントを過剰発現する細胞系は、例えば、化合物（例えば「低分子」）、抗体もしくはその他の生物学的物質のライブラリーに対する高スループットスクリーニング法において使用できる。これらのスクリーニングアッセイは、適切には規定の表現型変化が（ＧＰＣＲ−ＦＬＩＰＲスクリーニングにおけるカルシウムシグナリングに類似して）同定されるセルベース・アッセイであってよい、または例えば放射性リガンド結合および蛍光偏光などの親和性ベースのスクリーンにおいて使用するための高レベルの精製タンパク質源として機能することができる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態では、新規なタンパク質およびポリペプチドクロマチン会合因子は、ＡＬＴテロメア配列単独、ＨｅＬａテロメア配列単独または両方に局在すると同定された（表１〜３を参照されたい）。これは、この技術が様々な細胞環境間を識別できることを証明している。テロメア組成における変化は、がんの進行および発達において重要であると考えられ、テロメア会合のような本アッセイにおいて同定された様々なタンパク質セットは、様々ながんタイプにおける有用な治療的介入点を形成する標的および経路の同定をもたらすことができる。サブセットのこれらの因子についての詳細な精査は、酵素活性を有するタンパク質の同定をもたらした。酵素機能を有する因子は、創薬における前途有望な将来性を示せることは理解される。本発明の範囲を限定せずに、新規なテロメアクロマチン会合因子の選択について、それらの公知の酵素活性と一緒に下記でより詳細に記載する。明らかに、本発明はそれらを潜在的薬物標的として一層より重要にさせるこれらの既知のタンパク質の生物活性に関する追加の情報を提供することができる。
【００６８】
＜ＡＬＴ細胞のみ＞
このセクションで同定された酵素は、ＡＬＴテロメア維持経路が活性化されている患者における腫瘍学標的としての将来性を有することができ、そして非ＡＬＴ、すなわち同一患者における非がん細胞に関するある程度の選択性を達成するためのメカニズムを提供することができる。
Ｐｒｉ−２
Ｈｉｎｔ２
ＭＴＡ１
Ｐｉｎ−１
ＬＳＤ１
【００６９】
＜ＰＲＩ−２＞
これは、ヒトにおけるＰＲＩＭ２Ａとしても公知であるＤＮＡプライマーゼの大きなサブユニット（５８ｋＤａ、ｐ５８）である。このタンパク質は、小さなサブユニットであるｐ４９の存在下では酵素的にのみ活性であると考えられる。
【００７０】
＜Ｈｉｎｔ２＞
Ｈｉｎｔ２は、以前は機能が不明確であったアデノシンモノホスファート・リシンヒドロラーゼである。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００６）１３０：２１７９−２１８８）は、これが腫瘍学における潜在的薬物候補ではないことを示唆する多数の観察所見を報告したが、それはＨｉｎｔ２レベルが肝細胞がん腫においてはダウンレギュレートされ、ＨｅｐＧ２細胞におけるＨｉｎｔ２のノックダウンはアポトーシス性刺激への感受性の低下をもたらすからである。同一系におけるＨｉｎｔ２の過剰発現は逆作用を有し、ＨｅｐＧ２異種移植片におけるＨｉｎｔ２の過剰発現は腫瘍サイズの減少をもたらす。本出願に提示したデータは、Ｈｉｎｔ２のテロメア局在がその細胞機能において重要であることを示唆している。
【００７１】
＜ＭＴＡ１＞
ＭＴＡ１は、ヌクレオソームのリモデリングおよび脱アセチル化（ＮｕＲＤ）複合体の構成要素であり、その発現は少なくとも一部にはｃ−Ｍｙｃによって転写レベルで制御される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００５，Ｖｏｌ．１０２，１３９６８−１３９７３）。ＭＴＡ１は、さらにまたエストロゲン受容体コリプレッサーであることも公知である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，２００６，Ｖｏｌ．９５，７−１２）。ＭＴＡ１は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２を備える複合体内で作用する（Ｙａｏ ＆ Ｙａｎｇ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，４２５６０−４２５６８）。
【００７２】
転移関連遺伝子１（ＭＴＡ１）は、胸腺腫（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００１，Ｖｏｌ．１７４，１５９−１６３）および前立腺がん（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４，Ｖｏｌ．６４，８２５−８２９）を含む多数の腫瘍の侵襲性、ならびに不死化角化細胞（Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２ Ｖｏｌ．２１，２１６１−２１７０）およびＰＡＮＣ−１膵臓がん細胞（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００４，Ｖｏｌ．９０，４５５−４６２）の移動および侵襲と相関することが証明されている。相当に高度のＭＴＡ１発現を伴うヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞では、ノックダウンは増殖および侵襲の阻害を生じさせた（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２００３，Ｖｏｌ．２０，１９−２４）。ＭＴＡ１の高発現レベルは、肝細胞がんにおける相当に不良な予後と関連すると報告されてきた（Ｈａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２００３，Ｖｏｌ．１０，５９９−６０４）。リンパ節転移陰性乳がんでは、ＭＴＡ１の高発現には高い再発リスクが結び付いているが、そのような腫瘍は例えばタモキシフェンもしくはアントラサイクリン系などの全身性療法に感作される可能性がある（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，２００６，Ｖｏｌ．９５，７−１２）。
【００７３】
ＭＴＡ１が乳腺を標的として過剰発現させられたトランスジェニックマウスでは、不適切な乳腺発達および腫瘍形成が観察された（Ｂａｇｈｅｒｉ−Ｙａｒｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４，Ｖｏｌ．１３１，３４６９−３４７９）。
【００７４】
ＭＴＡ１が腫瘍侵襲性に影響を及ぼす可能性がある１つのメカニズムは、Ｈｉｆ−１αの転写活性およびタンパク質安定性の両方を増強することによる。タンパク質の安定化は、増加したＨＤＡＣ１発現を通しての増加したＨｉｆ−１α脱アセチル化による（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００６，Ｖｏｌ．２５，１２３１−１２４１）。これは、乳がんにおける上昇したＭＴＡ１レベルと腫瘍内微小血管密度との関係と一致している（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００６，Ｖｏｌ．９７，３７４−３７９）。
【００７５】
＜ＬＳＤ１＞
ＬＳＤ１は、同定された最初のヒストンデメチーゼラであり（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１２２，６５４−６５８）、ヒストンＨ３リシン４およびリシン９からモノメチルおよびジメチル修飾を選択的に取り除く。ＬＳＤ１は、アンドロゲン受容体と相互作用してアンドロゲン受容体依存性転写を刺激する（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，Ｖｏｌ．４３７，４３６−４３９）。ＬＳＤ１レベルは、高リスクの前立腺がんではアップレギュレートされる（Ｋａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，１１３４１−１１３４７）。ＬＳＤ１は、細胞増殖のために必要とされ、このタンパク質の欠乏症は部分的細胞周期停止および外部刺激による増殖抑制への感作をもたらす（Ｓｃｏｕｍａｎｎｅ ＆ Ｃｈｅｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，１５４７１−１５４７５）。これらの特徴は全部がＬＳＤ１を腫瘍学にとって魅力的な標的にさせる。これまでには報告されていないテロメアとの関連についての理由は、調査のための有益な領域を表している。
【００７６】
＜Ｐｉｎ−１＞
Ｐｉｎ−１は、多数の発がん経路および細胞シグナリング経路の異性化に含まれるペプチジルプロピルイソメラーゼである（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｖｏｌ．５６，５１−５８において精査されている）。Ｐｉｎ−１の過剰発現は非小細胞肺がん（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｖｏｌ．５６，５１−５８）、およびＢ型肝炎コーディングＨＢｘがん遺伝子と相乗作用的に機能する可能性がある肝細胞がん（Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１３２，１０８８−１１０３）を含む多数のがんにおいて報告されてきた。Ｐｉｎ−１によるＳｔａｔ−３の活性化は、乳がん細胞における上皮細胞から間葉細胞への転移増加を引き起こす（Ｌｕｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，Ｊｕｎ １１、印刷出版に先行した電子出版）。マウスモデルでは、Ｐｉｎ−１およびｐ５３の二重除去は胸腺肥大の加速をもたらす（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，Ｖｏｌ．２６，３８３５−３８４５）。
【００７７】
したがってＰｉｎ−１は、創薬のための魅力的な腫瘍学標的である。しかし、Ｐｉｎ−１の活性はアルツハイマー病の病因に関係するとされたアミロイド発生経路において重要な保護的役割を果たすと思われる（例えば、Ｎｏｗｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２００７，Ｖｏｌ．４１９，１５−１７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ，２００７，Ｖｏｌ．１１，１３−２３；Ｂａｌａｓｔｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００７，Ｖｏｌ．１７７２，４２２−４２９を参照されたい）。このため、血液脳関門を越えないＰｉｎ−１阻害剤を発生させることが必要になる可能性がある。
【００７８】
＜ＨｅＬａ細胞のみ＞
一部のテロメア関連タンパク質は、ＨｅＬａ細胞においてのみ検出され、ＡＬＴ−陽性細胞系においては検出されなかった。これは、ＡＬＴテロメア維持系の使用が所定のタンパク質のテロメアへの局在化を誘導するだけではなく、これがさらにその他の会合も防止することを意味する可能性がある（ＨｅＬａテロメアは、テロメラーゼによって維持されるので、したがって例えばＧＡＲ１もしくはＢＡＴ１などのＡＬＴにおいて見いだされないテロメラーゼ会合タンパク質を予測することができる）。これは、さらにがんの療法における患者を階層化するためのメカニズムを提供できる。
Ａｕｒｏｒａ Ｂ
ＵＳＰ１
【００７９】
＜Ａｕｒｏｒａ Ｂ＞
ＡｕｒｏｒａキナーゼＢは、内部セントロメアタンパク質およびスルビビンと複合体を形成する染色体パッセンジャータンパク質である（Ｓｉｓｔａｙａｎａｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，Ｖｏｌ．２６，３５８５−３５９３によって精査された）。本発明者らのスクリーニング中に検出されたＨｅＬａ細胞におけるテロメアとの会合は、全く予想外である。異常なＡｕｒｏｒａ Ｂの活性は、肺（Ｈａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，４１１３−４１２２；Ｖｉｓｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００６，Ｖｏｌ．５，２９０５−２０１３）、口腔扁平上皮細胞がん（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，２００７，Ｖｏｌ．４５０，２９７−３０２）、乳がん（Ｔｃｈａｔｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２００７，Ｖｏｌ．２４７，２６６−２７２）、前立腺がん（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，４９９６−５００２）、神経膠芽細胞腫（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．６０，２１８−２２１）および中皮腫（Ｌｏｐｅｚ−Ｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，２６７０−２６７９）を含む多数のがんにおいて重要であると考えられる。腎腫瘍の動物モデルでは、Ａｕｒｏｒａ Ｂの発現はエストロゲン応答性である（Ｈｏｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，２９５７−２９６３）。
【００８０】
Ａｕｒｏｒａ Ｂの低分子阻害は中皮腫細胞を放射性増感させ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，１５１９−１５２５）、阻害剤はそれら自体が抗増殖性である（Ｇｉｒｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００６，Ｖｏｌ．１１９，３６６４−３６７５）。
【００８１】
＜ＵＳＰ１＞
ＵＳＰ１は、モノ−ユビキチン化ＰＣＮＡを脱ユビキチン化するシステインプロテアーゼである。モノ−ユビキチン化ＰＣＮＡは、損傷したＤＮＡの病巣内合成のために必要とされる。ＵＳＰ１の阻害は、この形態のタンパク質の蓄積をもたらす（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００６，Ｖｏｌ．８，３３９−３４７）。
【００８２】
＜ＡＬＴおよびＨｅＬａ細胞の両方＞
所定のタンパク質は、ＡＬＴおよび非ＡＬＴ細胞両方のテロメアと会合することが見いだされた。これは、これらの細胞条件のための所定の特異的タンパク質に加えて、病理−生理学的両方の状況においてテロメアと会合するより小さな群のタンパク質が存在する。以前にはテロメアと会合することが既知ではないタンパク質の選択は、以前には予測することのできなかった新規な治療介入点を示す可能性がある。
ＧＭＰシンターゼ
Ｆｅｎ１
ＵＳＰ７
ＰＲＭＴ１
転写中間因子１β
【００８３】
＜ＧＭＰシンターゼ＞
ＧＭＰシンターゼは、グルタミンおよびＡＴＰの存在下でＧＭＰを形成するためのキサントシン５’−モノホスフェートのアミノ化を触媒するアミドペプチダーゼである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，２３４５０−２３４５５）。このため、ＧＭＰシンターゼはグアニンヌクレオチドの新規合成における重要な酵素である。迅速に分割する細胞におけるヌクレオチドのための要件を前提にすると、ヌクレオチド合成経路における酵素は、創薬のための前途有望な標的となる可能性がある。最もよく知られていて臨床的に最も有用な例は、チミジル酸シンターゼ阻害剤である５−ＦＵである。より近年には、ＧＭＰシンターゼは、キイロショウジョウバエにおいてＵｓｐ７（下記参照）と相互作用してヒストンＨ２Ｂ脱ユビキチン化を刺激することが証明されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１７，６９５−７０７）。
【００８４】
＜Ｆｅｎ１＞
Ｆｅｎ１は、多ヌクレオチドＤＮＡ合成を含むロング・パッチベースの切除修復（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，Ｖｏｌ．２７５，４４６０−４４６６）およびＯｋａｚａｋｉフラグメント再生に関係する構造特異的フラップエンドヌクレアーゼである。この酵素はアニーリングしていない５’末端を備える基質を切断し、その活性はＰＣＮＡとの会合によって５〜５０倍に増加する（Ｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，Ｖｏｌ．２７５，１０４９８−１０５０５）。
【００８５】
Ｆｅｎ１のノックアウトはマウスにおいては胚で致死性であるが、Ｆｅｎ１およびＡｐｃ１についての二重ヘテロ接合体は腺がんの数の増加および生存率の減少を発生させる（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，Ｖｏｌ．９９，９９２４−９９２９）。Ｆｅｎ１（−／−）未分化胚芽細胞は、γ線照射に対して極めて感受性であり、広汎なアポトーシスを示す（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００３，Ｖｏｌ．２３，５３４６−５３５３）。ニワトリＤＴ４０細胞系では、細胞はＦｅｎ１の非存在下で生育性であるが、おそらくは高率の細胞死に起因して生長遅滞表現型を有し、スルホン酸メチルメタンおよび過酸化水素に対して高感受性であるが、ＵＶ照射、Ｘ線およびエトポシドに対しては高感受性ではない（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００２，Ｖｏｌ．３０，３２７３−３２７７）。正常マウス胎児線維芽細胞では、Ｆｅｎ１レベルはＵＶ照射に応答して増加し、この作用はｐ５３依存性である（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，Ｖｏｌ．２４，８４０３−８４１３）。
【００８６】
Ｆｅｎ１のレベルは肺がんではアップレギュレートされると報告され（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２２，７２４３−７２４６）、この遺伝子はさらにまた５−ＦＵ耐性ＨＣＴ１１６結腸がん細胞系においてもまたアップレギュレートされる（ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，Ｖｏｌ．２４，１２７９−１２８８）。ヒトのがんにおけるＦｅｎ１の突然変異は同定され、これらの突然変異を抱いているトランスジェニックマウスは、自己免疫、慢性炎症およびがんに罹患する傾向を示した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００７ Ｊｕｎｅ ２４、印刷出版に先行した電子出版）。
【００８７】
＜ＵＳＰ７＞
ＵＳＰ７システインプロテアーゼは、大多数の哺乳動物細胞中に存在するＰＭＬ（前骨髄球性白血病）核小体の成分である（Ｍｕｒａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００２，Ｖｏｌ．４，１０６−１１０）。ＵＳＰ７は、少なくとも２つのウイルスタンパク質であるＨＳＶタイプのＩＣＰＯおよびＥＢＶのＥＢＮＡ１の標的である（Ｈｏｌｏｗａｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，４７７５３−４７７６１）。ＥＢＮＡ１は、ＵＳＰ７のｐ５３と同一領域へ結合するが、他方ＩＣＰＯは相違する領域へ結合する。
【００８８】
ＵＳＰ７とＩＣＰＯの相互作用は、ウイルスタンパク質を自己ユビキチン化から保護し、これによりそれを安定化する（Ｃａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４，Ｖｏｌ．２７９，３８１６０−３８１６８）。ＩＣＰＯは、溶菌感染および潜伏からの再活性化を刺激する前初期調節タンパク質である。
【００８９】
初期の報告書は、ＵＳＰ７は脱ユビキチン化活性を有し、過剰なＭｄｍ２の存在下においてさえｐ５３の強力な安定剤であると主張した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，Ｖｏｌ．４１６，６４８−６５３）。しかし、同一グループからの後期の研究は、ＲＮＡｉによる内因性ＵＳＰ７レベルの部分的減少によってｐ５３を不安定化すると、ほぼ完全な除去がｐ５３安定化をもたらすという動的に決定された作用を提案した。この研究者らは、これは、ＵＳＰ７がＭｄｍ２安定化のためにも必要とされ、結果としてＵＳＰ７除去細胞中では、自己ユビキチン化Ｍｄｍ２が極めて不安定になり、ｐ５３安定化および活性化をもたらすと主張している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００４，Ｖｏｌ．１３，８７９−８８６）。
【００９０】
Ｃｕｍｍｉｎｓ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎからの研究は、ＵＳＰ７欠損性マウスにおいてはＭｄｍ２が不安定になり、ｐ５３レベルが上昇することを証明することによって、ＵＳＰ７の最も重要な相互作用は脱ユビキチン化することであり、そこでＭｄｍ２を安定化させ、減少したレベルのｐ５３をもたらすという主張を支持した（Ｃｕｍｍｉｎｓ ＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ，２００４，Ｖｏｌ．３，６８９−６９２）。ＵＳＰ７は、Ｍｄｍ２調節性／調節タンパク質Ｍｄｍｘによってｐ５３のより複雑な制御レベルにも関係している（Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１８，５６５−５７６）。さらに調節複合性のレベルには、ＡＴＭタンパク質キナーゼの作用が加わり、これはＭｄｍ２およびＭｄｍｘをリン酸化することによって、ＵＳＰ７に対するそれらの親和性を弱化させる（Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００５，Ｖｏｌ．４，１１６６−１１７０）。
【００９１】
近年には、ＵＳＰ７の主要な作用の１つはミトコンドリアでアポトーシス性に活性な非ユビキチン化ｐ５３を生成することであると推測されてきた（Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００７，Ｖｏｌ．２６，９２３−９３４）。
【００９２】
ＵＳＰ７は、その他の細胞ユビキチン化標的を有すると思われる。ＧＭＰシンターゼとの複合体（上記参照）では、ＵＳＰ７は、少なくともキイロショウジョウバエの胚中では、ヒストンＨ２Ｂの脱ユビキチン化を触媒するが、Ｈ２Ａの脱ユビキチン化を触媒しない（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１７，６９５−７０７）。ＵＳＰ７はさらに、その転写活性を負に調節するＦＯＸＯ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００６，Ｖｏｌ．８，１０６４−１０７３）およびチェックポイントタンパク質であるＣｈｆｒ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００７，Ｖｏｌ．３５７，６１５−６１９）を脱ユビキチン化する。
【００９３】
おそらく驚くべきことに、ＵＳＰ７のレベルはＮＳＣＬＣを有する患者１３１人中５９人において減少したが、これはｐ５３発現の減少と関連していた（Ｍａｓｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００６，Ｖｏｌ．２０８，７２４−７３２）。ＵＳＰ７を標的とすることは、造血系腫瘍にとって実行可能なアプローチとなる可能性がある。
【００９４】
＜ＰＲＭＴ１＞
ＰＲＭＴ１は、その標的にヒストンＨ４、ＧＲＩＰ１およびＰＰＡＲγコアクチベーター１α（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．２１，１３８１−１３９３において精査された）、ＤＮＡポリメラーゼβ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００７，Ｖｏｌ．２１，２６−３４）およびＲＩＰ１４０（Ｍｏｓｔａｑｕｌ Ｈｕｑ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００６，Ｖｏｌ．２５，５０９４−５１０４）が含まれるアルギニンメチルトランスフェラーゼである。ＰＲＭＴ１は、ｈＣＡＦ１によって調節される（Ｒｏｂｉｎ−Ｌｅｓｐｉｎａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００７，Ｖｏｌ．１２０，６３８−６４７）。ヒストンＨ４メチル化は、エストロゲン受容体媒介性遺伝子調節における早期の重要な事象である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００６，Ｖｏｌ．２８１，２７２４２−２７２５０）。インターフェロンα／β−媒介性遺伝子転写の誘導は、さらにＰＲＭＴ１の活性、この場合にはＳｔａｔ１によって作用することによって厳密に決定される（Ｍｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００１ Ｖｏｌ．１０４，７３１−７４１）。ＰＲＭＴ１の活性の阻害は、大規模に遺伝子発現に影響を及ぼす能力を有している。
【００９５】
＜転写中間因子１β＞
ＴＲＩＭ２８としても公知であるＴＩＦ−１βは、転写調節複合体の構成要素として同定されてきた（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９６，Ｖｏｌ．１０，２０６７−２０７８；Ｍｏｏｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ Ｖｏｌ．２４，４８５９−４８６７）。ＤＮＡ自体に結合するとは考えられていないが、ＴＲＩＭ２８はＫＲＡＢリプレッサー（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９６ Ｖｏｌ．９３，１５２９９−１５３０４）、ヒストン結合タンパク質ＨＰ１、ＳＥＴＤＢ１（ＥＳＥＴ）、およびｐ５３の重要な調節因子であるＭＤＭ２（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ ２００５ Ｖｏｌ．２４ ３２７９−３２９０）を含む多種多様な各因子と相互作用することは公知である。
【００９６】
ＴＲＩＭ２８は、遺伝子発現の抑制およびヘテロクロマチンの安定化において典型的に機能する数種のより大きな多因子複合体のメンバーであると考えられる（Ｓｒｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００６ Ｖｏｌ．２６，８６２３−８６３８）。ＴＲＩＭ２８の配列分析は、補因子認識および相互作用に関係すると考えられるＮ末端ＲＩＮＧおよびコイルドコイルドメイン（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００ Ｖｏｌ．２９５，１１３９−６２）、ならびに例えばＨＰ１およびＳＥＴＤＢ１などの転写リプレッサーと相互作用すると考えられるＣ末端ＰＨＤおよびブロモドメインを含む数種の認識可能なドメインの存在を示唆している。
【００９７】
このため、本発明の方法に由来する情報は、細胞内でのこれらの因子のためのクロマチン活性の正確な同定を可能にすることは明らかである。これらの様々な因子のための細胞状況、ならびに潜在的補因子に関する情報を提供することによって、本発明は、創薬および標的選択へより焦点を合わせたアプローチを可能にする。当該のゲノム領域と相互作用するタンパク質の同定は、ゲノム生物学を理解するためにも極めて重要である。これらの課題は、以前には遺伝学、可溶性複合体の生化学的特性解析、構造研究、クロマチン免疫沈降法、および細胞生物学を用いて研究されていた。特異的遺伝子座で結合した因子の「クロマチン公式」を確立することによって、本発明の方法は、染色体の特性解析を有意に前進させる。例えば、テロメアを試験するために本発明の方法を使用する際には、本発明者らは単一実験において以前から公知である大多数の因子を同定し、現在ではテロメア生物学に関連すると考察される複数の新規なタンパク質を見いだした。各クラスのテロメアで見いだされた驚くべき多数（約２００）のタンパク質は、この遺伝子座で発生する事象の多様性を強調している。明らかに、本発明の方法は、遺伝学がどこか別の場所では極めて重要な役割を果たす、または冗長であるために遺伝学を用いて明白にすることが困難である因子（例えば、オーファン受容体）を同定する能力を有する。
【００９８】
以下では、本発明を下記の非限定的な実施例によって詳細に説明する。
【００９９】
［実施例］
本発明者らは、標的遺伝子座でのタンパク質およびポリペプチドの同定を可能にする十分な純度で会合した結合因子を備えるクロマチンを単離する技術を考案した。例えば、哺乳動物クロマチン中に存在する中間反復エレメントと会合しているタンパク質が、質量分析法を用いて直接的に精製および同定されている。この技術をヒトテロメアに適用すると、低レベル発現を示すタンパク質を含めて、以前にテロメアに結合することが証明された全タンパク質の９２％が同定された。以下の実施例では、ＨｅＬａテロメアがＡＬＴテロメアと比較され、ＡＬＴテロメアに特異的に結合する複数の因子が同定された。これによって、それらのテロメアの配列内の変化によって様々なタンパク質がクロマチンに結合すると推測される。
【０１００】
本技術は、ほんの数例を挙げると、ウイルス統合部位、特異的ノックアウト細胞、および薬物療法後変化を含む様々な実験状況に適応させることができる。本発明の方法は、有益にも、既にその標的部位と会合している可能性があるタンパク質に関する事前の知識を全く必要とせずに、標的クロマチン部位と会合しているタンパク質複合体における変化の同定を可能にする。
【実施例１】
【０１０１】
１．クロマチン鋳型の調製
出発細胞はＨｅＬａ Ｓ３細胞（ヒトがん細胞系）であった。懸濁液から、スピナーフラスコ内の細胞（０．５〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２０Ｌの培養）を室温で１０分間、２，５００ｇでの遠心分離によってペレット化し、その直後に架橋溶液（１０10ｃｅｌｌｓに対して２００ｍＬ；架橋溶液：３％ホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ（ホルムアルデヒド３７％、メタノール安定化溶液から調製））中に再懸濁させた。付着性細胞については、媒質を最初に廃棄し、直ちにプレートへ架橋溶液を加えた（１０ｍＬ／１５ｃｍプレート）。細胞は、室温で３０分間にわたり架橋溶液中でインキュベートした。
【０１０２】
懸濁液中の細胞は４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄した。この物質を４本のＦａｌｃｏｎ試験管内へ等分した（通例は８ｍＬペレット／試験管）。付着性細胞については、架橋溶液を廃棄し、プレートを１×ＰＢＳ溶液（１ｍＭ ＰＭＳＦが補給された標準リン酸緩衝食塩液）で２回洗浄した。さらにプレート１枚当たり３ｍＬの細胞廃棄溶液（１×ＰＢＳ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え、細胞は氷上のＦａｌｃｏｎ試験管内にプールした。
【０１０３】
次に細胞は１×ＰＢＳ溶液中に細胞ペレットを再懸濁させることによってＰＢＳ中で４回洗浄し、容量を５０ｍＬ／試験管にさせ、次に４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を毎回廃棄し、最終洗浄ペレットをスクロース溶液中に再懸濁させた（容量を試験管１本に付き５０ｍＬにさせる）。この溶液を４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄し、ペレットをスクロース溶液により４０ｍＬの容量にさせた。
【０１０４】
この混合液を氷上の４０ｍＬのＤｏｕｎｃｅ（ダンス）型ホモジナイザーへ移し、緊密に適合する乳棒を用いて２０回すりつぶした。すりつぶした混合物を新鮮Ｆａｌｃｏｎ（ファルコン）試験管内へ移し、４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を廃棄し、ペレットを５０ｍＬのグリセロールバッファー中に再懸濁させた。このステップを１回繰り返し、ペレットの量と等量のグリセロールバッファー中へペレットを再懸濁させた（つまり、ペレット容量が７．５ｍＬである場合は、７．５ｍＬのグリセロールバッファーを加えた）。この調製物は１．５ｍＬ容量（つまり、１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管当たり約０．５×１０9ｃｅｌｌ当量）へ等分することができ、次に液体窒素で急速冷凍して−８０℃で保存するか、標的プルダウンのために次のステップへ取り出す。テロメア配列プルダウンのために、６本の１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管の調製物と同等の３．１０9×ｃｅｌｌ当量を使用する。
【０１０５】
上記のクロマチン調製プロトコールは、真核細胞、特に哺乳動物細胞とともに使用するために適合する。しかし、本発明の方法が単に真核細胞ゲノムＤＮＡおよびクロマチンと会合しているタンパク質およびポリペプチド因子の同定には限定されないことは理解される。核酸＋会合因子を精製するためのプロトコールは、さらに原核細胞ならびにウイルスにおいても公知である。
【０１０６】
２．ハイブリダイゼーションステップのためのクロマチン鋳型の最適化
次のステップは、出発点において単一の１．５ｍＬアリコートのクロマチン鋳型調製物を参照しながら記載する。
【０１０７】
卓上型遠心分離器を使用して、クロマチン鋳型調製物を室温で２分間にわたり２，０００ｇで遠沈させた。ペレットを１．５ｍＬの１×ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ溶液（１×ＰＢＳ；０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中に再懸濁させ、１５μＬの濃ＲＮＡｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ、１００ｍｇ／ｍＬ）を加えた。この溶液は（エッペンドルフ型サーモミキサーを１，４００ｒｐｍで使用して）攪拌しながら室温で６０分間にわたり、次にさらに１２〜１６時間にわたり４℃で（攪拌せずに）インキュベートした。このＲＮＡｓｅステップは、クロマチンと会合している、または会合していない（例えば、不活性Ｘ染色体上のＸｉｓｔ被覆クロマチンドメイン）リボヌクレオタンパク質複合体を精製することを目的とするのであれば、省略できる。
【０１０８】
ＲＮＡｓｅ処理した（または必要であれば未処理の）混合物は、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管内で他の処理アリコートともにプールし、１×ＰＢＳを用いて５０ｍＬの容量にする。プールした混合物（現在では出発時６アリコートに対応する）を４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄する。洗浄ステップは、存在する可能性がある微量のＲＮＡｓｅＡを希釈するために６回まで繰り返すことができる。次にペレットを室温で５０ｍＬの新鮮ＬＢ３ＪＤバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１００ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％のＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ；新しく作製し、室温で維持し、１ｍＭの最終濃度になるようにＰＭＳＦを加える）中に再懸濁させた。この溶液は、約４．５ｍＬの典型的容量のペレットを生じさせるために、４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。このペレットに、再懸濁させるために２．５ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを加えた。結果として生じる粘性溶液は、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中の２つの３．５ｍＬアリコートに分割した。この溶液を４℃の低温室において氷上で超音波処理した（マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００超音波処理機）。超音波処理パラメータは：電源設定７、１５秒間の一定パルス、４５秒間の休止、７分間の総処理時間であった。これらの条件は、通常はその後のハイブリダイゼーションおよびプルダウンステップのために適切なサイズである長さ約２〜４ｋｂのクロマチンフラグメントを与える。超音波処理溶液を１ｍＬのアリコートに分割し、室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中へプールした。超音波処理クロマチン溶液の４００μＬのアリコートは、溶液中の塩濃度を減少させることができるように、Ｓ−４００−ＨＲゲル濾過スピンカラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で２分間にわたり８００ｇで各々処理した。
【０１０９】
カラムからの溶出液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中にプールし、５分間にわたり５８℃でインキュベートしたが、これは可溶性クロマチン調製物中に存在する内因性でビオチン化されたタンパク質を曝露させるために役立つ。プール溶液を室温へ冷却した。０．５ｍＬのＵｌｔｒａｌｉｎｋストレプトアビジン・ビーズスラリーを平衡化させ、１０ｍＬのＬＢ３ＪＤＬＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；３０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％のＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ；新しく作製し、室温で維持し、１ｍＭの最終濃度にあんるようにＰＭＳＦを加える）を用いて２回洗浄し、２分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を廃棄すると、約０．５ｍＬの容量のスラリーペレットが残留した。洗浄したストレプトアビジン・ビーズをプールした可溶性クロマチン溶液に加え、この混合物を室温の旋回装置上で２時間にわたりインキュベートした。この溶液を室温で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させると内因性ビオチン化タンパク質の大部分が除去され、これにより後のステップにおけるバックグラウンドが減少した。上清を保存したが、上清は「透明な」可溶性クロマチン溶液を含有している。
【０１１０】
こうして、クロマチン溶液は、ハイブリダイゼーションの準備が整った。クロマチン溶液は、以下の分光測光特性を有していた。
ＤＮＡ濃度（Ｏ．Ｄ．２６０）：２〜２．５ｍｇ／ｍＬ
Ｏ．Ｄ．２６０／Ｏ．Ｄ．２８０＝１．３０〜１．４５．
【０１１１】
Ｏ．Ｄ．比の数値が高いほど、初期のＲＮＡｓｅＡ処理は十分に有効ではないこと、そして精製された材料は非クロマチンＲＮＡ−タンパク質複合体によって汚染される可能性があることを意味する。これらの数値は、ＬＢ３ＪＤＬＳバッファーが「ブランク」溶液として使用される場合に入手された。
【０１１２】
可溶化して清浄化したクロマチン溶液は、４℃で保存することができる。
【０１１３】
３．ハイブリダイゼーションおよび標的配列捕集（プルダウン法）
先行ステップにおいて得られた可溶化クロマチンサンプルは、室温の１６，０００ｇで１５分間にわたり遠沈させた。約５ｍＬのクロマチンサンプルを生じさせるためにアリコートを一緒にプールし、これに最終濃度０．０２％（クロマチンサンプルの１／１，０００の容量）まで２０％ＳＤＳを加えた。
【０１１４】
このクロマチン溶液に３０μＬの所望のオリゴヌクレオチドプローブ配列（１００μＭのストック溶液から、プローブの詳細については「４．」を参照されたい）を加えた。スクランブルもしくはランダム化配列を有するプローブを含有するコントロール反応もまた並行してランした。
【０１１５】
このハイブリダイゼーション反応液をハイブリダイゼーションステップのためにサーモサイクラー内に配置したおよそ３４×１５０μＬのアリコートに分割した（ＨＹＢＡＩＤ Ｐｘ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションプログラムは、以下のとおりであった。
２５℃で３分間
７０℃で６分間
３８℃で６０分間
６０℃で２分間
３８℃で６０分間
６０℃で２分間
３８℃で１２０分間
最終温度２５℃
【０１１７】
ハイブリダイズしたサンプルを元の１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管内へプールし、ハイブリダイゼーションステップ中に形成された可能性がある任意の沈降物を除去できるように室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。
【０１１８】
２．４ｍＬのＭｙＯＮＥ−Ｃ１磁気ストレプトアビジン・ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中に配置し、それらを平衡させるためにこれに７．６ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを加えた。これらのビーズは磁気スタンド上に固定化し、上清を廃棄した。ビーズは１０ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中で洗浄し、再び固定化し、総量が２．４ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー内へ再懸濁させた。
【０１１９】
遠沈させたハイブリダイズしたクロマチンサンプルからの上清を２本の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中へ移した。各試験管へ３．５ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水を加え、次に１．２ｍＬのＣ１磁気ビーズ溶液を加えた。この混合物を室温で１２時間にわたり旋回させた。
【０１２０】
この混合物の容量は、ＬＢ３ＪＤバッファーを用いて各試験管内で１０ｍＬまでにさせた。次に磁気ビーズを磁気スタンド上で固定した。上清（およそ１０ｍＬ）は、ハイブリダイズしていない分画を表し、後の個別分析のために保存することができる。ペレットは、プルダウンした、ハイブリダイズしたクロマチン標的を表す。ペレットは、１０ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを用いて７回洗浄した。各洗浄後に、ビーズは旋回によって穏やかに再懸濁させた。洗浄ステップ後、ビーズは試験管１本に付き２．４ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させ、２本のエッペンドルフ（１．５ｍＬ）低結合試験管へ移し、遠沈させた。
【０１２１】
次に磁気ビーズをエッペンドルフ磁気スタンドを用いて固定した。上清を廃棄し、ビーズを１ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させた。これらの試験管を４２℃のサーモミキサー内で（１，０００ｒｐｍで攪拌しながら）５分間インキュベートし、次にビーズはエッペンドルフ磁気スタンドを用いて再び固定化した。このステップを繰り返し、最後にビーズを０．６ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させた。各ハイブリダイゼーションからのビーズ（テロメアおよびコントロール、各２本の試験管）を１本の試験管／反応液内にプールし、エッペンドルフ磁気スタンド上で固定化した。ペレットを室温で１ｍＬの溶出バッファー（１２．５ｍＭ ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；７５ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；０．７５ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．１５％ＳＤＳ；０．０７５％Ｓａｒｋｏｓｙｌ）中に再懸濁させ、室温のサーモミキサー内で（１，０００ｒｐｍで攪拌しながら）６０分間にわたりインキュベートした。６０分間にわたりインキュベートした後、温度を６５℃へ上昇させ、これらの混合液は、遠沈したクロマチン標的配列の溶出を実行するために１０分間にわたりインキュベートした。
【０１２２】
これらの試験管は、残留した磁気ビーズおよび溶出液を固定化できるようにエッペンドルフ磁気スタンド上に再び配置し、新鮮１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管へ移した。プローブが磁気ビーズから溶出させられていることを検証するために、溶出液のＯＤ２６０をチェックした（１５〜２５ｎｇ／μＬでなければならない）。
【０１２３】
溶出液各々に、２３０μＬの１００％ＴＣＡを加え、これらの試験管を氷上で１０分間にわたりインキュベートした。次にプルダウンしたクロマチン溶液を室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させ、約１．１ｍＬをピペッティングによって注意深く除去した。これらの試験管は−２０℃の低温アセトンを用いて１．５ｍＬにさせ、１０秒間にわたり攪拌し、次に室温で１０分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を廃棄すると、小さな白色ペレットが視認できた。ペレットをさらにもう１回低温アセトンで洗浄し、室温で１０分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を廃棄し、ペレットは風乾させた。
【０１２４】
プルダウンした標的クロマチンを含有するペレットは、５０μＬの架橋逆転溶液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）；２％ＳＤＳ；０．５Ｍの２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。次にこの溶液を２５分間にわたり９９℃でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填するか、またはその後の分析のため（例えば、質量分析法による）に待機中は−８０℃で保存した。
【０１２５】
スクロースバッファー
０．３Ｍスクロース；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；３ｍＭのＣａＣｌ2；２ｍＭのＭｇＯＡｃ（酢酸マグネシウム）
【０１２６】
グリセロールバッファー
２５％グリセロール；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＥＧＴＡ；５ｍＭのＭｇＯＡｃ（酢酸マグネシウム）
【０１２７】
４．オリゴヌクレオチドプローブの設計
プローブは、ＬＮＡおよびＤＮＡ残留物の混合物から構成され、長さ２５ヌクレオチドであった。さらに、それらをそれらの５’末端でのデスチオビチンであるビオチンアナログで標識したが、この標識は典型的に長さ２０〜９５炭素原子からなる極めて長いスペーサー基によってプローブ配列に結合している。デスチオビオチンは、ビオチンに比較してより穏和な溶出条件を使用できるように、親和性標識として選択された。極めて長いスペーサーは相当に重要であるが、それはクロマチン固定化戦略が立体障害問題によって損なわれる可能性があるためである（例えば、Ｓａｎｄａｌｔｚｏｐｏｕｌｏｓ Ｒ，Ｂｌａｎｋ Ｔ，Ｂｅｃｋｅｒ ＰＢ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４を参照されたい）。適切な極めて長いスペーサー技術は、Ｍｏｒｏｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．（２００３）２２（５−８）：１４３９−４１およびＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００５）；２８８：２２５−４０）に記載されている。
【０１２８】
上述した実施例では、テロメア標的化プローブ配列は、
５’ ＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇｔ ３’［配列番号１］
であった。
ランダム化／スクランブル化コントロールプローブ配列は、
５’ ＧａＴｇＴｇＧａＴｇＴｇｇＡｔＧｔＧｇＡｔｇＴｇｇ ３’［配列番号２］
であった。
このとき大文字はＬＮＡ残基を表し、小文字はＤＮＡ残基であった。オリゴヌクレオチドプローブを含有するデスチオビオチン化ＬＮＡは、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）による発注のために合成された。上記のプローブにおいて利用された分子スペーサーは、長さが１０８炭素原子であった。
【０１２９】
５．プルダウンしたタンパク質の精製
プルダウンしたタンパク質はＢｉｓ−Ｔｒｉｓの１２％アクリルアミドミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に装填し、泳動用色素がゲルから抜け出るまで１００Ｖで泳動した。次にこのゲルを、製造業者の取扱説明書にしたがってコロイダルブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により染色して固定した。１５〜２５のバンドを全レーンに沿って切り取った（全レーンを被覆する）。これらのサンプルは、分析およびタンパク質同定のためにＴａｐｌｉｎ Ｈａｒｖａｒｄ質量分析施設（ＴＨＭＳ）に提出された（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｙｇｉ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｆａｃｉｌｉｔｙ／＃Ｉｎｔｒｏを参照。Ｔａｐｌｉｎ生物学質量分析施設、ハーバード医科大学、Ｃ棟５１７号室、ロングウッドアベニュー２４０、米国マサチューセッツ州ボストン０２１１５）。
【０１３０】
典型的に、この分析は以下のステップを含んでいる。
ａ．ゲルバンド／スポットのゲル内消化
ｂ．マイクロキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
ｃ．タンパク質データベース検索
【０１３１】
６．データ分析およびデータのウェブベース報告
これらの結果は、民間アクセスのウェブサイトデータベースの形態にあるＴＨＭＳによって提供される。
【０１３２】
圧縮されたデータリンクは、それらがマッチする対応するタンパク質と一緒にサンプルから同定されたペプチドを示した。データベース内に列挙された他のタンパク質内で見いだされたペプチド配列には、カラム内で「赤色」標識された数（すなわち、＋３）が割り当てられた（冗長性）。圧縮されたデータリンク内の情報は、Ｓｅｑｕｅｓｔデータベースの検索から入手されたデータをソーティングおよびフィルタリングすることによって作製された。
【０１３３】
これらのタンパク質は、データの手動検査によって補強されたデータベース−検索プログラムによってそれにマッチされた２つ以上の強力なスコアリングペプチドの要件を備える各サンプルを用いて列挙された。唯一のマッチングペプチドを有していた列挙されたタンパク質が情報のために列挙されたが、１つのマッチングペプチドしか有していなかったタンパク質が正確であるかどうかは、典型的にはその後の確証によって（例えば、ウエスタンブロットによって）検証される。
【０１３４】
同定された新規なテロメアクロマチン会合因子は、表１に規定した。
【実施例２】
【０１３５】
出発細胞は、形質変換ヒト胚肺線維芽細胞系ＷＩ３８ ＶＡ１３（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：１６７１−１６７７）であった。実施例１において使用したＨｅＬａ細胞系とは相違して、ＷＩ３８ ＶＡ１３は、ＡＬＴ細胞タイプである非テロメアである。ＡＬＴテロメア配列と会合しているタンパク質およびポリペプチド因子は、実施例１に記載した方法によって単離した。
【０１３６】
同定された新規なＡＬＴテロメアクロマチン会合因子は、表２に規定した。図２は、実施例１および２によって同定された新規なクロマチン会合因子のグラフによる比較を示している。この図は、所定の因子がテロメラーゼおよびＡＬＴ細胞タイプ両方においてテロメア配列と一般に関連している重複の領域が明白であることを示している。両方のテロメラーゼ細胞（ＨｅＬａ）およびＡＬＴ細胞（ＷＩ３８ ＶＡ１３）に一般的なクロマチン会合因子の同一性は、表３に示した。
【実施例３】
【０１３７】
＜本発明の方法により同定された新規なクロマチン会合因子の特性解析＞
本発明の方法によって同定された候補が機能的に重要であることを証明する実験を実施した。ＡＬＴ細胞系ＷＩ３８ ＶＡ１３は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２遺伝子を標的とする２つのｓｈＲＮＡ構築体（ＳＩＧＭＡ、Ｍｉｓｓｉｏｎ ｓｈＲＮＡコレクション）を用いてトランスフェクトした。ＣＯＵＰ−ＴＦ２は、実施例２における新規なクロマチン会合因子であると同定されたオーファン核受容体である（表２においてボールド体で表示した）。細胞は、トランスフェクトに成功していた細胞を同定するために緑色蛍光タンパク質構築体をコトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、細胞を固定し、テロメアを検出するための抗ｒａｐ１抗体（ウサギポリクローナルａｂ４１８１、ＡｂＣａｍ社）およびＰＭＬ体を同定するための抗ＰＭＬ抗体（マウスモノクローナルＰＧＭ３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を用いて二重染色した。局在化シグナルは、ロバ抗ウサギ−Ｃｙ３およびロバ抗マウス−Ｃｙ５ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ社）により示された。
【０１３８】
図３に示したように、ＰＭＬおよびＲａｐ１シグナルは、未トランスフェクト細胞内では共局在化する（ＧＦＰ染色の欠如によって同定された）。しかし、ＧＦＰ陽性細胞内では、２つのシグナルはもはや共局在化しない。これは、ＣＯＵＰ−ＴＦ２がＡＬＴ細胞内でテロメアをＰＭＬ体へ局在化するために必要とされることを証明している。ＰＭＬ体は、転写、ＤＮＡ修復、ウイルス防御、ストレス、細胞周期調節、タンパク質分解およびアポトーシスを含む多数の核機能と関連付けられてきた。したがって、がん細胞内でのＰＭＬ体へのテロメアの局在化を阻害する能力は、がん療法へ重要な経路を提供することができる。
【０１３９】
ＴＲ４遺伝子（本明細書で同定されたまた別の新規な因子）に対して特異的なｓｈＲＮＡを用いるその後のノックダウン実験は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２と類似の結果を示した。これらの結果は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２および／またはＴＲ４は、インビボでＰＭＬ体へのテロメア局在化の極めて重要なメディエーターとして機能できることを示唆している。
【０１４０】
また別の実験（本明細書に示していない）は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２もしくはＴＲ４のノックダウンは、Ｓａｏｓ−２骨肉腫ＡＬＴ細胞系においてＷＩ３８ＶＡ１３細胞内と同一作用を正確に有するので、細胞系特異的ではないことを証明した。
【０１４１】
テロメア配列と会合するポリペプチドおよびタンパク質を標的とするために本発明の方法を使用することは、有意な数の会合タンパク質の同定を生じさせた。それでも、本発明の方法は、より小数のタンパク質を同定できると予想される場合は、単一コピー配列を標的とするために適応させた場合もまた有用性を証明する。これらの場合には、本発明の方法はシステム生物学フレームワーク内で新規な仮説を作り上げる、したがって遺伝子制御経路の大多数の化学的に従順な構成要素を同定するために使用できる相互作用経路の同定をもたらす。
【実施例４】
【０１４２】
＜超音波処理によるクロマチン鋳型の調製＞
本実施例は、実施例１に記載したクロマチンフラグメントを調製するための代替方法を提供する。
【０１４３】
以下の容量および数は、１回の精製のために提供する（すなわち、約３．１０9ｃｅｌｌ当量）：細胞を室温で２分間にわたり２，０００ｇで遠心分離し、ペレットを同一容量の１×ＰＢＳ−０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に再懸濁させ、９０μＬのＲＮａｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ、１００ｍｇ／ｍＬ）を加えた。細胞は、攪拌しながら室温で６０分間にわたり、次に４℃で１２〜１６時間にわたりインキュベートした。細胞は、ＰＢＳ中で６回洗浄した。細胞はＬＢＪＤ溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１００ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％ ＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、プロテアーゼ阻害剤）中で平衡化し、ペレットはペレット量が５５％のＬＢＪＤ溶液中に再懸濁させた。サンプルは、以下のパラメータを用いて超音波処理した（Ｍｉｃｒｏ−ｔｉｐ、Ｍｉｓｏｎｉｘ ３０００）。電源設定７（３６〜４５ワット）、１５秒間の一定パルス、および４５秒間の休止で７分間の総処理時間であった。サンプルは、室温で１５分間にわたり１６，０００ｇでの遠心分離によって収集した。次にクロマチンサンプルは、ＳｅｐｈａｃｒｙｌのＳ−４００−ＨＲスピンカラムへ適用し、５８℃で５分間にわたりインキュベートした。
【０１４４】
ＬＢＪＤＬＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；３０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％ＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、プロテアーゼ阻害剤）で事前に平衡化したストレプトアビジン・ビーズを加え（Ｐｉｅｒｃｅ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋストレプトアビジン、０．５ｍＬ）、サンプルを室温で２時間にわたりインキュベートした。ビーズを廃棄し、上清を保存した。
【０１４５】
本発明の特定の実施形態を本明細書で詳細に開示してきたが、これは例として、そして例示する目的でのみ実施されたものである。上記の実施形態は、以下の添付の特許請求項の範囲に関して限定することは意図されていない。本発明者らは、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な置換、変更、および修飾を加えられることを企図している。
【０１４６】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【０１４７】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【０１４８】
【表３Ａ】
【表３Ｂ】
【表３Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列、特にゲノムＤＮＡおよびクロマチンと会合するタンパク質およびポリペプチド因子についてのアッセイに関する。さらに、本アッセイにより同定された新規なクロマチン会合因子が提供される。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクス（後成学）は、細胞もしくは多細胞生物からその子孫への情報の伝播であって、その情報が遺伝子のヌクレオチド配列内でコード化されない伝播に関する。後成学的メカニズムは、ＤＮＡの化学修飾を通して、またはＤＮＡと会合しているタンパク質およびポリペプチドへの翻訳後修飾を通して機能することができる。
【０００３】
真核細胞のゲノム内では、ＤＮＡは、遺伝子発現の調整、ＤＮＡのパッケージングおよび複製の制御を支援するタンパク質複合体と会合している。ゲノムと会合している無数のタンパク質は、大多数の真核細胞の核内に存在する、クロマチンと命名されている核物質に関与する。細胞周期における相違する時点には、ゲノムＤＮＡのパッケージング（または凝縮）のレベルは、例えばＤＮＡの複製中（Ｓ期）などの低パッケージ化状態とゲノムが染色体内にパッケージ化される細胞分割中（Ｍ期）などの高凝縮状態とで相違する可能性がある。高度に発現した遺伝子もまた低パッケージング状態（いわゆる真正染色質状態）で存在する傾向があるが、他方不活性化された遺伝子は高パッケージング状態（いわゆる異質染色質状態）で存在する。凝縮、凝縮状態の維持、およびヘテロクロマチン（異質染色質）からユークロマチン（真正染色質）への移行の相対状態は、ほとんどが複数の特殊タンパク質およびポリペプチド複合体によって媒介されると考えられている。
【０００４】
基礎レベルでは、クロマチンの大多数の「オープン」形もしくは真正染色質形は、一緒にヌクレオソームを形成する１オクテットのヒストンタンパク質が巻き付けられている短い区間のゲノムＤＮＡを含んでいる。ヌクレオソームは、一列に配列されて数珠玉（ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）構造を形成している。隣接ヌクレオソーム間の相互作用は、より高度に規則的なクロマチン構造の形成を可能にする。ヒストンの翻訳後修飾を触媒する酵素、または物理的に相互作用してこれらのヒストンを一緒に固定することに役立つ構造的タンパク質によって媒介され得るのは、これらの相互作用である。
【０００５】
クロマチンの組織化および安定性への後成的制御は、細胞が正常かつ健常に機能するために不可欠である。異常な後成的修飾およびクロマチン安定性の低下は、老化細胞、アポトーシス細胞もしくは罹患細胞、特にがん細胞において見られることが多い。後成的活性を示すことのできる多数のタンパク質およびポリペプチド、ならびにクロマチンおよびクロマチン会合タンパク質と相互作用できる因子を同定して特性付けることは相当に重要である。さらにまた、特にクロマチン生物学を全体としてより明確に理解することを促進するために、新規なクロマチン会合因子を同定して特性付けることには極めて重要な価値がある。
【０００６】
従来法では、クロマチンに会合したタンパク質の単離は、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）を実施することによって達成されてきた。典型的なＣｈＩＰアッセイでは、クロマチン結合タンパク質は、インビボ（生体内）でホルムアルデヒドを用いてＤＮＡへ架橋結合させられる。その後クロマチンは、小さなフラグメントにせん断され、精製される。精製されたクロマチンフラグメントは、免疫沈降法によって複合体を単離できるように、公知の標的クロマチン結合タンパク質に特異的である抗体を用いて精査される。沈降したクロマチンは、それによって配列分析のためにＤＮＡを遊離させるように、架橋結合を逆転させるために処理される。架橋結合によってプルダウン（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）された付随的会合タンパク質を調査することは可能であるが、この方法は１つのゲノム領域には限定されず、このためには最適化されていない。ＣｈＩＰを実施するためのプロトコールは、Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６）１：１７９−１８５）およびＣｒａｎｅ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．（１９９９）３０４：５３３−５４７）に開示されている。
【０００７】
ＣｈＩＰに基づく技術に関する重要な欠点は、所与の配列については、その配列に会合した少なくとも１つの特定タンパク質が既知でなければならないことである。したがって、規定の標的核酸配列と直接的または間接的に会合するタンパク質因子を単離する方法が必要とされる。実質的に、抗原によって駆動されるのではなく核酸配列によって駆動されるクロマチン会合タンパク質またはポリペプチドを単離する方法が必要である。さらに、ＣｈＩＰでは、免疫沈降の欠如は必ずしも被験因子の欠如を反映する訳ではないので、この技術を用いた場合には常に偽陰性の結果が生じる危険性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、当分野におけるこれらの欠点を、所与の標的核酸配列と直接的または間接的に会合するタンパク質因子を単離するための新規な方法を提供することによって克服する。詳細には、本発明の方法は、新規なクロマチン結合タンパク質およびポリペプチドを単離することに関する上述の問題を克服する。
【０００９】
本発明の第１態様では、標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するための方法であって、
（ａ）標的核酸配列と、該標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
（ｂ）該サンプルと、該標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的でありハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとを接触させるステップと、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つの親和性標識をさらに含み、
（ｃ）該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと該標的核酸配列とがプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）該少なくとも１つの親和性標識に対して結合する分子を介して該プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、該プローブ−標的ハイブリッドを該サンプルから単離するステップと、
（ｅ）該標的核酸配列と会合している該１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
核酸配列は他の遺伝子座から特異的クロマチン遺伝子座を識別する普遍的手段を提供するものであるので、本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアプローチを精製戦略のための基礎として利用してきた。よって、クロマチンに適用された場合は、本方法は、特異的クロマチン領域の単離およびそれらの遺伝子座に結合したタンパク質のその後の同定を可能にする。重要なタンパク質−タンパク質およびタンパク質−核酸相互作用が精製手順中に維持されるため、本発明者らは、完全クロマチンのプロテオミクス（ＰＩＣｈ）としてのクロマチンとともに使用するために適用した場合の本発明の極めて広汎な態様について言及してきている。
【００１１】
典型的に、標的核酸配列は、真核または原核細胞核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）を含んでいる。適切には、真核細胞ＤＮＡは哺乳動物ＤＮＡであり、場合により標的核酸配列はクロマチン内に含まれている。後者の場合には、有益にも、本発明の方法は、個別に、または多因子複合体の一部として、ＤＮＡと会合しているポリペプチドを単離することができる。
【００１２】
本発明の方法の特定の実施形態では、標的核酸配列と会合している該１つ以上のポリペプチドは、該１つ以上のポリペプチドの架橋結合を生じさせる条件に曝される。この架橋ステップは、オリゴヌクレオチドプローブにサンプルを曝露させるステップの前（すなわち、ステップ（ｂ）の前）に行われ、その架橋結合は、該１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップの前（すなわち、ステップ（ｅ）の前）に脱架橋される。場合により、本発明の方法は、該溶出された１つ以上のポリペプチドの同一性を決定するために分析するステップをさらに追加する。分析は、当分野において公知の、任意の数の技術によって行うことができるが、典型的に、高スループットのプロテオミクス分析は質量分析法の構成要素、または抗体マイクロアレイ・スクリーンを含む。
【００１３】
本発明の第２態様は、以下に記載する一般式Ｉ：
【化１】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基ＣによってヌクレオチドＸに連結された１つ以上の親和性標識を含み；Ａはハプテンもしくは免疫タグを含み、ヌクレオチドＸは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する少なくとも１つの基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。適切には、ハプテンは、ビオチンもしくはそのアナログ（例えばデスチオビオチン）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールなどから選択される。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の第１および第２基を含むが、該第１基は第１親和性標識Ａを含み、該第２基は第２親和性標識Ａ’を含み、このときＡおよびＡ’は同一ではない。
【００１４】
本発明の第３態様は、以下に記載する一般式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基Ｃによってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結された親和性標識であり、該オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチド、典型的にはヌクレオチドの少なくとも２５％がロックされた核酸ヌクレオチド、場合によりヌクレオチドの１００％までがロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含む）に一致するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。場合により、該炭素スペーサー基は、オリゴヌクレオチドプローブの５’ヌクレオチドに結合されている。
【００１５】
本発明の第４態様は、以下に記載する一般式ＩＩＩ：
【化３】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、該ヌクレオチドＺおよびＷは、長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは、同一または相違し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。適切には、該親和性標識は、ビオチンもしくはビオチンもしくはそのアナログ（例えばデスチオビオチン）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールなどから選択される。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドＺが該オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表すような一般式ＩＩＩの基を含んでいる。
【００１６】
本発明の第５態様は、真核細胞のゲノム内のクロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）該真核細胞内のクロマチンの該特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
（ｂ）該特異的領域内に局在するＤＮＡ配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
（ｃ）クロマチンの該特異的領域と会合している１つ以上のポリペプチドを単離できるように上述した方法において該オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
（ｄ）クロマチンの該特異的領域と会合するポリペプチドを同定できるように該１つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態では、クロマチンの特異的領域はテロメア、セントロメア、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子間領域、遺伝子、反復配列、異種挿入配列、および統合ウイルスゲノムのうちの１つ以上を含んでいる。典型的には、クロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドは、酵素活性についてさらにスクリーニングされる。適切には、クロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドは、該標的が何らかの形態の酵素活性を示す場合は、前途有望な薬物標的であると同定される。
【００１８】
本発明のまた別の態様は、後成的活性の調節因子についてのスクリーニング法であって、
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の１つ以上の化合物と接触させるステップと、
該単離されたポリペプチドに結合してポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子であると同定するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、該単離されたポリペプチドは、Ｈｉｎｔ２、ＧＭＰシンターゼ、Ｐｒｉ２、Ｆｅｎ１、ＵＳＰ７、ＴＩＦ１−β、Ｐｉｎ−１、ＡｕｒｏｒａキナーゼＢ、ＵＳＰ１およびＭＴＡ１のうちの１つから選択される。これらの特異的標的については、以下でより詳細に記載する。
【００２０】
本発明のまた別の態様は、ポリペプチドの生物活性を特性付ける方法であって、
上述の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合すると同定されるポリペプチドを単離するステップと、
該ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
該ポリペプチドについての該核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
該真核細胞内の該ポリペプチドの発現を減少させられるように該アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
該ポリペプチドの該生物活性を決定できるように、該真核細胞の表現型を分析するステップとを含む方法を提供する。
【００２１】
適切には、該アンチセンス核酸配列はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（またはｓｈＲＮＡなどの前駆体）を含むことができる。該真核細胞は、哺乳動物細胞であってよい。適切には、該アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップは、該真核細胞内の該ポリペプチドの発現を減少させるためである。これは、該アンチセンス核酸配列をコードする異種配列を該真核細胞のゲノム内へ挿入し、それによって当分野において公知である組換え技術（例えば、遺伝子ターゲティング／相同組換え）によってトランスジェニック細胞を生成することによって達成できる。場合により、真核細胞は、例えば真核幹細胞などの多能性幹細胞である。そのような方法は、「ノックアウト」マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物の産生を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の方法の１つの実施形態の図である。
【図２】２つの相違するタイプのがん細胞間で一般に保持されている、本発明の方法によって同定された新規なテロメアクロマチン会合ポリペプチド因子の比率を示すグラフ表示である。円の中の数は規定細胞タイプにおいて同定された新規なテロメアクロマチン会合ポリペプチド因子の数を示している。
【図３】形質変換されたヒト線維芽細胞系において新規なテロメアクロマチン会合因子であるＣＯＵＰ−ＴＦ２をノックダウンする実験の結果を示す図である。ＰＭＬ抗体（ＰＭＬ）は、細胞内のＰＭＬ体の場所を示している。ＲＡＰ１抗体は、細胞内のテロメアの場所を示している。マージ画像は、テロメア（ＲＡＰ１）がＣＯＵＰ−ＴＦ２ ｓｈＲＮＡの存在下ではＰＭＬ体（ＰＭＬ）の位置を局在化しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で言及した全ての参考文献は、全体として参照して組み込まれる。他に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している意味と同一の意味を有する。本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ）などの標準の参考書において見いだすことのできる、ある範囲の従来型の分子生物学技術の使用を含んでいる。
【００２４】
本発明の詳細な説明を記載するに当たって、本発明の理解に役立つ多数の用語の定義を提供する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、自然に生成されたか、または合成手段によってインビトロ（試験管内）で生成されたかに関わらず、ペプチド結合によって結び付けられたアミノ酸残基のポリマーを意味する。長さがおよそ１２アミノ酸残基未満のポリペプチドは、典型的に「ペプチド」と呼ばれている。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、天然型ポリペプチド、前駆体形もしくは前駆タンパク質の産物を意味する。ポリペプチドは、さらにまたグリコシル化、タンパク質分解性切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化などを含むことができるがそれらに限定されない成熟もしくは翻訳後修飾もまた受ける。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。
【００２６】
本明細書で使用する「ポリペプチド複合体」は、一緒に集合して因子の会合単位を形成するタンパク質およびポリペプチドを説明することが意図されている。ポリペプチド複合体のメンバーは、非共有もしくは共有結合によって相互作用することができる。典型的には、ポリペプチド複合体のメンバーは協働して、ＤＮＡまたは既にＤＮＡと会合もしくは結合しているポリペプチドおよびタンパク質（すなわち、クロマチン）のいずれかへの結合を可能にする。クロマチン会合ポリペプチド複合体は、細胞状態および細胞周期内での位置に依存して、各々がその複合体と永続的に会合できる、または一時的に会合できる他のポリペプチドと相互作用するために機能する複数のタンパク質および／またはポリペプチドを含むことができる。したがって、特定のポリペプチド複合体は、様々な生理学的条件に応答して、または細胞周期の因子として、様々な発達段階でそれらの構成メンバーが変動する可能性がある。例えば、動物では、公知のクロマチンリモデリング活性を備えるポリペプチド複合体には、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ（ポリコーム）群遺伝子サイレンシング複合体ならびにＴｒｉｔｈｏｒａｘ群遺伝子活性化複合体が含まれる。
【００２７】
用語「単離された」は、核酸もしくはポリペプチド配列に適用される場合は、その天然起源生物から取り除かれている配列である。典型的には、単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチド／核酸分子は、それが産生された環境から取り除かれているが、必ずしも精製されている訳ではない。つまり、単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、必ずしも１００％純粋ではなく、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％純粋であってよい。精製されて単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、有益には少なくとも８０％純粋であり、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％純粋（例えば、９９％純粋）である。本発明の状況では、用語「単離された」は、ポリペプチドに適用される場合は、それが天然形、変性形、二量体／多量体形、グリコシル化形、結晶化形、または誘導体化形のいずれであろうと、また別の物理的形態にある同一ポリペプチドを含むことが意図されている。有益には、本発明の核酸分子／ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド（例えば、核酸プローブ、ＲＮＡｉ分子など）、およびポリペプチド／ペプチド（例えば、抗体またはそれらのフラグメント）は単離され、より有益には精製される。
【００２８】
クロマチンは、大多数の真核細胞の核内に存在するゲノムＤＮＡの凝縮構造である。クロマチンはＤＮＡおよび複数のＤＮＡ結合タンパク質ならびに所定のＲＮＡを含んでいる。用語「クロマチン（染色質）」は、この細胞物質が所定の化学染料を用いた染色を維持する容易さ（クロマティシティ）に由来する。クロマチンは主として、塩基性ヌクレオソーム構造を一緒に形成するヒストンタンパク質と会合しているＤＮＡから構成される。ヌクレオソームは、その周囲に長さが１４６ｂｐの一続きの二本鎖ＤＮＡが巻き付けられている１オクテットのヒストンタンパク質を含んでいる。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４はヌクレオソームの一部であるが、ヒストンＨ１は、より高次の構造へ隣接ヌクレオソームと一緒に結合するように作用することができる。より高次の構造への組立ては、ＤＮＡのより大きなパッキング、または凝縮を許容する。クロマチンは、凝縮されていない能動的に転写されたＤＮＡおよび凝縮されたＤＮＡ各々に対応する２つの主要な状態として、ユークロマチンおよびヘテロクロマチンがみられることがしばしば言及されている。その他の多数のポリペプチドおよびタンパク質複合体は、ユークロマチンおよびヘテロクロマチン状態間の移行を媒介するためにヌクレオソームおよびヒストンと相互作用する。これらの極めて重要なクロマチン会合タンパク質および複合体の多くの同一性および機能的活性は、現時点では未知である。
【００２９】
エピジェネティクス（後成学）は、細胞もしくは多細胞生物からその子孫への情報の伝播であって、その情報が遺伝子のヌクレオチド配列内でコード化されない伝播に関する。後成学的制御は、典型的に、ＤＮＡまたはクロマチン構造の化学修飾によって確立される。遺伝子発現は、一部の場合には、ＤＮＡと会合している、またはＤＮＡに結合することのできるポリペプチドへの化学基の共有結合によって調節することができる。例えば、ヒストン類のメチル化、ＳＵＭＯ化、リン酸化、ユビキチン化および／またはアセチル化は、これらの後成的修飾が発生しているゲノムの領域内での遺伝子発現の活性化または不活性化をもたらすことができる。後成的修飾は、生物の正常発達における様々な時点に、さらにまた正常細胞からがん性細胞への形質変換中にも発生する可能性がある。そのような修飾は、所定の遺伝子の不活性化もしくは活性化を生じさせることが多い。がんでは、腫瘍細胞の大多数が異常なＤＮＡの後成的インプリントを提示することが明確に証明されている（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ ＡＰ ＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ １（５８９５）：８９−９２）。
【００３０】
本明細書で使用する用語「がん」は、新生物内に所在する、または新生物に関連する特性を備える組織または細胞を意味する。新生物は、典型的に正常組織および正常細胞からそれらを識別する特性を有している。特にそのような特性には、一定の退生、細胞形態の変化、形状の不規則性、細胞付着性の減少、転移する能力、血管形成のレベル上昇、細胞侵襲性の増大、細胞アポトーシスのレベル減少、および細胞悪性度の全般的増加が含まれるがそれらに限定されない。「がん」に関連する、同義であることの多い用語には、肉腫、がん腫、腫瘍、上皮腫、白血病、リンパ腫、ポリープ、形質転換、新生物などが含まれる。
【００３１】
本発明の１つの実施形態は、特定標的クロマチン部位、遺伝子もしくは一続きの核酸、例えばＤＮＡと会合するタンパク質、ポリペプチドおよびタンパク質複合体を同定するための方法の開発にある。本方法は、プローブ−標的がハイブリダイズした配列の単離を可能にする親和性タグを用いて標識された高特異性核酸プローブを利用する。当該のタンパク質が特異的ゲノム領域に局在するかどうかを決定するために、標準アプローチは、固定された核上で免疫染色法およびＤＮＡ蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（イムノ−ＦＩＳＨ）法を結合してきた。しかし、従来型ＤＮＡ捕捉／ＦＩＳＨプローブおよび標準ＦＩＳＨ試薬を使用して標的クロマチンを回収しようとする以前の試みは、常に極めて低い収率および非特異的タンパク質による高度の汚染に悩まされてきた。本発明の方法は、標的部位に存在する可能性がある、または可能性がないタンパク質のいずれかについての予備知識の必要を伴わずに、規定標的部位での任意および全てのＤＮＡおよび／またはクロマチン会合タンパク質の同定を可能にするという利点を示す。そこで、本発明の方法は、既にＤＮＡに結合している公知のタンパク質抗体標的の存在に依存する、例えばＣｈＩＰなどの免疫沈降法に基づく技術に比して相当に大きな利点をさらに示す。また、まれであるが、抗体が架橋結合した抗原を定量的に沈降させる場合は、ＣｈＩＰは、目的のタンパク質を含有する遺伝子座の混合物以外の単一遺伝子座の精製を許容しない。本発明の方法はさらに、クロマチン／ＤＮＡ会合タンパク質複合体における変化を様々な細胞状態下で同様に監視することもまた可能にする。
【００３２】
図１には本発明の特定の実施形態を概説する。手短には、細胞を固定し、クロマチンを可溶化し、特異的プローブをクロマチンにハイブリダイズさせ、次にハイブリダイズしたクロマチンを磁気ビーズ上で捕捉し、ハイブリッドを溶出させ、タンパク質を同定する。例えばホルムアルデヒドなどの物質を用いた広汎な架橋結合を使用すると、タンパク質−ＤＮＡおよびタンパク質−タンパク質相互作用を維持することができる。抗体抗原親和性に基づく戦略とは相違して、核酸ハイブリダイゼーションはイオン性洗剤の存在に非感受性であるので、汚染を制限するために全体を通してこれらの洗剤の使用を可能にする。プローブ−クロマチン相互作用の安定性を増加させるためには、オリゴヌクレオチドを含有するロックされた核酸（ＬＮＡ）をプローブとして使用するが、これは、ＬＮＡ残基は塩基のスタッキング（積み重ね）に好都合であり、それによってそれらの融点を有意に増加させる変化したバックボーンを有しているためである（Ｖｅｓｔｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１３２３３−１３２４１）。クロマチンの固定化後に観察される立体障害（収率にとって有害）を最小限に抑えるために、固定化タグとＬＮＡプローブとの間は極めて長いスペーサー基である。適切なスペーサーには、長鎖脂肪族基が含まれる、またはスペーサーは、例えばＭｏｒｏｃｈｏ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００５）２８８，２２５−２４０）によって記載されたようなメトキシオキサルアミドおよびスクシンイミド前駆体から合成することができる。最後に、非特異的因子の共溶出は、アビジンに対してより弱い親和性を備えるビオチンアナログであり、ビオチンを用いた競合的な穏和な溶出を許容するデスチオビオチンを用いることによって限定される。
【００３３】
本発明のまた別の特定の実施形態では、テロメラーゼ陽性がん細胞およびＡＬＴ（テロメアの選択的伸長）がん細胞タイプにおけるテロメア配列と会合しているタンパク質複合体が本発明の方法によって同定された。テロメア配列中に存在して会合していると予想されるタンパク質およびタンパク質複合体に加えて、驚くべき、そして予想外の数の追加のポリペプチドが同定された。一部のポリペプチドは以前にクロマチンと会合すると予想されていなかった公知のタンパク質を含んでいたが、他の公知のクロマチン会合タンパク質はテロメアに局在すると新規に同定された。そこで本発明は、新規なクロマチン会合活性を備えるポリペプチドの同定および単離をさらに提供する。
【００３４】
したがって、本発明はさらに、クロマチン会合活性を有すると新規に同定される、したがって新規な後成的因子として作用する可能性があるサブセットのポリペプチドを提供することにある。本発明は、また別の後成的因子の同定、および重要にも、公知のポリペプチドにおける新規な後成的活性の同定を促進する。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明は、それによりゲノム内の規定部位でクロマチンと会合しているポリペプチドおよびタンパク質複合体の構成要素を特性付けることのできる方法を提供する。本発明の方法は、単にＤＮＡ結合しているポリペプチドには限定されず、例えばヒストン結合活性を備えるポリペプチドなどの会合したポリペプチドを含むことに留意されたい。
【００３６】
より詳細には、本発明の方法は、親和性標識された核酸プローブ配列が当該のクロマチン標的を含むサンプルの染色体材料の標本に特異的にハイブリダイズする第１ステップを含むことができる。このプローブは、ＤＮＡ内の規定標的配列とハイブリダイズするように設計される。標的配列は、適切には固有の遺伝子配列、反復配列、またはより高次の構造形成における役割を有することが公知の配列を含むことができる。プローブ配列は、ゲノムＤＮＡ内の標的配列だけが結合されるような濃度およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で導入される。
【００３７】
プローブは、１つ以上の適切な親和性タグで標識される。親和性タグは、免疫タグもしくはハプテンを含むことができる。例えば、プローブ配列内に含有された１つ以上のヌクレオチドは、（ビオチンもしくは例えばデスチオビオチンなどの適切なビオチンアナログのいずれかを用いて）ビオチン化することができる。また別の親和性標識には、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノールもしくはフルオレセイン、ならびに例えばポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＨＡおよびＭｙｃタグなどの抗原性ペプチド「タグ」を含むことができる。当該のサンプル中において高いコピー数で存在する標的配列については、プローブは、典型的には単一タイプの親和性標識しか含まない。例えば生物のゲノム内の単一コピー配列などの低濃度の標的に対しては、場合により本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、１つより多いタイプのタグを含むことができる。例えば、本発明の１つの実施形態では、真核細胞内の単一コピープロモーター領域に向けられたオリゴヌクレオチドプローブは、デスチオビオチンおよびジゴキシゲニンの両方で標識されたＬＮＡヌクレオチドを含んでいる。本発明のプローブ内への１つより多い親和性タグの包含は、低コピー数標的のためのプロセスの感受性を大きく増加させることができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションステップの前に、分解能を増加させ、プローブ−標的配列ハイブリッドの「プルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）」を包含している本方法の次のステップを促進するために、クロマチンは、部分的に酵素的に消化されることができる。または、クロマチンは、例えば超音波処理などの物理的方法によって、もしくは物理的および酵素的アプローチの組み合わせによって断片化することができる。
【００３９】
「プルダウン」ステップは、親和性タグに係合し、ハイブリダイズした配列を単離することを可能にする結合成分の使用によって促進される。ビオチン化プローブ配列の場合には、ハイブリダイズした配列の単離は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロビーズにハイブリダイズした配列を曝露するステップによってインビトロで実行することができる。この方法で、ハイブリダイズした配列はビーズに結合し、単純な微量高速遠心ステップによって溶液から沈降させることができる。または、マイクロビーズが磁場への曝露によってビーズを固定化することを可能にする磁気成分を含むことができる（図１を参照されたい）。また別の単離戦略には、例えばマイクロアレイ支持体もしくはディップスティック（計量棒）などの固体基質上にプローブを含有するＬＮＡの固定化が含まれる。この方法では、「プルダウン」は、表面上の特定領域への局在化によって促進され、これは後に会合したポリペプチドの表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間形質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）において使用するために適するように適切に適応させることができる。
【００４０】
精製された、もしくは「プルダウン」されたハイブリダイズした配列は、標的配列に結合している任意の会合したクロマチンポリペプチド、タンパク質およびポリペプチド複合体と一緒に標的配列にハイブリダイズした親和性標識プローブを含んでいる。これらの会合したクロマチンポリペプチド、タンパク質およびポリペプチド複合体は、プルダウン材料から標準のタンパク質沈降ステップによって単離することができ、そして必要であれば電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー技術（例えば、ＨＰＬＣ）によって分離することができる。
【００４１】
クロマチン会合タンパク質およびポリペプチドは、ペプチド質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）の質量分析法に基づく技術を適切に含む、例えば高スループットポリペプチド同定プロトコールなどによって分析すると、それらの同一性を決定することができる。または、公知のクロマチン会合複合体の組成における質的変化は、当該の複合体の構成メンバーに向けられる抗体アレイ技術を用いて監視することができる。
【００４２】
本発明の方法は、特定タイプのゲノムＤＮＡには限定されないこと、そして会合したタンパク質およびポリペプチドプロファイルを同定するためにゲノム内の実質的にあらゆる標的配列に向けることができることが理解される。さらに、任意の所与の配列については、本方法は発達、細胞周期または細胞の外部刺激への曝露後の様々な時点に使用することができる。したがって、本発明の方法は、特異的標的配列と会合しているタンパク質およびポリペプチドにおける変化の詳細なプロファイリングを監視することを許容できる。さらに、本発明の方法は、新規なＤＮＡおよびクロマチン会合タンパク質およびポリペプチド因子の同定を可能にするが、それらの多くはこれまで後成的活性、ＤＮＡ結合もしくはクロマチン会合活性を有するとは考えられていなかった公知のタンパク質であってよい。遺伝子座に結合したタンパク質の同一性に関する情報を提供することに加えて、本発明は、別個の細胞タイプにおける所与の配列へ結合した豊富なタンパク質の相対レベルに関する情報を提供する。例えば、テロメアについて使用するための本発明の方法を開発する経過において、本発明者らは、ＨｅＬａ−１．２．１１細胞由来のテロメア標本に比較してＨｅＬａ−Ｓ３細胞由来のテロメア標本における方がヒストンの数が少ないことに気付いた。
【００４３】
本発明の特定の実施形態では、ヒトがん細胞中の特定のテロメア反復配列と会合しているタンパク質およびポリペプチドが同定された。脊椎動物では、配列（ＴＴＡＧＧＧ）nは、染色体のテロメア領域（ヒトでは約５〜１５ｋｂ）内で繰り返され、ゲノム全体のおよそ０．０１〜０．０３％を表すことができる。この反復配列は、相対的に高い濃度、したがって核酸プローブを用いてターゲティングすることの相対的容易さのために選択された。核酸プローブはビオチン−アナログ標識ヌクレオチドを含んで、さらに標的テロメア反復配列に対するプローブの特異性を実質的に増加させるように機能したロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドもまた組み込んでいた。複数のタンパク質およびペプチドが、テロメアを損傷から保護すると考えられているタンパク質のｓｈｅｌｔｅｒｉｎ（シェルテリン）ファミリーのメンバーなどの公知の候補を含めて、標的配列と会合していると同定された。公知のテロメア会合タンパク質およびポリペプチドに加えて、以前には染色体のテロメア領域と結合する、もしくは会合することが公知ではなかった驚くべき数のポリペプチドおよびタンパク質が同定された。これらの新規なテロメア会合因子は、今後の研究のための、特に創薬標的として前途有望な標的を表す。表１〜３は、本発明の方法によって同定された新規なテロメア会合クロマチン因子を示している。同定された因子の幾つかは、翻訳後修飾のための標的であることが公知であることを見て取ることができる。
【００４４】
本発明のまた別の実施形態では、低存在度の標的が考察される。例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：ミバエ）では、Ｆａｂ−７領域はＡｂｄｏｍｉｎａｌ−Ｂという名称のホメオティック遺伝子の転写状態の維持に責任を負っている単一コピークロマチンフラグメントを表している。このフラグメントはＰｏｌｙｃｏｍｂ応答エレメントという名称を付けられ、遺伝子のＰｏｌｙｃｏｍｂおよびＴｒｉｔｈｏｒａｘ（トリソラックス）グループの因子を動員する。キイロショウジョウバエにおけるＦａｂ−７部位の機能に関する理解は、高等真核生物における後成的状態の維持を理解するために極めて重要であるが、それは基本的なクロマチン調節は典型的にマウスおよびヒトなどの高等生物において保存されているからである。Ｆａｂ−７に結合する複合体内に含まれるクロマチン会合ポリペプチドおよびタンパク質は、幹細胞療法の有効性を改良するために極めて重要であると考えられ、数種のがんにおいては異常調節される可能性がある。Ｆａｂ−７は、高度に反復性であるテロメアに比較して標的にとってより複雑な配列である。その結果として、Ｆａｂ−７は、重複法もしくは連続法でその領域を被覆するためには数種の別個のプローブの使用を必要とするが、これは標的領域の全長に沿って単一プローブがハイブリダイズできるテロメアとは相違している。
【００４５】
本発明のまた別の実施形態は、感染したヒトＴ細胞系のゲノム内に統合されているＨＩＶプロモーター（プロウイルスのＬＴＲ内に所在する）を標的とする。このプロモーターの調節に関する理解は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの病因学および分子学的メカニズムを決定する際に極めて重要である。詳細には、プロウイルスはある期間にわたってサイレントのままでいられることは公知であり、感染細胞の保菌者が療法から漏れる理由を理解することが極めて重要であるが、それはそれらの細胞がいわゆる「休眠」ウイルスを含有しているからである。関連する後成的成分およびＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの領域内でのクロマチンの状態を決定することができれば、疾患のメカニズムに関する詳細な洞察を可能にし、それによりＨＩＶ療法のための新規な候補薬物標的を同定する。本発明は、休眠性または活性の２つの状態をモデリングするヒトＴ細胞系内のＨＩＶ ＬＴＲ領域でのクロマチン組成間の比較を可能にし、これはさらにＨＩＶ／ＡＩＤＳのための新規な薬物療法を設計する際に有用である重要なデータを提供する。
【００４６】
本発明のプローブ核酸配列は、有益にも１つ以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含むことができる。ＬＮＡヌクレオチドは、リボース成分内に２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋を含有する二環式ＲＮＡアナログである。メチレン架橋はリボフラノース環の柔軟性を制限し、この構造を合成Ｃ３−ｅｎｄｏ立体配置内へ「ロック」する。この方法でヌクレオチドの立体配置を変化させることによって、結果として生じるオリゴマー／ポリマープローブは、強化されたハイブリダイゼーション性能および生体内安定性を示す。長さが約１５ヌクレオチド未満であるオリゴマープローブ配列は、適切には１００％までＬＮＡを含むことができる。典型的に、長いプローブ配列は、ＬＮＡおよび従来型ＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレオチドの混合物を含んでいる。ＬＮＡ含有プローブ配列は、ＩＳＨ適用（Ｓｉｌａｈｔｏｒｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １０７：３２−３７）およびＴｏｌｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｌｙ １；３１（１３）：３７５８−３７６２）に記載されたプローブ配列設計のための技術のための特別な適合性を証明した。
【００４７】
本発明の特定の実施形態におけるオリゴヌクレオチドプローブは、以下に記載する一般式Ｉ：
【化４】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基ＣによってヌクレオチドＸに連結された親和性標識を含んでいる）に一致する少なくとも１つの基を含んでいる。典型的には、Ａは、ハプテンを含んでいる。本発明の特定の実施形態では、Ａは、ビオチン、または例えばデスチオビオチン分子などのそのアナログを含んでいる。ヌクレオチドＸは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択することができる。スペーサー基の長さは、ｎが適切には約４０〜約１７０原子、より適切には約７５〜約１３０原子、より典型的に約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子であるような長さである。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、以下に記載する一般式ＩＩ：
【化５】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基Ｃによってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結されている免疫タグもしくはハプテンである）に一致する。オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチド、典型的にはヌクレオチドの少なくとも２５％がロックされた核酸ヌクレオチド、場合によりヌクレオチドの１００％までがロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでいる。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが２５ヌクレオチドであり、およそ５０％のＬＮＡおよび５０％のＤＮＡヌクレオチドを含んでいる。スペーサー基Ｃの長さは、ｎが適切には約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子であるような長さである。場合により、スペーサー基はオリゴヌクレオチドＹの５’ヌクレオチドに結合され、５’ヌクレオチドは場合によりロックされた核酸ヌクレオチドである。
【００４９】
本発明のまた別の特定の実施形態は、以下に記載する一般式ＩＩＩ：
【化６】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、該ヌクレオチドＺおよびＷは長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供する。本発明の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドＺが該オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表すように、一般式ＩＩＩの基を含んでいる。式ＩＩＩの基を含むプローブは、例えば単一コピー数配列などの低発生頻度を有するクロマチン内の配列（例えば、特定遺伝子）をターゲティングするために特に適合する。ヌクレオチドＺとＷとの間の分離は、通例は長さがほぼ０〜４０ヌクレオチド、好ましくは１〜３０ヌクレオチドである介在オリゴヌクレオチド鎖Ｖによって証明される。典型的に、少なくともヌクレオチドＺおよびＷはロックされたリボヌクレオチドである。適切には、スペーサー基ＣおよびＣ’は、長さが同一であっても相違していてもよい。本発明の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、式ＩＩＩの１つ以上の基を含むことができる。
【００５０】
プローブ核酸配列は、例えばゲノムＤＮＡ内で出現する任意の配列に向けることができる。有益にも、本発明は、コーディング配列もしくは非コーディング配列に限定されず、さらにまたゲノムの真正染色質領域とともに使用することにも限定されない。標的配列が例えばテロメア反復配列などの反復配列を含む場合は、プルダウンを実行するためには単一プローブ種で十分であることが多い。固有もしくは低頻度の反復配列が標的とされる場合には、標的遺伝子座の連続する、重複する、もしくは密接して位置する領域へ結合する２つより多いプローブの組合わせを使用することが必要になる場合がある。本発明の使用実施例では、マウス挟動原体ヘテロクロマチンの精製は、標的配列のおよそ２５％までとハイブリダイズする３種のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて達成される。しかし、プルダウン反応を最適化するためには、プローブによってより多くの標的配列がカバーされるほど、収率が大きくなる。
【００５１】
規定標的配列と会合することが見いだされたタンパク質およびポリペプチド因子の同定は、多数の経路を通して達成することができる。典型的には、タンパク質およびポリペプチドは、従来型タンパク質抽出技術によってプローブ−標的配列ハイブリッドから分離される。次にタンパク質／ポリペプチドは、適切には分子量にしたがって大まかに精製される。分離されたタンパク質は、ウエスタンブロッティングを含む、同一性を決定するための数種の方法によって分析できる。しかし、本発明の方法の成果が１つ以上の新規な因子を解明することである場合は、タンパク質同定のための質量分析法に基づく技術が適切に利用される。例えば、タンパク質サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥから抽出することができ、その後に場合により、例えばシステインアミノ酸残基のジスルフィド架橋カルボキシメチル化の減少や、別の化学修飾を受けさせられる。次にタンパク質／ポリペプチドは、例えばトリプシンなどの適切なタンパク質分解酵素を用いて幾つかのフラグメントに切断させられる。タンパク質分解ステップは、典型的に一晩にわたって実施され、次に結果として生じる切断したペプチドはアセトニトリルで抽出され、真空下で乾燥させられる。次にペプチドは、少量の蒸留水中に溶解させられ、これで質量分析法による分析の準備が整う。質量分析法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法による精製されたペプチド切断フラグメントのアリコートについて実施できる。次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦからの成果は、典型的にバイオインフォーマティクスの分析技術を使用してインシリコ（コンピュータ内）で分析され、新規な因子についての配列情報を同定および提供するためにＧｅｎＢａｎｋもしくはＳｗｉｓｓＰｒｏｔなどのオンラインのタンパク質データベースにクエリー（問い合わせ）するために使用される（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．９（１５）：１５４６−５１；ａｎｄ Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅ ＆ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：４８７−５１１を参照されたい）。
【００５２】
典型的には、ポリペプチド同定のための質量分析法に基づく技術は、Ｐａｐｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．（１９９３）Ｊｕｎ １；３（６）：３２７−３２）の後にはポリペプチド質量フィンガープリンティング（「ＰＭＦ」）法と呼ばれている。ＰＭＦは、インシリコでペプチドについて生成された理論的ペプチド質量へ構成フラグメントの分子量（ペプチド質量）をマッチさせることによってタンパク質を同定することができる。ＰＭＦの前提は、各ポリペプチドが固有のペプチド質量を各々備える固有セットのペプチドフラグメントを有することである。所与のポリペプチドの同定は、ＰＭＦ配列データベース内に存在する理論的質量へ入手したペプチド質量をマッチさせるステップによって遂行される。ＰＭＦの同定は、その質量が正確に公知である所与のタンパク質から入手した幾つかのペプチドフラグメントが存在する場合に最適化される。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、これらのペプチドフラグメント各々の質量を決定するための特に精度の高い手段を提供する。プロテオミックアプローチを使用すると、質量分析法によって同定されたペプチドおよびタンパク質から構成されるタンパク質複合体の性質を決定することができる（例えば、Ｇｉｎｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００７）Ａｕｇ；８（８）：６４５−５４を参照されたい）。
【００５３】
用語「調節因子」は、標的分子（例えば、遺伝子、酵素など）の活性を変化させる分子（例えば、化学物質／実体）を意味する。活性の変化は、調節因子の非存在下、さもなければ類似の条件下では活性の正常もしくはベースラインレベルに比例し、正常／ベースライン活性の増加または減少を表す場合がある。調節因子は、例えば低分子薬、抗体もしくは核酸などの本明細書で記載する任意の分子であってよい。本発明の状況では、標的は、本発明のスクリーニング法によって同定されている新規なクロマチン会合因子である。クロマチン会合因子の調節は、当業者には公知の任意の手段によって、例えば、クロマチン会合因子によって調節される遺伝子の発現における変化を同定するステップによって評価することができる。
【００５４】
本発明は、本発明の方法によって同定された１つ以上の新規なクロマチン会合因子の修飾された発現に関連する疾患を治療するための方法および組成物にさらに関する。
【００５５】
規定のクロマチン会合因子の発現および／または生物活性を阻害するための試薬には、アンチセンス核酸分子、ｓｉＲＮＡ（もしくはｓｈＲＮＡ）、リボザイム、低分子、および抗体またはそれらの抗原結合部分が含まれるがそれらに限定されない。核酸をベースとする技術を調査するためには、例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．（２００３）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１６２８−１６４４を参照されたい。クロマチン会合因子を阻害するための試薬は、発現および／または生物活性へ、例えば遺伝子発現に影響を及ぼす、または新規なクロマチン会合因子の生物活性を修飾もしくは阻害する因子に作用することによって、間接的に影響を及ぼすことができる。有益にも、本明細書で同定される新規なクロマチン会合因子の１つの阻害剤として使用するための試薬は、クロマチン会合因子に直接的に作用して、ｍＲＮＡレベル（例えば転写もしくはｍＲＮＡ安定性）、またはタンパク質レベル（例えば、翻訳もしくは生物活性）での遺伝子発現に影響を及ぼす。
【００５６】
所与のｍＲＮＡと相補的であり、インビボでハイブリダイズするアンチセンス核酸配列を設計することができる。アンチセンス核酸配列は、規定のクロマチン会合因子のためのｍＲＮＡの配列の全部もしくは一部へハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の形態にあってよい。典型的には、アンチセンス分子は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであり、選択された標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば１２、１５、１８、２０、３０、４０、５０、１００、２００ヌクレオチド以上などの任意の合理的長さであってく、有益にもその対応する標的ヌクレオチド配列と上述の相補性を有する。
【００５７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば天然ヌクレオチドであるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵに似ているが、化学修飾されているヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド（もしくはヌクレオチド誘導体）を含有していてよい。化学修飾は、例えば、インビボでのオリゴヌクレオチドの半減期を増加させるために内因性エキソおよび／またはエンドヌクレアーゼによる分解に改良された抵抗性を提供すること、標的細胞もしくは膜へのオリゴヌクレオチドの送達を強化すること、またはオリゴヌクレオチドの生体内利用率を増加させることに有益な可能性がある。典型的には、アンチセンス分子は、修飾および天然ヌクレオチドの混合物を含有し、および特に、５’最末端および／または３’最末端ヌクレオチド（例えば、鎖の各末端での最外側の２つのヌクレオチド）はインビボでのアンチセンス分子の半減期を増加させるように修飾することができる。さらに、または、アンチセンス分子のバックボーンは、例えばヌクレアーゼによる分解に対する耐性を増加させるために、化学修飾することができる。典型的なバックボーン修飾は、１つ以上のホスホジエステル結合からホスホロチオエート結合への変化である。アンチセンス分子は、適切にはさらにヌクレアーゼの存在下でアンチセンス分子の半減期を増加させるように作用する、５’キャップ構造および／またはポリＡ３’テールをさらに含むことができる。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボの標的組織および細胞内で本発明の方法によって同定された１つ以上のクロマチン会合因子の発現を阻害するために使用できる。または、そのような分子は、エクスビボ（生体外）処置、またはインビトロ診断試験において使用することができる。
【００５９】
特異的標的遺伝子に対するアンチセンス分子を（その対応するＲＮＡ配列によって）設計および合成するための要件、細胞内にアンチセンス分子を導入して発現させるための方法、そしてそのようなアンチセンス分子を修飾するための適切な手段は、当業者には公知である。
【００６０】
例えば、療法において使用するためのアンチセンス分子は、腫瘍の部位で（例えば、腫瘍の細胞塊内への注射によって）直接的に患者へ投与することができる、または腫瘍細胞内へトランスフェクトされるベクターから転写させることができる。遺伝子療法ベクターを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、例えば、適切なリポソーム送達系もしくはウイルスベクターを用いて達成できる（Ｈｕｇｈｅｓ，２００４，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，８５（１）：２８−３５）。
【００６１】
例えばクロマチン会合因子遺伝子などの標的遺伝子を特異的にダウンレギュレートするまた別の手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用することである。当然ながら、ＲＮＡｉは、典型的には、長い二本鎖ＲＮＡ分子によって開始され、この分子はＤｉｃｅｒ酵素によって５’および３’末端で２本のヌクレオチドオーバーハングを有する２１〜２３ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡ内へと処理される。結果として生じる短いｄｓＲＮＡ分子は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知である。次にこれらの短鎖ｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡを分解するための内因性ヌクレアーゼのためのガイドとして作用するタンパク質−ＲＮＡ複合体であるＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内へ組み込まれると考えられる。
【００６２】
短鎖（例えば、１９〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）はＲＮＡｉを開始することができること、そしてそのような分子は、例えばＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８）に記載されたように、インビボでの遺伝子機能の選択的不活性化を可能にすることが証明されている。そこで、この技術は、インビボでの細胞内のクロマチン会合因子をコードするｍＲＮＡの効果的および特異的なターゲティングおよび分解のための手段を提供する。したがって、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子、および本発明の方法によって同定された１つ以上のクロマチン会合因子の細胞内での発現を特異的に減少または排除するためのそれらの使用を提供する。
【００６３】
アンチセンスおよびリボザイム技術の場合と同様に、インビボ使用のためのｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子は、有益にも１つ以上の化学修飾ヌクレオチドおよび／または１つ以上の修飾バックボーン連鎖を含有している。
【００６４】
本発明の医薬製剤は、規制基準に適合するように調製され、経口、静脈内、局所、またはその他の標準的経路によって投与することができる。本医薬製剤は、錠剤、ピル剤、ローション剤、ジェル剤、液剤、散剤、坐剤、懸濁剤、リポソーム、微粒子または当分野において公知の他の適切な調製物の形態にあってよい。
【００６５】
そこで、本発明は、疾患を治療するために本発明の新規なクロマチン会合因子の活性または発現を調節もしくは変調することのできる分子の使用を含んでいる。典型的にクロマチン会合因子の異常な活性もしくは発現に関連する疾患には、がん、早期老化、炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス誘導性疾患ならびに感染症および不妊症が含まれる。
【００６６】
本発明の方法によって同定された新規なクロマチン会合因子（ポリペプチドもしくはそのフラグメント）は、薬物スクリーニングにおいて使用するためのトランスジェニック細胞系および精製因子を作製するために、個別に、または組合わせて組換え発現させることができる。クロマチン会合因子もしくはそのフラグメントを過剰発現する細胞系は、例えば、化合物（例えば「低分子」）、抗体もしくはその他の生物学的物質のライブラリーに対する高スループットスクリーニング法において使用できる。これらのスクリーニングアッセイは、適切には規定の表現型変化が（ＧＰＣＲ−ＦＬＩＰＲスクリーニングにおけるカルシウムシグナリングに類似して）同定されるセルベース・アッセイであってよい、または例えば放射性リガンド結合および蛍光偏光などの親和性ベースのスクリーンにおいて使用するための高レベルの精製タンパク質源として機能することができる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態では、新規なタンパク質およびポリペプチドクロマチン会合因子は、ＡＬＴテロメア配列単独、ＨｅＬａテロメア配列単独または両方に局在すると同定された（表１〜３を参照されたい）。これは、この技術が様々な細胞環境間を識別できることを証明している。テロメア組成における変化は、がんの進行および発達において重要であると考えられ、テロメア会合のような本アッセイにおいて同定された様々なタンパク質セットは、様々ながんタイプにおける有用な治療的介入点を形成する標的および経路の同定をもたらすことができる。サブセットのこれらの因子についての詳細な精査は、酵素活性を有するタンパク質の同定をもたらした。酵素機能を有する因子は、創薬における前途有望な将来性を示せることは理解される。本発明の範囲を限定せずに、新規なテロメアクロマチン会合因子の選択について、それらの公知の酵素活性と一緒に下記でより詳細に記載する。明らかに、本発明はそれらを潜在的薬物標的として一層より重要にさせるこれらの既知のタンパク質の生物活性に関する追加の情報を提供することができる。
【００６８】
＜ＡＬＴ細胞のみ＞
このセクションで同定された酵素は、ＡＬＴテロメア維持経路が活性化されている患者における腫瘍学標的としての将来性を有することができ、そして非ＡＬＴ、すなわち同一患者における非がん細胞に関するある程度の選択性を達成するためのメカニズムを提供することができる。
Ｐｒｉ−２
Ｈｉｎｔ２
ＭＴＡ１
Ｐｉｎ−１
ＬＳＤ１
【００６９】
＜ＰＲＩ−２＞
これは、ヒトにおけるＰＲＩＭ２Ａとしても公知であるＤＮＡプライマーゼの大きなサブユニット（５８ｋＤａ、ｐ５８）である。このタンパク質は、小さなサブユニットであるｐ４９の存在下では酵素的にのみ活性であると考えられる。
【００７０】
＜Ｈｉｎｔ２＞
Ｈｉｎｔ２は、以前は機能が不明確であったアデノシンモノホスファート・リシンヒドロラーゼである。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００６）１３０：２１７９−２１８８）は、これが腫瘍学における潜在的薬物候補ではないことを示唆する多数の観察所見を報告したが、それはＨｉｎｔ２レベルが肝細胞がん腫においてはダウンレギュレートされ、ＨｅｐＧ２細胞におけるＨｉｎｔ２のノックダウンはアポトーシス性刺激への感受性の低下をもたらすからである。同一系におけるＨｉｎｔ２の過剰発現は逆作用を有し、ＨｅｐＧ２異種移植片におけるＨｉｎｔ２の過剰発現は腫瘍サイズの減少をもたらす。本出願に提示したデータは、Ｈｉｎｔ２のテロメア局在がその細胞機能において重要であることを示唆している。
【００７１】
＜ＭＴＡ１＞
ＭＴＡ１は、ヌクレオソームのリモデリングおよび脱アセチル化（ＮｕＲＤ）複合体の構成要素であり、その発現は少なくとも一部にはｃ−Ｍｙｃによって転写レベルで制御される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００５，Ｖｏｌ．１０２，１３９６８−１３９７３）。ＭＴＡ１は、さらにまたエストロゲン受容体コリプレッサーであることも公知である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，２００６，Ｖｏｌ．９５，７−１２）。ＭＴＡ１は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２を備える複合体内で作用する（Ｙａｏ ＆ Ｙａｎｇ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，４２５６０−４２５６８）。
【００７２】
転移関連遺伝子１（ＭＴＡ１）は、胸腺腫（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２００１，Ｖｏｌ．１７４，１５９−１６３）および前立腺がん（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４，Ｖｏｌ．６４，８２５−８２９）を含む多数の腫瘍の侵襲性、ならびに不死化角化細胞（Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２ Ｖｏｌ．２１，２１６１−２１７０）およびＰＡＮＣ−１膵臓がん細胞（Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００４，Ｖｏｌ．９０，４５５−４６２）の移動および侵襲と相関することが証明されている。相当に高度のＭＴＡ１発現を伴うヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞では、ノックダウンは増殖および侵襲の阻害を生じさせた（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２００３，Ｖｏｌ．２０，１９−２４）。ＭＴＡ１の高発現レベルは、肝細胞がんにおける相当に不良な予後と関連すると報告されてきた（Ｈａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２００３，Ｖｏｌ．１０，５９９−６０４）。リンパ節転移陰性乳がんでは、ＭＴＡ１の高発現には高い再発リスクが結び付いているが、そのような腫瘍は例えばタモキシフェンもしくはアントラサイクリン系などの全身性療法に感作される可能性がある（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，２００６，Ｖｏｌ．９５，７−１２）。
【００７３】
ＭＴＡ１が乳腺を標的として過剰発現させられたトランスジェニックマウスでは、不適切な乳腺発達および腫瘍形成が観察された（Ｂａｇｈｅｒｉ−Ｙａｒｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４，Ｖｏｌ．１３１，３４６９−３４７９）。
【００７４】
ＭＴＡ１が腫瘍侵襲性に影響を及ぼす可能性がある１つのメカニズムは、Ｈｉｆ−１αの転写活性およびタンパク質安定性の両方を増強することによる。タンパク質の安定化は、増加したＨＤＡＣ１発現を通しての増加したＨｉｆ−１α脱アセチル化による（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００６，Ｖｏｌ．２５，１２３１−１２４１）。これは、乳がんにおける上昇したＭＴＡ１レベルと腫瘍内微小血管密度との関係と一致している（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ２００６，Ｖｏｌ．９７，３７４−３７９）。
【００７５】
＜ＬＳＤ１＞
ＬＳＤ１は、同定された最初のヒストンデメチーゼラであり（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１２２，６５４−６５８）、ヒストンＨ３リシン４およびリシン９からモノメチルおよびジメチル修飾を選択的に取り除く。ＬＳＤ１は、アンドロゲン受容体と相互作用してアンドロゲン受容体依存性転写を刺激する（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，Ｖｏｌ．４３７，４３６−４３９）。ＬＳＤ１レベルは、高リスクの前立腺がんではアップレギュレートされる（Ｋａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，１１３４１−１１３４７）。ＬＳＤ１は、細胞増殖のために必要とされ、このタンパク質の欠乏症は部分的細胞周期停止および外部刺激による増殖抑制への感作をもたらす（Ｓｃｏｕｍａｎｎｅ ＆ Ｃｈｅｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００７，Ｖｏｌ．２８２，１５４７１−１５４７５）。これらの特徴は全部がＬＳＤ１を腫瘍学にとって魅力的な標的にさせる。これまでには報告されていないテロメアとの関連についての理由は、調査のための有益な領域を表している。
【００７６】
＜Ｐｉｎ−１＞
Ｐｉｎ−１は、多数の発がん経路および細胞シグナリング経路の異性化に含まれるペプチジルプロピルイソメラーゼである（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｖｏｌ．５６，５１−５８において精査されている）。Ｐｉｎ−１の過剰発現は非小細胞肺がん（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｖｏｌ．５６，５１−５８）、およびＢ型肝炎コーディングＨＢｘがん遺伝子と相乗作用的に機能する可能性がある肝細胞がん（Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．１３２，１０８８−１１０３）を含む多数のがんにおいて報告されてきた。Ｐｉｎ−１によるＳｔａｔ−３の活性化は、乳がん細胞における上皮細胞から間葉細胞への転移増加を引き起こす（Ｌｕｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，Ｊｕｎ １１、印刷出版に先行した電子出版）。マウスモデルでは、Ｐｉｎ−１およびｐ５３の二重除去は胸腺肥大の加速をもたらす（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００７，Ｖｏｌ．２６，３８３５−３８４５）。
【００７７】
したがってＰｉｎ−１は、創薬のための魅力的な腫瘍学標的である。しかし、Ｐｉｎ−１の活性はアルツハイマー病の病因に関係するとされたアミロイド発生経路において重要な保護的役割を果たすと思われる（例えば、Ｎｏｗｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２００７，Ｖｏｌ．４１９，１５−１７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ，２００７，Ｖｏｌ．１１，１３−２３；Ｂａｌａｓｔｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００７，Ｖｏｌ．１７７２，４２２−４２９を参照されたい）。このため、血液脳関門を越えないＰｉｎ−１阻害剤を発生させることが必要になる可能性がある。
【００７８】
＜ＨｅＬａ細胞のみ＞
一部のテロメア関連タンパク質は、ＨｅＬａ細胞においてのみ検出され、ＡＬＴ−陽性細胞系においては検出されなかった。これは、ＡＬＴテロメア維持系の使用が所定のタンパク質のテロメアへの局在化を誘導するだけではなく、これがさらにその他の会合も防止することを意味する可能性がある（ＨｅＬａテロメアは、テロメラーゼによって維持されるので、したがって例えばＧＡＲ１もしくはＢＡＴ１などのＡＬＴにおいて見いだされないテロメラーゼ会合タンパク質を予測することができる）。これは、さらにがんの療法における患者を階層化するためのメカニズムを提供できる。
Ａｕｒｏｒａ Ｂ
ＵＳＰ１
【００７９】
＜Ａｕｒｏｒａ Ｂ＞
ＡｕｒｏｒａキナーゼＢは、内部セントロメアタンパク質およびスルビビンと複合体を形成する染色体パッセンジャータンパク質である（Ｓｉｓｔａｙａｎａｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，Ｖｏｌ．２６，３５８５−３５９３によって精査された）。本発明者らのスクリーニング中に検出されたＨｅＬａ細胞におけるテロメアとの会合は、全く予想外である。異常なＡｕｒｏｒａ Ｂの活性は、肺（Ｈａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，４１１３−４１２２；Ｖｉｓｃｈｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００６，Ｖｏｌ．５，２９０５−２０１３）、口腔扁平上皮細胞がん（Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ，２００７，Ｖｏｌ．４５０，２９７−３０２）、乳がん（Ｔｃｈａｔｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２００７，Ｖｏｌ．２４７，２６６−２７２）、前立腺がん（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，４９９６−５００２）、神経膠芽細胞腫（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．６０，２１８−２２１）および中皮腫（Ｌｏｐｅｚ−Ｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００６，Ｖｏｌ．６６，２６７０−２６７９）を含む多数のがんにおいて重要であると考えられる。腎腫瘍の動物モデルでは、Ａｕｒｏｒａ Ｂの発現はエストロゲン応答性である（Ｈｏｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，２９５７−２９６３）。
【００８０】
Ａｕｒｏｒａ Ｂの低分子阻害は中皮腫細胞を放射性増感させ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，２００７，Ｖｏｌ．６７，１５１９−１５２５）、阻害剤はそれら自体が抗増殖性である（Ｇｉｒｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００６，Ｖｏｌ．１１９，３６６４−３６７５）。
【００８１】
＜ＵＳＰ１＞
ＵＳＰ１は、モノ−ユビキチン化ＰＣＮＡを脱ユビキチン化するシステインプロテアーゼである。モノ−ユビキチン化ＰＣＮＡは、損傷したＤＮＡの病巣内合成のために必要とされる。ＵＳＰ１の阻害は、この形態のタンパク質の蓄積をもたらす（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００６，Ｖｏｌ．８，３３９−３４７）。
【００８２】
＜ＡＬＴおよびＨｅＬａ細胞の両方＞
所定のタンパク質は、ＡＬＴおよび非ＡＬＴ細胞両方のテロメアと会合することが見いだされた。これは、これらの細胞条件のための所定の特異的タンパク質に加えて、病理−生理学的両方の状況においてテロメアと会合するより小さな群のタンパク質が存在する。以前にはテロメアと会合することが既知ではないタンパク質の選択は、以前には予測することのできなかった新規な治療介入点を示す可能性がある。
ＧＭＰシンターゼ
Ｆｅｎ１
ＵＳＰ７
ＰＲＭＴ１
転写中間因子１β
【００８３】
＜ＧＭＰシンターゼ＞
ＧＭＰシンターゼは、グルタミンおよびＡＴＰの存在下でＧＭＰを形成するためのキサントシン５’−モノホスフェートのアミノ化を触媒するアミドペプチダーゼである（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，２３４５０−２３４５５）。このため、ＧＭＰシンターゼはグアニンヌクレオチドの新規合成における重要な酵素である。迅速に分割する細胞におけるヌクレオチドのための要件を前提にすると、ヌクレオチド合成経路における酵素は、創薬のための前途有望な標的となる可能性がある。最もよく知られていて臨床的に最も有用な例は、チミジル酸シンターゼ阻害剤である５−ＦＵである。より近年には、ＧＭＰシンターゼは、キイロショウジョウバエにおいてＵｓｐ７（下記参照）と相互作用してヒストンＨ２Ｂ脱ユビキチン化を刺激することが証明されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１７，６９５−７０７）。
【００８４】
＜Ｆｅｎ１＞
Ｆｅｎ１は、多ヌクレオチドＤＮＡ合成を含むロング・パッチベースの切除修復（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，Ｖｏｌ．２７５，４４６０−４４６６）およびＯｋａｚａｋｉフラグメント再生に関係する構造特異的フラップエンドヌクレアーゼである。この酵素はアニーリングしていない５’末端を備える基質を切断し、その活性はＰＣＮＡとの会合によって５〜５０倍に増加する（Ｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，Ｖｏｌ．２７５，１０４９８−１０５０５）。
【００８５】
Ｆｅｎ１のノックアウトはマウスにおいては胚で致死性であるが、Ｆｅｎ１およびＡｐｃ１についての二重ヘテロ接合体は腺がんの数の増加および生存率の減少を発生させる（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００２，Ｖｏｌ．９９，９９２４−９９２９）。Ｆｅｎ１（−／−）未分化胚芽細胞は、γ線照射に対して極めて感受性であり、広汎なアポトーシスを示す（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００３，Ｖｏｌ．２３，５３４６−５３５３）。ニワトリＤＴ４０細胞系では、細胞はＦｅｎ１の非存在下で生育性であるが、おそらくは高率の細胞死に起因して生長遅滞表現型を有し、スルホン酸メチルメタンおよび過酸化水素に対して高感受性であるが、ＵＶ照射、Ｘ線およびエトポシドに対しては高感受性ではない（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００２，Ｖｏｌ．３０，３２７３−３２７７）。正常マウス胎児線維芽細胞では、Ｆｅｎ１レベルはＵＶ照射に応答して増加し、この作用はｐ５３依存性である（Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５，Ｖｏｌ．２４，８４０３−８４１３）。
【００８６】
Ｆｅｎ１のレベルは肺がんではアップレギュレートされると報告され（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２２，７２４３−７２４６）、この遺伝子はさらにまた５−ＦＵ耐性ＨＣＴ１１６結腸がん細胞系においてもまたアップレギュレートされる（ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，Ｖｏｌ．２４，１２７９−１２８８）。ヒトのがんにおけるＦｅｎ１の突然変異は同定され、これらの突然変異を抱いているトランスジェニックマウスは、自己免疫、慢性炎症およびがんに罹患する傾向を示した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００７ Ｊｕｎｅ ２４、印刷出版に先行した電子出版）。
【００８７】
＜ＵＳＰ７＞
ＵＳＰ７システインプロテアーゼは、大多数の哺乳動物細胞中に存在するＰＭＬ（前骨髄球性白血病）核小体の成分である（Ｍｕｒａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００２，Ｖｏｌ．４，１０６−１１０）。ＵＳＰ７は、少なくとも２つのウイルスタンパク質であるＨＳＶタイプのＩＣＰＯおよびＥＢＶのＥＢＮＡ１の標的である（Ｈｏｌｏｗａｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００３，Ｖｏｌ．２７８，４７７５３−４７７６１）。ＥＢＮＡ１は、ＵＳＰ７のｐ５３と同一領域へ結合するが、他方ＩＣＰＯは相違する領域へ結合する。
【００８８】
ＵＳＰ７とＩＣＰＯの相互作用は、ウイルスタンパク質を自己ユビキチン化から保護し、これによりそれを安定化する（Ｃａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４，Ｖｏｌ．２７９，３８１６０−３８１６８）。ＩＣＰＯは、溶菌感染および潜伏からの再活性化を刺激する前初期調節タンパク質である。
【００８９】
初期の報告書は、ＵＳＰ７は脱ユビキチン化活性を有し、過剰なＭｄｍ２の存在下においてさえｐ５３の強力な安定剤であると主張した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，Ｖｏｌ．４１６，６４８−６５３）。しかし、同一グループからの後期の研究は、ＲＮＡｉによる内因性ＵＳＰ７レベルの部分的減少によってｐ５３を不安定化すると、ほぼ完全な除去がｐ５３安定化をもたらすという動的に決定された作用を提案した。この研究者らは、これは、ＵＳＰ７がＭｄｍ２安定化のためにも必要とされ、結果としてＵＳＰ７除去細胞中では、自己ユビキチン化Ｍｄｍ２が極めて不安定になり、ｐ５３安定化および活性化をもたらすと主張している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００４，Ｖｏｌ．１３，８７９−８８６）。
【００９０】
Ｃｕｍｍｉｎｓ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎからの研究は、ＵＳＰ７欠損性マウスにおいてはＭｄｍ２が不安定になり、ｐ５３レベルが上昇することを証明することによって、ＵＳＰ７の最も重要な相互作用は脱ユビキチン化することであり、そこでＭｄｍ２を安定化させ、減少したレベルのｐ５３をもたらすという主張を支持した（Ｃｕｍｍｉｎｓ ＆ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ，２００４，Ｖｏｌ．３，６８９−６９２）。ＵＳＰ７は、Ｍｄｍ２調節性／調節タンパク質Ｍｄｍｘによってｐ５３のより複雑な制御レベルにも関係している（Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１８，５６５−５７６）。さらに調節複合性のレベルには、ＡＴＭタンパク質キナーゼの作用が加わり、これはＭｄｍ２およびＭｄｍｘをリン酸化することによって、ＵＳＰ７に対するそれらの親和性を弱化させる（Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，２００５，Ｖｏｌ．４，１１６６−１１７０）。
【００９１】
近年には、ＵＳＰ７の主要な作用の１つはミトコンドリアでアポトーシス性に活性な非ユビキチン化ｐ５３を生成することであると推測されてきた（Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００７，Ｖｏｌ．２６，９２３−９３４）。
【００９２】
ＵＳＰ７は、その他の細胞ユビキチン化標的を有すると思われる。ＧＭＰシンターゼとの複合体（上記参照）では、ＵＳＰ７は、少なくともキイロショウジョウバエの胚中では、ヒストンＨ２Ｂの脱ユビキチン化を触媒するが、Ｈ２Ａの脱ユビキチン化を触媒しない（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｎａａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，Ｖｏｌ．１７，６９５−７０７）。ＵＳＰ７はさらに、その転写活性を負に調節するＦＯＸＯ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００６，Ｖｏｌ．８，１０６４−１０７３）およびチェックポイントタンパク質であるＣｈｆｒ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００７，Ｖｏｌ．３５７，６１５−６１９）を脱ユビキチン化する。
【００９３】
おそらく驚くべきことに、ＵＳＰ７のレベルはＮＳＣＬＣを有する患者１３１人中５９人において減少したが、これはｐ５３発現の減少と関連していた（Ｍａｓｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２００６，Ｖｏｌ．２０８，７２４−７３２）。ＵＳＰ７を標的とすることは、造血系腫瘍にとって実行可能なアプローチとなる可能性がある。
【００９４】
＜ＰＲＭＴ１＞
ＰＲＭＴ１は、その標的にヒストンＨ４、ＧＲＩＰ１およびＰＰＡＲγコアクチベーター１α（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．２１，１３８１−１３９３において精査された）、ＤＮＡポリメラーゼβ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００７，Ｖｏｌ．２１，２６−３４）およびＲＩＰ１４０（Ｍｏｓｔａｑｕｌ Ｈｕｑ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２００６，Ｖｏｌ．２５，５０９４−５１０４）が含まれるアルギニンメチルトランスフェラーゼである。ＰＲＭＴ１は、ｈＣＡＦ１によって調節される（Ｒｏｂｉｎ−Ｌｅｓｐｉｎａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００７，Ｖｏｌ．１２０，６３８−６４７）。ヒストンＨ４メチル化は、エストロゲン受容体媒介性遺伝子調節における早期の重要な事象である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００６，Ｖｏｌ．２８１，２７２４２−２７２５０）。インターフェロンα／β−媒介性遺伝子転写の誘導は、さらにＰＲＭＴ１の活性、この場合にはＳｔａｔ１によって作用することによって厳密に決定される（Ｍｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００１ Ｖｏｌ．１０４，７３１−７４１）。ＰＲＭＴ１の活性の阻害は、大規模に遺伝子発現に影響を及ぼす能力を有している。
【００９５】
＜転写中間因子１β＞
ＴＲＩＭ２８としても公知であるＴＩＦ−１βは、転写調節複合体の構成要素として同定されてきた（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９９６，Ｖｏｌ．１０，２０６７−２０７８；Ｍｏｏｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ Ｖｏｌ．２４，４８５９−４８６７）。ＤＮＡ自体に結合するとは考えられていないが、ＴＲＩＭ２８はＫＲＡＢリプレッサー（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９６ Ｖｏｌ．９３，１５２９９−１５３０４）、ヒストン結合タンパク質ＨＰ１、ＳＥＴＤＢ１（ＥＳＥＴ）、およびｐ５３の重要な調節因子であるＭＤＭ２（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ ２００５ Ｖｏｌ．２４ ３２７９−３２９０）を含む多種多様な各因子と相互作用することは公知である。
【００９６】
ＴＲＩＭ２８は、遺伝子発現の抑制およびヘテロクロマチンの安定化において典型的に機能する数種のより大きな多因子複合体のメンバーであると考えられる（Ｓｒｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００６ Ｖｏｌ．２６，８６２３−８６３８）。ＴＲＩＭ２８の配列分析は、補因子認識および相互作用に関係すると考えられるＮ末端ＲＩＮＧおよびコイルドコイルドメイン（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００ Ｖｏｌ．２９５，１１３９−６２）、ならびに例えばＨＰ１およびＳＥＴＤＢ１などの転写リプレッサーと相互作用すると考えられるＣ末端ＰＨＤおよびブロモドメインを含む数種の認識可能なドメインの存在を示唆している。
【００９７】
このため、本発明の方法に由来する情報は、細胞内でのこれらの因子のためのクロマチン活性の正確な同定を可能にすることは明らかである。これらの様々な因子のための細胞状況、ならびに潜在的補因子に関する情報を提供することによって、本発明は、創薬および標的選択へより焦点を合わせたアプローチを可能にする。当該のゲノム領域と相互作用するタンパク質の同定は、ゲノム生物学を理解するためにも極めて重要である。これらの課題は、以前には遺伝学、可溶性複合体の生化学的特性解析、構造研究、クロマチン免疫沈降法、および細胞生物学を用いて研究されていた。特異的遺伝子座で結合した因子の「クロマチン公式」を確立することによって、本発明の方法は、染色体の特性解析を有意に前進させる。例えば、テロメアを試験するために本発明の方法を使用する際には、本発明者らは単一実験において以前から公知である大多数の因子を同定し、現在ではテロメア生物学に関連すると考察される複数の新規なタンパク質を見いだした。各クラスのテロメアで見いだされた驚くべき多数（約２００）のタンパク質は、この遺伝子座で発生する事象の多様性を強調している。明らかに、本発明の方法は、遺伝学がどこか別の場所では極めて重要な役割を果たす、または冗長であるために遺伝学を用いて明白にすることが困難である因子（例えば、オーファン受容体）を同定する能力を有する。
【００９８】
以下では、本発明を下記の非限定的な実施例によって詳細に説明する。
【００９９】
［実施例］
本発明者らは、標的遺伝子座でのタンパク質およびポリペプチドの同定を可能にする十分な純度で会合した結合因子を備えるクロマチンを単離する技術を考案した。例えば、哺乳動物クロマチン中に存在する中間反復エレメントと会合しているタンパク質が、質量分析法を用いて直接的に精製および同定されている。この技術をヒトテロメアに適用すると、低レベル発現を示すタンパク質を含めて、以前にテロメアに結合することが証明された全タンパク質の９２％が同定された。以下の実施例では、ＨｅＬａテロメアがＡＬＴテロメアと比較され、ＡＬＴテロメアに特異的に結合する複数の因子が同定された。これによって、それらのテロメアの配列内の変化によって様々なタンパク質がクロマチンに結合すると推測される。
【０１００】
本技術は、ほんの数例を挙げると、ウイルス統合部位、特異的ノックアウト細胞、および薬物療法後変化を含む様々な実験状況に適応させることができる。本発明の方法は、有益にも、既にその標的部位と会合している可能性があるタンパク質に関する事前の知識を全く必要とせずに、標的クロマチン部位と会合しているタンパク質複合体における変化の同定を可能にする。
【実施例１】
【０１０１】
１．クロマチン鋳型の調製
出発細胞はＨｅＬａ Ｓ３細胞（ヒトがん細胞系）であった。懸濁液から、スピナーフラスコ内の細胞（０．５〜１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で２０Ｌの培養）を室温で１０分間、２，５００ｇでの遠心分離によってペレット化し、その直後に架橋溶液（１０10ｃｅｌｌｓに対して２００ｍＬ；架橋溶液：３％ホルムアルデヒド／１×ＰＢＳ（ホルムアルデヒド３７％、メタノール安定化溶液から調製））中に再懸濁させた。付着性細胞については、媒質を最初に廃棄し、直ちにプレートへ架橋溶液を加えた（１０ｍＬ／１５ｃｍプレート）。細胞は、室温で３０分間にわたり架橋溶液中でインキュベートした。
【０１０２】
懸濁液中の細胞は４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄した。この物質を４本のＦａｌｃｏｎ試験管内へ等分した（通例は８ｍＬペレット／試験管）。付着性細胞については、架橋溶液を廃棄し、プレートを１×ＰＢＳ溶液（１ｍＭ ＰＭＳＦが補給された標準リン酸緩衝食塩液）で２回洗浄した。さらにプレート１枚当たり３ｍＬの細胞廃棄溶液（１×ＰＢＳ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加え、細胞は氷上のＦａｌｃｏｎ試験管内にプールした。
【０１０３】
次に細胞は１×ＰＢＳ溶液中に細胞ペレットを再懸濁させることによってＰＢＳ中で４回洗浄し、容量を５０ｍＬ／試験管にさせ、次に４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を毎回廃棄し、最終洗浄ペレットをスクロース溶液中に再懸濁させた（容量を試験管１本に付き５０ｍＬにさせる）。この溶液を４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄し、ペレットをスクロース溶液により４０ｍＬの容量にさせた。
【０１０４】
この混合液を氷上の４０ｍＬのＤｏｕｎｃｅ（ダンス）型ホモジナイザーへ移し、緊密に適合する乳棒を用いて２０回すりつぶした。すりつぶした混合物を新鮮Ｆａｌｃｏｎ（ファルコン）試験管内へ移し、４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を廃棄し、ペレットを５０ｍＬのグリセロールバッファー中に再懸濁させた。このステップを１回繰り返し、ペレットの量と等量のグリセロールバッファー中へペレットを再懸濁させた（つまり、ペレット容量が７．５ｍＬである場合は、７．５ｍＬのグリセロールバッファーを加えた）。この調製物は１．５ｍＬ容量（つまり、１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管当たり約０．５×１０9ｃｅｌｌ当量）へ等分することができ、次に液体窒素で急速冷凍して−８０℃で保存するか、標的プルダウンのために次のステップへ取り出す。テロメア配列プルダウンのために、６本の１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管の調製物と同等の３．１０9×ｃｅｌｌ当量を使用する。
【０１０５】
上記のクロマチン調製プロトコールは、真核細胞、特に哺乳動物細胞とともに使用するために適合する。しかし、本発明の方法が単に真核細胞ゲノムＤＮＡおよびクロマチンと会合しているタンパク質およびポリペプチド因子の同定には限定されないことは理解される。核酸＋会合因子を精製するためのプロトコールは、さらに原核細胞ならびにウイルスにおいても公知である。
【０１０６】
２．ハイブリダイゼーションステップのためのクロマチン鋳型の最適化
次のステップは、出発点において単一の１．５ｍＬアリコートのクロマチン鋳型調製物を参照しながら記載する。
【０１０７】
卓上型遠心分離器を使用して、クロマチン鋳型調製物を室温で２分間にわたり２，０００ｇで遠沈させた。ペレットを１．５ｍＬの１×ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ溶液（１×ＰＢＳ；０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中に再懸濁させ、１５μＬの濃ＲＮＡｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ、１００ｍｇ／ｍＬ）を加えた。この溶液は（エッペンドルフ型サーモミキサーを１，４００ｒｐｍで使用して）攪拌しながら室温で６０分間にわたり、次にさらに１２〜１６時間にわたり４℃で（攪拌せずに）インキュベートした。このＲＮＡｓｅステップは、クロマチンと会合している、または会合していない（例えば、不活性Ｘ染色体上のＸｉｓｔ被覆クロマチンドメイン）リボヌクレオタンパク質複合体を精製することを目的とするのであれば、省略できる。
【０１０８】
ＲＮＡｓｅ処理した（または必要であれば未処理の）混合物は、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管内で他の処理アリコートともにプールし、１×ＰＢＳを用いて５０ｍＬの容量にする。プールした混合物（現在では出発時６アリコートに対応する）を４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させ、上清を廃棄する。洗浄ステップは、存在する可能性がある微量のＲＮＡｓｅＡを希釈するために６回まで繰り返すことができる。次にペレットを室温で５０ｍＬの新鮮ＬＢ３ＪＤバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１００ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％のＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ；新しく作製し、室温で維持し、１ｍＭの最終濃度になるようにＰＭＳＦを加える）中に再懸濁させた。この溶液は、約４．５ｍＬの典型的容量のペレットを生じさせるために、４℃で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。このペレットに、再懸濁させるために２．５ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを加えた。結果として生じる粘性溶液は、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中の２つの３．５ｍＬアリコートに分割した。この溶液を４℃の低温室において氷上で超音波処理した（マイクロチップを備えるＭｉｓｏｎｉｘ３０００超音波処理機）。超音波処理パラメータは：電源設定７、１５秒間の一定パルス、４５秒間の休止、７分間の総処理時間であった。これらの条件は、通常はその後のハイブリダイゼーションおよびプルダウンステップのために適切なサイズである長さ約２〜４ｋｂのクロマチンフラグメントを与える。超音波処理溶液を１ｍＬのアリコートに分割し、室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中へプールした。超音波処理クロマチン溶液の４００μＬのアリコートは、溶液中の塩濃度を減少させることができるように、Ｓ−４００−ＨＲゲル濾過スピンカラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で２分間にわたり８００ｇで各々処理した。
【０１０９】
カラムからの溶出液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中にプールし、５分間にわたり５８℃でインキュベートしたが、これは可溶性クロマチン調製物中に存在する内因性でビオチン化されたタンパク質を曝露させるために役立つ。プール溶液を室温へ冷却した。０．５ｍＬのＵｌｔｒａｌｉｎｋストレプトアビジン・ビーズスラリーを平衡化させ、１０ｍＬのＬＢ３ＪＤＬＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；３０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％のＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ；新しく作製し、室温で維持し、１ｍＭの最終濃度にあんるようにＰＭＳＦを加える）を用いて２回洗浄し、２分間にわたり３，２００ｇで遠沈させた。上清を廃棄すると、約０．５ｍＬの容量のスラリーペレットが残留した。洗浄したストレプトアビジン・ビーズをプールした可溶性クロマチン溶液に加え、この混合物を室温の旋回装置上で２時間にわたりインキュベートした。この溶液を室温で１０分間にわたり３，２００ｇで遠沈させると内因性ビオチン化タンパク質の大部分が除去され、これにより後のステップにおけるバックグラウンドが減少した。上清を保存したが、上清は「透明な」可溶性クロマチン溶液を含有している。
【０１１０】
こうして、クロマチン溶液は、ハイブリダイゼーションの準備が整った。クロマチン溶液は、以下の分光測光特性を有していた。
ＤＮＡ濃度（Ｏ．Ｄ．２６０）：２〜２．５ｍｇ／ｍＬ
Ｏ．Ｄ．２６０／Ｏ．Ｄ．２８０＝１．３０〜１．４５．
【０１１１】
Ｏ．Ｄ．比の数値が高いほど、初期のＲＮＡｓｅＡ処理は十分に有効ではないこと、そして精製された材料は非クロマチンＲＮＡ−タンパク質複合体によって汚染される可能性があることを意味する。これらの数値は、ＬＢ３ＪＤＬＳバッファーが「ブランク」溶液として使用される場合に入手された。
【０１１２】
可溶化して清浄化したクロマチン溶液は、４℃で保存することができる。
【０１１３】
３．ハイブリダイゼーションおよび標的配列捕集（プルダウン法）
先行ステップにおいて得られた可溶化クロマチンサンプルは、室温の１６，０００ｇで１５分間にわたり遠沈させた。約５ｍＬのクロマチンサンプルを生じさせるためにアリコートを一緒にプールし、これに最終濃度０．０２％（クロマチンサンプルの１／１，０００の容量）まで２０％ＳＤＳを加えた。
【０１１４】
このクロマチン溶液に３０μＬの所望のオリゴヌクレオチドプローブ配列（１００μＭのストック溶液から、プローブの詳細については「４．」を参照されたい）を加えた。スクランブルもしくはランダム化配列を有するプローブを含有するコントロール反応もまた並行してランした。
【０１１５】
このハイブリダイゼーション反応液をハイブリダイゼーションステップのためにサーモサイクラー内に配置したおよそ３４×１５０μＬのアリコートに分割した（ＨＹＢＡＩＤ Ｐｘ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションプログラムは、以下のとおりであった。
２５℃で３分間
７０℃で６分間
３８℃で６０分間
６０℃で２分間
３８℃で６０分間
６０℃で２分間
３８℃で１２０分間
最終温度２５℃
【０１１７】
ハイブリダイズしたサンプルを元の１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管内へプールし、ハイブリダイゼーションステップ中に形成された可能性がある任意の沈降物を除去できるように室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。
【０１１８】
２．４ｍＬのＭｙＯＮＥ−Ｃ１磁気ストレプトアビジン・ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中に配置し、それらを平衡させるためにこれに７．６ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを加えた。これらのビーズは磁気スタンド上に固定化し、上清を廃棄した。ビーズは１０ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中で洗浄し、再び固定化し、総量が２．４ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー内へ再懸濁させた。
【０１１９】
遠沈させたハイブリダイズしたクロマチンサンプルからの上清を２本の１５ｍＬのＦａｌｃｏｎ試験管中へ移した。各試験管へ３．５ｍＬのｍｉｌｌｉＱ水を加え、次に１．２ｍＬのＣ１磁気ビーズ溶液を加えた。この混合物を室温で１２時間にわたり旋回させた。
【０１２０】
この混合物の容量は、ＬＢ３ＪＤバッファーを用いて各試験管内で１０ｍＬまでにさせた。次に磁気ビーズを磁気スタンド上で固定した。上清（およそ１０ｍＬ）は、ハイブリダイズしていない分画を表し、後の個別分析のために保存することができる。ペレットは、プルダウンした、ハイブリダイズしたクロマチン標的を表す。ペレットは、１０ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファーを用いて７回洗浄した。各洗浄後に、ビーズは旋回によって穏やかに再懸濁させた。洗浄ステップ後、ビーズは試験管１本に付き２．４ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させ、２本のエッペンドルフ（１．５ｍＬ）低結合試験管へ移し、遠沈させた。
【０１２１】
次に磁気ビーズをエッペンドルフ磁気スタンドを用いて固定した。上清を廃棄し、ビーズを１ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させた。これらの試験管を４２℃のサーモミキサー内で（１，０００ｒｐｍで攪拌しながら）５分間インキュベートし、次にビーズはエッペンドルフ磁気スタンドを用いて再び固定化した。このステップを繰り返し、最後にビーズを０．６ｍＬのＬＢ３ＪＤバッファー中に再懸濁させた。各ハイブリダイゼーションからのビーズ（テロメアおよびコントロール、各２本の試験管）を１本の試験管／反応液内にプールし、エッペンドルフ磁気スタンド上で固定化した。ペレットを室温で１ｍＬの溶出バッファー（１２．５ｍＭ ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；７５ｍＭのＮａＣｌ；１．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；０．７５ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．１５％ＳＤＳ；０．０７５％Ｓａｒｋｏｓｙｌ）中に再懸濁させ、室温のサーモミキサー内で（１，０００ｒｐｍで攪拌しながら）６０分間にわたりインキュベートした。６０分間にわたりインキュベートした後、温度を６５℃へ上昇させ、これらの混合液は、遠沈したクロマチン標的配列の溶出を実行するために１０分間にわたりインキュベートした。
【０１２２】
これらの試験管は、残留した磁気ビーズおよび溶出液を固定化できるようにエッペンドルフ磁気スタンド上に再び配置し、新鮮１．５ｍＬのエッペンドルフ試験管へ移した。プローブが磁気ビーズから溶出させられていることを検証するために、溶出液のＯＤ２６０をチェックした（１５〜２５ｎｇ／μＬでなければならない）。
【０１２３】
溶出液各々に、２３０μＬの１００％ＴＣＡを加え、これらの試験管を氷上で１０分間にわたりインキュベートした。次にプルダウンしたクロマチン溶液を室温で１５分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させ、約１．１ｍＬをピペッティングによって注意深く除去した。これらの試験管は−２０℃の低温アセトンを用いて１．５ｍＬにさせ、１０秒間にわたり攪拌し、次に室温で１０分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を廃棄すると、小さな白色ペレットが視認できた。ペレットをさらにもう１回低温アセトンで洗浄し、室温で１０分間にわたり１６，０００ｇで遠沈させた。上清を廃棄し、ペレットは風乾させた。
【０１２４】
プルダウンした標的クロマチンを含有するペレットは、５０μＬの架橋逆転溶液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）；２％ＳＤＳ；０．５Ｍの２−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。次にこの溶液を２５分間にわたり９９℃でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填するか、またはその後の分析のため（例えば、質量分析法による）に待機中は−８０℃で保存した。
【０１２５】
スクロースバッファー
０．３Ｍスクロース；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；３ｍＭのＣａＣｌ2；２ｍＭのＭｇＯＡｃ（酢酸マグネシウム）
【０１２６】
グリセロールバッファー
２５％グリセロール；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＥＧＴＡ；５ｍＭのＭｇＯＡｃ（酢酸マグネシウム）
【０１２７】
４．オリゴヌクレオチドプローブの設計
プローブは、ＬＮＡおよびＤＮＡ残留物の混合物から構成され、長さ２５ヌクレオチドであった。さらに、それらをそれらの５’末端でのデスチオビチンであるビオチンアナログで標識したが、この標識は典型的に長さ２０〜９５炭素原子からなる極めて長いスペーサー基によってプローブ配列に結合している。デスチオビオチンは、ビオチンに比較してより穏和な溶出条件を使用できるように、親和性標識として選択された。極めて長いスペーサーは相当に重要であるが、それはクロマチン固定化戦略が立体障害問題によって損なわれる可能性があるためである（例えば、Ｓａｎｄａｌｔｚｏｐｏｕｌｏｓ Ｒ，Ｂｌａｎｋ Ｔ，Ｂｅｃｋｅｒ ＰＢ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９４を参照されたい）。適切な極めて長いスペーサー技術は、Ｍｏｒｏｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｏｓ．Ｎｕｃｌｅｏｔ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．（２００３）２２（５−８）：１４３９−４１およびＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００５）；２８８：２２５−４０）に記載されている。
【０１２８】
上述した実施例では、テロメア標的化プローブ配列は、
５’ ＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇＴｔＡｇＧｇｔ ３’［配列番号１］
であった。
ランダム化／スクランブル化コントロールプローブ配列は、
５’ ＧａＴｇＴｇＧａＴｇＴｇｇＡｔＧｔＧｇＡｔｇＴｇｇ ３’［配列番号２］
であった。
このとき大文字はＬＮＡ残基を表し、小文字はＤＮＡ残基であった。オリゴヌクレオチドプローブを含有するデスチオビオチン化ＬＮＡは、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）による発注のために合成された。上記のプローブにおいて利用された分子スペーサーは、長さが１０８炭素原子であった。
【０１２９】
５．プルダウンしたタンパク質の精製
プルダウンしたタンパク質はＢｉｓ−Ｔｒｉｓの１２％アクリルアミドミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に装填し、泳動用色素がゲルから抜け出るまで１００Ｖで泳動した。次にこのゲルを、製造業者の取扱説明書にしたがってコロイダルブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により染色して固定した。１５〜２５のバンドを全レーンに沿って切り取った（全レーンを被覆する）。これらのサンプルは、分析およびタンパク質同定のためにＴａｐｌｉｎ Ｈａｒｖａｒｄ質量分析施設（ＴＨＭＳ）に提出された（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｙｇｉ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｆａｃｉｌｉｔｙ／＃Ｉｎｔｒｏを参照。Ｔａｐｌｉｎ生物学質量分析施設、ハーバード医科大学、Ｃ棟５１７号室、ロングウッドアベニュー２４０、米国マサチューセッツ州ボストン０２１１５）。
【０１３０】
典型的に、この分析は以下のステップを含んでいる。
ａ．ゲルバンド／スポットのゲル内消化
ｂ．マイクロキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
ｃ．タンパク質データベース検索
【０１３１】
６．データ分析およびデータのウェブベース報告
これらの結果は、民間アクセスのウェブサイトデータベースの形態にあるＴＨＭＳによって提供される。
【０１３２】
圧縮されたデータリンクは、それらがマッチする対応するタンパク質と一緒にサンプルから同定されたペプチドを示した。データベース内に列挙された他のタンパク質内で見いだされたペプチド配列には、カラム内で「赤色」標識された数（すなわち、＋３）が割り当てられた（冗長性）。圧縮されたデータリンク内の情報は、Ｓｅｑｕｅｓｔデータベースの検索から入手されたデータをソーティングおよびフィルタリングすることによって作製された。
【０１３３】
これらのタンパク質は、データの手動検査によって補強されたデータベース−検索プログラムによってそれにマッチされた２つ以上の強力なスコアリングペプチドの要件を備える各サンプルを用いて列挙された。唯一のマッチングペプチドを有していた列挙されたタンパク質が情報のために列挙されたが、１つのマッチングペプチドしか有していなかったタンパク質が正確であるかどうかは、典型的にはその後の確証によって（例えば、ウエスタンブロットによって）検証される。
【０１３４】
同定された新規なテロメアクロマチン会合因子は、表１に規定した。
【実施例２】
【０１３５】
出発細胞は、形質変換ヒト胚肺線維芽細胞系ＷＩ３８ ＶＡ１３（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：１６７１−１６７７）であった。実施例１において使用したＨｅＬａ細胞系とは相違して、ＷＩ３８ ＶＡ１３は、ＡＬＴ細胞タイプである非テロメアである。ＡＬＴテロメア配列と会合しているタンパク質およびポリペプチド因子は、実施例１に記載した方法によって単離した。
【０１３６】
同定された新規なＡＬＴテロメアクロマチン会合因子は、表２に規定した。図２は、実施例１および２によって同定された新規なクロマチン会合因子のグラフによる比較を示している。この図は、所定の因子がテロメラーゼおよびＡＬＴ細胞タイプ両方においてテロメア配列と一般に関連している重複の領域が明白であることを示している。両方のテロメラーゼ細胞（ＨｅＬａ）およびＡＬＴ細胞（ＷＩ３８ ＶＡ１３）に一般的なクロマチン会合因子の同一性は、表３に示した。
【実施例３】
【０１３７】
＜本発明の方法により同定された新規なクロマチン会合因子の特性解析＞
本発明の方法によって同定された候補が機能的に重要であることを証明する実験を実施した。ＡＬＴ細胞系ＷＩ３８ ＶＡ１３は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２遺伝子を標的とする２つのｓｈＲＮＡ構築体（ＳＩＧＭＡ、Ｍｉｓｓｉｏｎ ｓｈＲＮＡコレクション）を用いてトランスフェクトした。ＣＯＵＰ−ＴＦ２は、実施例２における新規なクロマチン会合因子であると同定されたオーファン核受容体である（表２においてボールド体で表示した）。細胞は、トランスフェクトに成功していた細胞を同定するために緑色蛍光タンパク質構築体をコトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、細胞を固定し、テロメアを検出するための抗ｒａｐ１抗体（ウサギポリクローナルａｂ４１８１、ＡｂＣａｍ社）およびＰＭＬ体を同定するための抗ＰＭＬ抗体（マウスモノクローナルＰＧＭ３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を用いて二重染色した。局在化シグナルは、ロバ抗ウサギ−Ｃｙ３およびロバ抗マウス−Ｃｙ５ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ社）により示された。
【０１３８】
図３に示したように、ＰＭＬおよびＲａｐ１シグナルは、未トランスフェクト細胞内では共局在化する（ＧＦＰ染色の欠如によって同定された）。しかし、ＧＦＰ陽性細胞内では、２つのシグナルはもはや共局在化しない。これは、ＣＯＵＰ−ＴＦ２がＡＬＴ細胞内でテロメアをＰＭＬ体へ局在化するために必要とされることを証明している。ＰＭＬ体は、転写、ＤＮＡ修復、ウイルス防御、ストレス、細胞周期調節、タンパク質分解およびアポトーシスを含む多数の核機能と関連付けられてきた。したがって、がん細胞内でのＰＭＬ体へのテロメアの局在化を阻害する能力は、がん療法へ重要な経路を提供することができる。
【０１３９】
ＴＲ４遺伝子（本明細書で同定されたまた別の新規な因子）に対して特異的なｓｈＲＮＡを用いるその後のノックダウン実験は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２と類似の結果を示した。これらの結果は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２および／またはＴＲ４は、インビボでＰＭＬ体へのテロメア局在化の極めて重要なメディエーターとして機能できることを示唆している。
【０１４０】
また別の実験（本明細書に示していない）は、ＣＯＵＰ−ＴＦ２もしくはＴＲ４のノックダウンは、Ｓａｏｓ−２骨肉腫ＡＬＴ細胞系においてＷＩ３８ＶＡ１３細胞内と同一作用を正確に有するので、細胞系特異的ではないことを証明した。
【０１４１】
テロメア配列と会合するポリペプチドおよびタンパク質を標的とするために本発明の方法を使用することは、有意な数の会合タンパク質の同定を生じさせた。それでも、本発明の方法は、より小数のタンパク質を同定できると予想される場合は、単一コピー配列を標的とするために適応させた場合もまた有用性を証明する。これらの場合には、本発明の方法はシステム生物学フレームワーク内で新規な仮説を作り上げる、したがって遺伝子制御経路の大多数の化学的に従順な構成要素を同定するために使用できる相互作用経路の同定をもたらす。
【実施例４】
【０１４２】
＜超音波処理によるクロマチン鋳型の調製＞
本実施例は、実施例１に記載したクロマチンフラグメントを調製するための代替方法を提供する。
【０１４３】
以下の容量および数は、１回の精製のために提供する（すなわち、約３．１０9ｃｅｌｌ当量）：細胞を室温で２分間にわたり２，０００ｇで遠心分離し、ペレットを同一容量の１×ＰＢＳ−０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に再懸濁させ、９０μＬのＲＮａｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ、１００ｍｇ／ｍＬ）を加えた。細胞は、攪拌しながら室温で６０分間にわたり、次に４℃で１２〜１６時間にわたりインキュベートした。細胞は、ＰＢＳ中で６回洗浄した。細胞はＬＢＪＤ溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；１００ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％ ＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、プロテアーゼ阻害剤）中で平衡化し、ペレットはペレット量が５５％のＬＢＪＤ溶液中に再懸濁させた。サンプルは、以下のパラメータを用いて超音波処理した（Ｍｉｃｒｏ−ｔｉｐ、Ｍｉｓｏｎｉｘ ３０００）。電源設定７（３６〜４５ワット）、１５秒間の一定パルス、および４５秒間の休止で７分間の総処理時間であった。サンプルは、室温で１５分間にわたり１６，０００ｇでの遠心分離によって収集した。次にクロマチンサンプルは、ＳｅｐｈａｃｒｙｌのＳ−４００−ＨＲスピンカラムへ適用し、５８℃で５分間にわたりインキュベートした。
【０１４４】
ＬＢＪＤＬＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）；３０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）；１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８）；０．２％ＳＤＳ；０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、プロテアーゼ阻害剤）で事前に平衡化したストレプトアビジン・ビーズを加え（Ｐｉｅｒｃｅ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋストレプトアビジン、０．５ｍＬ）、サンプルを室温で２時間にわたりインキュベートした。ビーズを廃棄し、上清を保存した。
【０１４５】
本発明の特定の実施形態を本明細書で詳細に開示してきたが、これは例として、そして例示する目的でのみ実施されたものである。上記の実施形態は、以下の添付の特許請求項の範囲に関して限定することは意図されていない。本発明者らは、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な置換、変更、および修飾を加えられることを企図している。
【０１４６】
【表１Ａ】
【表１Ｂ】
【表１Ｃ】
【表１Ｄ】
【０１４７】
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【０１４８】
【表３Ａ】
【表３Ｂ】
【表３Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するための方法であって、
（ａ）標的核酸配列と、前記標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
（ｂ）前記サンプルと、前記標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを接触させるステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つの親和性標識をさらに含み、
（ｃ）前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび前記標的核酸配列がプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの親和性標識に対して結合する分子を介して前記プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、前記プローブ−標的ハイブリッドを前記サンプルから単離するステップと、
（ｅ）前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列は、真核細胞ＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸配列は、ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸配列は、原核細胞ＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞ＤＮＡは、哺乳動物ＤＮＡを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸配列は、哺乳動物ＤＮＡに組み込まれたウイルス由来配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸配列は、クロマチン内に含まれる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドは、クロマチン会合ポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび免疫タグからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブ−標的ハイブリッドは、前記少なくとも１つの親和性標識に結合する分子を通して固定化され、前記分子は固体支持体に付着している請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体は、マイクロビーズを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロビーズは、溶液から磁気的に分離することができる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブ配列は、複数のＬＮＡヌクレオチドを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、約５０％のＬＮＡヌクレオチド残基を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記親和性標識は、約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子を有するスペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブに共役結合している請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドは、前記サンプルを前記オリゴヌクレオチドプローブに曝露するステップの前に、前記１つ以上のポリペプチドの架橋結合を生じる条件に曝露され、次いで前記架橋結合ステップは、前記１つ以上のポリペプチドを溶出するステップの前に脱架橋される請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｆ）前記１つ以上のポリペプチドの同一性を決定するために、前記溶出された１つ以上のポリペプチドを分析するステップをさらに含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析は、質量分析法を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下に規定する一般式Ｉ：
【化１】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基によってヌクレオチドＸに固定された１つ以上の親和性標識を含み、Ａはハプテンもしくは免疫タグを含み、ヌクレオチドＸはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から選択される）に一致する少なくとも１つの基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】
前記ハプテンは、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、およびジニトロフェノールからなる群から選択される請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２２】
前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、ｎは約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子である請求項２０に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項２１に記載のプローブ。
【請求項２４】
以下に規定する一般式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基によってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結されている親和性標識であり、前記オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでいる）に一致するオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドの少なくとも２５％は、ロックされた核酸ヌクレオチドである請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、およそ５０％のＬＮＡおよび５０％のヌクレオチドを含んでいる請求項２４または２５に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、ｎは約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記スペーサー基は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’ヌクレオチドに結合されている請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項２９】
以下に規定する一般式ＩＩＩ：
【化３】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、前記ヌクレオチドＺおよびＷは長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは同一または相違し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされた核酸（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３０】
前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ（例えばデスチオビオチンなど）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールから選択される請求項２９に記載のプローブ。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、一般式ＩＩＩの基を含み、式中、ヌクレオチドＺが前記オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表す請求項２９または３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
真核細胞のゲノム内のクロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）前記真核細胞内のクロマチンの前記特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
（ｂ）前記特異的領域内に局在するＤＮＡ配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
（ｃ）クロマチンの前記特異的領域と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するために、請求項１に記載の方法における前記オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
（ｄ）クロマチンの前記特異的領域と会合するポリペプチドを同定するために、前記１つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
クロマチンの前記特異的領域は、テロメア、セントロメア、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子、反復配列、異種挿入配列および組み込まれたウイルスゲノムからなる群から選択される領域の１つ以上を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、酵素活性についてさらにスクリーニングされる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、薬物標的として同定される請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
後成的活性の調節因子についてのスクリーニング法であって、
請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって、真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の１つ以上の化合物と接触させるステップと、
前記単離されたポリペプチドに結合して前記単離されたポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子として同定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記単離されたポリペプチドは、Ｈｉｎｔ２、ＧＭＰシンターゼ、Ｐｒｉ２、Ｆｅｎ１、ＵＳＰ７、ＰＲＭＴ１、Ｐｉｎ−１、オーロラキナーゼＢ、ＵＳＰ１およびＭＴＡ１からなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの生物活性を特性付ける方法であって：
請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
前記ポリペプチドについての前記核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
前記真核細胞内の前記ポリペプチドの発現を減少させるために、前記アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
前記ポリペプチドの前記生物活性を決定するために、前記真核細胞の表現型を分析するステップと、を含む方法。
【請求項３９】
前記アンチセンス核酸配列は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記真核細胞は、哺乳動物である請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するための方法であって、
（ａ）標的核酸配列と、前記標的核酸配列と会合している１つ以上のポリペプチドとを含むサンプルを入手するステップと、
（ｂ）前記サンプルと、前記標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ハイブリダイズすることのできる配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを接触させるステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つのロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１つの親和性標識をさらに含み、
（ｃ）前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブおよび前記標的核酸配列がプローブ−標的ハイブリッドを形成できるように相互にハイブリダイズさせるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの親和性標識に対して結合する分子を介して前記プローブ−標的ハイブリッドを固定化することによって、前記プローブ−標的ハイブリッドを前記サンプルから単離するステップと、
（ｅ）前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドを溶出させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記標的核酸配列は、真核細胞ＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸配列は、ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸配列は、原核細胞ＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞ＤＮＡは、哺乳動物ＤＮＡを含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸配列は、哺乳動物ＤＮＡに組み込まれたウイルス由来配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸配列は、クロマチン内に含まれる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドは、クロマチン会合ポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび免疫タグからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブ−標的ハイブリッドは、前記少なくとも１つの親和性標識に結合する分子を通して固定化され、前記分子は固体支持体に付着している請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体は、マイクロビーズを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロビーズは、溶液から磁気的に分離することができる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブ配列は、複数のＬＮＡヌクレオチドを含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、約５０％のＬＮＡヌクレオチド残基を含む請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記親和性標識は、約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子を有するスペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブに共役結合している請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸配列と会合している前記１つ以上のポリペプチドは、前記サンプルを前記オリゴヌクレオチドプローブに曝露するステップの前に、前記１つ以上のポリペプチドの架橋結合を生じる条件に曝露され、次いで前記架橋結合ステップは、前記１つ以上のポリペプチドを溶出するステップの前に脱架橋される請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｆ）前記１つ以上のポリペプチドの同一性を決定するために、前記溶出された１つ以上のポリペプチドを分析するステップをさらに含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析は、質量分析法を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下に規定する一般式Ｉ：
【化１】
（式中、Ａは長さがｎ原子のスペーサー基によってヌクレオチドＸに固定された１つ以上の親和性標識を含み、Ａはハプテンもしくは免疫タグを含み、ヌクレオチドＸはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされたリボヌクレオチド（ＬＮＡ）から選択される）に一致する少なくとも１つの基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】
前記ハプテンは、ビオチンまたはそのアナログ、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、およびジニトロフェノールからなる群から選択される請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２２】
前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、ｎは約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子である請求項２０に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記ビオチンアナログは、デスチオビオチンである請求項２１に記載のプローブ。
【請求項２４】
以下に規定する一般式ＩＩ：
【化２】
（式中、Ｂはｎ原子の直鎖を含むスペーサー基によってオリゴヌクレオチド配列Ｙに連結されている親和性標識であり、前記オリゴヌクレオチド配列Ｙは、１０％以上がロックされた核酸ヌクレオチドである少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでいる）に一致するオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドの少なくとも２５％は、ロックされた核酸ヌクレオチドである請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、およそ５０％のＬＮＡおよび５０％のヌクレオチドを含んでいる請求項２４または２５に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記親和性標識は、スペーサー基によってオリゴヌクレオチドプローブへ共役結合し、ｎは約４０〜約１７０原子、より適切には約７０〜約１３０原子、より典型的には約９０〜約１２０原子、適切には約１００〜約１１０原子である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記スペーサー基は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’ヌクレオチドに結合されている請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項２９】
以下に規定する一般式ＩＩＩ：
【化３】
（式中、ＢおよびＢ’は長さがｎ原子のスペーサー基ＣおよびＣ’によって各ヌクレオチドＺおよびＷへ連結された同一もしくは相違する親和性標識を含み、前記ヌクレオチドＺおよびＷは長さがｐヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖Ｖによって分離され、このときｐは０〜４０であり、ヌクレオチドＺ、ＷおよびＶは同一または相違し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドおよびロックされた核酸（ＬＮＡ）から適切に選択される）に一致する基を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３０】
前記親和性標識は、ビオチンまたはそのアナログ（例えばデスチオビオチンなど）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、および／またはジニトロフェノールから選択される請求項２９に記載のプローブ。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、一般式ＩＩＩの基を含み、式中、ヌクレオチドＺが前記オリゴヌクレオチドプローブ内の５’ヌクレオチドを表す請求項２９または３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
真核細胞のゲノム内のクロマチンの特異的領域と会合するポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）前記真核細胞内のクロマチンの前記特異的領域内に存在する標的核酸配列を同定するステップと、
（ｂ）前記特異的領域内に局在するＤＮＡ配列の少なくとも一部分と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ配列を構築するステップと、
（ｃ）クロマチンの前記特異的領域と会合している１つ以上のポリペプチドを単離するために、請求項１に記載の方法における前記オリゴヌクレオチドプローブを利用するステップと、
（ｄ）クロマチンの前記特異的領域と会合するポリペプチドを同定するために、前記１つ以上の単離されたポリペプチドを分析するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
クロマチンの前記特異的領域は、テロメア、セントロメア、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、遺伝子、反復配列、異種挿入配列および組み込まれたウイルスゲノムからなる群から選択される領域の１つ以上を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、酵素活性についてさらにスクリーニングされる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
クロマチンの特異的領域と会合する前記ポリペプチドは、薬物標的として同定される請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
後成的活性の調節因子についてのスクリーニング法であって、
請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって、真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記単離されたポリペプチドを化合物のライブラリー由来の１つ以上の化合物と接触させるステップと、
前記単離されたポリペプチドに結合して前記単離されたポリペプチドの活性を調節する化合物を後成的活性の調節因子として同定するステップと
を含む方法。
【請求項３７】
前記単離されたポリペプチドは、Ｈｉｎｔ２、ＧＭＰシンターゼ、Ｐｒｉ２、Ｆｅｎ１、ＵＳＰ７、ＰＲＭＴ１、Ｐｉｎ−１、オーロラキナーゼＢ、ＵＳＰ１およびＭＴＡ１からなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの生物活性を特性付ける方法であって：
請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって真核細胞のゲノム内でクロマチンの特異的領域と会合するものとして同定されたポリペプチドを単離するステップと、
前記ポリペプチドについての核酸配列を入手するステップと、
前記ポリペプチドについての前記核酸配列の全部もしくは一部に相補的であるアンチセンス核酸配列を生成するステップと、
前記真核細胞内の前記ポリペプチドの発現を減少させるために、前記アンチセンス核酸配列を真核細胞内へ導入するステップと、
前記ポリペプチドの前記生物活性を決定するために、前記真核細胞の表現型を分析するステップと、を含む方法。
【請求項３９】
前記アンチセンス核酸配列は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記真核細胞は、哺乳動物である請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３６８３５（Ｐ２０１０−５３６８３５Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１４７３（Ｐ２０１０−５２１４７３）
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４７８１
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５９２０１７６３３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション (177)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２０日（２００８．８．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２８２１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４７８１
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５９２０１７６３３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション (177)
【Ｆターム（参考）】
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