核酸の定量方法
【課題】従来の処方法の欠点を克服する新たな簡便なDNA定量分析手法を提供すること。
【解決手段】ターゲットDNAに一塩基置換を導入した標準DNA試料を調製し、その一定量をターゲットDNA試料に混合し、前記一塩基置換部位を含むようにターゲットDNAと標準DNAを同一のプライマーで増幅し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブを用いて、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行い、ルシフェラーゼ反応により生成するピロリン酸に由来する発光を検出し、検出された発光量と加えた標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する。
【解決手段】ターゲットDNAに一塩基置換を導入した標準DNA試料を調製し、その一定量をターゲットDNA試料に混合し、前記一塩基置換部位を含むようにターゲットDNAと標準DNAを同一のプライマーで増幅し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブを用いて、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行い、ルシフェラーゼ反応により生成するピロリン酸に由来する発光を検出し、検出された発光量と加えた標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA及びRNAの定量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現量を調べることは、医薬品開発あるいは病気の因果関係を調べる上で重要事項である。しかし、DNAを中心とするバイオの分野ではターゲットとなるDNAのコピー数は一般に少ないことが多く、これらを増幅して計測するが、そのコピー数を正確に求めたいという要求が増大している。
【０００３】
現在利用されている代表的なDNA定量方法としては、１）電気泳動法、２）DNAマイクロアレイ法（特許文献１）、３）リアルタイムPCR法（非特許文献１）の３種類が挙げられる。このうち、電気泳動法は、マイナスに荷電するDNAを電気泳動分離し、分離された標準試料とターゲット試料のバンドを染色して、その強度比を調べる定量方法である。この方法は解析コストが安価であるが、欠点は定量精度が低いことである。
【０００４】
DNAマイクロアレイ法は、異なる蛍光体で標識されたターゲット試料及び標準試料を、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドもしくはcDNAが固定されたDNAチップと競合ハイブリダイズさせ、蛍光強度比を調べる定量方法である。この方法は一度に数万といった多数の遺伝子を定量可能であるが、得られる蛍光強度比は遺伝子配列の２次構造及びクロスハイブリダイズの影響を受け易い。したがって、この方法の欠点は定量精度が悪いこと、及び解析（装置・DNAチップ・試薬）に多額の費用が必要であることである。
【０００５】
一方、リアルタイムPCR法は、ターゲット試料と標準試料を同時にPCR増幅しながら試料から発せられる蛍光を観測し、PCR産物が一定量に達した時のPCRサイクル数から、初めに存在したターゲット試料の量を定量する方法である。PCR産物量を調べる手段としては、SYBR GREENを用いたインターカレーター法、もしくは遺伝子特異的プローブを用いた所謂TaqManプローブ法がある。このTaqManプローブとは、消光原子団と蛍光原子団がDNAプローブを介して繋がれたものであり、最初それ自身は蛍光を発しないが、PCR増幅するにしたがってプローブが部分分解し、遊離した蛍光原子団が蛍光を発する。この方法は、定量精度が比較的高く、検出下限も数分子程度と低い。しかしながらPCR増幅過程を実時間でモニターする、高額な装置が必要であること、さらに解析に先立って同じ配列を持った標準試料の希釈系列（少なくとも5つの異なる濃度）を作製し、毎回ターゲット試料と同時に実時間解析しなければならないこと、操作が煩雑で時間と労力を要することが問題である。
【０００６】
【特許文献１】特開2004-33160号
【非特許文献１】Higuchi R, et al, Bio. Technology, 413-417, （1992）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、従来のDNA定量方法の欠点を克服し、新規で簡便なDNA定量法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明では、定量対象であるターゲットDNAの一部を3’末端近傍に１塩基ミスマッチ（一塩基置換）を入れたプライマーで増幅し、ターゲットDNAとは１塩基だけ配列が異なる配列を有する「標準DNA試料」を調製する。標準DNAは、ターゲットDNAの少なくとも一部（例えば、解析対象とする領域）へ、１塩基ミスマッチを導入したものとすることができる。
【０００９】
調製した標準DNA試料の一定量をターゲットDNA試料と混合する。この混合したDNA試料をPCR増幅したのち定量分析するが、このとき用いるPCRプライマーは、標準試料作成時に導入した一塩基置換部分が増幅領域に含まれるように設計する。PCRで増幅される領域の配列は人為的に導入した一塩基置換部分以外は全く同じ配列であり、ターゲットDNAと標準DNAを同時に、その比率を保ったまま増幅することができる。
【００１０】
得られた増幅産物は１本鎖化した後、一塩基置換部分の塩基の存在比を計測し、加えた標準DNA試料の量とこの存在比からターゲットDNAの量を求める。一塩基置換部分の存在比は、ターミネーターddNTPを用いた相補鎖合成反応を行い、この反応の副産物であるピロリン酸をATPに変換し、ATPを基質とするルシフェラーゼによる発光を検出することで計測する。相補鎖合成反応に用いるプライマーは、その3’末端が置換部分の直前にくるように設計する。すなわち最初に取り込まれる核酸基質の鋳型が一塩基置換部分の塩基種となる。
【００１１】
相補鎖合成に用いる核酸基質4種はddATP、ddCTP、ddGTP、及びddTTPで、これらを順番に反応槽に加えて発光を観察する。なお、各ddNTPは一定量の鋳型に対するその発光強度を予め測定し、各塩基間の発光強度比を決定しておく。これにより、各核酸基質に対する発光強度を比較することで、置換部分の塩基の存在比（すなわち、標準DNAとターゲットDNAの存在比）が分かり、標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量分析できる。
【００１２】
すなわち、本発明は、1）ターゲットDNA試料に、前記ターゲットDNAの少なくとも一部に一塩基置換を導入した標準DNA試料の一定量を混合する工程、2）混合した試料を、前記一塩基置換部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを用いて増幅する工程、3）増幅した試料を一本鎖化し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブをハイブリダイズさせ、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行う工程、4）ルシフェラーゼ反応により前記相補鎖合成反応で生成するピロリン酸に由来する発光を検出する工程、5）検出された発光量と前記標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する工程を含む核酸の定量方法に関する。
【００１３】
ある実施形態では、前記1)〜5)の工程を置換塩基の異なる複数の標準DNA試料について行なう。また別な実施形態では、前記1)〜5)の工程を濃度の異なる複数の標準DNA試料について行なう。
【００１４】
本発明の方法では、PCR増幅に用いるプライマーを予めビオチンラベルしておくことにより、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて増幅産物を精製することができる。
【００１５】
ターゲットDNA試料としては、mRNAから逆転写したcDNA試料等を用いることができる。ターゲットDNAに予めアンカー配列を付加しておけば、このアンカー配列に一塩基置換を導入したプライマーを用いて標準DNA試料を調製することができる。
【００１６】
発明の方法では、ターゲットDNA及び標準DNAは遊離の形態であってもよいし、固相表面に固定化されたものであってもよい。たとえば、ターゲットDNA試料を磁気ビーズに固定化しておけば、その精製や再利用を容易に行なうことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明ではターゲットDNA試料の一部を用いてPCR増幅により標準DNA試料を簡単に作製することができる。定量分析にはルシフェラーゼ反応を利用した発光反応を利用するが、相補鎖合成で利用するddNTPはdNTP（特にdATP）とは異なりルシフェラーゼ反応の反応基質とはならないため背景発光がなく、また2塩基以上核酸基質が取り込まれることもないため正確な測定ができる。さらに、発光量はDNA量に線形比例するため、精度の高い定量が可能である。また、PCR増幅と発光反応の計測とは独立して行うことができるため、本発明では微量の試料DNAを大量にPCR増幅させた後、効率よく分析できる。ちなみに本発明では、ddNTPを加えてから計測終了までに要する時間は数分であり、リアルタイムPCRに比べるとはるかに短い時間で定量分析できる。後述するように、濃度の異なる複数種類の標準DNA試料を用意しておけば、さらに正確な定量が可能になる。発光の計測には安価なルミノメーターを改造したもの、あるいは光ダイオードを具備した安価な光検出器を用いることができ、蛍光プローブなど高価な試薬も不要であるため、全体として安価な定量分析が可能となる。
【００１８】
すなわち、本発明によれば、従来法では困難であった、(i)高い定量精度、(ii)低価格の解析装置、(iii)低い試薬コスト、(iv)簡便な解析操作、を全て実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の分析方法の基本手順を以下に概説する。また、本発明の方法の概略を図1に示す。
【００２０】
(1) ddNTPの発光強度比の測定
一定量のターゲットDNA試料に対する各ddNTP（ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP）の発光強度を予め測定し、それらの4種類の塩基間での発光強度比を決定しておく。
【００２１】
(2) ターゲットDNA試料と標準DNA試料（既知濃度）の混合
標準DNA試料は、以下のようにして調製する。まず、標準DNAを調製するためのプライマーセットを準備する。プライマーはターゲットDNAの5’側及び3’側にハイブリダイズする。これらプライマーで挟まれた領域が増幅領域である。プライマーの少なくとも片方は3’末端から3-10塩基目にターゲットDNAとは異なる塩基（置換塩基）を有し、この置換塩基より5’側のプライマー配列は少なくとも16塩基以上となるように設計する。ターゲットDNA試料の一部を分取し、上記プライマーを用いてPCR増幅することにより標準DNA試料を調製する。標準DNA試料は1本鎖として精製したのち吸光度からその量を定量する。定量した標準DNA試料の一定量をターゲットDNAに混合する。
【００２２】
(3) PCR増幅
置換塩基より3’側の配列を含まない（すなわち、標準DNA試料の調製に使用したプライマーよりも短く、置換塩基部分を含まない）プライマーを用いて、混合したターゲットDNA試料と標準DNA試料を同時にPCR増幅する。ターゲットDNAと標準DNAとは増幅対象領域において置換塩基部分以外は同じ配列であるため、PCR増幅率は同じである。
【００２３】
(4) 伸張用プローブのハイブリダイゼーション
ターゲットDNAと標準DNAの増幅産物を精製したのち1本鎖化し、伸長用プローブとDNAポリメラーゼを加える。なお、増幅用のPCRプライマーが残存している可能性がある場合には、DNAポリメラーゼとddNTPを加えて相補鎖合成に寄与しうる3’末端をブロックしてから再度精製を行う。
【００２４】
(5) 一塩基伸長と発光計測
4種のddNTPを順次加えて一塩基伸長を行い、ルシフェラーゼ反応による発光を計測する。なお、伸張用プローブは、一塩基置換部分の3’側にハイブリダイズするように設計しておく。これにより、一塩基伸長反応で取り込まれる核酸基質ddNTPの種類が異なることになる。一塩基伸長が起こり、ddNTPが取り込まれるとピロリン酸が生成し、これがATPに変換され、ルシフェラーゼ反応による発光をもたらす。すなわち、得られる発光強度は生成したピロリン酸量に比例する。ターゲットDNAと標準DNAでは取り込まれる塩基種が異なるため、発光量の比率と加えた標準DNA試料の量からターゲットDNAの量が定量できる。
【００２５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
第1の実施例はヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
ヒト大腸がんmRNA（201）から手順１にしたがってターゲットとなる領域を含む完全長cDNA（202）を調製した。cDNAは長いものであり、定量分析のターゲットとして解析したいDNA配列領域（203）を含む。ターゲット配列は配列表に示した配列番号１の配列である。この配列は図2に模式的に示したようにForwardプライマープライミング部位（204）、解析すべき増幅領域（203）、及びReverse プライマープライミング部位（205）からなる。
【００２７】
cDNA試料の一部を分取し、手順２にしたがって一塩基置換部分を含み、ターゲットと同じ配列を持つ1本鎖DNA断片を作製した。本実施例では、Forwardプライマーの3’末端から7塩基目に置換部分を含むよう設計したが、もちろんこれに限定されるものではない。ここではターゲットDNAに対して3種類の一塩基置換を含む標準DNA断片を作製し、それらを異なる量ターゲットに加える例をしめした。ターゲットDNAの量と標準DNA試料の量が近いほど定量精度は高くなる。そこで3段階の濃度で標準DNA試料を加えることでどれかがターゲットに近い量の標準DNA試料になり、より精度良く定量分析できるからである。
【００２８】
ここで作製した標準DNA試料の一定量をターゲットDNA試料に加える。手順３にしたがって混合した試料をPCR増幅する。PCRプライマー配列はすべてに共通であり、増幅領域は1塩基しか違いがないので、ターゲットDNAと標準DNA試料はほぼ同じ率で増幅できる。PCR増幅に用いるプライマーは導入した一塩基置換部分の外側（5’側）に位置するため、プライマー配列には置換部位は含まれない。増幅後、精製して１本鎖DNAを得る。これはターゲットDNA及び一定量の標準DNA試料が最初の存在比を保った形でコピー数が増幅されている。
【００２９】
得られたDNA試料、DNAポリメラーゼ、ピロリン酸をATPに変えるための酵素（ATP sulfurylaseあるいはPPDK）、ルシフェラーゼ及びこれら酵素反応基質をバッファー溶液とともに反応セルに入れ、よく攪拌する。核酸基質ddNTPを順次加えて得られる発光強度を測定する。標準DNA試料の量を縦軸に発光強度を横軸にプロットして検量線を得る。このグラフとターゲットDNAを鋳型にして１塩基相補鎖合成から得た発光強度からターゲットDNAの量を知ることができる（図6）。核酸基質ddNTPの中にはATPやピロリン酸が含まれていることがあり、相補鎖合成が起きなくても発光信号が得られることがある。これらの影響を除外するために計測後再度ddNTPを加えて背景発光を測定してその差を発光量とするのが精度良い結果を与える。
【００３０】
手順１：ターゲットDNA試料の調製
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞（HCT116）から、RNeasy Midi Kit （QIAGEN社）を用いてトータルRNA（約400 ng/μL、25 μL、計10 μg）を抽出・精製した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 2.5 μL （約1 μg）、オリゴ(dT)20プライマー(50 μM) 1 μL、dNTP Mix (10 mM each) 1 μL、及び滅菌水8.5 μLを添加し、混合した。RNAの高次構造を崩し、オリゴ(dT)20プライマーをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて65℃で5分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5xFirst Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 4 μL、 DTT (0.1 M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1μL、及びSuper ScriptIII (200unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化させる為に70℃ 15分間加熱させた。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2 unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (1 μg)から1本鎖cDNA 21 μLを得た。さらに、このcDNA 1μLを滅菌水で5x103倍希釈し、ターゲットDNA試料（5 mL）とした(トータルRNA10 pg由来cDNA/μL)。
【００３１】
手順２：標準DNA(１本鎖)の調製
3’末端から7塩基目を鋳型であるターゲットの配列とは異なる塩基種へ置換させた3種類の5’末端BiotinラベルForwardプライマーA（配列番号２）、5’末端BiotinラベルForwardプライマーB（配列番号３）、5’末端BiotinラベルForwardプライマーC（配列番号４）、及びReverseプライマーD（配列番号５）を準備した。まず、3本のPCRチューブ（チューブA、B、及びC）を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、ReverseプライマーD（10 μM）（配列番号5）10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブAには5’末端BiotinラベルForwardプライマーA（10 μM）10 μLを、チューブBには5’末端BiotinラベルForwardプライマーB（10 μM）10 μLを、チューブCには5’末端BiotinラベルForwardプライマーC（10μM）10μLを添加し、各々をよく混合させた。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物A、B、及びCを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した（50μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
【００３２】
これらのPCR産物A、B、及びCへ1x Binding & Washing Buffer （5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 mM EDTA、1 M NaCl） 150 μLを添加し、200 μLにメスアップした。また、Streptavidin coating磁気ビーズ（直径1 μm、107 個/μL、DYNAL BIOTECH社） 600 μLを1.5 mLチューブへ採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清除去した。Binding & Washing Buffer 600 μLで磁気ビーズを3回洗浄後、同液600 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液200 μLずつを各PCR産物試料へ添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌させ、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面にPCR産物を結合させた。磁気ビーズに結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 200 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 300 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、上清をそれぞれ新しいチューブに採取した。この上清に1M Tris (pH 7.5) 60 μL及び0.1% Tween (pH 7.5) 300 μLをそれぞれ添加して中和した。各試料にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v、Invitrogen社）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層をそれぞれ新しいチューブに採取し（約650 μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料に酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLをそれぞれ添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180 μLを各試料に添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水10μLに懸濁し、吸光度計でDNA濃度を測定し、いずれも約2 μg/μL（約2x1012分子/μL）であることを確認した。これを滅菌水で希釈し、標準DNA(A)（配列番号６）約1000分子/μL、標準DNA(B)（配列番号７）約500分子/μL、及び標準DNA(C)（配列番号８）約100分子/μLを各々1ｍLずつ調製した。これらの標準DNAはターゲットDNAに対して一塩基のみ非相補的塩基を有する1本鎖DNAである。
【００３３】
手順３：ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅
氷上に置いたチューブに、一塩基置換のない配列であるターゲットDNA試料10 μL(301)、標準DNA(A)(302)、(B)(303)、及び(C)(304)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した(305)。これに、滅菌水116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーE（配列番号9）（10μM）(306)40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）(307)40μL、Taq DNA polymerase (5unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる人為的に導入された一塩基置換部位の外側に位置するプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。
【００３４】
手順４：一本鎖化
得られたPCR産物に1x Binding & Washing Buffer 500 μLを添加した。また、Streptavidin coating磁気ビーズ500 μLを1.5 mLチューブに採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。Binding & Washing Buffer 500 μLで磁気ビーズを３回洗浄後、同液500 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液500 μLをPCR産物に添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌し、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面にPCR産物を結合させた。磁気ビーズに結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 500 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 450 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、新しいチューブへ上清を採取し、1M Tris (pH 7.5) 90 μL及び0.1% Tween (pH 7.5) 450 μLを添加して中和した。さらに、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層を新しいチューブに採取し（約900μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料に酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLを添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180μLを添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水100 μLに懸濁し、 DNA濃度を吸光度計で測定し、約150 ng/μL（約5x1011分子/μL）であることを確認した。
【００３５】
手順５：一塩基伸長による化学発光の測定
一本鎖化したPCR増幅物8 μl（401、402、403、及び404）に対し、一塩基伸長用プローブ（50μM、配列番号１０）（405）3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) 3 μl、滅菌水16 μlを混合した。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃ 30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬（0.065 U/μL Seaquase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、Apyrase 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2 mM DTT, pH 7.75）を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30 μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP（100 μM）を0.5 μLずつ添加し、発光検出を行なった（測定時間：1分間）。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光検出を行なった（測定時間：1分間）（図4）。
【００３６】
図5に、このようにして得られた発光強度の時間変化を示す。ここでグラフの縦軸は発光強度（V）を示しており、横軸は経過時間を示している。図5に示されているように2回のddNTPの添加にともなって、2つの発光強度ピーク501と502が現れる。501が最初にddNTPを投入したときに現れるピークであり、502が2回目にddNTPを投入したときに得られるピークである。２回目のピーク502はバックグラウンド発光に対応するため、発光強度シグナルはこれらのピークの差である503とした。
【００３７】
発光強度シグナルを30μLの発光試薬を混合した4種類の標準DNA１ μL（2x1010分子）について測定し、4種類のddATPの発光強度シグナルから伸長強度比を得た（表1の中段）。これらの数値で発光強度シグナル値を割り算することによって、塩基種の違いによる伸長度の差を補正した。表1の上段に補正前の発光シグナル値を下段に補正後のシグナル値を示す。この補正されたシグナル値を用いて、ターゲットDNA試料の分子数を定量するため、図6に示すように検量線601を作成した。グラフの横軸は発光強度シグナル値（補正後）であり、縦軸がPCR増幅前の標準DNAの分子数がプロットされている。次にターゲットDNA試料から得られた発光強度シグナル値（補正後）から、検量線601を使って、矢印602に示すようにターゲットDNA試料に対応する分子数（15500）を得た。この値は既知量のターゲット分子数15000にほぼ一致しており、十分な精度で定量できることを確認できた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表２に標準DNAの１種類だけがターゲットDNA試料に混合されている場合の、ターゲットDNA試料の分子数の定量結果を示す。表２の上段は、ターゲットDNA試料へ添加したPCR増幅前の標準DNA分子数を示す。中段は、混合させた時の各標準DNAに対するターゲットDNA試料の発光強度シグナル比を示す。下段は、これらから推定されたターゲットDNA試料の分子数を示す（それぞれ15500、15200、及び15900）。この場合も、ターゲットDNA試料分子数は15000であり、良好な定量精度を得ることができた。
【００４０】
【表２】
【実施例２】
【００４１】
第2の実施例は、オリゴ(dT)30磁気ビーズ上でmRNAを逆転写し、得られたターゲットDNA試料を定量する例である。
【００４２】
実施例１と同様、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した。本実施例では、手順１のようにして大腸がん細胞から調製したRNAが最初の材料である。手順６にしたがって準備したオリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いてcDNAを作製した。cDNAの作製手順は手順７に示した。手順２にしたがって3種類の標準DNA試料を調製した。これら標準DNA試料を異なる割合でターゲットDNA試料に混合させ、手順８にしたがって同一プライマーでPCR増幅を行った。この増幅産物を一本鎖化し（実施例１の手順４と同じ操作）、手順５にしたがって一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【００４３】
手順６：オリゴ（dT）30固定化磁気ビーズの調製
表面をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（直径1 μm、107個/μL、DYNAL社）をよく懸濁し、100 μL（磁気ビーズ109個を含む）を1.5 mLチューブに採取した。マグネットを1.5 mLチューブに近接させて磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。さらにBinding & Washing Buffer 100 μLで磁気ビーズを再懸濁し、マグネットで磁気ビーズを捕捉後、上清を除去することにより磁気ビーズを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。一方、5’末端にビオチン2分子を修飾し、続いてカーボン6つをスペーサー配列として含むオリゴ（dT）30（100 pmol/μL）6.67 μLへ、Binding & Washing Bufferを加えてオリゴ（dT）30希釈液400 μL（1.67 pmol/μL、4.0 x 1014分子含有）に調製した。このオリゴ（dT）30希釈溶液400 μLと、洗浄した磁気ビーズを混合し、ローターで60分間よく攪拌させ、ストレプトアビジン−ビオチン結合を利用して磁気ビーズ表面へオリゴ（dT）30を結合させた。磁気ビーズへ結合しなかった過剰なオリゴ（dT）30を取り除くため、マグネットで磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Bufferで2回ビーズの洗浄を行った。さらにRNaseを取り除くため、溶液A（0.1N NaOH、0.05M NaCl、DEPC処理）で2回、溶液B（0.1M NaCl、DEPC処理）で１回洗浄後、100 μLの滅菌水を添加して、オリゴ（dT）30が固定した磁気ビーズ懸濁液（1 x 107個/μL、推定オリゴ（dT）30固定数：約2.0 x 105分子/磁気ビーズ1個）を調製した。
【００４４】
手順７：オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料の調製
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞（HCT116）から、RNeasy Midi Kit （QIAGEN社）を用いてトータルRNA（約400 ng/μL、25 μL、 計10 μg）を抽出・精製した。これを滅菌水で約100 pg/μLの濃度へ希釈した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 1 μL （約100 ng）、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズ1μL（1 x 107 個/μL）、dNTP Mix (10mM each) 1 μL、及び滅菌水20 μLを添加し、混合した。磁気ビーズ上のオリゴ(dT)30プライマーとmRNAポリAテールをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて70℃で55分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5x First Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15mM MgCl2) 6 μL、 DTT (0.1M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1 μL、及びSuper ScriptIII (200 unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化する為に85℃ 3分間加熱した。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。PCRチューブに磁石を近接させ、cDNAが固定された磁気ビーズを捕捉し、残留試薬が含まれる上澄を除去した。さらに、洗浄液（10 mM Tris, 0.1% Tween20）50 μLでこの磁気ビーズを2回洗浄し、同液10 μLに再懸濁した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (100 pg)から、磁気ビーズ表面へ固定されたターゲットDNA試料（1本鎖cDNA）を得た。
【００４５】
手順８：ターゲットDNA試料と標準DNAの混合とPCR増幅
上記のようにして磁気ビーズに固定化したターゲットDNA試料10 μLへ、手順２のようにして調製した標準DNA(A)（配列番号６）、標準DNA(B)（配列番号７）、及び標準DNA(C)（配列番号８）を10μLずつ添加して混合試料を調製した。この混合試料に、滅菌水 116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10μM）40μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10μM）（配列番号５）40 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側に位置するように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。磁石をチューブに近接させてPCR産物が含まれる上澄を別チューブに採取した。残った磁気ビーズ上で合成されたPCR産物も採取するため、この磁気ビーズを0.1N NaOH 10μLで洗浄し、洗浄液を先程採取した上澄と混合した。このPCR産物410 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順５のようにして、一塩基伸長による化学発光の測定を行い、ターゲットDNA試料の定量解析を行った。
【実施例３】
【００４６】
第3の実施例は、磁気ビーズ固定化cDNAを再利用し、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
【００４７】
実施例２のように磁気ビーズ上に固定化された1本鎖cDNAの形で解析対象が得られた場合は、固定したcDNAを鋳型にして2ndストランドcDNA合成を行い、プライマーなどを除去した後に合成された相補鎖を溶液中に遊離させ、これを定量分析ターゲットとして用いることが可能である。相補鎖合成した試料に、3種類の標準DNA（実施例１の手順２）を異なる割合で添加し、同一のプライマーでPCR増幅する。このとき用いたPCRプライマーは一塩基置換部位よりも外側にハイブリダイズするように設計されているため、実施例１及び２と同様、ターゲットDNA試料及び標準DNAの増幅効率は全く同じである。増幅産物を一本鎖化し（実施例1の手順４と同じ操作）、手順５にしたがって一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【００４８】
本実施例では、元のcDNAを磁気ビーズ上に残すことができるため、必要に応じて繰り返し試料を定量解析できるという利点がある。
【００４９】
手順９：2ndストランドcDNAの合成
まず、実施例２の手順６にしたがってオリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを調製した。つぎに、手順７にしたがって、上記オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料(トータルRNA100pg由来cDNA)を調製した。続いて、磁気ビーズ固定化1本鎖cDNA懸濁液10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10μL、x5 Q-solution 20 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10 μM）10 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、50℃ 30秒間、72℃ 3分間加熱して2ndストランドcDNAを合成した。チューブに磁石を近接させて磁気ビーズを捕捉し、反応に使用されなかった過剰プライマーを含む上澄を除去し、洗浄液100μＬで2回磁気ビーズを洗浄した。95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、磁石を用いて磁気ビーズを捕捉した後、上澄を採取した。この上澄には2ndストランドDNAが含まれている。この操作を2回行い、ターゲットDNA試料である2ndストランドDNA溶液20 μLを得た（20 μL）。
【００５０】
手順１０：2nd cDNAと標準DNA混合液のPCR増幅
2nd ストランド cDNA20μLに手順２にしたがって調製した標準DNA(A)（配列番号６）、標準DNA(B)（配列番号７）、及び標準DNA(C)（配列番号８）を10 μLずつ添加し、混合試料を調製した。この混合試料50 μLへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10 μM）40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）40 μL、及びTaq DNA polymerase(5unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。このPCR産物400 μL内に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順５にしたがって、一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【実施例４】
【００５１】
第4の実施例は、アンカー付きプライマーセットを用いて、実施例３のように磁気ビーズ固定化cDNAを再利用し、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
【００５２】
まず、磁気ビーズに固定化したcDNAを鋳型として、アンカー付きプライマーでPCR増幅を行い、ターゲットDNAにアンカー配列を付加させた。このアンカー配列が付加されたターゲットDNA試料を別チューブに採取する。続いて、アンカー配列の一塩基のみを他の塩基種へ置換させたアンカー付きプライマーを用いて、標準DNA（１本鎖）を3種類調製した。先に調製したアンカー配列が付加されたターゲットDNA試料に、この3種類の標準DNAを異なる量で混合させ、PCR増幅を行った。この時のPCRプライマーは、一塩基置換部分よりも外側にハイブリダイズするように設計されているため、ターゲットDNA試料及び標準DNAを同じ増幅効率で増幅することが可能となる。この増幅産物を一本鎖化し、置換塩基部分を一塩基伸長させる。相補鎖合成反応が起こるとピロリン酸が生成し、これはATPに変換され、ルシフェラーゼ反応により発光が検出される。得られた発光強度はピロリン酸の量に比例している。ターゲットと標準試料では取り込まれる塩基種が異なるので識別して発行量を計測してその比率と加えた標準試料の量からターゲットの量を定量する。この場合も、3種類ではなく、1種類の標準DNAのみをターゲットDNA試料に混合し、定量解析することも可能である。
【００５３】
手順１２：アンカー配列を導入したターゲット配列の調製
手順７に従い、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料10 μL (トータルRNA100pg由来cDNA)の調製を行った。1本鎖cDNA試料10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、アンカー付きForwardプライマーG（配列番号１１）（10μM）10 μL、及びTaq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間、55℃ 30秒間、72℃ 2分間加熱して1回のみの伸長反応を行った。氷上で1分間ほど冷却させた後、反応チューブに磁石を近接させ、反応に使用されなかった過剰プライマーなどを含む上澄を除去した。洗浄液100 μLで磁気ビーズを2回洗浄後、95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、上澄を採取した。この操作を2回行い、熱変性によって、磁気ビーズ上で合成されたアンカー付きターゲットDNA試料を得た（20 μL）。
【００５４】
手順１３：アンカー配列を含んだ標準DNAの調製
手順１と同様にして、大腸がん細胞由来cDNA試料（トータルRNA 10 pg由来cDNA/μL）を得た。上記で使用したアンカー付きForwardプライマーG（配列番号１１）と、1塩基のみ異なる3種類のプライマー、すなわちアンカー付きForwardプライマーH（配列番号１２）、アンカー付きForwardプライマーI（配列番号１３）、アンカー付きForwardプライマーJ（配列番号１４）を用意した。３本のPCRチューブ（チューブH、I、及びJ）を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブHにはForwardプライマーH（10 μM）10 μLを、チューブIにはForwardプライマーI（10 μM）10 μLを、チューブJにはForwardプライマーJ（10 μM）10 μLを添加し、各々をよく混合した。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物H、I、及びJを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した（50 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
【００５５】
これらのPCR産物A、B、及びCに、1x Binding & Washing Buffer （5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 mM EDTA、1 M NaCl） 150 μLを添加し、200μLにメスアップした。また、Streptavidin coating磁気ビーズ（直径1 μm、107 個/μL、DYNAL BIOTECH社） 600 μLを1.5 mLチューブに採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。Binding & Washing Buffer 600 μLで磁気ビーズを3回洗浄後、同液600 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液200μLずつを各PCR産物試料へ添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌させ、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面へPCR産物を結合させた。磁気ビーズへ結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 200 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 300 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、新しいチューブへ上清をそれぞれ採取した。この上清に、1M Tris (pH 7.5) 60 μL及び0.1 % Tween (pH7.5) 300μLをそれぞれ添加して中和した。各試料に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v、Invitrogen社）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層をそれぞれ新しいチューブに採取し（約650μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料へ酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLをそれぞれ添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180μLを各試料に添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水10μLに懸濁し、 DNA濃度を吸光度計で測定し、いずれも約2 μg/μL（約2x1012分子/μL）であることを確認した。これを滅菌水で希釈し、標準DNA（H）（配列番号１５）約1000分子/μL、標準DNA(I)（配列番号１６）約500分子/μL、及び標準DNA(J)（配列番号１７）約100分子/μLを各々1ｍLずつ調製した。これらはターゲットDNA試料に対して一塩基のみ非相補的塩基を有する1本鎖DNAである。
【００５６】
手順１４：ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅
氷上に置いたチューブへ、手順１２で調製したアンカー付きターゲットDNA試料（20μＬ）、標準DNA(H)、標準DNA(I)、及び標準DNA(J)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した。これへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーK（配列番号18）（10 μM）40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）40 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(H)(I)(J)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の異なる置換塩基を有するDNAは同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類のDNA比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４と同様にして、一本鎖化したPCR産物100 μL（約5x1011分子/μL）を得た。
【００５７】
手順1５：一塩基伸長による化学発光の測定
一本鎖化したPCR合成物8 μlに対し、一塩基伸長用プローブ（50 μM、配列番号19）（405）3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) ３μl、滅菌水16 μlを混合する。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃ 30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬（0.065 U/μL Seaquase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、 Apyrase , 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、 0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2mM DTT, pH 7.75）を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP（100 μM）を0.5 μLずつ添加し、発光検出した（測定時間：1分間）。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光を検出した（測定時間：1分間）。
【００５８】
1回目測定した発光強度から、バックグラウンドである2回目測定した発光強度を差し引いた値を発光強度シグナルとした。このようにして得られる発光強度シグナルを30 μLの発光試薬を混合させた4種類の標準DNA1 μL（2x1010分子）について行い、4種類の発光強度シグナルをddATPによるシグナル値に対する比から伸長強度比を得た。これらの数値で発光強度シグナル値を割り算することによって、塩基種の違いによる伸長度の差を補正した。表1の上段に補正前の発光シグナル値を下段に補正後のシグナル値を示す。
【００５９】
この補正されたシグナル値を用いて、ターゲットDNA試料の分子数を定量するために、まず、混合した３種類の標準DNA(H)(I)(J)から図6に示すように検量線601を作成した。グラフの横軸は発光強度シグナル値（補正後）であり、縦軸がPCR増幅前の標準DNAの分子数がプロットされている。次にターゲットDNA試料から得られた発光強度シグナル値（補正後）から、検量線６01を使って、矢印602に示すようにターゲットDNA試料に対応する分子数（15500）を得た。この値は既知量のターゲット分子数15000にほぼ一致しており、十分な精度で定量できることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は核酸試料の定量分析を必要とする、医療、科学、食品等のあらゆる分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の方法の基本手順。
【図２】ターゲットDNA試料の構造。
【図３】ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅。
【図４】一塩基伸長と発光強度の測定。
【図５】発光強度シグナルの算出。
【図６】発光強度比の算出（標準DNAを3種使用した場合）。
【符号の説明】
【００６２】
201 mRNA
202 cDNA
203 解析すべきDNA増幅領域
204 Forwardプライマープライミング部位
205 Reverse プライマー側プライミング部位
301 ターゲットDNA試料
302 標準DNA(A)
303 標準DNA(B)
304 標準DNA(C)
305 混合試料
306 ForwardプライマーE
307 5’末端BiotinラベルReverseプライマーF
401 PCR増幅後に一本鎖化したターゲットDNA試料
402 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(A)
403 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(B)
404 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(C)
405 一塩基伸長用プローブ
501 最初にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
502 ２回目にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
501 発光強度シグナル
601 ３種類の標準DNA(A)(B)(C)から作成した検量線
602 ターゲットDNA試料に対応する分子数
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号２−プライマー
配列番号３−プライマー
配列番号４−プライマー
配列番号５−プライマー
配列番号６−標準DNA(A)
配列番号７−標準DNA(B)
配列番号８−標準DNA(C)
配列番号９−プライマー
配列番号１０−伸長用プローブ
配列番号１１−プライマー
配列番号１２−プライマー
配列番号１３−プライマー
配列番号１４−プライマー
配列番号１５−標準DNA(H)
配列番号１６−標準DNA(I)
配列番号１７−標準DNA(J)
配列番号１８−プライマー
配列番号１９−プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA及びRNAの定量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現量を調べることは、医薬品開発あるいは病気の因果関係を調べる上で重要事項である。しかし、DNAを中心とするバイオの分野ではターゲットとなるDNAのコピー数は一般に少ないことが多く、これらを増幅して計測するが、そのコピー数を正確に求めたいという要求が増大している。
【０００３】
現在利用されている代表的なDNA定量方法としては、１）電気泳動法、２）DNAマイクロアレイ法（特許文献１）、３）リアルタイムPCR法（非特許文献１）の３種類が挙げられる。このうち、電気泳動法は、マイナスに荷電するDNAを電気泳動分離し、分離された標準試料とターゲット試料のバンドを染色して、その強度比を調べる定量方法である。この方法は解析コストが安価であるが、欠点は定量精度が低いことである。
【０００４】
DNAマイクロアレイ法は、異なる蛍光体で標識されたターゲット試料及び標準試料を、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドもしくはcDNAが固定されたDNAチップと競合ハイブリダイズさせ、蛍光強度比を調べる定量方法である。この方法は一度に数万といった多数の遺伝子を定量可能であるが、得られる蛍光強度比は遺伝子配列の２次構造及びクロスハイブリダイズの影響を受け易い。したがって、この方法の欠点は定量精度が悪いこと、及び解析（装置・DNAチップ・試薬）に多額の費用が必要であることである。
【０００５】
一方、リアルタイムPCR法は、ターゲット試料と標準試料を同時にPCR増幅しながら試料から発せられる蛍光を観測し、PCR産物が一定量に達した時のPCRサイクル数から、初めに存在したターゲット試料の量を定量する方法である。PCR産物量を調べる手段としては、SYBR GREENを用いたインターカレーター法、もしくは遺伝子特異的プローブを用いた所謂TaqManプローブ法がある。このTaqManプローブとは、消光原子団と蛍光原子団がDNAプローブを介して繋がれたものであり、最初それ自身は蛍光を発しないが、PCR増幅するにしたがってプローブが部分分解し、遊離した蛍光原子団が蛍光を発する。この方法は、定量精度が比較的高く、検出下限も数分子程度と低い。しかしながらPCR増幅過程を実時間でモニターする、高額な装置が必要であること、さらに解析に先立って同じ配列を持った標準試料の希釈系列（少なくとも5つの異なる濃度）を作製し、毎回ターゲット試料と同時に実時間解析しなければならないこと、操作が煩雑で時間と労力を要することが問題である。
【０００６】
【特許文献１】特開2004-33160号
【非特許文献１】Higuchi R, et al, Bio. Technology, 413-417, （1992）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、従来のDNA定量方法の欠点を克服し、新規で簡便なDNA定量法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明では、定量対象であるターゲットDNAの一部を3’末端近傍に１塩基ミスマッチ（一塩基置換）を入れたプライマーで増幅し、ターゲットDNAとは１塩基だけ配列が異なる配列を有する「標準DNA試料」を調製する。標準DNAは、ターゲットDNAの少なくとも一部（例えば、解析対象とする領域）へ、１塩基ミスマッチを導入したものとすることができる。
【０００９】
調製した標準DNA試料の一定量をターゲットDNA試料と混合する。この混合したDNA試料をPCR増幅したのち定量分析するが、このとき用いるPCRプライマーは、標準試料作成時に導入した一塩基置換部分が増幅領域に含まれるように設計する。PCRで増幅される領域の配列は人為的に導入した一塩基置換部分以外は全く同じ配列であり、ターゲットDNAと標準DNAを同時に、その比率を保ったまま増幅することができる。
【００１０】
得られた増幅産物は１本鎖化した後、一塩基置換部分の塩基の存在比を計測し、加えた標準DNA試料の量とこの存在比からターゲットDNAの量を求める。一塩基置換部分の存在比は、ターミネーターddNTPを用いた相補鎖合成反応を行い、この反応の副産物であるピロリン酸をATPに変換し、ATPを基質とするルシフェラーゼによる発光を検出することで計測する。相補鎖合成反応に用いるプライマーは、その3’末端が置換部分の直前にくるように設計する。すなわち最初に取り込まれる核酸基質の鋳型が一塩基置換部分の塩基種となる。
【００１１】
相補鎖合成に用いる核酸基質4種はddATP、ddCTP、ddGTP、及びddTTPで、これらを順番に反応槽に加えて発光を観察する。なお、各ddNTPは一定量の鋳型に対するその発光強度を予め測定し、各塩基間の発光強度比を決定しておく。これにより、各核酸基質に対する発光強度を比較することで、置換部分の塩基の存在比（すなわち、標準DNAとターゲットDNAの存在比）が分かり、標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量分析できる。
【００１２】
すなわち、本発明は、1）ターゲットDNA試料に、前記ターゲットDNAの少なくとも一部に一塩基置換を導入した標準DNA試料の一定量を混合する工程、2）混合した試料を、前記一塩基置換部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを用いて増幅する工程、3）増幅した試料を一本鎖化し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブをハイブリダイズさせ、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行う工程、4）ルシフェラーゼ反応により前記相補鎖合成反応で生成するピロリン酸に由来する発光を検出する工程、5）検出された発光量と前記標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する工程を含む核酸の定量方法に関する。
【００１３】
ある実施形態では、前記1)〜5)の工程を置換塩基の異なる複数の標準DNA試料について行なう。また別な実施形態では、前記1)〜5)の工程を濃度の異なる複数の標準DNA試料について行なう。
【００１４】
本発明の方法では、PCR増幅に用いるプライマーを予めビオチンラベルしておくことにより、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて増幅産物を精製することができる。
【００１５】
ターゲットDNA試料としては、mRNAから逆転写したcDNA試料等を用いることができる。ターゲットDNAに予めアンカー配列を付加しておけば、このアンカー配列に一塩基置換を導入したプライマーを用いて標準DNA試料を調製することができる。
【００１６】
発明の方法では、ターゲットDNA及び標準DNAは遊離の形態であってもよいし、固相表面に固定化されたものであってもよい。たとえば、ターゲットDNA試料を磁気ビーズに固定化しておけば、その精製や再利用を容易に行なうことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明ではターゲットDNA試料の一部を用いてPCR増幅により標準DNA試料を簡単に作製することができる。定量分析にはルシフェラーゼ反応を利用した発光反応を利用するが、相補鎖合成で利用するddNTPはdNTP（特にdATP）とは異なりルシフェラーゼ反応の反応基質とはならないため背景発光がなく、また2塩基以上核酸基質が取り込まれることもないため正確な測定ができる。さらに、発光量はDNA量に線形比例するため、精度の高い定量が可能である。また、PCR増幅と発光反応の計測とは独立して行うことができるため、本発明では微量の試料DNAを大量にPCR増幅させた後、効率よく分析できる。ちなみに本発明では、ddNTPを加えてから計測終了までに要する時間は数分であり、リアルタイムPCRに比べるとはるかに短い時間で定量分析できる。後述するように、濃度の異なる複数種類の標準DNA試料を用意しておけば、さらに正確な定量が可能になる。発光の計測には安価なルミノメーターを改造したもの、あるいは光ダイオードを具備した安価な光検出器を用いることができ、蛍光プローブなど高価な試薬も不要であるため、全体として安価な定量分析が可能となる。
【００１８】
すなわち、本発明によれば、従来法では困難であった、(i)高い定量精度、(ii)低価格の解析装置、(iii)低い試薬コスト、(iv)簡便な解析操作、を全て実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の分析方法の基本手順を以下に概説する。また、本発明の方法の概略を図1に示す。
【００２０】
(1) ddNTPの発光強度比の測定
一定量のターゲットDNA試料に対する各ddNTP（ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP）の発光強度を予め測定し、それらの4種類の塩基間での発光強度比を決定しておく。
【００２１】
(2) ターゲットDNA試料と標準DNA試料（既知濃度）の混合
標準DNA試料は、以下のようにして調製する。まず、標準DNAを調製するためのプライマーセットを準備する。プライマーはターゲットDNAの5’側及び3’側にハイブリダイズする。これらプライマーで挟まれた領域が増幅領域である。プライマーの少なくとも片方は3’末端から3-10塩基目にターゲットDNAとは異なる塩基（置換塩基）を有し、この置換塩基より5’側のプライマー配列は少なくとも16塩基以上となるように設計する。ターゲットDNA試料の一部を分取し、上記プライマーを用いてPCR増幅することにより標準DNA試料を調製する。標準DNA試料は1本鎖として精製したのち吸光度からその量を定量する。定量した標準DNA試料の一定量をターゲットDNAに混合する。
【００２２】
(3) PCR増幅
置換塩基より3’側の配列を含まない（すなわち、標準DNA試料の調製に使用したプライマーよりも短く、置換塩基部分を含まない）プライマーを用いて、混合したターゲットDNA試料と標準DNA試料を同時にPCR増幅する。ターゲットDNAと標準DNAとは増幅対象領域において置換塩基部分以外は同じ配列であるため、PCR増幅率は同じである。
【００２３】
(4) 伸張用プローブのハイブリダイゼーション
ターゲットDNAと標準DNAの増幅産物を精製したのち1本鎖化し、伸長用プローブとDNAポリメラーゼを加える。なお、増幅用のPCRプライマーが残存している可能性がある場合には、DNAポリメラーゼとddNTPを加えて相補鎖合成に寄与しうる3’末端をブロックしてから再度精製を行う。
【００２４】
(5) 一塩基伸長と発光計測
4種のddNTPを順次加えて一塩基伸長を行い、ルシフェラーゼ反応による発光を計測する。なお、伸張用プローブは、一塩基置換部分の3’側にハイブリダイズするように設計しておく。これにより、一塩基伸長反応で取り込まれる核酸基質ddNTPの種類が異なることになる。一塩基伸長が起こり、ddNTPが取り込まれるとピロリン酸が生成し、これがATPに変換され、ルシフェラーゼ反応による発光をもたらす。すなわち、得られる発光強度は生成したピロリン酸量に比例する。ターゲットDNAと標準DNAでは取り込まれる塩基種が異なるため、発光量の比率と加えた標準DNA試料の量からターゲットDNAの量が定量できる。
【００２５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
第1の実施例はヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
ヒト大腸がんmRNA（201）から手順１にしたがってターゲットとなる領域を含む完全長cDNA（202）を調製した。cDNAは長いものであり、定量分析のターゲットとして解析したいDNA配列領域（203）を含む。ターゲット配列は配列表に示した配列番号１の配列である。この配列は図2に模式的に示したようにForwardプライマープライミング部位（204）、解析すべき増幅領域（203）、及びReverse プライマープライミング部位（205）からなる。
【００２７】
cDNA試料の一部を分取し、手順２にしたがって一塩基置換部分を含み、ターゲットと同じ配列を持つ1本鎖DNA断片を作製した。本実施例では、Forwardプライマーの3’末端から7塩基目に置換部分を含むよう設計したが、もちろんこれに限定されるものではない。ここではターゲットDNAに対して3種類の一塩基置換を含む標準DNA断片を作製し、それらを異なる量ターゲットに加える例をしめした。ターゲットDNAの量と標準DNA試料の量が近いほど定量精度は高くなる。そこで3段階の濃度で標準DNA試料を加えることでどれかがターゲットに近い量の標準DNA試料になり、より精度良く定量分析できるからである。
【００２８】
ここで作製した標準DNA試料の一定量をターゲットDNA試料に加える。手順３にしたがって混合した試料をPCR増幅する。PCRプライマー配列はすべてに共通であり、増幅領域は1塩基しか違いがないので、ターゲットDNAと標準DNA試料はほぼ同じ率で増幅できる。PCR増幅に用いるプライマーは導入した一塩基置換部分の外側（5’側）に位置するため、プライマー配列には置換部位は含まれない。増幅後、精製して１本鎖DNAを得る。これはターゲットDNA及び一定量の標準DNA試料が最初の存在比を保った形でコピー数が増幅されている。
【００２９】
得られたDNA試料、DNAポリメラーゼ、ピロリン酸をATPに変えるための酵素（ATP sulfurylaseあるいはPPDK）、ルシフェラーゼ及びこれら酵素反応基質をバッファー溶液とともに反応セルに入れ、よく攪拌する。核酸基質ddNTPを順次加えて得られる発光強度を測定する。標準DNA試料の量を縦軸に発光強度を横軸にプロットして検量線を得る。このグラフとターゲットDNAを鋳型にして１塩基相補鎖合成から得た発光強度からターゲットDNAの量を知ることができる（図6）。核酸基質ddNTPの中にはATPやピロリン酸が含まれていることがあり、相補鎖合成が起きなくても発光信号が得られることがある。これらの影響を除外するために計測後再度ddNTPを加えて背景発光を測定してその差を発光量とするのが精度良い結果を与える。
【００３０】
手順１：ターゲットDNA試料の調製
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞（HCT116）から、RNeasy Midi Kit （QIAGEN社）を用いてトータルRNA（約400 ng/μL、25 μL、計10 μg）を抽出・精製した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 2.5 μL （約1 μg）、オリゴ(dT)20プライマー(50 μM) 1 μL、dNTP Mix (10 mM each) 1 μL、及び滅菌水8.5 μLを添加し、混合した。RNAの高次構造を崩し、オリゴ(dT)20プライマーをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて65℃で5分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5xFirst Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) 4 μL、 DTT (0.1 M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1μL、及びSuper ScriptIII (200unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化させる為に70℃ 15分間加熱させた。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2 unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (1 μg)から1本鎖cDNA 21 μLを得た。さらに、このcDNA 1μLを滅菌水で5x103倍希釈し、ターゲットDNA試料（5 mL）とした(トータルRNA10 pg由来cDNA/μL)。
【００３１】
手順２：標準DNA(１本鎖)の調製
3’末端から7塩基目を鋳型であるターゲットの配列とは異なる塩基種へ置換させた3種類の5’末端BiotinラベルForwardプライマーA（配列番号２）、5’末端BiotinラベルForwardプライマーB（配列番号３）、5’末端BiotinラベルForwardプライマーC（配列番号４）、及びReverseプライマーD（配列番号５）を準備した。まず、3本のPCRチューブ（チューブA、B、及びC）を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、ReverseプライマーD（10 μM）（配列番号5）10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブAには5’末端BiotinラベルForwardプライマーA（10 μM）10 μLを、チューブBには5’末端BiotinラベルForwardプライマーB（10 μM）10 μLを、チューブCには5’末端BiotinラベルForwardプライマーC（10μM）10μLを添加し、各々をよく混合させた。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物A、B、及びCを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した（50μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
【００３２】
これらのPCR産物A、B、及びCへ1x Binding & Washing Buffer （5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 mM EDTA、1 M NaCl） 150 μLを添加し、200 μLにメスアップした。また、Streptavidin coating磁気ビーズ（直径1 μm、107 個/μL、DYNAL BIOTECH社） 600 μLを1.5 mLチューブへ採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清除去した。Binding & Washing Buffer 600 μLで磁気ビーズを3回洗浄後、同液600 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液200 μLずつを各PCR産物試料へ添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌させ、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面にPCR産物を結合させた。磁気ビーズに結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 200 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 300 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、上清をそれぞれ新しいチューブに採取した。この上清に1M Tris (pH 7.5) 60 μL及び0.1% Tween (pH 7.5) 300 μLをそれぞれ添加して中和した。各試料にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v、Invitrogen社）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層をそれぞれ新しいチューブに採取し（約650 μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料に酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLをそれぞれ添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180 μLを各試料に添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水10μLに懸濁し、吸光度計でDNA濃度を測定し、いずれも約2 μg/μL（約2x1012分子/μL）であることを確認した。これを滅菌水で希釈し、標準DNA(A)（配列番号６）約1000分子/μL、標準DNA(B)（配列番号７）約500分子/μL、及び標準DNA(C)（配列番号８）約100分子/μLを各々1ｍLずつ調製した。これらの標準DNAはターゲットDNAに対して一塩基のみ非相補的塩基を有する1本鎖DNAである。
【００３３】
手順３：ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅
氷上に置いたチューブに、一塩基置換のない配列であるターゲットDNA試料10 μL(301)、標準DNA(A)(302)、(B)(303)、及び(C)(304)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した(305)。これに、滅菌水116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーE（配列番号9）（10μM）(306)40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）(307)40μL、Taq DNA polymerase (5unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる人為的に導入された一塩基置換部位の外側に位置するプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。
【００３４】
手順４：一本鎖化
得られたPCR産物に1x Binding & Washing Buffer 500 μLを添加した。また、Streptavidin coating磁気ビーズ500 μLを1.5 mLチューブに採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。Binding & Washing Buffer 500 μLで磁気ビーズを３回洗浄後、同液500 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液500 μLをPCR産物に添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌し、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面にPCR産物を結合させた。磁気ビーズに結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 500 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 450 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、新しいチューブへ上清を採取し、1M Tris (pH 7.5) 90 μL及び0.1% Tween (pH 7.5) 450 μLを添加して中和した。さらに、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層を新しいチューブに採取し（約900μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料に酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLを添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180μLを添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水100 μLに懸濁し、 DNA濃度を吸光度計で測定し、約150 ng/μL（約5x1011分子/μL）であることを確認した。
【００３５】
手順５：一塩基伸長による化学発光の測定
一本鎖化したPCR増幅物8 μl（401、402、403、及び404）に対し、一塩基伸長用プローブ（50μM、配列番号１０）（405）3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) 3 μl、滅菌水16 μlを混合した。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃ 30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬（0.065 U/μL Seaquase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、Apyrase 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2 mM DTT, pH 7.75）を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30 μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP（100 μM）を0.5 μLずつ添加し、発光検出を行なった（測定時間：1分間）。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光検出を行なった（測定時間：1分間）（図4）。
【００３６】
図5に、このようにして得られた発光強度の時間変化を示す。ここでグラフの縦軸は発光強度（V）を示しており、横軸は経過時間を示している。図5に示されているように2回のddNTPの添加にともなって、2つの発光強度ピーク501と502が現れる。501が最初にddNTPを投入したときに現れるピークであり、502が2回目にddNTPを投入したときに得られるピークである。２回目のピーク502はバックグラウンド発光に対応するため、発光強度シグナルはこれらのピークの差である503とした。
【００３７】
発光強度シグナルを30μLの発光試薬を混合した4種類の標準DNA１ μL（2x1010分子）について測定し、4種類のddATPの発光強度シグナルから伸長強度比を得た（表1の中段）。これらの数値で発光強度シグナル値を割り算することによって、塩基種の違いによる伸長度の差を補正した。表1の上段に補正前の発光シグナル値を下段に補正後のシグナル値を示す。この補正されたシグナル値を用いて、ターゲットDNA試料の分子数を定量するため、図6に示すように検量線601を作成した。グラフの横軸は発光強度シグナル値（補正後）であり、縦軸がPCR増幅前の標準DNAの分子数がプロットされている。次にターゲットDNA試料から得られた発光強度シグナル値（補正後）から、検量線601を使って、矢印602に示すようにターゲットDNA試料に対応する分子数（15500）を得た。この値は既知量のターゲット分子数15000にほぼ一致しており、十分な精度で定量できることを確認できた。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表２に標準DNAの１種類だけがターゲットDNA試料に混合されている場合の、ターゲットDNA試料の分子数の定量結果を示す。表２の上段は、ターゲットDNA試料へ添加したPCR増幅前の標準DNA分子数を示す。中段は、混合させた時の各標準DNAに対するターゲットDNA試料の発光強度シグナル比を示す。下段は、これらから推定されたターゲットDNA試料の分子数を示す（それぞれ15500、15200、及び15900）。この場合も、ターゲットDNA試料分子数は15000であり、良好な定量精度を得ることができた。
【００４０】
【表２】
【実施例２】
【００４１】
第2の実施例は、オリゴ(dT)30磁気ビーズ上でmRNAを逆転写し、得られたターゲットDNA試料を定量する例である。
【００４２】
実施例１と同様、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した。本実施例では、手順１のようにして大腸がん細胞から調製したRNAが最初の材料である。手順６にしたがって準備したオリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いてcDNAを作製した。cDNAの作製手順は手順７に示した。手順２にしたがって3種類の標準DNA試料を調製した。これら標準DNA試料を異なる割合でターゲットDNA試料に混合させ、手順８にしたがって同一プライマーでPCR増幅を行った。この増幅産物を一本鎖化し（実施例１の手順４と同じ操作）、手順５にしたがって一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【００４３】
手順６：オリゴ（dT）30固定化磁気ビーズの調製
表面をストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（直径1 μm、107個/μL、DYNAL社）をよく懸濁し、100 μL（磁気ビーズ109個を含む）を1.5 mLチューブに採取した。マグネットを1.5 mLチューブに近接させて磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。さらにBinding & Washing Buffer 100 μLで磁気ビーズを再懸濁し、マグネットで磁気ビーズを捕捉後、上清を除去することにより磁気ビーズを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。一方、5’末端にビオチン2分子を修飾し、続いてカーボン6つをスペーサー配列として含むオリゴ（dT）30（100 pmol/μL）6.67 μLへ、Binding & Washing Bufferを加えてオリゴ（dT）30希釈液400 μL（1.67 pmol/μL、4.0 x 1014分子含有）に調製した。このオリゴ（dT）30希釈溶液400 μLと、洗浄した磁気ビーズを混合し、ローターで60分間よく攪拌させ、ストレプトアビジン−ビオチン結合を利用して磁気ビーズ表面へオリゴ（dT）30を結合させた。磁気ビーズへ結合しなかった過剰なオリゴ（dT）30を取り除くため、マグネットで磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Bufferで2回ビーズの洗浄を行った。さらにRNaseを取り除くため、溶液A（0.1N NaOH、0.05M NaCl、DEPC処理）で2回、溶液B（0.1M NaCl、DEPC処理）で１回洗浄後、100 μLの滅菌水を添加して、オリゴ（dT）30が固定した磁気ビーズ懸濁液（1 x 107個/μL、推定オリゴ（dT）30固定数：約2.0 x 105分子/磁気ビーズ1個）を調製した。
【００４４】
手順７：オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料の調製
約106細胞程度のヒト大腸がん細胞（HCT116）から、RNeasy Midi Kit （QIAGEN社）を用いてトータルRNA（約400 ng/μL、25 μL、 計10 μg）を抽出・精製した。これを滅菌水で約100 pg/μLの濃度へ希釈した。氷上に置いたPCRチューブへ、トータルRNA 1 μL （約100 ng）、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズ1μL（1 x 107 個/μL）、dNTP Mix (10mM each) 1 μL、及び滅菌水20 μLを添加し、混合した。磁気ビーズ上のオリゴ(dT)30プライマーとmRNAポリAテールをハイブリダイゼーションするため、サーマルサイクラー(ABI社)を用いて70℃で55分間加熱した。同じPCRチューブを再び氷上に置き、5x First Strand Buffer (250mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15mM MgCl2) 6 μL、 DTT (0.1M) 1 μL、RNase OUT(40 unit/μL、Invitrogen社) 1 μL、及びSuper ScriptIII (200 unit/μL、Invitrogen社) 1 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで50℃ 50分間加熱し、逆転写反応を実施した。続いて、逆転写酵素を不活性化する為に85℃ 3分間加熱した。mRNAを除去してcDNAを1本鎖化するために、RNase H (2unit/μL) 1μLを添加し、サーマルサイクラーで37℃ 20分間加熱した。PCRチューブに磁石を近接させ、cDNAが固定された磁気ビーズを捕捉し、残留試薬が含まれる上澄を除去した。さらに、洗浄液（10 mM Tris, 0.1% Tween20）50 μLでこの磁気ビーズを2回洗浄し、同液10 μLに再懸濁した。これにより、ヒト大腸がん細胞由来トータルRNA (100 pg)から、磁気ビーズ表面へ固定されたターゲットDNA試料（1本鎖cDNA）を得た。
【００４５】
手順８：ターゲットDNA試料と標準DNAの混合とPCR増幅
上記のようにして磁気ビーズに固定化したターゲットDNA試料10 μLへ、手順２のようにして調製した標準DNA(A)（配列番号６）、標準DNA(B)（配列番号７）、及び標準DNA(C)（配列番号８）を10μLずつ添加して混合試料を調製した。この混合試料に、滅菌水 116 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10μM）40μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10μM）（配列番号５）40 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側に位置するように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。磁石をチューブに近接させてPCR産物が含まれる上澄を別チューブに採取した。残った磁気ビーズ上で合成されたPCR産物も採取するため、この磁気ビーズを0.1N NaOH 10μLで洗浄し、洗浄液を先程採取した上澄と混合した。このPCR産物410 μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順５のようにして、一塩基伸長による化学発光の測定を行い、ターゲットDNA試料の定量解析を行った。
【実施例３】
【００４６】
第3の実施例は、磁気ビーズ固定化cDNAを再利用し、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
【００４７】
実施例２のように磁気ビーズ上に固定化された1本鎖cDNAの形で解析対象が得られた場合は、固定したcDNAを鋳型にして2ndストランドcDNA合成を行い、プライマーなどを除去した後に合成された相補鎖を溶液中に遊離させ、これを定量分析ターゲットとして用いることが可能である。相補鎖合成した試料に、3種類の標準DNA（実施例１の手順２）を異なる割合で添加し、同一のプライマーでPCR増幅する。このとき用いたPCRプライマーは一塩基置換部位よりも外側にハイブリダイズするように設計されているため、実施例１及び２と同様、ターゲットDNA試料及び標準DNAの増幅効率は全く同じである。増幅産物を一本鎖化し（実施例1の手順４と同じ操作）、手順５にしたがって一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【００４８】
本実施例では、元のcDNAを磁気ビーズ上に残すことができるため、必要に応じて繰り返し試料を定量解析できるという利点がある。
【００４９】
手順９：2ndストランドcDNAの合成
まず、実施例２の手順６にしたがってオリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを調製した。つぎに、手順７にしたがって、上記オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料(トータルRNA100pg由来cDNA)を調製した。続いて、磁気ビーズ固定化1本鎖cDNA懸濁液10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10μL、x5 Q-solution 20 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10 μM）10 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合した。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、50℃ 30秒間、72℃ 3分間加熱して2ndストランドcDNAを合成した。チューブに磁石を近接させて磁気ビーズを捕捉し、反応に使用されなかった過剰プライマーを含む上澄を除去し、洗浄液100μＬで2回磁気ビーズを洗浄した。95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、磁石を用いて磁気ビーズを捕捉した後、上澄を採取した。この上澄には2ndストランドDNAが含まれている。この操作を2回行い、ターゲットDNA試料である2ndストランドDNA溶液20 μLを得た（20 μL）。
【００５０】
手順１０：2nd cDNAと標準DNA混合液のPCR増幅
2nd ストランド cDNA20μLに手順２にしたがって調製した標準DNA(A)（配列番号６）、標準DNA(B)（配列番号７）、及び標準DNA(C)（配列番号８）を10 μLずつ添加し、混合試料を調製した。この混合試料50 μLへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40 μL、x5 Q-solution 80 μL、ForwardプライマーE（配列番号９）（10 μM）40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）40 μL、及びTaq DNA polymerase(5unit/μL、QIAGEN社) 4 μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(A)(B)(C)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の鋳型は同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類の鋳型比率は増幅前と同じに保たれる。このPCR産物400 μL内に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４にしたがって、試料の一本鎖化を行った後、手順５にしたがって、一塩基伸長による発光測定を行い、ターゲットDNA試料の定量分析を行った。
【実施例４】
【００５１】
第4の実施例は、アンカー付きプライマーセットを用いて、実施例３のように磁気ビーズ固定化cDNAを再利用し、ヒト大腸がん細胞（HCT116）におけるEFF1G遺伝子の発現量を定量した例である。
【００５２】
まず、磁気ビーズに固定化したcDNAを鋳型として、アンカー付きプライマーでPCR増幅を行い、ターゲットDNAにアンカー配列を付加させた。このアンカー配列が付加されたターゲットDNA試料を別チューブに採取する。続いて、アンカー配列の一塩基のみを他の塩基種へ置換させたアンカー付きプライマーを用いて、標準DNA（１本鎖）を3種類調製した。先に調製したアンカー配列が付加されたターゲットDNA試料に、この3種類の標準DNAを異なる量で混合させ、PCR増幅を行った。この時のPCRプライマーは、一塩基置換部分よりも外側にハイブリダイズするように設計されているため、ターゲットDNA試料及び標準DNAを同じ増幅効率で増幅することが可能となる。この増幅産物を一本鎖化し、置換塩基部分を一塩基伸長させる。相補鎖合成反応が起こるとピロリン酸が生成し、これはATPに変換され、ルシフェラーゼ反応により発光が検出される。得られた発光強度はピロリン酸の量に比例している。ターゲットと標準試料では取り込まれる塩基種が異なるので識別して発行量を計測してその比率と加えた標準試料の量からターゲットの量を定量する。この場合も、3種類ではなく、1種類の標準DNAのみをターゲットDNA試料に混合し、定量解析することも可能である。
【００５３】
手順１２：アンカー配列を導入したターゲット配列の調製
手順７に従い、オリゴ(dT)30固定化磁気ビーズを用いた1本鎖cDNA試料10 μL (トータルRNA100pg由来cDNA)の調製を行った。1本鎖cDNA試料10 μLへ、滅菌水39 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、アンカー付きForwardプライマーG（配列番号１１）（10μM）10 μL、及びTaq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1μLを添加し、混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間、55℃ 30秒間、72℃ 2分間加熱して1回のみの伸長反応を行った。氷上で1分間ほど冷却させた後、反応チューブに磁石を近接させ、反応に使用されなかった過剰プライマーなどを含む上澄を除去した。洗浄液100 μLで磁気ビーズを2回洗浄後、95℃に加熱した滅菌水10 μLに磁気ビーズを懸濁し、上澄を採取した。この操作を2回行い、熱変性によって、磁気ビーズ上で合成されたアンカー付きターゲットDNA試料を得た（20 μL）。
【００５４】
手順１３：アンカー配列を含んだ標準DNAの調製
手順１と同様にして、大腸がん細胞由来cDNA試料（トータルRNA 10 pg由来cDNA/μL）を得た。上記で使用したアンカー付きForwardプライマーG（配列番号１１）と、1塩基のみ異なる3種類のプライマー、すなわちアンカー付きForwardプライマーH（配列番号１２）、アンカー付きForwardプライマーI（配列番号１３）、アンカー付きForwardプライマーJ（配列番号１４）を用意した。３本のPCRチューブ（チューブH、I、及びJ）を氷上に用意し、それぞれに滅菌水29 μL、x10 PCR Buffer 10 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 10 μL、x5 Q-solution 20 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）10 μL、Taq DNA polymerase(5 unit/μL、QIAGEN社) 1 μL、及びターゲットDNA試料 10 μLを添加した。さらに、チューブHにはForwardプライマーH（10 μM）10 μLを、チューブIにはForwardプライマーI（10 μM）10 μLを、チューブJにはForwardプライマーJ（10 μM）10 μLを添加し、各々をよく混合した。これらをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行い、3種類の2本鎖PCR産物H、I、及びJを得た。続いて、試料中に残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社)で各PCR産物を精製した（50 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、いずれも約1μg/μLであることを確認した。
【００５５】
これらのPCR産物A、B、及びCに、1x Binding & Washing Buffer （5 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 mM EDTA、1 M NaCl） 150 μLを添加し、200μLにメスアップした。また、Streptavidin coating磁気ビーズ（直径1 μm、107 個/μL、DYNAL BIOTECH社） 600 μLを1.5 mLチューブに採取し、磁石をチューブに近接させることで磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。Binding & Washing Buffer 600 μLで磁気ビーズを3回洗浄後、同液600 μLに懸濁した。この磁気ビーズ懸濁液200μLずつを各PCR産物試料へ添加し、ローター（600 rpm、室温）で60分間よく攪拌させ、Streptavidin−Biotin結合を介して磁気ビーズ表面へPCR産物を結合させた。磁気ビーズへ結合しなかった過剰なPCR産物を除去するため、磁石で磁気ビーズを捕捉して上清を除去し、Binding & Washing Buffer 200 μLで2回ビーズの洗浄を行った。続いて、0.1N NaOH 300 μLにPCR産物が結合した磁気ビーズをそれぞれ懸濁し、5分間室温にて静置した。磁石で磁気ビーズを捕捉し、新しいチューブへ上清をそれぞれ採取した。この上清に、1M Tris (pH 7.5) 60 μL及び0.1 % Tween (pH7.5) 300μLをそれぞれ添加して中和した。各試料に、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、v/v、Invitrogen社）1 mLを添加し、3分間ボルテックスした後、遠心（15000 rpm、5分間、室温）した（フェノール・クロロホルム精製）。分離溶液の上層をそれぞれ新しいチューブに採取し（約650μL）、QIAquick PCR Purification Kitを用いて、精製・濃縮した（約250 μL）。さらに、これら試料へ酢酸ナトリウム(3M) 25 μL、エタノール(99.5%, -30℃) 625 μLをそれぞれ添加し、-80℃で15分間凍結後、遠心（15000 rpm、15分間、4℃）した。エタノール(70%, -30℃) 180μLを各試料に添加し、遠心（15000 rpm、5分間、4℃）して、上清を除去した（エタノール沈殿精製）。ペレットを乾燥させた後、滅菌水10μLに懸濁し、 DNA濃度を吸光度計で測定し、いずれも約2 μg/μL（約2x1012分子/μL）であることを確認した。これを滅菌水で希釈し、標準DNA（H）（配列番号１５）約1000分子/μL、標準DNA(I)（配列番号１６）約500分子/μL、及び標準DNA(J)（配列番号１７）約100分子/μLを各々1ｍLずつ調製した。これらはターゲットDNA試料に対して一塩基のみ非相補的塩基を有する1本鎖DNAである。
【００５６】
手順１４：ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅
氷上に置いたチューブへ、手順１２で調製したアンカー付きターゲットDNA試料（20μＬ）、標準DNA(H)、標準DNA(I)、及び標準DNA(J)を10 μLずつ添加して混合試料を調製した。これへ、滅菌水106 μL、x10 PCR Buffer 40 μL、dNTP Mix (2.5 mM each) 40μL、x5 Q-solution 80μL、ForwardプライマーK（配列番号18）（10 μM）40 μL、5’末端BiotinラベルReverseプライマーF（10 μM）（配列番号５）40 μL、Taq DNA polymerase (5 unit/μL、QIAGEN社) 4μLを混合させた。これをサーマルサイクラーで、94℃ 1分間→（94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、72℃ 1分間）x50サイクル→72℃ 7分間加熱してPCR増幅を行った。標準DNA(H)(I)(J)に含まれる一塩基置換部位の外側にハイブリダイズするように設計されたプライマーでPCR増幅するため、混合試料中に存在する4種類の異なる置換塩基を有するDNAは同じ効率で増幅される。すなわち、PCR増幅後の試料内の4種類のDNA比率は増幅前と同じに保たれる。PCR産物400μLに残留したdNTP及びPCRプライマーを除去するため、QIAquick PCR Purification KitでPCR産物を精製した（500 μL）。吸光度計で各DNA濃度を測定し、約100 ng/μLであることを確認した。手順４と同様にして、一本鎖化したPCR産物100 μL（約5x1011分子/μL）を得た。
【００５７】
手順1５：一塩基伸長による化学発光の測定
一本鎖化したPCR合成物8 μlに対し、一塩基伸長用プローブ（50 μM、配列番号19）（405）3 μl、及び10x Hybridization Buffer (100 mM Tris-acetate、20 mM Mg-Acetate、pH 7.75) ３μl、滅菌水16 μlを混合する。混合溶液を、サーマルサイクラーで、92℃ 30秒間、50℃ 3分間加熱し、4℃に冷却した。この溶液4 μLに120 μLの発光試薬（0.065 U/μL Seaquase、100 mM Tricine、2 mM EDTA、20 mM Mg-Acetate、33.8 U/ml PPDK-E、523.0 GLU/ml Luciferase(LUC-H)、 Apyrase , 1.5 U/ml Grade VI、0.4 mM Luciferin、 0.04 mM PEP、0.2 mM AMP、0.10% BSA、2mM DTT, pH 7.75）を混合し、30℃ 1分間インキュベートした。30μLずつ4連チューブに分注し、PPaseで予めPPiを分解したddNTP（100 μM）を0.5 μLずつ添加し、発光検出した（測定時間：1分間）。次に、同量のddNTPを添加して、再度発光を検出した（測定時間：1分間）。
【００５８】
1回目測定した発光強度から、バックグラウンドである2回目測定した発光強度を差し引いた値を発光強度シグナルとした。このようにして得られる発光強度シグナルを30 μLの発光試薬を混合させた4種類の標準DNA1 μL（2x1010分子）について行い、4種類の発光強度シグナルをddATPによるシグナル値に対する比から伸長強度比を得た。これらの数値で発光強度シグナル値を割り算することによって、塩基種の違いによる伸長度の差を補正した。表1の上段に補正前の発光シグナル値を下段に補正後のシグナル値を示す。
【００５９】
この補正されたシグナル値を用いて、ターゲットDNA試料の分子数を定量するために、まず、混合した３種類の標準DNA(H)(I)(J)から図6に示すように検量線601を作成した。グラフの横軸は発光強度シグナル値（補正後）であり、縦軸がPCR増幅前の標準DNAの分子数がプロットされている。次にターゲットDNA試料から得られた発光強度シグナル値（補正後）から、検量線６01を使って、矢印602に示すようにターゲットDNA試料に対応する分子数（15500）を得た。この値は既知量のターゲット分子数15000にほぼ一致しており、十分な精度で定量できることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は核酸試料の定量分析を必要とする、医療、科学、食品等のあらゆる分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の方法の基本手順。
【図２】ターゲットDNA試料の構造。
【図３】ターゲットDNA試料と標準DNA試料の混合とPCR増幅。
【図４】一塩基伸長と発光強度の測定。
【図５】発光強度シグナルの算出。
【図６】発光強度比の算出（標準DNAを3種使用した場合）。
【符号の説明】
【００６２】
201 mRNA
202 cDNA
203 解析すべきDNA増幅領域
204 Forwardプライマープライミング部位
205 Reverse プライマー側プライミング部位
301 ターゲットDNA試料
302 標準DNA(A)
303 標準DNA(B)
304 標準DNA(C)
305 混合試料
306 ForwardプライマーE
307 5’末端BiotinラベルReverseプライマーF
401 PCR増幅後に一本鎖化したターゲットDNA試料
402 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(A)
403 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(B)
404 PCR増幅後に一本鎖化した標準DNA(C)
405 一塩基伸長用プローブ
501 最初にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
502 ２回目にddNTPを投入したときに得られる発光強度のピーク
501 発光強度シグナル
601 ３種類の標準DNA(A)(B)(C)から作成した検量線
602 ターゲットDNA試料に対応する分子数
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号２−プライマー
配列番号３−プライマー
配列番号４−プライマー
配列番号５−プライマー
配列番号６−標準DNA(A)
配列番号７−標準DNA(B)
配列番号８−標準DNA(C)
配列番号９−プライマー
配列番号１０−伸長用プローブ
配列番号１１−プライマー
配列番号１２−プライマー
配列番号１３−プライマー
配列番号１４−プライマー
配列番号１５−標準DNA(H)
配列番号１６−標準DNA(I)
配列番号１７−標準DNA(J)
配列番号１８−プライマー
配列番号１９−プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む核酸の定量方法：
1）ターゲットDNA試料に、前記ターゲットDNAの少なくとも一部に一塩基置換を導入した標準DNA試料の一定量を混合する工程
2）混合した試料を、前記一塩基置換部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを用いて増幅する工程、
3）増幅した試料を一本鎖化し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブをハイブリダイズさせ、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行う工程、
4）ルシフェラーゼ反応により前記相補鎖合成反応で生成するピロリン酸に由来する発光を検出する工程、
5）検出された発光量と前記標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する工程。
【請求項２】
前記1)〜5)の工程を置換塩基の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項１に記載の核酸の定量方法。
【請求項３】
前記1)〜5)の工程を濃度の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸の定量方法。
【請求項４】
前記プライマーがビオチンラベルされており、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて増幅産物を精製する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲットDNA試料がcDNA試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲットDNAに予めアンカー配列を付加しておき、このアンカー配列に一塩基置換を導入した配列を有するプライマーを用いて前記標準DNA試料を調製することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲットDNA及び前記標準DNAはいずれも遊離の形態であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ターゲットDNA及び標準DNAの少なくとも一方が固相表面に固定化されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲットDNA試料が磁気ビーズに固定化された試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
以下の工程を含む核酸の定量方法：
1）ターゲットDNA試料に、前記ターゲットDNAの少なくとも一部に一塩基置換を導入した標準DNA試料の一定量を混合する工程
2）混合した試料を、前記一塩基置換部位を含む領域を増幅するように設計されたプライマーを用いて増幅する工程、
3）増幅した試料を一本鎖化し、前記一塩基置換部位の直前に結合するプローブをハイブリダイズさせ、ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTPを1種類ずつ順次加えて相補鎖合成反応を行う工程、
4）ルシフェラーゼ反応により前記相補鎖合成反応で生成するピロリン酸に由来する発光を検出する工程、
5）検出された発光量と前記標準DNA試料の量からターゲットDNAを定量する工程。
【請求項２】
前記1)〜5)の工程を置換塩基の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項１に記載の核酸の定量方法。
【請求項３】
前記1)〜5)の工程を濃度の異なる複数の標準DNA試料について行なうことを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸の定量方法。
【請求項４】
前記プライマーがビオチンラベルされており、ストレプトアビジン結合ビーズを用いて増幅産物を精製する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ターゲットDNA試料がcDNA試料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ターゲットDNAに予めアンカー配列を付加しておき、このアンカー配列に一塩基置換を導入した配列を有するプライマーを用いて前記標準DNA試料を調製することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ターゲットDNA及び前記標準DNAはいずれも遊離の形態であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ターゲットDNA及び標準DNAの少なくとも一方が固相表面に固定化されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ターゲットDNA試料が磁気ビーズに固定化された試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１３１１７６（Ｐ２００９−１３１１７６Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０９０８９（Ｐ２００７−３０９０８９）
【出願日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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