核酸検出方法およびその利用
従来の方法より検出感度を高めるとともに、正確かつ迅速に標的核酸を検出することが可能な核酸検出方法および当該方法を用いる遺伝子検出キットを提供する。 細胞を含む試料を支持体に固定し、そのまま支持体上で核酸を増幅し、増幅された核酸を検出する。試料から核酸を抽出しないので核酸抽出過程の核酸のロスに伴う検出感度の低下を防止できる。また、増幅後の核酸を検出するので、試料に含まれる標的核酸が微量であっても検出可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法およびその利用に関するものであり、より具体的には、試料中の微量核酸を効率よく増幅し、正確かつ迅速に検出する方法、および当該方法を利用した遺伝子検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合、標的の核酸や遺伝子を増幅し、その増幅産物を検出する方法が用いられる。標的の核酸や遺伝子を特異的に増幅させる方法としては、ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１、２参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１、２参照）、ＩＣＡＮ法（例えば、特許文献１参照）、ＬＡＭＰ法（例えば、非特許文献３参照）、ＲＣＡ法（例えば、非特許文献４参照）、プライマーエクステンション法（例えば、非特許文献５参照）等が知られている。なかでもＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法が最もよく使われている。これらの方法は、目的とする核酸の塩基配列を含む短い核酸をプライマーとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによる鋳型特異的な核酸合成反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う方法である。
【０００３】
さらに、上記核酸増幅方法において、増幅反応中または増幅反応後に、増幅された核酸断片を適当な手段を用いて標識することにより、試料中にわずかしか存在しない核酸を検出することが可能となる。また、ランダムな塩基配列のプライマーを使用し非特異的に核酸を増幅および標識し、それを用いて核酸を検出するＤＮＡマイクロアレイ（マクロアレイ）法やディファレンシャルディスプレイ法等も知られている。近年、様々な疾病に関連する遺伝子を網羅的に検出するＤＮＡマイクロアレイは、非常に注目を集めている。
【０００４】
また、ある特定の核酸や遺伝子を調べたい場合、上記核酸増幅方法以外の方法として、組織や細胞中の標的となる核酸を、それと相補的な塩基配列を含む標識した核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションさせるＩＳＨ法（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）やＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）がある（例えば、非特許文献１参照）。ＩＳＨ法は組織内の特定の遺伝子の発現の有無や量の比較に広く用いられている。ＦＩＳＨ法は染色体上の特定の遺伝子領域の判別に広く用いられている。
【０００５】
また、ＰＣＲ法で標的核酸を増幅し、ＩＳＨ法によりプローブを用いてハイブリダイゼーションさせ、最終的に顕微鏡で検出するｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法（例えば、非特許文献２参照）も存在するが、反応に最適な条件を出すのが困難であるため再現性に乏しく、一般化していない。
【０００６】
本出願人は、ＩＳＨ法に基づいて末梢血における白血球中の細菌検出キット「ハイブリゼップ（登録商標）」を体外診断用医薬品（承認番号：ＡＭＺ００６２００００）として販売している。「ハイブリゼップ（登録商標）」を用いた場合、従来用いられている血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出することが可能となり、少なくとも３日以上を要した検査時間を１日以内で行うことが可能となったことから、感染症分野において脚光を浴びている（例えば、非特許文献６参照）。なお、本出願人は、食細胞に貪食された外来微生物をＩＳＨ法に基づいて検出および同定のための方法（特許文献２参照）およびその改良方法（特許文献３参照）を提案しており、「ハイブリゼップ（登録商標）」はこれらの発明に基づいて開発された商品である。
【０００７】
【特許文献１】特許第３４３３９２９号公報（登録日：平成１５年５月３０日、発行日：平成１５年８月４日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ８９／１０４１１（国際公開日：１９８９年１１月２日、対応公告公報：特公平０７−４０号）
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／０９９１３３（国際公開日：２００２年１２月１２日）
【非特許文献１】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）
【非特許文献２】監修：真木寿治、「ＰＣＲ Ｔｉｐｓ〜使いこなすためのコツとヒント〜」秀潤社（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２：ｅ６３（２０００）
【非特許文献４】Ｌｉｚａｒｄｉ ＰＭ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｊｕｌ；１９（３）：２２５−３２．（１９９８）
【非特許文献５】Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ：著、堀越正美：訳「遺伝子発現と転写因子」メディカル・サイエンス・インターナショナル（１９９６）
【非特許文献６】松久明生、荒木宏昌、「Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法による敗血症診断の臨床的有用性」、ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、北隆館、１９９９年、１４巻、１号、ｐ．９７−１０１
ここで、ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合に用いる、上記ＰＣＲ法等の核酸増幅方法や、ＩＳＨ法等のハイブリダイゼーションを用いる方法では、標的とする核酸や遺伝子が試料中に微量しか存在しない場合に、十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できない場合があるという課題を有している。
【０００８】
まず、ＰＣＲ法等の核酸増幅方法を用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要がある。この核酸を抽出する過程で、核酸のロスが生じることを回避することは困難である。例えば、試料中に増幅するための鋳型として必要な量の標的核酸が含まれていたとしても、核酸抽出過程のロスにより鋳型として必要な量が回収できなかった場合には、増幅効率が低下するため標的核酸を十分増幅できず、試料中の標的核酸を検出できない場合が生じ得る。このような場合は、偽陰性となり、正確な結果が得られない。また、同一の試料を用いた場合でも、核酸抽出過程のロスの程度により異なった結果が得られる可能性があり、再現性が乏しくなる。すなわち、核酸の抽出を必要とする核酸増幅方法においては、試料中に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合に、核酸抽出過程の核酸のロスにより、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題がある。
【０００９】
また、増幅反応を阻害する物質（例えば、ヘパリン、界面活性剤、タンパク質変性剤、有機溶媒等）が試料溶液中に含まれている場合があり、上記と同様に、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題もある。
【００１０】
次に、ＩＳＨ法等のハイブリダイゼーションを用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要がないため核酸のロスは生じないが、試料に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合には、標的核酸とハイブリッドを形成しているプローブ核酸を検出するのが困難であるという問題がある。
【００１１】
また、本出願人が開発した「ハイブリゼップ（登録商標）」は、ＩＳＨ法に基づいて末梢血における白血球中の細菌を高感度かつ迅速に検出することを可能としたが、克服すべき課題として以下の２点を挙げることができる。
１）菌のシグナルの有無は顕微鏡による肉眼的観察に委ねられているため、ある程度の熟練を要すること。
２）白血球に貪食された細菌のみが検出標的であるため、白血球数の減少した患者の臨床検体については、検出率が低下すること。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても、正確かつ迅速に標的核酸を検出することが可能な核酸検出方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、試料を支持体に固定し、試料から核酸を抽出せずにそのまま支持体上で核酸を増幅することにより、試料中の核酸のロスに伴う検出感度の低下を招くことなく、簡便かつ迅速に試料中の標的核酸の検出が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００１４】
（１）細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【００１５】
（２）上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、（１）に記載の核酸検出方法。
【００１６】
（３）上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか１の方法、あるいは２以上の方法を組み合わせて用いることを特徴とする（２）に記載の核酸検出方法。
【００１７】
（４）上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００１８】
（５）上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００１９】
（６）上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする（５）に記載の核酸検出方法。
【００２０】
（７）上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする（６）に記載の核酸検出方法。
【００２１】
（８）上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする（５）に記載の核酸検出方法。
【００２２】
（９）上記試料は生体由来試料であることを特徴とする（１）ないし（８）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００２３】
（１０）上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする（９）に記載の核酸検出方法。
【００２４】
（１１）（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【００２５】
（１２）（１０）に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【００２６】
（１３）上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００２７】
（１４）上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である（１３）に記載の遺伝子検出キット。
【００２８】
（１５）上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である（１３）に記載の遺伝子検出キット。
【００２９】
（１６）上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００３０】
（１７）上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００３１】
（１８）少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、標識デオキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする（１１）ないし（１７）のいずれか１項に記載の遺伝子検出キット。
【００３２】
上記の構成によれば、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、高感度、高精度で再現性よく標的確酸を検出することが可能となる。また、簡便かつ迅速に実施でき、結果の判定に熟練を要しない。
【００３３】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る核酸検出方法の一例を示した図である。
【図２】試料に貪食サンプルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【図３】試料に敗血症患者の臨床検体を用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【図４】試料に敗血症血液モデルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球におけるＩＬ６の発現増加を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３６】
１．本発明に係る核酸検出方法
本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴としており、さらに、核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程が含まれていてもよい。図１に、本発明に係る核酸検出方法の１つの実施形態を示した。図１に示した実施形態では、生体由来試料を支持体に固定（試料固定化工程）し、疾病関連遺伝子由来のプライマーを含むＰＣＲミクスチャーを加えてＰＣＲを行う（核酸増幅工程）。この核酸増幅工程において核酸増幅と同時に、または核酸増幅後に増幅された核酸を標識する（詳細は後述する。）。そして最後に、電気泳動（アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等）、定量ＰＣＲ、ドットハイブリダイゼーション（マクロアレイ、マイクロアレイ等）等の核酸検出手段を用いて、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する（判定工程）。なお、本発明に係る核酸検出方法は、図１に示した実施形態に限定されるものではない。以下に本核酸検出方法について、その特徴を詳細に説明する。
【００３７】
（１）試料固定化工程
試料固定化工程は、試料を支持体に固定化する工程である。試料を支持体に固定化することにより、核酸増幅や標識の際に一般的に行なわれる核酸精製工程を省くことができる。また、試料溶液に核酸の増幅反応を阻害する物質（例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、陽イオン、高蛋白溶液、高塩濃度溶液、界面活性剤含有溶液、タンパク変性溶液（尿素、グアニジン塩酸等）、有機溶媒等）が含まれている場合に、これらの増幅阻害物質は通常細胞内に滞留することがないため、試料を支持体に固定化することにより容易に除去することができる。さらに、試料を支持体に固定化することにより、核酸を安定に保存することも可能となる。
【００３８】
〔試料〕
本発明に係る核酸検出方法（以下、適宜「本検出方法」と略記する。）に用いる試料は、細胞を含む試料であればよい。本検出方法により検出する標的核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）のいずれでもよい。細胞にはこれらの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）が含まれているため、その中の標的核酸を本検出方法で検出することが可能となる。細胞の種類は限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等のあらゆる細胞を対象とすることができる。また、試料の細胞以外の部分は、後述する核酸露出工程において化学処理、酵素処理、加熱処理等により消化可能であって、含まれる細胞の核酸が露出できるものであればよい。本検出方法に用いる試料としては、細胞を含む生体由来試料が好適であるが、これに限定されるものではなく、生体に由来しない試料にも本検出方法を適用することは可能である。
【００３９】
生体に由来しない試料としては、例えば、細胞を含む食品材料、土、水、繊維、埃等を挙げることができる。生体由来試料としては、動物および植物の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液を挙げることができる。さらにヒトの場合は透析排液も試料とすることが可能である。
【００４０】
また、本検出方法の標的とする核酸は試料に含まれる細胞固有の核酸に限定されず、細胞に感染したウイルスの核酸や、細胞が貪食した微生物等の核酸にも適用することが可能である。したがって、感染症患者の貪食細胞（白血球等）を含む生体由来試料は、本検出方法の試料として好適である。
【００４１】
〔支持体〕
支持体は、その表面に試料を固定化するとともに、当該支持体上で試料中の標的核酸を増幅するために用いるものである。したがって、このような目的を達成できる支持体であれば、材質、形状等は特に限定されるものではない。材質としては、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等）、多糖類（セルロース、アガロース等）、濾紙等を挙げることができる。また、形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができ、本検出方法を実施する条件に合わせて適宜好ましい形状のものを選択すればよい。
【００４２】
一つの支持体に対して１試料を固定化し、試料数に応じた数の支持体を用いてもよいが、作業を効率的に行うためには一つの支持体に複数の試料を固定化できることが好ましい。また、本検出方法では、試料固定化工程→核酸増幅工程、または試料固定化工程→核酸露出工程→核酸増幅工程を同一支持体上で一連の操作として行うため、一つの支持体に複数の試料を固定化した場合に、隣接する試料が混じり合わないようにする必要がある。したがって、本検出方法に用いる支持体としては一つの支持体上に複数の分離した区画を有するものが好ましい。さらに、本検出方法の核酸増幅工程において、ＰＣＲ法を用いて核酸を増幅する場合には、耐熱性素材であることが好ましい。さらに、市販されているＰＣＲ用遺伝子増幅機器（サーマルサイクラー）に適合する形状であることが特に好ましい。
【００４３】
〔固定〕
本発明に係る核酸検出方法において、固定とは、試料を何らかの方法により支持体に固着、保持させることを意味する。本検出方法に用いる固定方法は特に限定されるものではなく、従来公知の固定方法を適宜選択して用いればよい。公知の固定方法としては、共有結合やイオン結合などで不溶性の担体に結合させる担体結合法、架橋試薬により共有結合で結び付け不溶化する架橋法、高分子ゲルや半透膜などで包み込む包括法、脱水によりタンパクを急速に変性させ担体に固着させる方法等を挙げることができる。より具体的には、カルノア固定、アルコール固定、火焔固定、グルタルアルデヒド固定、乾燥固定、アセトン固定、メタノール固定、ホルマリン固定等を挙げることができる。
【００４４】
また、支持体の表面に試料を接着させることも固定に含まれる。したがって、支持担体の表面に接着性を高める物質、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、ポリ−Ｌ−リジン、ゼラチン等をコートしておくことも可能である。このような処理を施した支持体を用いれば、試料の種類によっては十分に支持体に固着、保持させることができる。また、支持体に接着固定した上に、上記例示した固定方法を併用することも可能である。
【００４５】
（２）核酸露出工程
核酸増幅工程において試料中に含まれる核酸を増幅するためには、プライマーや核酸合成酵素が標的核酸に到達できることが必須である。試料によっては標的核酸が試料表面に露出している場合もあり、このような試料については試料固定化工程から直接核酸増幅工程に進むことができる。したがって、本核酸露出工程は、本検出方法の必須の工程ではない。しかしながら、標的核酸が試料表面に露出していない場合には、核酸露出工程を設けて標的核酸を露出させることが必要となる。
【００４６】
核酸露出工程に用いる方法としては、界面活性剤処理法（ＳＤＳ、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ、ＴＷＥＥＮ−２０、ＢＲＩＪ、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ等）、プロテアーゼ等の酵素処理、加熱処理法等を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではなく、用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な方法を選択すればよい。例えば、細菌感染に起因する敗血症で、白血球に貪食された細菌の遺伝子を検出する場合、細菌の細胞壁を消化させる酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼ等を使用することにより細菌、真菌等の微生物の遺伝子を露出させることができる。
【００４７】
（３）核酸増幅工程
核酸増幅工程は、試料が固定化された支持体上で標的核酸を増幅する工程である。ここで、本発明に係る核酸検出方法は、試料中の核酸を抽出、精製することなく、試料が固定化された支持体上で標的核酸の増幅を行うことに最大の特徴がある。これにより、標的核酸が試料中に微量しか存在しない場合においても、抽出および精製過程のロスが生じないため、検出感度の低下を招くことなく微量の標的核酸を検出することが可能となる。また、作業の簡便化を図ることができ、作業時間を短縮することが可能となる。
【００４８】
核酸増幅とは、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーまたはランダムな配列のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼとを用いて、試料中の核酸を増幅させることを意味する。増幅方法としては、従来公知の増幅方法を好適に用いることができる。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製（レプリケーション）等を挙げることができる。
【００４９】
上記例示した増幅方法の中でもＰＣＲ法は、本検出方法に用いる増幅方法として好適である。以下に、本検出方法の核酸増幅工程にＰＣＲ法を用いた場合について説明する。
【００５０】
ＰＣＲ法とは、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡ合成酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、以下適宜「Ｔａｑポリメラーゼ」と表記する。）によるＤＮＡ合成反応の試験管内における繰り返しで、その特定ＤＮＡ領域を増幅する方法であり、遺伝子工学分野において一般的に用いられている周知技術である。ＰＣＲ法にはＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等も含まれる。
【００５１】
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法とは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域からの最初の増幅産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー位置より両側とも内側にプライマーを設定して行う方法である。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを用いることにより、１回目のＰＣＲで標的核酸が検出可能な量まで十分増幅しない場合でも、２回目のＰＣＲにより検出可能な量に増幅させることが可能となる。また、１回目のＰＣＲで非特異的な増幅産物が生じた場合、これらの非特異的増幅産物は２回目のＰＣＲにおけるプライマーに類似した配列を持つ確率が極めて低くなる。したがって、２回目のＰＣＲでは標的の配列を有する断片のみを増幅する確率が高くなるため、非特異的増幅産物の発生による弊害を解消し、より正確に標的核酸を検出することが可能となる。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、ｍＲＮＡに対してＰＣＲを適用するための変法であり、ＰＣＲの前段階として、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行う工程を含むＰＣＲ法である。本検出方法にＲＴ−ＰＣＲ法を用いれば、標的核酸をｍＲＮＡとすることが可能となる。すなわち、本検出方法を遺伝子発現の検出に応用することが可能となる。
【００５３】
上記〔支持体〕の項で述べたように、本検出方法では試料を固定化した支持体上でＰＣＲを行うため、支持体は複数の分離した区画を有するものが好ましい。複数の分離した区画を有する支持体を用いた場合の具体的なＰＣＲの手順としては、ＰＣＲミクスチャー（緩衝液、ｄＮＴＰｍｉｘ、Ｔａｑポリメラーゼ等を混合したもの）を支持担体上の各区画の試料に添加し、さらにプライマーを加えてＰＣＲ用遺伝子増幅機器（サーマルサイクラー）等を用いてＰＣＲを行えばよい。プライマーについては、１つのＰＣＲについて様々な標的核酸を特異的に増幅するプライマーセットを用いる。ＰＣＲの条件（反応液の量、酵素や基質の濃度、反応温度等）は特に限定されるものではなく、用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な条件を選択すればよい。
【００５４】
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う場合には、１回目のＰＣＲを支持体上で行い、２回目のＰＣＲはＰＣＲチューブ等を用いて行えばよい。なお、２回目のＰＣＲに用いるプライマーは、両側とも最初に使用したプライマー位置と同じ、または内側に設計しなければならない。
【００５５】
ＰＣＲにより増幅される断片は、標的核酸が特異的に有する配列部分であることが好ましい。試料に含まれる核酸は標的部分以外の部分が大多数であるため、標的微生物に特異的な配列部分にプライマーを設計しなければ、非特異的な増幅産物が生じる可能性が高くなる。したがって、標的核酸の特異的配列をあらかじめ調べておき、その配列部分を増幅するようにプライマーを設計することが重要である。
【００５６】
増幅される断片の長さは５０ｂｐ〜５，０００ｂｐの範囲内であることが好ましく、１００ｂｐｐ〜２，０００ｂｐの範囲内であることがより好ましい。この範囲を外れると、特異的な増幅産物を有効に得ることができなくなるおそれがある。
【００５７】
核酸増幅工程においては、増幅された核酸を標識することが好ましい。これにより、後段の判定工程を効率的に実施することができる。核酸の標識は増幅と同時または増幅後に行うことができる。標識手段としては、放射性標識、ハプテン（ビオチン、ジゴキシゲニン等）標識、蛍光標識等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
核酸増幅方法として、核酸の増幅と同時に行う場合は、前述のＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製（レプリケーション）等の増幅反応を行う際に、例えばジゴキシゲニンやビオチン等のハプテン、ＦＩＴＣ、放射性同位体で標識されたヌクレオチドアナログを基質とすれば、増幅反応中に標的核酸を標識することができる。また、増幅反応の際、末端を標識したプライマーを使用することによっても、標的核酸を標識することができる。増幅反応後に標識する場合は、ニックトランスレーション法やランダムプライム法、プライマーエクステンション法、ＴｄＴ法、５’カイネーション法等を用いることができる。この場合も標識されたヌクレオチドアナログを基質としたり、末端を標識したプライマーを使用することによって標識することができる。
【００５９】
核酸増幅工程において、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーを用いた場合には、既知の塩基配列を有する核酸断片を増幅することができる。一方、ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、非特異的に核酸が増幅されるため、どのような塩基配列を有する核酸断片が生じるかは予想できない。核酸増幅工程において既知の塩基配列を有する核酸断片を増幅するように設計されたプライマーを用いた場合には、後述する判定工程において、塩基配列の確認や既知の塩基配列を有する核酸断片とのハイブリダイゼーションにより、標的の核酸であるか否かを判定することができる。ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、後述する判定工程において、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いることにより、試料中に標的の核酸が含まれているか否かを判定することができる。
【００６０】
（４）判定工程
判定工程は、核酸増幅工程で増幅された核酸が標的の核酸断片であるか否かを判定する工程である。本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、標的核酸が微量であるため検出が困難となる問題は生じない。また、公知の方法を適宜選択して用いることができるので、判定に熟練を要することもない。
【００６１】
判定には増幅された核酸断片の長さや塩基配列を確認することが含まれることはいうまでもないが、増幅されたＤＮＡ断片の転写産物であるＲＮＡを確認することや、増幅された核酸断片に基づいて発現させたタンパク質を確認することも含まれる。判定工程で用いる方法の具体例としては、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を確認する方法として、アガロースゲル電気泳動、定量ＰＣＲ、シークエンス、ドットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、サザン・ハイブリダイゼーション、ノーザン・ハイブリダイゼーション等を挙げることができ、タンパク質を確認する方法として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン・ブロッティング、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等）等を挙げることができる。ただし、これらの方法に限定されるものではなく、適宜適当な方法を選択して使用すればよい。
【００６２】
もっとも簡便な判定方法としては、アガロースゲル電気泳動を挙げることができる。しかしながら、この方法は、試料から増幅された核酸断片の長さと、標的核酸のみを鋳型として増幅した場合の核酸断片の長さとを比較して、一致するか否かを確認するものであるため、非特異的な増幅産物が偶然類似する長さである場合に誤った結果（擬陽性）を導くことがあり得る。増幅された核酸が標的核酸と一致するか否かを正確に判定するために最も信頼性が高い方法は、増幅核酸の塩基配列を確認する方法（シークエンス）である。この方法を用いれば、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出することも可能となる。
【００６３】
標的核酸が増幅されているか否かを簡便かつ正確に判定する方法として、標識された増幅核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的核酸であるか否かを判定する方法を用いることが好ましい。また、この方法を用いる場合、プローブとする核酸は、ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片の塩基配列を有するように設定されたプライマーを用いて増幅されることが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片はあらかじめ支持体に固定されていることが好ましい。あらかじめ既知の遺伝子断片を支持体に固定することにより、プローブとのハイブリダイゼーションを正確に捕捉できる。また、既知の遺伝子断片に位置情報を持たせることが可能となり、様々な既知の遺伝子断片を整列させることにより、一度に多数の遺伝子を検出し得る。
【００６４】
具体的には、例えば標的核酸をあらかじめナイロンメンブレン等にスポット（固定）しておき、増幅された核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションさせる。スポットされた核酸と増幅された核酸との間にハイブリダイゼーションが成立すれば、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。一方、核酸増幅工程において核酸が増幅されていない場合や、標的の核酸でない核酸が非特異的に増幅されていた場合はハイブリダイゼーションが成立せず、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。
【００６５】
ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片は、核酸増幅工程により増幅される予定の塩基配列部分を含んでいれば特に限定されるものではないが、増幅される予定の塩基配列部分のみ、または増幅される予定の塩基配列部分の一部であることが好ましい。増幅される予定の塩基配列部分以外の塩基配列配列を含んでいる場合には、増幅された核酸が目的の配列を有しない非特異的増幅産物であった場合に、ハイブリダイズする可能性があるからである。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、既知の遺伝子断片に対して標識された増幅核酸をプローブとして、公知の方法により行えばよい。公知の方法としては、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載されている方法等を挙げることができるが、これ限定されるものではない。
【００６７】
また、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的核酸の存在の有無を判定する方法を用いることもできる。ここで、ＤＮＡマイクロアレイには、いわゆるオリゴＤＮＡタイプのものとｃＤＮＡタイプのものとのいずれをも含むものとする。また、ＤＮＡマイクロアレイは市販のものを用いてもよく、自製のものを用いてもよい。判定工程においてＤＮＡマイクロアレイを用いる場合には、上述したように、核酸増幅工程においてランダムな配列のプライマーを用いて非特異的に増幅された核酸中に標的核酸が存在するか否かを判定することができる。
【００６８】
（５）本発明に係る核酸検出方法の適用範囲
本検出方法の適用範囲としては、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。例示すれば以下のとおりであるが、これらに限定されるものではない。
ａ）病原微生物（細菌、真菌、ウイルス、寄生虫等）の検出、すなわち感染症の分子診断
ｂ）がんの分子診断
ｃ）出生前の遺伝性疾患等の分子診断
ｄ）薬物代謝に関与する遺伝子の分子診断
ｅ）法医学サンプルからの分子診断
ｆ）疾病マーカー遺伝子の分子診断
ｇ）移植時の組織タイピング
ｈ）適合性テスト
ｉ）ＳＮＰｓ検出
本発明に係る核酸検出方法は、上記ａ）に示した感染症の分子診断に用いることが最適であると考えられる。その理由を以下に説明する。
【００６９】
病原微生物は血液中または体液中に浮遊して存在している可能性は低く、宿主細胞に侵入してはじめて感染症を発症させる。したがって、感染症の病原微生物を検出するための試料としては白血球等の免疫系細胞が好適であるといえる。そして、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウイルス等を検出する手段としては、試料から核酸を抽出した後に増幅する従来のＰＣＲ法や、核酸を増幅することなく標的核酸の検出を行うＩＳＨ法では十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できない場合がある。一方、本発明に係る核酸検出方法では、細菌を貪食した細胞やウイルス等が侵入した細胞を直接支持体に固定化し、そのままの状態で細胞中の細菌やウイルス等の核酸を増幅して検出するものであるため、上記従来の方法と比較して顕著に検出感度および精度が向上することは明らかである。
【００７０】
また、従来細胞内の病原微生物等を検出する方法としてｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法がある。この方法は、細胞をスライドグラスに固定化し、細胞内でＰＣＲを行い、細胞内で増幅した産物をＩＳＨ法によりプローブをハイブリダイゼーションさせて視覚化し、顕微鏡で検出するものである。したがって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法は本発明に係る核酸検出方法と同等の検出感度が期待できるが、条件設定が難しく、再現性に乏しいという問題点がある。さらに、非特異的反応が多く、非特異的増幅産物を標的の特異的増幅産物と細胞内で区別することは困難であるという問題点がある。
【００７１】
以上より、本発明に係る核酸検出方法は、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウイルス等を検出する手段として非常に優れた方法であるといえる。
【００７２】
２．本発明に係る遺伝子検出キット
本発明に係る遺伝子検出キット（以下、適宜「本キット」と略記する。）は、本発明に係る核酸検出方法を用いて試料中の標的遺伝子を検出するために用いるキットである。本検出方法に用いる試薬、器具類をキット化することにより、本検出方法を簡便に実施することが可能となり、一層短時間で正確な検出結果を得ることが可能となる。なお、遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。
【００７３】
（１）本キットの構成
本キットには、少なくとも試料固定化工程で使用する試料固定化用支持体、核酸増幅工程で使用するプライマー、核酸合成酵素、基質（ヌクレオシド三リン酸）、緩衝液等の試薬、判定工程で使用する増幅核酸検出用指示薬等の試薬および器具等が含まれていることが好ましい。また、用いる試料を特定したキットとすることにより核酸露出工程が必要である場合には、核酸露出用の試薬（界面活性剤やタンパク質分解酵素等）を含ませることができる。また、用いる試料に適した固定用試薬を含ませることができる。例えば、白血球を含む生体由来試料に特定し、白血球に貪食された細菌等の微生物のゲノムを標的核酸とするキットの場合には、固定用試薬（例えば、カルノア固定液等）および核酸露出用試薬（微生物の細胞壁分解酵素等）を含ませることが好ましい。
【００７４】
さらに、核酸増幅方法および判定方法を特定することにより、キットに含まれる試薬の構成を具体化することが可能となる。例えば、核酸増幅方法をＰＣＲ法とする場合は、核酸増幅工程で用いる試薬はＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）となる。また、ＰＣＲにより核酸を標識することが必要であれば、さらに標識デオキシヌクレオシド三リン酸を含ませればよい。
【００７５】
判定方法をアガロースゲル電気泳動法とする場合は、アガロースゲル、電気泳動用緩衝液、分子量マーカー、核酸染色用試薬等をキットに含ませればよい。判定方法をドットハイブリダイゼーションとする場合は、標的核酸をスポット（固定）したメンブレン、ハイブリダイゼーション用緩衝液、核酸の標識に応じた検出用指示薬（例えば、ジゴキシゲニン標識を用いた場合には酵素標識した抗ジゴキシゲニン抗体、標識した酵素を発色させるための基質等）、ハイブリバッグ、その他必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい。核酸検出方法をＤＮＡマイクロアレイとする場合は、標的核酸に応じたＤＮＡマイクロアレイおよび必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい。
【００７６】
すなわち、本発明に係る核酸検出方法に用いる試料、標的遺伝子、核酸増幅方法、核酸検出方法を具体的に特定することにより、用いる試薬、器具等を様々に組み合わせてキットを構成することが可能となる。なお、本キットの構成は上記例示した試薬、器具等に限定されるものではなく、目的に応じて適当な公知の試薬、器具等を適宜選択して用いればよい。
【００７７】
（２）標的遺伝子
一つのキットに含まれる標的遺伝子は１遺伝子に限定する必要はなく、複数のプライマーセットをキットに含ませることにより、複数の標的遺伝子を検出可能なキットとすることができる。例えば、疾病関連遺伝子を標的とするキットには、同一の試料から検出することが可能な複数の疾病関連遺伝子を標的とできる。より具体的には、感染症の原因微生物の遺伝子を標的とする場合には、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。このような感染症の原因微生物の標的遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子や感受性遺伝子であることが好ましい。
【００７８】
また、癌マーカー遺伝子を標的とする場合には、ｐ５３、ＭＤＭ２、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＡＰＣ、Ｍｙｃ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｅｒｂＢ、ｓｒｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｒａｆ、ｆｅｓ、ｅｒｂ−Ａ、ｆｍｓ、ｓｉｓ、Ｒｂ、ＷＴ１等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。また、遺伝性疾患関連遺伝子を標的とする場合には、例えば、色素性乾皮症関連遺伝子（ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＥ、ＸＰＦ／ＥＲＣＣ１、ＸＰＶ）、家族性大腸癌関連遺伝子（ＡＰＣ）、アルツハイマー病関連遺伝子（ａｐｏＥ４）、冠状動脈性疾患関連遺伝子（ａｐｏＥ２）、Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病関連遺伝子（ＶＨＬ）、筋ジストロフィー関連遺伝子（ジストロフィン）等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。
【００７９】
なお、本キットの適用範囲は上記「１．（５）本発明に係る核酸検出方法の適用範囲」と同一であり、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがって、本キットの標的遺伝子はあらゆる遺伝子診断の分野から選択することが可能であり、上記例示したものに限定されるものではない。
【００８０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８１】
＜実施例１．貪食サンプルを用いた核酸の検出＞
〔試料調製〕
予め外来微生物（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、以下ＳＡ）ＡＴＣＣ １２６０００、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、以下ＳＥ）ＡＴＣＣ １４９９０、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、以下ＰＡ）ＡＴＣＣ １０１４５、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、以下ＥＦ）ＡＴＣＣ １９４３３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下ＥＣ）ＡＴＣＣ １１７７５）をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。
【００８２】
培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットをＰＢＳ５ｍＬを用いて懸濁し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集菌した菌をＰＢＳ５ｍＬで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を、０．０１〜０．０３に調整したものを１５ｍＬ作製した。作製した菌液を別々の１７５ｃｍ２の培養用フラスコに移し、約３０分間室温にて静置した。
【００８３】
ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍＬを採取し、血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇおよびデキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。分取した白血球画分をＰＢＳにて５０ｍＬにした。
【００８４】
上記菌液を入れて静置した培養用フラスコの上清を静かに捨て、上記ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍＬずつフラスコに加え、室温で約１０分間静置した。フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ１０ｍＬで１５ｍＬの遠沈管に回収し、４℃にて、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集した。
【００８５】
収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μＬ〜５×１０４個／μＬに調整した。このサンプルを貪食サンプルと称し、本実施例の試料とした。
【００８６】
〔試料固定化工程〕
上記各貪食サンプルを支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて風乾した。
【００８７】
〔核酸増幅工程〕
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、各貪食サンプルが固定化されたウェルにＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）：０．５μＬ（ｆｉｎａｌ ２．５Ｕ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：４μＬ、各細菌識別プライマー２種：０．４μＭ、滅菌精製水：ｕｐ ｔｏ ５０μＬ）を加えた。１回目のＰＣＲ用プライマーには、ＳＡ識別プライマーとして以下に示すＳＡ１Ｔ（配列番号１）およびＳＡ１Ｂ（配列番号２）を使用した。
ＳＡ１Ｔ：５’−ＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣ−３’
ＳＡ１Ｂ：５’−ＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣ−３’
ＳＥ識別プライマーとして以下に示すＳＥ１Ｔ（配列番号５）およびＳＥ１Ｂ（配列番号６）を使用した。
ＳＥ１Ｔ：５’−ＡＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡ−３’
ＳＥ１Ｂ：５’−ＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴ−３’
ＰＡ識別プライマーとして以下に示すＰＡ１Ｔ（配列番号９）およびＰＡ１Ｂ（配列番号１０）を使用した。
ＰＡ１Ｔ：５’−ＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧ−３’
ＰＡ１Ｂ：５’−ＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣ−３’
ＥＦ識別プライマーとして以下に示すＥＦ１Ｔ（配列番号１３）およびＥＦ１Ｂ（配列番号１４）を使用した。
ＥＦ１Ｔ：５’−ＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴ−３’
ＥＦ１Ｂ：５’−ＴＡＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣ−３’
ＥＣ識別プライマーとして以下に示すＥＣ１Ｔ（配列番号１７）およびＥＣ１Ｂ（配列番号１８）を使用した。
ＥＣ１Ｔ：５’−ＣＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣ−３’
ＥＣ１Ｂ：５’−ＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧ−３’
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で１分間、６８℃で３分間の反応を５０サイクル繰り返し、７２℃で１分保持して１回目のＰＣＲを終了した。
【００８８】
２回目のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）は、上記組成のＰＣＲ関連試薬の入ったＰＣＲチューブに、１回目のＰＣＲ反応液５μＬを加えて行った。２回目のＰＣＲ用プライマーには、ＳＡ識別プライマーとして以下に示すＳＡ２Ｔ（配列番号３）およびＳＡ２Ｂ（配列番号４）を使用した。
ＳＡ２Ｔ：５’−ＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴ−３’
ＳＡ２Ｂ：５’−ＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＡＣＧＧＣＴＡＴ−３’
ＳＥ識別プライマーとして以下に示すＳＥ２Ｔ（配列番号７）およびＳＥ２Ｂ（配列番号８）を使用した。
ＳＥ２Ｔ：５’−ＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’
ＳＥ２Ｂ：５’−ＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＡＴＧＴＧＧＴＧ−３’
ＰＡ識別プライマーとして以下に示すＰＡ２Ｔ（配列番号１１）およびＰＡ２Ｂ（配列番号１２）を使用した。
ＰＡ２Ｔ：５’−ＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＣＧ−３’
ＰＡ２Ｂ：５’−ＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＣＣＧＣＧＣＡＡＴ−３’
ＥＦ識別プライマーとして以下に示すＥＦ２Ｔ（配列番号１５）およびＥＦ２Ｂ（配列番号１６）を使用した。
ＥＦ２Ｔ：５’−ＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＴ−３’
ＥＦ２Ｂ：５’−ＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡ−３’
ＥＣ識別プライマーとして以下に示すＥＣ２Ｔ（配列番号１９）およびＥＣ２Ｂ（配列番号２０）を使用した。
ＥＣ２Ｔ：５’−ＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣ−３’
ＥＣ２Ｂ：５’−ＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＣＣＣ−３’
サーマルサイクラーは１回目と同様にＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返し、７２℃で１分保持して２回目のＰＣＲを終了した。
【００８９】
〔判定工程〕
１％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。使用した各細菌を鋳型として同一のプライマーを用いて行ったＰＣＲの結果と比較することにより、標的核酸が増幅されているか否かを確認した。
【００９０】
〔結果〕
結果を図２に示した。左側が各細菌を鋳型としてＰＣＲを行った結果を示したものであり、右側が各貪食サンプルを試料として本発明にかかる核酸検出方法を用いて各細菌の標的核酸を増幅した結果を示したものである。図中のＭは分子量マーカーを表し、左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図１から明らかなように、貪食サンプルの２回目のＰＣＲ（２ ＮＤ−ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ））のバンドの位置は、各細菌を鋳型としてＰＣＲを行った場合の２回目のＰＣＲ（２ ＮＤ−ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ））のバンドの位置と同一であり、標的の核酸が検出されたことを示している。
【００９１】
＜実施例２．敗血症患者からの起因菌の判定＞
〔試料調製〕
敗血症が疑われる患者より、血液５ｍＬを採取し、ヘパリンを加えた（ヘパリン加血液）。ヘパリン加血液に血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球をＰＢＳ１５０μＬで懸濁した。これを臨床検体と称し、試料とした。
【００９２】
〔試料の固定化〕
上記試料を支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて４２℃で風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて４２℃で風乾した。
【００９３】
〔試料の前処理（核酸露出工程）〕
各ウェルに酵素試薬（サポニン１２５μｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃），ｐＨ（５ｗ／ｖ％）５．５〜７．５）１２５ｎＬ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生化学工業社製）５０単位、リゾチーム（生化学工業社製）５０００単位、リゾスタフィン（ＳＩＧＭＡ社製）５単位を滅菌精製水１ｍＬに溶かして調製したもの）１０μＬを入れ、サーマルサイクラーを用いて、３７℃にて１０分処理後、９５℃にて１０分間処理し酵素の失活およびウェルを風乾させた。
【００９４】
ただし、Ｎ−アセチルムラミダーゼは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＩＦ０３３５０の熱処理細胞を３７℃、ｐＨ７．０で１分間に１μｇ溶菌する酵素活性を１単位とした。リゾチームは、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓを３５℃、ｐＨ６．２で１分間に５４０ｎｍの吸収を０．００１下げるときの酵素活性を１単位とした。リゾスタフィンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを３７℃、ｐＨ７．５で１０分間に６２０ｎｍの吸収を０．２４０から０．１２５に下げるときの酵素活性を１単位とした。
【００９５】
〔核酸増幅工程〕
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、試料が固定化されたウェルにＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ：０．２μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：３．２μＬ、各細菌識別プライマー２種：各０．１６μＭ、滅菌精製水で２０μＬに調整した）を加えた。
【００９６】
１回目のＰＣＲ用プライマーには、上記実施例１で使用したプライマーと同一のプライマーを使用した。すなわち、ＳＡ識別プライマーとしてＳＡ１Ｔ（配列番号１）およびＳＡ１Ｂ（配列番号２）を使用した。ＳＥ識別プライマーとしてＳＥ１Ｔ（配列番号５）およびＳＥ１Ｂ（配列番号６）を使用した。ＰＡ識別プライマーとしてＰＡ１Ｔ（配列番号９）およびＰＡ１Ｂ（配列番号１０）を使用した。ＥＦ識別プライマーとしてＥＦ１Ｔ（配列番号１３）およびＥＦ１Ｂ（配列番号１４）を使用した。ＥＣ識別プライマーとしてＥＣ１Ｔ（配列番号１７）およびＥＣ１Ｂ（配列番号１８）を使用した。
【００９７】
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒、６８℃で３分間の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持して１回目のＰＣＲ反応を終了した。
【００９８】
２回目のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）は、上記組成のＰＣＲ関連試薬の入ったＰＣＲチューブに、１回目のＰＣＲ反応液１μＬを加えて行った。２回目のＰＣＲ反応には以下のプライマーを使用した。
ＳＡ識別プライマー
ＳＡ３Ｔ：５’−ＡＣＴＧＴＴＣＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧ−３’（配列番号２１）
ＳＡ３Ｂ：５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２２）
ＳＥ識別プライマー
ＳＥ３Ｔ：５’−ＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２３）
ＳＥ３Ｂ：５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＡＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２４）
ＰＡ識別プライマー
ＰＡ３Ｔ：５’−ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧ−３’（配列番号２５）
ＰＡ３Ｂ：５’−ＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２６）
ＥＦ識別プライマー
ＥＦ３Ｔ：５’−ＡＴＣＡＧＧＣＧＴＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＴＴＧ−３’（配列番号２７）
ＥＦ３Ｂ：５’−ＴＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号２８）
ＥＣ識別プライマー
ＥＣ３Ｔ：５’−ＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号２９）
ＥＣ３Ｂ：５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＡＡＣＡＴＴＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３０）
サーマルサイクラーは１回目と同様にＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒、６８℃で１分間の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持して２回目のＰＣＲ反応を終了した。
【００９９】
〔判定工程〕
１％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。使用したプライマーに対応した各細菌を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、標的核酸が増幅されていることを確認した（ポジティブ・コントロール）。また、試料をスメアーしない状態でＰＣＲ反応を行い、標的核酸が非特異的に増幅していないことを確認した（ネガティブ・コントロール）。
【０１００】
〔結果〕
電気泳動の結果を図３に示した。図中の左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図３から明らかなように、レーン１３およびレーン１５に特異的な核酸の増幅が認められるため、この臨床検体はＳＡ（黄色ブドウ球菌）およびＰＡ（緑膿菌）に感染している（陽性）と判定した。
【０１０１】
なお、この臨床検体（臨床検体１）を含めて４例の臨床検体について、上記と同一の方法で起因菌を判定した結果を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
表１から明らかなように、本発明の核酸検出方法は、敗血症患者の起因菌の判定に有効であることが示された。
【０１０３】
＜実施例３．敗血症血液モデルからの生体因子（ＲＮＡ）の検出＞
〔敗血症血液モデルの調製〕
予め外来微生物（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下ＥＣ）ＡＴＣＣ１１７７５）をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。培養した菌液を４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットをＰＢＳ５ｍＬを用いて懸濁し、再度４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集菌した菌をＰＢＳ５ｍＬで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を、０．１〜０．１５に調整したものを５ｍＬ作製した。ヘパリン加健常ヒト血液８ｍＬを採取し、１５ｍＬの遠沈管２本に４ｍＬずつ分注した。ヘパリン加血液４ｍＬに作製した菌液及びＰＢＳを４００μＬ加え、３７℃で３時間静置し、炎症性サイトカインの発現を誘導した。
【０１０４】
上記ヘパリン加血液に血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球をＰＢＳ１５０μＬに懸濁した。これを敗血症血液モデルとし、試料とした。
【０１０５】
〔試料の固定化〕
上記試料を支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて７０℃で風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて４２℃で風乾した。
【０１０６】
〔試料の前処理〕
各ウェルにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅＩ，ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）０．１単位／μＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、滅菌蒸留水）１０μＬを入れ、サーマルサイクラーを用いて３７℃にて１０分処理し白血球ゲノムＤＮＡを分解した後、７０℃にて１０分間処理し酵素の失活およびウェルを風乾させた。
【０１０７】
ただし、仔牛胸腺ＤＮＡを基質として、２５℃、ｐＨ５．０において反応液の２６０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素活性を１単位とした。
【０１０８】
〔核酸増幅工程〕
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を行った。逆転写反応にはスーパースクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。試料が固定化されたウェルにＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（０．５μｇ／μＬ）：１μＬと滅菌蒸留水：９μＬとを加え７０℃で１０分間処理後、４℃にて１分間静置した。次に１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ］：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ：１μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ：２μＬを加えて２５℃にて５分間静置した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ：１μＬ（５０ｕｎｉｔｓ）を加えて２５℃にて１０分、４２℃で５０分、７０℃で１５分間処理後、４℃にて５分間静置した。逆転写反応終了後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／μＬ）：１μＬを加え３７℃にて２０分間処理し、ＲＮＡを完全に分解した。
【０１０９】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ：０．２μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：３．２μＬ、ＩＬ６識別プライマー：各０．１６μＭ、滅菌精製水で１８μＬに調整した）の入ったＰＣＲチューブに、逆転写反応液２μＬを加えて行った。
【０１１０】
なお、ＰＣＲ反応には以下のインターロイキン６（ＩＬ６）用プライマーを使用した。
ＩＬ６識別プライマー
ＩＬ６−Ｔ：５’−ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧ−３’（配列番号３１）
ＩＬ６−Ｂ：５’−ＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴ−３’（配列番号３２）
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応サイクルを５０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持してＰＣＲ反応を終了した。
【０１１１】
〔判定工程〕
２％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。電気泳動で特異的バンドが得られることにより、標的核酸が増幅されていることを確認した。
【０１１２】
〔結果〕
電気泳動の結果を図４に示した。図中の左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図４から明らかなように、レーン３にＩＬ６由来の特異的な核酸の増幅が観察されるため、大腸菌に感染した血液でのＩＬ６の発現上昇が、本発明の核酸検出方法により検出可能であることが証明された。
【０１１３】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸を検出する核酸検出工程とを含むものであり、試料から核酸を抽出する工程を必要としない。したがって、核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても増幅するための鋳型として必要な量の標的核酸が含まれていれば検出することができるという効果を奏し、それに伴い、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、試料から核酸を抽出する工程を必要としないため、操作が簡便となり、結果を得るまでに要する時間を短縮できるという効果を奏する。
【０１１５】
本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定するため、試料溶液中に増幅阻害物質が含まれている場合でも、細胞外に存在する増幅阻害物質は容易に除去することができる。したがって、増幅効率の低下に伴う検出感度の低下を招かないという効果を奏する。
【０１１６】
本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定し、当該支持体上で核酸を増幅するため、試料をＰＣＲチューブ等の別の容器等に移す必要がない。したがって、試料の移動に起因する核酸のロスが生じないため、検出感度の低下を招かないという効果を奏する。また、操作が簡便となり、要する時間を短縮できるという効果を奏する。
【０１１７】
本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、検出対象の標的核酸が微量であるために検出が困難であるという問題は生じない。したがって、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、検出方法に特別な工夫を必要としないため、公知の検出方法を適宜選択して用いることができるという効果を奏する。さらに、結果の判定に熟練を必要としないという効果を奏する。
【０１１８】
本発明に係る遺伝子検出キットは、本発明に係る核酸検出方法を用いて試料中の標的遺伝子を検出するためのキットである。したがって、当該キットを用いることにより、本発明に係る核酸検出方法を非常に簡便かつ迅速に実施することができるという効果を奏する。
【０１１９】
以上のように本発明は、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがって、本発明は医療、製薬、試薬分野をはじめ、広く生物関連産業に利用することができる。特に、本発明を医療分野における臨床検査で利用することにより、的確な治療方針の選択に貢献できる。また、生物関連分野の基礎研究に利用することができ、生物学の発展に大いに貢献することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出方法およびその利用に関するものであり、より具体的には、試料中の微量核酸を効率よく増幅し、正確かつ迅速に検出する方法、および当該方法を利用した遺伝子検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合、標的の核酸や遺伝子を増幅し、その増幅産物を検出する方法が用いられる。標的の核酸や遺伝子を特異的に増幅させる方法としては、ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１、２参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、非特許文献１、２参照）、ＩＣＡＮ法（例えば、特許文献１参照）、ＬＡＭＰ法（例えば、非特許文献３参照）、ＲＣＡ法（例えば、非特許文献４参照）、プライマーエクステンション法（例えば、非特許文献５参照）等が知られている。なかでもＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法が最もよく使われている。これらの方法は、目的とする核酸の塩基配列を含む短い核酸をプライマーとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによる鋳型特異的な核酸合成反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う方法である。
【０００３】
さらに、上記核酸増幅方法において、増幅反応中または増幅反応後に、増幅された核酸断片を適当な手段を用いて標識することにより、試料中にわずかしか存在しない核酸を検出することが可能となる。また、ランダムな塩基配列のプライマーを使用し非特異的に核酸を増幅および標識し、それを用いて核酸を検出するＤＮＡマイクロアレイ（マクロアレイ）法やディファレンシャルディスプレイ法等も知られている。近年、様々な疾病に関連する遺伝子を網羅的に検出するＤＮＡマイクロアレイは、非常に注目を集めている。
【０００４】
また、ある特定の核酸や遺伝子を調べたい場合、上記核酸増幅方法以外の方法として、組織や細胞中の標的となる核酸を、それと相補的な塩基配列を含む標識した核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションさせるＩＳＨ法（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）やＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法）がある（例えば、非特許文献１参照）。ＩＳＨ法は組織内の特定の遺伝子の発現の有無や量の比較に広く用いられている。ＦＩＳＨ法は染色体上の特定の遺伝子領域の判別に広く用いられている。
【０００５】
また、ＰＣＲ法で標的核酸を増幅し、ＩＳＨ法によりプローブを用いてハイブリダイゼーションさせ、最終的に顕微鏡で検出するｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法（例えば、非特許文献２参照）も存在するが、反応に最適な条件を出すのが困難であるため再現性に乏しく、一般化していない。
【０００６】
本出願人は、ＩＳＨ法に基づいて末梢血における白血球中の細菌検出キット「ハイブリゼップ（登録商標）」を体外診断用医薬品（承認番号：ＡＭＺ００６２００００）として販売している。「ハイブリゼップ（登録商標）」を用いた場合、従来用いられている血液培養法と比較して約４倍の感度で菌を検出することが可能となり、少なくとも３日以上を要した検査時間を１日以内で行うことが可能となったことから、感染症分野において脚光を浴びている（例えば、非特許文献６参照）。なお、本出願人は、食細胞に貪食された外来微生物をＩＳＨ法に基づいて検出および同定のための方法（特許文献２参照）およびその改良方法（特許文献３参照）を提案しており、「ハイブリゼップ（登録商標）」はこれらの発明に基づいて開発された商品である。
【０００７】
【特許文献１】特許第３４３３９２９号公報（登録日：平成１５年５月３０日、発行日：平成１５年８月４日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ８９／１０４１１（国際公開日：１９８９年１１月２日、対応公告公報：特公平０７−４０号）
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／０９９１３３（国際公開日：２００２年１２月１２日）
【非特許文献１】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）
【非特許文献２】監修：真木寿治、「ＰＣＲ Ｔｉｐｓ〜使いこなすためのコツとヒント〜」秀潤社（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２：ｅ６３（２０００）
【非特許文献４】Ｌｉｚａｒｄｉ ＰＭ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｊｕｌ；１９（３）：２２５−３２．（１９９８）
【非特許文献５】Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ：著、堀越正美：訳「遺伝子発現と転写因子」メディカル・サイエンス・インターナショナル（１９９６）
【非特許文献６】松久明生、荒木宏昌、「Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法による敗血症診断の臨床的有用性」、ＢＩＯ Ｃｌｉｎｉｃａ、北隆館、１９９９年、１４巻、１号、ｐ．９７−１０１
ここで、ある特定の核酸や遺伝子の存在の有無を調べたい場合に用いる、上記ＰＣＲ法等の核酸増幅方法や、ＩＳＨ法等のハイブリダイゼーションを用いる方法では、標的とする核酸や遺伝子が試料中に微量しか存在しない場合に、十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できない場合があるという課題を有している。
【０００８】
まず、ＰＣＲ法等の核酸増幅方法を用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要がある。この核酸を抽出する過程で、核酸のロスが生じることを回避することは困難である。例えば、試料中に増幅するための鋳型として必要な量の標的核酸が含まれていたとしても、核酸抽出過程のロスにより鋳型として必要な量が回収できなかった場合には、増幅効率が低下するため標的核酸を十分増幅できず、試料中の標的核酸を検出できない場合が生じ得る。このような場合は、偽陰性となり、正確な結果が得られない。また、同一の試料を用いた場合でも、核酸抽出過程のロスの程度により異なった結果が得られる可能性があり、再現性が乏しくなる。すなわち、核酸の抽出を必要とする核酸増幅方法においては、試料中に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合に、核酸抽出過程の核酸のロスにより、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題がある。
【０００９】
また、増幅反応を阻害する物質（例えば、ヘパリン、界面活性剤、タンパク質変性剤、有機溶媒等）が試料溶液中に含まれている場合があり、上記と同様に、増幅効率の低下に起因する検出感度の低下を招くという問題もある。
【００１０】
次に、ＩＳＨ法等のハイブリダイゼーションを用いる方法では、試料から核酸を抽出する必要がないため核酸のロスは生じないが、試料に含まれる標的の核酸が非常に微量である場合には、標的核酸とハイブリッドを形成しているプローブ核酸を検出するのが困難であるという問題がある。
【００１１】
また、本出願人が開発した「ハイブリゼップ（登録商標）」は、ＩＳＨ法に基づいて末梢血における白血球中の細菌を高感度かつ迅速に検出することを可能としたが、克服すべき課題として以下の２点を挙げることができる。
１）菌のシグナルの有無は顕微鏡による肉眼的観察に委ねられているため、ある程度の熟練を要すること。
２）白血球に貪食された細菌のみが検出標的であるため、白血球数の減少した患者の臨床検体については、検出率が低下すること。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても、正確かつ迅速に標的核酸を検出することが可能な核酸検出方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、試料を支持体に固定し、試料から核酸を抽出せずにそのまま支持体上で核酸を増幅することにより、試料中の核酸のロスに伴う検出感度の低下を招くことなく、簡便かつ迅速に試料中の標的核酸の検出が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００１４】
（１）細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【００１５】
（２）上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、（１）に記載の核酸検出方法。
【００１６】
（３）上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか１の方法、あるいは２以上の方法を組み合わせて用いることを特徴とする（２）に記載の核酸検出方法。
【００１７】
（４）上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００１８】
（５）上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００１９】
（６）上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする（５）に記載の核酸検出方法。
【００２０】
（７）上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする（６）に記載の核酸検出方法。
【００２１】
（８）上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする（５）に記載の核酸検出方法。
【００２２】
（９）上記試料は生体由来試料であることを特徴とする（１）ないし（８）のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【００２３】
（１０）上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする（９）に記載の核酸検出方法。
【００２４】
（１１）（１）ないし（１０）のいずれか１項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【００２５】
（１２）（１０）に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【００２６】
（１３）上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００２７】
（１４）上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である（１３）に記載の遺伝子検出キット。
【００２８】
（１５）上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である（１３）に記載の遺伝子検出キット。
【００２９】
（１６）上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００３０】
（１７）上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である（１２）に記載の遺伝子検出キット。
【００３１】
（１８）少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、標識デオキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする（１１）ないし（１７）のいずれか１項に記載の遺伝子検出キット。
【００３２】
上記の構成によれば、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、高感度、高精度で再現性よく標的確酸を検出することが可能となる。また、簡便かつ迅速に実施でき、結果の判定に熟練を要しない。
【００３３】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る核酸検出方法の一例を示した図である。
【図２】試料に貪食サンプルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【図３】試料に敗血症患者の臨床検体を用いて、本発明の核酸検出方法により白血球に貪食された微生物を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【図４】試料に敗血症血液モデルを用いて、本発明の核酸検出方法により白血球におけるＩＬ６の発現増加を検出した結果を示す電気泳動画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３６】
１．本発明に係る核酸検出方法
本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴としており、さらに、核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程が含まれていてもよい。図１に、本発明に係る核酸検出方法の１つの実施形態を示した。図１に示した実施形態では、生体由来試料を支持体に固定（試料固定化工程）し、疾病関連遺伝子由来のプライマーを含むＰＣＲミクスチャーを加えてＰＣＲを行う（核酸増幅工程）。この核酸増幅工程において核酸増幅と同時に、または核酸増幅後に増幅された核酸を標識する（詳細は後述する。）。そして最後に、電気泳動（アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等）、定量ＰＣＲ、ドットハイブリダイゼーション（マクロアレイ、マイクロアレイ等）等の核酸検出手段を用いて、増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する（判定工程）。なお、本発明に係る核酸検出方法は、図１に示した実施形態に限定されるものではない。以下に本核酸検出方法について、その特徴を詳細に説明する。
【００３７】
（１）試料固定化工程
試料固定化工程は、試料を支持体に固定化する工程である。試料を支持体に固定化することにより、核酸増幅や標識の際に一般的に行なわれる核酸精製工程を省くことができる。また、試料溶液に核酸の増幅反応を阻害する物質（例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、陽イオン、高蛋白溶液、高塩濃度溶液、界面活性剤含有溶液、タンパク変性溶液（尿素、グアニジン塩酸等）、有機溶媒等）が含まれている場合に、これらの増幅阻害物質は通常細胞内に滞留することがないため、試料を支持体に固定化することにより容易に除去することができる。さらに、試料を支持体に固定化することにより、核酸を安定に保存することも可能となる。
【００３８】
〔試料〕
本発明に係る核酸検出方法（以下、適宜「本検出方法」と略記する。）に用いる試料は、細胞を含む試料であればよい。本検出方法により検出する標的核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）のいずれでもよい。細胞にはこれらの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）が含まれているため、その中の標的核酸を本検出方法で検出することが可能となる。細胞の種類は限定されるものではなく、動物細胞、植物細胞、微生物細胞等のあらゆる細胞を対象とすることができる。また、試料の細胞以外の部分は、後述する核酸露出工程において化学処理、酵素処理、加熱処理等により消化可能であって、含まれる細胞の核酸が露出できるものであればよい。本検出方法に用いる試料としては、細胞を含む生体由来試料が好適であるが、これに限定されるものではなく、生体に由来しない試料にも本検出方法を適用することは可能である。
【００３９】
生体に由来しない試料としては、例えば、細胞を含む食品材料、土、水、繊維、埃等を挙げることができる。生体由来試料としては、動物および植物の生体構成成分を好適に用いることができる。ヒトを含む動物由来の試料としては、例えば血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、肺、腎、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液を挙げることができる。さらにヒトの場合は透析排液も試料とすることが可能である。
【００４０】
また、本検出方法の標的とする核酸は試料に含まれる細胞固有の核酸に限定されず、細胞に感染したウイルスの核酸や、細胞が貪食した微生物等の核酸にも適用することが可能である。したがって、感染症患者の貪食細胞（白血球等）を含む生体由来試料は、本検出方法の試料として好適である。
【００４１】
〔支持体〕
支持体は、その表面に試料を固定化するとともに、当該支持体上で試料中の標的核酸を増幅するために用いるものである。したがって、このような目的を達成できる支持体であれば、材質、形状等は特に限定されるものではない。材質としては、例えば、ガラス、金属、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等）、多糖類（セルロース、アガロース等）、濾紙等を挙げることができる。また、形状としては、例えば、板状、盆状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、管状等の種々の形状とすることができ、本検出方法を実施する条件に合わせて適宜好ましい形状のものを選択すればよい。
【００４２】
一つの支持体に対して１試料を固定化し、試料数に応じた数の支持体を用いてもよいが、作業を効率的に行うためには一つの支持体に複数の試料を固定化できることが好ましい。また、本検出方法では、試料固定化工程→核酸増幅工程、または試料固定化工程→核酸露出工程→核酸増幅工程を同一支持体上で一連の操作として行うため、一つの支持体に複数の試料を固定化した場合に、隣接する試料が混じり合わないようにする必要がある。したがって、本検出方法に用いる支持体としては一つの支持体上に複数の分離した区画を有するものが好ましい。さらに、本検出方法の核酸増幅工程において、ＰＣＲ法を用いて核酸を増幅する場合には、耐熱性素材であることが好ましい。さらに、市販されているＰＣＲ用遺伝子増幅機器（サーマルサイクラー）に適合する形状であることが特に好ましい。
【００４３】
〔固定〕
本発明に係る核酸検出方法において、固定とは、試料を何らかの方法により支持体に固着、保持させることを意味する。本検出方法に用いる固定方法は特に限定されるものではなく、従来公知の固定方法を適宜選択して用いればよい。公知の固定方法としては、共有結合やイオン結合などで不溶性の担体に結合させる担体結合法、架橋試薬により共有結合で結び付け不溶化する架橋法、高分子ゲルや半透膜などで包み込む包括法、脱水によりタンパクを急速に変性させ担体に固着させる方法等を挙げることができる。より具体的には、カルノア固定、アルコール固定、火焔固定、グルタルアルデヒド固定、乾燥固定、アセトン固定、メタノール固定、ホルマリン固定等を挙げることができる。
【００４４】
また、支持体の表面に試料を接着させることも固定に含まれる。したがって、支持担体の表面に接着性を高める物質、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、ポリ−Ｌ−リジン、ゼラチン等をコートしておくことも可能である。このような処理を施した支持体を用いれば、試料の種類によっては十分に支持体に固着、保持させることができる。また、支持体に接着固定した上に、上記例示した固定方法を併用することも可能である。
【００４５】
（２）核酸露出工程
核酸増幅工程において試料中に含まれる核酸を増幅するためには、プライマーや核酸合成酵素が標的核酸に到達できることが必須である。試料によっては標的核酸が試料表面に露出している場合もあり、このような試料については試料固定化工程から直接核酸増幅工程に進むことができる。したがって、本核酸露出工程は、本検出方法の必須の工程ではない。しかしながら、標的核酸が試料表面に露出していない場合には、核酸露出工程を設けて標的核酸を露出させることが必要となる。
【００４６】
核酸露出工程に用いる方法としては、界面活性剤処理法（ＳＤＳ、ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ、ＴＷＥＥＮ−２０、ＢＲＩＪ、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ等）、プロテアーゼ等の酵素処理、加熱処理法等を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではなく、用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な方法を選択すればよい。例えば、細菌感染に起因する敗血症で、白血球に貪食された細菌の遺伝子を検出する場合、細菌の細胞壁を消化させる酵素としてリゾスタフィン、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、ザイモラーゼ等を使用することにより細菌、真菌等の微生物の遺伝子を露出させることができる。
【００４７】
（３）核酸増幅工程
核酸増幅工程は、試料が固定化された支持体上で標的核酸を増幅する工程である。ここで、本発明に係る核酸検出方法は、試料中の核酸を抽出、精製することなく、試料が固定化された支持体上で標的核酸の増幅を行うことに最大の特徴がある。これにより、標的核酸が試料中に微量しか存在しない場合においても、抽出および精製過程のロスが生じないため、検出感度の低下を招くことなく微量の標的核酸を検出することが可能となる。また、作業の簡便化を図ることができ、作業時間を短縮することが可能となる。
【００４８】
核酸増幅とは、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーまたはランダムな配列のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼとを用いて、試料中の核酸を増幅させることを意味する。増幅方法としては、従来公知の増幅方法を好適に用いることができる。具体的には、例えば、ＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製（レプリケーション）等を挙げることができる。
【００４９】
上記例示した増幅方法の中でもＰＣＲ法は、本検出方法に用いる増幅方法として好適である。以下に、本検出方法の核酸増幅工程にＰＣＲ法を用いた場合について説明する。
【００５０】
ＰＣＲ法とは、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡ合成酵素（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、以下適宜「Ｔａｑポリメラーゼ」と表記する。）によるＤＮＡ合成反応の試験管内における繰り返しで、その特定ＤＮＡ領域を増幅する方法であり、遺伝子工学分野において一般的に用いられている周知技術である。ＰＣＲ法にはＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等も含まれる。
【００５１】
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法とは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域からの最初の増幅産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー位置より両側とも内側にプライマーを設定して行う方法である。Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを用いることにより、１回目のＰＣＲで標的核酸が検出可能な量まで十分増幅しない場合でも、２回目のＰＣＲにより検出可能な量に増幅させることが可能となる。また、１回目のＰＣＲで非特異的な増幅産物が生じた場合、これらの非特異的増幅産物は２回目のＰＣＲにおけるプライマーに類似した配列を持つ確率が極めて低くなる。したがって、２回目のＰＣＲでは標的の配列を有する断片のみを増幅する確率が高くなるため、非特異的増幅産物の発生による弊害を解消し、より正確に標的核酸を検出することが可能となる。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲ法とは、ｍＲＮＡに対してＰＣＲを適用するための変法であり、ＰＣＲの前段階として、逆転写酵素を用いて逆転写反応を行う工程を含むＰＣＲ法である。本検出方法にＲＴ−ＰＣＲ法を用いれば、標的核酸をｍＲＮＡとすることが可能となる。すなわち、本検出方法を遺伝子発現の検出に応用することが可能となる。
【００５３】
上記〔支持体〕の項で述べたように、本検出方法では試料を固定化した支持体上でＰＣＲを行うため、支持体は複数の分離した区画を有するものが好ましい。複数の分離した区画を有する支持体を用いた場合の具体的なＰＣＲの手順としては、ＰＣＲミクスチャー（緩衝液、ｄＮＴＰｍｉｘ、Ｔａｑポリメラーゼ等を混合したもの）を支持担体上の各区画の試料に添加し、さらにプライマーを加えてＰＣＲ用遺伝子増幅機器（サーマルサイクラー）等を用いてＰＣＲを行えばよい。プライマーについては、１つのＰＣＲについて様々な標的核酸を特異的に増幅するプライマーセットを用いる。ＰＣＲの条件（反応液の量、酵素や基質の濃度、反応温度等）は特に限定されるものではなく、用いる試料および標的核酸に応じて、適宜最適な条件を選択すればよい。
【００５４】
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う場合には、１回目のＰＣＲを支持体上で行い、２回目のＰＣＲはＰＣＲチューブ等を用いて行えばよい。なお、２回目のＰＣＲに用いるプライマーは、両側とも最初に使用したプライマー位置と同じ、または内側に設計しなければならない。
【００５５】
ＰＣＲにより増幅される断片は、標的核酸が特異的に有する配列部分であることが好ましい。試料に含まれる核酸は標的部分以外の部分が大多数であるため、標的微生物に特異的な配列部分にプライマーを設計しなければ、非特異的な増幅産物が生じる可能性が高くなる。したがって、標的核酸の特異的配列をあらかじめ調べておき、その配列部分を増幅するようにプライマーを設計することが重要である。
【００５６】
増幅される断片の長さは５０ｂｐ〜５，０００ｂｐの範囲内であることが好ましく、１００ｂｐｐ〜２，０００ｂｐの範囲内であることがより好ましい。この範囲を外れると、特異的な増幅産物を有効に得ることができなくなるおそれがある。
【００５７】
核酸増幅工程においては、増幅された核酸を標識することが好ましい。これにより、後段の判定工程を効率的に実施することができる。核酸の標識は増幅と同時または増幅後に行うことができる。標識手段としては、放射性標識、ハプテン（ビオチン、ジゴキシゲニン等）標識、蛍光標識等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
核酸増幅方法として、核酸の増幅と同時に行う場合は、前述のＰＣＲ法、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法、転写（トランスクリプション）、複製（レプリケーション）等の増幅反応を行う際に、例えばジゴキシゲニンやビオチン等のハプテン、ＦＩＴＣ、放射性同位体で標識されたヌクレオチドアナログを基質とすれば、増幅反応中に標的核酸を標識することができる。また、増幅反応の際、末端を標識したプライマーを使用することによっても、標的核酸を標識することができる。増幅反応後に標識する場合は、ニックトランスレーション法やランダムプライム法、プライマーエクステンション法、ＴｄＴ法、５’カイネーション法等を用いることができる。この場合も標識されたヌクレオチドアナログを基質としたり、末端を標識したプライマーを使用することによって標識することができる。
【００５９】
核酸増幅工程において、標的核酸の任意の配列に対し特異的なプライマーを用いた場合には、既知の塩基配列を有する核酸断片を増幅することができる。一方、ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、非特異的に核酸が増幅されるため、どのような塩基配列を有する核酸断片が生じるかは予想できない。核酸増幅工程において既知の塩基配列を有する核酸断片を増幅するように設計されたプライマーを用いた場合には、後述する判定工程において、塩基配列の確認や既知の塩基配列を有する核酸断片とのハイブリダイゼーションにより、標的の核酸であるか否かを判定することができる。ランダムな配列のプライマーを用いた場合には、後述する判定工程において、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いることにより、試料中に標的の核酸が含まれているか否かを判定することができる。
【００６０】
（４）判定工程
判定工程は、核酸増幅工程で増幅された核酸が標的の核酸断片であるか否かを判定する工程である。本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、標的核酸が微量であるため検出が困難となる問題は生じない。また、公知の方法を適宜選択して用いることができるので、判定に熟練を要することもない。
【００６１】
判定には増幅された核酸断片の長さや塩基配列を確認することが含まれることはいうまでもないが、増幅されたＤＮＡ断片の転写産物であるＲＮＡを確認することや、増幅された核酸断片に基づいて発現させたタンパク質を確認することも含まれる。判定工程で用いる方法の具体例としては、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を確認する方法として、アガロースゲル電気泳動、定量ＰＣＲ、シークエンス、ドットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、サザン・ハイブリダイゼーション、ノーザン・ハイブリダイゼーション等を挙げることができ、タンパク質を確認する方法として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン・ブロッティング、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等）等を挙げることができる。ただし、これらの方法に限定されるものではなく、適宜適当な方法を選択して使用すればよい。
【００６２】
もっとも簡便な判定方法としては、アガロースゲル電気泳動を挙げることができる。しかしながら、この方法は、試料から増幅された核酸断片の長さと、標的核酸のみを鋳型として増幅した場合の核酸断片の長さとを比較して、一致するか否かを確認するものであるため、非特異的な増幅産物が偶然類似する長さである場合に誤った結果（擬陽性）を導くことがあり得る。増幅された核酸が標的核酸と一致するか否かを正確に判定するために最も信頼性が高い方法は、増幅核酸の塩基配列を確認する方法（シークエンス）である。この方法を用いれば、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出することも可能となる。
【００６３】
標的核酸が増幅されているか否かを簡便かつ正確に判定する方法として、標識された増幅核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的核酸であるか否かを判定する方法を用いることが好ましい。また、この方法を用いる場合、プローブとする核酸は、ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片の塩基配列を有するように設定されたプライマーを用いて増幅されることが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片はあらかじめ支持体に固定されていることが好ましい。あらかじめ既知の遺伝子断片を支持体に固定することにより、プローブとのハイブリダイゼーションを正確に捕捉できる。また、既知の遺伝子断片に位置情報を持たせることが可能となり、様々な既知の遺伝子断片を整列させることにより、一度に多数の遺伝子を検出し得る。
【００６４】
具体的には、例えば標的核酸をあらかじめナイロンメンブレン等にスポット（固定）しておき、増幅された核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションさせる。スポットされた核酸と増幅された核酸との間にハイブリダイゼーションが成立すれば、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。一方、核酸増幅工程において核酸が増幅されていない場合や、標的の核酸でない核酸が非特異的に増幅されていた場合はハイブリダイゼーションが成立せず、試料中に標的の核酸が存在していたと判定することができる。
【００６５】
ハイブリダイゼーションの対象とする上記既知の遺伝子断片は、核酸増幅工程により増幅される予定の塩基配列部分を含んでいれば特に限定されるものではないが、増幅される予定の塩基配列部分のみ、または増幅される予定の塩基配列部分の一部であることが好ましい。増幅される予定の塩基配列部分以外の塩基配列配列を含んでいる場合には、増幅された核酸が目的の配列を有しない非特異的増幅産物であった場合に、ハイブリダイズする可能性があるからである。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、既知の遺伝子断片に対して標識された増幅核酸をプローブとして、公知の方法により行えばよい。公知の方法としては、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載されている方法等を挙げることができるが、これ限定されるものではない。
【００６７】
また、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的核酸の存在の有無を判定する方法を用いることもできる。ここで、ＤＮＡマイクロアレイには、いわゆるオリゴＤＮＡタイプのものとｃＤＮＡタイプのものとのいずれをも含むものとする。また、ＤＮＡマイクロアレイは市販のものを用いてもよく、自製のものを用いてもよい。判定工程においてＤＮＡマイクロアレイを用いる場合には、上述したように、核酸増幅工程においてランダムな配列のプライマーを用いて非特異的に増幅された核酸中に標的核酸が存在するか否かを判定することができる。
【００６８】
（５）本発明に係る核酸検出方法の適用範囲
本検出方法の適用範囲としては、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。例示すれば以下のとおりであるが、これらに限定されるものではない。
ａ）病原微生物（細菌、真菌、ウイルス、寄生虫等）の検出、すなわち感染症の分子診断
ｂ）がんの分子診断
ｃ）出生前の遺伝性疾患等の分子診断
ｄ）薬物代謝に関与する遺伝子の分子診断
ｅ）法医学サンプルからの分子診断
ｆ）疾病マーカー遺伝子の分子診断
ｇ）移植時の組織タイピング
ｈ）適合性テスト
ｉ）ＳＮＰｓ検出
本発明に係る核酸検出方法は、上記ａ）に示した感染症の分子診断に用いることが最適であると考えられる。その理由を以下に説明する。
【００６９】
病原微生物は血液中または体液中に浮遊して存在している可能性は低く、宿主細胞に侵入してはじめて感染症を発症させる。したがって、感染症の病原微生物を検出するための試料としては白血球等の免疫系細胞が好適であるといえる。そして、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウイルス等を検出する手段としては、試料から核酸を抽出した後に増幅する従来のＰＣＲ法や、核酸を増幅することなく標的核酸の検出を行うＩＳＨ法では十分な検出感度、再現性、簡便性等を実現できない場合がある。一方、本発明に係る核酸検出方法では、細菌を貪食した細胞やウイルス等が侵入した細胞を直接支持体に固定化し、そのままの状態で細胞中の細菌やウイルス等の核酸を増幅して検出するものであるため、上記従来の方法と比較して顕著に検出感度および精度が向上することは明らかである。
【００７０】
また、従来細胞内の病原微生物等を検出する方法としてｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法がある。この方法は、細胞をスライドグラスに固定化し、細胞内でＰＣＲを行い、細胞内で増幅した産物をＩＳＨ法によりプローブをハイブリダイゼーションさせて視覚化し、顕微鏡で検出するものである。したがって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法は本発明に係る核酸検出方法と同等の検出感度が期待できるが、条件設定が難しく、再現性に乏しいという問題点がある。さらに、非特異的反応が多く、非特異的増幅産物を標的の特異的増幅産物と細胞内で区別することは困難であるという問題点がある。
【００７１】
以上より、本発明に係る核酸検出方法は、細胞に貪食された細菌や細胞に侵入したウイルス等を検出する手段として非常に優れた方法であるといえる。
【００７２】
２．本発明に係る遺伝子検出キット
本発明に係る遺伝子検出キット（以下、適宜「本キット」と略記する。）は、本発明に係る核酸検出方法を用いて試料中の標的遺伝子を検出するために用いるキットである。本検出方法に用いる試薬、器具類をキット化することにより、本検出方法を簡便に実施することが可能となり、一層短時間で正確な検出結果を得ることが可能となる。なお、遺伝子にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。
【００７３】
（１）本キットの構成
本キットには、少なくとも試料固定化工程で使用する試料固定化用支持体、核酸増幅工程で使用するプライマー、核酸合成酵素、基質（ヌクレオシド三リン酸）、緩衝液等の試薬、判定工程で使用する増幅核酸検出用指示薬等の試薬および器具等が含まれていることが好ましい。また、用いる試料を特定したキットとすることにより核酸露出工程が必要である場合には、核酸露出用の試薬（界面活性剤やタンパク質分解酵素等）を含ませることができる。また、用いる試料に適した固定用試薬を含ませることができる。例えば、白血球を含む生体由来試料に特定し、白血球に貪食された細菌等の微生物のゲノムを標的核酸とするキットの場合には、固定用試薬（例えば、カルノア固定液等）および核酸露出用試薬（微生物の細胞壁分解酵素等）を含ませることが好ましい。
【００７４】
さらに、核酸増幅方法および判定方法を特定することにより、キットに含まれる試薬の構成を具体化することが可能となる。例えば、核酸増幅方法をＰＣＲ法とする場合は、核酸増幅工程で用いる試薬はＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）となる。また、ＰＣＲにより核酸を標識することが必要であれば、さらに標識デオキシヌクレオシド三リン酸を含ませればよい。
【００７５】
判定方法をアガロースゲル電気泳動法とする場合は、アガロースゲル、電気泳動用緩衝液、分子量マーカー、核酸染色用試薬等をキットに含ませればよい。判定方法をドットハイブリダイゼーションとする場合は、標的核酸をスポット（固定）したメンブレン、ハイブリダイゼーション用緩衝液、核酸の標識に応じた検出用指示薬（例えば、ジゴキシゲニン標識を用いた場合には酵素標識した抗ジゴキシゲニン抗体、標識した酵素を発色させるための基質等）、ハイブリバッグ、その他必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい。核酸検出方法をＤＮＡマイクロアレイとする場合は、標的核酸に応じたＤＮＡマイクロアレイおよび必要な試薬、器具等をキットに含ませればよい。
【００７６】
すなわち、本発明に係る核酸検出方法に用いる試料、標的遺伝子、核酸増幅方法、核酸検出方法を具体的に特定することにより、用いる試薬、器具等を様々に組み合わせてキットを構成することが可能となる。なお、本キットの構成は上記例示した試薬、器具等に限定されるものではなく、目的に応じて適当な公知の試薬、器具等を適宜選択して用いればよい。
【００７７】
（２）標的遺伝子
一つのキットに含まれる標的遺伝子は１遺伝子に限定する必要はなく、複数のプライマーセットをキットに含ませることにより、複数の標的遺伝子を検出可能なキットとすることができる。例えば、疾病関連遺伝子を標的とするキットには、同一の試料から検出することが可能な複数の疾病関連遺伝子を標的とできる。より具体的には、感染症の原因微生物の遺伝子を標的とする場合には、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌、腸球菌、大腸菌等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。このような感染症の原因微生物の標的遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子や感受性遺伝子であることが好ましい。
【００７８】
また、癌マーカー遺伝子を標的とする場合には、ｐ５３、ＭＤＭ２、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＡＰＣ、Ｍｙｃ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｅｒｂＢ、ｓｒｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｒａｆ、ｆｅｓ、ｅｒｂ−Ａ、ｆｍｓ、ｓｉｓ、Ｒｂ、ＷＴ１等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。また、遺伝性疾患関連遺伝子を標的とする場合には、例えば、色素性乾皮症関連遺伝子（ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＥ、ＸＰＦ／ＥＲＣＣ１、ＸＰＶ）、家族性大腸癌関連遺伝子（ＡＰＣ）、アルツハイマー病関連遺伝子（ａｐｏＥ４）、冠状動脈性疾患関連遺伝子（ａｐｏＥ２）、Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病関連遺伝子（ＶＨＬ）、筋ジストロフィー関連遺伝子（ジストロフィン）等を特異的に検出可能なプライマーセットをキットに含ませればよい。
【００７９】
なお、本キットの適用範囲は上記「１．（５）本発明に係る核酸検出方法の適用範囲」と同一であり、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがって、本キットの標的遺伝子はあらゆる遺伝子診断の分野から選択することが可能であり、上記例示したものに限定されるものではない。
【００８０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８１】
＜実施例１．貪食サンプルを用いた核酸の検出＞
〔試料調製〕
予め外来微生物（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、以下ＳＡ）ＡＴＣＣ １２６０００、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、以下ＳＥ）ＡＴＣＣ １４９９０、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、以下ＰＡ）ＡＴＣＣ １０１４５、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、以下ＥＦ）ＡＴＣＣ １９４３３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下ＥＣ）ＡＴＣＣ １１７７５）をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。
【００８２】
培養した菌液を、４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットをＰＢＳ５ｍＬを用いて懸濁し、再度４℃、２，０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集菌した菌をＰＢＳ５ｍＬで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を、０．０１〜０．０３に調整したものを１５ｍＬ作製した。作製した菌液を別々の１７５ｃｍ２の培養用フラスコに移し、約３０分間室温にて静置した。
【００８３】
ヘパリン加健常ヒト血液５０ｍＬを採取し、血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇおよびデキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。分取した白血球画分をＰＢＳにて５０ｍＬにした。
【００８４】
上記菌液を入れて静置した培養用フラスコの上清を静かに捨て、上記ＰＢＳで希釈した白血球画分を１０ｍＬずつフラスコに加え、室温で約１０分間静置した。フラスコ内の上清を捨て、フラスコの底に付着した白血球を０．０２％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ１０ｍＬで１５ｍＬの遠沈管に回収し、４℃にて、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈渣を穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて、１４０×ｇ〜１８０×ｇで１０分間遠心分離を行い、白血球を収集した。
【００８５】
収集した白血球をＰＢＳで懸濁し、血球計算盤にて細胞数を計測し、１×１０４個／μＬ〜５×１０４個／μＬに調整した。このサンプルを貪食サンプルと称し、本実施例の試料とした。
【００８６】
〔試料固定化工程〕
上記各貪食サンプルを支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて風乾した。
【００８７】
〔核酸増幅工程〕
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、各貪食サンプルが固定化されたウェルにＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）：０．５μＬ（ｆｉｎａｌ ２．５Ｕ）、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：４μＬ、各細菌識別プライマー２種：０．４μＭ、滅菌精製水：ｕｐ ｔｏ ５０μＬ）を加えた。１回目のＰＣＲ用プライマーには、ＳＡ識別プライマーとして以下に示すＳＡ１Ｔ（配列番号１）およびＳＡ１Ｂ（配列番号２）を使用した。
ＳＡ１Ｔ：５’−ＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＣＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣ−３’
ＳＡ１Ｂ：５’−ＡＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣ−３’
ＳＥ識別プライマーとして以下に示すＳＥ１Ｔ（配列番号５）およびＳＥ１Ｂ（配列番号６）を使用した。
ＳＥ１Ｔ：５’−ＡＣＴＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡ−３’
ＳＥ１Ｂ：５’−ＣＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴ−３’
ＰＡ識別プライマーとして以下に示すＰＡ１Ｔ（配列番号９）およびＰＡ１Ｂ（配列番号１０）を使用した。
ＰＡ１Ｔ：５’−ＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧ−３’
ＰＡ１Ｂ：５’−ＧＴＧＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＧＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣ−３’
ＥＦ識別プライマーとして以下に示すＥＦ１Ｔ（配列番号１３）およびＥＦ１Ｂ（配列番号１４）を使用した。
ＥＦ１Ｔ：５’−ＣＴＴＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴ−３’
ＥＦ１Ｂ：５’−ＴＡＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣ−３’
ＥＣ識別プライマーとして以下に示すＥＣ１Ｔ（配列番号１７）およびＥＣ１Ｂ（配列番号１８）を使用した。
ＥＣ１Ｔ：５’−ＣＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＧＣＡＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣ−３’
ＥＣ１Ｂ：５’−ＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧ−３’
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で１分間、６８℃で３分間の反応を５０サイクル繰り返し、７２℃で１分保持して１回目のＰＣＲを終了した。
【００８８】
２回目のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）は、上記組成のＰＣＲ関連試薬の入ったＰＣＲチューブに、１回目のＰＣＲ反応液５μＬを加えて行った。２回目のＰＣＲ用プライマーには、ＳＡ識別プライマーとして以下に示すＳＡ２Ｔ（配列番号３）およびＳＡ２Ｂ（配列番号４）を使用した。
ＳＡ２Ｔ：５’−ＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＴＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴ−３’
ＳＡ２Ｂ：５’−ＴＣＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＧＣＡＣＧＧＣＴＡＴ−３’
ＳＥ識別プライマーとして以下に示すＳＥ２Ｔ（配列番号７）およびＳＥ２Ｂ（配列番号８）を使用した。
ＳＥ２Ｔ：５’−ＡＴＴＣＴＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’
ＳＥ２Ｂ：５’−ＴＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＴＡＴＧＴＧＧＴＧ−３’
ＰＡ識別プライマーとして以下に示すＰＡ２Ｔ（配列番号１１）およびＰＡ２Ｂ（配列番号１２）を使用した。
ＰＡ２Ｔ：５’−ＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＣＧ−３’
ＰＡ２Ｂ：５’−ＴＡＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＣＣＧＣＧＣＡＡＴ−３’
ＥＦ識別プライマーとして以下に示すＥＦ２Ｔ（配列番号１５）およびＥＦ２Ｂ（配列番号１６）を使用した。
ＥＦ２Ｔ：５’−ＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＴ−３’
ＥＦ２Ｂ：５’−ＣＴＡＣＴＧＡＡＡＣＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡ−３’
ＥＣ識別プライマーとして以下に示すＥＣ２Ｔ（配列番号１９）およびＥＣ２Ｂ（配列番号２０）を使用した。
ＥＣ２Ｔ：５’−ＡＡＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＣＣＣ−３’
ＥＣ２Ｂ：５’−ＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＧＡＡＴＴＴＴＣＣＣ−３’
サーマルサイクラーは１回目と同様にＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で１分間、６８℃で１分間の反応を３０サイクル繰り返し、７２℃で１分保持して２回目のＰＣＲを終了した。
【００８９】
〔判定工程〕
１％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。使用した各細菌を鋳型として同一のプライマーを用いて行ったＰＣＲの結果と比較することにより、標的核酸が増幅されているか否かを確認した。
【００９０】
〔結果〕
結果を図２に示した。左側が各細菌を鋳型としてＰＣＲを行った結果を示したものであり、右側が各貪食サンプルを試料として本発明にかかる核酸検出方法を用いて各細菌の標的核酸を増幅した結果を示したものである。図中のＭは分子量マーカーを表し、左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図１から明らかなように、貪食サンプルの２回目のＰＣＲ（２ ＮＤ−ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ））のバンドの位置は、各細菌を鋳型としてＰＣＲを行った場合の２回目のＰＣＲ（２ ＮＤ−ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ））のバンドの位置と同一であり、標的の核酸が検出されたことを示している。
【００９１】
＜実施例２．敗血症患者からの起因菌の判定＞
〔試料調製〕
敗血症が疑われる患者より、血液５ｍＬを採取し、ヘパリンを加えた（ヘパリン加血液）。ヘパリン加血液に血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球をＰＢＳ１５０μＬで懸濁した。これを臨床検体と称し、試料とした。
【００９２】
〔試料の固定化〕
上記試料を支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて４２℃で風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて４２℃で風乾した。
【００９３】
〔試料の前処理（核酸露出工程）〕
各ウェルに酵素試薬（サポニン１２５μｇ、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（比重１．０６８〜１．０７５（２０／４℃），ｐＨ（５ｗ／ｖ％）５．５〜７．５）１２５ｎＬ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生化学工業社製）５０単位、リゾチーム（生化学工業社製）５０００単位、リゾスタフィン（ＳＩＧＭＡ社製）５単位を滅菌精製水１ｍＬに溶かして調製したもの）１０μＬを入れ、サーマルサイクラーを用いて、３７℃にて１０分処理後、９５℃にて１０分間処理し酵素の失活およびウェルを風乾させた。
【００９４】
ただし、Ｎ−アセチルムラミダーゼは、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＩＦ０３３５０の熱処理細胞を３７℃、ｐＨ７．０で１分間に１μｇ溶菌する酵素活性を１単位とした。リゾチームは、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓを３５℃、ｐＨ６．２で１分間に５４０ｎｍの吸収を０．００１下げるときの酵素活性を１単位とした。リゾスタフィンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを３７℃、ｐＨ７．５で１０分間に６２０ｎｍの吸収を０．２４０から０．１２５に下げるときの酵素活性を１単位とした。
【００９５】
〔核酸増幅工程〕
Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、試料が固定化されたウェルにＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ：０．２μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：３．２μＬ、各細菌識別プライマー２種：各０．１６μＭ、滅菌精製水で２０μＬに調整した）を加えた。
【００９６】
１回目のＰＣＲ用プライマーには、上記実施例１で使用したプライマーと同一のプライマーを使用した。すなわち、ＳＡ識別プライマーとしてＳＡ１Ｔ（配列番号１）およびＳＡ１Ｂ（配列番号２）を使用した。ＳＥ識別プライマーとしてＳＥ１Ｔ（配列番号５）およびＳＥ１Ｂ（配列番号６）を使用した。ＰＡ識別プライマーとしてＰＡ１Ｔ（配列番号９）およびＰＡ１Ｂ（配列番号１０）を使用した。ＥＦ識別プライマーとしてＥＦ１Ｔ（配列番号１３）およびＥＦ１Ｂ（配列番号１４）を使用した。ＥＣ識別プライマーとしてＥＣ１Ｔ（配列番号１７）およびＥＣ１Ｂ（配列番号１８）を使用した。
【００９７】
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒、６８℃で３分間の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持して１回目のＰＣＲ反応を終了した。
【００９８】
２回目のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）は、上記組成のＰＣＲ関連試薬の入ったＰＣＲチューブに、１回目のＰＣＲ反応液１μＬを加えて行った。２回目のＰＣＲ反応には以下のプライマーを使用した。
ＳＡ識別プライマー
ＳＡ３Ｔ：５’−ＡＣＴＧＴＴＣＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧ−３’（配列番号２１）
ＳＡ３Ｂ：５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２２）
ＳＥ識別プライマー
ＳＥ３Ｔ：５’−ＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２３）
ＳＥ３Ｂ：５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＡＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２４）
ＰＡ識別プライマー
ＰＡ３Ｔ：５’−ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧ−３’（配列番号２５）
ＰＡ３Ｂ：５’−ＴＧＧＴＧＧＡＧＣＧＴＴＣＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＧ−３’（配列番号２６）
ＥＦ識別プライマー
ＥＦ３Ｔ：５’−ＡＴＣＡＧＧＣＧＴＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＴＴＧ−３’（配列番号２７）
ＥＦ３Ｂ：５’−ＴＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号２８）
ＥＣ識別プライマー
ＥＣ３Ｔ：５’−ＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号２９）
ＥＣ３Ｂ：５’−ＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＡＡＣＡＴＴＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号３０）
サーマルサイクラーは１回目と同様にＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒、６８℃で１分間の反応サイクルを３０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持して２回目のＰＣＲ反応を終了した。
【００９９】
〔判定工程〕
１％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。使用したプライマーに対応した各細菌を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、標的核酸が増幅されていることを確認した（ポジティブ・コントロール）。また、試料をスメアーしない状態でＰＣＲ反応を行い、標的核酸が非特異的に増幅していないことを確認した（ネガティブ・コントロール）。
【０１００】
〔結果〕
電気泳動の結果を図３に示した。図中の左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図３から明らかなように、レーン１３およびレーン１５に特異的な核酸の増幅が認められるため、この臨床検体はＳＡ（黄色ブドウ球菌）およびＰＡ（緑膿菌）に感染している（陽性）と判定した。
【０１０１】
なお、この臨床検体（臨床検体１）を含めて４例の臨床検体について、上記と同一の方法で起因菌を判定した結果を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
表１から明らかなように、本発明の核酸検出方法は、敗血症患者の起因菌の判定に有効であることが示された。
【０１０３】
＜実施例３．敗血症血液モデルからの生体因子（ＲＮＡ）の検出＞
〔敗血症血液モデルの調製〕
予め外来微生物（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、以下ＥＣ）ＡＴＣＣ１１７７５）をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培養液（ＤＩＦＣＯ）に植菌し、３７℃で８時間以上培養した。培養した菌液を４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。上清を捨てた後、菌のペレットをＰＢＳ５ｍＬを用いて懸濁し、再度４℃、２０００×ｇで１０分間遠心分離して集菌した。集菌した菌をＰＢＳ５ｍＬで懸濁した後、ＰＢＳにて希釈して吸光度計により菌液の濁度（ＯＤ＝６００ｎｍ）を、０．１〜０．１５に調整したものを５ｍＬ作製した。ヘパリン加健常ヒト血液８ｍＬを採取し、１５ｍＬの遠沈管２本に４ｍＬずつ分注した。ヘパリン加血液４ｍＬに作製した菌液及びＰＢＳを４００μＬ加え、３７℃で３時間静置し、炎症性サイトカインの発現を誘導した。
【０１０４】
上記ヘパリン加血液に血液分離試薬（塩化ナトリウム２２５ｍｇ、デキストラン（ＭＷ２００，０００〜３００，０００）１．５ｇを滅菌精製水で溶解し、２５ｍＬにメスアップしたもの）を約４：１の割合で加え、３７℃（２０〜４０℃）で３０分間静置し、白血球画分を分取した。４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球中に赤血球の混入が認められる場合には、滅菌精製水１ｍＬにて白血球の沈さを穏やかに懸濁して溶血させた後、ＰＢＳ１４ｍＬを加えて等張化した後、再度４℃にて１４０〜１８０×ｇで１０分間遠心分離し、白血球を収集した。収集した白血球をＰＢＳ１５０μＬに懸濁した。これを敗血症血液モデルとし、試料とした。
【０１０５】
〔試料の固定化〕
上記試料を支持体として用いたＴｏｐＹｉｅｌｄ ｓｔｒｉｐｓ（ＮＵＮＣ：２４８９０９）の各ウェルにそれぞれ５μＬずつスメアーし、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて７０℃で風乾した。各ウェルに１００μＬの７５％エタノールを注ぎ５分間固定および脱塩した。その後、７５％エタノールを廃棄し、サーマルサイクラーを用いて４２℃で風乾した。
【０１０６】
〔試料の前処理〕
各ウェルにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅＩ，ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）０．１単位／μＬ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、滅菌蒸留水）１０μＬを入れ、サーマルサイクラーを用いて３７℃にて１０分処理し白血球ゲノムＤＮＡを分解した後、７０℃にて１０分間処理し酵素の失活およびウェルを風乾させた。
【０１０７】
ただし、仔牛胸腺ＤＮＡを基質として、２５℃、ｐＨ５．０において反応液の２６０ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素活性を１単位とした。
【０１０８】
〔核酸増幅工程〕
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を行った。まず、逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を行った。逆転写反応にはスーパースクリプトファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。試料が固定化されたウェルにＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（０．５μｇ／μＬ）：１μＬと滅菌蒸留水：９μＬとを加え７０℃で１０分間処理後、４℃にて１分間静置した。次に１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ］：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ：１μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ：２μＬを加えて２５℃にて５分間静置した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ：１μＬ（５０ｕｎｉｔｓ）を加えて２５℃にて１０分、４２℃で５０分、７０℃で１５分間処理後、４℃にて５分間静置した。逆転写反応終了後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／μＬ）：１μＬを加え３７℃にて２０分間処理し、ＲＮＡを完全に分解した。
【０１０９】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ関連試薬（１ウェルあたりＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ：０．２μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ：２μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２：２μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）：３．２μＬ、ＩＬ６識別プライマー：各０．１６μＭ、滅菌精製水で１８μＬに調整した）の入ったＰＣＲチューブに、逆転写反応液２μＬを加えて行った。
【０１１０】
なお、ＰＣＲ反応には以下のインターロイキン６（ＩＬ６）用プライマーを使用した。
ＩＬ６識別プライマー
ＩＬ６−Ｔ：５’−ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧ−３’（配列番号３１）
ＩＬ６−Ｂ：５’−ＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴ−３’（配列番号３２）
サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｅｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、９４℃で１分間保持した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応サイクルを５０サイクル繰り返し、７２℃で５分保持してＰＣＲ反応を終了した。
【０１１１】
〔判定工程〕
２％アガロースゲル電気泳動（アガロース：Ａｇａｒｏｓｅ−ＲＥ ｆｏｒ≧１Ｋｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｆｏｒ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ））により、増幅したＰＣＲ産物を分離し、エチジウム・ブロマイドにより染色した。電気泳動で特異的バンドが得られることにより、標的核酸が増幅されていることを確認した。
【０１１２】
〔結果〕
電気泳動の結果を図４に示した。図中の左端の数値は分子量（ｂｐ）を示している。図４から明らかなように、レーン３にＩＬ６由来の特異的な核酸の増幅が観察されるため、大腸菌に感染した血液でのＩＬ６の発現上昇が、本発明の核酸検出方法により検出可能であることが証明された。
【０１１３】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明に係る核酸検出方法は、細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、増幅された核酸を検出する核酸検出工程とを含むものであり、試料から核酸を抽出する工程を必要としない。したがって、核酸の抽出に起因する核酸のロスがほとんど生じず、試料中に含まれる標的核酸が非常に微量であっても増幅するための鋳型として必要な量の標的核酸が含まれていれば検出することができるという効果を奏し、それに伴い、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、試料から核酸を抽出する工程を必要としないため、操作が簡便となり、結果を得るまでに要する時間を短縮できるという効果を奏する。
【０１１５】
本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定するため、試料溶液中に増幅阻害物質が含まれている場合でも、細胞外に存在する増幅阻害物質は容易に除去することができる。したがって、増幅効率の低下に伴う検出感度の低下を招かないという効果を奏する。
【０１１６】
本発明に係る核酸検出方法は、試料を支持体に固定し、当該支持体上で核酸を増幅するため、試料をＰＣＲチューブ等の別の容器等に移す必要がない。したがって、試料の移動に起因する核酸のロスが生じないため、検出感度の低下を招かないという効果を奏する。また、操作が簡便となり、要する時間を短縮できるという効果を奏する。
【０１１７】
本発明に係る核酸検出方法は、核酸を増幅した後に検出を行うため、検出対象の標的核酸が微量であるために検出が困難であるという問題は生じない。したがって、再現性および検出精度が向上するという効果を奏する。また、検出方法に特別な工夫を必要としないため、公知の検出方法を適宜選択して用いることができるという効果を奏する。さらに、結果の判定に熟練を必要としないという効果を奏する。
【０１１８】
本発明に係る遺伝子検出キットは、本発明に係る核酸検出方法を用いて試料中の標的遺伝子を検出するためのキットである。したがって、当該キットを用いることにより、本発明に係る核酸検出方法を非常に簡便かつ迅速に実施することができるという効果を奏する。
【０１１９】
以上のように本発明は、従来の遺伝子診断と言われる分野すべてに適用可能である。したがって、本発明は医療、製薬、試薬分野をはじめ、広く生物関連産業に利用することができる。特に、本発明を医療分野における臨床検査で利用することにより、的確な治療方針の選択に貢献できる。また、生物関連分野の基礎研究に利用することができ、生物学の発展に大いに貢献することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、
試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、
増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか１の方法、あるいは２以上の方法を組み合わせて用いることを特徴とする請求項２に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする請求項５に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする請求項５に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
上記試料は生体由来試料であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする請求項９に記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【請求項１３】
上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１４】
上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である請求項１３に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１５】
上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である請求項１３に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１６】
上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１７】
上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１８】
少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、標識デオキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１】
細胞を含む試料を支持体に固定する試料固定化工程と、
試料中の核酸を支持体上で増幅する核酸増幅工程と、
増幅された核酸が標的の核酸であるか否かを判定する判定工程とを含むことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
上記核酸増幅工程の前段に、試料に含まれる核酸を露出させる核酸露出工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
上記核酸露出工程における核酸露出方法として、界面活性剤処理法、酵素処理法または加熱処理法のいずれか１の方法、あるいは２以上の方法を組み合わせて用いることを特徴とする請求項２に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
上記核酸増幅工程における核酸増幅方法として、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
上記核酸増幅工程において増幅された核酸を標識することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、当該プローブと既知の遺伝子断片との相補的なハイブリダイゼーションを指標として標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする請求項５に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
上記既知の遺伝子断片は、あらかじめ支持体に固定されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸検出方法。
【請求項８】
上記判定工程における判定方法として、核酸増幅工程で増幅かつ標識された核酸をプローブとし、ＤＮＡマイクロアレイを用いて標的の核酸であるか否かを判定することを特徴とする請求項５に記載の核酸検出方法。
【請求項９】
上記試料は生体由来試料であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項に記載の核酸検出方法。
【請求項１０】
上記生体由来試料はヒト由来であることを特徴とする請求項９に記載の核酸検出方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、試料中の標的遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸検出方法を実施するためのキットであって、ヒトの疾病関連遺伝子を検出するために使用する遺伝子検出キット。
【請求項１３】
上記ヒトの疾患関連遺伝子はヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１４】
上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤耐性遺伝子である請求項１３に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１５】
上記ヒトに感染した感染症原因微生物の遺伝子は薬剤感受性遺伝子である請求項１３に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１６】
上記ヒトの疾患関連遺伝子は癌マーカー遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１７】
上記ヒトの疾患関連遺伝子は遺伝性疾患関連遺伝子である請求項１２に記載の遺伝子検出キット。
【請求項１８】
少なくとも、標的遺伝子増幅プライマー、ＰＣＲ反応用緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液、標識デオキシヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、試料固定化用支持体、増幅核酸検出用指示薬を含むことを特徴とする請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載の遺伝子検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６８０
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１７７９０（Ｐ２００５−５１７７９０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１８４０
【国際出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（０００２３８２０１）扶桑薬品工業株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００１８４０
【国際出願日】平成１７年２月８日（２００５．２．８）
【出願人】（０００２３８２０１）扶桑薬品工業株式会社 (42)
【Ｆターム（参考）】
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