核酸の選択的分離方法
【課題】全ゲノムから標的核酸のみを選択的に効率よく分離する方法を提供する。
【解決手段】非標的核酸に相補的なプローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、核酸集団から標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法である。前記非標的核酸に相補的なプローブは、標的核酸を捕捉するためのプローブを用意し、型作成用核酸集団中で前記標的核酸捕捉用プローブと標的核酸との複合体を形成させ、標的核酸を含む前記核酸集団から非標的核酸のみを分離し、これを非標的核酸に相補的なプローブとする。この非標的核酸に相補的なプローブを、被検体核酸集団に用いることによって標的核酸を選択的に分離する方法。
【解決手段】非標的核酸に相補的なプローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、核酸集団から標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法である。前記非標的核酸に相補的なプローブは、標的核酸を捕捉するためのプローブを用意し、型作成用核酸集団中で前記標的核酸捕捉用プローブと標的核酸との複合体を形成させ、標的核酸を含む前記核酸集団から非標的核酸のみを分離し、これを非標的核酸に相補的なプローブとする。この非標的核酸に相補的なプローブを、被検体核酸集団に用いることによって標的核酸を選択的に分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の調整方法に関する。特に、ＤＮＡマイクロアレイ等に供する核酸の調整方法であり、ヒトゲノムＤＮＡのように反復配列等の検出対象外の配列を大量に含む核酸を検体として扱う場合に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関連が次々と調べられている。そして、染色体の構造異常や遺伝子の有無、及びその存在量（発現量）を知ることで、病気の詳細な特徴把握やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。中でもがんと染色体異常、及び遺伝子発現とが関連があることが示されており、がん関連遺伝子の同定に向けて熱心に研究が重ねられている。
【０００３】
染色体の構造異常には数タイプがあり、１つの染色体の部分的過剰（遺伝子コピー数増加）または欠如や、染色体転座などがある。これらの異常が、がん遺伝子活性化やがん抑制遺伝子の異常に関与していると考えられる。従って、がんにおける共通な染色体異常を検出することができれば、新しいがん関連遺伝子の同定ができる。
【０００４】
全染色体を対象に遺伝子コピー数の増加ないし欠失を一度に解析する手段として、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法の応用であるＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が開発された（非特許文献１）。腫瘍などの検体ＤＮＡを、例えばＣｙ３標識する。一方、対照サンプルとして正常組織由来ＤＮＡを用意し、これに検体ＤＮＡと異なる色素であるＣｙ５等で標識をする。Ｃｙ３標識検体ＤＮＡとＣｙ５標識正常ＤＮＡとを混合し、ヒト正常分裂中期染色体上で競合的にハイブリダイズさせる。Ｃｙ３は緑色の蛍光として、Ｃｙ５は赤色の蛍光として検出され、検体ＤＮＡに遺伝子増幅が見られる染色体領域では緑色蛍光の増加を、欠失の見られる染色体領域では赤色蛍光の増加を示す。
【０００５】
ＣＧＨ法は一度のハイブリダイゼーションで全染色体における遺伝子コピー数の変化を検出できるが、感度及び解像度が低いという解決すべき課題があった。ＣＧＨによるコピー数変化の検出感度は、増幅単位と増幅レベルによって規定される。増幅単位が５Ｍｂ以上であれば、２倍の増幅レベルでも検出可能であるが、増幅単位が約３００Ｋｂの場合は、５〜１０倍以上の増幅レベルで増幅可能となる（非特許文献２）。
【０００６】
近年、ＣＧＨ法の低解像度を解決する手段として、スライドガラス上に多数のＤＮＡをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを用いたアレイＣＧＨ法が開発された。ＣＧＨ用のＤＮＡマイクロアレイには網羅性と検出感度の点からＢＡＣクローンＤＮＡといった長いゲノムＤＮＡ（５０〜３００Ｋｂ）が搭載されたものが主流であった。しかし最近では、高密度ＤＮＡマイクロアレイが実現し、また検体処理方法の開発により検出感度も向上し、ＣＧＨ用のオリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイも開発された。オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイの登場により、解像度は約１０Ｋｂと飛躍的に向上した。
【０００７】
ヒトの１倍体ゲノムには約３×１０9個の塩基が存在するが、その５０％以上を反復配列が占めている。全ゲノムを検体としたハイブリダイゼーションでは、しばしばこの反復配列が非特異的結合を引き起こし、特異性が低下する原因となる。この非特異的結合を減少させるために、あらかじめ検体を競合ＤＮＡで処理しておく方法が開発された。競合ＤＮＡとしては、ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ＤＮＡやｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡを消化したものが用いられたが、今日ではｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡが広く普及している。Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡはヒト胎盤から調整した５０〜３１０ｂｐの大きさのＤＮＡでＡｌｕとＫｐｎファミリーの反復配列を多く含んでいる。
【０００８】
また、オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイにおける感度が悪いという課題を解決する検体処理方法としてＲＯＭＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）法が開発された（非特許文献３）。これは、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素で断片化し、断片化産物のうち０．２〜１．２ｋｂのサイズのＤＮＡ断片のみを選択的に増幅する方法である。全ゲノムの約２．５％のＤＮＡ断片を再現性良く増幅するため、全ゲノムＤＮＡを増幅した時と比べて感度が約５０倍向上する。
【０００９】
更に、非特異結合の要因となる反復配列の取り扱いに関しては、特許文献１に分離されたＤＮＡの増幅されたピースに含まれている共有反復配列のハイブリダイゼーション能力を無能力化し、および／または同共有反復配列を除去する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−１９９５６４号公報
【非特許文献１】Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：８１８（１９９２）
【非特許文献２】応用サイトメトリー（医学書院）
【非特許文献３】Ｌｕｔｉｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１３：２２９１−２３０５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
全ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいて、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを入れる方法は、非特異的結合を減少させるために効果的であるが、全ての反復配列と競合できるわけではない。また、検体をＤＮＡマイクロアレイに供する前に検体ＤＮＡとＣｏｔ−１ ＤＮＡとを混合し、プレハイブリダイゼーションを数時間行わなくてはならず、より長い検査時間を必要とする。更に、ＤＮＡマイクロアレイに供する検体中のＤＮＡ量が増えるために、ハイブリダイゼーションが平衡に達するまでに長い時間が必要となる。
【００１１】
ＲＯＭＡ法は制限酵素で断片化したＤＮＡ断片のうちある長さの断片のみを選択的に増幅するため、反復配列の多くを除去することが可能である。ただし、どこで切断されるか、またＤＮＡ断片の長さは制限酵素次第であり、全ての遺伝子のコピー数を検査できるとは限らない。全ての遺伝子のコピー数を調べるには、複数の制限酵素を用いて補間し合うことが必要となってくる。
【００１２】
また、全ゲノム中の遺伝子コピー数を調べたい箇所、すなわち標的核酸が決まっていて、その数がゲノム中の遺伝子数よりもはるかに少ない場合、反復配列でなくても標的以外の非標的核酸が検査に少なからず悪影響を及ぼす。
【００１３】
上記課題に鑑み、本発明は、全ゲノムから標的核酸のみを選択的に分離する方法を提案することを目的とする。また、標的核酸のみを分離するためのプローブ作製方法も同時に提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、非標的核酸に相補的なプローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、核酸集団から標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法である。前記非標的核酸に相補的なプローブは、標的核酸を捕捉するためのプローブを用意し、型作成用核酸集団中で前記標的核酸捕捉用プローブと標的核酸との複合体を形成させ、標的核酸を含む前記核酸集団から非標的核酸のみを分離し、これを非標的核酸に相補的なプローブとする。この非標的核酸に相補的なプローブを、被検体核酸集団に用いることによって標的核酸を選択的に分離する方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の核酸の選択的分離方法によれば、核酸集団から検出対象外の非標的核酸を分離除去することにより、効率的に標的核酸を調べることが可能となる。本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた標的核酸の遺伝子コピー数の解析に特に有効であり、核酸集団が反復配列などの非標的核酸を大量に含む場合と比べて、非特異結合による検出結果のノイズを減らし、更に高感度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記目的を達成するために本発明者は、以下の工程から成る方法を見出した。
（１）被検体核酸集団から非標的核酸を分離除去するための非標的核酸捕捉用プローブを作製する工程、
（２）非標的核酸捕捉用プローブを用いて、核酸集団から非標的核酸を分離除去する工程。
【００１７】
（１）の非標的核酸捕捉用プローブの作製には、被検体核酸集団そのもの、または被検体核酸集団と同種の核酸集団と標的核酸を捕捉するためのプローブを用意する。ここで、同種の核酸集団（以下、型作製用核酸集団と称する）とは、被検体核酸の配列を含む配列を有する核酸集団のことを意味し、同じ種族の核酸を意味する。また例えば、各核酸集団の標的核酸における配列同士を比較して、９０％以上の相同性を有していれば、同種の核酸集団といえる。型作製用核酸集団としては、例えば検体となる核酸集団がヒトゲノムＤＮＡである場合は、ヒトゲノムＤＮＡを用意する。これは、必ずしも被検体者のＤＮＡである必要はなく、市販のヒトゲノムＤＮＡで良い。また、検体となる核酸集団には、反復配列を含む核酸集団、がん細胞などの遺伝子コピー数異常を多く含む核酸集団などが挙げられる。
【００１８】
標的核酸を捕捉するためのプローブは、標的核酸領域の配列から標的核酸に特異的な配列を選択し、これをプローブとする。標的核酸を調べる方法がＤＮＡマイクロアレイである場合、ＤＮＡマイクロアレイに搭載したプローブ配列の相補的な配列を標的核酸捕捉用プローブの配列とするのが望ましい。標的核酸を捕捉するためのプローブは、合成オリゴヌクレオチドでも良いし、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ等により特定の領域の配列のみのＤＮＡ増幅産物を作成することにより準備しても良い。
【００１９】
標的核酸を捕捉するためのプローブと型作製用核酸集団とを混合し、プローブ−標的核酸複合体を形成させて型作製用核酸集団からの分離を行う。プローブ−標的核酸複合体を形成させる方法としては、通常のＤＮＡ−ＤＮＡ複合体形成方法を実施すれば良く、特定の温度下で緩衝溶液中において数分から数時間インキュベーションすることで可能となる。
【００２０】
標的核酸捕捉用プローブには磁性粒子や特異的な結合を形成する物質であらかじめ標識をしておくと分離しやすい。特定の物質と特異的に結合する標識物質としては、ビオチン、抗原等が挙げられる。すなわち、ビオチン−アビジン、抗原−抗体など、特異的な結合を形成する物質を用いる。
【００２１】
そして、プローブに修飾を施した標識部分と特異的に結合する物質としては、標識物質がビオチンである場合はアビジンまたはストレプトアビジンが、標識物質が抗原である場合は抗体が挙げられる。これらの物質が固定された分離用担体を用いることで、核酸集団からプローブ−標識核酸複合体を分離することができる。
【００２２】
すなわち、核酸捕捉用プローブにビオチンが修飾されている場合、このビオチン修飾プローブと核酸とで形成したプローブ−核酸複合体を、アビジンが固定された固相担体と接触させることにより複合体を固相担体上に捕捉する。また、核酸捕捉用プローブに抗原が修飾されている場合、この抗原修飾プローブと核酸とで形成したプローブ−核酸複合体を、抗原を捕捉する抗体が固定された固相担体と接触させることにより複合体を固相担体上に捕捉する。
【００２３】
分離用担体としては、吸着及び結合可能な面積、分離のしやすさを考慮するとビーズ状のものを用いることがより好ましい。核酸集団からビーズに結合したプローブ−標的核酸複合体の分離は、ビーズに対して濾過、遠心分離、磁気による吸着などを行うことによって可能である。核酸集団から標的核酸が分離されたものが非標的核酸捕捉用プローブとなる。このように、ネガティブアイソレーション方式によって得られた非標的核酸捕捉用プローブは、ビーズ等が付いていない状態で得られるので、次の工程に容易に進むことができる。
【００２４】
そして、上記の方法により得られた非標的核酸捕捉用プローブを用いて、（２）の核酸集団から非標的核酸の分離除去を行う。分離方法は基本的に（１）の非標的核酸捕捉用プローブの作成方法と同じである。非標的核酸捕捉用プローブに対してビオチン、抗原等の物質で標識する。この非標的核酸捕捉用プローブと検体核酸集団と混合してプローブ−非標的核酸複合体を作製し、核酸集団からの分離を行えば、標的核酸を得ることができる。非標的核酸捕捉用プローブ作製と同様に、ネガティブアイソレーション方式によって得られるので、ビーズ等が付いていない状態で獲得することができる。
【００２５】
このようにして得られた非標的核酸が分離された標的核酸を含む調製物を用いて、標的核酸の遺伝子コピー数を解析する場合について以下に説明する。
【００２６】
まず、非標的核酸が分離された標的核酸を含む調製物中の核酸に対し、標識処理を行う。この標識処理に先立って核酸の増幅処理を行っても良いし、標識処理と同時に増幅処理を行っても良い。ただし、増幅処理に伴ってコピー数比に多少のゆがみが生じる可能性があるので、調製物の量が十分であれば、増幅処理は行わない方が好ましい。公知技術であるニックトランスレーション法等で標識処理を行うことができる。また、増幅処理を伴う標識処理としてはランダムプライマー伸長法などが挙げられる。
【００２７】
標識物質としては、どのような標識物質でも特に制限なく本発明に用いることが可能であるが、一般に高感度な検出が可能な蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において特に有効である。また、ビオチン、アミノアリル系化合物等の核酸標識用物質も本発明の検体調製方法には有効である。
【００２８】
標識された標的核酸は、固相上ハイブリダイゼーションによって解析するのに用いることができる。この固相上ハイブリダイゼーションの形態としては、ＤＮＡマイクロアレイが特に好適に利用できる。
【実施例】
【００２９】
本発明による核酸の選択的分離方法について、以下の実施例により、更に詳しく説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１＞ 非標的核酸捕捉用プローブの作製
（１）標的核酸解析用プローブの設定
検体はヒトゲノムＤＮＡとし、ヒトゲノム中の標的遺伝子はＥＧＦＲとする。ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を解析するためのプローブとして表１に示す核酸配列を設計した。ＥＧＦＲ遺伝子の全塩基配列情報は公開されているデータベース等から容易に入手可能である。プローブの設計にあたっては、ヒトゲノムＤＮＡに対し特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように配慮して行った。
【００３１】
【表１】
【００３２】
なお、表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後に定法に従って核酸の５’末端にチオール基を導入した。
【００３３】
（２）非標的核酸捕捉用プローブの作製
まず、非標的核酸捕捉用プローブを作製する。処理の流れのイメージ図を図１に、フローチャートを図２に示す。非標的核酸捕捉用プローブを作成するために、型作製用核酸として市販のノバジェン社製Ｈｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを用意した。また、標的核酸捕捉用プローブとして表１のＰ１配列の相補鎖配列Ｃ１を合成した。Ｃ１の配列は表２に示す。
なお、配列Ｃ１の５’末端にビオチン修飾をして合成を行った。
【００３４】
【表２】
【００３５】
まず、制限酵素Ｂａｎ Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの切断処理を行った(Ｓ１１)。ＤＮＡ １μｇを４４．８μｌの液量になるように超純水で調製し、制限酵素キットの仕様書に従い、１０×Ｂｕｆｆｅｒを５μｌとＥｎｚｙｍｅを０．２μｌ加え、計５０μｌの反応液を作成し、５０℃で１時間静置した。
【００３６】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られたＤＮＡ溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、ヒトゲノムＤＮＡが１００から１００００ｂｐくらいに断片化されていることを確認した。
【００３７】
精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液とビオチン修飾した標的核酸捕捉用プローブを用いて、プローブ−標的核酸複合体を作成する。精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液５０μｌにビオチン修飾したＣ１配列のＤＮＡを２０ｐｍｏｌ加え、リン酸緩衝液を用いて最終的に２００μｌ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１Ｍ ＮａＣｌ）になるように反応液を調整した。反応液は、７０℃１５分でディネーチャー(ｄｅｎａｔｕｒｅ)させた後、３７℃で２時間、続いて４５℃で１時間インキュベートし、プローブ−標的核酸複合体を作成した（Ｓ１２）。
【００３８】
続いて、ＤＮＡ溶液中からプローブ−標的核酸複合体の分離を行う。プローブには予めビオチン修飾を施してあるので、ビオチンに特異的に結合する物質であるストレプトアビジンを使用して分離することができる。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のμＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｋｉｔをキットのプロトコルに従って使用して分離を行った。具体的には、プローブ−標的核酸複合体が作成されたＤＮＡ溶液中にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを１００μｌ添加した。３０分程静置して反応させた後（Ｓ１３）、強い磁場を形成するμＭＡＣＳマグネットに取り付けたμ Ｃｏｌｕｍｎに反応液を通した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓは磁気ビーズであるので、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的な結合により、プローブ−標的核酸複合体は磁気標識されており、カラム中にトラップされる（Ｓ１４）。一方、複合体を形成していないＤＮＡはそのままカラムを通過する。通過した溶液を回収することによって、標的核酸を含まない非標的核酸捕捉用プローブを得ることができた。なお、反応液をカラムに通した後、カラム中に非特異結合している非標的核酸捕捉用プローブを回収するために、リン酸緩衝液１００μｌをカラムに通した。これを４回繰り返した。以上の操作より、約７００μｌの溶液が回収された。
【００３９】
回収されたＤＮＡ溶液の精製を行った。回収液を各３５０μｌの２チューブに分け、それぞれに対してニッポン・ジーン社製のエタチンメイトをキットのプロトコルに従って使用し、エタノール沈殿を行った。表３の通りに試薬を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。そして、上清のみを採取し、７０％氷冷エタノール５００μlを加えて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿のみを残して溶液を捨て、風乾させた後、それぞれ１０μlの蒸留水に溶解させ、混合させて２０μｌの非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液はＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定したところ、３７.４ｎｇ／μｌであった。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（３）非標的核酸捕捉用プローブのビオチン標識化
非標的核酸捕捉用プローブに対し、ビオチン修飾処理を行った（Ｓ１５）。得られたＤＮＡが少量であったので、ランダムプライミング方式によって増幅を行いつつ、ビオチン化標識を行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のバイオプライムＤＮＡラベリングシステムを用いてキットのプロトコルに従ってビオチン標識反応を行った。なお、ＤＮＡ量が十分多ければ、ニックトランスレーション法でビオチン化標識を行っても良い。
【００４２】
（２）で回収された非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ５００ｎｇに対して以下に示す通りに反応液を調整し、ＤＮＡの増幅及びビオチン修飾反応を行った。まず、表４の通りに試薬を加え、９５℃で５分間保温し、その後すぐに氷上にて５分間静値した。
【００４３】
【表４】
【００４４】
更に、１０×ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１ｍＭのｂｉｏｔｉｎ−１４−ｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、２ｍＭのｄＡＴＰ、２ｍＭのｄＧＴＰ、２ｍＭのｄＴＴＰ）を５μｌ加え、液量が４９μｌになるように超純水を１０.６μｌ加えて軽く混ぜた。そして、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μｌ加えて、優しく混ぜて約１５秒間遠心した。３７℃で１時間インキュベートし、最後にＳｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μｌ加えて反応を止めた。
【００４５】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、６０μｌの超純水で溶出した。得られたＤＮＡ溶液はＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定したところ、１０４.４ｎｇ／μｌであった。溶出されたＤＮＡ溶液は約５７μｌであり、５μｇ以上の非標的核酸捕捉用プローブを作製することができた。
【００４６】
＜実施例２＞ 標的核酸ＤＮＡの調製
（１）検体ＤＮＡの処理
検体ＤＮＡとして人扁平上皮癌Ａ４３１細胞から抽出したＤＮＡを用意した。また、対照検体として、実施例１でも使用したＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを使用した。
【００４７】
まず、制限酵素Ｂａｎ Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて検体ＤＮＡ及び対照検体ＤＮＡの切断処理を行った（Ｓ２１）。ＤＮＡ １μｇを４４．８μｌの液量になるように超純水で調製し、制限酵素キットの仕様書に従い、１０×Ｂｕｆｆｅｒを５μｌとＥｎｚｙｍｅを０．２μｌ加え、計５０μｌの反応液を作成し、５０℃で１時間静置した。
【００４８】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られたＤＮＡ溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、それぞれのＤＮＡが１００から１００００ｂｐくらいに断片化されていることを確認した。
【００４９】
（２）標的領域ＤＮＡの回収
制限酵素処理ＤＮＡ溶液に対し、実施例１で作成した非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う。処理の流れのイメージ図を図３に、フローチャートを図４に示す。
【００５０】
精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液５０μｌにビオチン標識化非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ溶液を４０μｌ（約４μｇ）加え、リン酸緩衝液を用いて最終的に２００μｌ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１Ｍ ＮａＣｌ）になるように反応液を調整した。反応液は、７０℃１５分でディネーチャーさせた後、３７℃で２時間、続いて４５℃で１時間インキュベートし、非標的核酸捕捉用プローブ−非標的核酸複合体を作成した（Ｓ２２）。
【００５１】
続いて、ＤＮＡ溶液中から非標的核酸捕捉用プローブ−非標的核酸複合体の分離を行う。実施例１と同様に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のμＭＡＣＳ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｋｉｔをキットのプロトコルに従って使用して分離を行った。μＭＡＣＳキットで処理することにより、非標的核酸はカラムに捕捉され、標的核酸のみを回収することができた（Ｓ２３〜Ｅｎｄ）。回収されたＤＮＡ溶液はニッポン・ジーン社製のエタチンメイトを用いて精製した。回収液７００μｌを２チューブに分けて処理を行い、精製済みＤＮＡを風乾させた後、それぞれ１０μlの蒸留水に溶解後、混合して２０μｌの標的核酸ＤＮＡ溶液を得た。以上の処理を検体ＤＮＡと対照検体ＤＮＡそれぞれについて行い、２種類の標的核酸ＤＮＡ溶液を得た。なお、得られたＤＮＡ溶液は、ＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定しても検出できなかった。
【００５２】
なお、今回の実施例では溶液中で非標的核酸捕捉用プローブと核酸集団中の非標的核酸との複合体を形成させたが、非標的核酸捕捉用プローブを先にカラムに充填しておき、カラムに核酸集団溶液を通しても良い。ただし、カラム及び核酸集団溶液は３７℃から４７℃に保ち、カラムから標的核酸を含むＤＮＡ溶液の溶出は時間をかけて行うことが望ましい。
【００５３】
（３）リアルタイムＰＣＲによる回収物の確認
（２）で得られたＤＮＡ溶液は非標的核酸ＤＮＡが除去されており、標的核酸ＤＮＡが回収されたものであるかをリアルタイムＰＣＲで確認した。表１に示したＰ１、Ｐ２配列領域それぞれのコピー数を調べるためのＴａｑＭａｎプローブ及びプライマー合成をＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に依頼した。
【００５４】
表５に示す４種の検体についてリアルタイムＰＣＲを行った。まず、ＥＧＦＲ領域を含むＢＡＣクローンＲＰ１１−８９Ｅ８から抽出したＤＮＡを用いて検量線を作製した。分子量よりコピー数を算出し、１０3から１０6コピー／チューブまで１０倍希釈系列を作製した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｎｏ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び、プライマー、プローブを用いて、反応チューブ１本あたり表６に示す通りに調製した。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
反応液は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、以下の温度条件で反応を行った。Ｓｔｅｐ３、４がＰＣＲサイクルであり、４０回繰り返した。
【００５８】
Ｓｔｅｐ １ ５０℃ ２分
Ｓｔｅｐ ２ ９５℃ １０分
Ｓｔｅｐ ３ ９５℃ １５秒
Ｓｔｅｐ ４ ６０℃ １分。
【００５９】
結果は、専用ソフトウエアで解析し、立ち上がりのサイクル数Ｃｔ値を算出した。ＤＮＡコピー数の常用対数を横軸に、Ｃｔ値をプロットした図を図１に示す。図５に示すように、ＤＮＡコピー数の常用対数とＣｔ値との間には直線関係があり、Ｃｔ値を測定することにより被検試料中の遺伝子コピー数を定量できる。
【００６０】
各検体のリアルタイムＰＣＲ結果を表７に示す。表７は１から４の各検体について、ターゲットＰ１、Ｐ２それぞれでのＣｔ値を表したものである。Ｃｔ値と図１に示した検量線からコピー数を換算した。検体１、２は非標的核酸の捕捉処理を行っていない、全ゲノムＤＮＡである。表７の結果から、処理前のＤＮＡではＰ１とＰ２とでコピー数に差はほとんどないことがわかる。一方、検体３、４は非標的核酸の捕捉処理を行った後のＤＮＡであり、非標的核酸にはＰ２領域も含まれている。表７より、Ｐ１とＰ２とでコピー数に差が生じ、Ｐ２領域のコピー数が少なくなっている。この結果から、非標的核酸が捕捉され、標的核酸ＤＮＡを選択的に回収できたことがわかる。
【００６１】
また、検体１、３は癌細胞から抽出したＤＮＡであり、検体２、４は正常細胞から抽出したＤＮＡである。表７の結果より、捕捉処理前検体において癌細胞ＤＮＡの方が正常細胞ＤＮＡよりもＥＧＦＲ領域のコピー数が約１０倍（Ｐ１：１０．３倍、Ｐ２：１３．５倍）多いことが示されている。一方、捕捉処理後の検体でもＰ１領域でコピー数の比が９．６倍となっている。
【００６２】
以上のことから、処理後の検体がコピー数の解析に用いることができることが示された。これらの処理は、ゲノム中の標的領域が増えた時にも行うことができ、この場合は捕捉処理後の検体をＤＮＡマイクロアレイを用いることにより最も効率的に解析することが可能となる。
【００６３】
【表７】
【００６４】
＜実施例３＞ ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析
(１)ＤＮＡマイクロアレイの作製
（ｉ）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００６５】
（ｉｉ）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００６６】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６７】
（ｉｉｉ）プローブＤＮＡの合成
表１に示したＰ１、Ｐ２に加えて１００種のプローブを設定し、それぞれ合成を行った。いずれのプローブもＰ１、Ｐ２と同様の指針で設定されており、同じハイブリダイゼーション条件で検出が可能である。プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、常法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ最終濃度（インク溶解時）５μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６８】
（ｉｖ）バブルジェットプリンターによるプローブＤＮＡ吐出および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（５μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６９】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１９０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００７０】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、各プローブ１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００７１】
（ｖ）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡマイクロ当たり９スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定されたＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００７２】
（２）標的核酸の調製
ＤＮＡマイクロアレイに搭載させたプローブ１００種を標的領域とし、それ以外の領域を非標的領域とする。ヒトゲノムＤＮＡ中の標的領域のみを効率的に解析するために、実施例１で示した方法で非標的核酸捕捉用プローブを作製した。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイに搭載させたプローブの相補鎖配列のＤＮＡをビオチン修飾して合成し、実施例１と同じ処理を行った。そして、得られた非標的核酸捕捉用プローブを用いて、実施例２で示した方法で標的核酸の調整を行った。なお、検体ＤＮＡは実施例２と同様、人扁平上皮癌Ａ４３１細胞から抽出したＤＮＡとＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを使用した。
【００７３】
（３）ＤＮＡマイクロアレイによる解析
（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイを用いて、（２）で得られたＤＮＡの解析を行う。なお、比較のために、非標的核酸の捕捉処理を行っていない全ゲノムＤＮＡも同様にマイクロアレイ解析を行った。
【００７４】
各検体ＤＮＡに対し、Ｃｙ３及びＣｙ５標識処理を行った。標識処理にはニックトランスレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、キットのプロトコルに従って処理を行った。ＤＮＡ使用量を表８に示す。なお、処理後の検体３、４に関しては回収ＤＮＡ全量を使用した（処理にはヒトゲノムＤＮＡ１μｇ使用）。反応液は表９に示した通りに調製し、１５℃で６０分インキュベートした。ただし、Ａ４３１はＣｙ３標識し、Ｈｕｍａｎ ＦｅｍａｌｅはＣｙ５標識した。そして、反応終了後、ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒを５μｌ加え、反応を止めた。
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
反応後の検体を１と２、３と４をそれぞれ１チューブにまとめて（１１０μｌ）エタノール沈殿による精製を行った。エタチンメイトを使用し、表１０に示す通りに反応液を調製した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。続いて、上清のみを採取し、７０％氷冷エタノール５００μlを加えて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿のみを残して溶液を捨て、キャップを開けたまま、２０分ほど遮光下で風乾させた。
【００７８】
【表１０】
【００７９】
表１１に示した通りにハイブリ液を調整し、ターゲットＤＮＡに加え、遮光下３７℃で３０分静置した。３０分後、優しくタッピングしハイブリ液ターゲットＤＮＡに良く溶かした。そして、同じく遮光下で７０℃１５分、３７℃６０分静置し、ターゲットＤＮＡのディネーチャーとプレハイブリダイゼーションを行った。
【００８０】
【表１１】
【００８１】
ハイブリ液を（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイに添加し、３７℃４８時間ハイブリダイゼーションを行った。タカラバイオ社製のＴａｋａｒａ Ｓｌｉｄｅ Ｓｅａｌ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲを用いて液の封止を行った。
【００８２】
ハイブリダイゼーション終了後、４５℃に保温したバッファー１（２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）とバッファー２（２×ＳＳＣ）で各５分洗浄し、最後にバッファー３（０．１×ＳＳＣ）で軽くリンスし、スピンドライを行った。
【００８３】
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。測定結果を表１２に示す。表１２の通り、処理後の検体の方が癌/正常の比が大きくなっており、コピー数の差をコントラスト良く検出できている。これは、処理前の全ゲノムＤＮＡを検体とした時に比べて標的核酸のハイブリを阻害する非標的核酸が除去されたためと考えられる。
【００８４】
また、今回は標的核酸のみの検体にもＣｏｔ−１ ＤＮＡを混入させてハイブリを行ったが、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを入れなくても同様の結果が得られた。ハイブリ時間も８時間程度で安定したシグナルを得られた。
【００８５】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】非標的核酸捕捉用プローブを作製するための処理の流れを示すイメージ図である。
【図２】非標的核酸捕捉用プローブを作製するためのフローチャート図である。
【図３】非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う処理の流れを示すイメージ図である。
【図４】非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う処理のフローチャート図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲ結果（検量線）を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の調整方法に関する。特に、ＤＮＡマイクロアレイ等に供する核酸の調整方法であり、ヒトゲノムＤＮＡのように反復配列等の検出対象外の配列を大量に含む核酸を検体として扱う場合に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関連が次々と調べられている。そして、染色体の構造異常や遺伝子の有無、及びその存在量（発現量）を知ることで、病気の詳細な特徴把握やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。中でもがんと染色体異常、及び遺伝子発現とが関連があることが示されており、がん関連遺伝子の同定に向けて熱心に研究が重ねられている。
【０００３】
染色体の構造異常には数タイプがあり、１つの染色体の部分的過剰（遺伝子コピー数増加）または欠如や、染色体転座などがある。これらの異常が、がん遺伝子活性化やがん抑制遺伝子の異常に関与していると考えられる。従って、がんにおける共通な染色体異常を検出することができれば、新しいがん関連遺伝子の同定ができる。
【０００４】
全染色体を対象に遺伝子コピー数の増加ないし欠失を一度に解析する手段として、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法の応用であるＣＧＨ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が開発された（非特許文献１）。腫瘍などの検体ＤＮＡを、例えばＣｙ３標識する。一方、対照サンプルとして正常組織由来ＤＮＡを用意し、これに検体ＤＮＡと異なる色素であるＣｙ５等で標識をする。Ｃｙ３標識検体ＤＮＡとＣｙ５標識正常ＤＮＡとを混合し、ヒト正常分裂中期染色体上で競合的にハイブリダイズさせる。Ｃｙ３は緑色の蛍光として、Ｃｙ５は赤色の蛍光として検出され、検体ＤＮＡに遺伝子増幅が見られる染色体領域では緑色蛍光の増加を、欠失の見られる染色体領域では赤色蛍光の増加を示す。
【０００５】
ＣＧＨ法は一度のハイブリダイゼーションで全染色体における遺伝子コピー数の変化を検出できるが、感度及び解像度が低いという解決すべき課題があった。ＣＧＨによるコピー数変化の検出感度は、増幅単位と増幅レベルによって規定される。増幅単位が５Ｍｂ以上であれば、２倍の増幅レベルでも検出可能であるが、増幅単位が約３００Ｋｂの場合は、５〜１０倍以上の増幅レベルで増幅可能となる（非特許文献２）。
【０００６】
近年、ＣＧＨ法の低解像度を解決する手段として、スライドガラス上に多数のＤＮＡをスポットしたＤＮＡマイクロアレイを用いたアレイＣＧＨ法が開発された。ＣＧＨ用のＤＮＡマイクロアレイには網羅性と検出感度の点からＢＡＣクローンＤＮＡといった長いゲノムＤＮＡ（５０〜３００Ｋｂ）が搭載されたものが主流であった。しかし最近では、高密度ＤＮＡマイクロアレイが実現し、また検体処理方法の開発により検出感度も向上し、ＣＧＨ用のオリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイも開発された。オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイの登場により、解像度は約１０Ｋｂと飛躍的に向上した。
【０００７】
ヒトの１倍体ゲノムには約３×１０9個の塩基が存在するが、その５０％以上を反復配列が占めている。全ゲノムを検体としたハイブリダイゼーションでは、しばしばこの反復配列が非特異的結合を引き起こし、特異性が低下する原因となる。この非特異的結合を減少させるために、あらかじめ検体を競合ＤＮＡで処理しておく方法が開発された。競合ＤＮＡとしては、ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ＤＮＡやｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡを消化したものが用いられたが、今日ではｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡが広く普及している。Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡはヒト胎盤から調整した５０〜３１０ｂｐの大きさのＤＮＡでＡｌｕとＫｐｎファミリーの反復配列を多く含んでいる。
【０００８】
また、オリゴヌクレオチドＤＮＡマイクロアレイにおける感度が悪いという課題を解決する検体処理方法としてＲＯＭＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）法が開発された（非特許文献３）。これは、ヒトゲノムＤＮＡを制限酵素で断片化し、断片化産物のうち０．２〜１．２ｋｂのサイズのＤＮＡ断片のみを選択的に増幅する方法である。全ゲノムの約２．５％のＤＮＡ断片を再現性良く増幅するため、全ゲノムＤＮＡを増幅した時と比べて感度が約５０倍向上する。
【０００９】
更に、非特異結合の要因となる反復配列の取り扱いに関しては、特許文献１に分離されたＤＮＡの増幅されたピースに含まれている共有反復配列のハイブリダイゼーション能力を無能力化し、および／または同共有反復配列を除去する方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−１９９５６４号公報
【非特許文献１】Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：８１８（１９９２）
【非特許文献２】応用サイトメトリー（医学書院）
【非特許文献３】Ｌｕｔｉｏ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１３：２２９１−２３０５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
全ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいて、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを入れる方法は、非特異的結合を減少させるために効果的であるが、全ての反復配列と競合できるわけではない。また、検体をＤＮＡマイクロアレイに供する前に検体ＤＮＡとＣｏｔ−１ ＤＮＡとを混合し、プレハイブリダイゼーションを数時間行わなくてはならず、より長い検査時間を必要とする。更に、ＤＮＡマイクロアレイに供する検体中のＤＮＡ量が増えるために、ハイブリダイゼーションが平衡に達するまでに長い時間が必要となる。
【００１１】
ＲＯＭＡ法は制限酵素で断片化したＤＮＡ断片のうちある長さの断片のみを選択的に増幅するため、反復配列の多くを除去することが可能である。ただし、どこで切断されるか、またＤＮＡ断片の長さは制限酵素次第であり、全ての遺伝子のコピー数を検査できるとは限らない。全ての遺伝子のコピー数を調べるには、複数の制限酵素を用いて補間し合うことが必要となってくる。
【００１２】
また、全ゲノム中の遺伝子コピー数を調べたい箇所、すなわち標的核酸が決まっていて、その数がゲノム中の遺伝子数よりもはるかに少ない場合、反復配列でなくても標的以外の非標的核酸が検査に少なからず悪影響を及ぼす。
【００１３】
上記課題に鑑み、本発明は、全ゲノムから標的核酸のみを選択的に分離する方法を提案することを目的とする。また、標的核酸のみを分離するためのプローブ作製方法も同時に提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、非標的核酸に相補的なプローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、核酸集団から標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法である。前記非標的核酸に相補的なプローブは、標的核酸を捕捉するためのプローブを用意し、型作成用核酸集団中で前記標的核酸捕捉用プローブと標的核酸との複合体を形成させ、標的核酸を含む前記核酸集団から非標的核酸のみを分離し、これを非標的核酸に相補的なプローブとする。この非標的核酸に相補的なプローブを、被検体核酸集団に用いることによって標的核酸を選択的に分離する方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の核酸の選択的分離方法によれば、核酸集団から検出対象外の非標的核酸を分離除去することにより、効率的に標的核酸を調べることが可能となる。本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを用いた標的核酸の遺伝子コピー数の解析に特に有効であり、核酸集団が反復配列などの非標的核酸を大量に含む場合と比べて、非特異結合による検出結果のノイズを減らし、更に高感度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記目的を達成するために本発明者は、以下の工程から成る方法を見出した。
（１）被検体核酸集団から非標的核酸を分離除去するための非標的核酸捕捉用プローブを作製する工程、
（２）非標的核酸捕捉用プローブを用いて、核酸集団から非標的核酸を分離除去する工程。
【００１７】
（１）の非標的核酸捕捉用プローブの作製には、被検体核酸集団そのもの、または被検体核酸集団と同種の核酸集団と標的核酸を捕捉するためのプローブを用意する。ここで、同種の核酸集団（以下、型作製用核酸集団と称する）とは、被検体核酸の配列を含む配列を有する核酸集団のことを意味し、同じ種族の核酸を意味する。また例えば、各核酸集団の標的核酸における配列同士を比較して、９０％以上の相同性を有していれば、同種の核酸集団といえる。型作製用核酸集団としては、例えば検体となる核酸集団がヒトゲノムＤＮＡである場合は、ヒトゲノムＤＮＡを用意する。これは、必ずしも被検体者のＤＮＡである必要はなく、市販のヒトゲノムＤＮＡで良い。また、検体となる核酸集団には、反復配列を含む核酸集団、がん細胞などの遺伝子コピー数異常を多く含む核酸集団などが挙げられる。
【００１８】
標的核酸を捕捉するためのプローブは、標的核酸領域の配列から標的核酸に特異的な配列を選択し、これをプローブとする。標的核酸を調べる方法がＤＮＡマイクロアレイである場合、ＤＮＡマイクロアレイに搭載したプローブ配列の相補的な配列を標的核酸捕捉用プローブの配列とするのが望ましい。標的核酸を捕捉するためのプローブは、合成オリゴヌクレオチドでも良いし、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ等により特定の領域の配列のみのＤＮＡ増幅産物を作成することにより準備しても良い。
【００１９】
標的核酸を捕捉するためのプローブと型作製用核酸集団とを混合し、プローブ−標的核酸複合体を形成させて型作製用核酸集団からの分離を行う。プローブ−標的核酸複合体を形成させる方法としては、通常のＤＮＡ−ＤＮＡ複合体形成方法を実施すれば良く、特定の温度下で緩衝溶液中において数分から数時間インキュベーションすることで可能となる。
【００２０】
標的核酸捕捉用プローブには磁性粒子や特異的な結合を形成する物質であらかじめ標識をしておくと分離しやすい。特定の物質と特異的に結合する標識物質としては、ビオチン、抗原等が挙げられる。すなわち、ビオチン−アビジン、抗原−抗体など、特異的な結合を形成する物質を用いる。
【００２１】
そして、プローブに修飾を施した標識部分と特異的に結合する物質としては、標識物質がビオチンである場合はアビジンまたはストレプトアビジンが、標識物質が抗原である場合は抗体が挙げられる。これらの物質が固定された分離用担体を用いることで、核酸集団からプローブ−標識核酸複合体を分離することができる。
【００２２】
すなわち、核酸捕捉用プローブにビオチンが修飾されている場合、このビオチン修飾プローブと核酸とで形成したプローブ−核酸複合体を、アビジンが固定された固相担体と接触させることにより複合体を固相担体上に捕捉する。また、核酸捕捉用プローブに抗原が修飾されている場合、この抗原修飾プローブと核酸とで形成したプローブ−核酸複合体を、抗原を捕捉する抗体が固定された固相担体と接触させることにより複合体を固相担体上に捕捉する。
【００２３】
分離用担体としては、吸着及び結合可能な面積、分離のしやすさを考慮するとビーズ状のものを用いることがより好ましい。核酸集団からビーズに結合したプローブ−標的核酸複合体の分離は、ビーズに対して濾過、遠心分離、磁気による吸着などを行うことによって可能である。核酸集団から標的核酸が分離されたものが非標的核酸捕捉用プローブとなる。このように、ネガティブアイソレーション方式によって得られた非標的核酸捕捉用プローブは、ビーズ等が付いていない状態で得られるので、次の工程に容易に進むことができる。
【００２４】
そして、上記の方法により得られた非標的核酸捕捉用プローブを用いて、（２）の核酸集団から非標的核酸の分離除去を行う。分離方法は基本的に（１）の非標的核酸捕捉用プローブの作成方法と同じである。非標的核酸捕捉用プローブに対してビオチン、抗原等の物質で標識する。この非標的核酸捕捉用プローブと検体核酸集団と混合してプローブ−非標的核酸複合体を作製し、核酸集団からの分離を行えば、標的核酸を得ることができる。非標的核酸捕捉用プローブ作製と同様に、ネガティブアイソレーション方式によって得られるので、ビーズ等が付いていない状態で獲得することができる。
【００２５】
このようにして得られた非標的核酸が分離された標的核酸を含む調製物を用いて、標的核酸の遺伝子コピー数を解析する場合について以下に説明する。
【００２６】
まず、非標的核酸が分離された標的核酸を含む調製物中の核酸に対し、標識処理を行う。この標識処理に先立って核酸の増幅処理を行っても良いし、標識処理と同時に増幅処理を行っても良い。ただし、増幅処理に伴ってコピー数比に多少のゆがみが生じる可能性があるので、調製物の量が十分であれば、増幅処理は行わない方が好ましい。公知技術であるニックトランスレーション法等で標識処理を行うことができる。また、増幅処理を伴う標識処理としてはランダムプライマー伸長法などが挙げられる。
【００２７】
標識物質としては、どのような標識物質でも特に制限なく本発明に用いることが可能であるが、一般に高感度な検出が可能な蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において特に有効である。また、ビオチン、アミノアリル系化合物等の核酸標識用物質も本発明の検体調製方法には有効である。
【００２８】
標識された標的核酸は、固相上ハイブリダイゼーションによって解析するのに用いることができる。この固相上ハイブリダイゼーションの形態としては、ＤＮＡマイクロアレイが特に好適に利用できる。
【実施例】
【００２９】
本発明による核酸の選択的分離方法について、以下の実施例により、更に詳しく説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１＞ 非標的核酸捕捉用プローブの作製
（１）標的核酸解析用プローブの設定
検体はヒトゲノムＤＮＡとし、ヒトゲノム中の標的遺伝子はＥＧＦＲとする。ＥＧＦＲ遺伝子のコピー数を解析するためのプローブとして表１に示す核酸配列を設計した。ＥＧＦＲ遺伝子の全塩基配列情報は公開されているデータベース等から容易に入手可能である。プローブの設計にあたっては、ヒトゲノムＤＮＡに対し特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように配慮して行った。
【００３１】
【表１】
【００３２】
なお、表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後に定法に従って核酸の５’末端にチオール基を導入した。
【００３３】
（２）非標的核酸捕捉用プローブの作製
まず、非標的核酸捕捉用プローブを作製する。処理の流れのイメージ図を図１に、フローチャートを図２に示す。非標的核酸捕捉用プローブを作成するために、型作製用核酸として市販のノバジェン社製Ｈｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを用意した。また、標的核酸捕捉用プローブとして表１のＰ１配列の相補鎖配列Ｃ１を合成した。Ｃ１の配列は表２に示す。
なお、配列Ｃ１の５’末端にビオチン修飾をして合成を行った。
【００３４】
【表２】
【００３５】
まず、制限酵素Ｂａｎ Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡの切断処理を行った(Ｓ１１)。ＤＮＡ １μｇを４４．８μｌの液量になるように超純水で調製し、制限酵素キットの仕様書に従い、１０×Ｂｕｆｆｅｒを５μｌとＥｎｚｙｍｅを０．２μｌ加え、計５０μｌの反応液を作成し、５０℃で１時間静置した。
【００３６】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られたＤＮＡ溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、ヒトゲノムＤＮＡが１００から１００００ｂｐくらいに断片化されていることを確認した。
【００３７】
精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液とビオチン修飾した標的核酸捕捉用プローブを用いて、プローブ−標的核酸複合体を作成する。精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液５０μｌにビオチン修飾したＣ１配列のＤＮＡを２０ｐｍｏｌ加え、リン酸緩衝液を用いて最終的に２００μｌ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１Ｍ ＮａＣｌ）になるように反応液を調整した。反応液は、７０℃１５分でディネーチャー(ｄｅｎａｔｕｒｅ)させた後、３７℃で２時間、続いて４５℃で１時間インキュベートし、プローブ−標的核酸複合体を作成した（Ｓ１２）。
【００３８】
続いて、ＤＮＡ溶液中からプローブ−標的核酸複合体の分離を行う。プローブには予めビオチン修飾を施してあるので、ビオチンに特異的に結合する物質であるストレプトアビジンを使用して分離することができる。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のμＭＡＣＳ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｋｉｔをキットのプロトコルに従って使用して分離を行った。具体的には、プローブ−標的核酸複合体が作成されたＤＮＡ溶液中にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを１００μｌ添加した。３０分程静置して反応させた後（Ｓ１３）、強い磁場を形成するμＭＡＣＳマグネットに取り付けたμ Ｃｏｌｕｍｎに反応液を通した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓは磁気ビーズであるので、ビオチンとストレプトアビジンとの特異的な結合により、プローブ−標的核酸複合体は磁気標識されており、カラム中にトラップされる（Ｓ１４）。一方、複合体を形成していないＤＮＡはそのままカラムを通過する。通過した溶液を回収することによって、標的核酸を含まない非標的核酸捕捉用プローブを得ることができた。なお、反応液をカラムに通した後、カラム中に非特異結合している非標的核酸捕捉用プローブを回収するために、リン酸緩衝液１００μｌをカラムに通した。これを４回繰り返した。以上の操作より、約７００μｌの溶液が回収された。
【００３９】
回収されたＤＮＡ溶液の精製を行った。回収液を各３５０μｌの２チューブに分け、それぞれに対してニッポン・ジーン社製のエタチンメイトをキットのプロトコルに従って使用し、エタノール沈殿を行った。表３の通りに試薬を加え、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。そして、上清のみを採取し、７０％氷冷エタノール５００μlを加えて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿のみを残して溶液を捨て、風乾させた後、それぞれ１０μlの蒸留水に溶解させ、混合させて２０μｌの非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ溶液を得た。得られたＤＮＡ溶液はＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定したところ、３７.４ｎｇ／μｌであった。
【００４０】
【表３】
【００４１】
（３）非標的核酸捕捉用プローブのビオチン標識化
非標的核酸捕捉用プローブに対し、ビオチン修飾処理を行った（Ｓ１５）。得られたＤＮＡが少量であったので、ランダムプライミング方式によって増幅を行いつつ、ビオチン化標識を行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のバイオプライムＤＮＡラベリングシステムを用いてキットのプロトコルに従ってビオチン標識反応を行った。なお、ＤＮＡ量が十分多ければ、ニックトランスレーション法でビオチン化標識を行っても良い。
【００４２】
（２）で回収された非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ５００ｎｇに対して以下に示す通りに反応液を調整し、ＤＮＡの増幅及びビオチン修飾反応を行った。まず、表４の通りに試薬を加え、９５℃で５分間保温し、その後すぐに氷上にて５分間静値した。
【００４３】
【表４】
【００４４】
更に、１０×ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１ｍＭのｂｉｏｔｉｎ−１４−ｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、２ｍＭのｄＡＴＰ、２ｍＭのｄＧＴＰ、２ｍＭのｄＴＴＰ）を５μｌ加え、液量が４９μｌになるように超純水を１０.６μｌ加えて軽く混ぜた。そして、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを１μｌ加えて、優しく混ぜて約１５秒間遠心した。３７℃で１時間インキュベートし、最後にＳｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒを５μｌ加えて反応を止めた。
【００４５】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、６０μｌの超純水で溶出した。得られたＤＮＡ溶液はＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定したところ、１０４.４ｎｇ／μｌであった。溶出されたＤＮＡ溶液は約５７μｌであり、５μｇ以上の非標的核酸捕捉用プローブを作製することができた。
【００４６】
＜実施例２＞ 標的核酸ＤＮＡの調製
（１）検体ＤＮＡの処理
検体ＤＮＡとして人扁平上皮癌Ａ４３１細胞から抽出したＤＮＡを用意した。また、対照検体として、実施例１でも使用したＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを使用した。
【００４７】
まず、制限酵素Ｂａｎ Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて検体ＤＮＡ及び対照検体ＤＮＡの切断処理を行った（Ｓ２１）。ＤＮＡ １μｇを４４．８μｌの液量になるように超純水で調製し、制限酵素キットの仕様書に従い、１０×Ｂｕｆｆｅｒを５μｌとＥｎｚｙｍｅを０．２μｌ加え、計５０μｌの反応液を作成し、５０℃で１時間静置した。
【００４８】
反応液は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られたＤＮＡ溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、それぞれのＤＮＡが１００から１００００ｂｐくらいに断片化されていることを確認した。
【００４９】
（２）標的領域ＤＮＡの回収
制限酵素処理ＤＮＡ溶液に対し、実施例１で作成した非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う。処理の流れのイメージ図を図３に、フローチャートを図４に示す。
【００５０】
精製済み制限酵素処理ＤＮＡ溶液５０μｌにビオチン標識化非標的核酸捕捉用プローブＤＮＡ溶液を４０μｌ（約４μｇ）加え、リン酸緩衝液を用いて最終的に２００μｌ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１Ｍ ＮａＣｌ）になるように反応液を調整した。反応液は、７０℃１５分でディネーチャーさせた後、３７℃で２時間、続いて４５℃で１時間インキュベートし、非標的核酸捕捉用プローブ−非標的核酸複合体を作成した（Ｓ２２）。
【００５１】
続いて、ＤＮＡ溶液中から非標的核酸捕捉用プローブ−非標的核酸複合体の分離を行う。実施例１と同様に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のμＭＡＣＳ（商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｋｉｔをキットのプロトコルに従って使用して分離を行った。μＭＡＣＳキットで処理することにより、非標的核酸はカラムに捕捉され、標的核酸のみを回収することができた（Ｓ２３〜Ｅｎｄ）。回収されたＤＮＡ溶液はニッポン・ジーン社製のエタチンメイトを用いて精製した。回収液７００μｌを２チューブに分けて処理を行い、精製済みＤＮＡを風乾させた後、それぞれ１０μlの蒸留水に溶解後、混合して２０μｌの標的核酸ＤＮＡ溶液を得た。以上の処理を検体ＤＮＡと対照検体ＤＮＡそれぞれについて行い、２種類の標的核酸ＤＮＡ溶液を得た。なお、得られたＤＮＡ溶液は、ＮａｎｏＤｒｏｐ社製、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００でＤＮＡ濃度を測定しても検出できなかった。
【００５２】
なお、今回の実施例では溶液中で非標的核酸捕捉用プローブと核酸集団中の非標的核酸との複合体を形成させたが、非標的核酸捕捉用プローブを先にカラムに充填しておき、カラムに核酸集団溶液を通しても良い。ただし、カラム及び核酸集団溶液は３７℃から４７℃に保ち、カラムから標的核酸を含むＤＮＡ溶液の溶出は時間をかけて行うことが望ましい。
【００５３】
（３）リアルタイムＰＣＲによる回収物の確認
（２）で得られたＤＮＡ溶液は非標的核酸ＤＮＡが除去されており、標的核酸ＤＮＡが回収されたものであるかをリアルタイムＰＣＲで確認した。表１に示したＰ１、Ｐ２配列領域それぞれのコピー数を調べるためのＴａｑＭａｎプローブ及びプライマー合成をＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に依頼した。
【００５４】
表５に示す４種の検体についてリアルタイムＰＣＲを行った。まず、ＥＧＦＲ領域を含むＢＡＣクローンＲＰ１１−８９Ｅ８から抽出したＤＮＡを用いて検量線を作製した。分子量よりコピー数を算出し、１０3から１０6コピー／チューブまで１０倍希釈系列を作製した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｎｏ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び、プライマー、プローブを用いて、反応チューブ１本あたり表６に示す通りに調製した。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
反応液は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、以下の温度条件で反応を行った。Ｓｔｅｐ３、４がＰＣＲサイクルであり、４０回繰り返した。
【００５８】
Ｓｔｅｐ １ ５０℃ ２分
Ｓｔｅｐ ２ ９５℃ １０分
Ｓｔｅｐ ３ ９５℃ １５秒
Ｓｔｅｐ ４ ６０℃ １分。
【００５９】
結果は、専用ソフトウエアで解析し、立ち上がりのサイクル数Ｃｔ値を算出した。ＤＮＡコピー数の常用対数を横軸に、Ｃｔ値をプロットした図を図１に示す。図５に示すように、ＤＮＡコピー数の常用対数とＣｔ値との間には直線関係があり、Ｃｔ値を測定することにより被検試料中の遺伝子コピー数を定量できる。
【００６０】
各検体のリアルタイムＰＣＲ結果を表７に示す。表７は１から４の各検体について、ターゲットＰ１、Ｐ２それぞれでのＣｔ値を表したものである。Ｃｔ値と図１に示した検量線からコピー数を換算した。検体１、２は非標的核酸の捕捉処理を行っていない、全ゲノムＤＮＡである。表７の結果から、処理前のＤＮＡではＰ１とＰ２とでコピー数に差はほとんどないことがわかる。一方、検体３、４は非標的核酸の捕捉処理を行った後のＤＮＡであり、非標的核酸にはＰ２領域も含まれている。表７より、Ｐ１とＰ２とでコピー数に差が生じ、Ｐ２領域のコピー数が少なくなっている。この結果から、非標的核酸が捕捉され、標的核酸ＤＮＡを選択的に回収できたことがわかる。
【００６１】
また、検体１、３は癌細胞から抽出したＤＮＡであり、検体２、４は正常細胞から抽出したＤＮＡである。表７の結果より、捕捉処理前検体において癌細胞ＤＮＡの方が正常細胞ＤＮＡよりもＥＧＦＲ領域のコピー数が約１０倍（Ｐ１：１０．３倍、Ｐ２：１３．５倍）多いことが示されている。一方、捕捉処理後の検体でもＰ１領域でコピー数の比が９．６倍となっている。
【００６２】
以上のことから、処理後の検体がコピー数の解析に用いることができることが示された。これらの処理は、ゲノム中の標的領域が増えた時にも行うことができ、この場合は捕捉処理後の検体をＤＮＡマイクロアレイを用いることにより最も効率的に解析することが可能となる。
【００６３】
【表７】
【００６４】
＜実施例３＞ ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析
(１)ＤＮＡマイクロアレイの作製
（ｉ）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００６５】
（ｉｉ）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００６６】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６７】
（ｉｉｉ）プローブＤＮＡの合成
表１に示したＰ１、Ｐ２に加えて１００種のプローブを設定し、それぞれ合成を行った。いずれのプローブもＰ１、Ｐ２と同様の指針で設定されており、同じハイブリダイゼーション条件で検出が可能である。プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、常法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ最終濃度（インク溶解時）５μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６８】
（ｉｖ）バブルジェットプリンターによるプローブＤＮＡ吐出および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（５μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６９】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１９０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００７０】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、各プローブ１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００７１】
（ｖ）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡマイクロ当たり９スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定されたＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００７２】
（２）標的核酸の調製
ＤＮＡマイクロアレイに搭載させたプローブ１００種を標的領域とし、それ以外の領域を非標的領域とする。ヒトゲノムＤＮＡ中の標的領域のみを効率的に解析するために、実施例１で示した方法で非標的核酸捕捉用プローブを作製した。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイに搭載させたプローブの相補鎖配列のＤＮＡをビオチン修飾して合成し、実施例１と同じ処理を行った。そして、得られた非標的核酸捕捉用プローブを用いて、実施例２で示した方法で標的核酸の調整を行った。なお、検体ＤＮＡは実施例２と同様、人扁平上皮癌Ａ４３１細胞から抽出したＤＮＡとＨｕｍａｎ Ｆｅｍａｌｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを使用した。
【００７３】
（３）ＤＮＡマイクロアレイによる解析
（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイを用いて、（２）で得られたＤＮＡの解析を行う。なお、比較のために、非標的核酸の捕捉処理を行っていない全ゲノムＤＮＡも同様にマイクロアレイ解析を行った。
【００７４】
各検体ＤＮＡに対し、Ｃｙ３及びＣｙ５標識処理を行った。標識処理にはニックトランスレーションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、キットのプロトコルに従って処理を行った。ＤＮＡ使用量を表８に示す。なお、処理後の検体３、４に関しては回収ＤＮＡ全量を使用した（処理にはヒトゲノムＤＮＡ１μｇ使用）。反応液は表９に示した通りに調製し、１５℃で６０分インキュベートした。ただし、Ａ４３１はＣｙ３標識し、Ｈｕｍａｎ ＦｅｍａｌｅはＣｙ５標識した。そして、反応終了後、ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒを５μｌ加え、反応を止めた。
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
反応後の検体を１と２、３と４をそれぞれ１チューブにまとめて（１１０μｌ）エタノール沈殿による精製を行った。エタチンメイトを使用し、表１０に示す通りに反応液を調製した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。続いて、上清のみを採取し、７０％氷冷エタノール５００μlを加えて、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈殿のみを残して溶液を捨て、キャップを開けたまま、２０分ほど遮光下で風乾させた。
【００７８】
【表１０】
【００７９】
表１１に示した通りにハイブリ液を調整し、ターゲットＤＮＡに加え、遮光下３７℃で３０分静置した。３０分後、優しくタッピングしハイブリ液ターゲットＤＮＡに良く溶かした。そして、同じく遮光下で７０℃１５分、３７℃６０分静置し、ターゲットＤＮＡのディネーチャーとプレハイブリダイゼーションを行った。
【００８０】
【表１１】
【００８１】
ハイブリ液を（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイに添加し、３７℃４８時間ハイブリダイゼーションを行った。タカラバイオ社製のＴａｋａｒａ Ｓｌｉｄｅ Ｓｅａｌ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲを用いて液の封止を行った。
【００８２】
ハイブリダイゼーション終了後、４５℃に保温したバッファー１（２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）とバッファー２（２×ＳＳＣ）で各５分洗浄し、最後にバッファー３（０．１×ＳＳＣ）で軽くリンスし、スピンドライを行った。
【００８３】
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。測定結果を表１２に示す。表１２の通り、処理後の検体の方が癌/正常の比が大きくなっており、コピー数の差をコントラスト良く検出できている。これは、処理前の全ゲノムＤＮＡを検体とした時に比べて標的核酸のハイブリを阻害する非標的核酸が除去されたためと考えられる。
【００８４】
また、今回は標的核酸のみの検体にもＣｏｔ−１ ＤＮＡを混入させてハイブリを行ったが、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを入れなくても同様の結果が得られた。ハイブリ時間も８時間程度で安定したシグナルを得られた。
【００８５】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】非標的核酸捕捉用プローブを作製するための処理の流れを示すイメージ図である。
【図２】非標的核酸捕捉用プローブを作製するためのフローチャート図である。
【図３】非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う処理の流れを示すイメージ図である。
【図４】非標的核酸捕捉用プローブを用いて標的領域ＤＮＡの回収を行う処理のフローチャート図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲ結果（検量線）を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非標的核酸に相補的な非標的核酸捕捉用プローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む被検体核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、前記核酸集団から前記プローブ−非標的核酸複合体を分離除去することによって前記標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法であって、
前記非標的核酸に相補的なプローブを以下の工程により得る、核酸の選択的分離方法。
（１）標的核酸を捕捉するための標的核酸捕捉用プローブを用意する工程、
（２）前記被検体核酸集団そのもの、または該集団と同種の核酸集団を用意し、非標的核酸捕捉用プローブを作製するための核酸集団とする工程、
（３）前記標的核酸捕捉用プローブと前記非標的核酸捕捉用プローブを作成するための核酸集団中の標的核酸との複合体を形成させる工程、
（４）前記非標的核酸捕捉用プローブを作成するための核酸集団から前記プローブ−標的核酸複合体を分離除去し、除去されなかった核酸を非標的核酸捕捉用プローブとする工程。
【請求項２】
前記非標的核酸捕捉用プローブおよび前記標的核酸捕捉用プローブは固相担体上に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項３】
前記固相担体が磁性粒子であることを特徴とする請求項２に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項４】
前記核酸捕捉用プローブはカラムに充填されており、核酸集団をカラムに通すことによって前記核酸捕捉用プローブ−核酸複合体を形成させ、前記核酸集団からプローブ−核酸複合体を分離除去することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項５】
前記核酸集団が溶解している溶液中に前記核酸捕捉用プローブを添加して前記プローブ−核酸複合体を形成させ、前記核酸集団から前記プローブ−核酸複合体を分離除去する工程を行うことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項６】
前記核酸捕捉用プローブにはビオチンが修飾されており、ビオチン修飾プローブと核酸とで形成した核酸複合体は、アビジンが固定された固相担体と接触させることにより捕捉されることを特徴とする請求項５に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項７】
前記核酸捕捉用プローブには抗原が修飾されており、抗原修飾プローブと核酸とで形成した核酸複合体は、前記抗原を捕捉する抗体が固定された固相担体と接触させることにより捕捉されることを特徴とする請求項５に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項８】
前記核酸集団がヒトゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項１】
非標的核酸に相補的な非標的核酸捕捉用プローブに、非標的核酸と標的核酸とを含む被検体核酸集団を反応させてプローブ−非標的核酸複合体を形成させ、前記核酸集団から前記プローブ−非標的核酸複合体を分離除去することによって前記標的核酸を分離する核酸の選択的分離方法であって、
前記非標的核酸に相補的なプローブを以下の工程により得る、核酸の選択的分離方法。
（１）標的核酸を捕捉するための標的核酸捕捉用プローブを用意する工程、
（２）前記被検体核酸集団そのもの、または該集団と同種の核酸集団を用意し、非標的核酸捕捉用プローブを作製するための核酸集団とする工程、
（３）前記標的核酸捕捉用プローブと前記非標的核酸捕捉用プローブを作成するための核酸集団中の標的核酸との複合体を形成させる工程、
（４）前記非標的核酸捕捉用プローブを作成するための核酸集団から前記プローブ−標的核酸複合体を分離除去し、除去されなかった核酸を非標的核酸捕捉用プローブとする工程。
【請求項２】
前記非標的核酸捕捉用プローブおよび前記標的核酸捕捉用プローブは固相担体上に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項３】
前記固相担体が磁性粒子であることを特徴とする請求項２に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項４】
前記核酸捕捉用プローブはカラムに充填されており、核酸集団をカラムに通すことによって前記核酸捕捉用プローブ−核酸複合体を形成させ、前記核酸集団からプローブ−核酸複合体を分離除去することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項５】
前記核酸集団が溶解している溶液中に前記核酸捕捉用プローブを添加して前記プローブ−核酸複合体を形成させ、前記核酸集団から前記プローブ−核酸複合体を分離除去する工程を行うことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項６】
前記核酸捕捉用プローブにはビオチンが修飾されており、ビオチン修飾プローブと核酸とで形成した核酸複合体は、アビジンが固定された固相担体と接触させることにより捕捉されることを特徴とする請求項５に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項７】
前記核酸捕捉用プローブには抗原が修飾されており、抗原修飾プローブと核酸とで形成した核酸複合体は、前記抗原を捕捉する抗体が固定された固相担体と接触させることにより捕捉されることを特徴とする請求項５に記載の核酸の選択的分離方法。
【請求項８】
前記核酸集団がヒトゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の核酸の選択的分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２０７４１８（Ｐ２００９−２０７４１８Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６０５（Ｐ２００８−５３６０５）
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月４日（２００８．３．４）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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