植物においてストレス耐性を高める方法およびその方法
【課題】植物の細胞中で低温ショックタンパク質（Ｃｓｐ）を発現する植物を提供する。
【解決手段】５’から３’の方向で、ａ）植物中で機能し、かつ、ポリアデニル化配列として機能する３’転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結された、低温ショックタンパク質、例えば細菌低温ショックタンパク質をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを発現するＤＮＡを植物細胞に導入することによって、植物における非生物ストレスに対する上昇した耐性を示すトランスジェニック植物からなる。
【解決手段】５’から３’の方向で、ａ）植物中で機能し、かつ、ポリアデニル化配列として機能する３’転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結された、低温ショックタンパク質、例えば細菌低温ショックタンパク質をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを発現するＤＮＡを植物細胞に導入することによって、植物における非生物ストレスに対する上昇した耐性を示すトランスジェニック植物からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００３年９月２９日に出願した米国仮特許出願番号６０／５０６,７１７および２００３年１２月１７日に出願した出願番号６０／５３０,４５３の３５ ＵＳＣ§１１９（ｅ）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の取込み
ほぼ９８メガバイトである（ＭＳ−ＤＯＳで測定して）、各々ＣＳＰ.ＳＴ２５.ｔｘｔと命名したファイルを含む、すべてＣＤ−ＲＯＭに存在する、配列表のコンピュータ読出し可能な形態の配列表の２のコピー（配列表コピー１および配列表２コピー２）は２００４年９月２８日に作製し、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００３】
本発明は、植物における低温、渇水、塩、低温発芽、熱および他の非生物ストレス耐性、ならびに植物におけるウイルス、菌類、細菌および他の生物ストレス耐性に関する。
【背景技術】
【０００４】
種子および果実生産は、数十億ドルの商用産業であり、合衆国の多くの州および世界中の多くの国々の主たる収入源である。商業的に価値のある種子には、種子から搾ることができる植物油にふさわしい、例えばキャノーラ、ワタ種子およびヒマワリ種子が含まれる。エンドウ、インゲンおよびヒラマメのごときマメ科植物の種子も、それらはタンパク質に富むため商業的に価値がある。例えば、ダイズに関しては、４０−４５％のタンパク質および１８％の油脂からなる。また、コーヒーはCoffea arabica植物の乾燥およびローストした種子から生産される価値ある作物であり、一方、チョコレートはカカオの種子または"ビーン"から生産される。同様にして、例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギおよび他の穀物、堅果、豆果、トマトおよび柑橘類果実を含む多くの果実および種子は商業的に価値がある。例えば、トウモロコシ種子は、タコス、コーン油、トルティア、コーンフレーク、コーンミールおよび他の多くのもののごとき多くの食品品目または調理に使用する品目に製造される。トウモロコシは、限定するものではないが、飼料およびエタノール生産を含む多くの製造方法における原料としても使用される。
【０００５】
種子および果実の生産は両方とも、生物的および非生物的ストレスに固有に起因して制限される。例えば、ダイズ（Glycine max）は、貯蔵の間の種子発芽の損失に苦しめられ、および土壌温度が低温である場合は発芽することができない作物種である（Zhangら, Plant Soil 188: (1997)）。このことは、トウモロコシおよび農業経済学的に重要な他の植物についてもあてはまる。植物における非生物的ストレス耐性の改善は、低温、渇水、洪水、熱、ＵＶストレス、オゾン増加、酸性雨、汚染、塩ストレス、重金属、無機化土壌、および他の非生物的ストレス下の生長および／または発芽を増加させるのに栽培者に有利であろう。菌類およびウイルス感染のごとき生物的ストレスは、世界的に大きな作物の損失も生じる。
【０００６】
伝統的な育種（１の遺伝子型の特定のアレルを他のものに交雑する）が何世紀もの間用いられてきて、生物的ストレス耐性、非生物的ストレス耐性および収量が増加されている。伝統的な育種は、親植物に存在する制限された数のアレルに固有的に起因して制限される。これは、つぎに、このようにして付加し得る遺伝的変異性の量を制限する。分子生物学は、植物におけるストレス耐性を改善するであろう遺伝子について、本発明者が遠くかつ広く見ることを許容している。本発明者らは、他の生物がストレスの多い条件に対してどのように反応し、耐えるのかを決定することを探求した。低温ショックタンパク質は、低温およびストレスの多い条件で生存するために、細菌および他の生物によって使用されるシステムの一部である。本発明者らは、低温ショックタンパク質およびそれと関連するタンパク質をコードする遺伝子を植物に入れ、それを発現させると、植物の低温、渇水、熱、水および他の非生物的ストレス耐性ならびに植物の菌類、ウイルスおよび他の生物的ストレス耐性を上昇すると仮定した。本発明者らは、低温ショックタンパク質に相同であるか、または配列類似性を有する遺伝子を用いれば、生物的および非生物的ストレス耐性を上昇するであろうことも考えた。
【０００７】
本発明は、生物的および非生物的ストレスに起因するそれらの消失を制限する農業従事者にとって有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、植物の細胞中で低温ショックタンパク質（Ｃｓｐ）を発現する植物を提供する。このｃｓｐの発現は、該植物内におけるより大きな非生物的ストレス耐性に通じる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１の形態において、ｃｓｐをコードするポリヌクレオチドは、作動可能に連結した植物中で機能するプロモーターおよび植物中で機能するターミネーターによって発現する。
より詳細には、本発明は、ポリアデニル化部位を提供する３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結した低温ショックタンパク質をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結した、植物中で機能するプロモーターを含む第１のＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。第１のＤＮＡポリヌクレオチドは、第２のＤＮＡポリヌクレオチドに有利に異種性である場合がある。該発明は、第１のＤＮＡポリヌクレオチドと第２のＤＮＡポリヌクレオチドとの間に挿入したイントロンを有する組換えＤＮＡ分子も提供する。また、本発明は、第２のＤＮＡポリヌクレオチドが配列番号：３中のモチーフを含むタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子も提供する。本発明の組換えＤＮＡの特定の形態において、第２のＤＮＡポリヌクレオチドは以下の中から選択されるタンパク質をコードする：
（ａ）グラム陽性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）からの低温ショックタンパク質、
（ｃ）バチルス・ズブチリス低温ショックタンパク質Ｂ（ＣｓｐＢ）のホモログ、
（ｄ）配列番号：２に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）グラム陰性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｆ）エスシェリキア・コリ（Escherichia coli）からの低温ショックタンパク質を含むタンパク質、
（ｇ）エスシェリキア・コリ低温ショックタンパク質Ａ（ＣｓｐＡ）のホモログ、
（ｈ）配列番号：１に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉ）アグロバクテリウム・ツメファシエンスからの低温ショックタンパク質、および
（ｊ）配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３または６５のいずれかに実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１０】
本発明は、プロモーターが、誘導性プロモーター（inducible promoter）、構成的プロモーター（constitutive promoter）、時期調節型プロモーター（temporal-regulated promoter）、発生段階調節型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、組織優先型プロモーター（tissue-preferred promoter）、低温亢進型プロモーター（cold enhanced promoter）、低温特異的プロモーター（cold-specific promoter）、ストレス亢進型プロモーター（stress enhanced promoter）、ストレス特異的プロモーター（stress specific promoter）、渇水誘導性プロモーター（drought inducible promoter）、水分欠乏誘導性プロモーター（water deficit inducible promoter）および組織特異的プロモーター（tissue-specific promoter）よりなる群から選択される組換えＤＮＡ分子も提供する。
【００１１】
本発明は、前記した組換えＤＮＡ分子をゲノム中に含む植物細胞および植物、ならびにそれから作製した伝播体および子孫も提供する。植物には、限定するものではないが、作物植物、単子葉および双子葉植物が含まれる。より好ましくは詳細には、それには、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、イネ、ワタ、オオムギ、エンバク、シバ、ワタ、およびコムギが含まれ得る。
【００１２】
本発明は、低温ショックタンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子で形質転換されている非生物的ストレス耐性のトランスジェニック植物も提供する。かかる植物ならびにその細胞および種子のごとき伝播体には、そのゲノムの中に、低温ショックタンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子が含まれる。かかる植物は、１またはそれを超える高められた特性を示す：低温が同種の非形質転換植物の生長を制限するであろう条件下でのより高い生長速度、
（ａ）高温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｂ）水分が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｃ）土壌および／または水分中の高塩分または高イオンが同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｄ）同種の非形質転換植物よりもコールドショック後に生存する植物のより高いパーセントを有すること、
（ｅ）同種の非形質転換植物と比較した場合のより高い収量、または
（ｆ）同種の非形質転換植物と比較した渇水に対する耐性。
【００１３】
本発明の方法は、例えば種子を発生する目的で、単純にかかる種子を土壌に播き、例えばストレス条件下で、それを生長させることによって、本発明の植物を繁殖するさせることを含む。より詳細には、本発明は、非生物的ストレス耐性、増大した収量または増大した根の大きさのごとき高められた特性を有する植物を作製する方法を提供する。方法には、
ａ）低温ショックタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子を植物細胞または複数の細胞のゲノムに挿入し、
ｂ）形質転換植物細胞または複数の細胞を得、
ｃ）該形質転換植物細胞（または複数の細胞）から植物を再生し、ついで
ｄ）高められた特性を示す植物を選択する
工程が含まれる。
本発明の１の態様において、熱耐性、塩耐性、渇水耐性および低温ショック後の生存よりなる群から選択される高められた非生物ストレス耐性を示す植物を選択する。
【００１４】
本発明は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも４０％同一である単離されたタンパク質も提供する。ある種の態様において、匹敵する特性は、低温ショックタンパク質を、４０％を超える同一性を有するタンパク質と、例えば本明細書に詳細に開示した低温ショックタンパク質に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％同一性を有するタンパク質と置換することによって達成し得る。同様にして、本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、９０および９２を含む群から選択されるＤＮＡ配列を有する核酸にハイブリダイズする低温ショックタンパク質をコードする単離された核酸も提供する。
【００１５】
本発明は、詳細には、配列番号：５、７、９、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群の配列に実質的に同一であるＤＮＡ配列を有する低温ショックタンパク質をコードする単離された核酸も提供する。
【００１６】
本発明は、伝播体を植えるかまたは発芽させた場合の、前記の組換えＤＮＡ分子を含む伝播体、および、例えばかかる伝播体が種子である場合には、該伝播体から発芽した植物の圃場（field）も提供する。
【００１７】
本発明は、請求項５９の種子を土壌に植え；
ｂ）該植物から種子；およびそれから生成した種子を収穫することを含む種子の生産方法も提供する。
【００１８】
また、トランスジェニック植物の作製方法を提供し、当該方法には、
（ｉ）配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのフラグメントもしくはシス・エレメントに少なくとも４０％相同であるＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を植物細胞のゲノムに導入し、ここに該ＤＮＡポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結されており；ついで、
（ｉｉ）該トランスジェニック植物細胞を選択し；ついで、
（ｉｉｉ）該トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に再生する工程を含み、またこの方法によって作製した植物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はｐＭＯＮ５７３９６のプラスミド地図を示す。
【図２】図２はｐＭＯＮ２３４５０のプラスミド地図を示す。
【図３】図３はｐＭＯＮ５７３９７のプラスミド地図を示す。
【図４】図４はｐＭＯＮ５７３９８のプラスミド地図を示す。
【図５】図５はｐＭＯＮ２３４５０のプラスミド地図を示す。
【図６】図６はｐＭＯＮ５７３９９のプラスミド地図を示す。
【図７】図７はｐＭＯＮ４８４２１のプラスミド地図を示す。
【図８】図８はｐＭＯＮ５６６０９のプラスミド地図を示す。
【図９】図９はｐＭＯＮ５６６１０のプラスミド地図を示す。
【図１０】図１０はｐＭＯＮ７３６０７のプラスミド地図を示す。
【図１１】図１１はｐＭＯＮ６１３２２のプラスミド地図を示す。
【図１２】図１２はｐＭＯＮ７３６０８のプラスミド地図を示す。
【図１３】図１３はｐＭＯＮ６５１５４のプラスミド地図を示す。
【図１４】図１４はｐＭＯＮ７２４７２のプラスミド地図を示す。
【図１５】図１５はｐＥＮＴＲ１のプラスミド地図を示す。
【図１６】図１６は示した遺伝子を発現する植物および対照の生長パターンを示し、導入した遺伝子が非生物的ストレス耐性を提供することを示している。
【図１７】図１７はｐＭＯＮ４２９１６のプラスミド地図を示す。
【図１８】図１８はｐＭＯＮ７３９８３のプラスミド地図を示す。
【図１９】図１９はｐＭＯＮ７３９８４のプラスミド地図を示す。
【００２０】
本発明は、生物的および非生物的ストレスに対する増大した耐性を有する植物を提供する。提供する植物は、該植物の細胞における低温ショックタンパク質（ｃｓｐ）の発現に起因する増大したストレス耐性を有する。本発明は、幾つかの形態の例を提供し、本発明において機能することが予想される他の形態も意図する。
【００２１】
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するため、および、当業者が本発明を実施することを案内するために提供する。別段注記しない限り、用語は当業者による慣習的な用法に従って理解されるべきである。例えば、分子生物学および分子遺伝学で使用される一般用語の定義は、Lewin, Genes VII, Oxford University Press and Cell Press, New York, 2000；Buchananら, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Courier Companies, USA, 2000；Lodishら, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman and Co., New York, 2000に見出すことができる。遺伝学の一般用語は、先の刊行物ならびにLynchら, Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer and Associates, Sunderlant, MA, 1998；Hartwellら, Genetics：From Genes to Genomes, McGraw-Hill Companies, Boston, MA, 2000；Martlら, Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, MA；Strachanら, Human Molecular Genetics, John Wiley and Sons, New York, 1999に見出すことができる。
【００２２】
３７ ＣＦＲ§１.８２２に記載のＤＮＡ塩基の命名法を用いる。アミノ酸残基の標準的な一文字および三文字命名法を用いる。
【００２３】
多くの農業経済学的特性が"収量"に影響し得る。例えば、それには、限定するものではないが、植物の高さ、莢の数、植物上の莢の位置、節間の数、莢破壊の発生率（incidence of pod shatter）、種子サイズ、根粒着生および窒素固定の効率、栄養同化の効率、生物的および非生物的ストレスに対する抵抗性、炭素同化、植物構造、倒伏に対する抵抗性、パーセント種子発芽、苗木活力および幼植物特性が含まれ得る。例えば、それには、限定するものではないが、発芽の効率（ストレスを負荷した条件下での発芽を含む）、いずれかまたはすべての植物部分の生長速度（ストレスを負荷した条件下での生長速度を含む）、穂の数、穂当たりの種子の数、種子のサイズ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、種子中身の特徴（characteristic of seed fill）も含まれ得る。収量は多くの方法で測定することができ、それには、試験重量、種子重量、植物当たりの種子の数、植物当たりの種子重量、単位面積当たりの種子の数または重量（すなわち、エーカー当たりの種子、または種子の重量）、エーカー当たりのブッシェル重量、エーカー当たりのメートルトン、エーカー当たりのトン、ヘクタール当たりのキロが含まれる。１の形態において、本発明の植物は収量の要素である高められた特性を示す。
【００２４】
"核酸（配列）"または"ポリヌクレオチド（配列）"とは、ゲノムまたは合成起源の一本鎖または二本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）、すなわち５’（上流）末端から３'（下流）末端に読まれる、各々、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の高分子である。核酸はセンスまたは相補（アンチセンス）鎖を表し得る。
【００２５】
"自然のまま"とは、天然に生じる（"野生型"）核酸配列をいう。
"外来性"配列とは、外来起源または外来種から生じる配列をいい、あるいは同一起源からの場合にはその起源形態から修飾された配列をいう。例えば、自然のままのプロモーターを用いて、同一または異なる種からの外来性遺伝子の転写を引き起こし得る。
【００２６】
植物の"部分"には、植物のすべての部分または片が含まれ、限定するものではないが、根、若枝、葉、茎、花粉、種子、花、おしべ、めしべ、卵（egg)、胚、花弁、花糸、心皮（carpel）（柱頭、子房、および花柱を含む）、細胞（または複数の細胞）、または前記したもののいずれかの片が含まれる。
【００２７】
"伝播体"には、減数分裂および有糸分裂のすべての産物が含まれ、限定するものではないが、新しい植物を伝播し得る植物の種子および部分が含まれる。例えば、伝播体には、若枝、根または全植物に生長し得る他の植物の部分が含まれる。伝播体には、植物の一の部分を異なる植物（異なる種のものでさえ）の他の部分に移植して生きている生物を創り出す場合の移植片も含まれる。伝播体には、減数分裂生成物をクローニングするまたは互いに一緒にする、あるいは減数分裂生成物を一緒にして胚または受精卵を形成させる（自然またはヒトの介在でもって）ことによって生成する全植物および種子も含まれる。
【００２８】
"単離された"核酸配列は、中で核酸が自然に生じる生物の細胞中で自然に核酸が関連する他の核酸配列、すなわち他の染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡ、から実質的に分離または精製されている。この用語には、汚染する核酸および他の細胞コンポーネントを実質的に除去するように生化学的に精製された核酸が包含される。この用語は、組換え核酸および化学合成核酸も包含される。
【００２９】
本明細書中で用いる"同一性"または"同一"は、タンパク質（または複数のタンパク質）または核酸（または複数の核酸）の間の比較をいう場合は９８％またはそれを超える同一性を意味する。
【００３０】
第１の核酸またはタンパク質配列は、他の核酸（またはその相補鎖）またはタンパク質と最適に整列（比較のウインドウにわたり参照配列の総計２０％未満の適当なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失でもって）した場合に、参照核酸配列またはタンパク質に対して"実質的同一性"または"実質的類似性"を示し、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドまたはアミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドまたはアミノ酸位置、および最も好ましくは第１の核酸またはタンパク質の全長にわたっての比較ウインドウにわたって少なくとも約６０％の核酸配列等価、なお良好には７０％、好ましくは少なくとも約８０％の等価、より好ましくは少なくとも約８５％の等価、および最も好ましくは少なくとも約９０％の等価が存在する。比較ウインドウを整列するための配列の最適整列は、ローカルホモロジーアルゴリズム（それは、例えば、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）によって、好ましくはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって行い得る。参照核酸は完全長の分子であっても、またはより長い分子の部分であってもよい。あるいは、一方の核酸がストリンジェントな条件下で他方の核酸にハイブリダイズする場合には、２の核酸は実質的同一性を有する。適当なハイブリダイゼーション条件は経験的に決定し得、あるいは例えば、分かっている場合には、プローブの相対的Ｇ＋Ｃ含量およびプローブと標的配列との間のミスマッチ数に基づいて概算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、ハイブリズの温度または塩濃度である（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 第２版, Cold Spring Harbor Harbor Press、1989）。
【００３１】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の機能に影響するようにそれらの配列が整列する場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と"作動可能に連結する"。好ましくは２の配列は単一の隣接する核酸分子の部分であり、より好ましくは近接している。例えば、プロモーターが細胞中の遺伝子の転写を調節または仲介する場合には、該プロモーターは該遺伝子に作動可能に連結している。例えば、転写終結領域（ターミネーター）がターミネーターにおいてまたはその付近で遺伝子を含む転写物を終結するようＲＮＡポリメラーゼを導く場合には、該ターミネーターは該遺伝子に作動可能に連結している。例えば、エンハンサーはそれがその効果を示しているプロモーターに近接していない場合もあるが、一般的には同じ核酸分子に存在する。
【００３２】
"組換え"核酸もしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ分子は、例えば化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離したセグメントの操作によって、２ほかの配列の分離したセグメントの人工的結合によって作製する。核酸操作の技術はよく知られている（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。核酸の化学合成の方法は、例えば、BeaucageおよびCarruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981およびMatteucciら, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981に論じられている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザー上で行うことができる。
【００３３】
遺伝子の"発現"とは、遺伝子が転写されて対応するｍＲＮＡを生成し、ついでこのｍＲＮＡが翻訳されて対応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生成することをいう。遺伝子発現は、プロモーターのごとき５'調節エレメントを含む調節エレメントによって制御またはモジュレートされる。
【００３４】
"組換えＤＮＡ構築物"、"組換えベクター"、"発現ベクター"または"発現カセット"とは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、自律複製配列、ファージ、またはいずれかの起源由来の、ゲノム組み込みまたは自律複製することができる、１またはそれを超えるＤＮＡ配列が機能的に作動可能な様式で連結しているＤＮＡ分子を含む、線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列のごときいずれかの因子をいう。
【００３５】
"相補的"とは、塩基対形成による核酸配列の自然の会合をいう。核酸対のうちのいくつかのみが相補的である場合、２の二本鎖分子の間の相補性は部分的になり得る；あるいは、すべての塩基対が相補的である場合、完全である。相補性の度合いは、ハイブリダイゼーションおよび増幅反応の効率および強度に影響する。
【００３６】
"ホモロジー"とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性または類似性からみた、各々、核酸またはアミノ酸配列の間の類似性、すなわち配列の類似性または同一性のレベルをいう。ホモロジー、ホモログおよび相同も、異なる核酸またはタンパク質の中での類似の機能特性の概念をいう。相同は、１またはそれを超える以下の方法で本明細書に開示したまたは適当なデータベース（ＮＣＢＩまたはほかのような）に見出される遺伝子のコード配列を用いることによって決定し得る。タンパク質配列については、配列はアルゴリズムを用いて比較すべきである（例えば、"同一性"および"実質的同一性"のセクションをご参照）。ヌクレオチド配列については、１のＤＮＡ分子の配列をほぼ同じ方法で知られているまたは推定ホモログの配列に比較することができる。ホモログは、分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子）のいずれかの実質的な（２５ヌクレオチドまたはアミノ酸、より好ましくは５０ヌクレオチドまたはアミノ酸、より好ましくは１００ヌクレオチドまたはアミノ酸、または最も好ましくはより短い配列の全長の）領域の間で、少なくとも２０％同一、より好ましくは３０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８８％、より好ましくは９２％、最も好ましくは９５％同一である。
【００３７】
あるいは、２の配列または１もしくは両方の配列の相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし、同様の機能を示す場合、２の配列、またはアミノ酸配列をコードするもしくはコードし得るＤＮＡもしくはＲＮＡ分子は相同またはホモログであるか、または相同配列をコードする。したがって、２のタンパク質配列が相同であるかを決定することができれば、本明細書に記載するコンピュータ訓練を行い、およびタンパク質をコードし得るすべての可能な核酸配列の配列をコードする縮重を作製し、それらがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るかを決定し得るであろう。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、６.０×塩化ナトリウム／酢酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃、つづいて２.０×ＳＳＣ、５０℃の洗浄は、当業者に知られており、あるいはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２.０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーないし約０.２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーから選択し得る。また、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増大させ得る。温度および塩濃度は両方とも変化させることができ、あるいは温度または塩濃度のうちのいずれかの変数を変化させつつ他方のものを一定に保持することができる。１の好ましい形態において、本発明に記載するタンパク質をコードする核酸は、非常にストリンジェントな条件、例えば約２.０×ＳＳＣおよび約６５℃にて、１またはそれを超える核酸分子またはその相補体もしくはいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られている多くの方法によって検出することができ、これらには限定されるものではないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースタグおよび化学ルミネセンスタグが含まれ得る。
【００３８】
"低温ショックタンパク質（または複数のタンパク質）"（Csp(s)またはCSP（s)）は、エスシェリキア・コリのＣｓｐＡタンパク質（配列番号：１）またはバチルス・ズブチリスのＣｓｐＢタンパク質（配列番号：２）に対して４０％を超える同一性を有し、あるいは、低温ショックタンパク質は文献において決定された保存されたドメインを用いることによって見出し得る。例えば、本願明細書中で用いるように、低温ショックタンパク質は、イー・コリのＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスのＣｓｐＢの全長にわたり、イー・コリＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスＣｓｐＢに４０％同一、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％同一、より好ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一である。Ｇｅｎｂａｎｋないしタンパク質の関係を決定し、および／または関連するタンパク質を見出すことができるように設計されたタンパク質データベースのような、幾つかのデータベースが利用可能であり、それによって当業者は新たなまたは既存のタンパク質が低温ショックドメインを含むか否かまたは低温ショックタンパク質であるかを決定することができる。本明細書の定義内に含まれるものは、すべての知られている低温ショックタンパク質であり、限定されるものではないが、エスシェリキア・コリからのＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＦ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＨおよびＣｓｐＩ（米国特許第６,６１０,５３３号）が含まれる。
【００３９】
保存された低温ショックドメインを配列番号：３に示す（[FY]-G-F-I-x(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY]）（プロサイトモチーフPS00352；Bucher and Bairoch, (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hofmannら, Nucleic Acids Res.27: 215, 1999）。別法として、低温ショックタンパク質はSprint データベースを用いて見出することができる（関係のあるタンパク質のフィンガープリントデータベース）（Attwoodら, Nucleic Acids Res. 28(1): 225, 2000; Attwoodら, Nucleic Acids Research, 30(1), 印刷中, 2002）。別法として、低温ショックタンパク質はマトリックスベースのデスクリプションまたはPfamを用いて見出すことができる。Pfamは複数の配列アライメントおよび多くの一般的なタンパク質ドメインをカバーする隠れマルコフモデルの大きな収集である（Batemanら, Nucleic Acids Reserch, 28:263, 2000）。この記載では（２００１年１１月；Pfam release 6）、３０７１のファミリーが存在する。低温ショックタンパク質はＰＦ００３１３として含まれる。種系統樹はPfamデータベースにおいて決定された低温ショックタンパク質の分布を示している。
【００４０】
本明細書中で用いる"低温ショックタンパク質"には、限定されるものではないが、National Center for Biotechnology Informationで見出すことができる"Blink"(Blast Link）機能を用いるデータベースの、クエリー配列として低温ショックタンパク質を用いたサーチで見出されるいずれのタンパク質も含まれる。"Blink"は同様の配列を用いてタンパク質を見出すために用いる高速サーチ関数である。"低温ショックタンパク質"または"低温ショックドメイン"のこの定義は、前記に用いたものに加わるものであり、該定義を置き換えるものではない。低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質には、限定するものではないが、公共および個人的なデータベースにおいてすべての現在知られているタンパク質、ならびにBlast Linkで現在（２００１年１１月１日）用いられている標準blastサーチ設定下で"ヒット"する特許請求するタンパク質に十分に類似していることがいままでに発見されているもの（例えば、イー・コリのＣｓｐＡおよびビー・ズブチリスのＣｓｐＢ）が含まれる。このライティングでBlast２を稼働し、Blast Link（"Blink"）はタンパク質−タンパク質blastサーチにデフォルトパラメータを稼働する。このライティングのもののように、本発明者らは、Blinkで使用したデフォルト設定は以下のように考える；"ｎｒ"データベースを用いてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを稼働する、ＣＤサーチが"低複雑度"、予想値を１０、３のワード・サイズ、ギャップコストは；イグジスタンス（existance）１１、および伸長１として選択された複雑度のコンポジションベースの統計学としてＣＤサーチが選択される。表Ｉのリストは、これらの標準的設定を用いたイー・コリのＣｓｐＡについての最初の２００ヒットを示しているが、本発明者らは特許請求の範囲を最初の２００に限定しない。当業者はこれらのかなりストリンジェントな基準下では細菌起源の１６７のタンパク質を見出したが、２８の後生動物および５の植物のタンパク質も見出すであろう。これらのタンパク質には、本発明者らにより本発明において機能すると予想される、ＣｓｐＡに対してその相同性を行ったように、広い範囲のタンパク質が含まれる。これは決して全包含リストではなく、他のタンパク質も本発明において機能することが予想される。
【００４１】
表２０．幾つかの低温ショックタンパク質およびイー・コリＣｓｐＡに対する類似性によって見出された低温ショックドメインを含む幾つかのタンパク質
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ配列番号および名称を示す：タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、ｃＤＮＡ、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列を用いる比較において、最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
【００４２】
【表１−１】
【００４３】
【表１−２】
【００４４】
【表１−３】
【００４５】
【表１−４】
【００４６】
【表１−５】
【００４７】
バチルス・ズブチリスのＣｓｐＢは、低温ショックに応答して蓄積するタンパク質である（Willimskyら, Journal of Bacteriology 174: 6326 (1992))。それはイー・コリからのＣｓｐＡに対して相同性を有し（表１を参照されたい）、一本鎖核酸結合ドメインを含む（Lopezら, The Journal of Biological Chemistry 276: 15511 (2001)）。ＮＣＢＩにおける同じベーシックＢｌａｓｔサーチ（Ｂｌｉｎｋ）を用いて、以下のタンパク質が"ヒット"として指定された。本明細書に示すヒットの数は２００に限定されるが、多くの他のタンパク質が本発明で機能的であると予想される。
【００４８】
表２１．幾つかの低温ショックタンパク質およびビー・ズブチリスＣｓｐＢを用いたサーチで見出された低温ショックドメインを含むタンパク質
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ配列番号および名称を示す：タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、ｃＤＮＡ、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列に対する最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
【００４９】
【表２−１】
【００５０】
【表２−２】
【００５１】
【表２−３】
【００５２】
【表２−４】
【００５３】
【表２−５】
【００５４】
【表２−６】
【００５５】
ＣＳＰは、温度が低下するかまたは他のストレスが加えられた場合に、量において増加し得るまたは増加しないタンパク質の群である。事実、低温ショックタンパク質に関して最もよく研究された生物、イー・コリにおいては、幾つかの低温ショックタンパク質が構成的に発現し、他のタンパク質は低温によって誘導され、いまだ他のものは特定のストレスおよび／または成長条件またはステージに特異的のようである。この概説はYamanakaら, Molecular Microbiology, 27: 247(1998)である。この概説において、Yamanakaおよび共同研究者は、イー・コリにおいて９の低温ショックタンパク質（ＣｓｐＡないしＣｓｐＩ）がどのように発現されるかを詳述している。ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢおよびＣｓｐＧは低温誘導性である。ＣｓｐＤは細胞周期の定常期および飢餓の間に誘導される。ＣｓｐＣおよびＥは細胞分割に関係付けられている。
【００５６】
ＣｓｐＡはエスシェリキア・コリからの主低温ショックタンパク質である（配列番号：１）。ＣｓｐＡは主低温ショックタンパク質７.４とも呼ばれる。ＣｓｐＡは低温ショックに応答して高度に誘導される（Goldsteinら, Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 283 (1990))。より遅い増殖の幾つかの条件において、ＲＮＡまたはＤＮＡ二次構造形成に起因してリボソームが鈍化され、これは、その本来の生物中のＣＳＰの増大した合成についてのシグナルとして作用し得る。ＣＳＰは、イン・ビトロ(in vitro)条件下でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡに結合する（Phadtareら, Molecular Microbiology 33: 1004 (1999))。ＣＳＰは翻訳の間に比較的非特異的な様式でＲＮＡに結合し、二次構造形成を妨害し、ＲＮＡを安定化させる（この機能はＲＮＡシャペロンといわれることがある）と考えられている。ついで、リボソームが簡単にＣＳＰに取って代わり、線状ＲＮＡテンプレート上で翻訳を開始する。本発明者らは、これらのタンパク質の一本鎖核酸結合機能を含み得ると考え、この機能は、例えば原核生物低温ショックタンパク質、真核生物Ｙ−ボックス含有遺伝子、幾つかのグリシンに富むタンパク質（ＧＲＰ）、および低温ショックドメインを含む他のタンパク質を包含する、いずれかの低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質から生じ得る。これらのタンパク質には、限定されるものではないが、図４、Trends in Biochemical Science, 23(8):289 (1998)（出典明示して本明細書の一部とみなす）に示されるものが含まれる。この図は、これらのタンパク質間の進化の関係を明らかに示している。これらのタンパク質の起源は、現代の細菌および真核生物の分岐よりも先のようであり、これらのタンパク質は単細胞進化の出現時、３５億年前に存在していたと仮定されている。本発明者らは、前記に引用した図に示すように、例として２のタンパク質を選択して植物に形質転換した。これらのタンパク質はそれらの多くの真核生物相対物からよりも互いにより大きく分岐している。本発明者らは、これらのタンパク質の異なる場所での発現は生物的および非生物的ストレスに対する耐性を改善し得ると予想し、それは、限定されるものではないが、低温、渇水、塩ストレス、熱、低温ショック後の生存、菌類感染、ウイルス感染、微生物感染、および低温発芽を含み得る種々のストレスの多い条件下での植物の生長、活力、収量および健康を包含し得る。
【００５７】
ストレス下での植物の増大した生長速度のもう１の可能な説明は、ＣＳＰの発現によって提供される病原菌関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の顕在化とし得る。このモデルにおいては、植物がストレス適用に先立ってそのストレスに対して"準備する"ように、幾分全身獲得抵抗性（生物的ストレスに対してはほとんどＳＡＲのように作動する）のような植物応答を顕在化するＰＡＭＰを発揮する。ＣＳＰが存在することが、植物がシグナル伝達しなければならないが植物に作動するこのモデルについては、このメカニズムはＣＳＰを結合する植物受容体を介して最近提供されたものかもしれない（Felixら, Journal of Biological Chemistry, 278(8): 6201-8 (2003)）。このメカニズムは、ＰＡＭＰ−型応答を顕在化する受容体結合をいずれかの遺伝子が本発明において機能するであろうことを意味するであろう。ＰＡＭＰ−型応答の顕在化は、一般的に生物的ストレスについて研究されており、因子の外因的な投与を介して顕在化する場合がある。本明細書において、本発明者らは、ＣＳＰトランス遺伝子から生成するＣＳＰに対するＰＡＭＰ−型応答を顕在化し得た。トランスジーンは、パーティクルガンまたはアグロバクテリウム媒介形質転換を通して、組換えＤＮＡ構築物の一部分として植物細胞に形質転換した。ついで、これは、植物における全身獲得型の応答を創製し得、ついで、非生物的ストレスに対する抵抗性を増大し得た。この応答は、限定するものではないが、トウモロコシ、ダイズ、ムギ、イネ、アラビドプシス（Arabidopsis）、キャノーラおよびワタを含む単子葉植物および双子葉植物の両方において作動し得た。前記ＰＡＭＰ法がＣＳＰに対して活動の様式である場合、ＣＳＰは生物的ストレス保護ならびに非生物的ストレス保護を提供すると予想し得る。これらのメカニズムは限定することを意味するものではなく、１または両方または無数の他のものが現れた表現型に含まれ得る。
【００５８】
バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringensis）からのＣｓｐ様タンパク質であるＭＦ２は、植物におけるウイルス感染に対して何らかの保護を与えると評判となっている。米国特許第６,５２８,４８０号は、タンパク質を含有する抽出物で植物の葉を擦ることおよび植物をウイルスに感染させることを介する生物的ストレスに対するこの耐性を示している。それらは、その中で作製していないが、トランスジェニック植物を黙考している。
【００５９】
"同種の非形質転換植物"とは、形質転換植物と同種のすべての植物を含むことを意味する。１の形態において、形質転換植物は、形質転換植物と同じ種および株のものである。もう１の形態において、植物は、形質転換植物と可能な限り同一である。
【００６０】
"低温ショックドメイン"（ＣＳＤ）は、低温ショックタンパク質と相同であるタンパク質配列である。本発明の目的につき、低温ショックドメインを含有するタンパク質は"低温ショックタンパク質"である。イー・コリＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスＣｓｐＢおよび低温ショックドメインを含有するタンパク質の低温ショックドメインの間には４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％を超えるアミノ酸同一性が見られる（Wistow, Nature, 344:823 (1990)；Yamanakaら, Mol. Micro., 27: 247, 詳細にはYamanaka参考文献中の図１Ｂを参照されたい；Graumannら, TIBS 23: 286）。
【００６１】
本明細書中で用いる"酵母"は、規則正しくはサッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）をいうが、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）および他の種（例えば、ピキア（Pichia）属からのもの）も含み得る。"トウモロコシ"とはジア・メイズ（Zea mays）および、それと繁殖し得るすべての種および品種をいう。"コムギ"とは限定するものではないが、春、冬およびすべての環境適応性のムギ品種が含まれる。"コムギ"には限定するものではないが、デュラムコムギ（Triticum durum)、スペルトコムギ（Triticum spelta)、エンマーコムギ（Triticum dicoccum）およびヒトツブコムギ（Triticum monococcum）を含むいずれかのほかのコムギ種が含まれる。"コムギ"には前記したコムギ種のいずれかと繁殖し得るいずれの種のもの、該交雑の子孫（ライムギ、コムギおよびライムギの雑種を含む）も含まれる。"ダイズ"とは、グリシン・マックス（Glycine max）またはグリシン・ソジャ（Glycine soja）およびそれらと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"イネ"とはオリザ・サティバ（Oryza sativa）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。”オオムギ”とはホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"エンバク"とはアベナ・サティバ（Avena sativa）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"キャノーラ"とは遺伝的に改変されたナタネ植物、アブラナ科植物（Brassica napus L.）およびターニップ・レイプ（B. campestris L）によって生産される種子、油および粉に対して最近与えられた新造名であり、本明細書中においてキャノーラにはすべてのナタネ植物およびそれと繁殖し得る生物が含まれる。本明細書中で用いるイー・コリおよびエスシェリキア・コリには、エスシェリキア・コリ種およびこの生物のすべての菌株；例えば、イー・コリＫ１２が含まれる。本明細書中で用いるイー・コリおよびエスシェリキア・コリには１がＦ＋またはＨｆｔ株で、他がそれでない場合にいずれかのイー・コリと接合し得るいずれの生物をも含み得る。ビー・ズブチリスおよびバチルス・ズブチリスとは、バチルス属、ズブチリス種のすべての生物をいう。本明細書中で用いるアグロバクテリウム・ツメファシエンスには、この種のすべての菌株および型が含まれる。"ターフグラス"には、芝生を生成するためにいままでに植えられたまたは植えることができたすべてのシバの種および株が含まれ、ターフには限定されるものではないが；ゲーム（すなわち、フットボール、野球またはサッカー）を行うフィールドおよびゴルフコースのすべてのエリア（すなわち、ティー、フェアウェイ、グリーン、ラフほか）である芝生が含まれる。"ワタ"とはゴシピウム属のすべての植物およびそれと繁殖し得るすべての植物をいう。
【００６２】
"熱耐性"とは、高温または暖かい温度が同種の植物の生長、活力、収量、サイズに有害に作用する条件下で生長する植物の能力の尺度を意味する。熱耐性植物は、同種の非熱耐性植物よりも熱ストレスの条件下でより良好に生長するであろう。
【００６３】
"塩耐性"とは、浸透ストレス下、または水および土壌中の塩またはイオンによって生じるストレス下で生長するある植物の能力をいう。例えば、液体を潅漑した場合または同種のほかの植物の生長に有害な影響を与える水およびイオンの混合物を含有する培地に植えた場合に、同種および／または同品種の植物と比較して増大した生長速度を有する植物は、塩耐性であるというであろう。ある形質転換植物は、同種および同株の非形質転換植物よりもこれらの型の条件に対してより大きな耐性を有する。
【００６４】
本明細書中で用いるすべての数値は"約"なる語によって修飾されなければならず、約とは１０パーセントまでいずれかの向きで変化し得、なお同じ意味を保持している。例えば、１Ｍ溶液は、１.１Ｍ以下であって０.９Ｍを超える型のすべての溶液を含まなければならない。例えば、パーセントも修飾されなければならず、１０％は９％ないし１１％のすべてのパーセントを含むものである。"正確には"なる形容詞によって定義される用語は、"約"なる用語によっては定義されない。
【００６５】
"グリシンに富むタンパク質"とは、低温ショックドメインを含むタンパク質であるかまたはそれと実質的同一性を有する、またはそのホモログである真核生物におけるタンパク質と定義される。
【００６６】
"低温ショック後の生存（率）"とは、その植物の生長ステージにおいてその種の植物が通常出くわす温度未満の温度に置かれた後の、有意な期間に生長を続ける植物の能力と定義される。ある植物が、同種のものでさえが、低温条件下での生長について選択されていることは注意しなければならない。トウモロコシの同系繁殖体Wigor株は低温条件に耐えることができ、合衆国において市販されている大部分の系統よりもその条件に置いた場合に有意により高い生存率を有する。Wigorはポーランドにおいて市販されている。したがって、トランスジェニック植物についての低温耐性は、同じ相対年齢における同株ならびに同種の植物内で比較して、意味のある科学的データを取得しなければならない。その場合、植物は、直ちに、または数日または数週間後にスコアを付けて、ショック後のその生存能力、生長速度およびほかの表現型を判定しなければならない。
【００６７】
"渇水"または"水分が生長を制限するであろう"とは、特に持続した場合に、作物に対して損傷を生じ得るまたはその首尾よい生長を妨害し得る乾燥の期間と定義される。ここでも、同種の異なる植物、および同種の異なる株の植物が、渇水、乾燥および／または水欠乏に対して異なる耐性を有する場合がある。研究室においては、渇水は対照植物よりも９５％以下の水を与え、ついで、活力、生長、サイズ、根の長さ、およびほかの無数の生理学的および物理的測定値における差異を探すことによってシミュレートし得る。渇水は、特に水がその植物の生長を厳格に制限する場合には、ある植物は灌水するがほかの植物は灌水せず、その生長速度を比較することによって圃場においてもシミュレートすることができる。
【００６８】
非生物的ストレス耐性には、限定されるものではないが、増大した収量、生長、バイオマス、健康またはストレスに対する耐性を示す他の測定値が含まれ、該ストレスには、限定されるものではないが、熱ストレス、塩ストレス、低温ストレス（発芽の間の低温ストレスを含む）、水ストレス（限定されるものではないが、渇水ストレスを含む）、窒素ストレス（高および低窒素を含む）が含まれる。
【００６９】
生物的ストレス耐性には、限定されるものではないが、増大した収量、生長、バイオマス、健康またはストレスに対する耐性を示す他の測定値が含まれ、ストレスには菌類感染、最近感染および植物のウイルス感染が含まれる。
【００７０】
本発明の一部分として開示したある種の遺伝子配列は、起源が細菌であり、例えばある種の原核生物低温ショックタンパク質である。非改変細菌遺伝子がトランスジェニック植物細胞においてほとんど発現しない場合があることは当業者に知られている。植物コドンの慣習法は、細菌のごとき単細胞生物よりもヒトおよび他の高等生物のものにより類似している。幾つかのレポートは、植物における組換え遺伝子の発現を修飾する方法を開示している。これらのレポートは、疑われるポリアデニル化またはＡ／Ｔに富むドメインまたはイントロン・スプライシング共通配列を回避する組換え配列を用いて、植物コドン出現頻度表、コドン第三塩基位置のバイアスにおける修飾に基づいて、より効率的である配列を表すコード配列を設計する種々の方法を開示している。合成遺伝子構築物に関するこれらの方法は注目に値するが、本発明者らはBrownら（出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５,６８９,０５２号、１９９７年）の方法および／または前記に引用した方法、ならびに他のものに従って低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質の合成遺伝子を作製することを熟考する。かくして、本発明は、所望のタンパク質産物をイン・プランタ（in planta）で発現する合成植物遺伝子を調製する方法を提供する。簡単には、Brownらに従って、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で低頻度でしか利用されていないコドンおよび半低頻度でしか利用されていないコドンの頻度を減少させ、より好ましい単子葉植物コドンで置き換える。単子葉植物における改変ポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの蓄積の増加は、連続する６ヌクレオチドフラグメント中のコード配列を解析し、単子葉植物における最も低頻度の２８４、４８４および６６４の６ｍｅｒの出現の頻度と同様に６ｍｅｒの出現の頻度を改変したことによる好ましいコドンの出現頻度の増大の結果である。さらに、Brownらは、ヌクレオチド配列中のポリアデニル化シグナルおよびイントロン・スプライスサイトの発生を減少する方法とともに低頻度コドンの出現頻度を低下させる方法を適用し、ヌクレオチド配列中の自己相補的配列を除去し、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を維持しつつかかる配列を非−自己相補的ヌクレオチドで置き換え、ついでヌクレオチド配列中の５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチド対の出現の頻度を減少させることによる組換え遺伝子の発現の上昇を開示している。これらの工程は、順次行い、所望のポリペプチド中に存在する大部分のアミノ酸について単子葉植物により好ましい単子葉植物コドンの優先的な利用を含むヌクレオチド配列を生じる累積的効果を有する。詳細には、本明細書で言及するすべてのタンパク質は、前記に論じたようにまたは同様の方法を用いて合成遺伝子に作製することが意図され、限定されるものではないが、エスシェリキア・コリＣｓｐＡおよびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢが含まれる。
【００７１】
本明細書中に記載する作業は、低温ショックタンパク質および低温ショックドメインを含むタンパク質のイン・プランタでの発現を活性化する方法を同定し、それは多くの植物ストレスに対する耐性を付与し得、それには限定されるものではないが、感受性植物の核、プラスチドまたは葉緑体ゲノムに取り込んだ後に正規の場所以外で発現する低温、熱、渇水、塩および他のストレス、あるいはストレス関連表現型（低温発芽、低温ストレス後の生存率、および他の非生物的ストレス）が含まれる。米国特許第５,５００,３６５号（特に出典明示して本明細書の一部とみなす）は、合成遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを最適化する植物遺伝子を合成する方法を記載している。この方法は、外来性トランス遺伝子をより"植物様"とし、したがって植物、単子葉植物または双子葉植物によってより翻訳および発現される見込みがあるようにするための、その構造遺伝子配列の修飾に関する。しかしながら、米国特許第５,６８９,０５２号に開示する方法は、好ましくは単子葉植物におけるトランスジーンの高められた発現を提供している。
【００７２】
本発明の核酸構築物を開発することにおいて、構築物の種々のコンポーネントまたはそのフラグメントは、通常は、都合のよいクローニングベクター、例えば細菌宿主、例えばイー・コリ中で複製することができるプラスミドに挿入する。文献に記載されている膨大な数のベクターが存在し、その多くは市販されている。各クローニングの後に、所望の配列のコンポーネントを仕立てるように、所望のインサートを有するクローニングベクターを単離し、制限分解、新たなフラグメントまたはヌクレオチドの挿入、連結、欠失、突然変異導入、レセクションほかのごときさらなる操作に付することができる。構築物が完成されたら、ついでそれは、宿主細胞の形質転換の様式と一致するようにさらに操作するために適当なベクターに移すことができる。
【００７３】
例えば、発現カセット中に低温ショックタンパク質を含む本発明の二本鎖ＤＮＡ分子は、いずれかの適当な方法によって植物のゲノムに挿入し得る。好適な植物形質転換ベクターには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来のもの、ならびにHerrera-Estrellaら(1983）、Bevan(1984)、Kleeら(1985)およびＥＰＯ公報１２０,５１６によって開示されたものが含まれる。アグロバクテリウムのＴｉまたは毛状根誘導（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、別の方法を用いて本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入することができる。かかる方法には限定されるものではないが、例えばリポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取込みを増加させる化学剤、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを介する遊離ＤＮＡデリバリー、およびウイルスまたは花粉を用いた形質転換が含まれ得る。
【００７４】
エレクトロポレーションを用いて単子葉植物に低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子を導入するのに好適なプラスミド発現ベクターは、以下のものからなり得る：植物中で機能するプロモーター；スプライスサイトを提供してＨｓｐ７０（ＰＣＴ国際公開公報、ＷＯ９３／１９１８９）のごとき遺伝子の発現を促進するイントロン；およびノパリンシンターゼの３'配列（ＮＯＳ ３')のごとき３'ポリアデニル化配列。この発現カセットは、大量のＤＮＡの生成に好適な高コピー複製起点に会合し得る。
【００７５】
植物形質転換に有用なＴｉプラスミドカセットベクターの例はｐＭＯＮ−１７２２７である。このベクターはＰＣＴ国際公開ＷＯ ９２／０４４４９に記載され、グリホセート耐性を付与する酵素をコードする遺伝子（ＣＰ４と命名された）を含み、これは多くの植物の優れた選択マーカー遺伝子である。遺伝子は前記したようにアラビドプシスＥＰＳＰＳ葉緑体トランジット（transit）ペプチド（ＣＴＰ２）に融合し、ＦＭＶプロモーターから発現させる。セドヘプツロース−１,７−ビスホスファターゼ遺伝子またはｃＤＮＡを含有する十分な数の細胞（またはプロトプラスト）を得た場合、該細胞（またはプロトプラスト）を全植物に再生する。再生工程の方法の選択は極めて重要ではないが、マメ科植物（アルファルファ、ダイズ、クローバーほか）、セリ科植物（ニンジン、セロリー、パースニップ）、アブラナ科植物草本（キャベツ、ハツカダイコン、キャノーラ／ナタネほか）、ウリ科植物（メロンおよびキュウリ）、イネ科植物（コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシほか）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）、ヒマワリのごとき種々のフローラル作物（floral crop）、およびアーモンド、カシュー、ウォールナッツおよびペカンのごとき堅果をぶら下げた木本からの宿主に利用可能である適当なプロトコールを有する。
【００７６】
本発明の実施によって低温ショックタンパク質を発現するように作製し得る植物には、限定されるものではないが、アカシア属植物、アルファルファ、アニス、リンゴ、アプリコット、アーチチョーク、キバナスズシロ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、セイヨウヤブイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリ、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セルリー、サクラ、コエンドロ、カンキツ属植物、クレメンタイン、コーヒーノキ、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、アメリカトガサワラ、ナス、エンダイブ、キクジシャ、ユーカリノキ、フェンネル、イチジク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、ハネージューメロン、クズイモ、キーウィ、レタス、ニラネギ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュローム、堅果（nut）、エンバク、オクラ、タマネギ、柑橘類植物、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ラッカセイ、セイヨウナシ、コショウ、カキ属の木、マツ、パイナップル、オオバコ、スモモ、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアータマツ、アカチコリー、ハツカダイコン、ラズベリー、イネ、ライムギ、サトウモロコシ、ダイオウマツもしくはダイオウショウ（Southern pine）、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ 、タンジェリン、チャノキ、タバコ、トマト、ターフ、ブドウノキ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、ズッキーニ、またはいずれかのほかの植物が含まれる。
【００７７】
"プロモーター"とは、ＲＮＡポリメラーゼ（および、しばしば他の転写因子）に結合し、下流ＤＮＡ配列の転写を促進するＤＮＡ配列をいう。プロモーターは、他のものと比較して、ある組織においては高められたまたは減じられた発現を提供する場合がある。プロモーターの選択、特に植物が非生物的ストレスを受ける場合に発現を増大するプロモーターを選択することは、本発明において特に有用となり得る。
【００７８】
あるストレス応答が植物に対して同様の効果を有することが当該分野において観察されており、１のものに対する抵抗性は他のものに対する抵抗性を提供し得る。これは、例えば、脱水および低温に対する応答の間に見られる（Shinozakiら, Current Opinions in Plant Biology 3(3):217, 2000）。多くの他の論文は、異なる非生物的ストレス間の一般的な相互関係を示し、１のストレスに対する耐性は幾つかの他の非生物的ストレスのより大きな耐性に通じ得ることを示し得る（Pernasら, FEBS Lett 467(2-3): 206, 2000; Knight, Int Rev Cytol 195: 269, 2000; Didierjeanら, Planta 199: 1, 1996; Jeongら, Mol Cells 12: 185, 2001）。
【００７９】
Ｔ−ＤＮＡ中に含まれる植物発現因子の外側のＤＮＡセグメント中に見出される発現カセットおよび調節因子は、多くのプラスミドＤＮＡバックボーンで共通であり、および、プラスミド維持因子として機能し、これらには限定されるものではないが、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性のaad（Spc/Str）遺伝子、イー・コリ中での維持のための複製起点を提供するｐＢＲ３２２ ori（ori322）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞への接合移入のためのｂｏｍサイトが含まれ、ＤＮＡセグメントはＲＫ２プラスミドからの複製起点を含む０.７５ｋｂのoriＶである。また、植物への形質転換を意図するこれらのプラスミドは、因子を挿入するように機能するためのアグロバクテリウムの内因性ＤＮＡ一体化タンパク質に必要な因子を含む場合がある。これらには、ボーダー（右側（ＲＢ）および左側（ＬＢ）ボーダー）が含まれる。
【００８０】
本明細書中で用いる組換えＤＮＡ技術における研究室の手順は当該技術分野においてよく知られているものであり、普通に利用されている。標準的な技術を、クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡ単離、増幅および精製に使用する。一般的に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応は、製造業者の説明書に従って行う。これらの技術および種々の他の技術は、一般的に、Sambrookら, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborator, New York (1989)に従って行う。
【００８１】
本願明細書で引用したすべての出版物および公開された特許書類は、各々個別の出版物または特許出願が出典明示して本明細書の一部とみなすと特異的および個別的に示される場合と同じ程度で参照して出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００８２】
以下の実施例を含めて本発明の形態を示す。本発明者によって発見された以下の代表的な技術が本発明の実施において良好に機能することは当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、多くの変化を特定の形態で作成することができ、類似するまたは同様の結果がいまだ得られることは正しく認識しなければならず、したがって、添付する図面および実施例に記載されているまたは示されているすべての事項は説明で、それらに限定する意味ではないと理解されるべきである。
【００８３】
実施例
実施例１
ｐＭＯＮ５７３９６（図１）は、アラビドプシス（Arabidopsis）におけるエスシェリキア・コリＣｓｐＡと同様のタンパク質（配列番号：５６）のアグロバクテリウム媒介形質転換および構成的発現のためのバイナリーベクターである。イー・コリＣｓｐＡ遺伝子をクリーニングするために、２の遺伝子特異的プライマー、ＭＦ１およびＭＦを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）からのＣｓｐＡ配列情報（Genbank M30139, GI: 409136）に基づいて設計した。ＭＦ１の配列は、ＣｓｐＡの翻訳開始部位にアニールし、５'末端にNcoIサイトを導入するAGGTAATACACCATGGCCGGTAA（配列番号：６６）であり、一方ＭＦ２の配列はＣｓｐＡの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT（配列番号：６７）である。ＰＣＲを行って、イー・コリＣｓｐＡを単離した。詳細には、イー・コリＤＨ５α細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、ＭＦ１およびＭＦ２プライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社（Indianapolis, IN）からのＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いてＣｓｐＡ遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした：９４℃、１分、その後に９４℃、１６秒；５５℃、１分および７２℃、１分のサイクルを３０回繰り返す。増幅したＣｓｐＡ ＤＮＡは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターｐＭＯＮ２３４５０（図２）に連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された以下の手順に従って行った（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換した細胞を適当な選択培地にプレートし（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
【００８４】
得られたプラスミドは、制限マッピング（例えば、Griffithsら, An introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp.449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトと同様に、ベクターを上流（５'）のＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターおよび下流（３’）のエピトープタグ（Flag, これはオリゴペプチドDYKDDDK（配列番号：６８）をコードする）によって挟み、したがってこの構築物中のイー・コリＣｓｐＡはＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識され、アラビドプシスにおける形質転換の際にはＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動されるであろう。前記クローニングは、配列番号：５５に類似するタンパク質をコードするプラスミドを生じる。得られたプラスミドはｐＭＯＮ５７３９６という。
【００８５】
実施例２
ｐＭＯＮ５７３９７（図２）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびエスシェリキア・コリＣｓｐＡのようなタンパク質の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ｐＭＯＮ５７３９７を作製するためには、ＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識されたエスシェリキア・コリＣｓｐＡ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＭＯＮ５７３９６を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、FLAGエピトープタグを放出した（FLAGタグはオリゴペプチドDYKDDDK, Sigma, St. Louisをコードする）。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、かつ、製造業者（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリに形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換細胞は適当な選択培地（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。前記クローニングは、配列番号：５７に類似するタンパク質をコードするプラスミドを生じる。
【００８６】
得られたプラスミドは、XhoIおよびSalIサイトが存在しないことを確認する制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。この構築物中のイー・コリＣｓｐＡ遺伝子はＣ−末端において標識されておらず、ＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動する。
【００８７】
実施例３
ｐＭＯＮ５７３９８（図４）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：５９）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子をクローニングするためには、２の遺伝子特異的プライマーＭＦ３およびＭＦ４ａを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）からのＣｓｐＢ配列情報（Genbank U58859, gi:1336655）に基づいて設計した。ＭＦ３の配列は、ＣｓｐＢの翻訳開始部位にアニールし、５'末端にNcoIサイトを導入するAGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG（配列番号：６９）であり、一方ＭＦ４ａの配列はＣｓｐＢの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT（配列番号：７０）である。ＰＣＲを行って、ビー・ズブチリスＣｓｐＢを単離した。バチルス・ズブチリス細胞はCarolina Biological Supply（Burlington, NC）から得、細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、ＭＦ３およびＭＦ４ａプライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社（Indianapolis, IN）からのＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いてＣｓｐＢ遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした：９４℃、１分、その後に９４℃、１６秒；５５℃、１分および７２℃、１分のサイクルを３０回繰り返す。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターｐＭＯＮ２３４５０（図５）に連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された手順に従って行った（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換し（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor Press, 1989）、後日、コロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
【００８８】
得られたプラスミドは、制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp.449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトを上流（５'）のＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターおよび下流（３’）のエピトープタグ（Flag、これはオリゴペプチドDYKDDDK（SIGMA, St Louis）をコードする）によって挟んだ場合、この構築物中のビー・ズブチリスＣｓｐＢ様遺伝子はＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識され、アラビドプシスにおける形質転換の際にはＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動される。このクローニングは、該プラスミドにインサートされた配列番号：５９に類似するタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを生じる。
【００８９】
実施例４
ｐＭＯＮ５７３９９（図６）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：６１）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ｐＭＯＮ５７３９９を作製するために、ＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識されたバチルス・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子を含有するバイナリーベクターｐＭＯＮ５７３９８（前記実施例を参照されたい）を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、ＦＬＡＧエピトープタグを放出した（ＦＬＡＧタグはオリゴペプチドＤＹＫＤＤＤＫ, SIGMA, St Louisをコードする）。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、かつ、製造業者（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換細胞は適当な選択培地（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。このクローニングは、該プラスミドに挿入された配列番号：６１に類似するタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを生じる。
【００９０】
得られたプラスミドは、XhoIおよびSalIサイトが存在しないことを確認する制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版, pp 449-451, ISBN 0-7167-2604-1，W. H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトを上流（５’）Ｎ−末端でＣａＭＶ ｅ３５プロモーターによって挟んだ場合、この構築物中のビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子はＣ−末端で非標識化され、アラビドプシスにおける形質転換の際にＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動された。該プラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。
【００９１】
実施例５
アラビドプシス植物は、多くの利用可能な方法のうちのいずれか１によって形質転換し得る。例えば、アラビドプシス植物は、真空浸潤によるイン・プランタ形質転換法を用いて形質転換し得る（Bechtoldら, In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1199 (1993)）。この例は、どのようにしてアラビドプシス植物を形質転換し得るかを説明する。
【００９２】
ストック植物材料および生長条件
土壌を入れた２.５インチのポットを準備し、それを土壌が締まりすぎて充填されないようかつメッシュが土壌表面と接触することを確かめつつ、メッシュスクリーンでカバーする（これは、発芽する幼植物がメッシュを通して生長し得ることを保証する）。播種し、発芽ドームでカバーする。種子を３−４日春化処理する。１６時間明所／８時間暗所、２０−２２℃、７０％湿度の条件下で植物を生長させる。一週間に２回水を与え、１／２×（製造業者によって推奨されている強度の半分）のPeters 20-20-20肥料（Hummert International, Earth City, MOからのもの））を下方から与えた。微量元素（Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements）（製造業者によって推奨されている全部の強度で）を一週おきに添加した。約１−２週間後に、ドームを除去し、ポット当たり１または２の植物までポットを間引きした。発達した場合には第一の薹（primary bolt）を摘み取って、第２の薹形成をより促進する。５−７日内に、植物は浸潤する準備ができるであろう。
【００９３】
アグロバクテリウムの調製（小スケールおよび大スケール培養）；
アグロバクテリウムＡＢＩ株を、１００ｍｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（ＳＳＣＫと表示する）を含有するＬＢプレートにストリークする。浸潤の２日前に、アグロバクテリウムのループを１０ｍｌのＬＢ／ＳＳＣＫを含有する試験管に入れ、シェーカーに設置し、暗所下、２８℃にて一晩増殖させる。翌日、アグロバクテリウムを４００ｍｌのＹＥＰ／ＳＳＣＫ中に１：５０で希釈し、シェーカーに設置し、２８℃にて１６−２０時間増殖させる。（注記：本発明者らは、ＬＢを最初の一晩培養に使用し、ＹＥＰを大スケールの一晩培養に使用した場合、形質転換率が顕著に良好であることを見出した）。
【００９４】
浸潤
５００ｍｌの遠心ボトルに注入し、ついで３５００ｒｐｍにて２０−２５分間遠心することによってアグロバクテリウム細胞を集める。上清を捨てる。ペレットを乾燥し、ついで０.４４ｎＭのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）（ＤＭＳＯ中の１.０ｍｇ／Ｌストック液をリットル当たり１０μｌ）およびLehle Seeds社（Round Rock, TX）からの０.０２％のVac-In-Stuffを含む２５ｍｌの浸潤培地（０.５％のＭＳベース塩、１％のGamborg’s Ｂ−５ビタミン、５％のスクロース、０.５ｇ／ＬのＭＥＳ、ｐＨ５.７）に再懸濁する。新たにＢＡＰおよびSilwet L-77を浸潤の日に添加する。２００μｌのSilwet L-77および２０μｌのＢＡＰ（０.５ｍｇ／Ｌのストック液）を添加する。残余部（blank）として浸潤培地を用いて、１：１０希釈のアグロバクテリウム懸濁液のＯＤ６００を測る。真空浸潤するための４００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液／浸潤培地、ＯＤ６００＝０.６に必要な体積を計算する。
【００９５】
【数１】
【００９６】
再懸濁した培養液を真空デシケーター内側のRubbermaid容器に入れる。ロゼットを含む全体の植物はカバーされるが土壌があまり冠水しないように、浸潤すべき植物を含むポットを逆さにする。浸潤前は、少なくとも３０分間、植物を水に浸す（これは、土壌がアグロバクテリウム懸濁液を吸収することを保つ）。
【００９７】
〜２３−２７インチＨｇの真空を１０分間引く。真空を迅速に開放する。簡単には、ポットの水を切り、それをダイアパーに並べるトレイの傍らに置き、トレイをドームでカバーして湿度を維持し、生長チャンバーに戻す。翌日、ポットのカバーを外し、それを直立に設置し、ダイアパーを除去する。〜５日に植物に水は与えない。５日が終わった後に、植物に水を与え、前と同じ条件下で生長を続けさせる（浸潤した葉は変性し得るが、植物は花成を終了するまで生存する）。
【００９８】
種子の収穫および滅菌
ほぼ浸潤２週間後に、Lehle Aracons（Lehle Seeds, Round Rock, TX）を用いることによって、植物を個別に円錐形にする。すべての種子が成熟しおよび種子をつけた後（浸潤後〜４週間）、水から植物を取り出して種子を乾燥する。ほぼ２週間後に、円錐形の下方の枝を切り取ることによって種子を収穫する。篩を用いることによって種子を浄化して、長角果および枝材料を捕獲し、種子がそれを通ることを許容する。種子をエンベロープまたは１５ｍｌの三角試験管に入れる。
【００９９】
滅菌する前に所望の量の種子を１５ｍｌの三角試験管に移す。三角試験管の蓋を緩め、それを、４００ｍｌの漂白剤Clorox（Clorox Company, Oakland, CA）および４ｍｌの塩酸を含有するビーカーを含む真空デシケーターの傍らに置く（ＨＣｌはドラフトチャンバー中でCloroxに添加する）。デシケーターを密閉すると同時に真空を引き、〜１６時間、吸引部を閉じる（すなわち、デシケーターはなお真空下にあるが、真空はもはや直接的に引かれていない）。滅菌後、真空を開放し、種子を含む試験管を滅菌したフードに入れる（ガスをなお放出し得るようにキャップは緩めたままにしておく）。
【０１００】
２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを入れた４.３ｇ／ＬのＭＳベース塩、２.０ｇ／ＬのGamborg's B-5（５００×）、１０ｇ／Ｌのスクロース、０.５ｇ／ＬのＭＥＳ、および８ｇ／ＬのPhytagar（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）を含有する選択プレートに種子をプレートする（"播く"）。選択レベルは、カナマイシン６０ｍｇ／Ｌ、グリホセート６０μＭまたはビアラフォス１０ｍｇ／Ｌのいずれかであろう。
【０１０１】
非常に少量の種子を最初にプレートし、コンタミネーションをチェックし得る。コンタミネーションが存在する場合、種子をさらに〜４時間再滅菌し、コンタミネーションについて再度チェックする。第２の滅菌は通常必要でないが、種子が菌類汚染物を保有している場合があり、繰り返して滅菌する必要がある（滅菌時間は、一般的には１６時間より短い。２４時間滅菌時間から顕著な発芽率の低下が始まるからである）。プレートをパラフィルムで密閉し、〜２−４日低温室に置いて春化処理する。種子を春化処理した後に、低温白球根（cool white bulb）を入れたパーシバルに入れる。
【０１０２】
土壌への移行
〜２６℃および１６／８の明暗サイクルにて５−１０日後に、形質転換体は緑色植物体として見えるであろう。さらに１−２週間後に、植物は少なくとも１セットの本葉を有するであろう。植物を土壌に移し、発芽ドームでカバーし、正常なアラビドプシス生長条件を有する生長チャンバーに移動する。新たな生長が明らかになるまでカバーを維持する（通常５−７日）。
【０１０３】
実施例６
野生型非トランスジェニックおよびＣｓｐＡまたはＣｓｐＢトランスジェニック・アラビドプシス植物の生長を比較するために、滅菌ペトリ皿で垂直生長（verticle growth）させた：
野生型またはトランスジェニック種子は以下の方法を用いて液体滅菌した：
・７０％エタノール中での５分インキュベートにつづくボルテックス混合
・３０％Chlorox（６.１５％次亜塩素酸ナトリウム）＋０.０１％Triton X-100中での５分インキュベートにつづくボルテックス混合
・５の連続滅菌水洗浄
【０１０４】
種子は、各々以下のもの：多量養素、微量養素およびビタミンを含み、水酸化アンモニウムでｐＨ５.８に調節し、土壌支持用の１％のPhytagel（Sigma #P8169）を含有する０.５×Murashige and Skoog培地、からなる４０ｍｌの寒天培地を含む１００×１５ｍｍ正方形皿（Becton Diclinson-Falcon #35-1112）にプレートした。
【０１０５】
１０の野生型アラビドプシス種子を、端部からほぼ１ｃｍで等しく離してペトリ皿の１／２の全域にプレートした。これは無菌チップを用いるGilson P-200 Pipettemanで行った。１０のＣｓｐＡまたはＣｓｐＢトランスジェニック・アラビドプシス種子を等しく離して、ペトリ皿の他の１／２の全域に同様にプレートした。プレートにペンで印を付けて、どちらの半分がトランスジェニック種子を含むかを示した。
【０１０６】
ペトリ皿を暗所下、４℃に３日間置いて種子を等級別に分け、ついで２４時間連続光（１２０マイクロアインシュタイン／ｍ２）下、８℃にて６週間、Percivalインキュベーター（モデルAR-36L）に入れた。このインキュベーションの最後に、ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢのロゼットのサイズを野生型のものと比較し、より大きいことを見出した。これは図１６に見ることができる。これは、前記アッセイを用いた第１、第２および最後に描いたプレートにおいて見ることができる。図１６において、第３の写真（ＣｓｐＢ＋Ｆｌａｇ、ｐＭＯＮ５７３９９）は、植物を以下に記載するのと同様の低温ショックアッセイを通したプレートを示している。
【０１０７】
トランスジェニック・アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）種子の低温ショック幼植物活力評価：水平プレートアッセイ
導入：
これは、水平ペトリ皿中の寒天培地上で通常の温度にて発芽させて冷やすのにシフトする際に生長し続けたトランスジェニック・アラビドプシス種子の能力を評価する手順である。要するに、対照植物からの種子およびテスタートランスジェニック植物からの種子を滅菌し、等級別に分類し、ペトリ皿のいずれかの半分に６×８のグリッドでプレートした。プレートは水平位置、通常温度にて、１週間インキュベートし、ついで、プレートの水平位置を維持しつつ、さらに２週間冷蔵温度にシフトした。幼植物の天蓋領域をデジタル写真によって記録し、画像ソフトウェアを用いて定量化した。テスター幼植物の全天蓋領域の対照幼植物のそれとの比率は、トランスジェニックテスター系統において関心のある種々の遺伝子の低温耐性潜在性を比較することができる。
【０１０８】
材料：以下のものは、標準的なバイオテクノロジー研究室において入手可能な醜状の主要な装備（オートクレーブ、バランス、層状流動フードほか）であると仮定する。
【０１０９】
−アラビドプシス種子：このプロトコールをArabidopsis thaliana cv. Columbiaで用いたが、他のアラビドプシス種にも同様に適当のはずである。
−ペトリ皿：Falcon #35-1112（１００ｍｍ×深さ１５ｍｍ）
−培地：Sigma M5519＝Murashige ＆ Skoog Basal Media
−Phytagel(Sigma ＃P-8169)
−寒天培地をオートクレーブ処理し、そこからプレートに注ぐ１リットルのガラスボトル。
【０１１０】
本発明者らは、１のオレンジ色スクリューキャップを有するコーニングガラス・ボトルを用いる。
−磁気スターラーおよび磁気攪拌バー
−５０ｍｌのプラスチック製ピペットを使用し得る電気ピペッター
−種子をプレートするためのプラスチック製拡大レンズを有する小さな蛍光ボックス
−P1000 Gilsonピペッター（または相等物）および無菌チップ
−P200 Gilsonピペッター（または相等物）および無菌チップ
−７０％エタノール、無菌
−３０％Chlorox漂白剤＋０.１％ Tween 20
−滅菌ろ過した脱イオン水
−無菌の小型遠心チューブおよび試験管ラック
−好ましくは暗所の、４℃低温室、冷温ボックスまたは冷蔵庫
−〜１５０μＥ／ｍ２／秒の光源を含む、２２℃のPercival植物生長チャンバーまたは相等物
−〜１５０μＥ／ｍ２／秒の光源を含む、８℃のPercival植物生長チャンバー
−半透過性外科テープ３M Microporeテープ（３Ｍ #1530-1）
−黒色（Sharpie）マーカー
−トラップを有する真空吸引機
−グラシン・バランスウェイト紙（VWR #12578−165）
−計算機
−ノート
−IBM コンパチブル・コンピュータ
−Image-Pro Plusソフトウェア, version 4.1.0.0
−Microsoft Excelソフトウェア
【０１１１】
プロトコール：
１−保存バイアル用または無菌小型遠心チューブのエンベロープ用の小分けした種子
２−種子の同一性を保持するためのシャーピエで試験管を標識する
３−以下の溶液で順次洗浄し、ついで以下に示す時間待機することによる、試験管中の種子の表面滅菌。洗浄の間に少なくとも２回試験管をひっくり返して種子上の溶液の良好な表面接触を確実にする。種子は試験管の底部に沈み、柔軟なペレットを作る：
ａ．３ないし５分間の、７０％エタノールでの滅菌
ｂ．３ないし５分間の、３０％Chlorox漂白剤＋０.１％ Tween 20
ｃ．３０秒間の滅菌ろ過した脱イオン水
ｄ．ｃ工程をさらに４回繰り返し、最後の回に〜０.５ｍｌの滅菌水を種子ペレットの上に残す。
【０１１２】
１−小型遠心チューブを暗所下、４℃にて３日間置いて、プレートした際のより均一な発芽のために種子を等級別に分類する。
［別法として、種子は寒天培地ペトリ皿に直接的に置いてテープを貼って密閉し、ペトリ皿を、以下に示す８℃インキュベーションに先だって、暗所下、４℃にて３日間置くこともできる］
【０１１３】
２−ガラスボトル中に１リットルアリコットの０.５×Murashige and Skoog培地を調製し、水酸化アンモニウムでｐＨを５.８に調節し、ついで１０ｇのPhytagelを添加することによってプレートを作成する。ｐＨを調節する場合およびPhytagel中で均一に混合するためには磁気スターラーを使用し、ついで液体設定（徐々の排出）で４５分間、オートクレーブ処理する。
３−５０ｍｌ無菌ピペットを付けた電動ピペッターを用いてプレートに層状流動フードで注いで各プレートに４０ｍｌの培地を配達し、直ちにプレートを蓋でカバーする。
【０１１４】
４−送風機を切って、少なくとも２時間、層状流動フード中でプレートを冷やし、日付をつけたプラスチックバッグ中、４℃にて保存する。
５−プレートを標識し、種子をプレートする：
【０１１５】
１−半透過ミクロ細孔テープを用いてプレートの全四隅にテープを貼り、日付を標識し、プレートを、２２℃、〜１００μＥ／ｍ２秒の１６時間の日照サイクルに設定したPercivalインキュベーターに入れた。デジタルカメラで各プレートの写真を撮り、データをコンパクトディスクに保存する。
【０１１６】
２−プレートを、８℃、〜１００μＥ／ｍ２秒の２４時間の日照サイクルに設定したPercivalインキュベーターに移す。１層の厚さのみでプレートを水平位置に置き、さらに３週間までインキュベートする。デジタルカメラで各プレートを撮影し、データをコンパクトディスクに保存する。
【０１１７】
３−テスター生殖質が対照と比較してどのように進行しているかを見るために２または３日ごとにプレートを観察し、生殖質の一般的な性能の代表的なものである時点でデジタル撮影する。これには２週間未満（せいぜい３週間）の８℃でのインキュベーションがかかるにちがいない。相異を示すのにより長時間をとる生殖質は、デジタル写真を撮る時点での過密を回避するために、より低い種子密度でプレートする必要がある。
【０１１８】
４−デジタルカメラ写真およびImage-Pro Plusソフトウェアを用いてロゼット天蓋面積（rosette canopy area）を測定する。対照およびテスター集団について平均幼植物天蓋を計算し、発芽していない種子を分析から除去する。対照幼植物およびテスター幼植物について平均幼植物天蓋面積間の比を計算し、対照およびテスター幼植物セットについて標準偏差および標準誤差を計算する。テスター幼植物と対照幼植物との間に統計学的な差異が存在するかを確認する。結果をノートに記録する。
【０１１９】
５−トランスジェニック植物材料用の適当な廃棄容器（透明プラスチック廃棄バッグと灰色のビン）にプレートおよび幼植物を廃棄する。
【０１２０】
実施例７
ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢ遺伝子のＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコール（Invitrogen, Carlsbad, CA）に従ってベクターｐＣＲ−ＴＯＰＯ２.１に連結した。ｐＣＲ−ＴＯＰＯ２.１誘導体のNcoI／EcoRIフラグメントをｐＭＯＮ４８４２１にサブクローニングし（図７）、同じ制限酵素によって線状化した。３５Ｓプロモーター、Ｃｓｐ遺伝子およびｅ９ターミネーターを包含するｐＭＯＮ４８４２１誘導体のNotIフラグメントを、NotIサイトでｐＭＯＮ４２９１６にサブクローニングして（図１７）、各々ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢ遺伝子を含むｐＭＯＮ５６６０９（図８）およびｐＭＯＮ５６６１０（図９）を作製した。該プラスミドを、公知の方法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。ｐＭＯＮ５６６０９は配列番号：７に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。ｐＭＯＮ５６６１０は配列番号：９に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。
【０１２１】
実施例８
アグロバクテリウムの調製：
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５株を、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌおよびハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレート（ＬＢ／ＫＨと表示する）上にストリークする。共培養の２日前に、アグロバクテリウムのループを１０ｍｌのＬＢ／ＫＨを含む試験管に移し、暗所下、２８℃にて２４時間、シェーカー上でインキュベートする。この培養物を２０ｍｌのＬＢ／ＫＨ中で１：１００に希釈し、暗所下、２８℃にて一晩、シェーカー上でインキュベートする。翌日に、この培養物の１：２希釈物１ｍｌをキュベットに採り、残部としてＬＢ／ＫＨを用いてＯＤ６００を採った。共培養のＯ.Ｄ. １.０のアグロバクテリウム懸濁液５ｍｌに必要な体積を計算する。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
４０ｍｌ遠心チューブに必要な体積のアグロバクテリウム培養物を採り、７０００ｒｐｍにて７分間遠心する。上清を破棄し、ペレットを乾燥する。ペレットを、２０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを含む５ｍｌの共培養培地（CC MEDIA-MSベース塩、スクロース２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、チアミンＨＣｌ ０.５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン１１５ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ）に再懸濁する。
【０１２４】
イネ胚の形質転換：
温室で生長した日本晴および台北３０９イネ品種から円錐花序を採取する。円錐花序は５０％の市販の漂白剤に１０分間浸漬し、つづいて滅菌蒸留水ですすぐことによって滅菌した。円錐花序を７０％のアルコール処理に３分間付した。ついで、種子を円錐花序から採り、個々に殻を取り、０.１％のTween２０溶液を含むFalcon試験管に移した。ついで、層状エア流動チャンバー中で、種子を７０％アルコールで処理した。ついで、種子を無菌水ですすいだ。この後に、５０％漂白剤処理を４５分間行った。種子は無菌蒸留水で５回すすいだ。最後に、種子を０.１％の塩化水銀（ＩＩ）処理に付した。種子は滅菌蒸留水で再度８回洗浄した。
【０１２５】
層状流動チャンバー中で無菌種子から胚を無菌的に切除し、固体共培養培地（２ｇ／ＬのPhytagelを入れたCC MEDIA）に置いた。５０μＬの滴のアグロバクテリウム懸濁液を無菌ペトリ皿に置いた。１０の胚を各滴に移した。感染は１５分間放置した。アグロバクテリウム懸濁液を無菌ピペットチップで除去した。感染した胚を新たな固体ＣＣ ＭＥＤＩＡプレートに移し、暗所下にて２日間維持した。３日目に、胚を５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムで洗浄した。ついで、胚を無菌濾紙上で乾燥し、Delay培地（MSベース塩、チアミンＨＣｌ １ｍｇ／Ｌ、グルタミン５００ｍｇ／Ｌ、塩化マグネシウム７５０ｍｇ／Ｌ、カゼイン加水分解物１００ｍｇ／Ｌ、スクロース２０ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ、ピクロラム２.２ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ）に置いた。胚はDelay培地上、暗所下にて７日間維持する。この期間に、カルスが形成する。カルスを選択培地（５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むDelay培地）に移し、暗所下にて１０日間保存する。この１０日の期間後にカルスを新たな選択培地に継代培養する。さらに１０日後に、カルスを再生培地（ＭＳベース塩、スクロース３０ｍｇ／Ｌ、カイネチン２ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０.２ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所下で７日間維持する。ついで、カルスを新鮮な再生培地に移し、３０℃の１６時間の光周期に動かす。このカルス上で発育したシュートを発根培地（半分の強度のＭＳベース塩、スクロース１５ｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌ）に移す。発根したシュートを水を含有する試験管に移し、硬化のためにミストチャンバーに入れる。
【０１２６】
植物を陽性として選択した。これは、例えば、実施例１２−１４および２６−２９に記載した方法と同様の方法を用いて行い得た。記載した育種方法を含めるのは、次世代のトランスジェニック植物を作出するためである。
【０１２７】
実施例９
第３本葉展開期における低温ストレス応答−ＣｓｐＢおよびＣｓｐＡイネ・トランスジェニック植物
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、milique水中で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１２８】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度を有する温室中のポートレイ（portray）（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色砂質ローム土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に適用する（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１２９】
ＣｓｐＢ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、１００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および７０％ ＲＨ（Percival生長チャンバー）の存在下、１０℃にて４日間、低温ストレスに付した。ストレス処理の後に、植物を１０日間温室内で回復させ、１０日目に生存した植物の生長観察および写真証拠を記録した。各処理は１列当たり１０回反復し、それらは完全に無作為化した。
【０１３０】
結果：低温ストレス耐性について試験した８の異なる系統の中で、６の系統が野生型と比較して顕著に高い低温耐性を示した。Ｒ２−２２６−６−９−３、Ｒ２−２２６−２９−１−１、Ｒ２−２５７−２０−２−１、Ｒ２−２３８−１−１−３、Ｒ２−２３０−４−４−２およびＲ２−２５７−３−１−３を含む系統は、野生型と比較して（非ストレス負荷対照に対して）高い回復生長および生長におけるより生長における低いパーセントの低下（表−１、プレート−１）を示すことによって高い低温耐性を示した。系統Ｒ２−２３０−４−４２は、極めて良好に実行し、それは１００％の生存を示し、回復の間に良好な生長を維持した（表１）。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光の存在下、８℃の低温ストレスに１日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて１５日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１３３】
結果：８の異なる系統を低温ストレス耐性について試験し、８系統すべてが野生型（非トランスジェニック）植物と比較して改善した耐性を示した。これらの結果は、改善した低温耐性を示すＲ２分析データを確認した（表２）。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、生長チャンバー中、１０００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および７０％ＲＨの存在下、１０℃の低温ストレスに３日間付した。ストレス処理の後、植物を温室中で１５日間回復させ、１５日目に生長観察を記録した。各値は１２の観察の平均値であり、実験は以下の完全無作為化（ＣＲＤ）実験法によって行った。
【０１３６】
結果：試験した７の独立のＣｓｐＡトランスジェニック系統のうちの６系統が、野生型と比較して改善された低温耐性を示した。この実験において、植物の高さは非ストレス植物と比較して低温処理対照植物（ＷＴ）では５０％近くまで減少していた。一方、ＣｓｐＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物では、低温処理時の植物の高さの減少は異なる独立系統の中で４.５％から２２.５０％まで変化した（生長における低下が４７.０９％であった１の系統を除いて）。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの低温耐性を改善することを示唆している（表３）。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
ＣｓｐＡ−Ｒ３植物の分析
実験Ｉ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、１０℃の低温ストレスに３日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した（この実験においては、各トランスジェニック系統について８の反復を用い、野生型については１０の反復を用いた）。
【０１３９】
結果：低温ストレスに付した６のトランスジェニック系統は、野生型よりも低温ストレス下でより良好に実行した。これらの結果は、改善された低温耐性を示すことによってＲ２分析データをさらに確認した（表４）。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
注記：植物の高さは生存した植物についてのみ記録し、その平均を上記表に記載している。
【０１４２】
実験ＩＩ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、１０℃の低温ストレスに１日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した。
【０１４３】
結果：低温ストレスに付した５のトランスジェニック系統は、野生型よりも低温ストレス下でより良好に実行した。これらの結果は、改善された低温耐性を示すことによってＲ２分析データをさらに確認した（表５）。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
第３本葉展開期における熱ストレス応答
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１４６】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨを有する温室中のポートレイ（portray）（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日間）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に噴霧した（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１４７】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、７０％ＲＨの存在下、５０℃の熱ストレスに３時間付した。ストレス処理の後に、植物を温室中で１５日間回復させ、１５日目に生長観察を記録した。各値は１２の観察の平均値である。
【０１４８】
結果：試験した７の独立したＣｓｐＡトランスジェニック系統のうち、６系統が野生型と比較して改善された熱耐性を示した。この実験において、植物の高さは非ストレス植物と比較して熱処理対照植物（ＷＴ）では５０％を超えて減少していた。一方、ＣｓｐＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物では、熱処理時の植物の高さの減少は異なる独立系統の中で９.５％から３５％まで変化した。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの熱耐性を改善することを示唆している（表６）。
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、５３℃の高温ストレスに２時間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて１５日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５１】
結果：試験した８のトランスジェニック系統のうち、７系統が野生型と比較して試験した熱ストレス下で良好に実行した。これらの結果は、ＣｓｐＢがイネの熱耐性を改善することを示唆している（表７）。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
ＣｓｐＡ−Ｒ３植物の分析
実験Ｉ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、５３℃の高温ストレスに３時間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５４】
結果：これらの結果は、改善された熱耐性を示すことによってＲ２分析を確認した（表８）。
【０１５５】
【表１０】
【０１５６】
実験ＩＩ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、５０℃の高温ストレスに１日間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５７】
結果：これらの結果は、改善された熱耐性を示すことによってＲ２分析データを確認した（表９）。
【０１５８】
【表１１】
【０１５９】
水ストレス応答
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１６０】
ＣｓｐＢ−Ｒ２植物の分析
実験プロトコール
発芽した幼植物（３日齢）を、容水量（ＦＣ）の点からみてバーミキュライトを含有するＰＶＣポット中に作製した、２の異なるレベルの水ストレスに移した。ＦＣ−１００％は飽和条件（すなわち、１００ｇのバーミキュライトは３５０ｍｌの水を必要とする）である（Sharpら, 1988, Planl Physiol. 87: 50-57）。必要な量の水を添加することによって、バーミキュライトを含有するＰＶＣポットに異なるレベルの水ストレス（すなわち、５０％ＦＣおよび２５％ＦＣ）を作製した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。幼植物は８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨの存在下、温室中で、水ストレス条件にて１５日間生長させた。１５日目に、根およびシュートの生長を記録し、写真を撮影した。各処理を列当たり１０回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
【０１６１】
生長におけるパーセント低下は、以下の式に当てはめることによって計算した。
【０１６２】
【数３】
【０１６３】
結果：４の異なるＣｓｐＢトランスジェニック系統を水ストレス耐性について分析した。試験したすべてのＣｓｐＢトランスジェニック系統は、野生型植物と比較してストレスの間に顕著に高い生長を示した。Ｒ２−２５７−１５−１−１、Ｒ２−２３８−１−１−３、Ｒ２−２５７−３−１−６およびＲ２−２２６−６−９−３を含むトランスジェニック系統は、非ストレス対照（ＦＣ−１００％）を超える根およびシュートの生長における最小限のパーセント減少を示した。これらの系統における根およびシュートの生長における減少は、１１ないし２５％の範囲であった。一方、野生型は生長における最大の減少を示し、それは５０％に近かった。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの水ストレス耐性を改善することを示唆している（表−１０および表−１１）。
【０１６４】
【表１２】
【０１６５】
【表１３】
【０１６６】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
ａ．植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１６７】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨを有する温室中のポートレイ（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色砂質ローム土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日間）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に噴霧した（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１６８】
プロトコール：１月齢の幼植物を、温室中、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および６０％ＲＨの存在下で３日間、水ストレスに付した。水ストレスは、差し控え潅漑（withholding irrigation）によって負荷した。３日の終期に、植物はしおれまたは立枯れ症状を示し始めた。ストレスは、植物を水で潅漑することによって緩和され、２４時間後に、しおれまたは立枯れ症状を示すパーセント植物の観察を記録した。処理当たり系統当たり、最小１２の植物を維持した。
【０１６９】
結果：試験した７の独立したＣｓｐＡトランスジェニック系統のうちの６の系統が、野生型と比較して改善された水ストレス耐性を示した。対照植物の６６％は、潅漑後にしおれまたは立枯れから回復しなかった。一方、ＣｓｐＡトランスジェニック植物においては、潅漑後にしおれまたは立枯れ症状を示した植物のパーセントは異なる独立した系統の中で５％から４３％まで変化した（しおれまたは立枯れを示す植物のパーセンテージが８５％であった１の系統を除いて）。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネにおける水ストレス耐性を改善することを示唆している（表１２）。
【０１７０】
【表１４】
【０１７１】
塩ストレス応答
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：発芽種子（４８時間齢）を、２００ｍＭのＮａＣｌを含有するバーミキュライトを含むＰＶＣポットに移すことによって塩ストレスに付し、ついで１０日間生長させた。ストレスの１０日後に、幼植物を水を含有するバーミキュライトの新たなトレイに移すことによって１５日間回復させた。植物の高さのごとき生長観察は回収の終期に記録した。この実験は、完全無作為化法（ＣＲＤ）に従って温室中で行い、処理当たり８回の繰り返しを維持した。
【０１７２】
結果：７のＣｓｐＢトランスジェニック系統および野生型植物を２００ｍＭのＮａＣｌストレスに付した。この条件下で、５のトランスジェニック系統が野生型と比較してより良好に実行した。これらの結果は、ＣｓｐＢが塩ストレスに対するイネ植物の耐性を改善することを示唆している（表１３）。
【０１７３】
【表１５】
【０１７４】
Ｒ３水ストレスアッセイ
ＣｓｐＡおよび野生型（日本晴−農林５号）の４の独立したトランスジェニック系統（１、２、３、４）からの発芽幼植物を、バーミキュライトを含有するポットに移すことによって水ストレスに付した。３のレベルの水様式を維持し、それらは１００％容水量（ＦＣ−１００＝３.７２ｍｌの水／ｇバーミキュライト）、２５％容水量（ＦＣ２５＝０.９３ｍｌの水／ｇバーミキュライト）、１５％容水量（ＦＣ１５＝０.５５８ｍｌ／ｇバーミキュライト）である。幼植物は、温室中、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨの存在下で３０日間、異なる水様式で生長した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。３０日の終期に、植物に水を添加することによって回復させ、レベルをＦＣ１００とし、１５日間維持した。実験の間、ストレスの終期（ＥＳ）の植物の高さ（ｐｌ.ｈｔ）および根（Ｒ）シュート（Ｓ）の長さおよび乾燥重量を記録した。
各処理は系統当たり１０回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
【０１７５】
【表１６】
【０１７６】
【表１７】
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
実施例１０
ｃｓｐＡ
ｐＭＯＮ７３６０７の構築（図１０）
１．ベクターｐＭＯＮ６１３２２をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、ＣｓｐＡ遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
２．イー・コリｃｓｐＡ遺伝子をｐＭＯＮ５６６０９（図８）ベクターからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは遺伝子の５'末端のNcoIサイトの左で使用し、３'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
３．ＰＣＲフラグメントおよびｐＭＯＮ６１３２２（図１１）バックボーンを連結する。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
４．ベクターを配列決定して、プラスミドのｃｓｐＡ遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
【０１７９】
ｃｓｐＢ
ｐＭＯＮ７３６０８の構築（図１２）
１．ベクターｐＭＯＮ６１３２２をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、ＨＶＡ１遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
２．ビー・ズブチリスｃｓｐＢ遺伝子をｐＭＯＮ５６６１０ベクターからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは遺伝子の５'末端のNcoIサイトの左で使用し、３'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
３．ＰＣＲフラグメントおよびｐＭＯＮ６１３２２バックボーンを連結する。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
４．ベクターを配列決定して、プラスミドのＣｓｐＢ遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
【０１８０】
実施例１１ トウモロコシ植物の形質転換
トウモロコシ植物は、当該技術分野で知られている方法（例えば本明細書中の実施例２０−２５を参照されたい）によって形質転換し得る。
【０１８１】
実施例１２
コピー数についてのトランスジェニック植物の分析は、以下の様式で行う。
葉組織は若葉から、出来るだけ基部近くからかつ葉の１の側から収集する。試料は９６ウェルプレートに入れ、一晩凍結乾燥する。組織は各ウェルに３の３ｍｍ金属ボールを入れ、Mega Grinderを用いて１２００ｒｐｍにて２分間振盪することによってホモジナイズする。ＤＮＡはβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８に緩衝化したＴｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有する標準的な緩衝液を用いて抽出する。抽出は酢酸カリウムにつづいてクロロホルムを用いて行い、沈殿はイソプロパノールを用いて行う。遠心した後に、エタノール溶液で洗浄し、乾燥し、ＤＮＡをさらに分析する前にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁する。
【０１８２】
ＤＮＡは複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントを非変性アガロースゲル電気泳動によって分離する。ＤＮＡはＮａＯＨ溶液によって変性する。ゲルをＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝液中で中和し、毛管現象によってナイロンフィルターにブロットする。ナイロンフィルターは、放射性同位元素またはＤＩＧのいずれかで標識した適当なプローブを添加する前に、サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で予めハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、ブロットを洗浄し、オートラジオグラフィーフィルムに感光するかまたは抗−ＤＩＧ抗体コンジュゲートおよび適当な基質を用いてＤＩＧを検出することによって検出する。
【０１８３】
実施例１３
本発明者らは、Ｈｉｓ−標識抗原を合成および精製し得るベクター（Novagen, Merck KgaA, Darmstadt, Germanyの系列会社）を用いてイー・コリ中で発現させるために、ｃｓｐＡおよびｃｓｐＢの全長オープンリーディングフレームを用いる。精製した抗原を用いて、市場の供給業者、例えばStrategic Biocolutionsを用いてポリクローナル抗体を生成する。生成した抗体を用いて、ＣＳＰタンパク質の発現について植物を試験する。
【０１８４】
実施例１４
トランスジェニック・トウモロコシ系統の発達
初代形質転換体はＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａ、ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＣおよびＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｄのごとき生殖質において作製する。初代形質転換体は自殖（self）ならびに同系遺伝子型の非トランスジェニック植物に戻し交配する。自殖植物からの種子を圃場に植え、Taqman接合子アッセイによってアッセイして、推定ホモ接合選択体、推定ヘテロ接合選択体および陰性選択体を同定する。推定ヘテロ接合選択体は、適当なテスター、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＢおよびＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｄの複数の植物と交配する。雑種種子を収穫し、手で殻を剥き、選択によって保存する。他の繁殖方法を用いることもできる。例えば、本明細書の実施例２９を参照されたい。
【０１８５】
実施例１５
幼植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように、最適下限レベルに利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、進行的な水不足に通じる長期間にわたって水の量を制限する形態、または、幼植物を水耕的にまたは塩処理で浸透的にストレスをかけることによる急激な欠乏の態様をとる。トランスジーン陽性植物は、処理に対する改善された表現型応答でスクリーニングされる。測定する表現型応答には、処理の間または処理後回復期間後のシュート生長速度または乾燥重量蓄積、しおれもしくは立枯れまたは立枯れ回復、および根の増殖速度および乾燥重量蓄積が含まれ得る。改善された応答を有するものは、圃場効率試験に進める。スクリーニングには、生長チャンバーまたは温室のごとき制御された環境中の小ポットで生長させた多くのトランスジーン陽性およびトランスジーン陰性の植物が必要であろう。スクリーニングした植物の数は、適用した処理および測定した表現型と関連する分散によって示す。
【０１８６】
実施例１６
圃場生長植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように最適下限レベルまで利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、植物の後期栄養または早期繁殖発育のいずれかの間に進行的な水不足に通じる、長期間にわたり植物の利用可能な水の量を制限する形態をとり得る。トランスジーン陽性植物は、トランスジーン陰性植物に対して、処理に対する改善された表現型応答についてスクリーニングされるであろう。測定される表現型応答には、処理の間のシュート生長速度、葉のしおれまたは立枯れ（leaf wilting）、穀物収量、ならびに穀粒数および穀粒重量のごとき穂収量要素が含まれ得る。改善された応答を有するこれらの事象は、初年収量試行を促進するであろう。スクリーニングは、制御可能な潅漑を有する２の乾燥圃場場所において典型的な栽培密度で適用するであろう。スクリーニングされた植物の数は、適用した処理および測定された表現型と関連する変化によって指図される。
【０１８７】
実施例１７
記載した遺伝子の幾つかを、以下（実施例１７−３０）同様にしてクローニングし、植物に形質転換し、表現型決定する。例えば、ヌクレオチドおよび配列番号：４−５３をコードするヌクレオチド。
【０１８８】
デスティネーションベクターの構築
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーション（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）植物発現ベクターは、当業者に知られている方法を用いて構築した。発現ベクターのエレメントを表１７に要約する。イー・コリで発現する細菌複製機能を含むプラスミドｐＭＯＮ６５１５４のバックボーンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子はプラスミドｐＳＫ−に由来する。ｐＭＯＮ６４１５４における植物発現エレメントは当業者が入手可能であり、各エレメントについて表１７に参照を記載する。位置に関する表１７中のすべての参照は、図１３に開示するプラスミドマップ上の各エレメントの塩基対座標を示す。一般的に、ｐＭＯＮ６５１５４はネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）をコードする遺伝子に作動可能に連結したカリフラワーモザイクウイルスＳ３５プロモーターを含む選択マーカー発現カセットを含む。選択マーカー発現カセットの３'領域には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３'領域につづいて３'にジャガイモプロテイナーゼ・インヒビターＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子の３'領域が含まれる。プラスミドｐＭＯＮ６５１５４には、さらに、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング法を用いて関心のある遺伝子を挿入することができる植物発現カセットが含まれる。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングカセットは、イネ・アクチン１プロモーター、エキソンおよびイントロンによって５'で挟まれ、かつ、ジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３’領域によって３'で挟まれている。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法を用いて、クローニングカセットを関心のある遺伝子によって置き換えた。関心のある遺伝子を含むベクターｐＭＯＮ６５１５４およびその誘導体は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメントのごとき直接ＤＮＡデリバリーを介する植物形質転換の方法に特に有用であった。当業者であれば、当業者に知られている方法を用いて、同様の特徴を有する発現ベクターを構築し得るであろう。なお、当業者であれば、他のプロモーターおよび３'領域が関心のある遺伝子の発現に有用であり、他の選択マーカーを使用し得ることを認識するであろう。
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
植物形質転換のアグロバクテリウム媒介法に使用するために、別のプラスミドベクター（ｐＭＯＮ７２４７２、図１４）を構築した。プラスミドｐＲＧ７６は、関心のある植物発現の遺伝子、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング、およびｐＭＯＮ６５１５４中に存在する植物選択マーカー発現カセットを含む。加えて、アグロバクテリウムからの左側および右側Ｔ−ボーダー配列をプラスミドに加えた。右側ボーダー配列はイネ・アクチン１プロモーターの５'に位置し、左側ボーダー配列はｎｐｔＩＩ遺伝子の３'に位置するｐｉｎＩＩ ３'配列の３'に位置する。さらに、ｐＭＯＮ６５１６４のｐＳＫ−バックボーンをプラスミド・バクボーンによって置き換えて、イー・コリおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの両方におけるプラスミドの複製を容易にした。該バックボーンは、アグロバクテリウムにおいて機能的なＤＮＡ複製のｏｒｉＶ広宿主域複製起点、ｒｏｐ配列、イー・コリにおいて機能的なＤＮＡ複製のｐＢＲ３２２複製起点、ならびにイー・コリおよびアグロバクテリウムにおけるプラスミドの存在について選択するためのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性遺伝子を含む。
プラスミドベクターｐＲＧ８１に存在するエレメントを表１８に記載する。
【０１９１】
【表２０−１】
【０１９２】
【表２０−２】
【０１９３】
実施例１８
コード配列は、ｐＭＯＮ６５１５４（図１３）のごときＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーション植物発現ベクターにインサートする前に、ＰＣＲによって増幅した。すべてのコード配列は、クローニングした完全長配列またはｃＤＮＡライブラリーから所望の配列の増幅を許容するＤＮＡ配列情報のいずれかとして入手可能であった。ＰＣＲ増幅用のプライマーは、５'および３'非翻訳領域の大部分を排除するために、コード配列の開始コドンおよび終止コドンにおいてまたはその付近において設計した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクター（Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA）への組換えによるクローニングを許容するために、ＰＣＲ産物にａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列を付けた。
【０１９４】
２の方法を用いて、関心のあるａｔｔＢで挟んだＰＣＲ増幅配列を作製した。両方の方法は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に詳細に記載されている。第１の方法においては、ａｔｔＢおよび鋳型の特異的配列を含む単一のプライマーセットを用いた。プライマー配列は以下のとおりである：
ａｔｔＢ１フォワード・プライマー：
5' GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3’（配列番号：７１）
【０１９５】
ａｔｔＢ２リバース・プライマー
5'GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3'（配列番号：７２）
【０１９６】
別法として、ａｔｔＢアダプターＰＣＲを用いて、ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物を調製した。ａｔｔＢ１アダプターＰＣＲは２セットのプライマー、すなわち遺伝子特異的プライマーおよびａｔｔＢ配列をインストールするためのプライマーを用いる。所望のＤＮＡ配列プライマーを設計し、それには５'にａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２配列の１２塩基対が含まれていた。使用したプライマーは以下のとおりである：
ａｔｔＢ１遺伝子特異的フォワード・プライマー：
5' CCTGCAGGACCATGフォワード遺伝子特異的プライマー3'（配列番号：７３）
【０１９７】
ａｔｔＢ２遺伝子特異的リバース・プライマー：
5' CCTGCAGGCTCGAGCTAリバース遺伝子特異的プライマー3’（配列番号：７４）
【０１９８】
第２のセットのプライマーは以下の配列を有するａｔｔＢアダプタープライマーであった：
ａｔｔＢ１アダプターフォワードプライマー：
5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3'（配列番号：７５）
【０１９９】
ａｔｔＢ２アダプターリバースプライマー：
5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA 3'（配列番号：７６）
【０２００】
ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２で挟んだ配列を、Invitrogen Life Technologies（Carlsbad, CA）によって記載された方法に従ってＰＣＲによって増幅した。ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物を、前記したように精製し、ゲルから回収した。
【０２０１】
幾つかの例において、ａｔｔＢで挟んだ配列をＰＣＲから回収したが、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いてドナーベクターにインサートし得なかった。ドナーベクターへのＧＡＴＥＷＡ（登録商標）組換えを失敗した場合には、リガーゼを用いる慣用的なクローニング方法を用いて、ＤＮＡ配列をエントリーベクターにインサートした（Invitrogen Life Technologies, Carlsburg,CA）。
【０２０２】
エントリーベクターの選択は、エントリーベクターおよび所望のインサート配列中の制限エンドヌクレアーゼ部位の和合性に依存した。エントリーベクターを選択した制限エンドヌクレアーゼで消化してｃｃｄＢ遺伝子を除去し、脱リン酸化し、ゲル精製した。選択した制限エンドヌクレアーゼは使用したエントリーベクターおよび所望のインサート配列の配列に依存した。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、ＥｃｏＲ１を用いて、またはＥｃｏＲＶおよびＸｍａＩまたはＮｃｏＩおよびＸｈｏＩのごとき制限エンドヌクレアーゼの他の組合せを用いて、ｐＥＮＴＲ１１（図１５）から除去した。他の制限エンドヌクレアーゼは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）工程で使用するために他のエントリーベクターと使用し得る。制限エンドヌクレアーゼ消化したエントリーベクターを使用するために、所望のＰＣＲ産物上に和合性の粘着末端を作製できることが必要であった。粘着末端は、制限エンドヌクレアーゼ消化、アダプター連結またはＰＣＲの間の制限部位の付加のごとき当業者に知られている多数の方法により作製し得るであろう。
【０２０３】
幾つかの例において、ＰＣＲフラグメントおよびエントリーベクター上に和合性の粘着末端を作製することができなかった。別法として、和合性の粘着末端は、ｃＤＮＡクローンの制限酵素消化によっても作製し得る。しかしながら、ＰＣＲフラグメントをエントリーベクターに平滑末端連結することができた。この方法を用いて、エントリーベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断してｃｃｄＢ遺伝子を除去した。ゲル精製した線状エントリーベクターを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。当業者は、クレノーＤＮＡポリメラーゼの使用のごとき、平滑末端化したＤＮＡ分子を作製する他の法補に気付く。ＰＣＲ産物を平滑末端化し、好ましくはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、または他の好適なポリメラーゼ、Ｔ４ ポリヌクレオチド・キナーゼおよびフォスファターゼ酵素とインキュベーションすることによって脱リン酸化した。エントリーベクターおよびＰＣＲ産物は、当該技術分野で知られている方法を用いて平滑末端連結した。連結産物はイー・コリに形質転換し、個々のコロニーからのプラスミドをインサートＤＮＡの存在およびエントリーベクター中のａｔｔＬ部位に対する所望の向きについて分析した。オープンリーディングフレームのアミノ末端に次いでａｔｔＬ１配列を有するクローンを選択した。
【０２０４】
好ましくは、ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物をＧＡＹＥＷＡＹ（登録商標）法を用いてプラスミドにインサートし得なかった場合には、ＰＣＲ産物をクローニングするＴＡ法（Marchukら, 1991）を用いた。ＴＡ法は、Ｔａｑポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性の利点を採用している。エントリーベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断し、本明細書に記載する方法を用いて平滑末端とした。平滑末端化した線状エントリーベクターはｄＴＴＰおよびＴａｑポリメラーゼとインキュベートして、各ＤＮＡ鎖の３'末端に単一のチミジン残基の付加を生じた。ＴａｑポリメラーゼはｄＡＴＰに強い優先性を有するため、ＰＣＲ産物は３'末端に付加した単一のアデノシンを有して作製される場合が多くある。したがって、エントリーベクターおよびＰＣＲ産物は相補的な単一塩基３'オーバーハングを有する。当業者に知られている条件下で連結した後に、プラスミドをイー・コリに形質転換した。プラスミドは個々のコロニーから単離し、分析して正確な向きの所望のインサートを有するプラスミドを同定する。別法として、ａｔｔＢサイトを付加したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Promega Corporation, Madison, WI）のごとき市販のＴＡクローニングベクターにＴＡクローニングした。
【０２０５】
すべてのＰＣＲ増幅産物は、植物に導入する前に配列決定した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法によって作製したデスティネーション発現ベクター中のＰＣＲインサートを配列決定して、配列決定したインサートが予想されるアミノ酸配列をコードすることを確認した。エントリーベクターを連結方法を用いて作製した場合、インサートした配列は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いてデスティネーション発現ベクターの作製前にエントリーベクターで配列決定した。アミノ酸コード配列に影響しない点突然変異、すなわちサイレント突然変異は認めた。
【０２０６】
実施例１９ 発現ベクターの構築
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング法（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて、トウモロコシ形質転換に使用するための発現ベクターを構築した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に十分に記載されている。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）システムの使用により、植物発現ベクターへのコード配列のハイスループットクローニングが促進される。ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれた遺伝子配列は、前記のようにＰＣＲによって作製した。いずれの組換え配列、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２がコード配列の５'および３'に位置するかに依存して、センスおよびアンチセンス発現ベクターが作製された。センスまたはアンチセンス向きでいずれかのコード配列をインサートし得る植物発現ベクター、ｐＭＯＮ６５１５４（図１３）は、実施例１に記載したように構築し、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング手法におけるデスティネーションベクターとして使用した。
【０２０７】
ＰＣＲ増幅したコード配列を植物発現ベクターにインサートするために、２の別の方法を用いた。第１の方法においては、５'および３'末端でａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれた関心のあるコード配列を含むＰＣＲ産物を、ＢＰ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）の存在下でドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（登録商標）、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）とインキュベートした。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）エントリークローンは、この反応から作製し、イー・コリに形質転換した。プラスミドＤＮＡはエントリークローンから単離した。インサートしたコーディング配列は、ＰＣＲ増幅の忠実度を確認するために、エントリーベクターから配列決定し得た。エントリークローン、イー・コリのコロニーから単離したプラスミドＤＮＡを、ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）の存在下で、線状化したデスティネーションベクター、好ましくはｐＭＯＮ６５１５４とインキュベートして、関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを作製した。ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応からのＤＮＡをイー・コリに形質転換した。植物発現ベクターの正確な向きおよび配列を決定するために、デスティネーション発現ベクターからのプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。
【０２０８】
植物発現ベクターを作製する第２の方法においては、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれたＰＣＲ産物を、前記したごとくドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（登録商標）、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）およびＢＰ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）とインキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物のアリコットを線状化したデスティネーションベクターおよびＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）とさらにインキュベートした。得られたＤＮＡをイー・コリに形質転換し、関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを当該技術分野で知られているＰＣＲおよびサザンブロット分析技術を用いて選択した。関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを作製する両方の方法は、Invitrogen Life Technologies (ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual）によって記載されていた。
【０２０９】
別法として、エントリーベクターは制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて作製した。エントリーベクターはInvitrogen Life Technologies（Carlsbad, CA）から入手可能である。各エントリーベクター、例えばｐＥＮＴＲ１Ａ、ｐＥＮＴＲ２Ｂ、ｐＥＮＴＲ３Ｃ、ｐＥＮＴＲ４およびｐＥＮＴＲ１１はユニークなクローニングおよび発現特徴を有する。ｐＥＮＴＲ１１を本発明の実施において好ましく使用した。当業者は、他のエントリーベクターの有用性を認識するであろう。制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて所望の配列をエントリーベクターにインサートする前に、ｃｃｄＢ遺伝子の各側でエントリーベクターを制限消化することが必要であった。制限エンドヌクレアーゼの多数の異なる組合せは、エントリーベクターにインサートするＤＮＡ配列上に存在する制限サイトに依存して制限された。好ましくは、制限消化した後にエントリーベクターを脱リン酸化し、ゲル精製した。所望のＤＮＡ配列を、当業者に知られている分子生物学の慣用的な方法を用いてＥｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｅｒにインサートした。ＴＡクローニング（米国特許第５,８２７,６５７号）は、ＰＣＲフラグメントをエントリーベクターにクローニングする好ましい方法である。
【０２１０】
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング方法を用いて作製したベクター（ｐＭＯＮおよび５デジタル番号と命名した）およびその中に含まれるコード配列は、例えば配列番号：４−２８である。本発明のコード配列の幾つかを、本明細書に記載する方法を用いて植物発現ベクターにクローニングし得ることは予想される。
【０２１１】
実施例２０
生殖質のトウモロコシ 植物は温室で生育させた。雌穂は、胚が１.５ないし２.０ｍｍ長である場合、通常は授粉１０ないし１５日後、たいていの場合は授粉１１ないし１２日後に植物から収穫した。雌穂は８０％エタノールを雌穂に噴霧するかまたは浸漬し、その後に風乾することによって表面滅菌した。別法として、雌穂は１０％ＳＤＳを含有する５０％ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）中に２０分間浸漬し、その後に滅菌水で３回濯ぐことによって表面滅菌した。
【０２１２】
未熟な胚は、当業者に知られている方法を用いて個々の穀粒から単離した。未熟な胚は、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの前の３−６日間、好ましくは３−４日間、１６.９ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３を含有するmedium ２１１（Ｎ６塩、２％スクロース、１ｍｇ／Ｌ ２,４−Ｄ、０.５ｍｇ／Ｌナイアシン、１.０ｍｇ／Ｌ チアミン−ＨＣｌ、０.９１ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシチオール（myoinositiol）、０.５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１.６ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０.６９ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２ｇ／Ｌ ＧＥＬＧＲＯ（登録商標）、ｐＨ５.８）（medium ２１１Ｖという）上で培養した。
【０２１３】
実施例２１
トウモロコシ細胞および他の単子葉植物のアグロバクテリウム媒介形質転換の方法は知られている（Hieiら, 1997; 米国特許第５,５９１,６１６号；米国特許第５,９８１,８４０号；公開欧州特許出願 EP 0 672 752）。種々の菌株のアグロバクテリウムを使用し得る（前記参考文献を参照されたい）が、本発明者らはＡＢＩ株を好ましく用いた。アグロバクテリウムのＡＢＩ株は、３７℃にて培養することによりＴｉプラスミドを排除した、さらに修飾したＴｉプラスミドｐＭＰ９０ＲＫ（KonczおよびSchell, 1986）を含むＣ５８ノパリン型菌株であるＡ２０８株に由来する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーベクターシステム（Anら, 1998）を、トウモロコシを形質転換するために好ましく使用した。別の同時組込みＴｉプラスミドベクターが記載されており（Rogersら, 1988）、トウモロコシを形質転換するために使用し得た。関心のある１またはそれを超える遺伝子を含むバイナリーベクターは、エレクトロポレーション（Wen-junおよびForde, 1989）またはtriparental mating（Dittaら, 1980）を用いて、無力化したアグロバクテリウム株に導入し得る。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子、スクリーニングマーカー遺伝子および／または形質転換植物に所望の表現型特性を付与する１もしくはそれを超える遺伝子を含み得る。例示的なバイナリーベクター、ｐＭＯＮ３０１１３を図４に示す。他のバイナリーベクターを用いることができ、それらは当業者に知られている。
【０２１４】
トウモロコシ細胞の共培養の前に、アグロバクテリウム細胞は、修飾したＴｉプラスミドおよびバイナリーベクターの維持につき選択するための適当な抗生物質を含むＬＢ（DIFCO）液体培地中、２８℃にて増殖させ得る。例えば、ＡＢＩ／ｐＭＯＮ３０１１３は、ｐＭＰ９０ＲＫ修飾Ｔｉプラスミドの保持について選択するための５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよびバイナリーベクターｐＭＯＮ３０１１３の保持について選択するための１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させ得る。宿主アグロバクテリウム菌株中にプラスミドを保持するために適当な選択剤を使用することは当業者に明らかであろう。トウモロコシ細胞を接種する前に、アグロバクテリウム細胞はプラスミド保持についての適当な抗生物質および２００μＭアセトシリンゴンを含むＡＢ培地（Chiltonら, 1974）中、室温にて一晩増殖させる。トウモロコシ細胞の接種の直前に、アグロバクテリウムは好ましくは遠心分離によってペレット化し、２００μＭアセトシリンゴンを含有する１／２のＭＳＶＩ培地（２.２ｇ／Ｌ ＧＩＢＣＯ（Carlsbad, CA）ＭＳ塩、２ｍｇ／Ｌグリシン、０.５ｇ／Ｌナイアシン、０.５ｇ／Ｌ Ｌ−ピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌチアミン、１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、１０ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび１０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５.４）中で洗浄し、２００μＭアセトシリンゴンを含有する１／２のＭＳＰＬ培地（２.２ｇ／Ｌ ＧＩＢＣＯ（Carlsbad, CA）ＭＳ塩、２ｍｇ／Ｌグリシン、０.５ｇ／Ｌナイアシン、０.５ｇ／Ｌ Ｌ−ピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌチアミン、１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２６ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、６８.５ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５.４）中に０.１ないし１.０×１０９細胞／ｍｌで再懸濁した。当業者は、１／２のＭＳＶＩまたは１／２のＭＳＰＬの代わりに他の培地を使用し得る。
【０２１５】
未熟トウモロコシ胚は、先に記載したように単離する。胚は、摘出後０−７日、好ましくは摘出後直ちにアグロバクテリウムを接種する。別法として、未熟胚は７日を超えて培養し得る。例えば、胚形成カルスは前記したように開始し、アグロバクテリウムと共培養し得る。好ましくは、未熟トウモロコシ胚を摘出し、前記したように調製した１／２のＭＳＰＬ培地中のアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、アグロバクテリウムと室温にて５−２０分間インキュベートし得る。
【０２１６】
接種後、胚は、３.０ｍｇ／Ｌ ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）、１％ Ｄ−グルコース、２％スクロース、０.１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、０.５ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、２００μＭアセトシリンゴンおよび２０μＭ硝酸銀またはチオ硫酸銀を含有する１／２強度のＭＳ培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）に移す。未熟胚は、暗所下、２３℃にて１ないし３日間、アグロバクテリウムと共培養する。当業者は、記載した培地の代わりに他の培地を使用し得る。
【０２１７】
共培養した胚は、medium １５ＡＡ（４６２ｍｇ／Ｌ （ＮＨ４）ＳＯ４、４００ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１８６ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、２ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０.２５ｍｇ／Ｌ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０.０２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０.０２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０.７５ｍｇ／Ｌ ＫＩ、２.８３ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０.２ｍｇ／Ｌナイアシン、０.１ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.２ｍｇ／Ｌピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン、０.１ｍｇ／Ｌ 塩化コリン、０.１ｍｇ／Ｌパントテン酸カルシウム、０.０５ｍｇ／Ｌ葉酸、０.０５ｍｇ／Ｌ ｐ−アミノ安息香酸、０.０５ｍｇ／Ｌリボフラビン、０.０１５ｍｇ／ＬビタミンＢ１２、０.５ｇ／Ｌカザミノ酸、３３.５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１.３８ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース）、または１.５ｍｇ／Ｌ ２,４−Ｄ、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、３％スクロース、１.３８ｇ／Ｌ Ｌ−プロリンおよび２０μＭ硝酸銀またはチオ硫酸銀を含有するＭＳ培地に移し、選択することなく、暗所下、２７℃にて０ないし８日間培養する。形質転換体の選択および植物の再生に使用した培地は、好ましくは５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有する。当業者は、アグロバクテリウムの増殖を制御する他の抗生物質を代わりに使用し得る。細胞培養を支持する他の培養培地をそれに代えて使用し得る。選択の遅延がない（０日培養）場合には、選択を２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンで開始し得る。選択培地は、medium ２１１（前記した）またはＮ６塩をＭＳ塩で置き換えたmedium ２１１の変形を含み得る。２週間後に、胚形成カルスを１００ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培養培地に移し、約２週間間隔で継代培養する。共培養後に選択が遅延した場合、胚は最初に５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培地で培養し、つづいて胚形成カルスを１００−２００ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培地で継代培養する。当業者は、選択マーカーを欠いている細胞の増殖を阻害するが形質転換カルスは増殖する濃度のパロモマイシン上で組織を培養する。別法として、他の選択マーカーを用いて形質転換細胞を同定し得る。２５ないし５０ｍｇ／Ｌパロモマイシン上の約２週間の初期培養につづく５０−２００ｍｇ／Ｌパロモマイシン上の培養は、形質転換カルスの回収を生じると考えられる。形質転換体は選択の開始後６ないし８週に回収する。植物は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメント後に回収した形質転換体について前記したように、形質転換胚形成カルスから再生する。
【０２１８】
実施例２２ トウモロコシカルスのアグロバクテリウム媒介形質転換
本実施例では、アグロバクテリウムを用いたトウモロコシカルスの形質転換の方法を記載する。該方法を、ｎｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子およびパロモマイシン選択剤を用いて例示する。当業者は、その代わりに他の選択マーカーおよび選択剤の組合せを使用し得ることに気付くであろう。
【０２１９】
カルスは当業者に知られている方法を用いて未熟胚から開始した。例えば、１.５ｍｍないし２.０ｍｍの未熟胚をＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａのごとき遺伝子型の発育トウモロコシ種子から摘出し、胚軸側を下方にしてmedium ２１１Ｖ上で通常摘出後８−２１日培養した。別法として、確立したカルス培養物は、当業者に知られている方法によって開始および維持し得る。
【０２２０】
アグロバクテリウムは、実施例２１に記載した方法に従って植物組織の接種用に調製した。５０ないし１００片のカルスを、０.１ないし１.０×１０９ｃｆｕ／ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液約１５ｍｌを含有する６０ｍｍ×２０ｍｍペトリ皿に移した。カルスの片は、通常、培養２１日までの未熟胚によって生成したすべてのカルス、または直径２ｍｍないし８ｍｍの確立したカルスの片とした。カルスはアグロバクテリウム懸濁液と室温にて約３０分間培養し、つづいて吸引によって液体を除去した。
【０２２１】
約５０μｌの滅菌蒸留水を６０ｍｍ×２０ｍｍペトリ皿中のWhatman #1濾紙に添加した。１−５分後に、１５ないし２０片のカルスを各濾紙に移し、プレートを例えばＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密閉した。カルスおよびアグロバクテリウムは、暗所下、２３℃にて約３日間共培養した。
【０２２２】
カルスは、濾紙から、２０μＭ硝酸銀および５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むmedium ２１１に移し、暗所下、２７ないし２８℃にて２−５日間、好ましくは３日間培養した。選択は、カルスを２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium 211
に移すことによって開始した。暗所下、２７ないし２８℃にて２週間培養した後に、カルスは２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含むmedium ２１１（medium ２１１ＱＲＧ）に移した。カルスは２週間後に新鮮なmedium ２１１ ＱＲＧに継代培養し、さらに暗所下、２７ないし２８℃にて２週間培養した。ついで、カルスは、２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび７５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含むmedium ２１１に移した。暗所下、２７ないし２８℃にて２−３週間培養した後に、パロモマイシン抵抗性カルスを同定した。当業者は、カルスの継代培養の間の期間が概算であって、より頻繁な間隔、例えば２週間よりも１週間で組織を移すことによって選択プロセスを加速し得ることを認識するであろう。
【０２２３】
植物は、実施例に記載したように、形質転換カルスから再生し、土壌に移し、温室中で生育させた。アグロバクテリウム媒介形質転換後、medium ２１７（実施例９を参照されたい）はさらに５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有し、medium １２７Ｔ（実施例９を参照されたい）はさらに２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有した。アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて作製した本発明の遺伝子を含む形質転換トウモロコシ植物を表Ｙに要約する。
【０２２４】
実施例２３ マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの方法
マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのほぼ４時間前に、未熟胚をmedium ２１１ＳＶ（１２％までスクロースを添加したmedium ２１１Ｖ）に移した。２５の未熟胚を、胚盤の子葉鞘の末端を２０°の角度で培養培地に僅かに押しつけつつ５×５のグリッドで配置して、好ましくは６０×１５ｍｍペトリ皿に置いた。組織はボンバードメントの前に暗所下で維持した。
【０２２５】
マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの前に、その上に所望のＤＮＡが沈澱する金粒子の懸濁液を調製した。１０ｍｇの０.６μｍ金粒子（BioRad)を５０μＬ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）に懸濁した。２５μＬの所望のＤＮＡの２.４ｎＭ溶液を金粒子の懸濁液に添加し、約５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬの０.１Ｍスペルミジンを添加し、溶液を約５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬのポリエチレングリコール（分子量３０００−４０００、American Type Culture Collection）の２５％溶液を添加し、溶液を５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬの２.５Ｍ ＣａＣｌ２を添加し、溶液を５秒間やさしくボルテックス攪拌した。ＣａＣｌ２を添加した後に、溶液を室温にて１０ないし１５分間インキュベートした。つづいて、懸濁液を１２,０００ｒｐｍ（Sorval MC-12V遠心分離機）にて２０秒間遠心分離し、上清を捨てた。金粒子／ＤＮＡペレットを１００％エタノールで２回洗浄し、１０ｍＬの１００％エタノールに再懸濁した。金粒子／ＤＮＡ調製物は、２週まで−２０℃にて保存した。
【０２２６】
ＤＮＡは、放電粒子加速遺伝子デリバリーデバイス（米国特許第５,０１５,５８０号）を用いてトウモロコシ細胞に導入した。金粒子／ＤＮＡ懸濁液をＭｙｌａｒシート（Du Pont Mylarポリエステルフィルム タイプＳＭＭＣ２、両方の側にＰＶＤＣコポリマーがコートされており、１の側ではそのうえにアルミニウムがコートされている、１８ｍｍ四方に裁断）上に３１０ないし３２０μＬの金粒子／ＤＮＡ懸濁液を分散させることにより、そのシート上にコートした。金粒子懸濁液を１ないし３分間静置した後に、過剰量のエタノールを除去し、シートを風乾した。トウモロコシ組織のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントは、米国特許第５,０１５,５８０号に記載されているように行った。ＡＣ電圧は、放電粒子デリバリーシステムにおいて変化させ得る。ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａの前培養未熟胚のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントについては、最大電圧の３５％ないし４５％を好ましく使用した。マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント後に、組織は暗所下、２７℃にて培養した。
【０２２７】
実施例２４ 形質転換細胞の選択
形質転換体は、トランスジェニック・ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子の発現に基づいて、パロモマイシンを含む培養培地上で選択した。ＤＮＡデリバリーの２４時間後に、組織は２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する２１１Ｖ培地（medium ２１１ＨＶ）に移した。暗所下、２７℃にて３週間インキュベートした後に、組織を５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium ２１１（medium ２１１Ｇ）に移した。組織は３週間後に７５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium ２１１（medium ２１１ＸＸ）に移した。形質転換体は、選択の９週間後に単離した。表Ｙは、本明細書に開示したマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの方法を用いた形質転換体実験の結果を開示する。
【０２２８】
実施例２５ 繁殖性トランスジェニック植物の再生
繁殖性トランスジェニック植物は、形質転換したトウモロコシ細胞から作製した。形質転換カルスをmedium ２１７（Ｎ６塩、１ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.５ｍｇ／Ｌナイアシン、３.５２ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０.９１ｍｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン一水和物、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、０.５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１.６ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、０.６９ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２０ｇ／Ｌスクロース、３ｇ／Ｌ ＧＥＲＧＲＯ（登録商標）、ｐＨ５.８）に暗所下、２７℃にて５ないし７日間移した。体細胞胚成熟およびシュート再生はmedium ２１７で開始した。組織は、シュート発達のために、medium １２７Ｔ（ＭＳ塩、０.６５ｍｇ／Ｌナイアシン、０.１２５ｍｇ／Ｌピリドキシン−ＨＣｌ、０.１２５ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.１２５ｍｇ／Ｌ パントテン酸カルシウム、１５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、１０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌ Ｌ−マルトース、１００ｍｇ／Ｌパロモマイシン、５.５ｇ ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標）、ｐＨ５.８）に移した。
【０２２９】
medium １２７Ｔ上の組織は、４００−６００ルクスの光下、２６℃にて培養した。苗木は、苗木が約３インチの高さで根を有する場合、１２７Ｔ培地に移行した約４ないし６週間後に、土壌、好ましい３インチのポットに移した。植物は生長チャンバー中、２６℃にて２週間維持し、その後、温室生長のために５ガロンのポットに移植する前に温室のミストベンチ上で２週間維持した。植物は温室で成熟するまで生長させ、同系ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａで相互授粉を行った。植物から種子を収集し、さらなる育種活動に使用した。
【０２３０】
実施例２６ 植物からの核酸の単離
核酸はＲ０植物の葉組織から単離し、収集し、９６ウェル収集ボックスで瞬間凍結させ、０ないし２週間後に苗木を土壌に移した。ほぼ１００ｍｇの組織を各植物から収集し、分析まで−８０℃にて保存した。
【０２３１】
ＤＮＡおよびＲＮＡは、修飾を有するQiagen Rneasy ９６（登録商標）キット（Quiagen Inc., Valencia, CA）を用いて単一組織試料から単離した。１００ｍｇの凍結組織を、Bead Beater（登録商標）（Biospec Products, Bartlesville, OK）を用いて、７００μＬのRneasy（登録商標）ＲＴＬ緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）にホモジナイズした。試料は３２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、すべての上清をPromega WIZARD(登録商標）クリーニングプレート（Promega Corpaoration, Madison, WI）のウェルに移した。試料溶液は、クリーニングプレートを通す真空ろ過によって透明化した。透明な上清を核酸抽出に用いた。
【０２３２】
ＤＮＡ抽出については、７０μＬの透明化した試料を、粘着フォイルでカバーしたｖ−ウェルＰＣＲプレートに移し、９５℃まで８分間加熱した。試料は０℃にて５分間インキュベートし、その後に３分間遠心分離して不溶性の物質を除去した。Sephadex G-50ゲルろ過ボックス（Edge Biosystems, Gaithersburg, MO）を２０００ｒｐｍにて２分間調子を整えた。４０μＬの熱処理した上清を各ウェルにロードし、ボックスを２５００ｒｐｍにて２分間遠心した。さらに２０μＬのＴＥ緩衝液をカラム流出液に加え、分析まで試料プレートを−２０℃にて保存した。
【０２３３】
ＲＮＡ抽出のために、５００μＬの透明化した溶液を清潔な９６ウェル試料ボックスに移した。２５０μＬの１００％エタノールを各試料に添加し、試料をよく混合した。ついで、ほぼ７５０μＬのすべての溶液を、Promega WIZARD（登録商標）濾過ユニット中のQiagen Rneasy（登録商標）結合プレートのウェルにロードした。５００μＬのＲＷ１緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）を各ウェルに添加し、緩衝液を真空乾燥によって除去した。８０μＬの無ＲＮＡアーゼＤＮＡアーゼ（Qiagen Inc., Valencia, CA）を各ウェルに添加し、室温にて１５分間インキュベートし、真空濾過によってウェルを通してＤＮＡアーゼ溶液を引き入れた。さらに５００μＬのＲＷ１緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）をウェルに添加し、真空濾過によって緩衝液を除去した。試料は５００μＬ ＲＰＥ緩衝液２×（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて真空濾過によってさらに洗浄した。抽出プレートをマイクロタイタープレート上に置き、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離してフィルター中のいずれの残余ＲＰＥ緩衝液溶液を除去した。８０μｌのＲＮＡ等級の水（無ＤＮＡアーゼ）を各ウェルに添加し、つづいて室温にて２分間インキュベートした。抽出プレートおよびマイクロタイタープレートを３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、保存したＲＮＡ調製物を−８０℃にて収集プレート中で凍結した。
【０２３４】
実施例２７ コピー数のアッセイ
Ｒ０植物中のトランスジーンのコピー数を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法を用いて決定した。ｐＭＯＮ６５１５４およびｐＲＧ７６ ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーションベクターは、トランスジーン挿入のコピー数をアッセイするのに使用し得たジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３'領域由来の配列を用いて構築した。ｐｉｎＩＩフォワードおよびリバース・プライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'ccccaccctgcaatgtga 3'（配列番号：７７）
リバース・プライマー 5'tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3'（配列番号：７８）
【０２３５】
ｐｉｎＩＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ配列は
5'cctagacttgtccatcttctggattggcca 3'（配列番号：７９）であった。
プローブは蛍光色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で５'末端を標識し、クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルローダミン）をリンカーを介してプローブの３'末端に結合した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、Applied Biosystems（Foster City, CA)から得た。 ＳＡＴ、単一コピーのトウモロコシ遺伝子を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイにおける内部対照として使用した。ＳＡＴプライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'gcctgccgcagaccaa 3'（配列番号：８０）：
リバース・プライマー 5'atgcagagctcagcttcatc 3'（配列番号：８１）。
【０２３６】
ＳＡＴ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ配列は
5'tccagtacgtgcagtccctcctcc 3'（配列番号：８２）であり、プローブはその５'末端を蛍光色素ＶＩＣ（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、その３'末端をクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで標識した。
【０２３７】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは製造業者の指示書（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って行った。５ないし１００ｎｇのＤＮＡを各アッセイに用いた。ＰＣＲ増幅およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ検出は、AmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、AmpErase（登録商標）UNG、ｄUTPを含むｄNTP、受動参照１および最適化した緩衝液を含む１×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA）中で行った。８００ｎＭの各フォワードおよびリバースｐｉｎＩＩプライマーおよび１５０ｎＭのｐｉｎＩＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブをＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおいて使用した。２００ｎＭの各Ｓａｔフォワードおよびリバース・プライマーならびに１５０ｎＭ Ｓａｔ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイにおいて使用した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、５０℃にて２分、９５℃にて１０分、その後９５℃にて１５秒および６０℃にて１分間の４０サイクルで行った。リアルタイムＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ蛍光は、ABI Prism 7700 Sequence Detection SystemまたはABI 900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて測定した。ＣＴ値は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット指示マニュアル（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って計算した。△△ＣＴ値は、ＣＴ（内部対照遺伝子（Ｓａｔ））−ＣＴ（トランスジーン）−ＣＴ（非トランスジェニック植物中の内部対照遺伝子（Ｓａｔ））として計算した。コピー数は、表１２の基準に従って以下のように示された。
【０２３８】
【表２１】
【０２３９】
本発明の遺伝子を含む植物は、コピー数についてＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法によって分析する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）およびサザンブロット・ハイブリダイゼーションの両方によって分析した植物の約８０％において、サザンブロット分析がＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数の決定を確認した。
【０２４０】
実施例２８ 遺伝子発現のアッセイ
本発明のトランスジーンの発現は、Applied Biosystems（Foster City, CA）からのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。ＲＮＡ発現は、トランスジェニック標準における発現、ｐｉｎＩＩ３'非翻訳領域に作動可能に連結したビー・チューリンジエンシス（B. thuringiensis）ｃｒｙＩＡＩ遺伝子を含むＤＢＴ４１８と命名したトランスジェニック・トウモロコシ事象に対してアッセイした。ＤＢＴ４１８事象は、アワノメイガのごとき鱗翅目昆虫に対する商業レベルの抵抗性を付与するレベルでｃｒｙＩＡＩ遺伝子を発現し、ブランド名ＤＥＫＡＫＢｔ（登録商標）でＤＥＫＡＬＢ Genetics Corporationによって市販されている。ｐＭＯＮ６５１５４およびｐＲＧ７６ ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーションベクターは、デスティネーションベクターに挿入したいずれかのコード配列についてトランスジーン転写レベルをアッセイするために使用し得るジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３'領域由来の配列を用いて構築した。ｐｉｎＩＩプライマーおよび以前に記載したプローブを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ユビキチン融合タンパク質（ＵＢＩ）ＲＮＡを、すべてのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける内部対照として使用した。使用したＵＢＩプライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3'（配列番号：８３）：
リバース・プライマー 5'ccaacaggtgaatgcttgatagg 3'（配列番号：８４）。
【０２４１】
ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブの配列は
5'catgcgccgctttgcttc 3'（配列番号：８５）であった。ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブはその５'末端を蛍光色素ＶＩＣ（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、およびその３'末端をクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで標識した。
【０２４２】
逆転写、ＰＣＲ増幅およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プロービングは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）に記載した１工程手法に従って行った。５ないし１００ｎｇの全ＲＮＡを各アッセイに使用した。ＤＢＴ４１８事象からのイン・ビトロ(in vitro)転写された対照ＲＮＡを毎プレート上の対照として含め、０.０１ｐｇないし１０ｐｇの範囲の濃度で行った。ＤＢＴ４１８の葉からの全ＲＮＡおよび非トランスジェニック近交系ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａからの全ＲＮＡを、各々陽性および陰性対照として行った。ＲＴ−ＰＣＲは、３ｍＭ酢酸マンガン、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ、１００単位のｒＴｔｈ（登録商標）Applied Biosystems, Foster City, CA）ＤＮＡポリメラーゼおよび２５単位のAmpErase UNG（Applied Biosystems, Foster City, CA）を含有するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ緩衝液（５０ｍＭビシン、１１５ｍＭ酢酸カリウム、０.０１ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｍＭ受動参照１、８％グリセリン、ｐＨ８.２、Applied Biosystems, Foster City, CA）中で行った。ＲＴ−ＰＣＲは以下のように行った：５０℃にて２分、６０℃にて３０分、９５℃にて５分、その後に、９５℃にて２０秒および６０℃にて１分の４０サイクル。４００ｎＭの各フォワードおよびリバース・プライマーをｐｉｎＩＩ配列の増幅に使用し、２００ｎＭのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｐｉｎＩＩプローブを検出に使用した。ＵＢＩ ＲＮＡは４００ｎＭの各フォワードおよびリバース・プライマーを用いて増幅し、２００ｎＭ ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを検出に使用した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光は、ABI Prism 7700 Sequence Detection SystemまたはABI 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて測定した。本発明のトランスジーンの発現は、ＤＢＴ４１８におけるトランスジーン発現に対して定量化し、ＤＢＴ４１８発現に対するトランスジーン発現の比、すなわち２−（△△ＣＴ）（トランスジーン）／２−（△△ＣＴ）（ＤＢＴ４１８）
として報告する。
【０２４３】
実施例２９ 植物育種
戻し交雑を用いて、出発植物を改良し得る。戻し交雑は、特定の所望の特性を１の源から同系へとまたはその特性を欠いている他の植物へと移行する。これは、例えば、最初に優れた同系繁殖体（Ａ）（反復親）を、問題の特性に関する適当な遺伝子（または複数の遺伝子）、例えば本発明により調製した構築物、を運搬している供与同系繁殖体（非反復親）に交雑することによって成し得る。この交雑の子孫は、最初に非反復親から移行すべき所望の特性について得られた子孫において選択され、ついで選択された子孫を優れた反復親（Ａ）に戻し交配する。所望の特性について選択された５またはそれを超える戻し交雑世代の後、子孫は移行する特性を制御する遺伝子座についてはヘミ接合であるが、大部分またはほぼすべての他の遺伝子については優れた親と同様である。最後の戻し交雑世代は自家受粉させて、移行すべき遺伝子（または複数の遺伝子）について純粋な家系、すなわち１またはそれを超える形質転換事象、である子孫を得る。
【０２４４】
したがって、一連の育種操作を介して、さらなる組換え操作を必要とすることなく、選択したトランスジーンを１の系統から全く異なる系統に動かすことができる。トランスジーンは、それが典型的にはいずれか他の遺伝子と遺伝学的に同様にふるまい、かつ、いずれか他のトウモロコシ遺伝子と同様に育種技術によって操作し得る点において貴重である。したがって、１またはそれを超えるトランスジーンについて真の家系である同系繁殖体植物を作出することができる。異なる同系繁殖体植物を交雑することにより、異なる組合せのトランスジーンを有する多数の異なる雑種を作出することができる。このようにして、雑種（"雑種強勢"）としばしば関連する所望の作物学的性質、ならびに１またはそれを超えるトランスジーンによって付与された所望の特徴を有する植物を作出することができる。
【０２４５】
形質転換植物中の各遺伝子によって付与される表現型の特徴付けのために、本発明の遺伝子をトウモロコシ雑種に遺伝子移入することが望ましい。トランスジーン、好ましくはＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａが導入された宿主遺伝子型は、選りすぐりの同系繁殖体であり、したがって高収量トウモロコシ雑種を作出するためには限られた育種しか必要でない。カルスから再生した形質転換植物は同じ遺伝子型、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａに交雑する。子孫は２回自家受粉し、トランスジーンについてホモ接合である植物を同定する。ホモ接合トランスジェニック植物は、雑種を作出するために試験交雑親に交雑する。試験交雑親は、トランスジェニック親とは異なる雑種強勢群に属し、かつ、高収量雑種を作出し得ることが知られている、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＡのＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＥまたはＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｂのいずれかに対する交雑から生じた、同系繁殖体である。
【０２４６】
実施例３０ 表現型を評価する方法
本発明の遺伝子の発現は、形質転換細胞および植物において本明細書に開示するような種々の表現型に通じる。表現型データは、カルスの形質転換プロセスならびに植物再生の間、ならびに植物および子孫において収集する。表現型データは、形態的外観ならびにカルスの生長、例えばシュートの性質、根の性質、デンプン質、粘液質、非胚形成性、増大した生長速度、低下した生長速度、死滅、に関して形質転換カルスにおいて収集する。当業者は、形質転換カルスにおける他の表現型特徴を認識し得るであろう。
【０２４７】
表現型データは、植物再生のプロセスの間ならびに土壌に移行した再生植物においても収集する。表現型データには、正常植物、潅木植物、幅の狭い葉、縞の入った葉、節のある表現型、アルビノ、アントシアニン産生、バギーウィップ（buggy whipped）（直近に出現した葉が細長く、互いに巻きつく、当該技術分野で知られている現象）または変化した雄穂、雌穂または根のごとき特徴が含まれる。当業者は、形質転換植物における他の表現型特徴を認識し得る。
【０２４８】
広範な種々の表現型を植物育種のプロセスの間に、ならびに同系繁殖体および雑種植物の両方において試験する間にモニターする。例えば、Ｒ０およびＲ１植物（カルスから直接的に再生した植物およびそれら植物の直接の子孫）においては、植物の型（苗木について前記したもののような一般的な形態的特徴）および植物によって産生された穀物の栄養組成を記録する。栄養組成分析にはアミノ酸組成を含めることができ、タンパク質、デンプンおよび油の量、タンパク質、デンプンおよび油の特徴、ファイバー、灰、無機物含量をすべて測定し得る。当業者が穀物の他のコンポーネントの分析を含め得ることは予想される。Ｒ２およびＲ３植物においては、花粉を収めるまでの日、開花するまでの日、植物の型を観察する。さらに、Ｒ２植物の代謝産物調査を行う。当業者に入手可能な方法を用いて、５０ないし１００またはそれを超える代謝産物を植物において分析し、それによって植物の代謝フィンガープリントを確立し得る。また、Ｒ３植物においては、圃場条件下で葉の伸長速度を測定する。種々の表現型を、本発明のトランスジーンを含む雑種においてアッセイする。例えば、収量、水分、試験重量、栄養組成、クロロフィル含量、葉の温度、起立、幼植物の活力、植物の高さ、葉の数、分蘖、支柱根、常緑（stay green）、茎倒伏（stalk lodging）、根倒伏（root lodging）、植物の健康、バレネス（barreness）／多産性、グリーンスナップ（green snap)、害虫抵抗性（疾患、ウイルスおよび昆虫を含む）および代謝プロフィールを記録する。また、雑種から収穫した穀物の表現型特徴を記録し、それには雌穂の列当たりの穀粒の数、雌穂の穀粒の列の数、穀粒の発育停止、穀粒重量、穀粒サイズ、穀粒密度および物理的穀物品質が含まれる。さらに、光合成、葉面積、穀皮構造、穀粒乾燥落下速度（dry down rate）および節間の長さのような特徴を、雑種または同系繁殖体で測定し得る。本発明の遺伝子を発現しているトランスジェニック植物において転写特徴付けを行い得ることは予想される。
【０２４９】
本発明の遺伝子を発現しているトランスジェニック植物における雑種収量を決定するためには、トウモロコシが都合よく生長する地理的場所、例えばアイオワ、イリノイまたは合衆国中西部の他の場所における複数の場所で雑種を試験しなければならないことは認識される。トウモロコシ雑種の改良に寄与するトランスジーンを同定するために１年を超える収量試験が望ましいことは予想される。したがって、トランスジェニック雑種は、最初の年は十分な数の場所で評価して、非トランスジェニック雑種相対物からの少なくともほぼ１０％の収量の差異を同定する。収量試験の２年目は、２の雑種間の４−５％収量の差異を同定することができる十分な場所および十分な反復で行う。さらに、収量試験の２年目においては、雑種を正常な圃場条件下ならびにストレス条件下、例えば水または集団密度ストレスの条件下で評価する。当業者は、所望の比率の精度で２の雑種間で統計学的に有意な収量の差異を検出し得るように収量試行をどのように設計するかを知っている。
【０２５０】
実施例３１ トウモロコシ種子の表面滅菌および吸収
各トランスジェニックロットについて、トウモロコシ種子を５０ｍｌの０.０１％Triton X-100を含有する３０％漂白剤（過酸化水素ナトリウム溶液＝Chloroxまたは等価物）を入れた無菌の５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れ、フラスコをオービタルシェイカーで５分間回転することによってそれらを表面滅菌する。ついで、漂白剤溶液を注ぎ出し、約１００ｍｌの滅菌脱イオン水で洗浄し、水洗浄液を注ぎ出す。無菌水洗浄をさらに４回繰り返し、再度の水洗浄液を種子上に残す。エアバブリング下（０.２μｍフィルターを通す）での吸収のために、種子をこの水の中で、室温にて２４時間インキュベートする。
【０２５１】
Ｉ．ファイトトレイ（Phytotray）中の培地の調製
幾つかのファイトトレイ用の水−寒天培地を調製する。本発明者らは、容器の長い方の深さの側部が底面上にあり、小さい方の側部が蓋として使用されるような逆さにした位置でファイトトレイＩＩ（またはプラスチックボックス：６０×３０×１５ｃｍ）を使用している。脱イオン水中の０.３％BactoAgarを液体サイクル上の４５分間オートクレーブ処理することによって、ファイトトレイ当たり１００ｍｌに対して十分な水−寒天培地を調製する。容易に取扱いし得る程度まで培地を冷却し、溶解したままでファイトトレイ当たりほぼ１００ｍｌを注入する。
【０２５２】
ＩＩ．トウモロコシ低温幼植物活力アッセイ
・培地が固化したら、それと無菌種子を層状流動蓋（laminar flow hood）にする。
・無菌ピンセットを用いて、２０の健全な最も均一な種子を選択し、アッセイに使用する各ファイトトレイに、後に個々の種子を簡単に取り出し得るように均等に種子を離しながら、種子を置く。
・胚の側が下方に斜めに挿入し、種子がちょうど寒天の表面下となるように種子を置く。この位置では、現れるシュートおよび根は束縛されることなる直接的に伸長することができるであろう。
・種子を培地中、２２℃にて１週間または大部分の種子が小根を押出し、寒天から現れ始めるまでインキュベートする。
・層状流動蓋中の１０の最も均一に生長した幼植物を除いてすべてを除去する。
・ファイトトレイを１６時間日照サイクルで１０℃に設定した定温植物生長チャンバーに移し、そこで２週間インキュベートする。
・ファイトトレイを１週間２２℃に戻す。
・幼植物を取り出し、幼植物毎に根の長さおよびシュートの長さを測定し、新鮮重ｇ／３幼植物を測定し、ノートに記録する。
【０２５３】
低温発芽および出現アッセイ
以下の点を除いて前記と同様である：
・Ｉにおける最後の水洗の後に、一晩吸収工程の間にフラスコを１０℃に置く。
・固化した培地と一緒にファイトトレイを１０℃に置く。
・冷却したファイトトレイに低温吸収種子を播種した後に、それを１０℃のチャンバーに直接置く。
・約５日後に、小根がほぼ同じ長さである１０の最も均一に発芽した種子を除いて、すべてを除去する。ファイトトレイを１−２週間１０℃のチャンバーに戻す。幼植物を取り出し、各々の幼植物について根の長さおよびシュートの長さを測定し、３の幼植物ごとに新鮮重を測定し、ノートに記録する。
・第２のセットのファイトトレイを２２℃に１週間移す。
【０２５４】
幼植物を取り出し、各幼植物について根の長さおよびシュートの長さを測定し、ノートに記録する。
【０２５５】
実施例３１．ダイズ形質転換用のプラスミドの作製
実施例（ＣｓｐＡおよびＢ構築物−ｐＭＯＮ７３９８３および７３９８４）
ｐＭＯＮ７３９８３（図１８）は、アグロバクテリウム媒介形質転換およびダイズにおけるバチルス・ズブチリスＣｓｐＡのようなタンパク質（配列番号：１）を構成的に発現するためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＡ遺伝子をクローニングするためには、２の遺伝子特異的プライマーＭＳＡ４５２およびＭＳ４５３を、National Institute of Health (ＮＣＢＩ）の一部であるNational Library of Medicineの一部であるNational Center for Biotechnology InformationからのＣｓｐＡ配列の情報（Genbank＃ Ｍ３０１３９）に基づいて設計した。ＭＳＡ４５２の配列は：
ＣｓｐＡの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを５'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG（配列番号：８６）であり、一方、ＭＳＡ４５３の配列は：
ＣｓｐＡの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC（配列番号：８７）である。リバース・プライマーＭＳＡ４５３はGenbank遺伝子配列の３'末端にマッチするように設計した。ＰＣＲ反応はプライマーＭＳＡ４５２およびＭＳＡ４５３、High Fidelity Taqポリメラーゼ（BRL)およびｐＭＯＮ５７３９７（図３）を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子ＣｓｐＡの３'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡをゲル電気泳動によって精製し、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリＴｏｐ１０細胞（Invitrogen）に形質転換した。４の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep ＤＮＡを調製した。Ｍ１３−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをｐＭＯＮ７３９８１と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
【０２５６】
ｐＭＯＮ７３８８１ ＤＮＡをStuIおよびBamHIで消化して、ＣｓｐＡ遺伝子フラグメントを単離した。ｐＭＯＮ７３９８０ ＤＮＡを順次StuIおよびBamHIで消化し、ついでGene Clean IIキットによって精製した。ＣｓｐＢフラグメントおよびこの精製したベクターｐＭＯＮ７３９８０を連結し、連結反応物をイー・コリＤＨ１０Ｂ細胞に電気的に形質転換した。形質転換体はスペクチノマイシン含有培地で選択した。miniprep ＤＮＡを形質転換体から調製し、ＣａＭＶ ３５Ｓ−プロモーター特異的フォワード・プライマーを用いることによってインサートの存在についてＤＮＡをチェックした。このインサートを含むクローンをｐＭＯＮ７３９８３と命名した。より大きなＤＮＡ prepを作製し、BglII、EcoRI、PstI、EcoRI＋BamHI、StuI＋XhoIを含む一連の確認消化を行った。これらは、正確なクローニングを確認した。
【０２５７】
ｐＭＯＮ７３９８４は、アラビドプシスにおいて、アグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：２）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子をクローニングするために、２の遺伝子特異的プライマー、ＭＳＡ４５４およびＭＳＡ４５５を、National Institute of Health (ＮＣＢＩ）の一部であるNational Library of Medicineの一部であるNational Center for Biotechnology InformationからのＣｓｐＢ配列の情報（GenBank＃ Ｘ５９７１５）に基づいて設計した。ＭＳＡ４５４の配列は：
ＣｓｐＢの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを５'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG（配列番号：８８）であり、一方、ＭＳＡ４５５の配列は：
ＣｓｐＢの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG（配列番号：８９）である。リバース・プライマーＭＳＡ４５５はGenBank遺伝子配列の３'末端にマッチするように設計した。ＰＣＲ反応はプライマーＭＳＡ４５４およびＭＳＡ４５５、High Fidelity Taqポリメラーゼ（BRL)およびｐＭＯＮ５７３９９を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子ＣｓｐＢの３'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡをゲル電気泳動によって精製し、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリＴｏｐ１０細胞（Invitrogen）に形質転換した。４の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep ＤＮＡを調製した。Ｍ１３−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをｐＭＯＮ７３９８２と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
【０２５８】
ｐＭＯＮ７３８８２ ＤＮＡをStuIおよびBamHIで消化して、ＣｓｐＢ遺伝子フラグメントを単離した。ｐＭＯＮ７３９８０ ＤＮＡを順次StuIおよびBamHIで消化し、ついでGene Clean IIキットによって精製した。ＣｓｐＢフラグメントおよびこの精製したベクターｐＭＯＮ７３９８０を連結し、連結反応物をイー・コリＤＨ１０Ｂ細胞に電気的に形質転換した。形質転換体はスペクチノマイシン含有培地で選択した。miniprep ＤＮＡを形質転換体から調製し、ＣａＭＶ ３５Ｓ−プロモーター特異的フォワード・プライマーを用いることによってインサートの存在についてＤＮＡをチェックした。このインサートを含むクローンをｐＭＯＮ７３９８４と命名した。より大きなＤＮＡ prepを作製し、BglII、EcoRI、PstI、EcoRI＋BamHI、StuI＋XhoIを含む一連の確認消化を行った。これらは、クローニングが正確であることを確認した。
【０２５９】
ゲノムに前記のｐＭＯＮ構築物を安定して組み込んだ形質転換を介してダイズ植物を作製した。
【０２６０】
実施例３２
前記実施例１０および１１からのＤＮＡ構築物で形質転換したトウモロコシ植物を実験した。
温室
・渇水耐性について１は１０のｃｓｐＡ事象を試験し、１は１０のｃｓｐＢ事象を試験する２の実験を行った。
・各事象からの２４のトランスジーン陽性および２４のトランスジーン陰性ハイブリッド幼植物を試験した（すべて、分離したハイブリッドの雌穂に由来する種子）。
・試験は温室のベンチ上で行った。
・処理は水を差し控えることおよび植物を含有する各ポットの総ポット重量をモニターすることからなる。完全に給水したポットは各々約１０００ｇと秤量され、各ポットの重量が４００ｇに達するまで水を差し控え、ついで処理の残りの期間はポットをその重量で維持した。
・処理の全体を通して、ポットの土壌の表面から"最も高い"葉の先端までの距離を測定することによって植物の高さを決定した。これらの測定から、測定の間の間隔における高さを比較することによって、ＬＥＲ（leaf extension rates、葉伸長速度）を決定した。
・渇水の間のＬＥＲ比較は、事象内のトランスジーン陰性およびトランスジーン陽性植物の間で作成した。
・試験した１０の事象のうちの３については、ｃｓｐＡトランスジェニック植物は処理の間にＬＥＲについて有意に（ｐ＜０.１０)改善された。
・試験した１０の事象のうちの３については、ｃｓｐＢトランスジェニック植物は処理の間にＬＥＲについて有意に（ｐ＜０.１０)改善された。
【０２６１】
圃場効率
・ハイブリッド種子を用いて３の実験を行った。生長の後期生長期の渇水耐性について、１は１６のｃｓｐＢ事象（ＣＡ）を試験し；１は２１のｃｓｐＢ事象（ＫＳ）を試験し；１は１４のｃｓｐＡ事象（ＨＩ）を試験した。
・ＣＡおよびＨＩ試行については、トランスジーンの存在について分離している〜３４の植物を含む列が各々６および４の反復で存在した。分離している列は、分離している雌穂から由来した。
・ＫＳ実験については、列は６の反復でもって、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの対を形成をする列として〜３４の植物を含ませた。
・処理は、生長の後期生長期の間にほぼ１０日水を差し控える（生存植物を維持するために必要な少量の水を与えつつ）ことからなった。１０日の終期において、植物は収穫までよく潅漑した。
・処理の全体を通して、ＬＥＲ、クロロフィル（ＳＰＡＤメーターによって）および光合成率を含む多くの表現型を測定した。処理の後には、花粉を収めるまでおよびトウモロコシの毛（silk）が出現するまでの日数、ならびに穀粒／雌穂のごとき雌穂コンポーネント、穀粒を有する雌穂、穀粒重量および収量：を含む測定したさらなる表現型を含めた。
・事象内および構築物を横切って、トランスジーン陽性および陰性植物の間で表現型比較を作成した。
・ＣＡ試行、（栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"６の事象を横切る）構築物としてｃｓｐＢにおいては、トランスジーン陽性植物は渇水処理の間または後にＬＥＲ、葉の温度、および穀粒／雌穂ｃｓｐＢについて有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
・ＣＡ試行において、個々の事象は、渇水処理の間または後のＬＥＲ、平均雌穂長、穀粒体積／雌穂、気孔コンダクタンス、および開花までの日数について有意に（ｐ＜０.１０）改善されたいた。
・ＫＳ試行、（栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"６の事象を横切る）構築物としてｃｓｐＢにおいて、トランスジーン陽性植物は、ＬＥＲ、穀粒を結んでいる雌穂／列、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および収量について有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
・ＫＳ試行において、個々の事象は、ＬＥＲ、光合成率、気孔コンダクタンス、雌穂／列、および穀粒／植物について有意に（ｐ＜０.１０）改善されたいた。
・ＨＩ試行において、３の事象は、ＬＥＲ（クロロフィル含量はＨＩにおいて測定した唯一の他の表現型であった）について有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
【０２６２】
ＣＡおよびＫＳ結果の要約：
ｃｓｐＢ−ＫＳサイト圃場効率結果の概要
１．植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
２．水を制限した処理、測定したすべての表現型、特にＬＥＲ、クロロフィルおよび光合成率に対して
３．栄養繁殖および生殖表現型に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
４．ＬＥＲ、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、雌穂／区画、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および概算収量を含む１またはそれを超える事象が統計学的に改善された。
５．乾燥処理におけるＬＥＲ、雌穂／区画、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および概算収量について、ならびに湿潤処理におけるＬＥＲについて、構築物レベルの統計学的改善がｐ＜０.１０で観察された。
【０２６３】
【表２２】
【０２６４】
ｃｓｐＢ−ＣＳサイトについての圃場効率の概要（フォント変化）
１．植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
２．水を制限した処理は、測定したすべての栄養繁殖表現型、詳細にはＬＥＲ、クロロフィルおよび光合成率に処理の影響を生じるが、すべての生殖表現型に処理の影響が生じないように適用した。
３．関心のある表現型（栄養繁殖）に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
４．ＬＥＲ、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、穀粒／雌穂、平均雌穂長、および穀粒体積／雌穂について、１またはそれを超える事象がトランスジーンを含む植物において統計学的に改善された。
５．乾燥処理におけるＬＥＲ、葉の温度、および花粉を収めるまでの日数、および湿潤処理におけるＡＳＩについては、構築物レベルの有意な改善が観察された。
【０２６５】
【表２３】
【０２６６】
これらの事象の多くを、低温発芽効率における改善および低温条件下の幼植物生長についてつづいて試験し、効果を生じることは証明されなかった。したがって、このプロモーターによって駆動されるこれらの遺伝子は、低温発芽または低温条件下での幼植物生長の改善についてはトウモロコシにおいて機能しないようであったが、同じ遺伝子を駆動する異なるプロモーター、または異なる低温ショックタンパク質は、トウモロコシにおいてこれらの表現型を改善するために機能し得る。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００３年９月２９日に出願した米国仮特許出願番号６０／５０６,７１７および２００３年１２月１７日に出願した出願番号６０／５３０,４５３の３５ ＵＳＣ§１１９（ｅ）の利益を主張する。
【０００２】
配列表の取込み
ほぼ９８メガバイトである（ＭＳ−ＤＯＳで測定して）、各々ＣＳＰ.ＳＴ２５.ｔｘｔと命名したファイルを含む、すべてＣＤ−ＲＯＭに存在する、配列表のコンピュータ読出し可能な形態の配列表の２のコピー（配列表コピー１および配列表２コピー２）は２００４年９月２８日に作製し、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００３】
本発明は、植物における低温、渇水、塩、低温発芽、熱および他の非生物ストレス耐性、ならびに植物におけるウイルス、菌類、細菌および他の生物ストレス耐性に関する。
【背景技術】
【０００４】
種子および果実生産は、数十億ドルの商用産業であり、合衆国の多くの州および世界中の多くの国々の主たる収入源である。商業的に価値のある種子には、種子から搾ることができる植物油にふさわしい、例えばキャノーラ、ワタ種子およびヒマワリ種子が含まれる。エンドウ、インゲンおよびヒラマメのごときマメ科植物の種子も、それらはタンパク質に富むため商業的に価値がある。例えば、ダイズに関しては、４０−４５％のタンパク質および１８％の油脂からなる。また、コーヒーはCoffea arabica植物の乾燥およびローストした種子から生産される価値ある作物であり、一方、チョコレートはカカオの種子または"ビーン"から生産される。同様にして、例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギおよび他の穀物、堅果、豆果、トマトおよび柑橘類果実を含む多くの果実および種子は商業的に価値がある。例えば、トウモロコシ種子は、タコス、コーン油、トルティア、コーンフレーク、コーンミールおよび他の多くのもののごとき多くの食品品目または調理に使用する品目に製造される。トウモロコシは、限定するものではないが、飼料およびエタノール生産を含む多くの製造方法における原料としても使用される。
【０００５】
種子および果実の生産は両方とも、生物的および非生物的ストレスに固有に起因して制限される。例えば、ダイズ（Glycine max）は、貯蔵の間の種子発芽の損失に苦しめられ、および土壌温度が低温である場合は発芽することができない作物種である（Zhangら, Plant Soil 188: (1997)）。このことは、トウモロコシおよび農業経済学的に重要な他の植物についてもあてはまる。植物における非生物的ストレス耐性の改善は、低温、渇水、洪水、熱、ＵＶストレス、オゾン増加、酸性雨、汚染、塩ストレス、重金属、無機化土壌、および他の非生物的ストレス下の生長および／または発芽を増加させるのに栽培者に有利であろう。菌類およびウイルス感染のごとき生物的ストレスは、世界的に大きな作物の損失も生じる。
【０００６】
伝統的な育種（１の遺伝子型の特定のアレルを他のものに交雑する）が何世紀もの間用いられてきて、生物的ストレス耐性、非生物的ストレス耐性および収量が増加されている。伝統的な育種は、親植物に存在する制限された数のアレルに固有的に起因して制限される。これは、つぎに、このようにして付加し得る遺伝的変異性の量を制限する。分子生物学は、植物におけるストレス耐性を改善するであろう遺伝子について、本発明者が遠くかつ広く見ることを許容している。本発明者らは、他の生物がストレスの多い条件に対してどのように反応し、耐えるのかを決定することを探求した。低温ショックタンパク質は、低温およびストレスの多い条件で生存するために、細菌および他の生物によって使用されるシステムの一部である。本発明者らは、低温ショックタンパク質およびそれと関連するタンパク質をコードする遺伝子を植物に入れ、それを発現させると、植物の低温、渇水、熱、水および他の非生物的ストレス耐性ならびに植物の菌類、ウイルスおよび他の生物的ストレス耐性を上昇すると仮定した。本発明者らは、低温ショックタンパク質に相同であるか、または配列類似性を有する遺伝子を用いれば、生物的および非生物的ストレス耐性を上昇するであろうことも考えた。
【０００７】
本発明は、生物的および非生物的ストレスに起因するそれらの消失を制限する農業従事者にとって有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、植物の細胞中で低温ショックタンパク質（Ｃｓｐ）を発現する植物を提供する。このｃｓｐの発現は、該植物内におけるより大きな非生物的ストレス耐性に通じる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１の形態において、ｃｓｐをコードするポリヌクレオチドは、作動可能に連結した植物中で機能するプロモーターおよび植物中で機能するターミネーターによって発現する。
より詳細には、本発明は、ポリアデニル化部位を提供する３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結した低温ショックタンパク質をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結した、植物中で機能するプロモーターを含む第１のＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。第１のＤＮＡポリヌクレオチドは、第２のＤＮＡポリヌクレオチドに有利に異種性である場合がある。該発明は、第１のＤＮＡポリヌクレオチドと第２のＤＮＡポリヌクレオチドとの間に挿入したイントロンを有する組換えＤＮＡ分子も提供する。また、本発明は、第２のＤＮＡポリヌクレオチドが配列番号：３中のモチーフを含むタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子も提供する。本発明の組換えＤＮＡの特定の形態において、第２のＤＮＡポリヌクレオチドは以下の中から選択されるタンパク質をコードする：
（ａ）グラム陽性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）からの低温ショックタンパク質、
（ｃ）バチルス・ズブチリス低温ショックタンパク質Ｂ（ＣｓｐＢ）のホモログ、
（ｄ）配列番号：２に実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｅ）グラム陰性細菌からの低温ショックタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｆ）エスシェリキア・コリ（Escherichia coli）からの低温ショックタンパク質を含むタンパク質、
（ｇ）エスシェリキア・コリ低温ショックタンパク質Ａ（ＣｓｐＡ）のホモログ、
（ｈ）配列番号：１に実質的同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉ）アグロバクテリウム・ツメファシエンスからの低温ショックタンパク質、および
（ｊ）配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３または６５のいずれかに実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１０】
本発明は、プロモーターが、誘導性プロモーター（inducible promoter）、構成的プロモーター（constitutive promoter）、時期調節型プロモーター（temporal-regulated promoter）、発生段階調節型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、組織優先型プロモーター（tissue-preferred promoter）、低温亢進型プロモーター（cold enhanced promoter）、低温特異的プロモーター（cold-specific promoter）、ストレス亢進型プロモーター（stress enhanced promoter）、ストレス特異的プロモーター（stress specific promoter）、渇水誘導性プロモーター（drought inducible promoter）、水分欠乏誘導性プロモーター（water deficit inducible promoter）および組織特異的プロモーター（tissue-specific promoter）よりなる群から選択される組換えＤＮＡ分子も提供する。
【００１１】
本発明は、前記した組換えＤＮＡ分子をゲノム中に含む植物細胞および植物、ならびにそれから作製した伝播体および子孫も提供する。植物には、限定するものではないが、作物植物、単子葉および双子葉植物が含まれる。より好ましくは詳細には、それには、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、イネ、ワタ、オオムギ、エンバク、シバ、ワタ、およびコムギが含まれ得る。
【００１２】
本発明は、低温ショックタンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子で形質転換されている非生物的ストレス耐性のトランスジェニック植物も提供する。かかる植物ならびにその細胞および種子のごとき伝播体には、そのゲノムの中に、低温ショックタンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子が含まれる。かかる植物は、１またはそれを超える高められた特性を示す：低温が同種の非形質転換植物の生長を制限するであろう条件下でのより高い生長速度、
（ａ）高温が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｂ）水分が同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｃ）土壌および／または水分中の高塩分または高イオンが同種の非形質転換植物の生長を限定するであろう場合の条件下でのより高い生長速度、
（ｄ）同種の非形質転換植物よりもコールドショック後に生存する植物のより高いパーセントを有すること、
（ｅ）同種の非形質転換植物と比較した場合のより高い収量、または
（ｆ）同種の非形質転換植物と比較した渇水に対する耐性。
【００１３】
本発明の方法は、例えば種子を発生する目的で、単純にかかる種子を土壌に播き、例えばストレス条件下で、それを生長させることによって、本発明の植物を繁殖するさせることを含む。より詳細には、本発明は、非生物的ストレス耐性、増大した収量または増大した根の大きさのごとき高められた特性を有する植物を作製する方法を提供する。方法には、
ａ）低温ショックタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子を植物細胞または複数の細胞のゲノムに挿入し、
ｂ）形質転換植物細胞または複数の細胞を得、
ｃ）該形質転換植物細胞（または複数の細胞）から植物を再生し、ついで
ｄ）高められた特性を示す植物を選択する
工程が含まれる。
本発明の１の態様において、熱耐性、塩耐性、渇水耐性および低温ショック後の生存よりなる群から選択される高められた非生物ストレス耐性を示す植物を選択する。
【００１４】
本発明は、配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも４０％同一である単離されたタンパク質も提供する。ある種の態様において、匹敵する特性は、低温ショックタンパク質を、４０％を超える同一性を有するタンパク質と、例えば本明細書に詳細に開示した低温ショックタンパク質に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％同一性を有するタンパク質と置換することによって達成し得る。同様にして、本発明は、配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、９０および９２を含む群から選択されるＤＮＡ配列を有する核酸にハイブリダイズする低温ショックタンパク質をコードする単離された核酸も提供する。
【００１５】
本発明は、詳細には、配列番号：５、７、９、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群の配列に実質的に同一であるＤＮＡ配列を有する低温ショックタンパク質をコードする単離された核酸も提供する。
【００１６】
本発明は、伝播体を植えるかまたは発芽させた場合の、前記の組換えＤＮＡ分子を含む伝播体、および、例えばかかる伝播体が種子である場合には、該伝播体から発芽した植物の圃場（field）も提供する。
【００１７】
本発明は、請求項５９の種子を土壌に植え；
ｂ）該植物から種子；およびそれから生成した種子を収穫することを含む種子の生産方法も提供する。
【００１８】
また、トランスジェニック植物の作製方法を提供し、当該方法には、
（ｉ）配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそのフラグメントもしくはシス・エレメントに少なくとも４０％相同であるＤＮＡポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子を植物細胞のゲノムに導入し、ここに該ＤＮＡポリヌクレオチドはプロモーターに作動可能に連結されており、かつ、３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結されており；ついで、
（ｉｉ）該トランスジェニック植物細胞を選択し；ついで、
（ｉｉｉ）該トランスジェニック植物細胞をトランスジェニック植物に再生する工程を含み、またこの方法によって作製した植物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はｐＭＯＮ５７３９６のプラスミド地図を示す。
【図２】図２はｐＭＯＮ２３４５０のプラスミド地図を示す。
【図３】図３はｐＭＯＮ５７３９７のプラスミド地図を示す。
【図４】図４はｐＭＯＮ５７３９８のプラスミド地図を示す。
【図５】図５はｐＭＯＮ２３４５０のプラスミド地図を示す。
【図６】図６はｐＭＯＮ５７３９９のプラスミド地図を示す。
【図７】図７はｐＭＯＮ４８４２１のプラスミド地図を示す。
【図８】図８はｐＭＯＮ５６６０９のプラスミド地図を示す。
【図９】図９はｐＭＯＮ５６６１０のプラスミド地図を示す。
【図１０】図１０はｐＭＯＮ７３６０７のプラスミド地図を示す。
【図１１】図１１はｐＭＯＮ６１３２２のプラスミド地図を示す。
【図１２】図１２はｐＭＯＮ７３６０８のプラスミド地図を示す。
【図１３】図１３はｐＭＯＮ６５１５４のプラスミド地図を示す。
【図１４】図１４はｐＭＯＮ７２４７２のプラスミド地図を示す。
【図１５】図１５はｐＥＮＴＲ１のプラスミド地図を示す。
【図１６】図１６は示した遺伝子を発現する植物および対照の生長パターンを示し、導入した遺伝子が非生物的ストレス耐性を提供することを示している。
【図１７】図１７はｐＭＯＮ４２９１６のプラスミド地図を示す。
【図１８】図１８はｐＭＯＮ７３９８３のプラスミド地図を示す。
【図１９】図１９はｐＭＯＮ７３９８４のプラスミド地図を示す。
【００２０】
本発明は、生物的および非生物的ストレスに対する増大した耐性を有する植物を提供する。提供する植物は、該植物の細胞における低温ショックタンパク質（ｃｓｐ）の発現に起因する増大したストレス耐性を有する。本発明は、幾つかの形態の例を提供し、本発明において機能することが予想される他の形態も意図する。
【００２１】
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するため、および、当業者が本発明を実施することを案内するために提供する。別段注記しない限り、用語は当業者による慣習的な用法に従って理解されるべきである。例えば、分子生物学および分子遺伝学で使用される一般用語の定義は、Lewin, Genes VII, Oxford University Press and Cell Press, New York, 2000；Buchananら, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Courier Companies, USA, 2000；Lodishら, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman and Co., New York, 2000に見出すことができる。遺伝学の一般用語は、先の刊行物ならびにLynchら, Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer and Associates, Sunderlant, MA, 1998；Hartwellら, Genetics：From Genes to Genomes, McGraw-Hill Companies, Boston, MA, 2000；Martlら, Genetics: Analysis of Genes and Genomes, Jones and Bartlett Publishers, Sudbury, MA；Strachanら, Human Molecular Genetics, John Wiley and Sons, New York, 1999に見出すことができる。
【００２２】
３７ ＣＦＲ§１.８２２に記載のＤＮＡ塩基の命名法を用いる。アミノ酸残基の標準的な一文字および三文字命名法を用いる。
【００２３】
多くの農業経済学的特性が"収量"に影響し得る。例えば、それには、限定するものではないが、植物の高さ、莢の数、植物上の莢の位置、節間の数、莢破壊の発生率（incidence of pod shatter）、種子サイズ、根粒着生および窒素固定の効率、栄養同化の効率、生物的および非生物的ストレスに対する抵抗性、炭素同化、植物構造、倒伏に対する抵抗性、パーセント種子発芽、苗木活力および幼植物特性が含まれ得る。例えば、それには、限定するものではないが、発芽の効率（ストレスを負荷した条件下での発芽を含む）、いずれかまたはすべての植物部分の生長速度（ストレスを負荷した条件下での生長速度を含む）、穂の数、穂当たりの種子の数、種子のサイズ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、種子中身の特徴（characteristic of seed fill）も含まれ得る。収量は多くの方法で測定することができ、それには、試験重量、種子重量、植物当たりの種子の数、植物当たりの種子重量、単位面積当たりの種子の数または重量（すなわち、エーカー当たりの種子、または種子の重量）、エーカー当たりのブッシェル重量、エーカー当たりのメートルトン、エーカー当たりのトン、ヘクタール当たりのキロが含まれる。１の形態において、本発明の植物は収量の要素である高められた特性を示す。
【００２４】
"核酸（配列）"または"ポリヌクレオチド（配列）"とは、ゲノムまたは合成起源の一本鎖または二本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）、すなわち５’（上流）末端から３'（下流）末端に読まれる、各々、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の高分子である。核酸はセンスまたは相補（アンチセンス）鎖を表し得る。
【００２５】
"自然のまま"とは、天然に生じる（"野生型"）核酸配列をいう。
"外来性"配列とは、外来起源または外来種から生じる配列をいい、あるいは同一起源からの場合にはその起源形態から修飾された配列をいう。例えば、自然のままのプロモーターを用いて、同一または異なる種からの外来性遺伝子の転写を引き起こし得る。
【００２６】
植物の"部分"には、植物のすべての部分または片が含まれ、限定するものではないが、根、若枝、葉、茎、花粉、種子、花、おしべ、めしべ、卵（egg)、胚、花弁、花糸、心皮（carpel）（柱頭、子房、および花柱を含む）、細胞（または複数の細胞）、または前記したもののいずれかの片が含まれる。
【００２７】
"伝播体"には、減数分裂および有糸分裂のすべての産物が含まれ、限定するものではないが、新しい植物を伝播し得る植物の種子および部分が含まれる。例えば、伝播体には、若枝、根または全植物に生長し得る他の植物の部分が含まれる。伝播体には、植物の一の部分を異なる植物（異なる種のものでさえ）の他の部分に移植して生きている生物を創り出す場合の移植片も含まれる。伝播体には、減数分裂生成物をクローニングするまたは互いに一緒にする、あるいは減数分裂生成物を一緒にして胚または受精卵を形成させる（自然またはヒトの介在でもって）ことによって生成する全植物および種子も含まれる。
【００２８】
"単離された"核酸配列は、中で核酸が自然に生じる生物の細胞中で自然に核酸が関連する他の核酸配列、すなわち他の染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡ、から実質的に分離または精製されている。この用語には、汚染する核酸および他の細胞コンポーネントを実質的に除去するように生化学的に精製された核酸が包含される。この用語は、組換え核酸および化学合成核酸も包含される。
【００２９】
本明細書中で用いる"同一性"または"同一"は、タンパク質（または複数のタンパク質）または核酸（または複数の核酸）の間の比較をいう場合は９８％またはそれを超える同一性を意味する。
【００３０】
第１の核酸またはタンパク質配列は、他の核酸（またはその相補鎖）またはタンパク質と最適に整列（比較のウインドウにわたり参照配列の総計２０％未満の適当なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失でもって）した場合に、参照核酸配列またはタンパク質に対して"実質的同一性"または"実質的類似性"を示し、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドまたはアミノ酸位置、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドまたはアミノ酸位置、および最も好ましくは第１の核酸またはタンパク質の全長にわたっての比較ウインドウにわたって少なくとも約６０％の核酸配列等価、なお良好には７０％、好ましくは少なくとも約８０％の等価、より好ましくは少なくとも約８５％の等価、および最も好ましくは少なくとも約９０％の等価が存在する。比較ウインドウを整列するための配列の最適整列は、ローカルホモロジーアルゴリズム（それは、例えば、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）によって、好ましくはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって行い得る。参照核酸は完全長の分子であっても、またはより長い分子の部分であってもよい。あるいは、一方の核酸がストリンジェントな条件下で他方の核酸にハイブリダイズする場合には、２の核酸は実質的同一性を有する。適当なハイブリダイゼーション条件は経験的に決定し得、あるいは例えば、分かっている場合には、プローブの相対的Ｇ＋Ｃ含量およびプローブと標的配列との間のミスマッチ数に基づいて概算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、ハイブリズの温度または塩濃度である（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 第２版, Cold Spring Harbor Harbor Press、1989）。
【００３１】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の機能に影響するようにそれらの配列が整列する場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と"作動可能に連結する"。好ましくは２の配列は単一の隣接する核酸分子の部分であり、より好ましくは近接している。例えば、プロモーターが細胞中の遺伝子の転写を調節または仲介する場合には、該プロモーターは該遺伝子に作動可能に連結している。例えば、転写終結領域（ターミネーター）がターミネーターにおいてまたはその付近で遺伝子を含む転写物を終結するようＲＮＡポリメラーゼを導く場合には、該ターミネーターは該遺伝子に作動可能に連結している。例えば、エンハンサーはそれがその効果を示しているプロモーターに近接していない場合もあるが、一般的には同じ核酸分子に存在する。
【００３２】
"組換え"核酸もしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ分子は、例えば化学合成によって、または遺伝子工学技術による核酸の単離したセグメントの操作によって、２ほかの配列の分離したセグメントの人工的結合によって作製する。核酸操作の技術はよく知られている（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。核酸の化学合成の方法は、例えば、BeaucageおよびCarruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981およびMatteucciら, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981に論じられている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザー上で行うことができる。
【００３３】
遺伝子の"発現"とは、遺伝子が転写されて対応するｍＲＮＡを生成し、ついでこのｍＲＮＡが翻訳されて対応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生成することをいう。遺伝子発現は、プロモーターのごとき５'調節エレメントを含む調節エレメントによって制御またはモジュレートされる。
【００３４】
"組換えＤＮＡ構築物"、"組換えベクター"、"発現ベクター"または"発現カセット"とは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、自律複製配列、ファージ、またはいずれかの起源由来の、ゲノム組み込みまたは自律複製することができる、１またはそれを超えるＤＮＡ配列が機能的に作動可能な様式で連結しているＤＮＡ分子を含む、線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオチド配列のごときいずれかの因子をいう。
【００３５】
"相補的"とは、塩基対形成による核酸配列の自然の会合をいう。核酸対のうちのいくつかのみが相補的である場合、２の二本鎖分子の間の相補性は部分的になり得る；あるいは、すべての塩基対が相補的である場合、完全である。相補性の度合いは、ハイブリダイゼーションおよび増幅反応の効率および強度に影響する。
【００３６】
"ホモロジー"とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同一性または類似性からみた、各々、核酸またはアミノ酸配列の間の類似性、すなわち配列の類似性または同一性のレベルをいう。ホモロジー、ホモログおよび相同も、異なる核酸またはタンパク質の中での類似の機能特性の概念をいう。相同は、１またはそれを超える以下の方法で本明細書に開示したまたは適当なデータベース（ＮＣＢＩまたはほかのような）に見出される遺伝子のコード配列を用いることによって決定し得る。タンパク質配列については、配列はアルゴリズムを用いて比較すべきである（例えば、"同一性"および"実質的同一性"のセクションをご参照）。ヌクレオチド配列については、１のＤＮＡ分子の配列をほぼ同じ方法で知られているまたは推定ホモログの配列に比較することができる。ホモログは、分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子）のいずれかの実質的な（２５ヌクレオチドまたはアミノ酸、より好ましくは５０ヌクレオチドまたはアミノ酸、より好ましくは１００ヌクレオチドまたはアミノ酸、または最も好ましくはより短い配列の全長の）領域の間で、少なくとも２０％同一、より好ましくは３０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８８％、より好ましくは９２％、最も好ましくは９５％同一である。
【００３７】
あるいは、２の配列または１もしくは両方の配列の相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし、同様の機能を示す場合、２の配列、またはアミノ酸配列をコードするもしくはコードし得るＤＮＡもしくはＲＮＡ分子は相同またはホモログであるか、または相同配列をコードする。したがって、２のタンパク質配列が相同であるかを決定することができれば、本明細書に記載するコンピュータ訓練を行い、およびタンパク質をコードし得るすべての可能な核酸配列の配列をコードする縮重を作製し、それらがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るかを決定し得るであろう。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば、６.０×塩化ナトリウム／酢酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃、つづいて２.０×ＳＳＣ、５０℃の洗浄は、当業者に知られており、あるいはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２.０×ＳＳＣ、５０℃の低ストリンジェンシーないし約０.２×ＳＳＣ、５０℃の高ストリンジェンシーから選択し得る。また、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増大させ得る。温度および塩濃度は両方とも変化させることができ、あるいは温度または塩濃度のうちのいずれかの変数を変化させつつ他方のものを一定に保持することができる。１の好ましい形態において、本発明に記載するタンパク質をコードする核酸は、非常にストリンジェントな条件、例えば約２.０×ＳＳＣおよび約６５℃にて、１またはそれを超える核酸分子またはその相補体もしくはいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするであろう。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に知られている多くの方法によって検出することができ、これらには限定されるものではないが、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースタグおよび化学ルミネセンスタグが含まれ得る。
【００３８】
"低温ショックタンパク質（または複数のタンパク質）"（Csp(s)またはCSP（s)）は、エスシェリキア・コリのＣｓｐＡタンパク質（配列番号：１）またはバチルス・ズブチリスのＣｓｐＢタンパク質（配列番号：２）に対して４０％を超える同一性を有し、あるいは、低温ショックタンパク質は文献において決定された保存されたドメインを用いることによって見出し得る。例えば、本願明細書中で用いるように、低温ショックタンパク質は、イー・コリのＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスのＣｓｐＢの全長にわたり、イー・コリＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスＣｓｐＢに４０％同一、より好ましくは５０％同一、より好ましくは６０％同一、より好ましくは７０％同一、より好ましくは８０％同一、より好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一である。Ｇｅｎｂａｎｋないしタンパク質の関係を決定し、および／または関連するタンパク質を見出すことができるように設計されたタンパク質データベースのような、幾つかのデータベースが利用可能であり、それによって当業者は新たなまたは既存のタンパク質が低温ショックドメインを含むか否かまたは低温ショックタンパク質であるかを決定することができる。本明細書の定義内に含まれるものは、すべての知られている低温ショックタンパク質であり、限定されるものではないが、エスシェリキア・コリからのＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ＣｓｐＥ、ＣｓｐＦ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＨおよびＣｓｐＩ（米国特許第６,６１０,５３３号）が含まれる。
【００３９】
保存された低温ショックドメインを配列番号：３に示す（[FY]-G-F-I-x(6,7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x-[LIVMFY]）（プロサイトモチーフPS00352；Bucher and Bairoch, (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hofmannら, Nucleic Acids Res.27: 215, 1999）。別法として、低温ショックタンパク質はSprint データベースを用いて見出することができる（関係のあるタンパク質のフィンガープリントデータベース）（Attwoodら, Nucleic Acids Res. 28(1): 225, 2000; Attwoodら, Nucleic Acids Research, 30(1), 印刷中, 2002）。別法として、低温ショックタンパク質はマトリックスベースのデスクリプションまたはPfamを用いて見出すことができる。Pfamは複数の配列アライメントおよび多くの一般的なタンパク質ドメインをカバーする隠れマルコフモデルの大きな収集である（Batemanら, Nucleic Acids Reserch, 28:263, 2000）。この記載では（２００１年１１月；Pfam release 6）、３０７１のファミリーが存在する。低温ショックタンパク質はＰＦ００３１３として含まれる。種系統樹はPfamデータベースにおいて決定された低温ショックタンパク質の分布を示している。
【００４０】
本明細書中で用いる"低温ショックタンパク質"には、限定されるものではないが、National Center for Biotechnology Informationで見出すことができる"Blink"(Blast Link）機能を用いるデータベースの、クエリー配列として低温ショックタンパク質を用いたサーチで見出されるいずれのタンパク質も含まれる。"Blink"は同様の配列を用いてタンパク質を見出すために用いる高速サーチ関数である。"低温ショックタンパク質"または"低温ショックドメイン"のこの定義は、前記に用いたものに加わるものであり、該定義を置き換えるものではない。低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質には、限定するものではないが、公共および個人的なデータベースにおいてすべての現在知られているタンパク質、ならびにBlast Linkで現在（２００１年１１月１日）用いられている標準blastサーチ設定下で"ヒット"する特許請求するタンパク質に十分に類似していることがいままでに発見されているもの（例えば、イー・コリのＣｓｐＡおよびビー・ズブチリスのＣｓｐＢ）が含まれる。このライティングでBlast２を稼働し、Blast Link（"Blink"）はタンパク質−タンパク質blastサーチにデフォルトパラメータを稼働する。このライティングのもののように、本発明者らは、Blinkで使用したデフォルト設定は以下のように考える；"ｎｒ"データベースを用いてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを稼働する、ＣＤサーチが"低複雑度"、予想値を１０、３のワード・サイズ、ギャップコストは；イグジスタンス（existance）１１、および伸長１として選択された複雑度のコンポジションベースの統計学としてＣＤサーチが選択される。表Ｉのリストは、これらの標準的設定を用いたイー・コリのＣｓｐＡについての最初の２００ヒットを示しているが、本発明者らは特許請求の範囲を最初の２００に限定しない。当業者はこれらのかなりストリンジェントな基準下では細菌起源の１６７のタンパク質を見出したが、２８の後生動物および５の植物のタンパク質も見出すであろう。これらのタンパク質には、本発明者らにより本発明において機能すると予想される、ＣｓｐＡに対してその相同性を行ったように、広い範囲のタンパク質が含まれる。これは決して全包含リストではなく、他のタンパク質も本発明において機能することが予想される。
【００４１】
表２０．幾つかの低温ショックタンパク質およびイー・コリＣｓｐＡに対する類似性によって見出された低温ショックドメインを含む幾つかのタンパク質
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ配列番号および名称を示す：タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、ｃＤＮＡ、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列を用いる比較において、最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
【００４２】
【表１−１】
【００４３】
【表１−２】
【００４４】
【表１−３】
【００４５】
【表１−４】
【００４６】
【表１−５】
【００４７】
バチルス・ズブチリスのＣｓｐＢは、低温ショックに応答して蓄積するタンパク質である（Willimskyら, Journal of Bacteriology 174: 6326 (1992))。それはイー・コリからのＣｓｐＡに対して相同性を有し（表１を参照されたい）、一本鎖核酸結合ドメインを含む（Lopezら, The Journal of Biological Chemistry 276: 15511 (2001)）。ＮＣＢＩにおける同じベーシックＢｌａｓｔサーチ（Ｂｌｉｎｋ）を用いて、以下のタンパク質が"ヒット"として指定された。本明細書に示すヒットの数は２００に限定されるが、多くの他のタンパク質が本発明で機能的であると予想される。
【００４８】
表２１．幾つかの低温ショックタンパク質およびビー・ズブチリスＣｓｐＢを用いたサーチで見出された低温ショックドメインを含むタンパク質
このリストはNational Center for Biotechnology Informationにおいて標準Blast Link設定を用いてコンパイルした。各タンパク質のＧｅｎｂａｎｋ配列番号および名称を示す：タンパク質を命名する方法に起因して、幾つかのタンパク質および配列は、タンパク質、ｃＤＮＡ、アレルほかのように幾つかのエントリーを有するであろう。Ｇｅｎｂａｎｋ配列番号は、各エントリーの特定の識別名と考えることができる。エントリーは、クエリー配列に対する最高から最低のアイデンティティーの大体の順序で存在する。
【００４９】
【表２−１】
【００５０】
【表２−２】
【００５１】
【表２−３】
【００５２】
【表２−４】
【００５３】
【表２−５】
【００５４】
【表２−６】
【００５５】
ＣＳＰは、温度が低下するかまたは他のストレスが加えられた場合に、量において増加し得るまたは増加しないタンパク質の群である。事実、低温ショックタンパク質に関して最もよく研究された生物、イー・コリにおいては、幾つかの低温ショックタンパク質が構成的に発現し、他のタンパク質は低温によって誘導され、いまだ他のものは特定のストレスおよび／または成長条件またはステージに特異的のようである。この概説はYamanakaら, Molecular Microbiology, 27: 247(1998)である。この概説において、Yamanakaおよび共同研究者は、イー・コリにおいて９の低温ショックタンパク質（ＣｓｐＡないしＣｓｐＩ）がどのように発現されるかを詳述している。ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢおよびＣｓｐＧは低温誘導性である。ＣｓｐＤは細胞周期の定常期および飢餓の間に誘導される。ＣｓｐＣおよびＥは細胞分割に関係付けられている。
【００５６】
ＣｓｐＡはエスシェリキア・コリからの主低温ショックタンパク質である（配列番号：１）。ＣｓｐＡは主低温ショックタンパク質７.４とも呼ばれる。ＣｓｐＡは低温ショックに応答して高度に誘導される（Goldsteinら, Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 283 (1990))。より遅い増殖の幾つかの条件において、ＲＮＡまたはＤＮＡ二次構造形成に起因してリボソームが鈍化され、これは、その本来の生物中のＣＳＰの増大した合成についてのシグナルとして作用し得る。ＣＳＰは、イン・ビトロ(in vitro)条件下でｓｓＤＮＡおよびＲＮＡに結合する（Phadtareら, Molecular Microbiology 33: 1004 (1999))。ＣＳＰは翻訳の間に比較的非特異的な様式でＲＮＡに結合し、二次構造形成を妨害し、ＲＮＡを安定化させる（この機能はＲＮＡシャペロンといわれることがある）と考えられている。ついで、リボソームが簡単にＣＳＰに取って代わり、線状ＲＮＡテンプレート上で翻訳を開始する。本発明者らは、これらのタンパク質の一本鎖核酸結合機能を含み得ると考え、この機能は、例えば原核生物低温ショックタンパク質、真核生物Ｙ−ボックス含有遺伝子、幾つかのグリシンに富むタンパク質（ＧＲＰ）、および低温ショックドメインを含む他のタンパク質を包含する、いずれかの低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質から生じ得る。これらのタンパク質には、限定されるものではないが、図４、Trends in Biochemical Science, 23(8):289 (1998)（出典明示して本明細書の一部とみなす）に示されるものが含まれる。この図は、これらのタンパク質間の進化の関係を明らかに示している。これらのタンパク質の起源は、現代の細菌および真核生物の分岐よりも先のようであり、これらのタンパク質は単細胞進化の出現時、３５億年前に存在していたと仮定されている。本発明者らは、前記に引用した図に示すように、例として２のタンパク質を選択して植物に形質転換した。これらのタンパク質はそれらの多くの真核生物相対物からよりも互いにより大きく分岐している。本発明者らは、これらのタンパク質の異なる場所での発現は生物的および非生物的ストレスに対する耐性を改善し得ると予想し、それは、限定されるものではないが、低温、渇水、塩ストレス、熱、低温ショック後の生存、菌類感染、ウイルス感染、微生物感染、および低温発芽を含み得る種々のストレスの多い条件下での植物の生長、活力、収量および健康を包含し得る。
【００５７】
ストレス下での植物の増大した生長速度のもう１の可能な説明は、ＣＳＰの発現によって提供される病原菌関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の顕在化とし得る。このモデルにおいては、植物がストレス適用に先立ってそのストレスに対して"準備する"ように、幾分全身獲得抵抗性（生物的ストレスに対してはほとんどＳＡＲのように作動する）のような植物応答を顕在化するＰＡＭＰを発揮する。ＣＳＰが存在することが、植物がシグナル伝達しなければならないが植物に作動するこのモデルについては、このメカニズムはＣＳＰを結合する植物受容体を介して最近提供されたものかもしれない（Felixら, Journal of Biological Chemistry, 278(8): 6201-8 (2003)）。このメカニズムは、ＰＡＭＰ−型応答を顕在化する受容体結合をいずれかの遺伝子が本発明において機能するであろうことを意味するであろう。ＰＡＭＰ−型応答の顕在化は、一般的に生物的ストレスについて研究されており、因子の外因的な投与を介して顕在化する場合がある。本明細書において、本発明者らは、ＣＳＰトランス遺伝子から生成するＣＳＰに対するＰＡＭＰ−型応答を顕在化し得た。トランスジーンは、パーティクルガンまたはアグロバクテリウム媒介形質転換を通して、組換えＤＮＡ構築物の一部分として植物細胞に形質転換した。ついで、これは、植物における全身獲得型の応答を創製し得、ついで、非生物的ストレスに対する抵抗性を増大し得た。この応答は、限定するものではないが、トウモロコシ、ダイズ、ムギ、イネ、アラビドプシス（Arabidopsis）、キャノーラおよびワタを含む単子葉植物および双子葉植物の両方において作動し得た。前記ＰＡＭＰ法がＣＳＰに対して活動の様式である場合、ＣＳＰは生物的ストレス保護ならびに非生物的ストレス保護を提供すると予想し得る。これらのメカニズムは限定することを意味するものではなく、１または両方または無数の他のものが現れた表現型に含まれ得る。
【００５８】
バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringensis）からのＣｓｐ様タンパク質であるＭＦ２は、植物におけるウイルス感染に対して何らかの保護を与えると評判となっている。米国特許第６,５２８,４８０号は、タンパク質を含有する抽出物で植物の葉を擦ることおよび植物をウイルスに感染させることを介する生物的ストレスに対するこの耐性を示している。それらは、その中で作製していないが、トランスジェニック植物を黙考している。
【００５９】
"同種の非形質転換植物"とは、形質転換植物と同種のすべての植物を含むことを意味する。１の形態において、形質転換植物は、形質転換植物と同じ種および株のものである。もう１の形態において、植物は、形質転換植物と可能な限り同一である。
【００６０】
"低温ショックドメイン"（ＣＳＤ）は、低温ショックタンパク質と相同であるタンパク質配列である。本発明の目的につき、低温ショックドメインを含有するタンパク質は"低温ショックタンパク質"である。イー・コリＣｓｐＡまたはビー・ズブチリスＣｓｐＢおよび低温ショックドメインを含有するタンパク質の低温ショックドメインの間には４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％を超えるアミノ酸同一性が見られる（Wistow, Nature, 344:823 (1990)；Yamanakaら, Mol. Micro., 27: 247, 詳細にはYamanaka参考文献中の図１Ｂを参照されたい；Graumannら, TIBS 23: 286）。
【００６１】
本明細書中で用いる"酵母"は、規則正しくはサッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）をいうが、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）および他の種（例えば、ピキア（Pichia）属からのもの）も含み得る。"トウモロコシ"とはジア・メイズ（Zea mays）および、それと繁殖し得るすべての種および品種をいう。"コムギ"とは限定するものではないが、春、冬およびすべての環境適応性のムギ品種が含まれる。"コムギ"には限定するものではないが、デュラムコムギ（Triticum durum)、スペルトコムギ（Triticum spelta)、エンマーコムギ（Triticum dicoccum）およびヒトツブコムギ（Triticum monococcum）を含むいずれかのほかのコムギ種が含まれる。"コムギ"には前記したコムギ種のいずれかと繁殖し得るいずれの種のもの、該交雑の子孫（ライムギ、コムギおよびライムギの雑種を含む）も含まれる。"ダイズ"とは、グリシン・マックス（Glycine max）またはグリシン・ソジャ（Glycine soja）およびそれらと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"イネ"とはオリザ・サティバ（Oryza sativa）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。”オオムギ”とはホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"エンバク"とはアベナ・サティバ（Avena sativa）およびそれと繁殖し得るいずれの種または品種をもいう。"キャノーラ"とは遺伝的に改変されたナタネ植物、アブラナ科植物（Brassica napus L.）およびターニップ・レイプ（B. campestris L）によって生産される種子、油および粉に対して最近与えられた新造名であり、本明細書中においてキャノーラにはすべてのナタネ植物およびそれと繁殖し得る生物が含まれる。本明細書中で用いるイー・コリおよびエスシェリキア・コリには、エスシェリキア・コリ種およびこの生物のすべての菌株；例えば、イー・コリＫ１２が含まれる。本明細書中で用いるイー・コリおよびエスシェリキア・コリには１がＦ＋またはＨｆｔ株で、他がそれでない場合にいずれかのイー・コリと接合し得るいずれの生物をも含み得る。ビー・ズブチリスおよびバチルス・ズブチリスとは、バチルス属、ズブチリス種のすべての生物をいう。本明細書中で用いるアグロバクテリウム・ツメファシエンスには、この種のすべての菌株および型が含まれる。"ターフグラス"には、芝生を生成するためにいままでに植えられたまたは植えることができたすべてのシバの種および株が含まれ、ターフには限定されるものではないが；ゲーム（すなわち、フットボール、野球またはサッカー）を行うフィールドおよびゴルフコースのすべてのエリア（すなわち、ティー、フェアウェイ、グリーン、ラフほか）である芝生が含まれる。"ワタ"とはゴシピウム属のすべての植物およびそれと繁殖し得るすべての植物をいう。
【００６２】
"熱耐性"とは、高温または暖かい温度が同種の植物の生長、活力、収量、サイズに有害に作用する条件下で生長する植物の能力の尺度を意味する。熱耐性植物は、同種の非熱耐性植物よりも熱ストレスの条件下でより良好に生長するであろう。
【００６３】
"塩耐性"とは、浸透ストレス下、または水および土壌中の塩またはイオンによって生じるストレス下で生長するある植物の能力をいう。例えば、液体を潅漑した場合または同種のほかの植物の生長に有害な影響を与える水およびイオンの混合物を含有する培地に植えた場合に、同種および／または同品種の植物と比較して増大した生長速度を有する植物は、塩耐性であるというであろう。ある形質転換植物は、同種および同株の非形質転換植物よりもこれらの型の条件に対してより大きな耐性を有する。
【００６４】
本明細書中で用いるすべての数値は"約"なる語によって修飾されなければならず、約とは１０パーセントまでいずれかの向きで変化し得、なお同じ意味を保持している。例えば、１Ｍ溶液は、１.１Ｍ以下であって０.９Ｍを超える型のすべての溶液を含まなければならない。例えば、パーセントも修飾されなければならず、１０％は９％ないし１１％のすべてのパーセントを含むものである。"正確には"なる形容詞によって定義される用語は、"約"なる用語によっては定義されない。
【００６５】
"グリシンに富むタンパク質"とは、低温ショックドメインを含むタンパク質であるかまたはそれと実質的同一性を有する、またはそのホモログである真核生物におけるタンパク質と定義される。
【００６６】
"低温ショック後の生存（率）"とは、その植物の生長ステージにおいてその種の植物が通常出くわす温度未満の温度に置かれた後の、有意な期間に生長を続ける植物の能力と定義される。ある植物が、同種のものでさえが、低温条件下での生長について選択されていることは注意しなければならない。トウモロコシの同系繁殖体Wigor株は低温条件に耐えることができ、合衆国において市販されている大部分の系統よりもその条件に置いた場合に有意により高い生存率を有する。Wigorはポーランドにおいて市販されている。したがって、トランスジェニック植物についての低温耐性は、同じ相対年齢における同株ならびに同種の植物内で比較して、意味のある科学的データを取得しなければならない。その場合、植物は、直ちに、または数日または数週間後にスコアを付けて、ショック後のその生存能力、生長速度およびほかの表現型を判定しなければならない。
【００６７】
"渇水"または"水分が生長を制限するであろう"とは、特に持続した場合に、作物に対して損傷を生じ得るまたはその首尾よい生長を妨害し得る乾燥の期間と定義される。ここでも、同種の異なる植物、および同種の異なる株の植物が、渇水、乾燥および／または水欠乏に対して異なる耐性を有する場合がある。研究室においては、渇水は対照植物よりも９５％以下の水を与え、ついで、活力、生長、サイズ、根の長さ、およびほかの無数の生理学的および物理的測定値における差異を探すことによってシミュレートし得る。渇水は、特に水がその植物の生長を厳格に制限する場合には、ある植物は灌水するがほかの植物は灌水せず、その生長速度を比較することによって圃場においてもシミュレートすることができる。
【００６８】
非生物的ストレス耐性には、限定されるものではないが、増大した収量、生長、バイオマス、健康またはストレスに対する耐性を示す他の測定値が含まれ、該ストレスには、限定されるものではないが、熱ストレス、塩ストレス、低温ストレス（発芽の間の低温ストレスを含む）、水ストレス（限定されるものではないが、渇水ストレスを含む）、窒素ストレス（高および低窒素を含む）が含まれる。
【００６９】
生物的ストレス耐性には、限定されるものではないが、増大した収量、生長、バイオマス、健康またはストレスに対する耐性を示す他の測定値が含まれ、ストレスには菌類感染、最近感染および植物のウイルス感染が含まれる。
【００７０】
本発明の一部分として開示したある種の遺伝子配列は、起源が細菌であり、例えばある種の原核生物低温ショックタンパク質である。非改変細菌遺伝子がトランスジェニック植物細胞においてほとんど発現しない場合があることは当業者に知られている。植物コドンの慣習法は、細菌のごとき単細胞生物よりもヒトおよび他の高等生物のものにより類似している。幾つかのレポートは、植物における組換え遺伝子の発現を修飾する方法を開示している。これらのレポートは、疑われるポリアデニル化またはＡ／Ｔに富むドメインまたはイントロン・スプライシング共通配列を回避する組換え配列を用いて、植物コドン出現頻度表、コドン第三塩基位置のバイアスにおける修飾に基づいて、より効率的である配列を表すコード配列を設計する種々の方法を開示している。合成遺伝子構築物に関するこれらの方法は注目に値するが、本発明者らはBrownら（出典明示してその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５,６８９,０５２号、１９９７年）の方法および／または前記に引用した方法、ならびに他のものに従って低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質の合成遺伝子を作製することを熟考する。かくして、本発明は、所望のタンパク質産物をイン・プランタ（in planta）で発現する合成植物遺伝子を調製する方法を提供する。簡単には、Brownらに従って、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で低頻度でしか利用されていないコドンおよび半低頻度でしか利用されていないコドンの頻度を減少させ、より好ましい単子葉植物コドンで置き換える。単子葉植物における改変ポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの蓄積の増加は、連続する６ヌクレオチドフラグメント中のコード配列を解析し、単子葉植物における最も低頻度の２８４、４８４および６６４の６ｍｅｒの出現の頻度と同様に６ｍｅｒの出現の頻度を改変したことによる好ましいコドンの出現頻度の増大の結果である。さらに、Brownらは、ヌクレオチド配列中のポリアデニル化シグナルおよびイントロン・スプライスサイトの発生を減少する方法とともに低頻度コドンの出現頻度を低下させる方法を適用し、ヌクレオチド配列中の自己相補的配列を除去し、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を維持しつつかかる配列を非−自己相補的ヌクレオチドで置き換え、ついでヌクレオチド配列中の５'−ＣＧ−３'ジヌクレオチド対の出現の頻度を減少させることによる組換え遺伝子の発現の上昇を開示している。これらの工程は、順次行い、所望のポリペプチド中に存在する大部分のアミノ酸について単子葉植物により好ましい単子葉植物コドンの優先的な利用を含むヌクレオチド配列を生じる累積的効果を有する。詳細には、本明細書で言及するすべてのタンパク質は、前記に論じたようにまたは同様の方法を用いて合成遺伝子に作製することが意図され、限定されるものではないが、エスシェリキア・コリＣｓｐＡおよびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢが含まれる。
【００７１】
本明細書中に記載する作業は、低温ショックタンパク質および低温ショックドメインを含むタンパク質のイン・プランタでの発現を活性化する方法を同定し、それは多くの植物ストレスに対する耐性を付与し得、それには限定されるものではないが、感受性植物の核、プラスチドまたは葉緑体ゲノムに取り込んだ後に正規の場所以外で発現する低温、熱、渇水、塩および他のストレス、あるいはストレス関連表現型（低温発芽、低温ストレス後の生存率、および他の非生物的ストレス）が含まれる。米国特許第５,５００,３６５号（特に出典明示して本明細書の一部とみなす）は、合成遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを最適化する植物遺伝子を合成する方法を記載している。この方法は、外来性トランス遺伝子をより"植物様"とし、したがって植物、単子葉植物または双子葉植物によってより翻訳および発現される見込みがあるようにするための、その構造遺伝子配列の修飾に関する。しかしながら、米国特許第５,６８９,０５２号に開示する方法は、好ましくは単子葉植物におけるトランスジーンの高められた発現を提供している。
【００７２】
本発明の核酸構築物を開発することにおいて、構築物の種々のコンポーネントまたはそのフラグメントは、通常は、都合のよいクローニングベクター、例えば細菌宿主、例えばイー・コリ中で複製することができるプラスミドに挿入する。文献に記載されている膨大な数のベクターが存在し、その多くは市販されている。各クローニングの後に、所望の配列のコンポーネントを仕立てるように、所望のインサートを有するクローニングベクターを単離し、制限分解、新たなフラグメントまたはヌクレオチドの挿入、連結、欠失、突然変異導入、レセクションほかのごときさらなる操作に付することができる。構築物が完成されたら、ついでそれは、宿主細胞の形質転換の様式と一致するようにさらに操作するために適当なベクターに移すことができる。
【００７３】
例えば、発現カセット中に低温ショックタンパク質を含む本発明の二本鎖ＤＮＡ分子は、いずれかの適当な方法によって植物のゲノムに挿入し得る。好適な植物形質転換ベクターには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来のもの、ならびにHerrera-Estrellaら(1983）、Bevan(1984)、Kleeら(1985)およびＥＰＯ公報１２０,５１６によって開示されたものが含まれる。アグロバクテリウムのＴｉまたは毛状根誘導（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、別の方法を用いて本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入することができる。かかる方法には限定されるものではないが、例えばリポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取込みを増加させる化学剤、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントを介する遊離ＤＮＡデリバリー、およびウイルスまたは花粉を用いた形質転換が含まれ得る。
【００７４】
エレクトロポレーションを用いて単子葉植物に低温ショックタンパク質または低温ショックドメインを含むタンパク質をコードする遺伝子を導入するのに好適なプラスミド発現ベクターは、以下のものからなり得る：植物中で機能するプロモーター；スプライスサイトを提供してＨｓｐ７０（ＰＣＴ国際公開公報、ＷＯ９３／１９１８９）のごとき遺伝子の発現を促進するイントロン；およびノパリンシンターゼの３'配列（ＮＯＳ ３')のごとき３'ポリアデニル化配列。この発現カセットは、大量のＤＮＡの生成に好適な高コピー複製起点に会合し得る。
【００７５】
植物形質転換に有用なＴｉプラスミドカセットベクターの例はｐＭＯＮ−１７２２７である。このベクターはＰＣＴ国際公開ＷＯ ９２／０４４４９に記載され、グリホセート耐性を付与する酵素をコードする遺伝子（ＣＰ４と命名された）を含み、これは多くの植物の優れた選択マーカー遺伝子である。遺伝子は前記したようにアラビドプシスＥＰＳＰＳ葉緑体トランジット（transit）ペプチド（ＣＴＰ２）に融合し、ＦＭＶプロモーターから発現させる。セドヘプツロース−１,７−ビスホスファターゼ遺伝子またはｃＤＮＡを含有する十分な数の細胞（またはプロトプラスト）を得た場合、該細胞（またはプロトプラスト）を全植物に再生する。再生工程の方法の選択は極めて重要ではないが、マメ科植物（アルファルファ、ダイズ、クローバーほか）、セリ科植物（ニンジン、セロリー、パースニップ）、アブラナ科植物草本（キャベツ、ハツカダイコン、キャノーラ／ナタネほか）、ウリ科植物（メロンおよびキュウリ）、イネ科植物（コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシほか）、ナス科植物（ジャガイモ、タバコ、トマト、コショウ）、ヒマワリのごとき種々のフローラル作物（floral crop）、およびアーモンド、カシュー、ウォールナッツおよびペカンのごとき堅果をぶら下げた木本からの宿主に利用可能である適当なプロトコールを有する。
【００７６】
本発明の実施によって低温ショックタンパク質を発現するように作製し得る植物には、限定されるものではないが、アカシア属植物、アルファルファ、アニス、リンゴ、アプリコット、アーチチョーク、キバナスズシロ、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、セイヨウヤブイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリ、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セルリー、サクラ、コエンドロ、カンキツ属植物、クレメンタイン、コーヒーノキ、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、アメリカトガサワラ、ナス、エンダイブ、キクジシャ、ユーカリノキ、フェンネル、イチジク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、ハネージューメロン、クズイモ、キーウィ、レタス、ニラネギ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュローム、堅果（nut）、エンバク、オクラ、タマネギ、柑橘類植物、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ラッカセイ、セイヨウナシ、コショウ、カキ属の木、マツ、パイナップル、オオバコ、スモモ、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアータマツ、アカチコリー、ハツカダイコン、ラズベリー、イネ、ライムギ、サトウモロコシ、ダイオウマツもしくはダイオウショウ（Southern pine）、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ 、タンジェリン、チャノキ、タバコ、トマト、ターフ、ブドウノキ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、ズッキーニ、またはいずれかのほかの植物が含まれる。
【００７７】
"プロモーター"とは、ＲＮＡポリメラーゼ（および、しばしば他の転写因子）に結合し、下流ＤＮＡ配列の転写を促進するＤＮＡ配列をいう。プロモーターは、他のものと比較して、ある組織においては高められたまたは減じられた発現を提供する場合がある。プロモーターの選択、特に植物が非生物的ストレスを受ける場合に発現を増大するプロモーターを選択することは、本発明において特に有用となり得る。
【００７８】
あるストレス応答が植物に対して同様の効果を有することが当該分野において観察されており、１のものに対する抵抗性は他のものに対する抵抗性を提供し得る。これは、例えば、脱水および低温に対する応答の間に見られる（Shinozakiら, Current Opinions in Plant Biology 3(3):217, 2000）。多くの他の論文は、異なる非生物的ストレス間の一般的な相互関係を示し、１のストレスに対する耐性は幾つかの他の非生物的ストレスのより大きな耐性に通じ得ることを示し得る（Pernasら, FEBS Lett 467(2-3): 206, 2000; Knight, Int Rev Cytol 195: 269, 2000; Didierjeanら, Planta 199: 1, 1996; Jeongら, Mol Cells 12: 185, 2001）。
【００７９】
Ｔ−ＤＮＡ中に含まれる植物発現因子の外側のＤＮＡセグメント中に見出される発現カセットおよび調節因子は、多くのプラスミドＤＮＡバックボーンで共通であり、および、プラスミド維持因子として機能し、これらには限定されるものではないが、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性のaad（Spc/Str）遺伝子、イー・コリ中での維持のための複製起点を提供するｐＢＲ３２２ ori（ori322）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞への接合移入のためのｂｏｍサイトが含まれ、ＤＮＡセグメントはＲＫ２プラスミドからの複製起点を含む０.７５ｋｂのoriＶである。また、植物への形質転換を意図するこれらのプラスミドは、因子を挿入するように機能するためのアグロバクテリウムの内因性ＤＮＡ一体化タンパク質に必要な因子を含む場合がある。これらには、ボーダー（右側（ＲＢ）および左側（ＬＢ）ボーダー）が含まれる。
【００８０】
本明細書中で用いる組換えＤＮＡ技術における研究室の手順は当該技術分野においてよく知られているものであり、普通に利用されている。標準的な技術を、クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡ単離、増幅および精製に使用する。一般的に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応は、製造業者の説明書に従って行う。これらの技術および種々の他の技術は、一般的に、Sambrookら, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laborator, New York (1989)に従って行う。
【００８１】
本願明細書で引用したすべての出版物および公開された特許書類は、各々個別の出版物または特許出願が出典明示して本明細書の一部とみなすと特異的および個別的に示される場合と同じ程度で参照して出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００８２】
以下の実施例を含めて本発明の形態を示す。本発明者によって発見された以下の代表的な技術が本発明の実施において良好に機能することは当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、多くの変化を特定の形態で作成することができ、類似するまたは同様の結果がいまだ得られることは正しく認識しなければならず、したがって、添付する図面および実施例に記載されているまたは示されているすべての事項は説明で、それらに限定する意味ではないと理解されるべきである。
【００８３】
実施例
実施例１
ｐＭＯＮ５７３９６（図１）は、アラビドプシス（Arabidopsis）におけるエスシェリキア・コリＣｓｐＡと同様のタンパク質（配列番号：５６）のアグロバクテリウム媒介形質転換および構成的発現のためのバイナリーベクターである。イー・コリＣｓｐＡ遺伝子をクリーニングするために、２の遺伝子特異的プライマー、ＭＦ１およびＭＦを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）からのＣｓｐＡ配列情報（Genbank M30139, GI: 409136）に基づいて設計した。ＭＦ１の配列は、ＣｓｐＡの翻訳開始部位にアニールし、５'末端にNcoIサイトを導入するAGGTAATACACCATGGCCGGTAA（配列番号：６６）であり、一方ＭＦ２の配列はＣｓｐＡの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT（配列番号：６７）である。ＰＣＲを行って、イー・コリＣｓｐＡを単離した。詳細には、イー・コリＤＨ５α細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、ＭＦ１およびＭＦ２プライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社（Indianapolis, IN）からのＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いてＣｓｐＡ遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした：９４℃、１分、その後に９４℃、１６秒；５５℃、１分および７２℃、１分のサイクルを３０回繰り返す。増幅したＣｓｐＡ ＤＮＡは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターｐＭＯＮ２３４５０（図２）に連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された以下の手順に従って行った（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換した細胞を適当な選択培地にプレートし（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
【００８４】
得られたプラスミドは、制限マッピング（例えば、Griffithsら, An introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp.449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトと同様に、ベクターを上流（５'）のＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターおよび下流（３’）のエピトープタグ（Flag, これはオリゴペプチドDYKDDDK（配列番号：６８）をコードする）によって挟み、したがってこの構築物中のイー・コリＣｓｐＡはＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識され、アラビドプシスにおける形質転換の際にはＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動されるであろう。前記クローニングは、配列番号：５５に類似するタンパク質をコードするプラスミドを生じる。得られたプラスミドはｐＭＯＮ５７３９６という。
【００８５】
実施例２
ｐＭＯＮ５７３９７（図２）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびエスシェリキア・コリＣｓｐＡのようなタンパク質の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ｐＭＯＮ５７３９７を作製するためには、ＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識されたエスシェリキア・コリＣｓｐＡ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＭＯＮ５７３９６を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、FLAGエピトープタグを放出した（FLAGタグはオリゴペプチドDYKDDDK, Sigma, St. Louisをコードする）。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、かつ、製造業者（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリに形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換細胞は適当な選択培地（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。前記クローニングは、配列番号：５７に類似するタンパク質をコードするプラスミドを生じる。
【００８６】
得られたプラスミドは、XhoIおよびSalIサイトが存在しないことを確認する制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1，W.H.Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。この構築物中のイー・コリＣｓｐＡ遺伝子はＣ−末端において標識されておらず、ＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動する。
【００８７】
実施例３
ｐＭＯＮ５７３９８（図４）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：５９）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子をクローニングするためには、２の遺伝子特異的プライマーＭＦ３およびＭＦ４ａを、National Institutes of Health の一部分であるNational Library of Medicineの一部分であるNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）からのＣｓｐＢ配列情報（Genbank U58859, gi:1336655）に基づいて設計した。ＭＦ３の配列は、ＣｓｐＢの翻訳開始部位にアニールし、５'末端にNcoIサイトを導入するAGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG（配列番号：６９）であり、一方ＭＦ４ａの配列はＣｓｐＢの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にEcoRIサイトを導入するTCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT（配列番号：７０）である。ＰＣＲを行って、ビー・ズブチリスＣｓｐＢを単離した。バチルス・ズブチリス細胞はCarolina Biological Supply（Burlington, NC）から得、細胞を溶解し、少量のライゼートを鋳型として用い、ＭＦ３およびＭＦ４ａプライマー、ならびにRoche Molecular Biochemicals社（Indianapolis, IN）からのＴａｑポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いてＣｓｐＢ遺伝子を増幅した。温度サイクル条件は以下のとおりとした：９４℃、１分、その後に９４℃、１６秒；５５℃、１分および７２℃、１分のサイクルを３０回繰り返す。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡは、ゲル電気泳動によって精製し、NcoIおよびEcoRIで消化し、予めNcoIおよびEcoRIでの消化によって線状化しておいたバイナリーベクターｐＭＯＮ２３４５０（図５）に連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、および製造業者によって推奨された手順に従って行った（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換し（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、 Cold Spring Harbor Press, 1989）、後日、コロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全インサート配列を決定した。
【００８８】
得られたプラスミドは、制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版 pp.449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトを上流（５'）のＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターおよび下流（３’）のエピトープタグ（Flag、これはオリゴペプチドDYKDDDK（SIGMA, St Louis）をコードする）によって挟んだ場合、この構築物中のビー・ズブチリスＣｓｐＢ様遺伝子はＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識され、アラビドプシスにおける形質転換の際にはＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動される。このクローニングは、該プラスミドにインサートされた配列番号：５９に類似するタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを生じる。
【００８９】
実施例４
ｐＭＯＮ５７３９９（図６）は、アラビドプシスにおけるアグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：６１）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ｐＭＯＮ５７３９９を作製するために、ＦｌａｇエピトープタグによってＣ−末端で標識されたバチルス・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子を含有するバイナリーベクターｐＭＯＮ５７３９８（前記実施例を参照されたい）を制限酵素XhoIおよびSalIで消化してベクター中のこれらのサイトを切断し、ＦＬＡＧエピトープタグを放出した（ＦＬＡＧタグはオリゴペプチドＤＹＫＤＤＤＫ, SIGMA, St Louisをコードする）。ついで、線状化したプラスミドを精製し、再連結した。連結はＴ４リガーゼを用い、かつ、製造業者（BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）によって推奨されている手法に従って行った。連結混合物はプラスミド増殖のためにイー・コリ細胞に形質転換した（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）。形質転換細胞は適当な選択培地（Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, 1989）にプレートし、数時間または数日後にコロニーを評点付けした。プラスミドを個々のコロニーから調製し、完全なインサート配列を決定した。このクローニングは、該プラスミドに挿入された配列番号：６１に類似するタンパク質をコードする配列を有するプラスミドを生じる。
【００９０】
得られたプラスミドは、XhoIおよびSalIサイトが存在しないことを確認する制限マッピング（例えば、Griffithsら, An Introduction to Genetic Analysis, 第６版, pp 449-451, ISBN 0-7167-2604-1，W. H. Freeman and Co., New York）および配列決定によっても確認した。ベクター中の選択したNcoI−EcoRIクローニングサイトを上流（５’）Ｎ−末端でＣａＭＶ ｅ３５プロモーターによって挟んだ場合、この構築物中のビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子はＣ−末端で非標識化され、アラビドプシスにおける形質転換の際にＣａＭＶ ｅ３５Ｓプロモーターによって転写的に駆動された。該プラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。
【００９１】
実施例５
アラビドプシス植物は、多くの利用可能な方法のうちのいずれか１によって形質転換し得る。例えば、アラビドプシス植物は、真空浸潤によるイン・プランタ形質転換法を用いて形質転換し得る（Bechtoldら, In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1199 (1993)）。この例は、どのようにしてアラビドプシス植物を形質転換し得るかを説明する。
【００９２】
ストック植物材料および生長条件
土壌を入れた２.５インチのポットを準備し、それを土壌が締まりすぎて充填されないようかつメッシュが土壌表面と接触することを確かめつつ、メッシュスクリーンでカバーする（これは、発芽する幼植物がメッシュを通して生長し得ることを保証する）。播種し、発芽ドームでカバーする。種子を３−４日春化処理する。１６時間明所／８時間暗所、２０−２２℃、７０％湿度の条件下で植物を生長させる。一週間に２回水を与え、１／２×（製造業者によって推奨されている強度の半分）のPeters 20-20-20肥料（Hummert International, Earth City, MOからのもの））を下方から与えた。微量元素（Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements）（製造業者によって推奨されている全部の強度で）を一週おきに添加した。約１−２週間後に、ドームを除去し、ポット当たり１または２の植物までポットを間引きした。発達した場合には第一の薹（primary bolt）を摘み取って、第２の薹形成をより促進する。５−７日内に、植物は浸潤する準備ができるであろう。
【００９３】
アグロバクテリウムの調製（小スケールおよび大スケール培養）；
アグロバクテリウムＡＢＩ株を、１００ｍｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（ＳＳＣＫと表示する）を含有するＬＢプレートにストリークする。浸潤の２日前に、アグロバクテリウムのループを１０ｍｌのＬＢ／ＳＳＣＫを含有する試験管に入れ、シェーカーに設置し、暗所下、２８℃にて一晩増殖させる。翌日、アグロバクテリウムを４００ｍｌのＹＥＰ／ＳＳＣＫ中に１：５０で希釈し、シェーカーに設置し、２８℃にて１６−２０時間増殖させる。（注記：本発明者らは、ＬＢを最初の一晩培養に使用し、ＹＥＰを大スケールの一晩培養に使用した場合、形質転換率が顕著に良好であることを見出した）。
【００９４】
浸潤
５００ｍｌの遠心ボトルに注入し、ついで３５００ｒｐｍにて２０−２５分間遠心することによってアグロバクテリウム細胞を集める。上清を捨てる。ペレットを乾燥し、ついで０.４４ｎＭのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）（ＤＭＳＯ中の１.０ｍｇ／Ｌストック液をリットル当たり１０μｌ）およびLehle Seeds社（Round Rock, TX）からの０.０２％のVac-In-Stuffを含む２５ｍｌの浸潤培地（０.５％のＭＳベース塩、１％のGamborg’s Ｂ−５ビタミン、５％のスクロース、０.５ｇ／ＬのＭＥＳ、ｐＨ５.７）に再懸濁する。新たにＢＡＰおよびSilwet L-77を浸潤の日に添加する。２００μｌのSilwet L-77および２０μｌのＢＡＰ（０.５ｍｇ／Ｌのストック液）を添加する。残余部（blank）として浸潤培地を用いて、１：１０希釈のアグロバクテリウム懸濁液のＯＤ６００を測る。真空浸潤するための４００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液／浸潤培地、ＯＤ６００＝０.６に必要な体積を計算する。
【００９５】
【数１】
【００９６】
再懸濁した培養液を真空デシケーター内側のRubbermaid容器に入れる。ロゼットを含む全体の植物はカバーされるが土壌があまり冠水しないように、浸潤すべき植物を含むポットを逆さにする。浸潤前は、少なくとも３０分間、植物を水に浸す（これは、土壌がアグロバクテリウム懸濁液を吸収することを保つ）。
【００９７】
〜２３−２７インチＨｇの真空を１０分間引く。真空を迅速に開放する。簡単には、ポットの水を切り、それをダイアパーに並べるトレイの傍らに置き、トレイをドームでカバーして湿度を維持し、生長チャンバーに戻す。翌日、ポットのカバーを外し、それを直立に設置し、ダイアパーを除去する。〜５日に植物に水は与えない。５日が終わった後に、植物に水を与え、前と同じ条件下で生長を続けさせる（浸潤した葉は変性し得るが、植物は花成を終了するまで生存する）。
【００９８】
種子の収穫および滅菌
ほぼ浸潤２週間後に、Lehle Aracons（Lehle Seeds, Round Rock, TX）を用いることによって、植物を個別に円錐形にする。すべての種子が成熟しおよび種子をつけた後（浸潤後〜４週間）、水から植物を取り出して種子を乾燥する。ほぼ２週間後に、円錐形の下方の枝を切り取ることによって種子を収穫する。篩を用いることによって種子を浄化して、長角果および枝材料を捕獲し、種子がそれを通ることを許容する。種子をエンベロープまたは１５ｍｌの三角試験管に入れる。
【００９９】
滅菌する前に所望の量の種子を１５ｍｌの三角試験管に移す。三角試験管の蓋を緩め、それを、４００ｍｌの漂白剤Clorox（Clorox Company, Oakland, CA）および４ｍｌの塩酸を含有するビーカーを含む真空デシケーターの傍らに置く（ＨＣｌはドラフトチャンバー中でCloroxに添加する）。デシケーターを密閉すると同時に真空を引き、〜１６時間、吸引部を閉じる（すなわち、デシケーターはなお真空下にあるが、真空はもはや直接的に引かれていない）。滅菌後、真空を開放し、種子を含む試験管を滅菌したフードに入れる（ガスをなお放出し得るようにキャップは緩めたままにしておく）。
【０１００】
２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを入れた４.３ｇ／ＬのＭＳベース塩、２.０ｇ／ＬのGamborg's B-5（５００×）、１０ｇ／Ｌのスクロース、０.５ｇ／ＬのＭＥＳ、および８ｇ／ＬのPhytagar（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）を含有する選択プレートに種子をプレートする（"播く"）。選択レベルは、カナマイシン６０ｍｇ／Ｌ、グリホセート６０μＭまたはビアラフォス１０ｍｇ／Ｌのいずれかであろう。
【０１０１】
非常に少量の種子を最初にプレートし、コンタミネーションをチェックし得る。コンタミネーションが存在する場合、種子をさらに〜４時間再滅菌し、コンタミネーションについて再度チェックする。第２の滅菌は通常必要でないが、種子が菌類汚染物を保有している場合があり、繰り返して滅菌する必要がある（滅菌時間は、一般的には１６時間より短い。２４時間滅菌時間から顕著な発芽率の低下が始まるからである）。プレートをパラフィルムで密閉し、〜２−４日低温室に置いて春化処理する。種子を春化処理した後に、低温白球根（cool white bulb）を入れたパーシバルに入れる。
【０１０２】
土壌への移行
〜２６℃および１６／８の明暗サイクルにて５−１０日後に、形質転換体は緑色植物体として見えるであろう。さらに１−２週間後に、植物は少なくとも１セットの本葉を有するであろう。植物を土壌に移し、発芽ドームでカバーし、正常なアラビドプシス生長条件を有する生長チャンバーに移動する。新たな生長が明らかになるまでカバーを維持する（通常５−７日）。
【０１０３】
実施例６
野生型非トランスジェニックおよびＣｓｐＡまたはＣｓｐＢトランスジェニック・アラビドプシス植物の生長を比較するために、滅菌ペトリ皿で垂直生長（verticle growth）させた：
野生型またはトランスジェニック種子は以下の方法を用いて液体滅菌した：
・７０％エタノール中での５分インキュベートにつづくボルテックス混合
・３０％Chlorox（６.１５％次亜塩素酸ナトリウム）＋０.０１％Triton X-100中での５分インキュベートにつづくボルテックス混合
・５の連続滅菌水洗浄
【０１０４】
種子は、各々以下のもの：多量養素、微量養素およびビタミンを含み、水酸化アンモニウムでｐＨ５.８に調節し、土壌支持用の１％のPhytagel（Sigma #P8169）を含有する０.５×Murashige and Skoog培地、からなる４０ｍｌの寒天培地を含む１００×１５ｍｍ正方形皿（Becton Diclinson-Falcon #35-1112）にプレートした。
【０１０５】
１０の野生型アラビドプシス種子を、端部からほぼ１ｃｍで等しく離してペトリ皿の１／２の全域にプレートした。これは無菌チップを用いるGilson P-200 Pipettemanで行った。１０のＣｓｐＡまたはＣｓｐＢトランスジェニック・アラビドプシス種子を等しく離して、ペトリ皿の他の１／２の全域に同様にプレートした。プレートにペンで印を付けて、どちらの半分がトランスジェニック種子を含むかを示した。
【０１０６】
ペトリ皿を暗所下、４℃に３日間置いて種子を等級別に分け、ついで２４時間連続光（１２０マイクロアインシュタイン／ｍ２）下、８℃にて６週間、Percivalインキュベーター（モデルAR-36L）に入れた。このインキュベーションの最後に、ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢのロゼットのサイズを野生型のものと比較し、より大きいことを見出した。これは図１６に見ることができる。これは、前記アッセイを用いた第１、第２および最後に描いたプレートにおいて見ることができる。図１６において、第３の写真（ＣｓｐＢ＋Ｆｌａｇ、ｐＭＯＮ５７３９９）は、植物を以下に記載するのと同様の低温ショックアッセイを通したプレートを示している。
【０１０７】
トランスジェニック・アラビドプシス・タリアーナ（Arabidopsis thaliana）種子の低温ショック幼植物活力評価：水平プレートアッセイ
導入：
これは、水平ペトリ皿中の寒天培地上で通常の温度にて発芽させて冷やすのにシフトする際に生長し続けたトランスジェニック・アラビドプシス種子の能力を評価する手順である。要するに、対照植物からの種子およびテスタートランスジェニック植物からの種子を滅菌し、等級別に分類し、ペトリ皿のいずれかの半分に６×８のグリッドでプレートした。プレートは水平位置、通常温度にて、１週間インキュベートし、ついで、プレートの水平位置を維持しつつ、さらに２週間冷蔵温度にシフトした。幼植物の天蓋領域をデジタル写真によって記録し、画像ソフトウェアを用いて定量化した。テスター幼植物の全天蓋領域の対照幼植物のそれとの比率は、トランスジェニックテスター系統において関心のある種々の遺伝子の低温耐性潜在性を比較することができる。
【０１０８】
材料：以下のものは、標準的なバイオテクノロジー研究室において入手可能な醜状の主要な装備（オートクレーブ、バランス、層状流動フードほか）であると仮定する。
【０１０９】
−アラビドプシス種子：このプロトコールをArabidopsis thaliana cv. Columbiaで用いたが、他のアラビドプシス種にも同様に適当のはずである。
−ペトリ皿：Falcon #35-1112（１００ｍｍ×深さ１５ｍｍ）
−培地：Sigma M5519＝Murashige ＆ Skoog Basal Media
−Phytagel(Sigma ＃P-8169)
−寒天培地をオートクレーブ処理し、そこからプレートに注ぐ１リットルのガラスボトル。
【０１１０】
本発明者らは、１のオレンジ色スクリューキャップを有するコーニングガラス・ボトルを用いる。
−磁気スターラーおよび磁気攪拌バー
−５０ｍｌのプラスチック製ピペットを使用し得る電気ピペッター
−種子をプレートするためのプラスチック製拡大レンズを有する小さな蛍光ボックス
−P1000 Gilsonピペッター（または相等物）および無菌チップ
−P200 Gilsonピペッター（または相等物）および無菌チップ
−７０％エタノール、無菌
−３０％Chlorox漂白剤＋０.１％ Tween 20
−滅菌ろ過した脱イオン水
−無菌の小型遠心チューブおよび試験管ラック
−好ましくは暗所の、４℃低温室、冷温ボックスまたは冷蔵庫
−〜１５０μＥ／ｍ２／秒の光源を含む、２２℃のPercival植物生長チャンバーまたは相等物
−〜１５０μＥ／ｍ２／秒の光源を含む、８℃のPercival植物生長チャンバー
−半透過性外科テープ３M Microporeテープ（３Ｍ #1530-1）
−黒色（Sharpie）マーカー
−トラップを有する真空吸引機
−グラシン・バランスウェイト紙（VWR #12578−165）
−計算機
−ノート
−IBM コンパチブル・コンピュータ
−Image-Pro Plusソフトウェア, version 4.1.0.0
−Microsoft Excelソフトウェア
【０１１１】
プロトコール：
１−保存バイアル用または無菌小型遠心チューブのエンベロープ用の小分けした種子
２−種子の同一性を保持するためのシャーピエで試験管を標識する
３−以下の溶液で順次洗浄し、ついで以下に示す時間待機することによる、試験管中の種子の表面滅菌。洗浄の間に少なくとも２回試験管をひっくり返して種子上の溶液の良好な表面接触を確実にする。種子は試験管の底部に沈み、柔軟なペレットを作る：
ａ．３ないし５分間の、７０％エタノールでの滅菌
ｂ．３ないし５分間の、３０％Chlorox漂白剤＋０.１％ Tween 20
ｃ．３０秒間の滅菌ろ過した脱イオン水
ｄ．ｃ工程をさらに４回繰り返し、最後の回に〜０.５ｍｌの滅菌水を種子ペレットの上に残す。
【０１１２】
１−小型遠心チューブを暗所下、４℃にて３日間置いて、プレートした際のより均一な発芽のために種子を等級別に分類する。
［別法として、種子は寒天培地ペトリ皿に直接的に置いてテープを貼って密閉し、ペトリ皿を、以下に示す８℃インキュベーションに先だって、暗所下、４℃にて３日間置くこともできる］
【０１１３】
２−ガラスボトル中に１リットルアリコットの０.５×Murashige and Skoog培地を調製し、水酸化アンモニウムでｐＨを５.８に調節し、ついで１０ｇのPhytagelを添加することによってプレートを作成する。ｐＨを調節する場合およびPhytagel中で均一に混合するためには磁気スターラーを使用し、ついで液体設定（徐々の排出）で４５分間、オートクレーブ処理する。
３−５０ｍｌ無菌ピペットを付けた電動ピペッターを用いてプレートに層状流動フードで注いで各プレートに４０ｍｌの培地を配達し、直ちにプレートを蓋でカバーする。
【０１１４】
４−送風機を切って、少なくとも２時間、層状流動フード中でプレートを冷やし、日付をつけたプラスチックバッグ中、４℃にて保存する。
５−プレートを標識し、種子をプレートする：
【０１１５】
１−半透過ミクロ細孔テープを用いてプレートの全四隅にテープを貼り、日付を標識し、プレートを、２２℃、〜１００μＥ／ｍ２秒の１６時間の日照サイクルに設定したPercivalインキュベーターに入れた。デジタルカメラで各プレートの写真を撮り、データをコンパクトディスクに保存する。
【０１１６】
２−プレートを、８℃、〜１００μＥ／ｍ２秒の２４時間の日照サイクルに設定したPercivalインキュベーターに移す。１層の厚さのみでプレートを水平位置に置き、さらに３週間までインキュベートする。デジタルカメラで各プレートを撮影し、データをコンパクトディスクに保存する。
【０１１７】
３−テスター生殖質が対照と比較してどのように進行しているかを見るために２または３日ごとにプレートを観察し、生殖質の一般的な性能の代表的なものである時点でデジタル撮影する。これには２週間未満（せいぜい３週間）の８℃でのインキュベーションがかかるにちがいない。相異を示すのにより長時間をとる生殖質は、デジタル写真を撮る時点での過密を回避するために、より低い種子密度でプレートする必要がある。
【０１１８】
４−デジタルカメラ写真およびImage-Pro Plusソフトウェアを用いてロゼット天蓋面積（rosette canopy area）を測定する。対照およびテスター集団について平均幼植物天蓋を計算し、発芽していない種子を分析から除去する。対照幼植物およびテスター幼植物について平均幼植物天蓋面積間の比を計算し、対照およびテスター幼植物セットについて標準偏差および標準誤差を計算する。テスター幼植物と対照幼植物との間に統計学的な差異が存在するかを確認する。結果をノートに記録する。
【０１１９】
５−トランスジェニック植物材料用の適当な廃棄容器（透明プラスチック廃棄バッグと灰色のビン）にプレートおよび幼植物を廃棄する。
【０１２０】
実施例７
ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢ遺伝子のＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコール（Invitrogen, Carlsbad, CA）に従ってベクターｐＣＲ−ＴＯＰＯ２.１に連結した。ｐＣＲ−ＴＯＰＯ２.１誘導体のNcoI／EcoRIフラグメントをｐＭＯＮ４８４２１にサブクローニングし（図７）、同じ制限酵素によって線状化した。３５Ｓプロモーター、Ｃｓｐ遺伝子およびｅ９ターミネーターを包含するｐＭＯＮ４８４２１誘導体のNotIフラグメントを、NotIサイトでｐＭＯＮ４２９１６にサブクローニングして（図１７）、各々ＣｓｐＡおよびＣｓｐＢ遺伝子を含むｐＭＯＮ５６６０９（図８）およびｐＭＯＮ５６６１０（図９）を作製した。該プラスミドを、公知の方法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。ｐＭＯＮ５６６０９は配列番号：７に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。ｐＭＯＮ５６６１０は配列番号：９に類似するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むと考えられる。
【０１２１】
実施例８
アグロバクテリウムの調製：
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５株を、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌおよびハイグロマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレート（ＬＢ／ＫＨと表示する）上にストリークする。共培養の２日前に、アグロバクテリウムのループを１０ｍｌのＬＢ／ＫＨを含む試験管に移し、暗所下、２８℃にて２４時間、シェーカー上でインキュベートする。この培養物を２０ｍｌのＬＢ／ＫＨ中で１：１００に希釈し、暗所下、２８℃にて一晩、シェーカー上でインキュベートする。翌日に、この培養物の１：２希釈物１ｍｌをキュベットに採り、残部としてＬＢ／ＫＨを用いてＯＤ６００を採った。共培養のＯ.Ｄ. １.０のアグロバクテリウム懸濁液５ｍｌに必要な体積を計算する。
【０１２２】
【数２】
【０１２３】
４０ｍｌ遠心チューブに必要な体積のアグロバクテリウム培養物を採り、７０００ｒｐｍにて７分間遠心する。上清を破棄し、ペレットを乾燥する。ペレットを、２０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを含む５ｍｌの共培養培地（CC MEDIA-MSベース塩、スクロース２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、チアミンＨＣｌ ０.５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン１１５ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ）に再懸濁する。
【０１２４】
イネ胚の形質転換：
温室で生長した日本晴および台北３０９イネ品種から円錐花序を採取する。円錐花序は５０％の市販の漂白剤に１０分間浸漬し、つづいて滅菌蒸留水ですすぐことによって滅菌した。円錐花序を７０％のアルコール処理に３分間付した。ついで、種子を円錐花序から採り、個々に殻を取り、０.１％のTween２０溶液を含むFalcon試験管に移した。ついで、層状エア流動チャンバー中で、種子を７０％アルコールで処理した。ついで、種子を無菌水ですすいだ。この後に、５０％漂白剤処理を４５分間行った。種子は無菌蒸留水で５回すすいだ。最後に、種子を０.１％の塩化水銀（ＩＩ）処理に付した。種子は滅菌蒸留水で再度８回洗浄した。
【０１２５】
層状流動チャンバー中で無菌種子から胚を無菌的に切除し、固体共培養培地（２ｇ／ＬのPhytagelを入れたCC MEDIA）に置いた。５０μＬの滴のアグロバクテリウム懸濁液を無菌ペトリ皿に置いた。１０の胚を各滴に移した。感染は１５分間放置した。アグロバクテリウム懸濁液を無菌ピペットチップで除去した。感染した胚を新たな固体ＣＣ ＭＥＤＩＡプレートに移し、暗所下にて２日間維持した。３日目に、胚を５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムで洗浄した。ついで、胚を無菌濾紙上で乾燥し、Delay培地（MSベース塩、チアミンＨＣｌ １ｍｇ／Ｌ、グルタミン５００ｍｇ／Ｌ、塩化マグネシウム７５０ｍｇ／Ｌ、カゼイン加水分解物１００ｍｇ／Ｌ、スクロース２０ｍｇ／Ｌ、２,４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ、ピクロラム２.２ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ）に置いた。胚はDelay培地上、暗所下にて７日間維持する。この期間に、カルスが形成する。カルスを選択培地（５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むDelay培地）に移し、暗所下にて１０日間保存する。この１０日の期間後にカルスを新たな選択培地に継代培養する。さらに１０日後に、カルスを再生培地（ＭＳベース塩、スクロース３０ｍｇ／Ｌ、カイネチン２ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ０.２ｍｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所下で７日間維持する。ついで、カルスを新鮮な再生培地に移し、３０℃の１６時間の光周期に動かす。このカルス上で発育したシュートを発根培地（半分の強度のＭＳベース塩、スクロース１５ｇ／Ｌ、セフォタキシム２５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン２５ｍｇ／Ｌ）に移す。発根したシュートを水を含有する試験管に移し、硬化のためにミストチャンバーに入れる。
【０１２６】
植物を陽性として選択した。これは、例えば、実施例１２−１４および２６−２９に記載した方法と同様の方法を用いて行い得た。記載した育種方法を含めるのは、次世代のトランスジェニック植物を作出するためである。
【０１２７】
実施例９
第３本葉展開期における低温ストレス応答−ＣｓｐＢおよびＣｓｐＡイネ・トランスジェニック植物
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、milique水中で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１２８】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度を有する温室中のポートレイ（portray）（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色砂質ローム土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に適用する（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１２９】
ＣｓｐＢ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、１００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および７０％ ＲＨ（Percival生長チャンバー）の存在下、１０℃にて４日間、低温ストレスに付した。ストレス処理の後に、植物を１０日間温室内で回復させ、１０日目に生存した植物の生長観察および写真証拠を記録した。各処理は１列当たり１０回反復し、それらは完全に無作為化した。
【０１３０】
結果：低温ストレス耐性について試験した８の異なる系統の中で、６の系統が野生型と比較して顕著に高い低温耐性を示した。Ｒ２−２２６−６−９−３、Ｒ２−２２６−２９−１−１、Ｒ２−２５７−２０−２−１、Ｒ２−２３８−１−１−３、Ｒ２−２３０−４−４−２およびＲ２−２５７−３−１−３を含む系統は、野生型と比較して（非ストレス負荷対照に対して）高い回復生長および生長におけるより生長における低いパーセントの低下（表−１、プレート−１）を示すことによって高い低温耐性を示した。系統Ｒ２−２３０−４−４２は、極めて良好に実行し、それは１００％の生存を示し、回復の間に良好な生長を維持した（表１）。
【０１３１】
【表３】
【０１３２】
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光の存在下、８℃の低温ストレスに１日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて１５日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１３３】
結果：８の異なる系統を低温ストレス耐性について試験し、８系統すべてが野生型（非トランスジェニック）植物と比較して改善した耐性を示した。これらの結果は、改善した低温耐性を示すＲ２分析データを確認した（表２）。
【０１３４】
【表４】
【０１３５】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、生長チャンバー中、１０００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および７０％ＲＨの存在下、１０℃の低温ストレスに３日間付した。ストレス処理の後、植物を温室中で１５日間回復させ、１５日目に生長観察を記録した。各値は１２の観察の平均値であり、実験は以下の完全無作為化（ＣＲＤ）実験法によって行った。
【０１３６】
結果：試験した７の独立のＣｓｐＡトランスジェニック系統のうちの６系統が、野生型と比較して改善された低温耐性を示した。この実験において、植物の高さは非ストレス植物と比較して低温処理対照植物（ＷＴ）では５０％近くまで減少していた。一方、ＣｓｐＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物では、低温処理時の植物の高さの減少は異なる独立系統の中で４.５％から２２.５０％まで変化した（生長における低下が４７.０９％であった１の系統を除いて）。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの低温耐性を改善することを示唆している（表３）。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
ＣｓｐＡ−Ｒ３植物の分析
実験Ｉ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、１０℃の低温ストレスに３日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した（この実験においては、各トランスジェニック系統について８の反復を用い、野生型については１０の反復を用いた）。
【０１３９】
結果：低温ストレスに付した６のトランスジェニック系統は、野生型よりも低温ストレス下でより良好に実行した。これらの結果は、改善された低温耐性を示すことによってＲ２分析データをさらに確認した（表４）。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
注記：植物の高さは生存した植物についてのみ記録し、その平均を上記表に記載している。
【０１４２】
実験ＩＩ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、１０℃の低温ストレスに１日間曝した。その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さおよびパーセント幼植物生存を記録した。
【０１４３】
結果：低温ストレスに付した５のトランスジェニック系統は、野生型よりも低温ストレス下でより良好に実行した。これらの結果は、改善された低温耐性を示すことによってＲ２分析データをさらに確認した（表５）。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
第３本葉展開期における熱ストレス応答
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１４６】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨを有する温室中のポートレイ（portray）（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日間）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に噴霧した（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１４７】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期のイネ幼植物（１２日齢）を、７０％ＲＨの存在下、５０℃の熱ストレスに３時間付した。ストレス処理の後に、植物を温室中で１５日間回復させ、１５日目に生長観察を記録した。各値は１２の観察の平均値である。
【０１４８】
結果：試験した７の独立したＣｓｐＡトランスジェニック系統のうち、６系統が野生型と比較して改善された熱耐性を示した。この実験において、植物の高さは非ストレス植物と比較して熱処理対照植物（ＷＴ）では５０％を超えて減少していた。一方、ＣｓｐＡ遺伝子を有するトランスジェニック植物では、熱処理時の植物の高さの減少は異なる独立系統の中で９.５％から３５％まで変化した。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの熱耐性を改善することを示唆している（表６）。
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、５３℃の高温ストレスに２時間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて１５日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５１】
結果：試験した８のトランスジェニック系統のうち、７系統が野生型と比較して試験した熱ストレス下で良好に実行した。これらの結果は、ＣｓｐＢがイネの熱耐性を改善することを示唆している（表７）。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
ＣｓｐＡ−Ｒ３植物の分析
実験Ｉ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、５３℃の高温ストレスに３時間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５４】
結果：これらの結果は、改善された熱耐性を示すことによってＲ２分析を確認した（表８）。
【０１５５】
【表１０】
【０１５６】
実験ＩＩ
プロトコール：第３本葉展開期の幼植物を、１０００μｍｏｌ.の光の存在下、５０℃の高温ストレスに１日間曝し、その後に、幼植物を温室中、２８℃にて３０日間回復させ、回復の終期に植物の高さを記録した。
【０１５７】
結果：これらの結果は、改善された熱耐性を示すことによってＲ２分析データを確認した（表９）。
【０１５８】
【表１１】
【０１５９】
水ストレス応答
植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１６０】
ＣｓｐＢ−Ｒ２植物の分析
実験プロトコール
発芽した幼植物（３日齢）を、容水量（ＦＣ）の点からみてバーミキュライトを含有するＰＶＣポット中に作製した、２の異なるレベルの水ストレスに移した。ＦＣ−１００％は飽和条件（すなわち、１００ｇのバーミキュライトは３５０ｍｌの水を必要とする）である（Sharpら, 1988, Planl Physiol. 87: 50-57）。必要な量の水を添加することによって、バーミキュライトを含有するＰＶＣポットに異なるレベルの水ストレス（すなわち、５０％ＦＣおよび２５％ＦＣ）を作製した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。幼植物は８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨの存在下、温室中で、水ストレス条件にて１５日間生長させた。１５日目に、根およびシュートの生長を記録し、写真を撮影した。各処理を列当たり１０回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
【０１６１】
生長におけるパーセント低下は、以下の式に当てはめることによって計算した。
【０１６２】
【数３】
【０１６３】
結果：４の異なるＣｓｐＢトランスジェニック系統を水ストレス耐性について分析した。試験したすべてのＣｓｐＢトランスジェニック系統は、野生型植物と比較してストレスの間に顕著に高い生長を示した。Ｒ２−２５７−１５−１−１、Ｒ２−２３８−１−１−３、Ｒ２−２５７−３−１−６およびＲ２−２２６−６−９−３を含むトランスジェニック系統は、非ストレス対照（ＦＣ−１００％）を超える根およびシュートの生長における最小限のパーセント減少を示した。これらの系統における根およびシュートの生長における減少は、１１ないし２５％の範囲であった。一方、野生型は生長における最大の減少を示し、それは５０％に近かった。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネの水ストレス耐性を改善することを示唆している（表−１０および表−１１）。
【０１６４】
【表１２】
【０１６５】
【表１３】
【０１６６】
ＣｓｐＡ−Ｒ２植物の分析
ａ．植物材料の調製：
発芽：種子は０.０１％塩化水銀（ＩＩ）で３分間処理することによって滅菌し、その後にmilique水で１０回よく洗浄して微量の塩化水銀（ＩＩ）を除去した。滅菌種子は、milique水に３時間浸漬することによって吸収させた。吸収した種子は、種子発芽機（Serwell Instruments Inc.）を用いて、３０℃および６０％ＲＨ、滅菌した湿潤濾紙上で発芽した。
【０１６７】
第３本葉展開期の幼植物の確立：３日齢の発芽幼植物を、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨを有する温室中のポートレイ（５２.５ｍｍ（長さ）×２６ｍｍ（深さ）×５.２ｍｍ（直径））に移した。幼植物は、赤色砂質ローム土を含むポートレイ中で第３本葉展開期（ほぼ１２日間）まで生育させた。肥料溶液は、実験が完了するまで一週間に１回幼植物に噴霧した（Ｎ−７５ＰＰＭ、Ｐ−３２ＰＰＭ、Ｋ−３２ＰＰＭ、Ｚｎ−８ＰＰＭ、Ｍｏ−２ＰＰＭ、Ｃｕ−０.０４ＰＰＭ、Ｂ−０.４ＰＰＭおよびＦｅ−３.００ＰＰＭ）。
【０１６８】
プロトコール：１月齢の幼植物を、温室中、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光および６０％ＲＨの存在下で３日間、水ストレスに付した。水ストレスは、差し控え潅漑（withholding irrigation）によって負荷した。３日の終期に、植物はしおれまたは立枯れ症状を示し始めた。ストレスは、植物を水で潅漑することによって緩和され、２４時間後に、しおれまたは立枯れ症状を示すパーセント植物の観察を記録した。処理当たり系統当たり、最小１２の植物を維持した。
【０１６９】
結果：試験した７の独立したＣｓｐＡトランスジェニック系統のうちの６の系統が、野生型と比較して改善された水ストレス耐性を示した。対照植物の６６％は、潅漑後にしおれまたは立枯れから回復しなかった。一方、ＣｓｐＡトランスジェニック植物においては、潅漑後にしおれまたは立枯れ症状を示した植物のパーセントは異なる独立した系統の中で５％から４３％まで変化した（しおれまたは立枯れを示す植物のパーセンテージが８５％であった１の系統を除いて）。これらの結果は、ＣｓｐＡがイネにおける水ストレス耐性を改善することを示唆している（表１２）。
【０１７０】
【表１４】
【０１７１】
塩ストレス応答
ＣｓｐＢ−Ｒ３植物の分析
プロトコール：発芽種子（４８時間齢）を、２００ｍＭのＮａＣｌを含有するバーミキュライトを含むＰＶＣポットに移すことによって塩ストレスに付し、ついで１０日間生長させた。ストレスの１０日後に、幼植物を水を含有するバーミキュライトの新たなトレイに移すことによって１５日間回復させた。植物の高さのごとき生長観察は回収の終期に記録した。この実験は、完全無作為化法（ＣＲＤ）に従って温室中で行い、処理当たり８回の繰り返しを維持した。
【０１７２】
結果：７のＣｓｐＢトランスジェニック系統および野生型植物を２００ｍＭのＮａＣｌストレスに付した。この条件下で、５のトランスジェニック系統が野生型と比較してより良好に実行した。これらの結果は、ＣｓｐＢが塩ストレスに対するイネ植物の耐性を改善することを示唆している（表１３）。
【０１７３】
【表１５】
【０１７４】
Ｒ３水ストレスアッセイ
ＣｓｐＡおよび野生型（日本晴−農林５号）の４の独立したトランスジェニック系統（１、２、３、４）からの発芽幼植物を、バーミキュライトを含有するポットに移すことによって水ストレスに付した。３のレベルの水様式を維持し、それらは１００％容水量（ＦＣ−１００＝３.７２ｍｌの水／ｇバーミキュライト）、２５％容水量（ＦＣ２５＝０.９３ｍｌの水／ｇバーミキュライト）、１５％容水量（ＦＣ１５＝０.５５８ｍｌ／ｇバーミキュライト）である。幼植物は、温室中、８００μｍｏｌ.／ｍｔ２／秒の光強度および６０％ＲＨの存在下で３０日間、異なる水様式で生長した。異なるストレスレベルにおける水の状態は、実験を通して、蒸発散に起因して損失した水の量を毎日添加することによって一定に維持した。３０日の終期に、植物に水を添加することによって回復させ、レベルをＦＣ１００とし、１５日間維持した。実験の間、ストレスの終期（ＥＳ）の植物の高さ（ｐｌ.ｈｔ）および根（Ｒ）シュート（Ｓ）の長さおよび乾燥重量を記録した。
各処理は系統当たり１０回繰り返し、それらを完全に無作為化した。
【０１７５】
【表１６】
【０１７６】
【表１７】
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
実施例１０
ｃｓｐＡ
ｐＭＯＮ７３６０７の構築（図１０）
１．ベクターｐＭＯＮ６１３２２をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、ＣｓｐＡ遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
２．イー・コリｃｓｐＡ遺伝子をｐＭＯＮ５６６０９（図８）ベクターからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは遺伝子の５'末端のNcoIサイトの左で使用し、３'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
３．ＰＣＲフラグメントおよびｐＭＯＮ６１３２２（図１１）バックボーンを連結する。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
４．ベクターを配列決定して、プラスミドのｃｓｐＡ遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
【０１７９】
ｃｓｐＢ
ｐＭＯＮ７３６０８の構築（図１２）
１．ベクターｐＭＯＮ６１３２２をNcoIおよびApaIで切断して、バックボーンを開け、ＨＶＡ１遺伝子を取り出す。バックボーンフラグメントをゲル精製によって単離する。
２．ビー・ズブチリスｃｓｐＢ遺伝子をｐＭＯＮ５６６１０ベクターからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲプライマーは遺伝子の５'末端のNcoIサイトの左で使用し、３'末端にSwaIおよびApaIサイトを作製する。
３．ＰＣＲフラグメントおよびｐＭＯＮ６１３２２バックボーンを連結する。ライブラリー有効ＤＨ５α細胞に形質転換する。ApaIおよびNcoIを用いてコロニーをスクリーニングしてインサートを含むクローンを同定する。
４．ベクターを配列決定して、プラスミドのＣｓｐＢ遺伝子および他の選択した領域の忠実性を確認する。
【０１８０】
実施例１１ トウモロコシ植物の形質転換
トウモロコシ植物は、当該技術分野で知られている方法（例えば本明細書中の実施例２０−２５を参照されたい）によって形質転換し得る。
【０１８１】
実施例１２
コピー数についてのトランスジェニック植物の分析は、以下の様式で行う。
葉組織は若葉から、出来るだけ基部近くからかつ葉の１の側から収集する。試料は９６ウェルプレートに入れ、一晩凍結乾燥する。組織は各ウェルに３の３ｍｍ金属ボールを入れ、Mega Grinderを用いて１２００ｒｐｍにて２分間振盪することによってホモジナイズする。ＤＮＡはβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８に緩衝化したＴｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌおよびドデシル硫酸ナトリウムを含有する標準的な緩衝液を用いて抽出する。抽出は酢酸カリウムにつづいてクロロホルムを用いて行い、沈殿はイソプロパノールを用いて行う。遠心した後に、エタノール溶液で洗浄し、乾燥し、ＤＮＡをさらに分析する前にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁する。
【０１８２】
ＤＮＡは複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメントを非変性アガロースゲル電気泳動によって分離する。ＤＮＡはＮａＯＨ溶液によって変性する。ゲルをＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝液中で中和し、毛管現象によってナイロンフィルターにブロットする。ナイロンフィルターは、放射性同位元素またはＤＩＧのいずれかで標識した適当なプローブを添加する前に、サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で予めハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、ブロットを洗浄し、オートラジオグラフィーフィルムに感光するかまたは抗−ＤＩＧ抗体コンジュゲートおよび適当な基質を用いてＤＩＧを検出することによって検出する。
【０１８３】
実施例１３
本発明者らは、Ｈｉｓ−標識抗原を合成および精製し得るベクター（Novagen, Merck KgaA, Darmstadt, Germanyの系列会社）を用いてイー・コリ中で発現させるために、ｃｓｐＡおよびｃｓｐＢの全長オープンリーディングフレームを用いる。精製した抗原を用いて、市場の供給業者、例えばStrategic Biocolutionsを用いてポリクローナル抗体を生成する。生成した抗体を用いて、ＣＳＰタンパク質の発現について植物を試験する。
【０１８４】
実施例１４
トランスジェニック・トウモロコシ系統の発達
初代形質転換体はＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａ、ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＣおよびＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｄのごとき生殖質において作製する。初代形質転換体は自殖（self）ならびに同系遺伝子型の非トランスジェニック植物に戻し交配する。自殖植物からの種子を圃場に植え、Taqman接合子アッセイによってアッセイして、推定ホモ接合選択体、推定ヘテロ接合選択体および陰性選択体を同定する。推定ヘテロ接合選択体は、適当なテスター、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＢおよびＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｄの複数の植物と交配する。雑種種子を収穫し、手で殻を剥き、選択によって保存する。他の繁殖方法を用いることもできる。例えば、本明細書の実施例２９を参照されたい。
【０１８５】
実施例１５
幼植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように、最適下限レベルに利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、進行的な水不足に通じる長期間にわたって水の量を制限する形態、または、幼植物を水耕的にまたは塩処理で浸透的にストレスをかけることによる急激な欠乏の態様をとる。トランスジーン陽性植物は、処理に対する改善された表現型応答でスクリーニングされる。測定する表現型応答には、処理の間または処理後回復期間後のシュート生長速度または乾燥重量蓄積、しおれもしくは立枯れまたは立枯れ回復、および根の増殖速度および乾燥重量蓄積が含まれ得る。改善された応答を有するものは、圃場効率試験に進める。スクリーニングには、生長チャンバーまたは温室のごとき制御された環境中の小ポットで生長させた多くのトランスジーン陽性およびトランスジーン陰性の植物が必要であろう。スクリーニングした植物の数は、適用した処理および測定した表現型と関連する分散によって示す。
【０１８６】
実施例１６
圃場生長植物は、処理が測定可能な表現型応答を生じるように最適下限レベルまで利用可能な水を限定する処理を受ける。例えば、この処理は、植物の後期栄養または早期繁殖発育のいずれかの間に進行的な水不足に通じる、長期間にわたり植物の利用可能な水の量を制限する形態をとり得る。トランスジーン陽性植物は、トランスジーン陰性植物に対して、処理に対する改善された表現型応答についてスクリーニングされるであろう。測定される表現型応答には、処理の間のシュート生長速度、葉のしおれまたは立枯れ（leaf wilting）、穀物収量、ならびに穀粒数および穀粒重量のごとき穂収量要素が含まれ得る。改善された応答を有するこれらの事象は、初年収量試行を促進するであろう。スクリーニングは、制御可能な潅漑を有する２の乾燥圃場場所において典型的な栽培密度で適用するであろう。スクリーニングされた植物の数は、適用した処理および測定された表現型と関連する変化によって指図される。
【０１８７】
実施例１７
記載した遺伝子の幾つかを、以下（実施例１７−３０）同様にしてクローニングし、植物に形質転換し、表現型決定する。例えば、ヌクレオチドおよび配列番号：４−５３をコードするヌクレオチド。
【０１８８】
デスティネーションベクターの構築
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーション（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）植物発現ベクターは、当業者に知られている方法を用いて構築した。発現ベクターのエレメントを表１７に要約する。イー・コリで発現する細菌複製機能を含むプラスミドｐＭＯＮ６５１５４のバックボーンおよびアンピシリン抵抗性遺伝子はプラスミドｐＳＫ−に由来する。ｐＭＯＮ６４１５４における植物発現エレメントは当業者が入手可能であり、各エレメントについて表１７に参照を記載する。位置に関する表１７中のすべての参照は、図１３に開示するプラスミドマップ上の各エレメントの塩基対座標を示す。一般的に、ｐＭＯＮ６５１５４はネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）をコードする遺伝子に作動可能に連結したカリフラワーモザイクウイルスＳ３５プロモーターを含む選択マーカー発現カセットを含む。選択マーカー発現カセットの３'領域には、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の３'領域につづいて３'にジャガイモプロテイナーゼ・インヒビターＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子の３'領域が含まれる。プラスミドｐＭＯＮ６５１５４には、さらに、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング法を用いて関心のある遺伝子を挿入することができる植物発現カセットが含まれる。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニングカセットは、イネ・アクチン１プロモーター、エキソンおよびイントロンによって５'で挟まれ、かつ、ジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３’領域によって３'で挟まれている。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法を用いて、クローニングカセットを関心のある遺伝子によって置き換えた。関心のある遺伝子を含むベクターｐＭＯＮ６５１５４およびその誘導体は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメントのごとき直接ＤＮＡデリバリーを介する植物形質転換の方法に特に有用であった。当業者であれば、当業者に知られている方法を用いて、同様の特徴を有する発現ベクターを構築し得るであろう。なお、当業者であれば、他のプロモーターおよび３'領域が関心のある遺伝子の発現に有用であり、他の選択マーカーを使用し得ることを認識するであろう。
【０１８９】
【表１９】
【０１９０】
植物形質転換のアグロバクテリウム媒介法に使用するために、別のプラスミドベクター（ｐＭＯＮ７２４７２、図１４）を構築した。プラスミドｐＲＧ７６は、関心のある植物発現の遺伝子、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング、およびｐＭＯＮ６５１５４中に存在する植物選択マーカー発現カセットを含む。加えて、アグロバクテリウムからの左側および右側Ｔ−ボーダー配列をプラスミドに加えた。右側ボーダー配列はイネ・アクチン１プロモーターの５'に位置し、左側ボーダー配列はｎｐｔＩＩ遺伝子の３'に位置するｐｉｎＩＩ ３'配列の３'に位置する。さらに、ｐＭＯＮ６５１６４のｐＳＫ−バックボーンをプラスミド・バクボーンによって置き換えて、イー・コリおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンスの両方におけるプラスミドの複製を容易にした。該バックボーンは、アグロバクテリウムにおいて機能的なＤＮＡ複製のｏｒｉＶ広宿主域複製起点、ｒｏｐ配列、イー・コリにおいて機能的なＤＮＡ複製のｐＢＲ３２２複製起点、ならびにイー・コリおよびアグロバクテリウムにおけるプラスミドの存在について選択するためのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性遺伝子を含む。
プラスミドベクターｐＲＧ８１に存在するエレメントを表１８に記載する。
【０１９１】
【表２０−１】
【０１９２】
【表２０−２】
【０１９３】
実施例１８
コード配列は、ｐＭＯＮ６５１５４（図１３）のごときＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーション植物発現ベクターにインサートする前に、ＰＣＲによって増幅した。すべてのコード配列は、クローニングした完全長配列またはｃＤＮＡライブラリーから所望の配列の増幅を許容するＤＮＡ配列情報のいずれかとして入手可能であった。ＰＣＲ増幅用のプライマーは、５'および３'非翻訳領域の大部分を排除するために、コード配列の開始コドンおよび終止コドンにおいてまたはその付近において設計した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクター（Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA）への組換えによるクローニングを許容するために、ＰＣＲ産物にａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列を付けた。
【０１９４】
２の方法を用いて、関心のあるａｔｔＢで挟んだＰＣＲ増幅配列を作製した。両方の方法は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に詳細に記載されている。第１の方法においては、ａｔｔＢおよび鋳型の特異的配列を含む単一のプライマーセットを用いた。プライマー配列は以下のとおりである：
ａｔｔＢ１フォワード・プライマー：
5' GGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3’（配列番号：７１）
【０１９５】
ａｔｔＢ２リバース・プライマー
5'GGGG CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN鋳型特異的配列3'（配列番号：７２）
【０１９６】
別法として、ａｔｔＢアダプターＰＣＲを用いて、ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物を調製した。ａｔｔＢ１アダプターＰＣＲは２セットのプライマー、すなわち遺伝子特異的プライマーおよびａｔｔＢ配列をインストールするためのプライマーを用いる。所望のＤＮＡ配列プライマーを設計し、それには５'にａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２配列の１２塩基対が含まれていた。使用したプライマーは以下のとおりである：
ａｔｔＢ１遺伝子特異的フォワード・プライマー：
5' CCTGCAGGACCATGフォワード遺伝子特異的プライマー3'（配列番号：７３）
【０１９７】
ａｔｔＢ２遺伝子特異的リバース・プライマー：
5' CCTGCAGGCTCGAGCTAリバース遺伝子特異的プライマー3’（配列番号：７４）
【０１９８】
第２のセットのプライマーは以下の配列を有するａｔｔＢアダプタープライマーであった：
ａｔｔＢ１アダプターフォワードプライマー：
5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG 3'（配列番号：７５）
【０１９９】
ａｔｔＢ２アダプターリバースプライマー：
5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA 3'（配列番号：７６）
【０２００】
ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２で挟んだ配列を、Invitrogen Life Technologies（Carlsbad, CA）によって記載された方法に従ってＰＣＲによって増幅した。ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物を、前記したように精製し、ゲルから回収した。
【０２０１】
幾つかの例において、ａｔｔＢで挟んだ配列をＰＣＲから回収したが、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いてドナーベクターにインサートし得なかった。ドナーベクターへのＧＡＴＥＷＡ（登録商標）組換えを失敗した場合には、リガーゼを用いる慣用的なクローニング方法を用いて、ＤＮＡ配列をエントリーベクターにインサートした（Invitrogen Life Technologies, Carlsburg,CA）。
【０２０２】
エントリーベクターの選択は、エントリーベクターおよび所望のインサート配列中の制限エンドヌクレアーゼ部位の和合性に依存した。エントリーベクターを選択した制限エンドヌクレアーゼで消化してｃｃｄＢ遺伝子を除去し、脱リン酸化し、ゲル精製した。選択した制限エンドヌクレアーゼは使用したエントリーベクターおよび所望のインサート配列の配列に依存した。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、ＥｃｏＲ１を用いて、またはＥｃｏＲＶおよびＸｍａＩまたはＮｃｏＩおよびＸｈｏＩのごとき制限エンドヌクレアーゼの他の組合せを用いて、ｐＥＮＴＲ１１（図１５）から除去した。他の制限エンドヌクレアーゼは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）工程で使用するために他のエントリーベクターと使用し得る。制限エンドヌクレアーゼ消化したエントリーベクターを使用するために、所望のＰＣＲ産物上に和合性の粘着末端を作製できることが必要であった。粘着末端は、制限エンドヌクレアーゼ消化、アダプター連結またはＰＣＲの間の制限部位の付加のごとき当業者に知られている多数の方法により作製し得るであろう。
【０２０３】
幾つかの例において、ＰＣＲフラグメントおよびエントリーベクター上に和合性の粘着末端を作製することができなかった。別法として、和合性の粘着末端は、ｃＤＮＡクローンの制限酵素消化によっても作製し得る。しかしながら、ＰＣＲフラグメントをエントリーベクターに平滑末端連結することができた。この方法を用いて、エントリーベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断してｃｃｄＢ遺伝子を除去した。ゲル精製した線状エントリーベクターを、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。当業者は、クレノーＤＮＡポリメラーゼの使用のごとき、平滑末端化したＤＮＡ分子を作製する他の法補に気付く。ＰＣＲ産物を平滑末端化し、好ましくはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、または他の好適なポリメラーゼ、Ｔ４ ポリヌクレオチド・キナーゼおよびフォスファターゼ酵素とインキュベーションすることによって脱リン酸化した。エントリーベクターおよびＰＣＲ産物は、当該技術分野で知られている方法を用いて平滑末端連結した。連結産物はイー・コリに形質転換し、個々のコロニーからのプラスミドをインサートＤＮＡの存在およびエントリーベクター中のａｔｔＬ部位に対する所望の向きについて分析した。オープンリーディングフレームのアミノ末端に次いでａｔｔＬ１配列を有するクローンを選択した。
【０２０４】
好ましくは、ａｔｔＢで挟んだＰＣＲ産物をＧＡＹＥＷＡＹ（登録商標）法を用いてプラスミドにインサートし得なかった場合には、ＰＣＲ産物をクローニングするＴＡ法（Marchukら, 1991）を用いた。ＴＡ法は、Ｔａｑポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性の利点を採用している。エントリーベクターを制限エンドヌクレアーゼで切断し、本明細書に記載する方法を用いて平滑末端とした。平滑末端化した線状エントリーベクターはｄＴＴＰおよびＴａｑポリメラーゼとインキュベートして、各ＤＮＡ鎖の３'末端に単一のチミジン残基の付加を生じた。ＴａｑポリメラーゼはｄＡＴＰに強い優先性を有するため、ＰＣＲ産物は３'末端に付加した単一のアデノシンを有して作製される場合が多くある。したがって、エントリーベクターおよびＰＣＲ産物は相補的な単一塩基３'オーバーハングを有する。当業者に知られている条件下で連結した後に、プラスミドをイー・コリに形質転換した。プラスミドは個々のコロニーから単離し、分析して正確な向きの所望のインサートを有するプラスミドを同定する。別法として、ａｔｔＢサイトを付加したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Promega Corporation, Madison, WI）のごとき市販のＴＡクローニングベクターにＴＡクローニングした。
【０２０５】
すべてのＰＣＲ増幅産物は、植物に導入する前に配列決定した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法によって作製したデスティネーション発現ベクター中のＰＣＲインサートを配列決定して、配列決定したインサートが予想されるアミノ酸配列をコードすることを確認した。エントリーベクターを連結方法を用いて作製した場合、インサートした配列は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術を用いてデスティネーション発現ベクターの作製前にエントリーベクターで配列決定した。アミノ酸コード配列に影響しない点突然変異、すなわちサイレント突然変異は認めた。
【０２０６】
実施例１９ 発現ベクターの構築
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング法（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて、トウモロコシ形質転換に使用するための発現ベクターを構築した。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）法は、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）に十分に記載されている。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）システムの使用により、植物発現ベクターへのコード配列のハイスループットクローニングが促進される。ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれた遺伝子配列は、前記のようにＰＣＲによって作製した。いずれの組換え配列、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２がコード配列の５'および３'に位置するかに依存して、センスおよびアンチセンス発現ベクターが作製された。センスまたはアンチセンス向きでいずれかのコード配列をインサートし得る植物発現ベクター、ｐＭＯＮ６５１５４（図１３）は、実施例１に記載したように構築し、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング手法におけるデスティネーションベクターとして使用した。
【０２０７】
ＰＣＲ増幅したコード配列を植物発現ベクターにインサートするために、２の別の方法を用いた。第１の方法においては、５'および３'末端でａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれた関心のあるコード配列を含むＰＣＲ産物を、ＢＰ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）の存在下でドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（登録商標）、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）とインキュベートした。ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）エントリークローンは、この反応から作製し、イー・コリに形質転換した。プラスミドＤＮＡはエントリークローンから単離した。インサートしたコーディング配列は、ＰＣＲ増幅の忠実度を確認するために、エントリーベクターから配列決定し得た。エントリークローン、イー・コリのコロニーから単離したプラスミドＤＮＡを、ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）の存在下で、線状化したデスティネーションベクター、好ましくはｐＭＯＮ６５１５４とインキュベートして、関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを作製した。ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）反応からのＤＮＡをイー・コリに形質転換した。植物発現ベクターの正確な向きおよび配列を決定するために、デスティネーション発現ベクターからのプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。
【０２０８】
植物発現ベクターを作製する第２の方法においては、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２配列によって挟まれたＰＣＲ産物を、前記したごとくドナーベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（登録商標）、Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）およびＢＰ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）とインキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物のアリコットを線状化したデスティネーションベクターおよびＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）とさらにインキュベートした。得られたＤＮＡをイー・コリに形質転換し、関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを当該技術分野で知られているＰＣＲおよびサザンブロット分析技術を用いて選択した。関心のあるコード配列を含む植物発現ベクターを作製する両方の方法は、Invitrogen Life Technologies (ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Cloning Technology Instruction Manual）によって記載されていた。
【０２０９】
別法として、エントリーベクターは制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて作製した。エントリーベクターはInvitrogen Life Technologies（Carlsbad, CA）から入手可能である。各エントリーベクター、例えばｐＥＮＴＲ１Ａ、ｐＥＮＴＲ２Ｂ、ｐＥＮＴＲ３Ｃ、ｐＥＮＴＲ４およびｐＥＮＴＲ１１はユニークなクローニングおよび発現特徴を有する。ｐＥＮＴＲ１１を本発明の実施において好ましく使用した。当業者は、他のエントリーベクターの有用性を認識するであろう。制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて所望の配列をエントリーベクターにインサートする前に、ｃｃｄＢ遺伝子の各側でエントリーベクターを制限消化することが必要であった。制限エンドヌクレアーゼの多数の異なる組合せは、エントリーベクターにインサートするＤＮＡ配列上に存在する制限サイトに依存して制限された。好ましくは、制限消化した後にエントリーベクターを脱リン酸化し、ゲル精製した。所望のＤＮＡ配列を、当業者に知られている分子生物学の慣用的な方法を用いてＥｎｔｒｙ Ｖｅｃｔｅｒにインサートした。ＴＡクローニング（米国特許第５,８２７,６５７号）は、ＰＣＲフラグメントをエントリーベクターにクローニングする好ましい方法である。
【０２１０】
ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング方法を用いて作製したベクター（ｐＭＯＮおよび５デジタル番号と命名した）およびその中に含まれるコード配列は、例えば配列番号：４−２８である。本発明のコード配列の幾つかを、本明細書に記載する方法を用いて植物発現ベクターにクローニングし得ることは予想される。
【０２１１】
実施例２０
生殖質のトウモロコシ 植物は温室で生育させた。雌穂は、胚が１.５ないし２.０ｍｍ長である場合、通常は授粉１０ないし１５日後、たいていの場合は授粉１１ないし１２日後に植物から収穫した。雌穂は８０％エタノールを雌穂に噴霧するかまたは浸漬し、その後に風乾することによって表面滅菌した。別法として、雌穂は１０％ＳＤＳを含有する５０％ＣＬＯＲＯＸ（登録商標）中に２０分間浸漬し、その後に滅菌水で３回濯ぐことによって表面滅菌した。
【０２１２】
未熟な胚は、当業者に知られている方法を用いて個々の穀粒から単離した。未熟な胚は、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの前の３−６日間、好ましくは３−４日間、１６.９ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３を含有するmedium ２１１（Ｎ６塩、２％スクロース、１ｍｇ／Ｌ ２,４−Ｄ、０.５ｍｇ／Ｌナイアシン、１.０ｍｇ／Ｌ チアミン−ＨＣｌ、０.９１ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシチオール（myoinositiol）、０.５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、１.６ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０.６９ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２ｇ／Ｌ ＧＥＬＧＲＯ（登録商標）、ｐＨ５.８）（medium ２１１Ｖという）上で培養した。
【０２１３】
実施例２１
トウモロコシ細胞および他の単子葉植物のアグロバクテリウム媒介形質転換の方法は知られている（Hieiら, 1997; 米国特許第５,５９１,６１６号；米国特許第５,９８１,８４０号；公開欧州特許出願 EP 0 672 752）。種々の菌株のアグロバクテリウムを使用し得る（前記参考文献を参照されたい）が、本発明者らはＡＢＩ株を好ましく用いた。アグロバクテリウムのＡＢＩ株は、３７℃にて培養することによりＴｉプラスミドを排除した、さらに修飾したＴｉプラスミドｐＭＰ９０ＲＫ（KonczおよびSchell, 1986）を含むＣ５８ノパリン型菌株であるＡ２０８株に由来する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのバイナリーベクターシステム（Anら, 1998）を、トウモロコシを形質転換するために好ましく使用した。別の同時組込みＴｉプラスミドベクターが記載されており（Rogersら, 1988）、トウモロコシを形質転換するために使用し得た。関心のある１またはそれを超える遺伝子を含むバイナリーベクターは、エレクトロポレーション（Wen-junおよびForde, 1989）またはtriparental mating（Dittaら, 1980）を用いて、無力化したアグロバクテリウム株に導入し得る。バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子、スクリーニングマーカー遺伝子および／または形質転換植物に所望の表現型特性を付与する１もしくはそれを超える遺伝子を含み得る。例示的なバイナリーベクター、ｐＭＯＮ３０１１３を図４に示す。他のバイナリーベクターを用いることができ、それらは当業者に知られている。
【０２１４】
トウモロコシ細胞の共培養の前に、アグロバクテリウム細胞は、修飾したＴｉプラスミドおよびバイナリーベクターの維持につき選択するための適当な抗生物質を含むＬＢ（DIFCO）液体培地中、２８℃にて増殖させ得る。例えば、ＡＢＩ／ｐＭＯＮ３０１１３は、ｐＭＰ９０ＲＫ修飾Ｔｉプラスミドの保持について選択するための５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよびバイナリーベクターｐＭＯＮ３０１１３の保持について選択するための１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地中で増殖させ得る。宿主アグロバクテリウム菌株中にプラスミドを保持するために適当な選択剤を使用することは当業者に明らかであろう。トウモロコシ細胞を接種する前に、アグロバクテリウム細胞はプラスミド保持についての適当な抗生物質および２００μＭアセトシリンゴンを含むＡＢ培地（Chiltonら, 1974）中、室温にて一晩増殖させる。トウモロコシ細胞の接種の直前に、アグロバクテリウムは好ましくは遠心分離によってペレット化し、２００μＭアセトシリンゴンを含有する１／２のＭＳＶＩ培地（２.２ｇ／Ｌ ＧＩＢＣＯ（Carlsbad, CA）ＭＳ塩、２ｍｇ／Ｌグリシン、０.５ｇ／Ｌナイアシン、０.５ｇ／Ｌ Ｌ−ピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌチアミン、１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、１０ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび１０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５.４）中で洗浄し、２００μＭアセトシリンゴンを含有する１／２のＭＳＰＬ培地（２.２ｇ／Ｌ ＧＩＢＣＯ（Carlsbad, CA）ＭＳ塩、２ｍｇ／Ｌグリシン、０.５ｇ／Ｌナイアシン、０.５ｇ／Ｌ Ｌ−ピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌチアミン、１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２６ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、６８.５ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５.４）中に０.１ないし１.０×１０９細胞／ｍｌで再懸濁した。当業者は、１／２のＭＳＶＩまたは１／２のＭＳＰＬの代わりに他の培地を使用し得る。
【０２１５】
未熟トウモロコシ胚は、先に記載したように単離する。胚は、摘出後０−７日、好ましくは摘出後直ちにアグロバクテリウムを接種する。別法として、未熟胚は７日を超えて培養し得る。例えば、胚形成カルスは前記したように開始し、アグロバクテリウムと共培養し得る。好ましくは、未熟トウモロコシ胚を摘出し、前記したように調製した１／２のＭＳＰＬ培地中のアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、アグロバクテリウムと室温にて５−２０分間インキュベートし得る。
【０２１６】
接種後、胚は、３.０ｍｇ／Ｌ ２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）、１％ Ｄ−グルコース、２％スクロース、０.１１５ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、０.５ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、２００μＭアセトシリンゴンおよび２０μＭ硝酸銀またはチオ硫酸銀を含有する１／２強度のＭＳ培地（MurashigeおよびSkoog, 1962）に移す。未熟胚は、暗所下、２３℃にて１ないし３日間、アグロバクテリウムと共培養する。当業者は、記載した培地の代わりに他の培地を使用し得る。
【０２１７】
共培養した胚は、medium １５ＡＡ（４６２ｍｇ／Ｌ （ＮＨ４）ＳＯ４、４００ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１８６ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、２ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０.２５ｍｇ／Ｌ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０.０２５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０.０２５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０.７５ｍｇ／Ｌ ＫＩ、２.８３ｇ／Ｌ ＫＮＯ３、０.２ｍｇ／Ｌナイアシン、０.１ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.２ｍｇ／Ｌピリドキシン−ＨＣｌ、０.１ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン、０.１ｍｇ／Ｌ 塩化コリン、０.１ｍｇ／Ｌパントテン酸カルシウム、０.０５ｍｇ／Ｌ葉酸、０.０５ｍｇ／Ｌ ｐ−アミノ安息香酸、０.０５ｍｇ／Ｌリボフラビン、０.０１５ｍｇ／ＬビタミンＢ１２、０.５ｇ／Ｌカザミノ酸、３３.５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１.３８ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース）、または１.５ｍｇ／Ｌ ２,４−Ｄ、５００ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、３％スクロース、１.３８ｇ／Ｌ Ｌ−プロリンおよび２０μＭ硝酸銀またはチオ硫酸銀を含有するＭＳ培地に移し、選択することなく、暗所下、２７℃にて０ないし８日間培養する。形質転換体の選択および植物の再生に使用した培地は、好ましくは５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有する。当業者は、アグロバクテリウムの増殖を制御する他の抗生物質を代わりに使用し得る。細胞培養を支持する他の培養培地をそれに代えて使用し得る。選択の遅延がない（０日培養）場合には、選択を２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンで開始し得る。選択培地は、medium ２１１（前記した）またはＮ６塩をＭＳ塩で置き換えたmedium ２１１の変形を含み得る。２週間後に、胚形成カルスを１００ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培養培地に移し、約２週間間隔で継代培養する。共培養後に選択が遅延した場合、胚は最初に５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培地で培養し、つづいて胚形成カルスを１００−２００ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する培地で継代培養する。当業者は、選択マーカーを欠いている細胞の増殖を阻害するが形質転換カルスは増殖する濃度のパロモマイシン上で組織を培養する。別法として、他の選択マーカーを用いて形質転換細胞を同定し得る。２５ないし５０ｍｇ／Ｌパロモマイシン上の約２週間の初期培養につづく５０−２００ｍｇ／Ｌパロモマイシン上の培養は、形質転換カルスの回収を生じると考えられる。形質転換体は選択の開始後６ないし８週に回収する。植物は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメント後に回収した形質転換体について前記したように、形質転換胚形成カルスから再生する。
【０２１８】
実施例２２ トウモロコシカルスのアグロバクテリウム媒介形質転換
本実施例では、アグロバクテリウムを用いたトウモロコシカルスの形質転換の方法を記載する。該方法を、ｎｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子およびパロモマイシン選択剤を用いて例示する。当業者は、その代わりに他の選択マーカーおよび選択剤の組合せを使用し得ることに気付くであろう。
【０２１９】
カルスは当業者に知られている方法を用いて未熟胚から開始した。例えば、１.５ｍｍないし２.０ｍｍの未熟胚をＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａのごとき遺伝子型の発育トウモロコシ種子から摘出し、胚軸側を下方にしてmedium ２１１Ｖ上で通常摘出後８−２１日培養した。別法として、確立したカルス培養物は、当業者に知られている方法によって開始および維持し得る。
【０２２０】
アグロバクテリウムは、実施例２１に記載した方法に従って植物組織の接種用に調製した。５０ないし１００片のカルスを、０.１ないし１.０×１０９ｃｆｕ／ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液約１５ｍｌを含有する６０ｍｍ×２０ｍｍペトリ皿に移した。カルスの片は、通常、培養２１日までの未熟胚によって生成したすべてのカルス、または直径２ｍｍないし８ｍｍの確立したカルスの片とした。カルスはアグロバクテリウム懸濁液と室温にて約３０分間培養し、つづいて吸引によって液体を除去した。
【０２２１】
約５０μｌの滅菌蒸留水を６０ｍｍ×２０ｍｍペトリ皿中のWhatman #1濾紙に添加した。１−５分後に、１５ないし２０片のカルスを各濾紙に移し、プレートを例えばＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）で密閉した。カルスおよびアグロバクテリウムは、暗所下、２３℃にて約３日間共培養した。
【０２２２】
カルスは、濾紙から、２０μＭ硝酸銀および５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むmedium ２１１に移し、暗所下、２７ないし２８℃にて２−５日間、好ましくは３日間培養した。選択は、カルスを２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium 211
に移すことによって開始した。暗所下、２７ないし２８℃にて２週間培養した後に、カルスは２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含むmedium ２１１（medium ２１１ＱＲＧ）に移した。カルスは２週間後に新鮮なmedium ２１１ ＱＲＧに継代培養し、さらに暗所下、２７ないし２８℃にて２週間培養した。ついで、カルスは、２０μＭ硝酸銀、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンおよび７５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含むmedium ２１１に移した。暗所下、２７ないし２８℃にて２−３週間培養した後に、パロモマイシン抵抗性カルスを同定した。当業者は、カルスの継代培養の間の期間が概算であって、より頻繁な間隔、例えば２週間よりも１週間で組織を移すことによって選択プロセスを加速し得ることを認識するであろう。
【０２２３】
植物は、実施例に記載したように、形質転換カルスから再生し、土壌に移し、温室中で生育させた。アグロバクテリウム媒介形質転換後、medium ２１７（実施例９を参照されたい）はさらに５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有し、medium １２７Ｔ（実施例９を参照されたい）はさらに２５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有した。アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて作製した本発明の遺伝子を含む形質転換トウモロコシ植物を表Ｙに要約する。
【０２２４】
実施例２３ マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの方法
マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのほぼ４時間前に、未熟胚をmedium ２１１ＳＶ（１２％までスクロースを添加したmedium ２１１Ｖ）に移した。２５の未熟胚を、胚盤の子葉鞘の末端を２０°の角度で培養培地に僅かに押しつけつつ５×５のグリッドで配置して、好ましくは６０×１５ｍｍペトリ皿に置いた。組織はボンバードメントの前に暗所下で維持した。
【０２２５】
マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの前に、その上に所望のＤＮＡが沈澱する金粒子の懸濁液を調製した。１０ｍｇの０.６μｍ金粒子（BioRad)を５０μＬ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０）に懸濁した。２５μＬの所望のＤＮＡの２.４ｎＭ溶液を金粒子の懸濁液に添加し、約５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬの０.１Ｍスペルミジンを添加し、溶液を約５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬのポリエチレングリコール（分子量３０００−４０００、American Type Culture Collection）の２５％溶液を添加し、溶液を５秒間やさしくボルテックス攪拌した。７５μＬの２.５Ｍ ＣａＣｌ２を添加し、溶液を５秒間やさしくボルテックス攪拌した。ＣａＣｌ２を添加した後に、溶液を室温にて１０ないし１５分間インキュベートした。つづいて、懸濁液を１２,０００ｒｐｍ（Sorval MC-12V遠心分離機）にて２０秒間遠心分離し、上清を捨てた。金粒子／ＤＮＡペレットを１００％エタノールで２回洗浄し、１０ｍＬの１００％エタノールに再懸濁した。金粒子／ＤＮＡ調製物は、２週まで−２０℃にて保存した。
【０２２６】
ＤＮＡは、放電粒子加速遺伝子デリバリーデバイス（米国特許第５,０１５,５８０号）を用いてトウモロコシ細胞に導入した。金粒子／ＤＮＡ懸濁液をＭｙｌａｒシート（Du Pont Mylarポリエステルフィルム タイプＳＭＭＣ２、両方の側にＰＶＤＣコポリマーがコートされており、１の側ではそのうえにアルミニウムがコートされている、１８ｍｍ四方に裁断）上に３１０ないし３２０μＬの金粒子／ＤＮＡ懸濁液を分散させることにより、そのシート上にコートした。金粒子懸濁液を１ないし３分間静置した後に、過剰量のエタノールを除去し、シートを風乾した。トウモロコシ組織のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントは、米国特許第５,０１５,５８０号に記載されているように行った。ＡＣ電圧は、放電粒子デリバリーシステムにおいて変化させ得る。ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａの前培養未熟胚のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントについては、最大電圧の３５％ないし４５％を好ましく使用した。マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント後に、組織は暗所下、２７℃にて培養した。
【０２２７】
実施例２４ 形質転換細胞の選択
形質転換体は、トランスジェニック・ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子の発現に基づいて、パロモマイシンを含む培養培地上で選択した。ＤＮＡデリバリーの２４時間後に、組織は２５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有する２１１Ｖ培地（medium ２１１ＨＶ）に移した。暗所下、２７℃にて３週間インキュベートした後に、組織を５０ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium ２１１（medium ２１１Ｇ）に移した。組織は３週間後に７５ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含有するmedium ２１１（medium ２１１ＸＸ）に移した。形質転換体は、選択の９週間後に単離した。表Ｙは、本明細書に開示したマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの方法を用いた形質転換体実験の結果を開示する。
【０２２８】
実施例２５ 繁殖性トランスジェニック植物の再生
繁殖性トランスジェニック植物は、形質転換したトウモロコシ細胞から作製した。形質転換カルスをmedium ２１７（Ｎ６塩、１ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.５ｍｇ／Ｌナイアシン、３.５２ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０.９１ｍｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン一水和物、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、０.５ｇ／Ｌ ＭＥＳ、１.６ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物、０.６９ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン、２０ｇ／Ｌスクロース、３ｇ／Ｌ ＧＥＲＧＲＯ（登録商標）、ｐＨ５.８）に暗所下、２７℃にて５ないし７日間移した。体細胞胚成熟およびシュート再生はmedium ２１７で開始した。組織は、シュート発達のために、medium １２７Ｔ（ＭＳ塩、０.６５ｍｇ／Ｌナイアシン、０.１２５ｍｇ／Ｌピリドキシン−ＨＣｌ、０.１２５ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣｌ、０.１２５ｍｇ／Ｌ パントテン酸カルシウム、１５０ｍｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、１０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌ Ｌ−マルトース、１００ｍｇ／Ｌパロモマイシン、５.５ｇ ＰＨＹＴＡＧＡＲ（登録商標）、ｐＨ５.８）に移した。
【０２２９】
medium １２７Ｔ上の組織は、４００−６００ルクスの光下、２６℃にて培養した。苗木は、苗木が約３インチの高さで根を有する場合、１２７Ｔ培地に移行した約４ないし６週間後に、土壌、好ましい３インチのポットに移した。植物は生長チャンバー中、２６℃にて２週間維持し、その後、温室生長のために５ガロンのポットに移植する前に温室のミストベンチ上で２週間維持した。植物は温室で成熟するまで生長させ、同系ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａで相互授粉を行った。植物から種子を収集し、さらなる育種活動に使用した。
【０２３０】
実施例２６ 植物からの核酸の単離
核酸はＲ０植物の葉組織から単離し、収集し、９６ウェル収集ボックスで瞬間凍結させ、０ないし２週間後に苗木を土壌に移した。ほぼ１００ｍｇの組織を各植物から収集し、分析まで−８０℃にて保存した。
【０２３１】
ＤＮＡおよびＲＮＡは、修飾を有するQiagen Rneasy ９６（登録商標）キット（Quiagen Inc., Valencia, CA）を用いて単一組織試料から単離した。１００ｍｇの凍結組織を、Bead Beater（登録商標）（Biospec Products, Bartlesville, OK）を用いて、７００μＬのRneasy（登録商標）ＲＴＬ緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）にホモジナイズした。試料は３２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、すべての上清をPromega WIZARD(登録商標）クリーニングプレート（Promega Corpaoration, Madison, WI）のウェルに移した。試料溶液は、クリーニングプレートを通す真空ろ過によって透明化した。透明な上清を核酸抽出に用いた。
【０２３２】
ＤＮＡ抽出については、７０μＬの透明化した試料を、粘着フォイルでカバーしたｖ−ウェルＰＣＲプレートに移し、９５℃まで８分間加熱した。試料は０℃にて５分間インキュベートし、その後に３分間遠心分離して不溶性の物質を除去した。Sephadex G-50ゲルろ過ボックス（Edge Biosystems, Gaithersburg, MO）を２０００ｒｐｍにて２分間調子を整えた。４０μＬの熱処理した上清を各ウェルにロードし、ボックスを２５００ｒｐｍにて２分間遠心した。さらに２０μＬのＴＥ緩衝液をカラム流出液に加え、分析まで試料プレートを−２０℃にて保存した。
【０２３３】
ＲＮＡ抽出のために、５００μＬの透明化した溶液を清潔な９６ウェル試料ボックスに移した。２５０μＬの１００％エタノールを各試料に添加し、試料をよく混合した。ついで、ほぼ７５０μＬのすべての溶液を、Promega WIZARD（登録商標）濾過ユニット中のQiagen Rneasy（登録商標）結合プレートのウェルにロードした。５００μＬのＲＷ１緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）を各ウェルに添加し、緩衝液を真空乾燥によって除去した。８０μＬの無ＲＮＡアーゼＤＮＡアーゼ（Qiagen Inc., Valencia, CA）を各ウェルに添加し、室温にて１５分間インキュベートし、真空濾過によってウェルを通してＤＮＡアーゼ溶液を引き入れた。さらに５００μＬのＲＷ１緩衝液（Qiagen Inc., Valencia, CA）をウェルに添加し、真空濾過によって緩衝液を除去した。試料は５００μＬ ＲＰＥ緩衝液２×（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて真空濾過によってさらに洗浄した。抽出プレートをマイクロタイタープレート上に置き、３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離してフィルター中のいずれの残余ＲＰＥ緩衝液溶液を除去した。８０μｌのＲＮＡ等級の水（無ＤＮＡアーゼ）を各ウェルに添加し、つづいて室温にて２分間インキュベートした。抽出プレートおよびマイクロタイタープレートを３０００ｒｐｍにて３分間遠心分離し、保存したＲＮＡ調製物を−８０℃にて収集プレート中で凍結した。
【０２３４】
実施例２７ コピー数のアッセイ
Ｒ０植物中のトランスジーンのコピー数を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法を用いて決定した。ｐＭＯＮ６５１５４およびｐＲＧ７６ ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーションベクターは、トランスジーン挿入のコピー数をアッセイするのに使用し得たジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３'領域由来の配列を用いて構築した。ｐｉｎＩＩフォワードおよびリバース・プライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'ccccaccctgcaatgtga 3'（配列番号：７７）
リバース・プライマー 5'tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3'（配列番号：７８）
【０２３５】
ｐｉｎＩＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ配列は
5'cctagacttgtccatcttctggattggcca 3'（配列番号：７９）であった。
プローブは蛍光色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で５'末端を標識し、クエンチャー色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルローダミン）をリンカーを介してプローブの３'末端に結合した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブは、Applied Biosystems（Foster City, CA)から得た。 ＳＡＴ、単一コピーのトウモロコシ遺伝子を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイにおける内部対照として使用した。ＳＡＴプライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'gcctgccgcagaccaa 3'（配列番号：８０）：
リバース・プライマー 5'atgcagagctcagcttcatc 3'（配列番号：８１）。
【０２３６】
ＳＡＴ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ配列は
5'tccagtacgtgcagtccctcctcc 3'（配列番号：８２）であり、プローブはその５'末端を蛍光色素ＶＩＣ（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、その３'末端をクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで標識した。
【０２３７】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは製造業者の指示書（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って行った。５ないし１００ｎｇのＤＮＡを各アッセイに用いた。ＰＣＲ増幅およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ検出は、AmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、AmpErase（登録商標）UNG、ｄUTPを含むｄNTP、受動参照１および最適化した緩衝液を含む１×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA）中で行った。８００ｎＭの各フォワードおよびリバースｐｉｎＩＩプライマーおよび１５０ｎＭのｐｉｎＩＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブをＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイにおいて使用した。２００ｎＭの各Ｓａｔフォワードおよびリバース・プライマーならびに１５０ｎＭ Ｓａｔ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数アッセイにおいて使用した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、５０℃にて２分、９５℃にて１０分、その後９５℃にて１５秒および６０℃にて１分間の４０サイクルで行った。リアルタイムＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ蛍光は、ABI Prism 7700 Sequence Detection SystemまたはABI 900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて測定した。ＣＴ値は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット指示マニュアル（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って計算した。△△ＣＴ値は、ＣＴ（内部対照遺伝子（Ｓａｔ））−ＣＴ（トランスジーン）−ＣＴ（非トランスジェニック植物中の内部対照遺伝子（Ｓａｔ））として計算した。コピー数は、表１２の基準に従って以下のように示された。
【０２３８】
【表２１】
【０２３９】
本発明の遺伝子を含む植物は、コピー数についてＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法によって分析する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）およびサザンブロット・ハイブリダイゼーションの両方によって分析した植物の約８０％において、サザンブロット分析がＴＡＱＭＡＮ（登録商標）コピー数の決定を確認した。
【０２４０】
実施例２８ 遺伝子発現のアッセイ
本発明のトランスジーンの発現は、Applied Biosystems（Foster City, CA）からのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。ＲＮＡ発現は、トランスジェニック標準における発現、ｐｉｎＩＩ３'非翻訳領域に作動可能に連結したビー・チューリンジエンシス（B. thuringiensis）ｃｒｙＩＡＩ遺伝子を含むＤＢＴ４１８と命名したトランスジェニック・トウモロコシ事象に対してアッセイした。ＤＢＴ４１８事象は、アワノメイガのごとき鱗翅目昆虫に対する商業レベルの抵抗性を付与するレベルでｃｒｙＩＡＩ遺伝子を発現し、ブランド名ＤＥＫＡＫＢｔ（登録商標）でＤＥＫＡＬＢ Genetics Corporationによって市販されている。ｐＭＯＮ６５１５４およびｐＲＧ７６ ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーションベクターは、デスティネーションベクターに挿入したいずれかのコード配列についてトランスジーン転写レベルをアッセイするために使用し得るジャガイモｐｉｎＩＩ遺伝子の３'領域由来の配列を用いて構築した。ｐｉｎＩＩプライマーおよび以前に記載したプローブを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲに使用した。ユビキチン融合タンパク質（ＵＢＩ）ＲＮＡを、すべてのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける内部対照として使用した。使用したＵＢＩプライマーは以下の通りであった：
フォワード・プライマー 5'cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3'（配列番号：８３）：
リバース・プライマー 5'ccaacaggtgaatgcttgatagg 3'（配列番号：８４）。
【０２４１】
ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブの配列は
5'catgcgccgctttgcttc 3'（配列番号：８５）であった。ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブはその５'末端を蛍光色素ＶＩＣ（登録商標）（Applied Biosystems, Foster City, CA）で、およびその３'末端をクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで標識した。
【０２４２】
逆転写、ＰＣＲ増幅およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プロービングは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）に記載した１工程手法に従って行った。５ないし１００ｎｇの全ＲＮＡを各アッセイに使用した。ＤＢＴ４１８事象からのイン・ビトロ(in vitro)転写された対照ＲＮＡを毎プレート上の対照として含め、０.０１ｐｇないし１０ｐｇの範囲の濃度で行った。ＤＢＴ４１８の葉からの全ＲＮＡおよび非トランスジェニック近交系ＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａからの全ＲＮＡを、各々陽性および陰性対照として行った。ＲＴ−ＰＣＲは、３ｍＭ酢酸マンガン、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＵＴＰ、１００単位のｒＴｔｈ（登録商標）Applied Biosystems, Foster City, CA）ＤＮＡポリメラーゼおよび２５単位のAmpErase UNG（Applied Biosystems, Foster City, CA）を含有するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＥＺ緩衝液（５０ｍＭビシン、１１５ｍＭ酢酸カリウム、０.０１ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｍＭ受動参照１、８％グリセリン、ｐＨ８.２、Applied Biosystems, Foster City, CA）中で行った。ＲＴ−ＰＣＲは以下のように行った：５０℃にて２分、６０℃にて３０分、９５℃にて５分、その後に、９５℃にて２０秒および６０℃にて１分の４０サイクル。４００ｎＭの各フォワードおよびリバース・プライマーをｐｉｎＩＩ配列の増幅に使用し、２００ｎＭのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｐｉｎＩＩプローブを検出に使用した。ＵＢＩ ＲＮＡは４００ｎＭの各フォワードおよびリバース・プライマーを用いて増幅し、２００ｎＭ ＵＢＩ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを検出に使用した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）蛍光は、ABI Prism 7700 Sequence Detection SystemまたはABI 7900HT Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて測定した。本発明のトランスジーンの発現は、ＤＢＴ４１８におけるトランスジーン発現に対して定量化し、ＤＢＴ４１８発現に対するトランスジーン発現の比、すなわち２−（△△ＣＴ）（トランスジーン）／２−（△△ＣＴ）（ＤＢＴ４１８）
として報告する。
【０２４３】
実施例２９ 植物育種
戻し交雑を用いて、出発植物を改良し得る。戻し交雑は、特定の所望の特性を１の源から同系へとまたはその特性を欠いている他の植物へと移行する。これは、例えば、最初に優れた同系繁殖体（Ａ）（反復親）を、問題の特性に関する適当な遺伝子（または複数の遺伝子）、例えば本発明により調製した構築物、を運搬している供与同系繁殖体（非反復親）に交雑することによって成し得る。この交雑の子孫は、最初に非反復親から移行すべき所望の特性について得られた子孫において選択され、ついで選択された子孫を優れた反復親（Ａ）に戻し交配する。所望の特性について選択された５またはそれを超える戻し交雑世代の後、子孫は移行する特性を制御する遺伝子座についてはヘミ接合であるが、大部分またはほぼすべての他の遺伝子については優れた親と同様である。最後の戻し交雑世代は自家受粉させて、移行すべき遺伝子（または複数の遺伝子）について純粋な家系、すなわち１またはそれを超える形質転換事象、である子孫を得る。
【０２４４】
したがって、一連の育種操作を介して、さらなる組換え操作を必要とすることなく、選択したトランスジーンを１の系統から全く異なる系統に動かすことができる。トランスジーンは、それが典型的にはいずれか他の遺伝子と遺伝学的に同様にふるまい、かつ、いずれか他のトウモロコシ遺伝子と同様に育種技術によって操作し得る点において貴重である。したがって、１またはそれを超えるトランスジーンについて真の家系である同系繁殖体植物を作出することができる。異なる同系繁殖体植物を交雑することにより、異なる組合せのトランスジーンを有する多数の異なる雑種を作出することができる。このようにして、雑種（"雑種強勢"）としばしば関連する所望の作物学的性質、ならびに１またはそれを超えるトランスジーンによって付与された所望の特徴を有する植物を作出することができる。
【０２４５】
形質転換植物中の各遺伝子によって付与される表現型の特徴付けのために、本発明の遺伝子をトウモロコシ雑種に遺伝子移入することが望ましい。トランスジーン、好ましくはＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａが導入された宿主遺伝子型は、選りすぐりの同系繁殖体であり、したがって高収量トウモロコシ雑種を作出するためには限られた育種しか必要でない。カルスから再生した形質転換植物は同じ遺伝子型、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ａに交雑する。子孫は２回自家受粉し、トランスジーンについてホモ接合である植物を同定する。ホモ接合トランスジェニック植物は、雑種を作出するために試験交雑親に交雑する。試験交雑親は、トランスジェニック親とは異なる雑種強勢群に属し、かつ、高収量雑種を作出し得ることが知られている、例えばＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＡのＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ ＥまたはＣＯＲＮ ＯＦ ＧＥＲＭＰＬＡＳＭ Ｂのいずれかに対する交雑から生じた、同系繁殖体である。
【０２４６】
実施例３０ 表現型を評価する方法
本発明の遺伝子の発現は、形質転換細胞および植物において本明細書に開示するような種々の表現型に通じる。表現型データは、カルスの形質転換プロセスならびに植物再生の間、ならびに植物および子孫において収集する。表現型データは、形態的外観ならびにカルスの生長、例えばシュートの性質、根の性質、デンプン質、粘液質、非胚形成性、増大した生長速度、低下した生長速度、死滅、に関して形質転換カルスにおいて収集する。当業者は、形質転換カルスにおける他の表現型特徴を認識し得るであろう。
【０２４７】
表現型データは、植物再生のプロセスの間ならびに土壌に移行した再生植物においても収集する。表現型データには、正常植物、潅木植物、幅の狭い葉、縞の入った葉、節のある表現型、アルビノ、アントシアニン産生、バギーウィップ（buggy whipped）（直近に出現した葉が細長く、互いに巻きつく、当該技術分野で知られている現象）または変化した雄穂、雌穂または根のごとき特徴が含まれる。当業者は、形質転換植物における他の表現型特徴を認識し得る。
【０２４８】
広範な種々の表現型を植物育種のプロセスの間に、ならびに同系繁殖体および雑種植物の両方において試験する間にモニターする。例えば、Ｒ０およびＲ１植物（カルスから直接的に再生した植物およびそれら植物の直接の子孫）においては、植物の型（苗木について前記したもののような一般的な形態的特徴）および植物によって産生された穀物の栄養組成を記録する。栄養組成分析にはアミノ酸組成を含めることができ、タンパク質、デンプンおよび油の量、タンパク質、デンプンおよび油の特徴、ファイバー、灰、無機物含量をすべて測定し得る。当業者が穀物の他のコンポーネントの分析を含め得ることは予想される。Ｒ２およびＲ３植物においては、花粉を収めるまでの日、開花するまでの日、植物の型を観察する。さらに、Ｒ２植物の代謝産物調査を行う。当業者に入手可能な方法を用いて、５０ないし１００またはそれを超える代謝産物を植物において分析し、それによって植物の代謝フィンガープリントを確立し得る。また、Ｒ３植物においては、圃場条件下で葉の伸長速度を測定する。種々の表現型を、本発明のトランスジーンを含む雑種においてアッセイする。例えば、収量、水分、試験重量、栄養組成、クロロフィル含量、葉の温度、起立、幼植物の活力、植物の高さ、葉の数、分蘖、支柱根、常緑（stay green）、茎倒伏（stalk lodging）、根倒伏（root lodging）、植物の健康、バレネス（barreness）／多産性、グリーンスナップ（green snap)、害虫抵抗性（疾患、ウイルスおよび昆虫を含む）および代謝プロフィールを記録する。また、雑種から収穫した穀物の表現型特徴を記録し、それには雌穂の列当たりの穀粒の数、雌穂の穀粒の列の数、穀粒の発育停止、穀粒重量、穀粒サイズ、穀粒密度および物理的穀物品質が含まれる。さらに、光合成、葉面積、穀皮構造、穀粒乾燥落下速度（dry down rate）および節間の長さのような特徴を、雑種または同系繁殖体で測定し得る。本発明の遺伝子を発現しているトランスジェニック植物において転写特徴付けを行い得ることは予想される。
【０２４９】
本発明の遺伝子を発現しているトランスジェニック植物における雑種収量を決定するためには、トウモロコシが都合よく生長する地理的場所、例えばアイオワ、イリノイまたは合衆国中西部の他の場所における複数の場所で雑種を試験しなければならないことは認識される。トウモロコシ雑種の改良に寄与するトランスジーンを同定するために１年を超える収量試験が望ましいことは予想される。したがって、トランスジェニック雑種は、最初の年は十分な数の場所で評価して、非トランスジェニック雑種相対物からの少なくともほぼ１０％の収量の差異を同定する。収量試験の２年目は、２の雑種間の４−５％収量の差異を同定することができる十分な場所および十分な反復で行う。さらに、収量試験の２年目においては、雑種を正常な圃場条件下ならびにストレス条件下、例えば水または集団密度ストレスの条件下で評価する。当業者は、所望の比率の精度で２の雑種間で統計学的に有意な収量の差異を検出し得るように収量試行をどのように設計するかを知っている。
【０２５０】
実施例３１ トウモロコシ種子の表面滅菌および吸収
各トランスジェニックロットについて、トウモロコシ種子を５０ｍｌの０.０１％Triton X-100を含有する３０％漂白剤（過酸化水素ナトリウム溶液＝Chloroxまたは等価物）を入れた無菌の５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れ、フラスコをオービタルシェイカーで５分間回転することによってそれらを表面滅菌する。ついで、漂白剤溶液を注ぎ出し、約１００ｍｌの滅菌脱イオン水で洗浄し、水洗浄液を注ぎ出す。無菌水洗浄をさらに４回繰り返し、再度の水洗浄液を種子上に残す。エアバブリング下（０.２μｍフィルターを通す）での吸収のために、種子をこの水の中で、室温にて２４時間インキュベートする。
【０２５１】
Ｉ．ファイトトレイ（Phytotray）中の培地の調製
幾つかのファイトトレイ用の水−寒天培地を調製する。本発明者らは、容器の長い方の深さの側部が底面上にあり、小さい方の側部が蓋として使用されるような逆さにした位置でファイトトレイＩＩ（またはプラスチックボックス：６０×３０×１５ｃｍ）を使用している。脱イオン水中の０.３％BactoAgarを液体サイクル上の４５分間オートクレーブ処理することによって、ファイトトレイ当たり１００ｍｌに対して十分な水−寒天培地を調製する。容易に取扱いし得る程度まで培地を冷却し、溶解したままでファイトトレイ当たりほぼ１００ｍｌを注入する。
【０２５２】
ＩＩ．トウモロコシ低温幼植物活力アッセイ
・培地が固化したら、それと無菌種子を層状流動蓋（laminar flow hood）にする。
・無菌ピンセットを用いて、２０の健全な最も均一な種子を選択し、アッセイに使用する各ファイトトレイに、後に個々の種子を簡単に取り出し得るように均等に種子を離しながら、種子を置く。
・胚の側が下方に斜めに挿入し、種子がちょうど寒天の表面下となるように種子を置く。この位置では、現れるシュートおよび根は束縛されることなる直接的に伸長することができるであろう。
・種子を培地中、２２℃にて１週間または大部分の種子が小根を押出し、寒天から現れ始めるまでインキュベートする。
・層状流動蓋中の１０の最も均一に生長した幼植物を除いてすべてを除去する。
・ファイトトレイを１６時間日照サイクルで１０℃に設定した定温植物生長チャンバーに移し、そこで２週間インキュベートする。
・ファイトトレイを１週間２２℃に戻す。
・幼植物を取り出し、幼植物毎に根の長さおよびシュートの長さを測定し、新鮮重ｇ／３幼植物を測定し、ノートに記録する。
【０２５３】
低温発芽および出現アッセイ
以下の点を除いて前記と同様である：
・Ｉにおける最後の水洗の後に、一晩吸収工程の間にフラスコを１０℃に置く。
・固化した培地と一緒にファイトトレイを１０℃に置く。
・冷却したファイトトレイに低温吸収種子を播種した後に、それを１０℃のチャンバーに直接置く。
・約５日後に、小根がほぼ同じ長さである１０の最も均一に発芽した種子を除いて、すべてを除去する。ファイトトレイを１−２週間１０℃のチャンバーに戻す。幼植物を取り出し、各々の幼植物について根の長さおよびシュートの長さを測定し、３の幼植物ごとに新鮮重を測定し、ノートに記録する。
・第２のセットのファイトトレイを２２℃に１週間移す。
【０２５４】
幼植物を取り出し、各幼植物について根の長さおよびシュートの長さを測定し、ノートに記録する。
【０２５５】
実施例３１．ダイズ形質転換用のプラスミドの作製
実施例（ＣｓｐＡおよびＢ構築物−ｐＭＯＮ７３９８３および７３９８４）
ｐＭＯＮ７３９８３（図１８）は、アグロバクテリウム媒介形質転換およびダイズにおけるバチルス・ズブチリスＣｓｐＡのようなタンパク質（配列番号：１）を構成的に発現するためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＡ遺伝子をクローニングするためには、２の遺伝子特異的プライマーＭＳＡ４５２およびＭＳ４５３を、National Institute of Health (ＮＣＢＩ）の一部であるNational Library of Medicineの一部であるNational Center for Biotechnology InformationからのＣｓｐＡ配列の情報（Genbank＃ Ｍ３０１３９）に基づいて設計した。ＭＳＡ４５２の配列は：
ＣｓｐＡの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを５'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG（配列番号：８６）であり、一方、ＭＳＡ４５３の配列は：
ＣｓｐＡの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC（配列番号：８７）である。リバース・プライマーＭＳＡ４５３はGenbank遺伝子配列の３'末端にマッチするように設計した。ＰＣＲ反応はプライマーＭＳＡ４５２およびＭＳＡ４５３、High Fidelity Taqポリメラーゼ（BRL)およびｐＭＯＮ５７３９７（図３）を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子ＣｓｐＡの３'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡをゲル電気泳動によって精製し、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリＴｏｐ１０細胞（Invitrogen）に形質転換した。４の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep ＤＮＡを調製した。Ｍ１３−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをｐＭＯＮ７３９８１と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
【０２５６】
ｐＭＯＮ７３８８１ ＤＮＡをStuIおよびBamHIで消化して、ＣｓｐＡ遺伝子フラグメントを単離した。ｐＭＯＮ７３９８０ ＤＮＡを順次StuIおよびBamHIで消化し、ついでGene Clean IIキットによって精製した。ＣｓｐＢフラグメントおよびこの精製したベクターｐＭＯＮ７３９８０を連結し、連結反応物をイー・コリＤＨ１０Ｂ細胞に電気的に形質転換した。形質転換体はスペクチノマイシン含有培地で選択した。miniprep ＤＮＡを形質転換体から調製し、ＣａＭＶ ３５Ｓ−プロモーター特異的フォワード・プライマーを用いることによってインサートの存在についてＤＮＡをチェックした。このインサートを含むクローンをｐＭＯＮ７３９８３と命名した。より大きなＤＮＡ prepを作製し、BglII、EcoRI、PstI、EcoRI＋BamHI、StuI＋XhoIを含む一連の確認消化を行った。これらは、正確なクローニングを確認した。
【０２５７】
ｐＭＯＮ７３９８４は、アラビドプシスにおいて、アグロバクテリウム媒介形質転換およびバチルス・ズブチリスＣｓｐＢのようなタンパク質（配列番号：２）の構成的発現のためのバイナリーベクターである。ビー・ズブチリスＣｓｐＢ遺伝子をクローニングするために、２の遺伝子特異的プライマー、ＭＳＡ４５４およびＭＳＡ４５５を、National Institute of Health (ＮＣＢＩ）の一部であるNational Library of Medicineの一部であるNational Center for Biotechnology InformationからのＣｓｐＢ配列の情報（GenBank＃ Ｘ５９７１５）に基づいて設計した。ＭＳＡ４５４の配列は：
ＣｓｐＢの翻訳開始サイトにアニールし、StuIおよびBglIIサイトを５'末端に導入する
GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG（配列番号：８８）であり、一方、ＭＳＡ４５５の配列は：
ＣｓｐＢの最後のコドンにアニールし、プライマーの末端にBamHIおよびEcoRIサイトを導入する
CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG（配列番号：８９）である。リバース・プライマーＭＳＡ４５５はGenBank遺伝子配列の３'末端にマッチするように設計した。ＰＣＲ反応はプライマーＭＳＡ４５４およびＭＳＡ４５５、High Fidelity Taqポリメラーゼ（BRL)およびｐＭＯＮ５７３９９を鋳型として使用して行った。この鋳型は遺伝子ＣｓｐＢの３'末端で、GenBank配列のものとは異なる。増幅したＣｓｐＢ ＤＮＡをゲル電気泳動によって精製し、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）に連結した。連結反応物を、製造業者のプロトコールに従ってイー・コリＴｏｐ１０細胞（Invitrogen）に形質転換した。４の形質転換体コロニーを取り、Qiagen Miniprepキットを用いてminiprep ＤＮＡを調製した。Ｍ１３−特異的フォワードおよびリバース・プライマーを用いてインサートを配列決定した。正確な配列を有するクローンをｐＭＯＮ７３９８２と命名し、さらなるサブクローニングに使用した。
【０２５８】
ｐＭＯＮ７３８８２ ＤＮＡをStuIおよびBamHIで消化して、ＣｓｐＢ遺伝子フラグメントを単離した。ｐＭＯＮ７３９８０ ＤＮＡを順次StuIおよびBamHIで消化し、ついでGene Clean IIキットによって精製した。ＣｓｐＢフラグメントおよびこの精製したベクターｐＭＯＮ７３９８０を連結し、連結反応物をイー・コリＤＨ１０Ｂ細胞に電気的に形質転換した。形質転換体はスペクチノマイシン含有培地で選択した。miniprep ＤＮＡを形質転換体から調製し、ＣａＭＶ ３５Ｓ−プロモーター特異的フォワード・プライマーを用いることによってインサートの存在についてＤＮＡをチェックした。このインサートを含むクローンをｐＭＯＮ７３９８４と命名した。より大きなＤＮＡ prepを作製し、BglII、EcoRI、PstI、EcoRI＋BamHI、StuI＋XhoIを含む一連の確認消化を行った。これらは、クローニングが正確であることを確認した。
【０２５９】
ゲノムに前記のｐＭＯＮ構築物を安定して組み込んだ形質転換を介してダイズ植物を作製した。
【０２６０】
実施例３２
前記実施例１０および１１からのＤＮＡ構築物で形質転換したトウモロコシ植物を実験した。
温室
・渇水耐性について１は１０のｃｓｐＡ事象を試験し、１は１０のｃｓｐＢ事象を試験する２の実験を行った。
・各事象からの２４のトランスジーン陽性および２４のトランスジーン陰性ハイブリッド幼植物を試験した（すべて、分離したハイブリッドの雌穂に由来する種子）。
・試験は温室のベンチ上で行った。
・処理は水を差し控えることおよび植物を含有する各ポットの総ポット重量をモニターすることからなる。完全に給水したポットは各々約１０００ｇと秤量され、各ポットの重量が４００ｇに達するまで水を差し控え、ついで処理の残りの期間はポットをその重量で維持した。
・処理の全体を通して、ポットの土壌の表面から"最も高い"葉の先端までの距離を測定することによって植物の高さを決定した。これらの測定から、測定の間の間隔における高さを比較することによって、ＬＥＲ（leaf extension rates、葉伸長速度）を決定した。
・渇水の間のＬＥＲ比較は、事象内のトランスジーン陰性およびトランスジーン陽性植物の間で作成した。
・試験した１０の事象のうちの３については、ｃｓｐＡトランスジェニック植物は処理の間にＬＥＲについて有意に（ｐ＜０.１０)改善された。
・試験した１０の事象のうちの３については、ｃｓｐＢトランスジェニック植物は処理の間にＬＥＲについて有意に（ｐ＜０.１０)改善された。
【０２６１】
圃場効率
・ハイブリッド種子を用いて３の実験を行った。生長の後期生長期の渇水耐性について、１は１６のｃｓｐＢ事象（ＣＡ）を試験し；１は２１のｃｓｐＢ事象（ＫＳ）を試験し；１は１４のｃｓｐＡ事象（ＨＩ）を試験した。
・ＣＡおよびＨＩ試行については、トランスジーンの存在について分離している〜３４の植物を含む列が各々６および４の反復で存在した。分離している列は、分離している雌穂から由来した。
・ＫＳ実験については、列は６の反復でもって、トランスジェニックおよび非トランスジェニックの対を形成をする列として〜３４の植物を含ませた。
・処理は、生長の後期生長期の間にほぼ１０日水を差し控える（生存植物を維持するために必要な少量の水を与えつつ）ことからなった。１０日の終期において、植物は収穫までよく潅漑した。
・処理の全体を通して、ＬＥＲ、クロロフィル（ＳＰＡＤメーターによって）および光合成率を含む多くの表現型を測定した。処理の後には、花粉を収めるまでおよびトウモロコシの毛（silk）が出現するまでの日数、ならびに穀粒／雌穂のごとき雌穂コンポーネント、穀粒を有する雌穂、穀粒重量および収量：を含む測定したさらなる表現型を含めた。
・事象内および構築物を横切って、トランスジーン陽性および陰性植物の間で表現型比較を作成した。
・ＣＡ試行、（栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"６の事象を横切る）構築物としてｃｓｐＢにおいては、トランスジーン陽性植物は渇水処理の間または後にＬＥＲ、葉の温度、および穀粒／雌穂ｃｓｐＢについて有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
・ＣＡ試行において、個々の事象は、渇水処理の間または後のＬＥＲ、平均雌穂長、穀粒体積／雌穂、気孔コンダクタンス、および開花までの日数について有意に（ｐ＜０.１０）改善されたいた。
・ＫＳ試行、（栄養繁殖特性についてはすべての事象を横切り、生殖特性については"最良の"６の事象を横切る）構築物としてｃｓｐＢにおいて、トランスジーン陽性植物は、ＬＥＲ、穀粒を結んでいる雌穂／列、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および収量について有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
・ＫＳ試行において、個々の事象は、ＬＥＲ、光合成率、気孔コンダクタンス、雌穂／列、および穀粒／植物について有意に（ｐ＜０.１０）改善されたいた。
・ＨＩ試行において、３の事象は、ＬＥＲ（クロロフィル含量はＨＩにおいて測定した唯一の他の表現型であった）について有意に（ｐ＜０.１０）改善されていた。
【０２６２】
ＣＡおよびＫＳ結果の要約：
ｃｓｐＢ−ＫＳサイト圃場効率結果の概要
１．植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
２．水を制限した処理、測定したすべての表現型、特にＬＥＲ、クロロフィルおよび光合成率に対して
３．栄養繁殖および生殖表現型に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
４．ＬＥＲ、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、雌穂／区画、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および概算収量を含む１またはそれを超える事象が統計学的に改善された。
５．乾燥処理におけるＬＥＲ、雌穂／区画、穀粒／雌穂、穀粒／植物、殻重量および概算収量について、ならびに湿潤処理におけるＬＥＲについて、構築物レベルの統計学的改善がｐ＜０.１０で観察された。
【０２６３】
【表２２】
【０２６４】
ｃｓｐＢ−ＣＳサイトについての圃場効率の概要（フォント変化）
１．植物を植えるおよびサンプリングする圃場設計、サイト均一性および完成は、有益なデータセットを生成することができる高品質な実験ですべて一致した。
２．水を制限した処理は、測定したすべての栄養繁殖表現型、詳細にはＬＥＲ、クロロフィルおよび光合成率に処理の影響を生じるが、すべての生殖表現型に処理の影響が生じないように適用した。
３．関心のある表現型（栄養繁殖）に対する処理の影響は、統計学的に真正であるのに十分であり、統計学的に有意なレベルで観察されるトランスジーン媒介改善を許容するのに十分であった。
４．ＬＥＲ、クロロフィル、光合成率、気孔コンダクタンス、葉の温度、花粉を収めるまでの日数、開花までの日数、開花−トウモロコシの毛が出現する間隔、穀粒／雌穂、平均雌穂長、および穀粒体積／雌穂について、１またはそれを超える事象がトランスジーンを含む植物において統計学的に改善された。
５．乾燥処理におけるＬＥＲ、葉の温度、および花粉を収めるまでの日数、および湿潤処理におけるＡＳＩについては、構築物レベルの有意な改善が観察された。
【０２６５】
【表２３】
【０２６６】
これらの事象の多くを、低温発芽効率における改善および低温条件下の幼植物生長についてつづいて試験し、効果を生じることは証明されなかった。したがって、このプロモーターによって駆動されるこれらの遺伝子は、低温発芽または低温条件下での幼植物生長の改善についてはトウモロコシにおいて機能しないようであったが、同じ遺伝子を駆動する異なるプロモーター、または異なる低温ショックタンパク質は、トウモロコシにおいてこれらの表現型を改善するために機能し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５'から３'の方向で
ａ）植物中で機能し、かつ、下記の第２のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のＤＮＡポリヌクレオチド；
ｂ）下記の３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結された、配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチド；および
ｃ）ポリアデニル化配列として機能する３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
プロモーターが、誘導性プロモーター（inducible promoter）、構成的プロモーター（constitutive promoter）、時期調節型プロモーター（temporal-regulated promoter）、発生段階調節型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、組織優先型プロモーター（tissue-preferred promoter）、低温亢進型プロモーター（cold enhanced promoter）、低温特異的プロモーター（cold-specific promoter）、ストレス亢進型プロモーター（stress enhanced promoter）、ストレス特異的プロモーター（stress specific promoter）、渇水誘導性プロモーター（drought inducible promoter）、水分欠乏誘導性プロモーター（water deficit inducible promoter）および組織特異的プロモーター（tissue-specific promoter）よりなる群から選択される、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
該低温ショックタンパク質の発現が植物に渇水耐性を付与する、請求項１記載の組換えＤＮＡが植物の細胞のゲノムに挿入されている植物。
【請求項４】
単子葉植物である請求項３記載の植物。
【請求項５】
双子葉植物である請求項３記載の植物。
【請求項６】
植物が、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、イネ、ワタ、オオムギ、エンバク、シバ、ワタおよびコムギよりなる群から選択される請求項３記載の植物。
【請求項７】
請求項３記載の植物の伝播体。
【請求項８】
請求項３記載の植物の子孫。
【請求項９】
細胞のゲノムに組換えＤＮＡが挿入されている植物細胞であって、該組換えＤＮＡは配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードし、該タンパク質の発現が該植物細胞に水欠乏耐性を付与する該植物細胞。
【請求項１０】
渇水耐性を有するトランスジェニック植物の作物を作製するために使用することができる、配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する細菌低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡを含むトランスジェニック種子を生産する方法であって：
（ａ）低温ショックドメインを含むタンパク質をコードする組換えＤＮＡを含む第１の植物を選択し；
（ｂ）該組換えＤＮＡを第２の植物に遺伝子移入し；
（ｃ）第２の植物からの種子を生長させて植物の集団を作り；
（ｄ）渇水耐性を示す植物について植物の集団をスクリーニングし；
（ｅ）該集団から、渇水耐性を示す１またはそれを超える植物を選択し；
（ｆ）該組換えＤＮＡが該選択した植物に安定して組み込まれていることを証明し；
（ｇ）選択した植物が低温ショックドメインを含むタンパク質を発現しているかを判定し；ついで
（ｈ）選択した植物から種子を収集する
ことを含む該方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡがホモ接合体である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
土壌に植物の種子を植栽してそれを生育させることによる、種子を生成するために植物を繁殖させる方法であって、該植物は配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡがその細胞のゲノムに挿入されており、ここに該タンパク質の発現が該植物に渇水耐性を付与する該方法。
【請求項１３】
配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡが植物のゲノムに挿入されているトランスジェニック植物を生育させることを含む、水が生長を限定する場合の条件下で圃場作物を作出する方法であって、生長の後期栄養繁殖期の間は水を差し控えることを特徴とする該方法。
【請求項１４】
配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質。
【請求項１】
５'から３'の方向で
ａ）植物中で機能し、かつ、下記の第２のＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のＤＮＡポリヌクレオチド；
ｂ）下記の３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチドに作動可能に連結された、配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする第２のＤＮＡポリヌクレオチド；および
ｃ）ポリアデニル化配列として機能する３'転写終結ＤＮＡポリヌクレオチド、
を含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
プロモーターが、誘導性プロモーター（inducible promoter）、構成的プロモーター（constitutive promoter）、時期調節型プロモーター（temporal-regulated promoter）、発生段階調節型プロモーター（developmentally-regulated promoter）、組織優先型プロモーター（tissue-preferred promoter）、低温亢進型プロモーター（cold enhanced promoter）、低温特異的プロモーター（cold-specific promoter）、ストレス亢進型プロモーター（stress enhanced promoter）、ストレス特異的プロモーター（stress specific promoter）、渇水誘導性プロモーター（drought inducible promoter）、水分欠乏誘導性プロモーター（water deficit inducible promoter）および組織特異的プロモーター（tissue-specific promoter）よりなる群から選択される、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
該低温ショックタンパク質の発現が植物に渇水耐性を付与する、請求項１記載の組換えＤＮＡが植物の細胞のゲノムに挿入されている植物。
【請求項４】
単子葉植物である請求項３記載の植物。
【請求項５】
双子葉植物である請求項３記載の植物。
【請求項６】
植物が、ダイズ、トウモロコシ、キャノーラ、イネ、ワタ、オオムギ、エンバク、シバ、ワタおよびコムギよりなる群から選択される請求項３記載の植物。
【請求項７】
請求項３記載の植物の伝播体。
【請求項８】
請求項３記載の植物の子孫。
【請求項９】
細胞のゲノムに組換えＤＮＡが挿入されている植物細胞であって、該組換えＤＮＡは配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードし、該タンパク質の発現が該植物細胞に水欠乏耐性を付与する該植物細胞。
【請求項１０】
渇水耐性を有するトランスジェニック植物の作物を作製するために使用することができる、配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する細菌低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡを含むトランスジェニック種子を生産する方法であって：
（ａ）低温ショックドメインを含むタンパク質をコードする組換えＤＮＡを含む第１の植物を選択し；
（ｂ）該組換えＤＮＡを第２の植物に遺伝子移入し；
（ｃ）第２の植物からの種子を生長させて植物の集団を作り；
（ｄ）渇水耐性を示す植物について植物の集団をスクリーニングし；
（ｅ）該集団から、渇水耐性を示す１またはそれを超える植物を選択し；
（ｆ）該組換えＤＮＡが該選択した植物に安定して組み込まれていることを証明し；
（ｇ）選択した植物が低温ショックドメインを含むタンパク質を発現しているかを判定し；ついで
（ｈ）選択した植物から種子を収集する
ことを含む該方法。
【請求項１１】
組換えＤＮＡがホモ接合体である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
土壌に植物の種子を植栽してそれを生育させることによる、種子を生成するために植物を繁殖させる方法であって、該植物は配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡがその細胞のゲノムに挿入されており、ここに該タンパク質の発現が該植物に渇水耐性を付与する該方法。
【請求項１３】
配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する低温ショックタンパク質をコードする組換えＤＮＡが植物のゲノムに挿入されているトランスジェニック植物を生育させることを含む、水が生長を限定する場合の条件下で圃場作物を作出する方法であって、生長の後期栄養繁殖期の間は水を差し控えることを特徴とする該方法。
【請求項１４】
配列番号:６３または配列番号:６５のアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１１−１２５３４０（Ｐ２０１１−１２５３４０Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２８８２０５（Ｐ２０１０−２８８２０５）
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００６−５３４０３０（Ｐ２００６−５３４０３０）の分割
【原出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８８２０５（Ｐ２０１０−２８８２０５）
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００６−５３４０３０（Ｐ２００６−５３４０３０）の分割
【原出願日】平成１６年９月２９日（２００４．９．２９）
【出願人】（５０１２３１６１３）モンサント テクノロジー エルエルシー (71)
【Ｆターム（参考）】
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