核酸の単離
本発明は、核酸を単離する方法に関し、当該方法は、以下：結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで、核酸を固相に結合させる工程、結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程；及び前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨで、核酸を固相から溶出させる工程を含む。前記洗浄溶液は、前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ）を有する緩衝剤を含み、及び前記洗浄溶液のｐＨは、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い。前記方法に使用される溶液、組成物及びキットにも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を単離するための改善された方法、並びに当該方法に使用される溶液、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の核酸を単離する方法は、カオトロピック剤、例えばグアニジウムチオシアネート、及び細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）するための有機溶媒、及び分解タンパク質（ヌクレアーゼ等、その他核酸を分解するタンパク質）を使用する。例えば、Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９０， Ｖｏｌ． ２８（３）： ４９５−５０３）は、ヒトの血清又は尿を含有する試料を、グアニジウムチオシアネートを含有する溶解／結合緩衝剤の存在下で、シリカ粒子と接触させて行われる方法を記載する。放出された核酸は、シリカ粒子と結合し、それを、グアニジウムチオシアネートを含有する洗浄緩衝剤で、続いてエタノールで、続いてアセトンで洗浄する。結合した核酸は、続いて、水性低塩濃度緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で溶出される。
【０００３】
しかしながら、そのような方法は、カオトロピック剤及び有機溶媒が酵素反応に対し高度に阻害的であるという短所を有する。溶出した試料中にキャリーオーバーされるこれらの物質の残存量は、単離された核酸のその後の酵素的プロセス、例えばシークエンシング又は増幅等に、干渉する可能性がある。カオトロピック剤及び有機溶媒は、これらの試薬が、毒性で、取り扱いが困難で、及び処分に特別な規定がある点においても望ましくない。カオトロピック剤の使用の更なる短所は、それらが高いモル濃度を要するため、保存中に溶液内に沈殿が生じる場合があることである。これらの薬剤を含有する溶液は、使用前に加熱することにより、カオトロピック剤を再溶解させることが必要な場合もある。
【０００４】
カオトロピック塩及び有機溶媒の必要性は、Ｈｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌ， （Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００５， ５１ （７）： １２１７−１２２２）が記載した方法において、回避されている。コスモトロピック塩（硫酸アンモニウム）を含有する溶解／結合緩衝剤の存在下、血漿試料を磁気シリカ粒子と混合し、その後プロテイナーゼＫを添加する。磁気粒子を分離した後、プロテイナーゼＫを含有する洗浄緩衝剤で洗浄し、そして８０℃で溶出緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて溶出する。そのような方法を使用して妥当な量の核酸を取得することは可能であるが、なおも核酸の収量の増大が要求されている。また、プロテイナーゼＫ等の酵素を何ら必要とせずに実施できる方法の提供も要求されている。酵素を使用する場合、前記方法を実施するコストが増大し、また、安定性を維持するために、別個の特別な条件（例えば、低温又は凍結乾燥形態等）下で酵素を保存することが必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明において、核酸を単離する方法であって、以下：
（ｉ） 結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで、核酸を固相に結合させる工程；
（ｉｉ） 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程；及び
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨで、核酸を固相から溶出させる工程；
を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ）を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤（即ち洗浄緩衝剤）の緩衝範囲よりも低い、前記方法が提供される。
【０００６】
出願人は、本発明の方法が、Ｈｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌにより記載された方法等の従来の方法と比較して、核酸の収量の驚異的な増大をもたらすことを見出した。本発明の方法の使用による収量の改善は、従来技術と比較した場合の、洗浄工程で固相から除去される核酸の量の減少、及び／又は溶出工程で固相から放出される核酸の量の増大によるものと考えられる。
【０００７】
核酸の収量の改善は、洗浄溶液中の酵素（プロテアーゼ等）の存在、又は有機溶媒若しくはカオトロピック剤の使用を必要とせずに、本発明の方法を使用して達成され得る。故に、洗浄溶液は、例えばＨｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌの方法で必要な洗浄溶液と比較して単純化され、プロテアーゼ又は他の酵素を別個に保管する必要が無い。カオトロピック剤又は有機溶媒を必要としないので、そのような薬剤又は溶媒が単離された核酸のその後の酵素処理を阻害するのを回避できる。
【０００８】
好ましくは、前記第一のｐＨは酸性のｐＨであって、好ましくはｐＨ３〜６、又はｐＨ３〜５の範囲内である。好ましくは、前記第二のｐＨは、ｐＨ６．５以上であり、好ましくはｐＨ７．０以上であり、又はアルカリ性のｐＨである。適切には、前記第二のｐＨは、ｐＨ６．５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９の範囲内である。そのようなｐＨ値は、低いｐＨで核酸を結合させ、そして高いｐＨで核酸を放出することが可能なシリカベースの固相等の固相で典型的に使用されるものである。核酸にダメージを与えかねない極端なｐＨは避けられる。
【０００９】
好ましくは、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲は、前記第一のｐＨよりも高い（即ち洗浄緩衝剤の緩衝範囲の下端が前記第一のｐＨよりも高い）。好ましくは、当該洗浄緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．０よりも高い。好ましくは、前記第二のｐＨは、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲内である。このことは、洗浄工程後に固相上に存在する残留洗浄溶液のｐＨが、溶出工程の間に最も効率的に第二のｐＨに転換されることにより、固相から放出される核酸の量を最大にすると考えられるため、好ましい。
【００１０】
好ましくは、前記洗浄溶液のｐＨは、ｐＨ６．３以下、好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０である。これらの好ましい範囲内のｐＨの洗浄溶液の使用は、好ましい結合及び洗浄緩衝剤の緩衝範囲に適合する。
【００１１】
好ましくは、前記第一のｐＨは、結合工程のｐＨが結合緩衝剤により調整されるように、結合緩衝剤の緩衝範囲内である。好ましくは、結合緩衝剤の緩衝範囲の下端は、結合工程における極端なｐＨを避けるように、ｐＨ３．０以上である。
【００１２】
溶解、結合、洗浄及び溶出緩衝剤に通常使用される緩衝剤の緩衝範囲は、当業者に知られている。幾つかの重要な生物学的緩衝剤のｐＫａ値及び緩衝範囲を、緩衝範囲により区別して、下記表１に示す（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの引用）。
【００１３】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００１４】
本発明の方法は、結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで核酸を結合させ、及び第二のｐＨで核酸を溶出させることが出来る固相と共に、公知の結合緩衝剤及び／又は溶出緩衝剤を使用して実施される場合もある。
【００１５】
前記固相は、イオン化基を有し、周囲の条件に従って電荷を変化させる。イオン化基のｐＫａは、固相に核酸が結合し、及び固相から核酸が放出されるのに要求される条件に適合する。一般に、核酸は、ｐＫａより低い、又は概ね等しいｐＨで、固相と結合し得て、そしてより高いｐＨ（通常はｐＫａを超える）で固相から放出され得る。第一のｐＨで核酸と結合し、そして結合した核酸を第一のｐＨよりも高いｐＨで溶出する適切な固相は、当業者に周知である。例えば、第一のｐＨで固相は正の電荷を有し、そして第二のｐＨで固相の正電荷は小さくなり、中性になり、又は負電荷を有し得る。あるいは、又は加えて、第一のｐＨにおいて、固相は中性又は負の電荷を有し、そして第二のｐＨで固相は負電荷又は更なる負電荷を有し得る。そのような電荷の変化により、核酸は、第一のｐＨで核酸に吸着され、そして第二のｐＨで核酸から放出される。
【００１６】
例えば、固相は、ｐＫａが第一及び第二のｐＨの間である陰イオン化基を含み得る。核酸は、当該固相が中性又は負電荷が小さいときに固相に結合し、そして、固相が負電荷を有するとき、又は更なる負電荷を有するとき、固相から放出される。
【００１７】
あるいは、又は加えて、固相は、ｐＫａが第一及び第二のｐＨの間である陽イオン化基を含み得る。核酸は、当該固相が正電荷を有するときに固相に結合し、そして、中性又は正電荷が小さいとき、固相から放出される。
【００１８】
本発明において使用され得る固相の例として、無機酸化物、例えばシリカ又はガラス（例えばＢｏｏｍ ｅｔ ａｌ又はＨｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌに記載のもの）、若しくは酸化アルミニウム等、多糖類、電荷切り替え材料（例えばＷＯ ０２／４８１６４に記載のもの）等が挙げられる。
【００１９】
前記固相は、例えば、膜、ゲル、又は粒子、例えば磁気粒子等の、任意の適切な形態をとる場合がある。シリカ膜又はゲル、及び磁気シリカ粒子は、好ましい例である。シリカ膜は、特に好ましい。これは、磁気シリカ粒子（Ｈｏｕｒｆａｒ， ｅｔ ａｌ等により使用される）よりも廉価で、磁気シリカ粒子と異なり、冷凍保存を必要としない。
【００２０】
核酸と固相との結合はカオトロピック剤の存在により促進され得るが、そのような薬剤の残留は、単離された核酸の酵素処理を阻害し、及び毒性を有する。そのため、本発明の方法は、カオトロピック剤の非存在下で実施されるのが好ましい。
【００２１】
好ましくは、前記固相は、核酸との結合がコスモトロピック剤の存在により促進される固相である。好ましくは、核酸と固相との結合は、コスモトロピック剤の存在下で実施される。そのような薬剤は、シリカベースの固相等の固相と核酸との結合を促進するものとして公知である。
【００２２】
「カオトロピック」及び「コスモトロピック」剤という用語は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ （Ｃａｃａｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９７；３０：２４１−７７）が起源であって、これらの薬剤を、それらが巨大分子及び水の構造に与える影響に依存して区分するものである。カオトロープは、溶媒の構造を破壊する物質として、そしてコスモとロープは、溶媒の構造を強化する物質として定義され得る。Ｃａｃａｃｅ ｅｔ ａｌ．の図１は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ、及びタンパク質の構造／機能に影響するありふれた有機溶媒を示す。カオトロピック剤は、当業者に知られており、例えばヨウ化ナトリウム、過塩素酸根トリウム、グアニジウムチオシアネート及びグアニジウムハイドロクロライド等が挙げられる。コスモトロピック剤は、当業者に知られており、例えば硫酸アンモニウム及び塩化リチウム等が挙げられる。
【００２３】
本発明において、細胞から核酸を単離する方法が提供され、当該方法は、細胞を溶解して核酸を放出させる工程、及び放出された核酸を本発明の方法を使用して単離する工程を含む。
【００２４】
溶解は、好ましくは結合緩衝剤を使用して実施される。細胞溶解用に使用され得る結合緩衝剤は、当業者に知られたものである。Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌにより使用される溶解緩衝剤は、グアニジウムチオシアネート、ｐＨ６．４のＴｒｉｓ塩酸、ＥＤＴＡ（ｐＨ８に調整）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する。しかしながら、溶解緩衝剤は、カオトロピック剤を含有しないのが好ましい。本発明における使用に好ましい溶解／結合緩衝剤は、コスモトロピック剤を含有する。好ましくは、前記緩衝剤は酸性の緩衝剤であり、適切にはｐＫａ（２５℃）が３〜５の範囲の強酸性の緩衝剤である。
【００２５】
核酸の収量の更なる改善は、常温を上回る温度、例えば５０〜９０℃、６０〜８０℃、又は７０〜８０℃で、固相から核酸を溶出することにより達成され得る。
【００２６】
好ましくは、前記核酸は、溶出緩衝剤の存在下で、固相から溶出される。好ましくは、第二のｐＨは、溶出時のｐＨが溶出緩衝剤により調整されるように、溶出緩衝剤の緩衝範囲内である。
【００２７】
好ましい態様において、前記溶出緩衝剤の緩衝範囲は、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲と重複し、又はこれに包含される。これは、洗浄工程後の固相上に残留する洗浄溶液のｐＨが、溶出工程の間に速やかに第二のｐＨまで上昇するのを助ける。
【００２８】
本発明において、更に、本発明の方法における洗浄溶液として使用される溶液が提供される。
【００２９】
本発明において、第一のｐＨで核酸と結合し、第二のより高いｐＨで核酸を溶出する固相を洗浄する緩衝剤を含有する溶液も提供され、ここで、当該溶液のｐＨは、ｐＨ６．３以下、好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０であり、当該緩衝剤の緩衝範囲よりも低い。
【００３０】
好ましくは、本発明の溶液は、カオトロピック剤を含有しない。好ましくは、当該溶液は、有機溶媒を含有しない。
【００３１】
好ましくは、前記緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．０よりも高く、好ましくはｐＨ６．０よりも高い。好ましくは、当該緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ６．５〜１０の範囲と重複し、これに包含され、又はこれを包含する。幾つかの好ましい態様において、当該緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ７．０よりも高い。
【００３２】
好ましくは、本発明の溶液のｐＨは、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ３．５〜５である。
【００３３】
本発明の洗浄溶液又は溶液のための好ましい緩衝剤の例として、Ｔｒｉｓ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤が挙げられる。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ７．１〜９である。ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．５〜６．７である。
【００３４】
本発明において、更に、液体に溶解されることで本発明の溶液を形成する、乾燥形態の組成物が提供される。当該組成物は、凍結乾燥品であってもよい。そのような組成物は、例えば、本発明の溶液を調製し、それを凍結乾燥して、乾燥形態の組成物を形成すること等により調製される場合がある。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の洗浄溶液又は溶液は、更に、洗剤を含有する。洗剤は、単離された核酸のその後の処理に干渉し得る阻害因子の除去を助け得る。適切な例として、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）等のイオン性洗剤、又はＮＰ−４０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン性洗剤が揚げられる。
【００３６】
当然のことながら、洗剤は、本発明の乾燥組成物中には存在しない。乾燥形態の組成物を使用して調製された溶液中に洗剤を含有させる必要があるのであれば、当該組成物が水溶液中に溶解した後に、これを添加し得る。
【００３７】
核酸の収量の増大は、本発明の方法を使用することで、洗浄溶液中にプロテアーゼを含有させること無く達成することが出来る。好ましくは、本発明の洗浄溶液又は溶液は、プロテアーゼを含有しない。
【００３８】
本発明において、核酸を単離するためのキットが提供され、当該キットは、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液；
を備える。
【００３９】
本発明において、核酸を単離するためのキットが提供され、当該キットは、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；
を備える。
【００４０】
それらのキットは、本発明の方法を実施するのに使用され得る。
【００４１】
前記結合緩衝剤は、溶液として、液体に溶解される乾燥形態（例えば凍結乾燥品）として提供されてもよい。
【００４２】
前記液体に溶解されることで洗浄溶液を形成する乾燥形態の組成物、及び／又は前記液体に溶解されることで溶出溶液を形成する乾燥形態の組成物は、凍結乾燥品であってもよい。凍結乾燥品は、例えば、洗浄溶液又は溶出溶液を調製し、当該溶液を凍結乾燥して、乾燥形態の組成物を形成することにより、調製されてもよい。
【００４３】
本発明の結合緩衝剤、又は組成物を溶解するための溶液は、適切には、水又は水溶液である。
【００４４】
本発明のキットの洗浄溶液は、好ましくは、本発明の溶液である。
【００４５】
前記洗浄溶液を提供する乾燥形態の組成物は、好ましくは、本発明の組成物である。
【００４６】
好ましくは、前記キットは、カオトロピック剤及び有機溶媒のいずれも含有しない。好ましくは、前記キットの結合緩衝剤は、コスモトロピック剤を含有する。適切なコスモトロピック剤の例として、硫酸アンモニウム及び塩化リチウムが挙げられる。硫酸アンモニウムが好ましい。
【００４７】
本発明のキットは、更に、核酸が結合できる固相を備える。適切な固相は、上に記載している。好ましい固相は、核酸が当該固相に結合できる第一のｐＨと、当該固相から核酸が溶出できる第二のｐＨとの間にｐＫａを有する、陰イオン化基を有する。好ましくは、当該固相は、無機酸化物であり、好ましくはシリカである。
【００４８】
本発明のキットは、更に、結合緩衝剤と一緒に使用されるプロテアーゼを備え得る。好ましくは、当該プロテアーゼは凍結乾燥品であって、結合緩衝剤と別個に備えられる（及びキットの他の構成から隔離される）。
【００４９】
本発明のキットは、当該キットの構成を使用して核酸の単離を実施する為の指示を備え得る。
【００５０】
更に、本発明のキットは、一旦単離された核酸の精製及び／又は検出に必要な試薬を備える。
【００５１】
本発明のキットは、典型的には、当該キットの構成（即ち、結合緩衝剤、洗浄緩衝剤（又は液体に溶解することで洗浄溶液を形成する乾燥形態の組成物）、及び（存在するのであれば）溶出溶液（又は液体に溶解することで溶出溶液を形成する乾燥形態の組成物））が、個別に包装して提供され、又は当該キットが提供される容器の別個の区画中で保存される。
【００５２】
出願人は、洗浄工程の過程で、核酸が固相との結合を維持し、洗い流されないようにするために、洗浄緩衝剤が、固相表面に残留する結合緩衝剤と混合したときに、第一のｐＨに近いｐＨ値に維持されるべきであると考えた。しかしながら、流出工程の過程で、核酸が固相から効率的に放出されるようにするため、残留する洗浄緩衝剤は、流出溶液と混合したときに、第二のｐＨに変化するべきである。理論に拘束されず、本発明の方法を使用して収量の改善を達成できるのは：（ｉ）洗浄溶液が洗浄工程の過程で固相から顕著な量の核酸を除去せず（洗浄溶液のｐＨが結合緩衝剤の緩衝範囲内であるため）；及び（ｉｉ）固相上に残留した洗浄緩衝剤のｐＨが溶出溶液と混合したときに速やかに第二のｐＨに変化する（洗浄緩衝剤の緩衝範囲であるため）ためであると考えられる。
【００５３】
本発明において、核酸を単離するための、本発明の溶液若しくは組成物の使用、又は本発明のキットの使用も提供される。
【００５４】
出願人は、本願の方法により、生体試料から、僅か２５コピーの核酸、具体的にはウイルスＲＮＡの抽出が可能なことを見出した。ウイルスの濃度が低い場合、本発明の方法を使用して達成される核酸の収量は、カオトロピック塩及び有機溶媒を使用する典型的な核酸抽出方法の場合と同等であり、そうでない場合も再現可能性は良好である。
【００５５】
本発明の方法は、カオトロピック塩及び／又は有機溶媒を使用する公知の幾つかの核酸抽出方法と異なり、無害で、特別な廃棄方法を必要としない緩衝剤製剤を用いて実施され得る。使用される緩衝剤製剤は、安定で、保存の過程で沈殿した構成を再溶解するための使用前の冷蔵又は加熱を必要としない。当該方法は、核酸の単離において、並びに病院及び研究室での試験において使用されてもよく、そして、フィールドでの現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）核酸試験、及びポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）核酸試験において特に重要である。
【００５６】
本発明の態様は、例示のみを目的として、以下に付する図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ｐＨ４及びｐＨ５での酸性及びアルカリ性の洗浄緩衝剤を使用して達成される核酸の収量の比較を示す。
【００５８】
【図２】洗浄緩衝剤のｐＨに対する残留した溶解緩衝剤の影響、及び溶出緩衝剤のｐＨに対する残留した洗浄緩衝剤の影響を示す。
【００５９】
【図３】様々なｐＨ洗浄緩衝剤で達成される核酸の収量の比較（ＭＥＳを含有する洗浄緩衝剤を使用する）を示す。
【００６０】
【図４】核酸を単離するＱｉａｇｅｎの方法と比較した、本発明の方法を使用して達成されるＲＮＡの回収の結果を示す。
【実施例】
【００６１】
実施例１
ｐＨ４及びｐＨ５での酸性及びアルカリ性の洗浄緩衝剤を使用して達成される核酸の収量の比較を示す。
ＨＩＶウイルスＲＮＡを、水ベースの溶解緩衝剤（ｐＨ４．０のＴｒｉｓ酢酸含有）を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、ｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（緩衝範囲ｐＨ７．１〜９）、ｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（緩衝範囲ｐＨ３．０〜６．２）、又はｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（緩衝範囲ｐＨ３．６〜５．６）のいずれかの洗浄緩衝剤で洗浄する。ｐＨ４及び５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、本発明の溶液の態様である。
【００６２】
固相に結合した洗浄された核酸を、溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）で溶出した。当該単離された核酸を、増幅及び検出した。図１は、平均の検出シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【００６３】
図１は、ｐＨ４及びｐＨ５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて達成される核酸の収量が、ｐＨ４及び５の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、並びにｐＨ４及び５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸を用いた場合よりも顕著に高かったことを示す。
【００６４】
前記の酸性の洗浄緩衝剤は、固相上に残留した緩衝剤が溶出緩衝剤のｐＨを低下させることにより、核酸の溶出の効率を下げ、収量を低下させたために、ｐＨ４又は５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌほど効果的ではなかったと考えられる。
【００６５】
実施例２
洗浄緩衝剤のｐＨに対する残留した溶解緩衝剤の影響、及び溶出緩衝剤のｐＨに対する残留した洗浄緩衝剤の影響
残留した溶解緩衝剤と洗浄緩衝剤との間の、及び残留した洗浄緩衝剤と溶出緩衝剤との間の相互作用は、これらの緩衝剤を混合することにより調査された。２０μｌの溶解緩衝剤（ｐＨ４のＴｒｉｓ酢酸を含有する）を５００μｌの洗浄緩衝剤（ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はｐＨ４の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム）と混合し、及び、２０μｌの洗浄緩衝剤（ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はｐＨ４の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム）を１２０μｌの溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）と混合することにより、様々な緩衝剤の相互作用を記載した。混合物のｐＨを、ｐＨ紙を用いて測定した。結果を、図２に示す。
【００６６】
当該結果は、ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが、溶解緩衝剤と混合しても酸性を維持することを示す。ｐＨ４のＴｒｉｓ−ＨＣｌ又はｐＨ６のＴｒｉｓ−ＨＣｌを溶出緩衝剤と混合しても、混合物はｐＨ８．５に維持される。しかしながら、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを溶出緩衝剤と混合した場合、得られる溶液のｐＨは酸性である。
【００６７】
実施例３
異なるｐＨの洗浄緩衝剤（ＭＥＳを含有する洗浄緩衝剤を使用する）で達成される核酸の収量の比較
ＨＩＶウイルスＲＮＡを、水ベースの溶解緩衝剤（ｐＨ４．０のＴｒｉｓ酢酸含有）を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、ｐＨ４．５若しくは６の１０ｍＭ ＭＥＳ（緩衝範囲ｐＨ５．５〜６．７）で洗浄する。核酸を溶出緩衝剤（ｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で溶出した。単離された核酸を、増幅及び検出した。図３は、平均の検出シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【００６８】
結果は、ｐＨ４及び５（ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲より低い）では、取得される核酸の量は、ｐＨ６（ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲内）の場合よりも、顕著に多いことを示す。
【００６９】
収量の改善は、洗浄緩衝剤の緩衝範囲よりも低い酸性のｐＨの洗浄緩衝剤を使用することにより達成されると結論付けられる。
【００７０】
実施例４
本発明の方法を使用して達成されるＲＮＡ回収率の、Ｑｉａｇｅｎの核酸単離方法との比較
ＨＩＶ陽性血漿試料から、本発明の方法及びＱｉａｇｅｎの方法を使用して、ウイルスＲＮＡを単離した。そして、単離された核酸を増幅及び検出した。
【００７１】
本発明の態様の方法は、以下のように実施された：溶解緩衝剤（ｐＨ４，５のクエン酸ナトリウム含有する）を、血漿試料と混合し、インキュベーションし、その後プロテイナーゼＫを添加した。当該混合物をインキュベーションし、そして、シリカ若しくはグラスファイバーの固相上にロードした。結合した核酸を洗浄緩衝剤（ｐＨ３．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）で洗浄し、そして、７５〜８０℃で、溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）で溶出した。
【００７２】
図４は、平均シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。本発明の態様に係る方法の結果を黒色の柱で示し、Ｑｉａｇｅｎの方法の結果を白色の柱で示す。
【００７３】
図４に示された結果は、本発明の方法は、僅か２５コピーの核酸、具体的にはウイルスＲＮＡを、生体試料から抽出することを可能とすることを示す。ウイルスの濃度が低い場合、本発明の態様に係る方法を使用して達成される核酸の収量は、カオトロピック塩及び有機溶媒を使用する典型的な核酸抽出方法の場合と同等であり、そうでない場合も再現可能性は良好である。
【００７４】
使用される緩衝剤製剤は、カオトロピック塩及び／又は有機溶媒を使用する公知の幾つかの核酸抽出方法と異なり、無害で、特別な廃棄方法を必要としない。使用される緩衝剤製剤は、安定で、冷蔵を必要としない。当該方法は、核酸の単離において、並びに病院及び研究室での試験において使用されてもよく、そして、フィールドでの現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）核酸試験、及びポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）核酸試験において特に重要である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を単離するための改善された方法、並びに当該方法に使用される溶液、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の核酸を単離する方法は、カオトロピック剤、例えばグアニジウムチオシアネート、及び細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）するための有機溶媒、及び分解タンパク質（ヌクレアーゼ等、その他核酸を分解するタンパク質）を使用する。例えば、Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９０， Ｖｏｌ． ２８（３）： ４９５−５０３）は、ヒトの血清又は尿を含有する試料を、グアニジウムチオシアネートを含有する溶解／結合緩衝剤の存在下で、シリカ粒子と接触させて行われる方法を記載する。放出された核酸は、シリカ粒子と結合し、それを、グアニジウムチオシアネートを含有する洗浄緩衝剤で、続いてエタノールで、続いてアセトンで洗浄する。結合した核酸は、続いて、水性低塩濃度緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で溶出される。
【０００３】
しかしながら、そのような方法は、カオトロピック剤及び有機溶媒が酵素反応に対し高度に阻害的であるという短所を有する。溶出した試料中にキャリーオーバーされるこれらの物質の残存量は、単離された核酸のその後の酵素的プロセス、例えばシークエンシング又は増幅等に、干渉する可能性がある。カオトロピック剤及び有機溶媒は、これらの試薬が、毒性で、取り扱いが困難で、及び処分に特別な規定がある点においても望ましくない。カオトロピック剤の使用の更なる短所は、それらが高いモル濃度を要するため、保存中に溶液内に沈殿が生じる場合があることである。これらの薬剤を含有する溶液は、使用前に加熱することにより、カオトロピック剤を再溶解させることが必要な場合もある。
【０００４】
カオトロピック塩及び有機溶媒の必要性は、Ｈｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌ， （Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００５， ５１ （７）： １２１７−１２２２）が記載した方法において、回避されている。コスモトロピック塩（硫酸アンモニウム）を含有する溶解／結合緩衝剤の存在下、血漿試料を磁気シリカ粒子と混合し、その後プロテイナーゼＫを添加する。磁気粒子を分離した後、プロテイナーゼＫを含有する洗浄緩衝剤で洗浄し、そして８０℃で溶出緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて溶出する。そのような方法を使用して妥当な量の核酸を取得することは可能であるが、なおも核酸の収量の増大が要求されている。また、プロテイナーゼＫ等の酵素を何ら必要とせずに実施できる方法の提供も要求されている。酵素を使用する場合、前記方法を実施するコストが増大し、また、安定性を維持するために、別個の特別な条件（例えば、低温又は凍結乾燥形態等）下で酵素を保存することが必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明において、核酸を単離する方法であって、以下：
（ｉ） 結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで、核酸を固相に結合させる工程；
（ｉｉ） 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程；及び
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨで、核酸を固相から溶出させる工程；
を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ）を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤（即ち洗浄緩衝剤）の緩衝範囲よりも低い、前記方法が提供される。
【０００６】
出願人は、本発明の方法が、Ｈｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌにより記載された方法等の従来の方法と比較して、核酸の収量の驚異的な増大をもたらすことを見出した。本発明の方法の使用による収量の改善は、従来技術と比較した場合の、洗浄工程で固相から除去される核酸の量の減少、及び／又は溶出工程で固相から放出される核酸の量の増大によるものと考えられる。
【０００７】
核酸の収量の改善は、洗浄溶液中の酵素（プロテアーゼ等）の存在、又は有機溶媒若しくはカオトロピック剤の使用を必要とせずに、本発明の方法を使用して達成され得る。故に、洗浄溶液は、例えばＨｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌの方法で必要な洗浄溶液と比較して単純化され、プロテアーゼ又は他の酵素を別個に保管する必要が無い。カオトロピック剤又は有機溶媒を必要としないので、そのような薬剤又は溶媒が単離された核酸のその後の酵素処理を阻害するのを回避できる。
【０００８】
好ましくは、前記第一のｐＨは酸性のｐＨであって、好ましくはｐＨ３〜６、又はｐＨ３〜５の範囲内である。好ましくは、前記第二のｐＨは、ｐＨ６．５以上であり、好ましくはｐＨ７．０以上であり、又はアルカリ性のｐＨである。適切には、前記第二のｐＨは、ｐＨ６．５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９の範囲内である。そのようなｐＨ値は、低いｐＨで核酸を結合させ、そして高いｐＨで核酸を放出することが可能なシリカベースの固相等の固相で典型的に使用されるものである。核酸にダメージを与えかねない極端なｐＨは避けられる。
【０００９】
好ましくは、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲は、前記第一のｐＨよりも高い（即ち洗浄緩衝剤の緩衝範囲の下端が前記第一のｐＨよりも高い）。好ましくは、当該洗浄緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．０よりも高い。好ましくは、前記第二のｐＨは、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲内である。このことは、洗浄工程後に固相上に存在する残留洗浄溶液のｐＨが、溶出工程の間に最も効率的に第二のｐＨに転換されることにより、固相から放出される核酸の量を最大にすると考えられるため、好ましい。
【００１０】
好ましくは、前記洗浄溶液のｐＨは、ｐＨ６．３以下、好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０である。これらの好ましい範囲内のｐＨの洗浄溶液の使用は、好ましい結合及び洗浄緩衝剤の緩衝範囲に適合する。
【００１１】
好ましくは、前記第一のｐＨは、結合工程のｐＨが結合緩衝剤により調整されるように、結合緩衝剤の緩衝範囲内である。好ましくは、結合緩衝剤の緩衝範囲の下端は、結合工程における極端なｐＨを避けるように、ｐＨ３．０以上である。
【００１２】
溶解、結合、洗浄及び溶出緩衝剤に通常使用される緩衝剤の緩衝範囲は、当業者に知られている。幾つかの重要な生物学的緩衝剤のｐＫａ値及び緩衝範囲を、緩衝範囲により区別して、下記表１に示す（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの引用）。
【００１３】
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【００１４】
本発明の方法は、結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで核酸を結合させ、及び第二のｐＨで核酸を溶出させることが出来る固相と共に、公知の結合緩衝剤及び／又は溶出緩衝剤を使用して実施される場合もある。
【００１５】
前記固相は、イオン化基を有し、周囲の条件に従って電荷を変化させる。イオン化基のｐＫａは、固相に核酸が結合し、及び固相から核酸が放出されるのに要求される条件に適合する。一般に、核酸は、ｐＫａより低い、又は概ね等しいｐＨで、固相と結合し得て、そしてより高いｐＨ（通常はｐＫａを超える）で固相から放出され得る。第一のｐＨで核酸と結合し、そして結合した核酸を第一のｐＨよりも高いｐＨで溶出する適切な固相は、当業者に周知である。例えば、第一のｐＨで固相は正の電荷を有し、そして第二のｐＨで固相の正電荷は小さくなり、中性になり、又は負電荷を有し得る。あるいは、又は加えて、第一のｐＨにおいて、固相は中性又は負の電荷を有し、そして第二のｐＨで固相は負電荷又は更なる負電荷を有し得る。そのような電荷の変化により、核酸は、第一のｐＨで核酸に吸着され、そして第二のｐＨで核酸から放出される。
【００１６】
例えば、固相は、ｐＫａが第一及び第二のｐＨの間である陰イオン化基を含み得る。核酸は、当該固相が中性又は負電荷が小さいときに固相に結合し、そして、固相が負電荷を有するとき、又は更なる負電荷を有するとき、固相から放出される。
【００１７】
あるいは、又は加えて、固相は、ｐＫａが第一及び第二のｐＨの間である陽イオン化基を含み得る。核酸は、当該固相が正電荷を有するときに固相に結合し、そして、中性又は正電荷が小さいとき、固相から放出される。
【００１８】
本発明において使用され得る固相の例として、無機酸化物、例えばシリカ又はガラス（例えばＢｏｏｍ ｅｔ ａｌ又はＨｏｕｒｆａｒ ｅｔ ａｌに記載のもの）、若しくは酸化アルミニウム等、多糖類、電荷切り替え材料（例えばＷＯ ０２／４８１６４に記載のもの）等が挙げられる。
【００１９】
前記固相は、例えば、膜、ゲル、又は粒子、例えば磁気粒子等の、任意の適切な形態をとる場合がある。シリカ膜又はゲル、及び磁気シリカ粒子は、好ましい例である。シリカ膜は、特に好ましい。これは、磁気シリカ粒子（Ｈｏｕｒｆａｒ， ｅｔ ａｌ等により使用される）よりも廉価で、磁気シリカ粒子と異なり、冷凍保存を必要としない。
【００２０】
核酸と固相との結合はカオトロピック剤の存在により促進され得るが、そのような薬剤の残留は、単離された核酸の酵素処理を阻害し、及び毒性を有する。そのため、本発明の方法は、カオトロピック剤の非存在下で実施されるのが好ましい。
【００２１】
好ましくは、前記固相は、核酸との結合がコスモトロピック剤の存在により促進される固相である。好ましくは、核酸と固相との結合は、コスモトロピック剤の存在下で実施される。そのような薬剤は、シリカベースの固相等の固相と核酸との結合を促進するものとして公知である。
【００２２】
「カオトロピック」及び「コスモトロピック」剤という用語は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ （Ｃａｃａｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９７；３０：２４１−７７）が起源であって、これらの薬剤を、それらが巨大分子及び水の構造に与える影響に依存して区分するものである。カオトロープは、溶媒の構造を破壊する物質として、そしてコスモとロープは、溶媒の構造を強化する物質として定義され得る。Ｃａｃａｃｅ ｅｔ ａｌ．の図１は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ ｓｅｒｉｅｓ、及びタンパク質の構造／機能に影響するありふれた有機溶媒を示す。カオトロピック剤は、当業者に知られており、例えばヨウ化ナトリウム、過塩素酸根トリウム、グアニジウムチオシアネート及びグアニジウムハイドロクロライド等が挙げられる。コスモトロピック剤は、当業者に知られており、例えば硫酸アンモニウム及び塩化リチウム等が挙げられる。
【００２３】
本発明において、細胞から核酸を単離する方法が提供され、当該方法は、細胞を溶解して核酸を放出させる工程、及び放出された核酸を本発明の方法を使用して単離する工程を含む。
【００２４】
溶解は、好ましくは結合緩衝剤を使用して実施される。細胞溶解用に使用され得る結合緩衝剤は、当業者に知られたものである。Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌにより使用される溶解緩衝剤は、グアニジウムチオシアネート、ｐＨ６．４のＴｒｉｓ塩酸、ＥＤＴＡ（ｐＨ８に調整）、及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する。しかしながら、溶解緩衝剤は、カオトロピック剤を含有しないのが好ましい。本発明における使用に好ましい溶解／結合緩衝剤は、コスモトロピック剤を含有する。好ましくは、前記緩衝剤は酸性の緩衝剤であり、適切にはｐＫａ（２５℃）が３〜５の範囲の強酸性の緩衝剤である。
【００２５】
核酸の収量の更なる改善は、常温を上回る温度、例えば５０〜９０℃、６０〜８０℃、又は７０〜８０℃で、固相から核酸を溶出することにより達成され得る。
【００２６】
好ましくは、前記核酸は、溶出緩衝剤の存在下で、固相から溶出される。好ましくは、第二のｐＨは、溶出時のｐＨが溶出緩衝剤により調整されるように、溶出緩衝剤の緩衝範囲内である。
【００２７】
好ましい態様において、前記溶出緩衝剤の緩衝範囲は、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲と重複し、又はこれに包含される。これは、洗浄工程後の固相上に残留する洗浄溶液のｐＨが、溶出工程の間に速やかに第二のｐＨまで上昇するのを助ける。
【００２８】
本発明において、更に、本発明の方法における洗浄溶液として使用される溶液が提供される。
【００２９】
本発明において、第一のｐＨで核酸と結合し、第二のより高いｐＨで核酸を溶出する固相を洗浄する緩衝剤を含有する溶液も提供され、ここで、当該溶液のｐＨは、ｐＨ６．３以下、好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０であり、当該緩衝剤の緩衝範囲よりも低い。
【００３０】
好ましくは、本発明の溶液は、カオトロピック剤を含有しない。好ましくは、当該溶液は、有機溶媒を含有しない。
【００３１】
好ましくは、前記緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．０よりも高く、好ましくはｐＨ６．０よりも高い。好ましくは、当該緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ６．５〜１０の範囲と重複し、これに包含され、又はこれを包含する。幾つかの好ましい態様において、当該緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ７．０よりも高い。
【００３２】
好ましくは、本発明の溶液のｐＨは、ｐＨ５．０以下、好ましくはｐＨ３．５〜５である。
【００３３】
本発明の洗浄溶液又は溶液のための好ましい緩衝剤の例として、Ｔｒｉｓ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤が挙げられる。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ７．１〜９である。ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲は、ｐＨ５．５〜６．７である。
【００３４】
本発明において、更に、液体に溶解されることで本発明の溶液を形成する、乾燥形態の組成物が提供される。当該組成物は、凍結乾燥品であってもよい。そのような組成物は、例えば、本発明の溶液を調製し、それを凍結乾燥して、乾燥形態の組成物を形成すること等により調製される場合がある。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の洗浄溶液又は溶液は、更に、洗剤を含有する。洗剤は、単離された核酸のその後の処理に干渉し得る阻害因子の除去を助け得る。適切な例として、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）等のイオン性洗剤、又はＮＰ−４０及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ等の非イオン性洗剤が揚げられる。
【００３６】
当然のことながら、洗剤は、本発明の乾燥組成物中には存在しない。乾燥形態の組成物を使用して調製された溶液中に洗剤を含有させる必要があるのであれば、当該組成物が水溶液中に溶解した後に、これを添加し得る。
【００３７】
核酸の収量の増大は、本発明の方法を使用することで、洗浄溶液中にプロテアーゼを含有させること無く達成することが出来る。好ましくは、本発明の洗浄溶液又は溶液は、プロテアーゼを含有しない。
【００３８】
本発明において、核酸を単離するためのキットが提供され、当該キットは、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液；
を備える。
【００３９】
本発明において、核酸を単離するためのキットが提供され、当該キットは、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であって、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；
を備える。
【００４０】
それらのキットは、本発明の方法を実施するのに使用され得る。
【００４１】
前記結合緩衝剤は、溶液として、液体に溶解される乾燥形態（例えば凍結乾燥品）として提供されてもよい。
【００４２】
前記液体に溶解されることで洗浄溶液を形成する乾燥形態の組成物、及び／又は前記液体に溶解されることで溶出溶液を形成する乾燥形態の組成物は、凍結乾燥品であってもよい。凍結乾燥品は、例えば、洗浄溶液又は溶出溶液を調製し、当該溶液を凍結乾燥して、乾燥形態の組成物を形成することにより、調製されてもよい。
【００４３】
本発明の結合緩衝剤、又は組成物を溶解するための溶液は、適切には、水又は水溶液である。
【００４４】
本発明のキットの洗浄溶液は、好ましくは、本発明の溶液である。
【００４５】
前記洗浄溶液を提供する乾燥形態の組成物は、好ましくは、本発明の組成物である。
【００４６】
好ましくは、前記キットは、カオトロピック剤及び有機溶媒のいずれも含有しない。好ましくは、前記キットの結合緩衝剤は、コスモトロピック剤を含有する。適切なコスモトロピック剤の例として、硫酸アンモニウム及び塩化リチウムが挙げられる。硫酸アンモニウムが好ましい。
【００４７】
本発明のキットは、更に、核酸が結合できる固相を備える。適切な固相は、上に記載している。好ましい固相は、核酸が当該固相に結合できる第一のｐＨと、当該固相から核酸が溶出できる第二のｐＨとの間にｐＫａを有する、陰イオン化基を有する。好ましくは、当該固相は、無機酸化物であり、好ましくはシリカである。
【００４８】
本発明のキットは、更に、結合緩衝剤と一緒に使用されるプロテアーゼを備え得る。好ましくは、当該プロテアーゼは凍結乾燥品であって、結合緩衝剤と別個に備えられる（及びキットの他の構成から隔離される）。
【００４９】
本発明のキットは、当該キットの構成を使用して核酸の単離を実施する為の指示を備え得る。
【００５０】
更に、本発明のキットは、一旦単離された核酸の精製及び／又は検出に必要な試薬を備える。
【００５１】
本発明のキットは、典型的には、当該キットの構成（即ち、結合緩衝剤、洗浄緩衝剤（又は液体に溶解することで洗浄溶液を形成する乾燥形態の組成物）、及び（存在するのであれば）溶出溶液（又は液体に溶解することで溶出溶液を形成する乾燥形態の組成物））が、個別に包装して提供され、又は当該キットが提供される容器の別個の区画中で保存される。
【００５２】
出願人は、洗浄工程の過程で、核酸が固相との結合を維持し、洗い流されないようにするために、洗浄緩衝剤が、固相表面に残留する結合緩衝剤と混合したときに、第一のｐＨに近いｐＨ値に維持されるべきであると考えた。しかしながら、流出工程の過程で、核酸が固相から効率的に放出されるようにするため、残留する洗浄緩衝剤は、流出溶液と混合したときに、第二のｐＨに変化するべきである。理論に拘束されず、本発明の方法を使用して収量の改善を達成できるのは：（ｉ）洗浄溶液が洗浄工程の過程で固相から顕著な量の核酸を除去せず（洗浄溶液のｐＨが結合緩衝剤の緩衝範囲内であるため）；及び（ｉｉ）固相上に残留した洗浄緩衝剤のｐＨが溶出溶液と混合したときに速やかに第二のｐＨに変化する（洗浄緩衝剤の緩衝範囲であるため）ためであると考えられる。
【００５３】
本発明において、核酸を単離するための、本発明の溶液若しくは組成物の使用、又は本発明のキットの使用も提供される。
【００５４】
出願人は、本願の方法により、生体試料から、僅か２５コピーの核酸、具体的にはウイルスＲＮＡの抽出が可能なことを見出した。ウイルスの濃度が低い場合、本発明の方法を使用して達成される核酸の収量は、カオトロピック塩及び有機溶媒を使用する典型的な核酸抽出方法の場合と同等であり、そうでない場合も再現可能性は良好である。
【００５５】
本発明の方法は、カオトロピック塩及び／又は有機溶媒を使用する公知の幾つかの核酸抽出方法と異なり、無害で、特別な廃棄方法を必要としない緩衝剤製剤を用いて実施され得る。使用される緩衝剤製剤は、安定で、保存の過程で沈殿した構成を再溶解するための使用前の冷蔵又は加熱を必要としない。当該方法は、核酸の単離において、並びに病院及び研究室での試験において使用されてもよく、そして、フィールドでの現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）核酸試験、及びポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）核酸試験において特に重要である。
【００５６】
本発明の態様は、例示のみを目的として、以下に付する図面を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ｐＨ４及びｐＨ５での酸性及びアルカリ性の洗浄緩衝剤を使用して達成される核酸の収量の比較を示す。
【００５８】
【図２】洗浄緩衝剤のｐＨに対する残留した溶解緩衝剤の影響、及び溶出緩衝剤のｐＨに対する残留した洗浄緩衝剤の影響を示す。
【００５９】
【図３】様々なｐＨ洗浄緩衝剤で達成される核酸の収量の比較（ＭＥＳを含有する洗浄緩衝剤を使用する）を示す。
【００６０】
【図４】核酸を単離するＱｉａｇｅｎの方法と比較した、本発明の方法を使用して達成されるＲＮＡの回収の結果を示す。
【実施例】
【００６１】
実施例１
ｐＨ４及びｐＨ５での酸性及びアルカリ性の洗浄緩衝剤を使用して達成される核酸の収量の比較を示す。
ＨＩＶウイルスＲＮＡを、水ベースの溶解緩衝剤（ｐＨ４．０のＴｒｉｓ酢酸含有）を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、ｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（緩衝範囲ｐＨ７．１〜９）、ｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム（緩衝範囲ｐＨ３．０〜６．２）、又はｐＨ４若しくは５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（緩衝範囲ｐＨ３．６〜５．６）のいずれかの洗浄緩衝剤で洗浄する。ｐＨ４及び５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、本発明の溶液の態様である。
【００６２】
固相に結合した洗浄された核酸を、溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）で溶出した。当該単離された核酸を、増幅及び検出した。図１は、平均の検出シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【００６３】
図１は、ｐＨ４及びｐＨ５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて達成される核酸の収量が、ｐＨ４及び５の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、並びにｐＨ４及び５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸を用いた場合よりも顕著に高かったことを示す。
【００６４】
前記の酸性の洗浄緩衝剤は、固相上に残留した緩衝剤が溶出緩衝剤のｐＨを低下させることにより、核酸の溶出の効率を下げ、収量を低下させたために、ｐＨ４又は５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌほど効果的ではなかったと考えられる。
【００６５】
実施例２
洗浄緩衝剤のｐＨに対する残留した溶解緩衝剤の影響、及び溶出緩衝剤のｐＨに対する残留した洗浄緩衝剤の影響
残留した溶解緩衝剤と洗浄緩衝剤との間の、及び残留した洗浄緩衝剤と溶出緩衝剤との間の相互作用は、これらの緩衝剤を混合することにより調査された。２０μｌの溶解緩衝剤（ｐＨ４のＴｒｉｓ酢酸を含有する）を５００μｌの洗浄緩衝剤（ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はｐＨ４の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム）と混合し、及び、２０μｌの洗浄緩衝剤（ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はｐＨ４の１０ｍＭ クエン酸ナトリウム）を１２０μｌの溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）と混合することにより、様々な緩衝剤の相互作用を記載した。混合物のｐＨを、ｐＨ紙を用いて測定した。結果を、図２に示す。
【００６６】
当該結果は、ｐＨ４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びｐＨ６の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌが、溶解緩衝剤と混合しても酸性を維持することを示す。ｐＨ４のＴｒｉｓ−ＨＣｌ又はｐＨ６のＴｒｉｓ−ＨＣｌを溶出緩衝剤と混合しても、混合物はｐＨ８．５に維持される。しかしながら、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを溶出緩衝剤と混合した場合、得られる溶液のｐＨは酸性である。
【００６７】
実施例３
異なるｐＨの洗浄緩衝剤（ＭＥＳを含有する洗浄緩衝剤を使用する）で達成される核酸の収量の比較
ＨＩＶウイルスＲＮＡを、水ベースの溶解緩衝剤（ｐＨ４．０のＴｒｉｓ酢酸含有）を使用して単離し、シリカベースの固相に結合させ、そして、ｐＨ４．５若しくは６の１０ｍＭ ＭＥＳ（緩衝範囲ｐＨ５．５〜６．７）で洗浄する。核酸を溶出緩衝剤（ｐＨ８．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）で溶出した。単離された核酸を、増幅及び検出した。図３は、平均の検出シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【００６８】
結果は、ｐＨ４及び５（ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲より低い）では、取得される核酸の量は、ｐＨ６（ＭＥＳ緩衝剤の緩衝範囲内）の場合よりも、顕著に多いことを示す。
【００６９】
収量の改善は、洗浄緩衝剤の緩衝範囲よりも低い酸性のｐＨの洗浄緩衝剤を使用することにより達成されると結論付けられる。
【００７０】
実施例４
本発明の方法を使用して達成されるＲＮＡ回収率の、Ｑｉａｇｅｎの核酸単離方法との比較
ＨＩＶ陽性血漿試料から、本発明の方法及びＱｉａｇｅｎの方法を使用して、ウイルスＲＮＡを単離した。そして、単離された核酸を増幅及び検出した。
【００７１】
本発明の態様の方法は、以下のように実施された：溶解緩衝剤（ｐＨ４，５のクエン酸ナトリウム含有する）を、血漿試料と混合し、インキュベーションし、その後プロテイナーゼＫを添加した。当該混合物をインキュベーションし、そして、シリカ若しくはグラスファイバーの固相上にロードした。結合した核酸を洗浄緩衝剤（ｐＨ３．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）で洗浄し、そして、７５〜８０℃で、溶出緩衝剤（ｐＨ８．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する）で溶出した。
【００７２】
図４は、平均シグナル強度を示し、エラーバーは、平均の標準誤差を示す。本発明の態様に係る方法の結果を黒色の柱で示し、Ｑｉａｇｅｎの方法の結果を白色の柱で示す。
【００７３】
図４に示された結果は、本発明の方法は、僅か２５コピーの核酸、具体的にはウイルスＲＮＡを、生体試料から抽出することを可能とすることを示す。ウイルスの濃度が低い場合、本発明の態様に係る方法を使用して達成される核酸の収量は、カオトロピック塩及び有機溶媒を使用する典型的な核酸抽出方法の場合と同等であり、そうでない場合も再現可能性は良好である。
【００７４】
使用される緩衝剤製剤は、カオトロピック塩及び／又は有機溶媒を使用する公知の幾つかの核酸抽出方法と異なり、無害で、特別な廃棄方法を必要としない。使用される緩衝剤製剤は、安定で、冷蔵を必要としない。当該方法は、核酸の単離において、並びに病院及び研究室での試験において使用されてもよく、そして、フィールドでの現場（ｏｎ−ｓｉｔｅ）核酸試験、及びポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）核酸試験において特に重要である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を単離する方法であって、以下：
（ｉ） 結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで、核酸を固相に結合させる工程；
（ｉｉ） 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程；及び
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨで、核酸を固相から溶出させる工程；
を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ）を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記方法。
【請求項２】
前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲が、第一のｐＨよりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二のｐＨが、洗浄緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲がｐＨ５．０よりも高い、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のｐＨが、ｐＨ３〜６又はｐＨ３〜５の範囲内である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のｐＨが、ｐＨ６．５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄溶液のｐＨがｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ３．０〜６．０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のｐＨが結合緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記結合緩衝剤の緩衝範囲の下端がｐＨ３．０以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
カオトロピック剤及び有機溶媒の非存在下で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固相への核酸の結合が、コスモトロピック剤の存在下で実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記コスモトロピック剤が硫酸アンモニウムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相が、第一のｐＨと第二のｐＨの間のｐＫａを有する陰イオン化基（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｉｏｎｉｓａｂｌｅ ｇｒｏｕｐ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記固相が無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞から核酸を単離する方法であって、細胞を溶解して細胞から核酸を放出させる工程、及び放出された核酸を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を使用して単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記溶解が結合緩衝剤を使用して行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合緩衝剤がコスモトロピック剤を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
室温よりも高い温度で前記核酸が固相から溶出される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
溶出緩衝剤の存在下で前記核酸が固相から溶出され、第二のｐＨが溶出緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出緩衝剤の緩衝範囲が、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲と重複し、又はこれに包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一のｐＨで核酸が結合し、そして第二のより高いｐＨで核酸が溶出される固相を洗浄する緩衝剤を含有する溶液であって、ｐＨが、ｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０であり、前記緩衝剤の緩衝範囲がｐＨ６．０を超える、前記溶液。
【請求項２２】
カオトロピック剤を含まない、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２３】
有機溶媒を含まない、請求項２１又は２２のいずれかに記載の溶液。
【請求項２４】
ｐＨがｐＨ５．０以下である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２５】
前記緩衝剤の緩衝範囲が、ｐＨ６．５〜１０の範囲と重複し、これに包含され、又はこれを包含する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２６】
前記緩衝剤がＴｒｉｓ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２７】
プロテアーゼを含有しない、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２８】
更に洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含有する、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２９】
液体に溶解されることで請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の溶液を形成する、乾燥形態の組成物。
【請求項３０】
核酸を単離するためのキットであって、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液；
を備える、前記キット。
【請求項３１】
核酸を単離するためのキットであって、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；
を備える、前記キット。
【請求項３２】
前記洗浄溶液が、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の溶液である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、前記乾燥形態の組成物が、請求項２９に記載の組成物である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
カオトロピック剤を含有せず、及び有機溶媒を含有しない、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
前記結合緩衝剤が、コスモトロピック剤を含有する、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
更に、結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで核酸が結合し、そして第二のｐＨで核酸が溶出する固相を備える、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
前記固相が、核酸が固相と結合可能な第一のｐＨと、固相から核酸が溶出可能な第二のｐＨとの間のｐＫａを有する陰イオン化基を含む固相を備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記固相が、無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項３６又は３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
更に、プロテアーゼ、好ましくは凍結乾燥品のプロテアーゼを、結合緩衝剤と別個に備える、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
核酸を単離するための、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の溶液、請求項２９に記載の組成物、又は請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項１】
核酸を単離する方法であって、以下：
（ｉ） 結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで、核酸を固相に結合させる工程；
（ｉｉ） 結合した核酸を洗浄溶液で洗浄する工程；及び
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨで、核酸を固相から溶出させる工程；
を含み、前記洗浄溶液が、前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｒａｎｇｅ）を有する緩衝剤を含み、且つ前記洗浄溶液のｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記方法。
【請求項２】
前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲が、第一のｐＨよりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二のｐＨが、洗浄緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲がｐＨ５．０よりも高い、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のｐＨが、ｐＨ３〜６又はｐＨ３〜５の範囲内である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のｐＨが、ｐＨ６．５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記洗浄溶液のｐＨがｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ３．０〜６．０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のｐＨが結合緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記結合緩衝剤の緩衝範囲の下端がｐＨ３．０以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
カオトロピック剤及び有機溶媒の非存在下で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固相への核酸の結合が、コスモトロピック剤の存在下で実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記コスモトロピック剤が硫酸アンモニウムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相が、第一のｐＨと第二のｐＨの間のｐＫａを有する陰イオン化基（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｉｏｎｉｓａｂｌｅ ｇｒｏｕｐ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記固相が無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞から核酸を単離する方法であって、細胞を溶解して細胞から核酸を放出させる工程、及び放出された核酸を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を使用して単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記溶解が結合緩衝剤を使用して行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合緩衝剤がコスモトロピック剤を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
室温よりも高い温度で前記核酸が固相から溶出される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
溶出緩衝剤の存在下で前記核酸が固相から溶出され、第二のｐＨが溶出緩衝剤の緩衝範囲内である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出緩衝剤の緩衝範囲が、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲と重複し、又はこれに包含される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第一のｐＨで核酸が結合し、そして第二のより高いｐＨで核酸が溶出される固相を洗浄する緩衝剤を含有する溶液であって、ｐＨが、ｐＨ６．０以下、好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０であり、前記緩衝剤の緩衝範囲がｐＨ６．０を超える、前記溶液。
【請求項２２】
カオトロピック剤を含まない、請求項２１に記載の溶液。
【請求項２３】
有機溶媒を含まない、請求項２１又は２２のいずれかに記載の溶液。
【請求項２４】
ｐＨがｐＨ５．０以下である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２５】
前記緩衝剤の緩衝範囲が、ｐＨ６．５〜１０の範囲と重複し、これに包含され、又はこれを包含する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２６】
前記緩衝剤がＴｒｉｓ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２７】
プロテアーゼを含有しない、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２８】
更に洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含有する、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項２９】
液体に溶解されることで請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の溶液を形成する、乾燥形態の組成物。
【請求項３０】
核酸を単離するためのキットであって、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液；
を備える、前記キット。
【請求項３１】
核酸を単離するためのキットであって、以下：
（ｉ） 第一のｐＨで固相に核酸を結合させるための結合緩衝剤；
（ｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高いｐＨを包含する緩衝範囲を有する緩衝剤を含有する洗浄溶液であり、ｐＨが、前記結合緩衝剤の緩衝範囲内であるが、前記洗浄溶液の緩衝剤の緩衝範囲よりも低い、前記洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；及び任意で
（ｉｉｉ） 前記第一のｐＨよりも高い第二のｐＨ値をとる、固相から核酸を溶出するための溶液を、液体に溶解されることで形成する、乾燥形態の組成物；
を備える、前記キット。
【請求項３２】
前記洗浄溶液が、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の溶液である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
洗浄溶液を、液体に溶解されることで形成する、前記乾燥形態の組成物が、請求項２９に記載の組成物である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
カオトロピック剤を含有せず、及び有機溶媒を含有しない、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
前記結合緩衝剤が、コスモトロピック剤を含有する、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
更に、結合緩衝剤の存在下、第一のｐＨで核酸が結合し、そして第二のｐＨで核酸が溶出する固相を備える、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
前記固相が、核酸が固相と結合可能な第一のｐＨと、固相から核酸が溶出可能な第二のｐＨとの間のｐＫａを有する陰イオン化基を含む固相を備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記固相が、無機酸化物、好ましくはシリカを含む、請求項３６又は３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
更に、プロテアーゼ、好ましくは凍結乾燥品のプロテアーゼを、結合緩衝剤と別個に備える、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
核酸を単離するための、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の溶液、請求項２９に記載の組成物、又は請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のキットの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５３０２７８（Ｐ２０１１−５３０２７８Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２１６３８（Ｐ２０１１−５２１６３８）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１９５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１５８３５
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５０３３７２８４２）ケンブリッジ エンタープライズ リミティド (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１９５１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１５８３５
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５０３３７２８４２）ケンブリッジ エンタープライズ リミティド (32)
【Ｆターム（参考）】
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