核酸複合体の調製方法及び核酸複合体、並びに遺伝子導入剤溶液
【課題】超高分子量ポリマーからなる遺伝子導入剤と同等以上の遺伝子導入活性を発現させることができる細胞低分子量ポリマーの核酸複合体の調製。
【解決手段】遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する。該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とする。
（Ｒ１，Ｒ２は、アルキル基、Ｒ３は、アルキレン基、Ｒ４は、水素原子又はメチル基）
【解決手段】遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する。該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とする。
（Ｒ１，Ｒ２は、アルキル基、Ｒ３は、アルキレン基、Ｒ４は、水素原子又はメチル基）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸複合体の調製方法と、この核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体に関する。本発明はまた、この核酸複合体の調製に有用な遺伝子導入剤溶液と遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現やｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどによる発現抑制、阻害を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡやＲＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発され、例えば、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合したポリマーからなる遺伝子導入剤が報告されている（非特許文献１，２）。
【０００４】
前記非特許文献１では、前記ポリマーのうち、分子量が６万以下であるポリマーは遺伝子導入剤としての活性を示さないが、分子量が３０万以上であるポリマーは高い遺伝子導入活性を示すことが報告されている。また、非特許文献２では、分子量が２０万を超えるポリマーは試験管内で高い遺伝子導入活性を示すが、このような分子量の大きなポリマーは細胞に大きなダメージを与えることが報告されている。
【０００５】
このように、カチオン性ポリマーを用いた遺伝子導入剤にあっては、高分子量側で高い遺伝子導入活性を示す一方で、細胞毒性が高いことが知られている。
【０００６】
本出願人らは、高分子量のポリマーからなる遺伝子導入剤が有する問題を回避する方法として、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むポリマー材料を遺伝子導入剤とし、この遺伝子導入剤と核酸とを低級アルコールを含む混合系内で複合化させる核酸複合体の調製方法を提案した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１３６６３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wetering,P,,Cherng,J.Y.,Talsma,H.,Crommelin,D.J.,Hennink,W.E.,(1998),J Control Release 53,145-153
【非特許文献２】Layman,J.,Ramirez,S.,Green,M.,Long,T.,(2009),Biomacromolecules 10,1244-1252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記非特許文献１，２で報告されている２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーからなる遺伝子導入剤は、カチオン性ポリマーであるが、ｐＫａが７程度であるため、細胞培養環境である中性条件下ではほとんど電荷を持っていない。このため、核酸の凝集力が低く、３０万以上の超高分子量体でなければ遺伝子導入剤として機能しない。しかし、前述の如く、高分子量のポリマーよりなる遺伝子導入剤は細胞毒性が高く、分解、代謝、排泄等の面において不利であることから、生体内使用には不適当で、医薬品としての実用化が困難である。
また、イオン性のモノマーである２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合して３０万以上の超高分子量体とすることは難しく、サイズ排除カラムを使用した分子量分画や、ポリマー同士の架橋反応により高分子量化を図る方法では多くの時間と労力を必要とする。
【００１０】
特許文献１では、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなる低ｐＫａのポリマーを分岐鎖に有する遺伝子導入剤と核酸とを、低級アルコールの存在下で混合し、このアルコールにより、前記ポリマーの主鎖と側鎖のジメチルアミノ基との擬似的な結合（水素結合）を解離させ、核酸を包接するのに十分な塩基性を前記ポリマーに発現させているため、低分子量のポリマーよりなる遺伝子導入剤に核酸を効率的に複合化させることが可能である。しかしながら、この核酸複合体の調製方法では、アルコールを多量に必要とするため、細胞分化等に対する影響の面からアルコール使用量の低減が望まれる。
【００１１】
本発明は上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、低分子量のポリマーであっても、超高分子量のポリマーからなる遺伝子導入剤と同等、もしくはそれ以上の遺伝子導入活性を発現させることができると共に、細胞に対する影響の少ない核酸複合体の調製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、核酸複合体の調製に有用な遺伝子導入剤溶液及び遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねる過程で、イオン性の低い、特定の含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体をアルコールに溶解させたところ、アルコール溶液中において、このポリマー同士が会合した大粒径の会合体としてブラウン運動をすること；この会合体は高分子量のポリマーと同様の挙動を示すこと；を発見し、この会合体を遺伝子導入剤として用いることを試みた。しかしながら、アルコール溶液中でイオン性の低いポリマー分子同士の会合体を形成させても、このアルコール溶液をＴＥ緩衝溶液などの核酸水溶液に滴下すると、会合体と核酸とが複合化する前に会合体が水分子の水和により解離し、再び低分子量で粒径の小さいポリマー単量体として存在するようになるため、所期の遺伝子導入活性を得ることはできなかった。
【００１３】
そこで、本発明者らは、このポリマー会合体と核酸とを複合化させる方法について検討を重ねた結果、このポリマーを特定濃度でアルコールに溶解させると、含窒素化合物重合体の側鎖にアルコールが溶媒和し、安定なポリマーの会合体を形成すること；この会合体を含むアルコール溶液を核酸水溶液に添加しても、この会合体は溶液中ですぐに解離せず、解離する前に会合体の状態で核酸と複合体を形成し、超高分子量のポリマー分子からなる遺伝子導入剤と同等以上の核酸包接能で優れた遺伝子導入活性を示すこと；この会合体は、遺伝子導入後は生体内で徐々に解離して低分子量の含窒素化合物重合体として存在するようになるため、分解、代謝、排泄性等に優れ、細胞に与える影響も小さいこと；を見出した。
【００１４】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１５】
本発明（請求項１）の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とするものである。
【００１６】
【化１】
【００１７】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００１８】
請求項２の核酸複合体の調製方法は、請求項１において、前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項３の核酸複合体の調製方法は、請求項２において、前記アルコールは、エタノールであることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項４の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記第２の溶液の核酸の濃度が１５〜４５μｇ／ｍＬであることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項５の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように前記第１の溶液と第２の溶液とを混合することを特徴とするものである。
【００２２】
請求項６の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることを特徴とするものである。
【００２３】
請求項７の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項８の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基であることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項９の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記含窒素モノマーが、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１０の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体の分子量が１０，０００〜１５０，０００であることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸複合体の調製方法により調製されたものである。
【００２８】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなるものである。
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００３１】
本発明（請求項１３）の核酸複合体は、請求項１２に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものである。
【００３２】
本発明（請求項１４）の遺伝子導入剤溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液よりなることを特徴とするものである。
【００３３】
【化３】
【００３４】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【発明の効果】
【００３５】
前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を特定の濃度で含むアルコール溶液（第１の溶液）と、核酸を含む溶液（第２の溶液）とを混合する本発明の核酸複合体の調製方法では、第１の溶液中において、低分子量の含窒素化合物重合体同士が会合し、見かけ上、大粒径の高分子量重合体として存在するため、この会合体を第２の溶液に付与することにより、核酸と速やかに複合体を形成し、超高分子量の重合体からなる遺伝子導入剤と同等もしくはそれ以上の遺伝子導入活性を発現させることができる。
【００３６】
即ち、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体は、ジアルキル３級アミノ基を側鎖に有するアミン系ポリマーであるが、ｐＫａはほぼ中性であり、極めて弱いイオン性ポリマーである。このため、このイオン性が低いポリマーをアルコールに溶解させるとポリマー分子同士が会合して大きな粒子を形成しながらブラウン運動する。この会合体は、１つの超高分子量のポリマーと同様の挙動を示し、超高分子量のポリマーと同程度の量の核酸を包接することが可能であるため、高い遺伝子導入活性を示す。
【００３７】
しかして、形成された核酸複合体は、生体内に導入された後、血液等の水に希釈されることによって、ポリマー会合体が解離し、細胞に与える影響の小さい低分子量の分子に戻る。
【００３８】
このように、本発明によれば、比較的低分子量のポリマーを遺伝子導入時には超高分子量のポリマーとして機能させ、遺伝子導入後は分解、代謝、排泄に有利な低分子量のポリマーに復元させることができ、遺伝子導入剤として超高分子量ポリマーを用いる場合の合成の煩雑さ、細胞毒性の問題を排除した上で、高い遺伝子導入活性を得ることができる。
【００３９】
しかも、ポリマーを会合させるために用いるアルコール使用量も少量で足り、アルコールの多量投与の問題もない。
【００４０】
前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることが好ましく（請求項２）、特に、エタノールであることが好ましい（請求項３）。前記のアルコールを用いると、含窒素化合物重合体の会合体がより一層安定にアルコール溶液中で存在する。
【００４１】
前記第２の溶液の核酸の濃度は、１５〜４５μｇ／ｍＬであることが好ましい（請求項４）。核酸の濃度がこの範囲内であれば、細胞への核酸導入量を適正量とした上で第１の溶液と第２の溶液とを混合した際の会合体の希釈による解離を防止することができる。
【００４２】
前記第１の溶液と第２の溶液とは、前記含窒素化合物重合体と核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように混合することが好ましい（請求項５）。含窒素化合物重合体と核酸とのイオンモル比が前記範囲内であれば、含窒素化合物重合体の会合体と核酸とが速やかに複合体を形成する。
【００４３】
前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることが好ましい（請求項６）。アルキレン基の炭素数が前記範囲内である含窒素モノマーは、光照射により容易にラジカルを生成するため、このラジカルを利用して短時間で含窒素化合物重合体を製造することができる。
【００４４】
前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなる重合体よりなることが好ましく（請求項７）、前記含窒素モノマーとしては、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３が、メチレン基、又はエチレン基であることが好ましい（請求項８）。前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基である場合は、血清中での遺伝子導入活性より向上する。含窒素モノマー（Ｉ）としては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることが好ましい（請求項９）。
【００４５】
前記含窒素化合物の分子量としては１０，０００〜１５０，０００であることが好ましい（請求項１０）。分子量が前記範囲内であると、含窒素化合物重合体同士が会合し易くなり、核酸を効果的に凝集することができ、結果として遺伝子導入効率が向上する。また、分子量が前記範囲内であれば、細胞毒性を低く抑えることが可能である。
【００４６】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤は、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなり、本発明（請求項１１）の核酸複合体は、本発明の核酸複合体の調製方法により調製されたものであり、また、本発明（請求項１３）の核酸複合体は、本発明の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものであり、本発明の遺伝子導入剤及び核酸複合体によれば、細胞に対する影響を抑えて遺伝子を効率的に導入することができ、また、遺伝子導入後の分解、代謝、排泄性に優れる。
【００４７】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤溶液は、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液であり、本発明の核酸複合体の調製に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】各種濃度のＴＥ緩衝溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径分布を示すグラフである。
【図２】各種濃度の生理食塩水中の含窒素化合物重合体の粒子径分布を示すグラフである。
【図３】実施例及び比較例の核酸複合体の遺伝子導入活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
以下においては、まず、本発明の遺伝子導入剤溶液及び核酸複合体の調製方法について説明し、次いで本発明に用いる含窒素化合物重合体及び遺伝子導入剤について詳述する。
【００５０】
［遺伝子導入剤溶液及び核酸複合体の調製方法］
本発明の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、該第１の溶液が、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とするものである。
【００５１】
【化４】
【００５２】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００５３】
本発明に係る核酸複合体の調製方法では、前記含窒素化合物重合体を特定の濃度となるようにアルコールに溶解させた本発明の遺伝子導入剤溶液を用いる。前記含窒素化合物重合体を特定の濃度でアルコールに溶解させると、含窒素化合物重合体同士が会合し、超高分子量体と同様の特性を示すようになる。従って、低分子量の含窒素化合物重合体であっても、超高分子量体と同程度の核酸を包接することができるようになり、高い遺伝子導入活性を示すようになる。また、前記会合体は、血液などの水溶液中において徐々に解離し、低分子量の含窒素化合物重合体の単量体として存在するようになるため、分解、排出、代謝性の面で有利であり、細胞に与える悪影響も非常に小さい。また、本発明においては、アルコールの使用量を少なくすることができるため、アルコールによる細胞への影響を低減することもできる。
【００５４】
前記含窒素化合物重合体を溶解させるアルコールとしては、含窒素化合物重合体の会合体の安定性の面で、炭素数が１〜５の低級アルコールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。溶媒としてエタノールを用いた場合には、細胞に与える影響をさらに低減させることができる。
【００５５】
前記含窒素化合物重合体を含む第１の溶液、即ち本発明の遺伝子導入剤溶液中の前記含窒素化合物重合体の濃度は、３〜５０μｇ／μＬ、好ましくは５〜１５μｇ／μＬである。含窒素化合物重合体の濃度が上記下限値以上であることにより、アルコール溶液中で安定な会合体を形成することができ、第２の溶液と混合する際も、含窒素化合物重合体が解離しにくく、安定な核酸複合体を形成することができる。また、このように比較的高濃度のアルコール溶液とすることにより、アルコールの使用量の低減を図ることができる。含窒素化合物重合体の濃度が上記上限値以下であることにより、適度な粒径の会合体を形成させて、これを用いて得られる核酸複合体を細胞に導入し易くすることができる。
【００５６】
一方、核酸を含む第２の溶液の核酸の濃度は１５〜４５μｇ／ｍＬ、特に、２５〜３５μｇ／ｍＬであることが好ましい。核酸の濃度が上記下限値以上であることにより、第１の溶液と第２の溶液との混合溶液の溶媒量を抑えて、希釈による前記含窒素化合物重合体同士の会合体の解離を防止することができる。また、核酸の濃度が上記上限値以下であることにより、核酸の使用量を過度に多くすることなく、細胞への核酸導入量を適正値とすることができる。即ち、細胞への核酸の導入量は、通常、細胞５万個当たり０．５μｇ程度であるため、この第２の溶液の核酸濃度は、適正量の核酸導入量となるように制御される。この第２の溶液の溶媒としては、水が好ましい。
【００５７】
なお、第１の溶液と第２の溶液との混合方法には特に制限はないが、遺伝子導入剤の溶液（第１の溶液）を核酸の溶液（第２の溶液）に滴下して混合することが、前記会合体が解離する前に核酸と速やかに複合体を形成させる点において好ましい。
【００５８】
前記第１の溶液と前記第２の溶液とは、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０程度、特に３０〜６０程度になるように混合することが好ましい。本明細書において、ＮＰ比とは、含窒素モノマーの３級アミン官能基のモル数（含窒素化合物重合体中のモノマーのモル数に相当する。）（Ｎ）／核酸のリン酸残基のモル数（Ｐ）を指す。この比を用いて混合比を計算するのは、含窒素化合物重合体中のカチオンの電荷量が、含窒素化合物重合体の重量と分子構造に依存しているためであり、また、核酸中のアニオン電荷量が、核酸の重量と塩基対数や核酸種に依存しているためである。
【００５９】
［含窒素化合物重合体、及びその製造方法］
本発明において用いる含窒素化合物重合体は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマー（以下「含窒素モノマー（Ｉ）」と称す場合がある。）を重合してなるものである。
【００６０】
【化５】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００６１】
含窒素モノマー（Ｉ）は、一般式（Ｉ）におけるＲ３がアルキレン基、又はエチレン基の場合にｐＫａの値が中性であり、加水分解されにくいという性質、及び温度の変化により化合物の性質が変化（特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなどで確認されている温度変化によって脱溶媒和してグロビュール化するなどの変化）しにくいという性質を備えている。従って、この含窒素モノマー（Ｉ）を重合してなる含窒素化合物重合体は、それ自体高い遺伝子導入活性を示す。
【００６２】
一般式（Ｉ）中のＲ３は、炭素数１〜１０、特に炭素数１〜２のアルキレン基であることが好ましく、このようなアルキレン基であればｐＫａがほぼ中性領域となり、血清中のアニオン性タンパクなどの成分の影響を受けにくくすることが可能となる。また、アミド結合を形成する窒素原子は、水素原子と結合していることが好ましい。水素原子が結合していない場合は、光開裂によるラジカルが生成しにくくなると考えられるからである。炭素数が前記範囲内であれば、光照射による光開裂が生じ易くなり、結果として、短時間で目的とする重合体を得やすくなる。また、一般式（Ｉ）中のＲ１，Ｒ２としては、炭素数１〜５程度のアルキル基が好ましい。
【００６３】
このような含窒素モノマー（Ｉ）としては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドを挙げることができる。なお、本明細書において「（メタ）アクリル」とは「アクリル及び／又はメタクリル」を意味する。
【００６４】
本発明に係る含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）が光照射されると容易にラジカルを生成するという性質を利用して合成することができ、光照射によれば非常に短時間で含窒素化合物重合体を製造することが可能である。
【００６５】
このような含窒素化合物重合体を製造する方法に特に制限はないが、前記含窒素モノマー（Ｉ）を主成分とする反応液に対して、光を照射して含窒素モノマー（Ｉ）を重合させる方法が挙げられる。
【００６６】
以下に、光照射による含窒素化合物重合体の製造手順について説明するが、本発明で用いる含窒素化合物重合体の製造方法は、何ら以下の方法に限定されるものではない。
【００６７】
含窒素モノマー（Ｉ）の重合反応は、反応液中に含窒素モノマー（Ｉ）が含まれていれば、含窒素モノマー（Ｉ）以外の重合反応に関与しない化合物、例えば、溶媒の存在下で反応を行ってもよいが、重合反応に関与しない化合物を用いずに、実質的に含窒素モノマー（Ｉ）のみからなる反応液で重合を行うことが好ましい。これは、前記化合物が、重合反応に直接的に関与しない場合であっても、生成したラジカルを吸収し、重合反応の反応速度を低下させる場合があるためである。溶媒等の重合反応に関与しない化合物の存在下で反応を行う場合に用いることができる当該重合反応に関与しない化合物としては、含窒素モノマー（Ｉ）の光開裂を阻害するラジカルスカベンジャーや、重合反応自体を阻害する連鎖移動剤などでなければどのようなものであってもよく、例えば、ベンゼン、トルエンなどの無極性溶媒を挙げることができる。このような重合反応に影響を与えないものを溶媒として用いた場合、反応液全体の粘度が低下するため撹拌効率を向上させることが可能であり、また、反応終了後、目的とする重合体の回収が容易になる。
【００６８】
溶媒等の重合反応に関与しない化合物を用いる場合、その使用量は反応液中の含有量として２０重量％以下であることが好ましい。なお、溶媒等の重合反応に関与しない化合物の存在下で反応を行う場合には、重合収率や得られる重合体の分子量が低下する場合があるため、製造プロセスの生産能力や製造目的などに応じて、用いる化合物の種類や使用量を適宜選択することが好ましい。ただし、反応後、溶媒などの重合反応に関与しない化合物を除去する工程などを考慮すると、前記化合物を用いずに反応を行うことが好ましい。なお、この重合反応においては、含窒素モノマー（Ｉ）が、モノマーとしての役割だけでなく、重合開始剤としての役割も担っている。従って、前述のイニファターやＡＩＢＮなどの重合開始剤を別途用いることなく、複雑な枝葉の多い構造の高分子を合成することができる。
【００６９】
前記溶媒を用いる場合、反応液に含まれる含窒素モノマー（Ｉ）の濃度は、８０重量％以上、特に９０重量％以上であることが好ましい。
【００７０】
なお、本発明に係る含窒素化合物重合体は、１種の含窒素モノマー（Ｉ）からなる分岐型重合体であってもよいが、２種以上の含窒素モノマー（Ｉ）からなってもよく、さらには、含窒素モノマー（Ｉ）と含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーを含む分岐型重合体であってもよい。
【００７１】
含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーを含む含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）と含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーとを含む反応液に対して光照射を行うことにより製造することができるが、この場合においても、含窒素モノマー（Ｉ）が８０重量％以上になるように反応液を調製することが好ましい。この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられる。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７２】
ただし、本発明で用いる含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）による前述の効果を有効に得る上で、含窒素モノマー（Ｉ）のみを重合してなるものであることが好ましい。
【００７３】
反応液に対して照射する光としては、単色光であっても、混合光であってもよいが、本発明者らが、照射光の波長と重合反応性との関係について検討を重ねたところ、特定の波長の光を照射することにより前記含窒素モノマー（Ｉ）を効率的に重合させることができることを見出した。即ち、３９０ｎｍを超える長波長の光を照射した場合には、反応が進行しなかったり、反応速度が極端に低下するため生産効率が低くなる。これは３９０ｎｍを超える長波長の光が、前記含窒素モノマー（Ｉ）の側鎖のラジカル解裂を効率よく起こすだけのエネルギーを有していないか、前記光のエネルギーが量子化された励起バンドと大きく異なるなどの理由が考えられる。また、２９０ｎｍ未満の短波長の光を照射した場合にも、重合物はほとんど得られないか、又は重合容器の光の入射面で不溶性のフィルムが形成されるのみである。これは、含窒素モノマー（Ｉ）分子が２９０ｎｍ未満のＵＶを吸収する性質を有しており、照射光が反応液内に十分に到達せず、重合反応に寄与する側鎖の光開裂が起こらないためであると考えられる。従って、反応液に対して照射する光の波長は、２９０〜３９０ｎｍ程度、特に３００〜３２０ｎｍ程度、とりわけ３１０ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯、ブラックライトなどを用いることができる。光の照射強度としては、反応容器のスケールや、照射強度に依存するが０．０１〜５０．０ｍＷ／ｃｍ２程度、特に０．１〜１０．０ｍＷ／ｃｍ２程度好ましい。照射強度が高いと、反応を制御しにくくなるおそれがあるため好ましくない。また、照射強度が低いと、重合時間が徒に長くなるため効率的ではない。
【００７４】
光の照射時間としては、反応容器のスケールや照射強度に依存するが１０秒〜１４４０分、特に１分〜３６０分、とりわけ３〜６０分程度が好ましい。この含窒素化合物重合体の製造方法であれば、このような短時間の光照射でも、含窒素化合物重合体を容易に製造することができる。
【００７５】
この光照射により、反応液中に目的とする含窒素化合物重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、含窒素化合物重合体を得ることができる。
【００７６】
このようにして得られる含窒素化合物重合体の分子量としては、１０，０００〜１５０，０００程度、特に１５,０００〜１００，０００程度が好ましい。分子量が上記下限値以上であることにより、これを会合させて、超高分子量の会合体を形成することにより、高い遺伝子導入活性を得ることができる。一方、分子量が上記上限値以下であることにより、細胞に対する影響を抑えることができ、排出性の問題からも好ましい。特に、本発明では、含窒素化合物重合体の会合体を形成させてこれを遺伝子導入剤とするため、含窒素化合物重合体自体の分子量はさほど大きくなくても高い遺伝子導入活性を得ることができるという利点がある。
【００７７】
含窒素化合物重合体の分子量は、含窒素化合物重合体の重合反応における光照射の時間、及び反応液に含まれる含窒素モノマー（Ｉ）の濃度を制御することにより調整することができる。即ち、照射時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい含窒素化合物重合体を得ることができる。また、この他にも光開裂反応の量子化エネルギーを考慮して、照射する光の波長を選択することでも反応を制御することができる。
【００７８】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００７９】
［遺伝子導入剤］
本発明において用いる遺伝子導入剤は、前記含窒素化合物重合体の会合体よりなるものであり、複数個の含窒素化合物重合体が会合して大粒径の会合体となることにより、高い遺伝子導入活性を示す一方で、遺伝子導入後においては生体内で解離して元の含窒素化合物重合体に戻るという特異的な挙動を示す。
【００８０】
なお、含窒素化合物重合体を構成する含窒素モノマー（Ｉ）は、前述の如く、一般式（Ｉ）におけるＲ３がアルキレン基、又はエチレン基の場合にｐＫａの値が中性であり、加水分解されにくいという性質、及び温度の変化により化合物の性質が変化（特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなどで確認されている温度変化によって脱溶媒和してグロビュール化するなどの変化）しにくいという性質を備えている。従って、この含窒素モノマー（Ｉ）を重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなる本発明の遺伝子導入剤は、血清を含む培地においても、アニオン性のタンパクや脂質の影響を受けずに高い遺伝子導入活性を示す。
【００８１】
本発明に係る含窒素化合物重合体を本発明において規定する濃度のアルコール溶液とした場合において、前記アルコール溶液中で形成される含窒素化合物重合体の会合体である本発明の遺伝子導入剤の粒子径は、５０〜５００ｎｍ程度、特に１００〜３００ｎｍ程度であることが好ましい。この会合体の粒子径が上記下限値より大きいことにより、核酸を十分に包接することができ、高い遺伝子導入活性を得ることができる。また、粒子径が上記上限値以下であることにより、細胞に取り込まれ易くなる。含窒素化合物重合体の粒径は、例えば、前述の含窒素化合物重合体のアルコール溶液中の含窒素化合物重合体の濃度を調整することにより、制御することができ、高濃度の溶液ほど多くの含窒素化合物重合体を会合させて粒径の大きい会合体とすることができる。
【００８２】
［核酸複合体］
本発明の核酸複合体は、上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）と核酸とが複合化したものであり、前記本発明の遺伝子導入剤溶液を用いる本発明の核酸複合体の調製方法により調製することができ、含窒素化合物重合体の会合体である本発明の遺伝子導入剤が核酸を包接することにより、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００８３】
本発明に係る含窒素化合物重合体の会合体と核酸との複合体の粒子径は、１５０〜５００ｎｍ、特に２００〜４００ｎｍ、とりわけ２５０〜３５０ｎｍが好ましい。粒子径が上記上限値以下であることにより、細胞内に取り込まれやすくなり、生体内使用の場合、血管梗塞などを防止することができる。また、粒子径が上記下限値以上であることにより、核酸複合体内部の核酸に酵素の作用がおよぶことを防止することができ、この粒子径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法、透過型電子顕微鏡、または電子間力顕微鏡によって測定される。
【００８４】
核酸の好ましい例としては、各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイや単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００８５】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８７】
［遺伝子導入方法］
核酸複合体と細胞とを、例えば血清存在下で接触させることにより細胞に遺伝子を導入することができる。核酸複合体と細胞とを血清存在下で接触させることにより、細胞に負担をかけることなく核酸を細胞に移行させることができる。
【００８８】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、神経細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００８９】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００９０】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００９１】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００９２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００９３】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００９４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９５】
（１） 含窒素化合物重合体の合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド５．０ｇを１０ｍＬ石英管に採取した。高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量：２Ｌ／分）で８分間パージした後、窒素を封入して密栓した。３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製：ＭＡＸ−３０１）で３７０ｎｍの紫外線を９分間照射した。照射強度は、ウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５を装着して０．０４ｍＷ／ｃｍ２に調整した。照射中は、攪拌操作を一切行わなかった。モノマーは、完全にガラス状に固化していた。この反応により得られた固体は無色透明、無臭であり、スパチュラの刺入が困難又は不可能な硬度を有していた。この固体上にマイクロ回転子を乗せ、逆浸透膜により濾過した水（ＲＯ水）を３ｍＬを加えて２４時間攪拌したところ、固体は全て溶解して高粘度の溶液となった。この溶液を回収し、分画分子量（１５ｋＤａ）の透析チューブへ移し、ＲＯ水で７２時間透析することにより低分子量成分を除去し、得られた溶液を０．２μｍフィルターで濾過した後に、液体窒素で４８時間の凍結乾燥を行い、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマーの粉末を得た（重合収率７．５％）。
得られた重合体の分子量をＧＰＣにより測定したところ、３７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．７）であった。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．１ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，ＣＨ３），δ１．９ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２Ｃ），δ２．４ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），δ２．６ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），δ２．９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２）であった。
【００９６】
（２） 含窒素化合物重合体の粒子径の測定（参考例１〜３）
前記（１）において合成した含窒素化合物重合体（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマー）を遺伝子導入剤として使用する際に導入効率が良いとされる濃度の溶液を調製し、溶液中での粒子径を静的光散乱装置（ＳＹＳＭＥＸ社：Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ−Ｎａｎｏ）を使用して測定した。
【００９７】
＜参考例１＞
前記含窒素化合物重合体を、濃度がそれぞれ０．１２μｇ／μＬ（「１０倍希釈液」と称す。）、１．２μｇ／μＬ（「原液」と称す。）、６．０μｇ／μＬ（「５倍濃度液」と称す。）、１２μｇ／μＬ（「１０倍濃度液」と称す。）となるようにＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ トリス・ＨＣＬ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、各溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径を測定した。各溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径はその濃度により若干異なっていたが、いずれも約２０ｎｍ程度の最頻粒子径であった。濃度によって若干の誤差があったのは、光散乱強度、ブラウン運動の規制範囲の変化などの要因が考えられる。前記原液、５倍濃度液、及び１０倍濃度液における含窒素化合物重合体の粒子径分布を図１に示す。
【００９８】
＜参考例２＞
前記含窒素化合物重合体を生理食塩水に溶解させたこと以外は参考例１と同様に含窒素化合物重合体の溶液を調製し、粒子径の測定を行った。いずれの濃度の溶液においても最頻粒子径は約２０ｎｍ程度であった。原液、及び１０倍希釈液における含窒素化合物重合体の粒子径分布を図２に示す。
【００９９】
＜参考例３＞
前記含窒素化合物重合体をエタノールに溶解させたこと以外は参考例１と同様に含窒素化合物重合体の溶液を調製し、粒子径の測定を行った。各溶液の含窒素化合物重合体の粒子径はその濃度によって若干異なっていたが、最頻粒子径は２００〜２１０ｎｍであった。
【０１００】
以上より、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマー（含窒素化合物重合体）は、エタノール溶液中で複数の含窒素化合物重合体同士が会合していること、及びエタノール中の粒子径は、水溶液中の粒子径の１０倍程度であることが分かった。
【０１０１】
（３） 遺伝子導入活性の評価
＜実施例１〜４＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を６万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。ＤＮＡ溶液として、濃度が３３．３μｇ／ｍＬであるＴＥ緩衝溶液を用意した。遺伝子導入剤の溶液としては、前記（１）において合成した含窒素化合物重合体を濃度が６．２μｇ／μＬ（実施例１）、１２．３μｇ／μＬ（実施例２）、２４．６μｇ／μＬ（実施例３）、４９．２μｇ／μＬ（実施例４）となるようにそれぞれエタノールに溶解させたものを用いた。
【０１０２】
前記実施例１の遺伝子導入剤溶液を６０μＬ、実施例２の遺伝子導入剤溶液を３０μＬ、実施例３の遺伝子導入剤溶液を１５μＬ、実施例４の遺伝子導入剤溶液を７．５μＬ採取し、ＤＮＡ溶液９０μＬにそれぞれ滴下して加えた。実施例１〜４では、含窒素化合物重合体中の３級アミン官能基のモル数とＤＮＡリン酸残基のモル数の比（ＮＰ比）が５０となるように調整した。
【０１０３】
なお、含窒素化合物重合体に含まれる３級アミンの官能基のモル数は、含窒素化合物重合体の重量と含窒素モノマー単位の分子量１５７から計算することにより求めることができ、ＤＮＡリン酸残基のモル数は、ＤＮＡ単位と配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０により求めることができる。
【０１０４】
実施例１〜４の遺伝子導入剤溶液をＤＮＡ溶液へ滴下した後１０分間静置し、この混合溶液に完全培地（ＤＭＥＭ培地へ１０％ＦＣＳを添加したもの）を６ｍＬ加えて混合し、培養皿の各Ｗｅｌｌへ１ｍＬづつ分注して４８時間の追加培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセイにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社，アッセイキット試薬）。規格化はタンパク濃度で行い、タンパク濃度の定量は、ＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図３に示す。
【０１０５】
＜比較例１〜４＞
比較例として、前記（１）において合成した含窒素化合物重合体を、エタノールの代りにＴＥ緩衝溶液に各濃度で溶解させたこと以外は、それぞれ前記実施例１〜４と同様の方法で核酸複合体を調製して遺伝子導入活性の評価を行った。結果を図３に示す。
【０１０６】
図３より、実施例１〜４の核酸複合体は、いずれも比較例１〜４の核酸複合体よりも遺伝子導入活性が高いことがわかる。また、ＴＥ緩衝溶液で調製した比較例１〜４は、遺伝子の導入活性が含窒素化合物重合体の濃度に依存していないことが分かる。この結果及び静的光散乱により測定した粒子径の結果から、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマーは、水溶液中において単一分子でブラウン運動をし、水による希釈効果によってもポリマー同士が会合していないと考えられる。
【０１０７】
一方、図３より、実施例１〜４では、遺伝子の導入活性が含窒素化合物重合体の濃度に依存していることがわかる。遺伝子導入剤溶液中の含窒素化合物重合体の濃度が６μｇ／μＬから２４μｇ／μＬまでの間において、濃度が高くなる程遺伝子導入活性が向上したのは、含窒素化合物重合体の溶液がＤＮＡ溶液へ滴下された際に、高濃度の含窒素化合物重合体溶液ほど含窒素化合物重合体の会合体が解離しにくいためであると考えられる。含窒素化合物重合体の濃度が４９．２μｇ／μＬの場合に遺伝子導入活性が若干低下したのは、含窒素化合物重合体の会合体が大きくなり、細胞に取り込まれにくくなったためだと考えられる。
【０１０８】
（４） 特許文献１に記載の重合体の溶液中における粒子径の測定
（４−１） イニファターの合成
１，２，３，４，５，６−ヘキサキスブロモメチルベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中に加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノールに投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫で１５時間冷却して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーによる測定を行い、原料ピークが消失していることを確認することにより、精製物が単一物質であるとことを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，３６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）であった。
【０１０９】
（４−２） ６分岐型重合体の合成
前記（４−１）により合成した１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４６ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。１ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量：２Ｌ／分）で１０分間パージした後、丸管形ブラック蛍光灯（東芝製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の環内の中央部にガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの全周方向から蛍光灯の光を４８時間照射した。溶液は薄い黄色を呈していた。得られた溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させた。ｎ−ヘキサンをデカンテーションした後、沈殿物をクロロホルムに溶解し、エバポレーターで乾固させてフラスコ中で薄いフィルムを形成させた。ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（５０／５０）の混合溶媒で洗浄して精製した。得られた６分岐型重合体の分子量をポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより測定したところ、２１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０）であった。
【０１１０】
（４−３） ６分岐型重合体の溶液中における粒子径の測定
前記操作により得られた６分岐型重合体を参考例１，３と同様の方法でＴＥ緩衝溶液又はエタノールに溶解させて、溶解直後の６分岐型重合体の粒子径を測定したところ、いずれの溶媒においても粒子径は１６ｎｍ程度であった。よって、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートからなる重合体は、エタノール溶液中でも会合する性質が小さく、擬似的に超高分子量化することはできないと考えられる。なお、６分岐型重合体（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートポリマー）は側鎖が水溶液中で加水分解したり、アルコール中でエステル交換反応を起す性質があるため、水溶液中やエタノール溶液中で長期間保存することはできない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸複合体の調製方法と、この核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体に関する。本発明はまた、この核酸複合体の調製に有用な遺伝子導入剤溶液と遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現やｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどによる発現抑制、阻害を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡやＲＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発され、例えば、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合したポリマーからなる遺伝子導入剤が報告されている（非特許文献１，２）。
【０００４】
前記非特許文献１では、前記ポリマーのうち、分子量が６万以下であるポリマーは遺伝子導入剤としての活性を示さないが、分子量が３０万以上であるポリマーは高い遺伝子導入活性を示すことが報告されている。また、非特許文献２では、分子量が２０万を超えるポリマーは試験管内で高い遺伝子導入活性を示すが、このような分子量の大きなポリマーは細胞に大きなダメージを与えることが報告されている。
【０００５】
このように、カチオン性ポリマーを用いた遺伝子導入剤にあっては、高分子量側で高い遺伝子導入活性を示す一方で、細胞毒性が高いことが知られている。
【０００６】
本出願人らは、高分子量のポリマーからなる遺伝子導入剤が有する問題を回避する方法として、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーブロックを含むポリマー材料を遺伝子導入剤とし、この遺伝子導入剤と核酸とを低級アルコールを含む混合系内で複合化させる核酸複合体の調製方法を提案した（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１３６６３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wetering,P,,Cherng,J.Y.,Talsma,H.,Crommelin,D.J.,Hennink,W.E.,(1998),J Control Release 53,145-153
【非特許文献２】Layman,J.,Ramirez,S.,Green,M.,Long,T.,(2009),Biomacromolecules 10,1244-1252
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記非特許文献１，２で報告されている２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートのポリマーからなる遺伝子導入剤は、カチオン性ポリマーであるが、ｐＫａが７程度であるため、細胞培養環境である中性条件下ではほとんど電荷を持っていない。このため、核酸の凝集力が低く、３０万以上の超高分子量体でなければ遺伝子導入剤として機能しない。しかし、前述の如く、高分子量のポリマーよりなる遺伝子導入剤は細胞毒性が高く、分解、代謝、排泄等の面において不利であることから、生体内使用には不適当で、医薬品としての実用化が困難である。
また、イオン性のモノマーである２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを重合して３０万以上の超高分子量体とすることは難しく、サイズ排除カラムを使用した分子量分画や、ポリマー同士の架橋反応により高分子量化を図る方法では多くの時間と労力を必要とする。
【００１０】
特許文献１では、前記２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体からなる低ｐＫａのポリマーを分岐鎖に有する遺伝子導入剤と核酸とを、低級アルコールの存在下で混合し、このアルコールにより、前記ポリマーの主鎖と側鎖のジメチルアミノ基との擬似的な結合（水素結合）を解離させ、核酸を包接するのに十分な塩基性を前記ポリマーに発現させているため、低分子量のポリマーよりなる遺伝子導入剤に核酸を効率的に複合化させることが可能である。しかしながら、この核酸複合体の調製方法では、アルコールを多量に必要とするため、細胞分化等に対する影響の面からアルコール使用量の低減が望まれる。
【００１１】
本発明は上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、低分子量のポリマーであっても、超高分子量のポリマーからなる遺伝子導入剤と同等、もしくはそれ以上の遺伝子導入活性を発現させることができると共に、細胞に対する影響の少ない核酸複合体の調製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、この核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、核酸複合体の調製に有用な遺伝子導入剤溶液及び遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねる過程で、イオン性の低い、特定の含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体をアルコールに溶解させたところ、アルコール溶液中において、このポリマー同士が会合した大粒径の会合体としてブラウン運動をすること；この会合体は高分子量のポリマーと同様の挙動を示すこと；を発見し、この会合体を遺伝子導入剤として用いることを試みた。しかしながら、アルコール溶液中でイオン性の低いポリマー分子同士の会合体を形成させても、このアルコール溶液をＴＥ緩衝溶液などの核酸水溶液に滴下すると、会合体と核酸とが複合化する前に会合体が水分子の水和により解離し、再び低分子量で粒径の小さいポリマー単量体として存在するようになるため、所期の遺伝子導入活性を得ることはできなかった。
【００１３】
そこで、本発明者らは、このポリマー会合体と核酸とを複合化させる方法について検討を重ねた結果、このポリマーを特定濃度でアルコールに溶解させると、含窒素化合物重合体の側鎖にアルコールが溶媒和し、安定なポリマーの会合体を形成すること；この会合体を含むアルコール溶液を核酸水溶液に添加しても、この会合体は溶液中ですぐに解離せず、解離する前に会合体の状態で核酸と複合体を形成し、超高分子量のポリマー分子からなる遺伝子導入剤と同等以上の核酸包接能で優れた遺伝子導入活性を示すこと；この会合体は、遺伝子導入後は生体内で徐々に解離して低分子量の含窒素化合物重合体として存在するようになるため、分解、代謝、排泄性等に優れ、細胞に与える影響も小さいこと；を見出した。
【００１４】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１５】
本発明（請求項１）の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とするものである。
【００１６】
【化１】
【００１７】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００１８】
請求項２の核酸複合体の調製方法は、請求項１において、前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項３の核酸複合体の調製方法は、請求項２において、前記アルコールは、エタノールであることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項４の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記第２の溶液の核酸の濃度が１５〜４５μｇ／ｍＬであることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項５の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように前記第１の溶液と第２の溶液とを混合することを特徴とするものである。
【００２２】
請求項６の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることを特徴とするものである。
【００２３】
請求項７の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなることを特徴とするものである。
【００２４】
請求項８の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基であることを特徴とするものである。
【００２５】
請求項９の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記含窒素モノマーが、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることを特徴とするものである。
【００２６】
請求項１０の核酸複合体の調製方法は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体の分子量が１０，０００〜１５０，０００であることを特徴とするものである。
【００２７】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸複合体の調製方法により調製されたものである。
【００２８】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなるものである。
【００２９】
【化２】
【００３０】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００３１】
本発明（請求項１３）の核酸複合体は、請求項１２に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものである。
【００３２】
本発明（請求項１４）の遺伝子導入剤溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液よりなることを特徴とするものである。
【００３３】
【化３】
【００３４】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【発明の効果】
【００３５】
前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を特定の濃度で含むアルコール溶液（第１の溶液）と、核酸を含む溶液（第２の溶液）とを混合する本発明の核酸複合体の調製方法では、第１の溶液中において、低分子量の含窒素化合物重合体同士が会合し、見かけ上、大粒径の高分子量重合体として存在するため、この会合体を第２の溶液に付与することにより、核酸と速やかに複合体を形成し、超高分子量の重合体からなる遺伝子導入剤と同等もしくはそれ以上の遺伝子導入活性を発現させることができる。
【００３６】
即ち、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体は、ジアルキル３級アミノ基を側鎖に有するアミン系ポリマーであるが、ｐＫａはほぼ中性であり、極めて弱いイオン性ポリマーである。このため、このイオン性が低いポリマーをアルコールに溶解させるとポリマー分子同士が会合して大きな粒子を形成しながらブラウン運動する。この会合体は、１つの超高分子量のポリマーと同様の挙動を示し、超高分子量のポリマーと同程度の量の核酸を包接することが可能であるため、高い遺伝子導入活性を示す。
【００３７】
しかして、形成された核酸複合体は、生体内に導入された後、血液等の水に希釈されることによって、ポリマー会合体が解離し、細胞に与える影響の小さい低分子量の分子に戻る。
【００３８】
このように、本発明によれば、比較的低分子量のポリマーを遺伝子導入時には超高分子量のポリマーとして機能させ、遺伝子導入後は分解、代謝、排泄に有利な低分子量のポリマーに復元させることができ、遺伝子導入剤として超高分子量ポリマーを用いる場合の合成の煩雑さ、細胞毒性の問題を排除した上で、高い遺伝子導入活性を得ることができる。
【００３９】
しかも、ポリマーを会合させるために用いるアルコール使用量も少量で足り、アルコールの多量投与の問題もない。
【００４０】
前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることが好ましく（請求項２）、特に、エタノールであることが好ましい（請求項３）。前記のアルコールを用いると、含窒素化合物重合体の会合体がより一層安定にアルコール溶液中で存在する。
【００４１】
前記第２の溶液の核酸の濃度は、１５〜４５μｇ／ｍＬであることが好ましい（請求項４）。核酸の濃度がこの範囲内であれば、細胞への核酸導入量を適正量とした上で第１の溶液と第２の溶液とを混合した際の会合体の希釈による解離を防止することができる。
【００４２】
前記第１の溶液と第２の溶液とは、前記含窒素化合物重合体と核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように混合することが好ましい（請求項５）。含窒素化合物重合体と核酸とのイオンモル比が前記範囲内であれば、含窒素化合物重合体の会合体と核酸とが速やかに複合体を形成する。
【００４３】
前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることが好ましい（請求項６）。アルキレン基の炭素数が前記範囲内である含窒素モノマーは、光照射により容易にラジカルを生成するため、このラジカルを利用して短時間で含窒素化合物重合体を製造することができる。
【００４４】
前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなる重合体よりなることが好ましく（請求項７）、前記含窒素モノマーとしては、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３が、メチレン基、又はエチレン基であることが好ましい（請求項８）。前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基である場合は、血清中での遺伝子導入活性より向上する。含窒素モノマー（Ｉ）としては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることが好ましい（請求項９）。
【００４５】
前記含窒素化合物の分子量としては１０，０００〜１５０，０００であることが好ましい（請求項１０）。分子量が前記範囲内であると、含窒素化合物重合体同士が会合し易くなり、核酸を効果的に凝集することができ、結果として遺伝子導入効率が向上する。また、分子量が前記範囲内であれば、細胞毒性を低く抑えることが可能である。
【００４６】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤は、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなり、本発明（請求項１１）の核酸複合体は、本発明の核酸複合体の調製方法により調製されたものであり、また、本発明（請求項１３）の核酸複合体は、本発明の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものであり、本発明の遺伝子導入剤及び核酸複合体によれば、細胞に対する影響を抑えて遺伝子を効率的に導入することができ、また、遺伝子導入後の分解、代謝、排泄性に優れる。
【００４７】
本発明（請求項１２）の遺伝子導入剤溶液は、前記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液であり、本発明の核酸複合体の調製に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】各種濃度のＴＥ緩衝溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径分布を示すグラフである。
【図２】各種濃度の生理食塩水中の含窒素化合物重合体の粒子径分布を示すグラフである。
【図３】実施例及び比較例の核酸複合体の遺伝子導入活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
以下においては、まず、本発明の遺伝子導入剤溶液及び核酸複合体の調製方法について説明し、次いで本発明に用いる含窒素化合物重合体及び遺伝子導入剤について詳述する。
【００５０】
［遺伝子導入剤溶液及び核酸複合体の調製方法］
本発明の核酸複合体の調製方法は、遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、該第１の溶液が、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とするものである。
【００５１】
【化４】
【００５２】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００５３】
本発明に係る核酸複合体の調製方法では、前記含窒素化合物重合体を特定の濃度となるようにアルコールに溶解させた本発明の遺伝子導入剤溶液を用いる。前記含窒素化合物重合体を特定の濃度でアルコールに溶解させると、含窒素化合物重合体同士が会合し、超高分子量体と同様の特性を示すようになる。従って、低分子量の含窒素化合物重合体であっても、超高分子量体と同程度の核酸を包接することができるようになり、高い遺伝子導入活性を示すようになる。また、前記会合体は、血液などの水溶液中において徐々に解離し、低分子量の含窒素化合物重合体の単量体として存在するようになるため、分解、排出、代謝性の面で有利であり、細胞に与える悪影響も非常に小さい。また、本発明においては、アルコールの使用量を少なくすることができるため、アルコールによる細胞への影響を低減することもできる。
【００５４】
前記含窒素化合物重合体を溶解させるアルコールとしては、含窒素化合物重合体の会合体の安定性の面で、炭素数が１〜５の低級アルコールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。溶媒としてエタノールを用いた場合には、細胞に与える影響をさらに低減させることができる。
【００５５】
前記含窒素化合物重合体を含む第１の溶液、即ち本発明の遺伝子導入剤溶液中の前記含窒素化合物重合体の濃度は、３〜５０μｇ／μＬ、好ましくは５〜１５μｇ／μＬである。含窒素化合物重合体の濃度が上記下限値以上であることにより、アルコール溶液中で安定な会合体を形成することができ、第２の溶液と混合する際も、含窒素化合物重合体が解離しにくく、安定な核酸複合体を形成することができる。また、このように比較的高濃度のアルコール溶液とすることにより、アルコールの使用量の低減を図ることができる。含窒素化合物重合体の濃度が上記上限値以下であることにより、適度な粒径の会合体を形成させて、これを用いて得られる核酸複合体を細胞に導入し易くすることができる。
【００５６】
一方、核酸を含む第２の溶液の核酸の濃度は１５〜４５μｇ／ｍＬ、特に、２５〜３５μｇ／ｍＬであることが好ましい。核酸の濃度が上記下限値以上であることにより、第１の溶液と第２の溶液との混合溶液の溶媒量を抑えて、希釈による前記含窒素化合物重合体同士の会合体の解離を防止することができる。また、核酸の濃度が上記上限値以下であることにより、核酸の使用量を過度に多くすることなく、細胞への核酸導入量を適正値とすることができる。即ち、細胞への核酸の導入量は、通常、細胞５万個当たり０．５μｇ程度であるため、この第２の溶液の核酸濃度は、適正量の核酸導入量となるように制御される。この第２の溶液の溶媒としては、水が好ましい。
【００５７】
なお、第１の溶液と第２の溶液との混合方法には特に制限はないが、遺伝子導入剤の溶液（第１の溶液）を核酸の溶液（第２の溶液）に滴下して混合することが、前記会合体が解離する前に核酸と速やかに複合体を形成させる点において好ましい。
【００５８】
前記第１の溶液と前記第２の溶液とは、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０程度、特に３０〜６０程度になるように混合することが好ましい。本明細書において、ＮＰ比とは、含窒素モノマーの３級アミン官能基のモル数（含窒素化合物重合体中のモノマーのモル数に相当する。）（Ｎ）／核酸のリン酸残基のモル数（Ｐ）を指す。この比を用いて混合比を計算するのは、含窒素化合物重合体中のカチオンの電荷量が、含窒素化合物重合体の重量と分子構造に依存しているためであり、また、核酸中のアニオン電荷量が、核酸の重量と塩基対数や核酸種に依存しているためである。
【００５９】
［含窒素化合物重合体、及びその製造方法］
本発明において用いる含窒素化合物重合体は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマー（以下「含窒素モノマー（Ｉ）」と称す場合がある。）を重合してなるものである。
【００６０】
【化５】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【００６１】
含窒素モノマー（Ｉ）は、一般式（Ｉ）におけるＲ３がアルキレン基、又はエチレン基の場合にｐＫａの値が中性であり、加水分解されにくいという性質、及び温度の変化により化合物の性質が変化（特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなどで確認されている温度変化によって脱溶媒和してグロビュール化するなどの変化）しにくいという性質を備えている。従って、この含窒素モノマー（Ｉ）を重合してなる含窒素化合物重合体は、それ自体高い遺伝子導入活性を示す。
【００６２】
一般式（Ｉ）中のＲ３は、炭素数１〜１０、特に炭素数１〜２のアルキレン基であることが好ましく、このようなアルキレン基であればｐＫａがほぼ中性領域となり、血清中のアニオン性タンパクなどの成分の影響を受けにくくすることが可能となる。また、アミド結合を形成する窒素原子は、水素原子と結合していることが好ましい。水素原子が結合していない場合は、光開裂によるラジカルが生成しにくくなると考えられるからである。炭素数が前記範囲内であれば、光照射による光開裂が生じ易くなり、結果として、短時間で目的とする重合体を得やすくなる。また、一般式（Ｉ）中のＲ１，Ｒ２としては、炭素数１〜５程度のアルキル基が好ましい。
【００６３】
このような含窒素モノマー（Ｉ）としては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドを挙げることができる。なお、本明細書において「（メタ）アクリル」とは「アクリル及び／又はメタクリル」を意味する。
【００６４】
本発明に係る含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）が光照射されると容易にラジカルを生成するという性質を利用して合成することができ、光照射によれば非常に短時間で含窒素化合物重合体を製造することが可能である。
【００６５】
このような含窒素化合物重合体を製造する方法に特に制限はないが、前記含窒素モノマー（Ｉ）を主成分とする反応液に対して、光を照射して含窒素モノマー（Ｉ）を重合させる方法が挙げられる。
【００６６】
以下に、光照射による含窒素化合物重合体の製造手順について説明するが、本発明で用いる含窒素化合物重合体の製造方法は、何ら以下の方法に限定されるものではない。
【００６７】
含窒素モノマー（Ｉ）の重合反応は、反応液中に含窒素モノマー（Ｉ）が含まれていれば、含窒素モノマー（Ｉ）以外の重合反応に関与しない化合物、例えば、溶媒の存在下で反応を行ってもよいが、重合反応に関与しない化合物を用いずに、実質的に含窒素モノマー（Ｉ）のみからなる反応液で重合を行うことが好ましい。これは、前記化合物が、重合反応に直接的に関与しない場合であっても、生成したラジカルを吸収し、重合反応の反応速度を低下させる場合があるためである。溶媒等の重合反応に関与しない化合物の存在下で反応を行う場合に用いることができる当該重合反応に関与しない化合物としては、含窒素モノマー（Ｉ）の光開裂を阻害するラジカルスカベンジャーや、重合反応自体を阻害する連鎖移動剤などでなければどのようなものであってもよく、例えば、ベンゼン、トルエンなどの無極性溶媒を挙げることができる。このような重合反応に影響を与えないものを溶媒として用いた場合、反応液全体の粘度が低下するため撹拌効率を向上させることが可能であり、また、反応終了後、目的とする重合体の回収が容易になる。
【００６８】
溶媒等の重合反応に関与しない化合物を用いる場合、その使用量は反応液中の含有量として２０重量％以下であることが好ましい。なお、溶媒等の重合反応に関与しない化合物の存在下で反応を行う場合には、重合収率や得られる重合体の分子量が低下する場合があるため、製造プロセスの生産能力や製造目的などに応じて、用いる化合物の種類や使用量を適宜選択することが好ましい。ただし、反応後、溶媒などの重合反応に関与しない化合物を除去する工程などを考慮すると、前記化合物を用いずに反応を行うことが好ましい。なお、この重合反応においては、含窒素モノマー（Ｉ）が、モノマーとしての役割だけでなく、重合開始剤としての役割も担っている。従って、前述のイニファターやＡＩＢＮなどの重合開始剤を別途用いることなく、複雑な枝葉の多い構造の高分子を合成することができる。
【００６９】
前記溶媒を用いる場合、反応液に含まれる含窒素モノマー（Ｉ）の濃度は、８０重量％以上、特に９０重量％以上であることが好ましい。
【００７０】
なお、本発明に係る含窒素化合物重合体は、１種の含窒素モノマー（Ｉ）からなる分岐型重合体であってもよいが、２種以上の含窒素モノマー（Ｉ）からなってもよく、さらには、含窒素モノマー（Ｉ）と含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーを含む分岐型重合体であってもよい。
【００７１】
含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーを含む含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）と含窒素モノマー（Ｉ）以外のモノマーとを含む反応液に対して光照射を行うことにより製造することができるが、この場合においても、含窒素モノマー（Ｉ）が８０重量％以上になるように反応液を調製することが好ましい。この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられる。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００７２】
ただし、本発明で用いる含窒素化合物重合体は、含窒素モノマー（Ｉ）による前述の効果を有効に得る上で、含窒素モノマー（Ｉ）のみを重合してなるものであることが好ましい。
【００７３】
反応液に対して照射する光としては、単色光であっても、混合光であってもよいが、本発明者らが、照射光の波長と重合反応性との関係について検討を重ねたところ、特定の波長の光を照射することにより前記含窒素モノマー（Ｉ）を効率的に重合させることができることを見出した。即ち、３９０ｎｍを超える長波長の光を照射した場合には、反応が進行しなかったり、反応速度が極端に低下するため生産効率が低くなる。これは３９０ｎｍを超える長波長の光が、前記含窒素モノマー（Ｉ）の側鎖のラジカル解裂を効率よく起こすだけのエネルギーを有していないか、前記光のエネルギーが量子化された励起バンドと大きく異なるなどの理由が考えられる。また、２９０ｎｍ未満の短波長の光を照射した場合にも、重合物はほとんど得られないか、又は重合容器の光の入射面で不溶性のフィルムが形成されるのみである。これは、含窒素モノマー（Ｉ）分子が２９０ｎｍ未満のＵＶを吸収する性質を有しており、照射光が反応液内に十分に到達せず、重合反応に寄与する側鎖の光開裂が起こらないためであると考えられる。従って、反応液に対して照射する光の波長は、２９０〜３９０ｎｍ程度、特に３００〜３２０ｎｍ程度、とりわけ３１０ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯、ブラックライトなどを用いることができる。光の照射強度としては、反応容器のスケールや、照射強度に依存するが０．０１〜５０．０ｍＷ／ｃｍ２程度、特に０．１〜１０．０ｍＷ／ｃｍ２程度好ましい。照射強度が高いと、反応を制御しにくくなるおそれがあるため好ましくない。また、照射強度が低いと、重合時間が徒に長くなるため効率的ではない。
【００７４】
光の照射時間としては、反応容器のスケールや照射強度に依存するが１０秒〜１４４０分、特に１分〜３６０分、とりわけ３〜６０分程度が好ましい。この含窒素化合物重合体の製造方法であれば、このような短時間の光照射でも、含窒素化合物重合体を容易に製造することができる。
【００７５】
この光照射により、反応液中に目的とする含窒素化合物重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、含窒素化合物重合体を得ることができる。
【００７６】
このようにして得られる含窒素化合物重合体の分子量としては、１０，０００〜１５０，０００程度、特に１５,０００〜１００，０００程度が好ましい。分子量が上記下限値以上であることにより、これを会合させて、超高分子量の会合体を形成することにより、高い遺伝子導入活性を得ることができる。一方、分子量が上記上限値以下であることにより、細胞に対する影響を抑えることができ、排出性の問題からも好ましい。特に、本発明では、含窒素化合物重合体の会合体を形成させてこれを遺伝子導入剤とするため、含窒素化合物重合体自体の分子量はさほど大きくなくても高い遺伝子導入活性を得ることができるという利点がある。
【００７７】
含窒素化合物重合体の分子量は、含窒素化合物重合体の重合反応における光照射の時間、及び反応液に含まれる含窒素モノマー（Ｉ）の濃度を制御することにより調整することができる。即ち、照射時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい含窒素化合物重合体を得ることができる。また、この他にも光開裂反応の量子化エネルギーを考慮して、照射する光の波長を選択することでも反応を制御することができる。
【００７８】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００７９】
［遺伝子導入剤］
本発明において用いる遺伝子導入剤は、前記含窒素化合物重合体の会合体よりなるものであり、複数個の含窒素化合物重合体が会合して大粒径の会合体となることにより、高い遺伝子導入活性を示す一方で、遺伝子導入後においては生体内で解離して元の含窒素化合物重合体に戻るという特異的な挙動を示す。
【００８０】
なお、含窒素化合物重合体を構成する含窒素モノマー（Ｉ）は、前述の如く、一般式（Ｉ）におけるＲ３がアルキレン基、又はエチレン基の場合にｐＫａの値が中性であり、加水分解されにくいという性質、及び温度の変化により化合物の性質が変化（特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなどで確認されている温度変化によって脱溶媒和してグロビュール化するなどの変化）しにくいという性質を備えている。従って、この含窒素モノマー（Ｉ）を重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなる本発明の遺伝子導入剤は、血清を含む培地においても、アニオン性のタンパクや脂質の影響を受けずに高い遺伝子導入活性を示す。
【００８１】
本発明に係る含窒素化合物重合体を本発明において規定する濃度のアルコール溶液とした場合において、前記アルコール溶液中で形成される含窒素化合物重合体の会合体である本発明の遺伝子導入剤の粒子径は、５０〜５００ｎｍ程度、特に１００〜３００ｎｍ程度であることが好ましい。この会合体の粒子径が上記下限値より大きいことにより、核酸を十分に包接することができ、高い遺伝子導入活性を得ることができる。また、粒子径が上記上限値以下であることにより、細胞に取り込まれ易くなる。含窒素化合物重合体の粒径は、例えば、前述の含窒素化合物重合体のアルコール溶液中の含窒素化合物重合体の濃度を調整することにより、制御することができ、高濃度の溶液ほど多くの含窒素化合物重合体を会合させて粒径の大きい会合体とすることができる。
【００８２】
［核酸複合体］
本発明の核酸複合体は、上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）と核酸とが複合化したものであり、前記本発明の遺伝子導入剤溶液を用いる本発明の核酸複合体の調製方法により調製することができ、含窒素化合物重合体の会合体である本発明の遺伝子導入剤が核酸を包接することにより、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００８３】
本発明に係る含窒素化合物重合体の会合体と核酸との複合体の粒子径は、１５０〜５００ｎｍ、特に２００〜４００ｎｍ、とりわけ２５０〜３５０ｎｍが好ましい。粒子径が上記上限値以下であることにより、細胞内に取り込まれやすくなり、生体内使用の場合、血管梗塞などを防止することができる。また、粒子径が上記下限値以上であることにより、核酸複合体内部の核酸に酵素の作用がおよぶことを防止することができ、この粒子径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法、透過型電子顕微鏡、または電子間力顕微鏡によって測定される。
【００８４】
核酸の好ましい例としては、各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイや単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００８５】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００８６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００８７】
［遺伝子導入方法］
核酸複合体と細胞とを、例えば血清存在下で接触させることにより細胞に遺伝子を導入することができる。核酸複合体と細胞とを血清存在下で接触させることにより、細胞に負担をかけることなく核酸を細胞に移行させることができる。
【００８８】
核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、神経細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００８９】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００９０】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００９１】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００９２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００９３】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００９４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９５】
（１） 含窒素化合物重合体の合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド５．０ｇを１０ｍＬ石英管に採取した。高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量：２Ｌ／分）で８分間パージした後、窒素を封入して密栓した。３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製：ＭＡＸ−３０１）で３７０ｎｍの紫外線を９分間照射した。照射強度は、ウシオ電機社のＵＩＴ−１５０にＵＶＤ−Ｃ４０５を装着して０．０４ｍＷ／ｃｍ２に調整した。照射中は、攪拌操作を一切行わなかった。モノマーは、完全にガラス状に固化していた。この反応により得られた固体は無色透明、無臭であり、スパチュラの刺入が困難又は不可能な硬度を有していた。この固体上にマイクロ回転子を乗せ、逆浸透膜により濾過した水（ＲＯ水）を３ｍＬを加えて２４時間攪拌したところ、固体は全て溶解して高粘度の溶液となった。この溶液を回収し、分画分子量（１５ｋＤａ）の透析チューブへ移し、ＲＯ水で７２時間透析することにより低分子量成分を除去し、得られた溶液を０．２μｍフィルターで濾過した後に、液体窒素で４８時間の凍結乾燥を行い、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマーの粉末を得た（重合収率７．５％）。
得られた重合体の分子量をＧＰＣにより測定したところ、３７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．７）であった。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．１ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，ＣＨ３），δ１．９ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２Ｃ），δ２．４ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），δ２．６ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ），δ２．９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２）であった。
【００９６】
（２） 含窒素化合物重合体の粒子径の測定（参考例１〜３）
前記（１）において合成した含窒素化合物重合体（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマー）を遺伝子導入剤として使用する際に導入効率が良いとされる濃度の溶液を調製し、溶液中での粒子径を静的光散乱装置（ＳＹＳＭＥＸ社：Ｚｅｔａ Ｓｉｚｅｒ−Ｎａｎｏ）を使用して測定した。
【００９７】
＜参考例１＞
前記含窒素化合物重合体を、濃度がそれぞれ０．１２μｇ／μＬ（「１０倍希釈液」と称す。）、１．２μｇ／μＬ（「原液」と称す。）、６．０μｇ／μＬ（「５倍濃度液」と称す。）、１２μｇ／μＬ（「１０倍濃度液」と称す。）となるようにＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭ トリス・ＨＣＬ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、各溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径を測定した。各溶液中の含窒素化合物重合体の粒子径はその濃度により若干異なっていたが、いずれも約２０ｎｍ程度の最頻粒子径であった。濃度によって若干の誤差があったのは、光散乱強度、ブラウン運動の規制範囲の変化などの要因が考えられる。前記原液、５倍濃度液、及び１０倍濃度液における含窒素化合物重合体の粒子径分布を図１に示す。
【００９８】
＜参考例２＞
前記含窒素化合物重合体を生理食塩水に溶解させたこと以外は参考例１と同様に含窒素化合物重合体の溶液を調製し、粒子径の測定を行った。いずれの濃度の溶液においても最頻粒子径は約２０ｎｍ程度であった。原液、及び１０倍希釈液における含窒素化合物重合体の粒子径分布を図２に示す。
【００９９】
＜参考例３＞
前記含窒素化合物重合体をエタノールに溶解させたこと以外は参考例１と同様に含窒素化合物重合体の溶液を調製し、粒子径の測定を行った。各溶液の含窒素化合物重合体の粒子径はその濃度によって若干異なっていたが、最頻粒子径は２００〜２１０ｎｍであった。
【０１００】
以上より、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマー（含窒素化合物重合体）は、エタノール溶液中で複数の含窒素化合物重合体同士が会合していること、及びエタノール中の粒子径は、水溶液中の粒子径の１０倍程度であることが分かった。
【０１０１】
（３） 遺伝子導入活性の評価
＜実施例１〜４＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を６万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。ＤＮＡ溶液として、濃度が３３．３μｇ／ｍＬであるＴＥ緩衝溶液を用意した。遺伝子導入剤の溶液としては、前記（１）において合成した含窒素化合物重合体を濃度が６．２μｇ／μＬ（実施例１）、１２．３μｇ／μＬ（実施例２）、２４．６μｇ／μＬ（実施例３）、４９．２μｇ／μＬ（実施例４）となるようにそれぞれエタノールに溶解させたものを用いた。
【０１０２】
前記実施例１の遺伝子導入剤溶液を６０μＬ、実施例２の遺伝子導入剤溶液を３０μＬ、実施例３の遺伝子導入剤溶液を１５μＬ、実施例４の遺伝子導入剤溶液を７．５μＬ採取し、ＤＮＡ溶液９０μＬにそれぞれ滴下して加えた。実施例１〜４では、含窒素化合物重合体中の３級アミン官能基のモル数とＤＮＡリン酸残基のモル数の比（ＮＰ比）が５０となるように調整した。
【０１０３】
なお、含窒素化合物重合体に含まれる３級アミンの官能基のモル数は、含窒素化合物重合体の重量と含窒素モノマー単位の分子量１５７から計算することにより求めることができ、ＤＮＡリン酸残基のモル数は、ＤＮＡ単位と配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０により求めることができる。
【０１０４】
実施例１〜４の遺伝子導入剤溶液をＤＮＡ溶液へ滴下した後１０分間静置し、この混合溶液に完全培地（ＤＭＥＭ培地へ１０％ＦＣＳを添加したもの）を６ｍＬ加えて混合し、培養皿の各Ｗｅｌｌへ１ｍＬづつ分注して４８時間の追加培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセイにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社，アッセイキット試薬）。規格化はタンパク濃度で行い、タンパク濃度の定量は、ＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図３に示す。
【０１０５】
＜比較例１〜４＞
比較例として、前記（１）において合成した含窒素化合物重合体を、エタノールの代りにＴＥ緩衝溶液に各濃度で溶解させたこと以外は、それぞれ前記実施例１〜４と同様の方法で核酸複合体を調製して遺伝子導入活性の評価を行った。結果を図３に示す。
【０１０６】
図３より、実施例１〜４の核酸複合体は、いずれも比較例１〜４の核酸複合体よりも遺伝子導入活性が高いことがわかる。また、ＴＥ緩衝溶液で調製した比較例１〜４は、遺伝子の導入活性が含窒素化合物重合体の濃度に依存していないことが分かる。この結果及び静的光散乱により測定した粒子径の結果から、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドポリマーは、水溶液中において単一分子でブラウン運動をし、水による希釈効果によってもポリマー同士が会合していないと考えられる。
【０１０７】
一方、図３より、実施例１〜４では、遺伝子の導入活性が含窒素化合物重合体の濃度に依存していることがわかる。遺伝子導入剤溶液中の含窒素化合物重合体の濃度が６μｇ／μＬから２４μｇ／μＬまでの間において、濃度が高くなる程遺伝子導入活性が向上したのは、含窒素化合物重合体の溶液がＤＮＡ溶液へ滴下された際に、高濃度の含窒素化合物重合体溶液ほど含窒素化合物重合体の会合体が解離しにくいためであると考えられる。含窒素化合物重合体の濃度が４９．２μｇ／μＬの場合に遺伝子導入活性が若干低下したのは、含窒素化合物重合体の会合体が大きくなり、細胞に取り込まれにくくなったためだと考えられる。
【０１０８】
（４） 特許文献１に記載の重合体の溶液中における粒子径の測定
（４−１） イニファターの合成
１，２，３，４，５，６−ヘキサキスブロモメチルベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中に加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノールに投入して３０分間攪拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫で１５時間冷却して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーによる測定を行い、原料ピークが消失していることを確認することにより、精製物が単一物質であるとことを確認した。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，３６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）であった。
【０１０９】
（４−２） ６分岐型重合体の合成
前記（４−１）により合成した１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４６ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。１ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量：２Ｌ／分）で１０分間パージした後、丸管形ブラック蛍光灯（東芝製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の環内の中央部にガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの全周方向から蛍光灯の光を４８時間照射した。溶液は薄い黄色を呈していた。得られた溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させた。ｎ−ヘキサンをデカンテーションした後、沈殿物をクロロホルムに溶解し、エバポレーターで乾固させてフラスコ中で薄いフィルムを形成させた。ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（５０／５０）の混合溶媒で洗浄して精製した。得られた６分岐型重合体の分子量をポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより測定したところ、２１，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０）であった。
【０１１０】
（４−３） ６分岐型重合体の溶液中における粒子径の測定
前記操作により得られた６分岐型重合体を参考例１，３と同様の方法でＴＥ緩衝溶液又はエタノールに溶解させて、溶解直後の６分岐型重合体の粒子径を測定したところ、いずれの溶媒においても粒子径は１６ｎｍ程度であった。よって、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートからなる重合体は、エタノール溶液中でも会合する性質が小さく、擬似的に超高分子量化することはできないと考えられる。なお、６分岐型重合体（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートポリマー）は側鎖が水溶液中で加水分解したり、アルコール中でエステル交換反応を起す性質があるため、水溶液中やエタノール溶液中で長期間保存することはできない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、
該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、
該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【化１】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項２】
請求項１において、前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項３】
請求項２において、前記アルコールは、エタノールであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記第２の溶液の核酸の濃度が１５〜４５μｇ／μＬであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように前記第１の溶液と第２の溶液とを混合することを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記含窒素モノマーが、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体の分子量が、１０，０００〜１５０，０００であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体。
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなる遺伝子導入剤。
【化２】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなる核酸複合体。
【請求項１４】
下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液よりなることを特徴とする遺伝子導入剤溶液。
【化３】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項１】
遺伝子導入剤を含む第１の溶液と、核酸を含む第２の溶液とを混合することにより核酸複合体を調製する方法において、
該第１の溶液は、下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を含むアルコール溶液であり、
該第１の溶液中の該含窒素化合物重合体の濃度が３〜５０μｇ／μＬであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【化１】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項２】
請求項１において、前記アルコールは、炭素数が１〜５の低級アルコールであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項３】
請求項２において、前記アルコールは、エタノールであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記第２の溶液の核酸の濃度が１５〜４５μｇ／μＬであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体と前記核酸とのイオンモル比（ＮＰ比）が２０〜８０となるように前記第１の溶液と第２の溶液とを混合することを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体は、前記含窒素モノマーのみを重合してなることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記一般式（Ｉ）におけるＲ３がメチレン基、又はエチレン基であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記含窒素モノマーが、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリルアミド及び／又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミドであることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記含窒素化合物重合体の分子量が、１０，０００〜１５０，０００であることを特徴とする核酸複合体の調製方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の核酸複合体の調製方法により調製された核酸複合体。
【請求項１２】
下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体の会合体よりなる遺伝子導入剤。
【化２】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなる核酸複合体。
【請求項１４】
下記一般式（Ｉ）で示される含窒素モノマーを重合してなる含窒素化合物重合体を３〜５０μｇ／μＬ含むアルコール溶液よりなることを特徴とする遺伝子導入剤溶液。
【化３】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、それぞれ独立にアルキル基を示し、
Ｒ３は、アルキレン基を示し、
Ｒ４は、水素原子又はメチル基を示す。）
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１００６２３（Ｐ２０１２−１００６２３Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５３９４０（Ｐ２０１０−２５３９４０）
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１２日（２０１０．１１．１２）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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