樹状細胞アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ−ＡＳＧＰＲ）を介して抗原提示細胞に結合する作用物質
本発明は、例えば、ＤＣ及び他の細胞を活性化できる抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体を作製及び使用するための組成物及び方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、樹状細胞アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ−ＡＳＧＰＲ、dendritic cell asialoglycoprotein receptor）を介して抗原提示細胞に結合する作用物質の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を、抗原提示との関連で説明する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性の細胞間シグナルを提供し、その後病原体を認識することにより、自然免疫及び獲得免疫の橋渡しを制御するのに極めて重要な役割を果たす。ＤＣのこれらの機能は、トール様受容体（ＴＬＲ、toll-like receptor）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ、lectin-like receptor）により最も顕著に代表される「パターン認識受容体」（ＰＲＲ、pattern recognition receptor）である特化した表面受容体の発現に大きく依存する（C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)、E. Pyz, A. S. Marshall, S. Gordon, G. D. Brown, Ann Med 38, 242 (2006)、G. D. Brown, Nat Rev Immunol 6, 33 (Jan, 2006)）。
【０００４】
現在の理論的枠組において、ＴＬＲの主要な役割とは、免疫応答を開始するために、インターロイキン１２（ＩＬ−１２、interleukin 12）及び他の炎症性サイトカインを産生するようにＤＣに警告することである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉及び取り込み機序の構成要素として作用する（C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)）。しかしながら、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞遊走（T. B. Geijtenbeek et al., Nat Immunol 1, 353 (Oct, 2000)）、細胞間相互作用（T. B. Geijtenbeek et al., Cell 100, 575 (Mar 3, 2000)）を含む幅広い範囲の生物学的機能を有し得る。ＬＬＲのこれらの多機能性は、ＬＬＲがＴＬＲとは異なり、自己及び非自己の両方を認識できるという事実に起因し得る。しかしながら、多数のＬＬＲが免疫細胞中で発現されるという重複性を含むＬＬＲの複雑性は、個々のＬＬＲの詳細な機能を理解するための主要な障害の１つである。加えて、これらの受容体のほとんどに対する天然リガンドは、未同定のままである。にもかかわらず、最近の研究からの証拠は、ＬＬＲが、ＴＬＲと連携して微生物感染中の免疫細胞の活性化に寄与できることを示唆している（C. F. d'Ostiani et al., J Exp Med 191, 1661 (May 15, 2000)、C. Fradin, D. Poulain, T. Jouault, Infect Immun 68, 4391 (Aug, 2000)、A. Cambi et al., Eur J Immunol 33, 532 (Feb, 2003)、M. G. Netea, J. W. Meer, I. Verschueren, B. J. Kullberg, Eur J Immunol 32, 1455 (May, 2002)、S. J. Lee et al., Science 295, 1898 (Mar 8, 2002)、N. Maeda et al., J Biol Chem 278, 5513 (Feb 21, 2003)、L. Tailleux et al., J Exp Med 197, 121 (Jan 6, 2003)、T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)、A. M. Cooper et al., J Immunol 168, 1322 (Feb 1, 2002)）。
【０００５】
Valladeauら（The Journal of Immunology, 2001, 167: 5767-5774）は、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体と関連する未成熟なヒト樹状細胞上の新規なＬＬＲ受容体を記述しており、それが効率的にエンドサイトーシスを媒介することを実証した。ＤＣ−ＡＳＧＰＲのｍＲＮＡは、免疫組織で、ＤＣ及び顆粒球で主に認められたが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、又は単球では認められなかった。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ種は、ＣＤ３４由来の先駆細胞から得られたＣＤ１４由来のＤＣに限定されており、ＣＤ１ａ由来のサブセットには存在しなかった。単球由来のＤＣ及び扁桃間質型ＤＣの両方は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲタンパク質を発現したが、ランゲルハンス型細胞は発現しなかった。さらに、ＣＤ４０活性化の際に発現が失われたため、ＤＣ−ＡＳＧＰＲは未成熟の特徴であった。細胞質内ドメインにおけるチロシンに基づくモチーフ及びジロイシンモチーフの存在と合致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂは、３７℃でＤＣにより急速に内部移行された。最後に、細胞内ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、初期エンドソームに局在化されており、受容体がリガンドの内部移行後に細胞表面へと再利用されることが示唆された。これらの知見により、未成熟なＤＣの特徴として及びＤＣの特化したＡｇ捕捉機能に重要な別のレクチンとして、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ／ヒトマクロファージレクチンが同定された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)
【非特許文献２】E. Pyz, A. S. Marshall, S. Gordon, G. D. Brown, Ann Med 38, 242 (2006)
【非特許文献３】G. D. Brown, Nat Rev Immunol 6, 33 (Jan, 2006)
【非特許文献４】T. B. Geijtenbeek et al., Nat Immunol 1, 353 (Oct, 2000)
【非特許文献５】T. B. Geijtenbeek et al., Cell 100, 575 (Mar 3, 2000)
【非特許文献６】C. F. d'Ostiani et al., J Exp Med 191, 1661 (May 15, 2000)
【非特許文献７】C. Fradin, D. Poulain, T. Jouault, Infect Immun 68, 4391 (Aug, 2000)
【非特許文献８】A. Cambi et al., Eur J Immunol 33, 532 (Feb, 2003)
【非特許文献９】M. G. Netea, J. W. Meer, I. Verschueren, B. J. Kullberg, Eur J Immunol 32, 1455 (May, 2002)
【非特許文献１０】S. J. Lee et al., Science 295, 1898 (Mar 8, 2002)
【非特許文献１１】N. Maeda et al., J Biol Chem 278, 5513 (Feb 21, 2003)
【非特許文献１２】L. Tailleux et al., J Exp Med 197, 121 (Jan 6, 2003)
【非特許文献１３】T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)
【非特許文献１４】A. M. Cooper et al., J Immunol 168, 1322 (Feb 1, 2002)
【非特許文献１５】Valladeau et al., The Journal of Immunology, 2001, 167: 5767-5774
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、代用抗原のヒトＤＣへの内部移行を指示できることが知られているが、本発明は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの新規な生物学的活性を使用し、ある場合には抗原取り込み（例えばワクチン接種）との関連で、他の場合には、ＤＣ、Ｂ細胞、及び単球上のこの受容体を介するシグナル伝達を誘発可能なＤＣ−ＡＳＧＰＲエフェクターの固有の作用を介して（単独で又は他の免疫調節分子と協調して）、免疫系において特に望ましい変化を生じさせる。本発明の開示は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する細胞を活性化することが可能である固有な作用物質を開発する手段と共に、これらのシグナルを受容する細胞にその結果生じる変化の効果が、免疫系の他の細胞に対する作用に関係することを明らかにする。これらの効果は（単独で、又は他のシグナルと協調して（つまり共刺激）のいずれかで）、ある種の疾患状態の治療結果を、又はワクチン接種との関連においては防御的結果の増強を高度に予測する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗体−抗原複合体を形成する標的作用物質が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製することにより、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法を含み、この作用物質は、例えば抗体−作用物質複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される。一実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞であり、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片はコヘリン／ドックリン（Coherin/Dockerin）対の半分に結合している。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片はコヘリン／ドックリン対の半分にも結合でき、抗原はコヘリン／ドックリン対の相補的な半分に結合して、複合体を形成する。作用物質の非限定的な例には、１又は複数のペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、及びそれらの組合せが含まれる。
【０００９】
作用物質は、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ、transforming growth factor）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、platelet derived growth factor）、上皮成長因子（ＥＧＦ、epidermal growth factor）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ、connective tissue activated peptide）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片、及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリトロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）；骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合性成長因子（繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、insulin-like growth factor））；インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）；増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインであり得る。別の実施形態では、作用物質は、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質である抗原を含む。
【００１０】
本発明は、樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させるための組成物及び方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を結合するステップを含み、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される組成物及び方法も含む。別の実施形態は、防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用である。皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用；同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用、又は組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【００１１】
別の実施形態は、患者の樹状細胞を単離するステップ；活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に樹状細胞を曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を患者へ再導入するステップによって、樹状細胞の有効性を増大させる方法を含む。抗原は、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質であり得る。本発明は、哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリン又はその一部、及び免疫グロブリンに結合した抗原も含む。免疫グロブリンは、コヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合し、又はモジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分、若しくは抗原との融合タンパク質であるコヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分を含んでもよい。抗原特異的ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びにＦｃドメインの一部を有するＦａｂｃ断片及び／又はＦａｂ断片であり得る。抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリンは毒素に結合してもよく、ここで毒素は、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン（seguitoxin）、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン（cyanoginosin）、α菌毒、テトロドトキシン、アコノトキシン（aconotoxin）、ヘビ毒、及びクモ毒からなる群から選択される。抗原は、免疫グロブリンとの融合タンパク質でもよく、又はそれと共有結合若しくは非共有結合で化学的に結合したものでもよい。
【００１２】
本発明は、患者の樹状細胞を単離するステップ、活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に樹状細胞を曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を患者へ再導入するステップにより、樹状細胞の有効性を増大させるための組成物及び方法も含む。作用物質を使用して、治療的又は防御的適用で、単独で又は共活性化作用物質と共にＤＣ−ＡＳＧＰＲと結合して抗原提示細胞を活性化し、防御的又は治療的ワクチン接種のために、抗原に連結されたＤＣ−ＡＳＧＰＲ及び／又は活性化作用物質を単独で又は共活性化作用物質と共に結合することができる。別の使用は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介した免疫細胞の不適切な活性化から生じることが知られている又は疑われている疾患と関連した治療目的のために毒性作用物質に連結された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ作用物質、及び抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を有し、その抗原が抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシングされ提示されるワクチンとして使用するために、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合及び活性化することが可能な特異的抗体Ｖ領域配列を開発することである。
【００１３】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、添付された図と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−１Ｅ】レクチン様受容体ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介するシグナル伝達がＤＣを活性化し、その結果、サイトカイン及びケモカインだけでなく共刺激分子のレベルが増大することを実証する図である。図１Ａは、３日間及び６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで、その後マウスモノクローナル抗ヒトＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体で染色したことを示す。図１Ｂは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂ（１〜２ｕｇ／ｍｌ）でコーティングされたプレートで、１６〜１８時間培養したことを示す。細胞は、蛍光染料で標識された抗ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。ヒストグラム中の白色バー及び黒色バーは、それぞれアイソタイプ対照ｍＡｂ及び抗レクチンｍＡｂで活性化された細胞を表す。図１Ｃは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１２時間培養し、方法の項で説明したように、ＲＮＡ単離及びAffymetrix社製Gene Chip解析に供したことを示す。抗レクチンｍＡｂによる遺伝子発現の倍増を、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣにおける遺伝子発現レベルと比較した。図１Ｄは、図１Ｂで示された実験に由来する培養上清中のサイトカイン及びケモカインを、Luminexにより測定したことを示す。図１Ｅは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１６〜１８時間培養し、その後抗ＣＤ８３抗体で染色したことを示す。図１Ｅで示された実験に由来する培養上清中のサイトカイン及びケモカインを、Luminexにより測定した。示された結果は、異なる正常供与体に由来する細胞を使用した３回の独立した実験を表す。
【図２Ａ−２Ｄ】ＤＣ上に発現したＤＣ−ＡＳＧＰＲが、体液性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。５×１０３個／ウェルの６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂでコーティングされた９６ウェルプレートで１６〜１８時間インキュベートし、その後ＣＦＳＥで染色された１×１０５個の自己ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、２０単位／ｍｌのＩＬ−２及び５０ｎＭのＣｐＧの存在下で共培養した。図２Ａは、蛍光性標識抗体で染色された６日目の細胞のＦＡＣＳである。ＣＤ３＋及び７−ＡＡＤ＋細胞はゲートをかけて除外した。ＦＡＣＳソーターによりＣＤ３８＋及びＣＦＳＥ−細胞を精製し、ギムザ染色を実施した。図２Ｂは、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＭについて、１３日目の培養上清をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析したことを示す。図１Ｃは、５感染多重度（ｍｏｉ、multiplicity of infection）の加熱不活性化インフルエンザウィルス（ＰＲ８）でＤＣをパルスし、Ｂ細胞と共に培養したことを示す。１３日目に、インフルエンザ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）について培養上清を分析した。図１Ｄは、細胞表面ＡＰＲＩＬの発現については、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂで培養されたＤＣを染色し、可溶性ＡＰＲＩＬについては、上清をアッセイしたことを示す。
【図３Ａ−３Ｄ】Ｂ細胞上におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの細胞表面発現が、Ｂ細胞活性化及び免疫グロブリン産生に寄与することを示す図である。図３Ａは、バフィーコートに由来するＰＢＭＣを、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３、及び抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲｍＡｂ又は対照ｍＡｂで染色したことを示す。ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋細胞にゲートをかけ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞上の分子の発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。図３Ｂは、バフィーコートに由来するＣＤ１９＋細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１２時間培養し、方法の項で説明したように、ＲＮＡ単離及びAffymetrix社製Gene Chip解析に供したことを示す。抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂによる遺伝子発現の倍増を、対照ｍＡｂで刺激されたＣＤ１９＋Ｂ細胞における遺伝子発現レベルと比較した。図３Ｃは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１６〜１８時間培養し、その後サイトカイン及びケモカインについて、培養上清をLuminexにより分析したことを示す。図３Ｄは、１×１０５個のＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１３日間培養したことを示す。全Ｉｇレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、３つの異なる正常供与体に由来する細胞を使用した２回の繰り返し実験を表す。
【図４Ａ−４Ｄ】精製された同種異系Ｔ細胞の増殖が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで刺激されたＤＣにより著しく増強されたことを示す図である。
【図５】ある種の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂがＤＣを活性化できることを示す図である。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４。１２種の純粋な抗ＡＳＧＰＲ ｍＡｂパネルの１つと共に、ＤＣを２４時間インキュベートした。その後、細胞表面ＣＤ８６（ＤＣ活性化マーカー）の発現については細胞を試験し、分泌されたサイトカインについては上清をアッセイした。抗ＡＳＧＰＲ ｍＡｂパネルからの３種のｍＡｂ（３６、３８、４３）が、ＤＣを活性化した。
【図６】異なる抗原がＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂと関連して発現され得ることを示す図である。そのような抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質を、任意のコヒーシン．融合タンパク質と単に混合して、ｒＡｂ．融合タンパク質と全く同様に機能する、安定した非共有結合性［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体を構築することができる。
【図７】ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮａ ＤＣ（５，０００個／ウェル）を、１０ｎＭ又は１ｎＭの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１、又はｈＩｇＧ４．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１複合体で負荷した。６時間後、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（２００，０００個／ウェル）を培養液に添加した。８日目に、ＨＬＡ−Ａ２０１免疫優性ペプチドに特異的なＴＣＲを保持する細胞の増殖について、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。内部の囲みは、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図８】様々な抗体とサルＡＳＧＰＲとの交差反応性を実証した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の種々の実施形態の作製及び使用について以下に詳細に論じるが、本発明は、多様な特定の場面で具体化できる多数の適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書で論じる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するに過ぎず、本発明の範囲の境界を定めるものではない。
【００１６】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関係する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単一の実体のみを指すのではなく、その特定の例を例示で使用できる一般的な種類を含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記述するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で大要を記載しているのを除いて、本発明の境界を定めるものではない。
【００１７】
樹状細胞（ＤＣ、dendritic cell）は、抗原特異的免疫の調節に重要な役割を果たす抗原提示細胞である（Mellman and Steinman 2001）、（J. Banchereau et al., Annu Rev Immunol 18, 767 (2000))、（Cella, Sallusto et al. 1997）。ＤＣは、抗原を捕捉し、それらをペプチドへとプロセシングし、Ｔ細胞にこれらを提示する。したがって、抗原をＤＣに直接送達することは、ワクチンを改善するための重点領域である。そのような例の１つは、その後患者に再投与される自己ＤＣへの生体外抗原負荷を使用した、ＤＣに基づくワクチンの開発である（Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001）、（Steinman and Dhodapkar 2001）。ワクチン効能を改善するための別の戦略は、内部移行化ＤＣ特異的受容体に対する抗体に結合した抗原をＤＣに特異的にターゲッティングすることである。ワクチン接種のためにＤＣをターゲッティングする可能性は、重要なマウス研究により強調されている。インビボでは、オバルブミン（ＯＶＡ）に結合した抗ＬＯＸ−１ｍＡｂを用いたターゲッティングにより、ＭＨＣクラスＩ経路に向けた外来性抗原交差提示を介して、防御的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導された（Y. Delneste et al., Immunity 17, 353 (Sep, 2002)）。また、抗ＤＥＣ２０５ｍＡｂに結合したＯＶＡは、ＣＤ４０Ｌ成熟刺激と組み合わせると、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ拘束性提示をインビボで増強し、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続的形成に結びついた（Bonifaz, Bonnyay et al. 2004）。これらの研究は両方とも、劇的な用量節約（つまり、非常に低い抗原用量での強力な免疫応答）を示し、他のタイプのＯＶＡ免疫で通常認められるよりも広範な応答を示唆した。ＨＩＶ ｇａｇ抗原をＤＥＣ２０５を介してＤＣにターゲッティングする最近の研究では、これらの概念が臨床的に関連する抗原に拡張され、抗原のＤＣへのターゲッティングの基本特性、すなわち劇的な用量節約、単回ワクチン接種による防御的応答、並びにＣＤ８及びＣＤ４の両区画における抗原特異的Ｔ細胞の増殖が確認された（Trumpfheller, Finke et al. 2006）。
【００１８】
本発明は、制御された多変量的な様式で、複数の抗原又はタンパク質（一次ｍＡｂから独立して工学的に作製され、発現され、精製された）の１つの単一の一次組換えｍＡｂとの複合体形成を提供する。現在、異なるタンパク質（各々は別々に工学的に作製され、ストレプトアビジンに連結される）を、１つの一次ｍＡｂに付加することをもたらす部位特異的なビオチン化部位を工学的に作製するための方法が存在する。しかしながら、本発明は、一定の等モル比率及び位置に、別々に工学的に作製されたタンパク質の複数の組合せを一次ｍＡｂに付加することを提供する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「モジュール型ｒＡｂ担体」という用語は、多様な抗原、活性化タンパク質、又は他の抗体の、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ、monoclonal antibody）への、制御されたモジュール付加をもたらすのに工学的に作製された、組換え抗体系を示すのに使用される。ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技術、組換え抗体ディスプレイ、及びヒト化モノクローナル抗体などを使用して作製されたモノクローナル抗体でありえる。モジュール型ｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原及び／又は抗原及び活性化サイトカインを樹状細胞（ＤＣ）にターゲッティングするのに（内部移行する受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）使用できる。モジュール型ｒＡｂ担体は、制御及び規定された方法で、２つの異なる組換えｍＡｂを端と端とで連結するためにも使用できる。
【００２０】
「モジュール型ｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変及び第１の定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びに同系統のモジュール型結合部分がアミノ酸配列に付加及び／又は結合されたＦｃドメインの一部を有するＦａｂｃ断片及び／又はＦａｂ断片であり得る。モジュール型ｒＡｂ担体に使用するための抗体は、任意のアイソタイプ又はクラス、サブクラス又は任意の供給源（動物及び／又は組換え）由来であり得る。
【００２１】
１つの非限定的な例では、モジュール型ｒＡｂ担体は、工学的に作製された組換えｍＡｂと関連して、特定の規定されたタンパク質複合体を作製するための１又は複数のモジュール型コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを有するように工学的に作製される。ｍＡｂは、ｍＡｂの抗原結合ドメインに由来する１又は複数のモジュール型コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインのカルボキシを含む融合タンパク質の一部である。コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインは、例えば、化学的架橋剤及び／又はジスルフィド結合を使用することにより、翻訳後でも結合させることができる。
【００２２】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の受容個体において体液性及び／又は細胞性免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明では２つの異なる場面で使用され得る：抗体若しくはｒＡｂの他の抗原認識ドメインの標的として、或いはモジュール型ｒＡｂ担体に相補的なドックリン／コヒーシン分子の一部として、細胞若しくは標的に及び／又は細胞若しくは標的内にｒＡｂにより運搬される分子としてである。抗原とは、通常、ワクチン接種が有利な治療となる疾患を引き起す作用物質である。抗原がＭＨＣ上に提示される場合、ペプチドは約８個〜２５個のアミノ酸であることが多い。抗原には、例えば、単純な中間代謝産物、糖類、脂質、及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、及びタンパク質などの高分子を含む任意のタイプの生体分子が含まれる。一般的な抗原の分類には、それらに制限されないが、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫性疾患、アレルギー、及び移植片拒絶反応に関与する抗原、並びに他の様々な抗原が含まれる。
【００２３】
モジュール型ｒＡｂ担体は、任意の数の活性作用物質、例えば抗生物質、抗感染症薬、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、下熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝血剤、ポリサッカリド、コラーゲン、細胞、及び複数の先述した活性作用物質の組合せを運搬できる。本発明を使用して送達する抗生物質の例には、限定されないが、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬物、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、アマンチジン（amantidine）、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アンチノマイシンＤ（antinomycin D）、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びイミダゾールカルボキサミドなどが含まれる。
【００２４】
本発明を使用して送達する抗腫瘍作用物質の例には、限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、及びメトトレキサートなどが含まれる。下熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、モトリン（登録商標）、イブプロフェン（登録商標）、ナプロシン（naprosyn）、及びアセトアミノフェンなどが含まれる。
【００２５】
本発明を使用して送達する抗炎症剤の例には、限定されないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、及びジクロフェナクＮａなどが含まれる。
【００２６】
本発明を使用して送達する、骨粗鬆症を治療するための治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定されないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド並びにその突然変異、誘導体、及び類似体が含まれる。
【００２７】
本発明を使用して送達する酵素及び酵素補助因子の例には、限定されないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、superoxide dismutase）などが含まれる。
【００２８】
本発明を使用して送達するサイトカインの例には、限定されないが、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、及びそのような成長因子の生理活性類似体、断片、及び誘導体が含まれる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリトロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せであり得る。他のサイトカインには、βトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）；骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合性成長因子（例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））；インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）；増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【００２９】
本発明を使用して送達する成長因子の例には、限定されないが、哺乳動物細胞からなどのように天然供給源又は自然供給源から単離できるか、又は組換えＤＮＡ技術若しくは種々の化学的工程によるなどのように合成的に調製できる成長因子が含まれる。加えて、これらの因子の類似体、断片、又は誘導体は、それらが天然分子の生物学的活性の少なくとも一部を示すという条件で、使用することができる。例えば、類似体は、部位特異的突然変異又は他の遺伝子工学技術により改変された遺伝子の発現により調製できる。
【００３０】
本発明を使用して送達する抗凝血剤の例には、限定されないが、ワルファリン、ヘパリン、及びヒルジンなどが含まれる。本発明を使用して送達する免疫系に作用する因子の例には、限定されないが、炎症及び悪性新生物を制御する因子、並びに走化性ペプチド及びブラジキニンなどの感染性微生物を攻撃する因子が含まれる。
【００３１】
ウィルス抗原の例には、これらに限定されないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、及び他のＨＩＶ構成要素などのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ、human immunodeficiency virus）抗原に由来するレトロウィルス抗原などのレトロウィルス抗原；Ｂ型肝炎ウィルスのＳ、Ｍ、及びＬタンパク質などの肝炎ウィルス抗原、Ｂ型肝炎ウィルスのプレＳ抗原、及びＣ型肝炎ウィルスＲＮＡなどの、他の肝炎、例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ型肝炎のウィルス成分；赤血球凝集素及びノイラミニダーゼなどのインフルエンザウィルス抗原及び他のインフルエンザウィルス成分；麻疹ウィルス融合タンパク質などの麻疹ウィルス抗原及び他の麻疹ウィルス成分；タンパク質Ｅｌ及びＥ２などの風疹ウィルス抗原及び他の風疹ウィルス成分；ＶＰ７ｓｃなどのロタウィルス抗原及び他のロタウィルス成分；エンベロープ糖タンパク質Ｂなどのサイトメガロウィルス抗原及び他のサイトメガロウィルス抗原成分；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などのＲＳウィルス抗原及び他のＲＳウィルス抗原成分；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄなどの単純ヘルペスウィルス抗原、及び他の単純ヘルペスウィルス抗原成分；ｇｐＩ、ｇｐIIなどの水痘帯状ヘルペスウィルス抗原、及び他の水痘帯状ヘルペスウィルス抗原成分；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅなどの日本脳炎ウィルス抗原、及び他の日本脳炎ウィルス抗原成分；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの狂犬病ウィルス抗原、及び他の狂犬病ウィルス抗原成分が含まれる。ウィルス抗原の追加の例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M.(Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３２】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを使用して送達できる抗原標的には、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウィルスには、ピコルナウィルス、コロナウィルス、トガウィルス、フラビルウィルス（flavirvirus）、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、オルトミクソウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パピロマウィルス（papilomavirus）、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、及び海綿状ウィルス（spongiform virus）が含まれる。他のウィルス標的には、インフルエンザ、単純ヘルペスウィルス１及び２、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ、又はＨＩＶが含まれる。病原体には、トリパノソーマ、サナダムシ、円虫、蠕虫、マラリアが含まれる。胎児性抗原又は前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーは、このような方法でターゲッティングできる。他の例には、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種を目的とした本発明によるベクター投与には、ベクター関連抗原が、導入遺伝子の長期発現を可能にするのに十分なほど非免疫原性であることが必要とされ、強力な免疫応答がそのために望まれよう。幾つかの場合には、個体のワクチン接種が、年に１回又は２年に１回のように低頻度でしか必要とされず、感染物質に対して長期的な免疫学的防御を提供できる。ベクターにおいて及び最終的には抗原として本発明と共に使用するための生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸配列の特定の例は、米国特許第６，５４１，０１１号明細書、参照により本明細書中に組み込まれた関連部分、特に本発明と共に使用できる生物及び特異的配列と一致する表に見出すことができる。
【００３３】
本明細書中で開示されたｒＡｂワクチンと共に使用するための細菌抗原には、これらに限定されないが、例えば、百日咳トキシン、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼなどの細菌抗原、及び他の百日咳細菌抗原成分；ジフテリアトキシン又はトキソイドなどのジフテリア細菌抗原、及び他のジフテリア細菌抗原成分；破傷風トキシン又はトキソイドなどの破傷風細菌抗原、及び他の破傷風細菌抗原成分；Ｍタンパク質のなどの連鎖球菌細菌抗原、及び他の連鎖球菌細菌抗原成分；リポポリサッカリドなどのグラム陰性桿菌細菌抗原及び他のグラム陰性細菌抗原成分、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５、heat shock protein 65）、３０ｋＤａの主要分泌タンパク質、抗原８５Ａなどのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）細菌抗原、及び他のマイコバクテリウム抗原成分；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌カプセルポリサッカリドなどの肺炎球菌細菌抗原、及び他の肺炎球菌細菌抗原成分；カプセルポリサッカリドなどのヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原、及び他のヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原成分；炭疽菌防御抗原などの炭疽菌細菌抗原、及び他の炭疽菌細菌抗原成分；ｒｏｍｐＡなどのリケッチア細菌抗原、及び他のリケッチア細菌抗原成分が含まれる。また、本明細書中に記載された細菌抗原と共に、任意の他の細菌抗原、マイコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リケッチア抗原、又はクラミジア抗原が含まれる。部分的又は全体的な病原体は、ヘモフィルスインフルエンザ；熱帯熱マラリア原虫；ナイセリア・メニンギティディス（neisseria meningitidis）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（streptococcus pneumoniae）；ナイセリア・ゴノロエエ（neisseria gonorrhoeae）；サルモネラ血清型チフス；赤痢菌；ビブリオ・コレラエ（vibrio cholerae）；デング熱；脳炎；日本脳炎；ライム病；エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）；西ナイルウィルス；黄熱病；野兎病；肝炎（ウィルス性；細菌性）；ＲＳＶ（ＲＳウィルス、respiratory syncytial virus）；ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３；アデノウィルス；天然痘；アレルギー並びに癌であってもよい。
【００３４】
本発明の組成物及び方法で使用するための真菌抗原には、これらに限定されないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０、heat shock protein 60）などのヒストプラスマ真菌抗原、及び他のヒストプラスマ真菌抗原成分；カプセルポリサッカリドなどのクリプトコッカス真菌抗原、及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分；小球抗原などのコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原、及び他のコクシジオデス真菌抗原成分；並びにトリコフィチンなどの白癬真菌抗原、及び他のコクシジオデス真菌抗原成分が含まれる。
【００３５】
原生動物抗原及び他の寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、例えば、メロゾイド表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイド周囲抗原、生殖母細胞／生殖体表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡなどの熱帯熱マラリア原虫抗原、及び他のマラリア原虫抗原成分；ＳＡＧ−１、ｐ３０などのトキソプラズマ抗原、及び他のトキソプラズマ抗原成分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシンなどの住血吸虫抗原、及び他の住血吸虫抗原成分；ｇｐ６３、リポホスホグリカン及びその関連タンパク質などの森林型熱帯リーシュマニア及び他のリーシュマニア抗原性成分、及び他のリーシュマニア抗原成分；並びに７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原などのクルーズトリパノソーマ（trypanosoma cruzi）抗原、及び他のトリパノソーマ抗原成分が含まれる。
【００３６】
本発明のｒＡｂを使用してターゲッティングできる抗原は、一般的に、内部移行の可能性、免疫細胞特異性のレベル、ターゲッティングされる免疫細胞のタイプ、免疫細胞の成熟及び／又は活性化のレベルなどを含む、多数の因子に基づき選択される。樹状細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＡＳＰＧＲなどが含まれ、一方で幾つかの場合には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７の非存在も示す。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１及び／又はＦｃγ受容体が含まれる。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが含まれる。
【００３７】
送達用の細胞表面上の標的抗原には、典型的には腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、及び細胞小器官などに由来する腫瘍抗原に特徴的なものが含まれる。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定されないが、白血病及びリンパ腫などの血液癌、星状細胞腫又は膠芽腫などの神経性腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌又は結腸癌などの消化管腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、頚部、子宮、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、又は陰茎癌などの尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽腔、咽頭及び口腔の癌、食道、直腸、胆嚢、胆管系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳、及び神経系の他の部分、甲状腺、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び白血病が含まれる。
【００３８】
本発明を使用した抗原提示のために、単独で又は組合せで免疫細胞に送達できる抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば、変異癌遺伝子；腫瘍に関連したウィルスタンパク質；並びに腫瘍ムチン及び糖脂質が含まれる。腫瘍に関連したウィルスタンパク質であり得る抗原は、上記したクラスのウィルス由来のものとなる。ある種の抗原は、腫瘍の特徴であり得るか（サブセットの１つは、通常は腫瘍前駆細胞によって発現されないタンパク質である）、又は腫瘍前駆細胞で通常発現されるが、腫瘍の突然変異特徴を有するタンパク質であり得る。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば腫瘍抗原を生じさせる遺伝子の突然変異を有する、正常なタンパク質の突然変異変異体（複数可）が含まれる。
【００３９】
腫瘍抗原の非限定的な特定の例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、prostate specific antigen）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６、及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）βカテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫遍在性変異遺伝子産物、melanoma ubiquitous mutated gene product）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウィルス核抗原、Epstein-Barr Virus nuclear antigen）１〜６、ｇｐ７５、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ、human papilloma virus）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ、lung resistance protein）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が含まれる。加えて、免疫原性分子は、自己免疫性疾患の開始及び／又は伝播に関与する自己抗原であり得、その病態は、関連する標的器官、組織、又は細胞により発現される分子、例えばＳＬＥ又はＭＧに特異的な抗体の活性に主として起因する。そのような疾患では、関連自己抗原に対する進行中の抗体媒介性（つまり、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（つまり、Ｔｈ１型）免疫応答に向けることが望ましい場合がある。或いは、適切な自己抗原に対するＴｈ１型応答を予防的に誘導することにより、関連する自己免疫疾患を有しないが感受性があることが疑われる対象体における自己抗原に対するＴｈ２型応答の開始を予防又はそのレベルを減少させることが望ましい場合がある。所望の自己抗原には、限定されないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Ｓｍｉｔｈタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質；並びに（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体が含まれる。１又は複数のタイプの自己免疫応答に関与する他の様々な抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、濾胞刺激的ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチンなどの内因性ホルモン、及び他のホルモンが含まれる。
【００４０】
自己免疫性疾患、アレルギー、及び移植片拒絶に関与する抗原が、本発明の組成物及び方法において使用できる。例えば、以下の自己免疫性疾患又は障害の１又は複数に関与する抗原が、本発明において使用できる：糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続いて起こる乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音性聴力損失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症。自己免疫性疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５、glutamic acid decarboxylase 65）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体構成要素、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ、thyroid stimulating hormone）受容体が含まれる。アレルギーに関与する抗原の例には、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉抗原、イエダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が含まれる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経移植片構成要素などの移植片受容物に移植される移植片の抗原性構成要素が含まれる。抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドであり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「エピトープ（複数可）」という用語は、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされた、多数の病原体ポリペプチドのいずれか内に位置する、エピトープに類似した一次、二次、又は三次構造を含むペプチド又はタンパク質抗原を指す。類似性のレベルは、一般的に、そのようなポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体もまた、ペプチド又はタンパク質抗原に結合、反応、又はその他の方法で認識する程度となる。例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡなどのような種々のイムノアッセイ法が、そのような抗体と共に使用でき、それらのすべては当業者に公知である。ワクチンに使用するために好適な病原体エピトープ、及び／又はそれらの機能的な等価物の同定は、本発明の一部である。いったん単離及び同定されれば、機能的な等価物は容易に取得できる。例えば、親水性に基づいてアミノ酸配列からエピトープを同定及び調製することを教示する、参照により本明細書中に組み込まれた米国特許第４，５５４，１０１号明細書において教示されているHoppの方法が使用できる。他の幾つかの文献に記載された方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムを使用して、エピトープコア配列を同定することもできる（例えば、Jameson and Wolf, 1988；Wolf et al., 1988；米国特許第４，５５４，１０１号明細書を参照）。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、その後、ペプチド合成又は組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチドに容易に組み込むことができる。
【００４２】
有効成分として本発明の抗原をコードする核酸を含むワクチン組成物の調製は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製することができ、感染の前に液体に溶解又は懸濁するのに好適な固体形態を調製することもできる。調製物は、乳化してリポソームに封入することができる。活性免疫原成分は、薬学的に許容され、有効成分と適合する担体と混合されることが多い。
【００４３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、それが投与される対象体にアレルギー反応又は他の悪影響を引き起さない担体を指す。好適な薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなどの１又は複数、及びそれらの組合せが含まれる。加えて、必要に応じて、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含有できる。有効であり得るアジュバントの例には、それらに限定されないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ、N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、及び２％のスクワレン／Tween 80エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ（monophosporyl lipid A）＋ＴＤＭ（trehalose dimycolate）＋ＣＷＳ（cell wall skeleton））を含有するＲＩＢＩが含まれる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、dimethyldioctadecylammonium bromide）、フロインド完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが含まれる。加えて、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）などの免疫調節物質、又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘発因子は、本明細書中に記載のアジュバントと組み合わせて使用できる。
【００４４】
医薬品には、本発明に記載されたように、血漿リポタンパク質に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを有する裸のポリヌクレオチド（naked polynucleotide）が含まれ得る。このポリヌクレオチドは、生理活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムをコードしていてよく、生理学的に許容される投与可能な形態で提供されよう。本発明から生じ得る別の薬剤製品は、本明細書中に記述された方法により患者の血液又は他の供給源のいずれかから単離された高度に精製された血漿リポタンパク質画分、並びに血漿リポタンパク質に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有し、生理学的に許容される投与可能な形態の精製されたリポタンパク質画分に事前に結合されたポリヌクレオチドを含み得る。
【００４５】
さらに別の医薬品は、生理学的に許容される投与可能な形態の、特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有するポリヌクレオチドに事前に結合された特異的ＤＮＡ結合モチーフの単一又は複数コピーを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含み得る。さらに別の医薬品は、生理学的に許容される投与可能な形態の、特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有するポリヌクレオチドに事前に結合された特異的ＤＮＡ結合モチーフの単一又は複数コピーを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含み得る。
【００４６】
投与される用量は、治療される対象体の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。高度に精製されたリポタンパク質画分に事前に結合された裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇから１ｍｇまでのポリヌクレオチド及び１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質に及ぶ量で投与できる。
【００４７】
ｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与では、患者は、化学療法剤の投与に関する一般的なプロトコールに従い、もしあれば、ベクターの毒性を考慮に入れる。治療サイクルは必要に応じて繰り返されるであろうことが予期される。記載された遺伝子治療と組み合わせて、種々の標準的治療並びに外科的介入が適用できることも企図される。
【００４８】
遺伝子治療の臨床適用が企図される場合、目的の適用に適した医薬組成物として、複合体を調製することが必要となる。一般的に、これには、発熱物質並びにヒト又は動物に有害であり得るどんな他の不純物も本質的に存在しない医薬組成物を調製することが必要となろう。また、適切な塩及び緩衝液を使用して、複合体に安定性を与え、標的細胞による複雑な取り込みを可能にすることも一般に望まれる。
【００４９】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。
【００５０】
そのような組成物は、接種物と呼ぶこともできる。そのような媒体及び作用物質を医薬活性物質用に使用することは、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用物質は、有効成分と適合性がない場合を除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分を組成物に組み込むこともできる。本発明の組成物には、古典的な医薬調製物が含まれ得る。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有する。
【００５１】
疾患の状態。治療される特定の疾患に依存して、最大の（又は幾つかの場合では最小の）免疫応答を生じさせるための部位への抗原送達を最大化するためには、標的組織がその経路を介して入手可能である限り、本発明による治療的組成物の投与は、任意の一般的な経路を介したものとなる。投与は、一般的に、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射による投与となる。送達する他の区域には、経口、鼻腔、頬側、直腸、膣、又は局所が含まれる。局所投与は、皮膚癌の治療に特に有利となる。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝液、又は他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与されよう。
【００５２】
本発明のワクチン又は治療用組成物は、注射により非経口的に、例えば皮下又は筋肉内のいずれかで投与できる。他の投与方法に好適である追加的製剤には、坐剤、幾つかの場合には、経口製剤、又はエアゾール剤としての流通に好適な製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバント、抗原パッケージング、又は種々の製剤への個々のサイトカインの付加を使用したＴ細胞サブセットの操作により、最適化された免疫応答を有する経口ワクチンの改善がもたらされる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれていてよく、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する。
【００５３】
本発明の核酸をコードする抗原は、中性又は塩の形態としてワクチン又は治療用組成物に製剤することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマレイン酸などのような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、及びプロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【００５４】
ワクチン又は治療用組成物は、投与製剤と適合する方法で、予防上及び／又は治療上有効であろうような量で投与される。投与される量は、例えば、抗体を合成する対象体の免疫系の能力、及び所望の防御又は治療の程度を含む、治療する対象体に依存する。好適な用量範囲は、約１ｍｇから３００ｍｇまでの範囲、好ましくは約１０ｍｇから５０ｍｇまでの範囲などの、約０．１ｍｇから１０００ｍｇまでの範囲を有する、１回のワクチン接種当たり数百マイクログラムのオーダーの有効成分である。初期投与及び追加免疫接種に好適な投与計画も多様であるが、初期投与に続くその後の接種又は他の投与により典型的に表される。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各対象体に特有であり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドが他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、受容個体の免疫状態及び健康、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療的活性によって決まることは、当業者には明らかであろう。
【００５５】
組成物は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与スケジュールは、ワクチン接種の主要な経過が、例えば１〜１０回の別個投与、その後に、免疫応答を維持及び／又は増強するのに必要なその後の時間間隔で与えられる、例えば２回目の投与の場合は１〜４か月での他の投与、及びもし必要な場合には、数か月後の後続投与（複数可）を含むスケジュールである。防御免疫の所望のレベルを維持するためには、１〜５年、通常は３年間隔での定期的な追加免疫が望ましい。免疫の経過は、ＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共に共培養された末梢血リンパ球（ＰＢＬ、peripheral blood lymphocyte）のインビトロ増殖アッセイにより、及び初回抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γのレベルを測定することにより追跡できる。アッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素、及び蛍光標識などの従来の標識を使用して実施できる。これらの技術は当業者にとって公知であり、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第４，１７４，３８４号明細書、及び第３，９４９，０６４号明細書に見出すことができ、関連部分は参照により組み込まれる。
【００５６】
モジュール型ｒＡｂ担体及び／又は結合ｒＡｂ担体−（コヒーシン／ドックリン及び／又はドックリン−コヒーシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるかどうか、最終精製タンパク質又は最終ワクチン形態が使用されるかどうかに依存して、１又は複数の「単位用量」で提供できる。単位用量は、その投与、つまり適切な経路及び治療投与計画と関連した所望の応答を生じさせるように計算された治療的組成物の所定量を含有することであると定義される。投与される量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術分野における当業者の技能内である。治療される対象体、特に、対象体の免疫系の状態及び所望の防御を評価することもできる。単位用量は、単回注射として投与する必要はないが、設定された期間にわたる持続注入を含むことができる。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／ｋｇ）体重によって好都合に記述することができ、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１，０００ｍｇ／ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重以上の間の範囲で投与される。同様に、送達されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの量は、約０．２から約８．０ｍｇ／ｋｇ体重まで変動し得る。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ、及び７．５ｍｇのワクチンが、インビボで個体に送達できる。投与されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原の用量は、治療される対象体の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。リポソーム性又はウィルス性送達ベクターに事前に結合された裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇのポリヌクレオチドから１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質に及ぶ量で投与できる。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ ５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇのベクターに独立して結合した、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、又は１，０００μｇの間のポリヌクレオチド又はタンパク質を含み得る。
【００５７】
本発明は、インフルエンザ抗原がターゲッティングされている樹状細胞によるヒトインフルエンザ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験された。本明細書中に示された結果は、それら自身がこの系で有効でない抗原の用量での、そのような抗原特異的細胞の特異的増殖を実証する。
【００５８】
本発明は、例えば、リシン、炭疽菌毒素、及びブドウ球菌Ｂエンテロトキシンに由来する防御抗原と複合体形成した組換えヒト化ｍＡｂ（特定のヒト樹状細胞受容体に対するもの）であるモジュール型ｒＡｂ担体を作製するためも使用できる。この物質の潜在的な市場は、全軍関係者のワクチン接種、及びこれらの作用物質と関連する任意の生体脅威（biothreat）に応じて大規模人口密集地に対して投与するために備蓄された保管ワクチンである。本発明は、ヒト及び動物使用の両方について、ワクチン設計一般に対する幅広い適用を有する。所望の産業には、医薬品産業及びバイオテクノロジー産業が含まれる。
【００５９】
本発明は、抗原に対する強力で幅広い免疫応答を誘発する目的のために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ、antigen-presenting cell）に特異的にターゲッティングする（送達する）、ワクチン剤を含む組成物及び方法を含む。これらの組成物は、抗原がそれから由来した作用物質（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的免疫応答を誘起する。加えて、本発明は、抗原提示細胞上に発現されるＤＣ−ＡＳＧＰＲと呼ばれる受容体にそれらが特定的に結合することにより、直接的に又は他の作用物質と協調して、治療効果のある作用物質を生成する。
【００６０】
抗体（Ａｂ）重鎖を介して、防御抗原をコードすることが知られているか又は予想される抗原と融合した新規な組換えヒト化ｍＡｂ（特定のヒト樹状細胞受容体ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する）。これらには、種々の作用物質に対するワクチン接種用の例として、インフルエンザＨ５Ｎ１型由来の赤血球凝集素；リシン由来の弱毒化トキシンに由来するＨＩＶ ｇａｇ、炭疽菌トキシン、及びブドウ球菌Ｂエンテロトキシン；黒色腫抗原由来の抗原性ペプチドの「ストリング（string）」などが含まれる。本発明は、感染リスクのある又は感染した患者用の、予防的又は治療的なワクチン接種として使用できる。本発明は、ヒト及び動物使用の両方について、多数の疾患及び癌に対するワクチン接種用の幅広い適用を有する。本発明を使用できる産業には、医薬品業及びバイオテクノロジー業が含まれる。
【００６１】
本発明は、ワクチン接種目的のために、抗原をＡＰＣにターゲッティングするために使用できる。どの抗原内部移行化受容体がこの目的に最も適するかは知られていない。本発明は、この目的に関して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの特に有利な特徴について説明する。さらに、本発明は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲとの結合が、免疫系を活性化して高度に予測された著しい治療上の有益性を有する点において有益であり得ることを示す。
【００６２】
本発明は、ヒトＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する高親和性モノクローナル抗体の開発を含む。受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、human placental alkaline phosphatase）融合タンパク質を、それぞれ、マウスの免疫及びｍＡｂのスクリーニング用に産生した。ｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＩｇＧ用の発現構築体は、過去に記述されており（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）、分泌を指示するためにマウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドが使用された（Bendtsen, Nielsen et al. 2004）。ｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＡＰ用の発現ベクターはＰＣＲを使用して生成し、ＡＰ残基１３３〜１５８１位（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅した一方で、近位のインフレームのXhoI部位並びに遠位のＴＧＡ終止コドン及びNotI部位を付加した。このXhoI−NotI断片は、上記のｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＩｇＧベクターのＩｇＧコード配列を置換した。同じＩｇ及びＡＰベクター系列のＤＣ−ＡＳＧＰＲエクトドメイン構築体は、（ｂｐ４８４〜１２５１、ｇｉ｜５３８３２０１７）をコードするインサートを含有していた。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ融合タンパク質は、メーカーのプロトコール（１．３ｍｌの２９３Fectin試薬／Ｌを用いた１ｍｇの全プラスミドＤＮＡの形質移入）に従って、FreeStyle（商標）２９３発現系（Invitrogen社製）を使用して産生した。ｒＡｂ産生の場合、Ｈ及びＬ鎖をコードする等量のベクターを同時形質移入した。形質移入された細胞を３日間培養し、培養上清を回収し、新しい培地を添加して２日間インキュベーションを継続した。貯留した上清は、濾過により清澄化した。受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧは、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７による溶出を用いたHiTrapプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、その後ＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂ（下記に記載の組換え抗体）は、HiTrap MabSelect（商標）カラムの使用により同様に精製した。マウスｍＡｂは、従来の細胞融合技術により産生した。手短かに言えば、２０μｇの受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質をＲｉｂｉアジュバントと共に用いて、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを腹腔内的に免疫し、次いで１０日後及び１５日後に２０μｇの抗原で追加免疫した。３か月後、脾臓を採取する３日前にマウスを再び追加免疫した。或いは、３０〜４０日間にわたって３〜４日ごとに、Ｒｉｂｉアジュバント中の１〜１０μｇの抗原をマウスの足蹠に注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を回収した。従来技術を使用して、脾臓又はリンパ節細胞に由来するＢ細胞を、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（Shulman, Wilde et al. 1978）に融合した。ＥＬＩＳＡを使用し、融合パートナー単独と比較又はＡＰに融合した受容体エクトドメインと対比して、受容体エクトドメイン融合タンパク質について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）。その後、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３Ｆ細胞を使用して、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、CELLineフラスコ（Intergra社製）中で、単細胞クローニングし増殖させた。ハイブリドーマ上清を、等容積の１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelectレジンと共に回転させた。結合緩衝液でレジンを洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２ＭＴｒｉｓで中和した後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００６３】
直接ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体の特徴付け。幾つかの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの相対的親和性をＥＬＩＳＡにより決定した（つまり、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇタンパク質をマイクロプレート表面上に固定し、（抗マウスＩｇＧ．ＨＲＰ結合試薬により検出される）ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇに結合するそれらの能力について、抗体を連続用量滴定法で試験する）。この例において、ＰＡＢ４２及びＰＡＢ４４は、他のｍＡｂより高い親和性結合を示す。同じｍＡｂは、マイクロプレート表面に結合されたヒトＩｇに有意には結合しない。これは、ｍＡｂが、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇ融合タンパク質のＤＣ−ＡＳＧＰＲエクトドメイン部分と反応することを示す（データは示さず）。
【００６４】
間接ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体の特徴付け。次に、幾つかの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの相対的親和性をＥＬＩＳＡにより決定した（つまり、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂをマイクロプレート表面上に固定し、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．ＡＰ試薬に結合するそれらの能力について、連続用量滴定法で試験する）。ＰＡＢ４２、ＰＡＢ４４、及びＰＡＢ５４として列挙されたハイブリドーマ由来の上清は、他のｍＡｂより高い親和性結合を示すことが見出された（データは示さず）。
【００６５】
ＦＡＣＳによる抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの特徴付け。細胞表面ＤＣ−ＡＳＧＰＲの合成を指示する発現プラスミドで形質移入された２９３Ｆ細胞と対比して、ＦＡＣＳによりｍＡｂパネルも試験した。シグナルの平均蛍光強度は、非形質移入２９３Ｆ細胞と対比した類似シグナルから差し引いた。この基準では、ｍＡｂは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する細胞表面に特異的に結合できる。幾つかのｍＡｂ、例えば３７Ａ７は、この点に関しては特に有利であると考えられる（データは示さず）。
【００６６】
図１Ａ〜１Ｄは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達がＤＣを活性化することを示す。ＤＣは、それらの活性化に依存して、誘導又は耐性のいずれかである免疫応答の結果を決定する一次免疫細胞である（J. Banchereau et al., Annu Rev Immunol 18, 767 (2000)）。ＤＣ活性化におけるＬＬＲの役割はまだ明らかではない。したがって、本発明者らは、ＬＬＲ ＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発がＤＣ活性化に帰着し得るかどうかを試験した。インビトロで３日間及び６日間培養されたＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣの両方が、ＬＯＸ−１、ＡＳＧＰＲ、及びＣＬＥＣ−６を発現する（図１Ａ）。ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで６日間のＤＣを刺激し、図１Ｂのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介するシグナルがＤＣを活性化し、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現増加に帰着し得たことを示す。ＤＣ上のＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発は、ＤＣに由来するＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＩＬ−８の産生増加にも帰着した（図１Ｃ）。他のサイトカイン及びケモカイン、ＴＮＦａ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−ｌａ、及びＩＬ−１０も、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達により著しく増加し（データは示さず）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが細胞シグナルを送達してＤＣを活性化できることが示唆される。それと一致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的ｍＡｂで刺激されたＤＣは、共刺激分子並びにケモカイン及びサイトカイン関連遺伝子を含む、増加したレベルの複数の遺伝子を発現した（図１Ｄ）。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４媒介性免疫細胞活性化にＬＬＲが寄与する可能性は、過去に記述されている（T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)、P. Jeannin et al., Immunity 22, 551 (May, 2005)）。本発明者らは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナルが、ＤＣをさらに活性化するために、ＣＤ４０を介したシグナルと相乗作用を示し得ることを観察した（図１Ｅ）。これが重要であるのは、ＬＬＲがインビボでのＤＣ活性化中に共刺激分子として機能し得るためである。まとめると、図１のデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達がＤＣを活性化することができ、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、ＤＣを活性化するために共刺激分子として機能することを証明する。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用中のＤＣ−ＡＳＧＰＲ結合は、ＩＬ−１２ｐ７０産生の劇的な増加に帰着する。
【００６７】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣは、強力な体液性免疫応答を誘導する。ＤＣは、Ｔ細胞依存性及びＴ細胞非依存性Ｂ細胞応答の両方のためにシグナルを供給することにより（M. Wykes, G. MacPherson, Immunology 100, 1 (May, 2000)、M. Balazs, F. Martin, T. Zhou, J. Kearney, Immunity 17, 341 (Sep, 2002)、T. Kikuchi, S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, R. G. Crystal, Nat Med 6, 1154 (Oct, 2000)、B. Dubois et al., J Leukoc Biol 66, 224 (Aug, 1999)）、及びＢ細胞に抗原を移動させることにより（H. Qi, J. G. Egen, A. Y. Huang, R. N. Germain, Science 312, 1672 (Jun 16, 2006)、A. Bergtold, D. D. Desai, A. Gavhane, R. Clynes, Immunity 23, 503 (Nov, 2005)）、体液性免疫応答において重要な役割を果たす。ＤＣに加えて、第３のシグナルとしてのＴＬＲ９を介したシグナル伝達は、効率的なＢ細胞応答のために必要である（C. R. Ruprecht, A. Lanzavecchia, Eur J Immunol 36, 810 (Apr, 2006)、N. L. Bernasconi, E. Traggiai, A. Lanzavecchia, Science 298, 2199 (Dec 13, 2002)）。
【００６８】
したがって、本発明者らは、ＴＬＲ９リガンド、ＣｐＧの存在下で、ＤＣ媒介性体液性免疫応答におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割を試験した。６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂで刺激し、その後、精製されたＢ細胞を共培養した。図２Ａで示されるように、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂで活性化されたＤＣは、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣと比較して、著しく増強されたＢ細胞増殖（ＣＦＳＥ希釈）及び形質細胞分化（ＣＤ３８＋ＣＤ２０−）に帰着した。ＣＤ３８＋ＣＤ２０−Ｂ細胞は、形質細胞の典型的な形態を有するが、それらはＣＤ１３８を発現しない。大多数の増殖細胞は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、又はＣＣＲ７を発現しなかった。産生された全免疫グロブリン（Ｉｇ）の量は、ＥＬＩＳＡにより測定された（図２Ｂ）。図２Ａのデータと一致して、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲで刺激されたＤＣと共に培養されたＢ細胞は、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡ産生の著しい増加に帰着した。全Ｉｇに加えて、本発明者らは、Ｂ細胞によるインフルエンザウィルス特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡの産生については、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発により活性化されたＤＣが、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣより強力であることも観察し（図２Ｃ）、これは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ媒介性ＤＣ活性化が、全液性免疫応答及び抗原特異的体液性免疫応答の両方に寄与することを示唆した。本発明者らは、生体外抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの、体液性免疫応答における役割を試験した。ＣＤ１９＋及びＣＤ１４＋細胞を含む、ＰＢＭＣのＡＰＣの一部は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する（追加図２）。バフィーコート由来のＰＢＭＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂでコーティングされたプレートで培養し、全Ｉｇ及びＢ細胞増殖を測定した。ＤＣから生成されたデータ（図２Ａ）と一致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＡＰＣは、ＴＬＲ９リガンドの非存在下（図２ｄの上パネル）又は存在下で（図２Ｄの下パネル）、増強されたＢ細胞増殖及び形質細胞分化に帰着した。ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂでコーティングされたプレートでＰＢＭＣを培養した際、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡも著しく増加した（図２ｅ）。図１に示されたように、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達により活性化されたＤＣは、表現型を成熟させ、大量の炎症性サイトカイン及びケモカインを産生し、成熟したＤＣ表現型及びＤＣ由来の可溶性因子の両方は、Ｂ細胞応答の増強に寄与できた（図２）。しかしながら、ＤＣ由来Ｂリンパ球刺激タンパク質（ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ）及び増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ、）は、ＤＣがそれによりヒトＢ細胞の増殖及び機能を直接的に調節し得る重要な分子でもある（P. A. Moore et al., Science 285, 260 (Jul 9, 1999)、J. A. Gross et al., Nature 404, 995 (Apr 27, 2000)、A. Craxton, D. Magaletti, E. J. Ryan, E. A. Clark, Blood 101, 4464 (Jun 1, 2003)、I. MacLennan, C. Vinuesa, Immunity 17, 235 (Sep, 2002)）。したがって、本発明者らは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナルがＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの発現レベルを変化させ得るかどうかを試験した。図２ｄのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣが、増加したレベルの細胞内ＡＰＲＩＬ及び分泌ＡＰＲＩＬを発現したが、ＢＬｙＳは発現しなかったことを示す（示さず）。混合培養液におけるＢ細胞上のＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬ受容体の発現レベルを測定したが、著しい変化はなかった（示さず）。
【００６９】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、Ｂ細胞活性化及びＩｇ産生に寄与する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する（図３Ａ）。したがって、本発明者らは、Ｂ細胞活性化におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割を試験した。図３Ｂのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＢ細胞が、著しく高い量のケモカインを産生したことを示す。ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ａに加えて、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂでＢ細胞を刺激した際、対照ｍＡｂと比較してＩＬ−６及びＴＮＦαのわずかな増加も観察された。細胞活性化と関連する遺伝子も上方調節された（図３Ｃ）。Ｂ細胞は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されるとＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを産生し（図３Ｄ）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、インビボでの正常な免疫グロブリンレベルの維持に重要な役割を果たし得ることが示唆される。しかしながら、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達だけでは、著しいＢ細胞増殖を誘導しなかった。
【００７０】
Ｔ細胞応答におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割。ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣは、増強されたレベルの共刺激分子を発現、増加した量のサイトカイン及びケモカインを産生し（図１を参照）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、細胞性免疫応答と同様に体液性免疫応答にも寄与することを示唆する。これは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ、mixed lymphocyte reaction）により試験された。精製された同種異系Ｔ細胞の増殖は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで刺激されたＤＣにより著しく増強された（図４Ａ）。ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して活性化されたＤＣは、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣよりも効率的に、Ｍａｒｔ−ｌ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を初回抗原刺激することもできた（図４Ｂの上パネル）。より重要なことに、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達は、ＤＣがＭａｒｋ−１ペプチドをＣＤ８Ｔ細胞に交差初回抗原刺激することを可能にした（図４Ｂの下パネル）。これは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲがＤＣ機能の増強に重要な役割を果たし、ＣＤ８Ｔ細胞に対する抗原のより良好な初回抗原刺激及び交差初回抗原刺激に帰着することを示す。Ｔ細胞応答の活性化の際にＰＢＭＣ中の混合ＡＰＣ上に発現されたＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂで刺激されたＰＢＭＣが、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣと比較して、インフルエンザＭ１四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度増加に帰着したことを示す図４Ｃに示されている。この増強された抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答は、図４Ｄのデータにより支持されて、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣが、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を著しく増加させることを示す。
【００７１】
材料及び方法
抗体及び四量体：アイソタイプ対照Ａｂを含む、ＤＣ及びＢ細胞の表面染色用の抗体（Ａｂ）は、BD Biosciences社（米国カリフォルニア州）から購入した。ＥＬＩＳＡ用のＡｂは、Bethyl社（米国テキサス州）から購入した。抗ＢＬｙＳ及び抗ＡＰＲＩＬは、PeproTech社製（米国ニュージャージー州）であった。四量体、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）（インフルエンザＭ１）、及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２）（Ｍａｒｔ−１）は、Beckman Coulter社（米国カリフォルニア州）から購入した。
【００７２】
細胞及び培養：ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）（R&D社製、米国カリフォルニア州）を含有するCellgenics社製（フランス）培地中で、正常供与体に由来する単球（１×１０６／ｍｌ）を培養した。３日目及び６日目のＤＣの場合、同量のサイトカインをそれぞれ１日目及び３日目に培地に補完した。Ｂ細胞は、ネガティブ分離キット（BD社製）で精製した。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、抗ＣＤ４又はＣＤ８でコーティングされた磁気ビーズ（Milteniy社製、米国カリフォルニア州）で精製した。ＰＢＭＣは、Percoll（商標）勾配（GE Healthcare UK Ltd社製、バッキンガムシャー、英国）を使用して、密度勾配遠心分離によりバフィーコートから単離した。ＤＣ活性化の場合、１×１０５個のＤＣを、ｍＡｂでコーティングされた９６ウェルプレートで１６〜１８時間培養した。ｍＡｂ（１〜２μｇ／ウェル）は、炭酸緩衝液、ｐＨ９．４で少なくとも３時間３７℃でインキュベートした。培養上清を回収し、Luminex（Biorad社製、米国カリフォルニア州）によりサイトカイン／ケモカインを測定した。遺伝子分析の場合、ＤＣは、ｍＡｂでコーティングされたプレートで８時間培養した。幾つかの実験では、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌ（R&D社製、米国カリフォルニア州）又は５０ｎＭのＣｐＧ（InVivogen社製、米国カリフォルニア州）を培養液に添加した。ＤＣ及びＢ細胞の共培養の場合、１０％ＦＣＳ及び抗生物質（Biosource社製、米国カリフォルニア州）と共にＲＰＭＩ１６４０に再懸濁された５×１０３個のＤＣを、まず、ｍＡｂでコーティングされたプレートで少なくとも６時間培養し、その後ＣＦＳＥ（Molecular Probes社製、米国オレゴン州）で標識された、１×１０５個の精製自己Ｂ細胞を添加した。幾つかの実験では、ＤＣを、５ｍｏｉ（感染多重度）の加熱不活性化インフルエンザウィルス（Ａ／ＰＲ／８Ｈ１Ｎ１）で２時間パルスし、その後Ｂ細胞と混合した。ＤＣ及びＴ細胞の共培養の場合、５×１０３個のＤＣを、１×１０５個の精製自己ＣＤ８Ｔ細胞又は混合同種異系Ｔ細胞と共に培養した。同種異系Ｔ細胞は、インキュベーションの最後の１８時間の間、１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンでパルスし、その後、μ−カウンター（Wallac社製、米国ミネソタ州）でｃｐｍを測定した。ｍＡｂでコーティングされたプレートで、５×１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを培養した。Ｍａｒｔ−１及びインフルエンザＭ１特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、それぞれ培養の１０日目及び７日目に、抗ＣＤ８及び四量体で細胞を染色することにより測定した。１０μＭのＭａｒｔ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号２）及び２０ｎＭのＭａｒｔ−１ペプチド含有組換えタンパク質（以下を参照）を、ＤＣ及びＣＤ８Ｔ細胞培養液に添加した。２０ｎＭの精製組換えインフルエンザＭ１タンパク質（以下を参照）をＰＢＭＣ培養液に添加した。
【００７３】
モノクローナル抗体：マウスｍＡｂは従来技術により産生した。手短かに言えば、６週齢のＢＡＬＥ／ｃマウスを、Ｒｉｂｉアジュバントと共に２０μｇの受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質で腹腔内免疫し、その後、１０日及び１５日後に２０μｇの抗原で追加免疫した。３か月後、脾臓を採取する３日前にマウスを再び追加免疫した。或いは、３０〜４０日間にわたって３〜４日ごとに、Ｒｉｂｉアジュバント中の１〜１０μｇの抗原をマウスの足蹠に注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を回収した。脾臓又はリンパ節細胞に由来するＢ細胞を、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞と融合させた。ハイブリドーマ上清をスクリーニングして、融合パートナー単独又はアルカリホスファターゼに融合した受容体エクトドメインと比較して、受容体エクトドメイン融合タンパク質に対するＡｂを分析した（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）。その後、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３Ｆ細胞を使用して、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、CELLineフラスコ（Intergra社製、米国カルフォル二ア州）中で、単細胞クローニングし増殖させた。ハイブリドーマ上清を、等容積の１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelectレジンと共に回転させた。結合緩衝液でレジンを洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２ＭＴｒｉｓで中和した後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００７４】
ＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡ、並びにインフルエンザ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を測定した。既知量のＩｇ及びヒトＡＢ血清を含有する標準ヒト血清（Bethyl社製）を、それぞれ全Ｉｇ及びインフルエンザ特異的Ｉｇ用の標準物質として使用した。試料中のインフルエンザ特異的Ａｂの力価、単位は、同一の光学密度を示すＡＢ血清の希釈係数として定義された。ＢＡＦＦ及びＢＬｙＳの量は、ＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystem社製、米国カリフォルニア州）により測定した。
【００７５】
ＲＮＡ精製及び遺伝子分析：全ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen社製）で抽出し、２１００型Bioanalyser（Agilent社製）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion社製）を使用して調製し、Sentrix Human6 BeadChips（４６Ｋ転写物）にハイブリダイズした。これらのマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングされた微小ウェルに内蔵された３μｍビーズに取り付けられた５０ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色した後、Illumina社により製造されたサブミクロン解像度スキャナー（Beadstation 500X）を使用して、アレイ表面を画像化する。遺伝子発現分析ソフトウェアプログラム、GeneSpring、バージョン７．１（Agilent社製）を使用して、データ分析を行った。
【００７６】
組換えインフルエンザＭ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製：ＰＣＲを使用して、開始コドンに対して遠位であるNheI部位及び終止コドンに対して遠位であるNotIを組み込む一方で、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ （Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅した。消化された断片は、pET-28b(+)（Novagen社製）にクローニングし、Ｍ１のＯＲＦをＨｉｓ６タグと共にインフレームで配置し、したがってＨｉｓ．インフルエンザＭ１タンパク質をコードした。NcoI及びNheI部位間に挿入された、Ｃ．サーモセラム（C.thermocellum）由来のＮ末端１６９残基のコヒーシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体（未発表）は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヒーシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓの発現の場合、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号３）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号４）をコードする：影付の残基は、免疫優勢ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであり、ペプチドを取り囲む下線の残基は、ＭＡＲＴ−１由来である）を、上記ベクターのNheI及びXhoI部位間に挿入した。１２０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧを添加した際の対数増殖期の中間部まで２００回転／分で振とうし、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）で選択し３７℃のＬＢ中で増殖させた大腸菌（E.Coli）株BL21(DE3)（Novagen社製）又はT7Express（NEB社製）で、タンパク質を発現させた。３時間後、細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で保管した。各１Ｌの発酵液からの大腸菌細胞を、０．１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルII（Calbiochem社製、米国カリフォルニア州）を有する、氷冷した３０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）に再懸濁した。リセット期間を５分間、設定を１８にして（Fisher社製Sonic Dismembrator 60）、細胞を氷上で２×５分間超音波処理し、その後、４℃で２０分間、１７，０００ｒ．ｐ．ｍ．（Sorvall社製SA-600）で回転させた。Ｈｉｓ．インフルエンザＭ１精製の場合、５０ｍｌの細胞溶解産物上清画分を、５ｍｌのＱセファロースビーズを通して通過させ、６．２５ｍｌの１６０ｍＭＴｒｉｓ、４０ｍＭイミダゾール、４ＭＮａＣｌ ｐＨ７．９をＱセファロース通過物に添加した。これを、Ｎｉ＋＋で充填された５ｍｌのHiTrap chelating HPカラムに、４ｍｌ／分で負荷した。カラムに結合したタンパク質を、２０ｍＭＮａＰＯ４、３００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ｄ）で洗浄し、その後１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でさらに洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で溶出した。ピーク画分を貯留し、１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ５．５で平衡化された５ｍｌのHiTrap Sカラムに４ｍｌ／分で負荷し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後０〜１ＭまでのＮａＣｌ勾配を用いて５０ｍＭＮａＰＯ４ ｐＨ５．５中で溶出した。約５００ｍＭＮａＣｌで溶出したピーク画分を貯留した。Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１．Ｈｉｓ精製の場合、２Ｌの培養液からの細胞を上記のように溶解した。遠心分離の後、２．５ｍｌのTriton X114を上清に添加し、氷上で５分間インキュベーションした。２５℃で５分間さらにインキュベーションした後、２５℃での遠心分離に引き続いて上清をTriton X114から分離した。抽出を繰り返し、上清を５ｍｌのＱセファロースビーズを通して通過させ、６．２５ｍｌの１６０ｍＭＴｒｉｓ、４０ｍＭイミダゾール、４ＭＮａＣｌ ｐＨ７．９を、Ｑセファロース通過物に添加した。その後、タンパク質をＮｉ＋＋キレートクロマトグラフィーにより上述のように精製し、緩衝液Ｄ中の０〜５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００７７】
特定の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのみがＤＣ活性化特性を有する：本発明は、ＤＣ活性化が抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体の一般的な特性ではなく、むしろある種の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのみがこの機能を有すことを開示する。図５は、ある種のｍＡｂのみがＤＣ−ＡＳＧＰＲを介してＤＣＳを活性化することを示し、それは、実際のＤＣに対するスクリーニングにより特徴付けられなければならない。
【００７８】
抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのＬ及びＨ可変領域に対応する特定の配列：本発明は、治療的又は防御的製品の望ましい構成要素である抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体に対応する以下に示された特定のアミノ酸配列（例えばヒト化組換え抗体と関連した）を包含する。下記は、キメラマウスＶ領域−ヒトＣ領域組換え抗体と関連するそのような配列である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号５）である。上記の配列は、ｍＡｂ４９Ｃ１１のＨ鎖Ｖ領域（下線で示されている）とｈIｇＧ４のＣ領域との間のキメラである。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、対応するＬ鎖キメラ−QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号６）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４Ｇ２．２＿Ｈｖ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRLNYFDYWGQGTTLTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号７）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４Ｇ２．２＿Ｋｖ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYALSITSLQTEDLATYYCQQCWTSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号８）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS（配列番号９）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１０）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ１Ｈ１１Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHGKSLEWIGGINPINGGPTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWDYGSRDVMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号１１）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ１Ｈ１１Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１２）である。本発明は、これらのＶ領域配列、並びに例えばＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する親和性を増強するために当業者により修飾された関連配列、及び／又はヒトＶ領域フレームワーク配列へと組み込まれ、抗原提示細胞上のＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合できるタンパク質型の発現を指示するために発現ベクター中に工学的に作製される関連配列を起想する。
【００７９】
工学的に作製された組換え抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ組換え抗体−抗原融合タンパク質（（ｒＡｂ．抗原）は、インビトロで効果的なプロトタイプワクチンである：発現ベクターは、例えばＨ鎖コード配列にインフレームで融合した多様なタンパク質コード配列で構築できる。例えば、インフルエンザＨＡ５、インフルエンザＭ１、ＨＩＶ ｇａｇ、又は癌抗原に由来する免疫優勢ペプチドなどの抗原、又はサイトカインは、本発明との関連では、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する抗原提示細胞の表面へと、抗原又はサイトカイン（又はトキシン）を直接的に導くために抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ Ｖ領域配列を使用することに由来する有用性を有し得るｒＡｂ．抗原又はｒＡｂ．サイトカイン融合タンパク質として、引き続いて発現することができる。これは、例えば抗原の内部移行を可能にし、時には受容体の活性化を伴い、治療的又は防御的作用の開始を確実にする（例えば、強力な免疫応答の開始を介して、又は標的細胞の死滅を介して）。この概念に基づいた例示的なプロトタイプワクチンは、［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ５−１−６×Ｈｉｓ］又はEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLAHHHHHH（配列番号１３）などのＨ鎖ベクターを使用できる。上記の配列は、可動性リンカー配列（イタリック体で示されている）を介してトリインフルエンザＨＡ５のＨＡ−１ドメイン（太字で示されている）に融合した、既示のキメラＨ鎖に対応する。これは、上記で既示の対応するＬ鎖キメラ配列と同時発現できる。同様に、配列［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｄｏｃｋｅｒｉｎ］−DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI（配列番号１４）は、上記で既示の対応するＬ鎖配列の同時形質移入により、ｒＡｂ．ドックリン融合タンパク質を発現するために使用できる。
【００８０】
図６は、異なる抗原がＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂと関連して発現され得ることを示す。そのような抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質は、任意のコヒーシン．融合タンパク質と単に混合して、ｒＡｂ．融合タンパク質と全く同様に機能する、安定した非共有結合性の［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体を構築できる。図６は、そのような［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する細胞の表面に抗原を集中させ得ることを示す。この図は、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１複合体が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲのｃＤＮＡで形質移入した２９３Ｆ細胞の表面にインフルエンザＭ１を送達することも示す。１μｇ／ｍｌ（右パネル）の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂ（緑色で示されている）又は対照ｈＩｇＧ４．Ｄｏｃ ｒＡｂ（青色で示されている）を、ビオチン化されたＣｏｈ．インフルエンザＭ１（２μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベートした。形質移入した２９３Ｆ細胞を添加し、氷上で２０分間インキュベーションを継続した。その後、細胞を洗浄し、ＰＥ標識ストレプトアビジンで染色した。その後、ＰＥ蛍光について細胞を分析した。
【００８１】
ドックリン：コヒーシン相互作用を介してインフルエンザＭ１と複合体を形成した抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂは、抗原をヒトＤＣにターゲッティングし、その結果、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖する：例えばＤＣに抗原を送達するデバイスとしての抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂの潜在的有用性を下記の図に示す。図７は、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８＋細胞の劇的な増殖が、インフルエンザＭ１に対する防御免疫応答の誘発に向けられたワクチンとしてのそのような作用物質の効力を高度に予測することを示す。
【００８２】
図８は、様々な抗体とサルＡＳＧＰＲとの交差反応性を実証した。pIRESベクターのNheI−NotI部位にＰＣＲ産物を挿入することにより、pIRES_ASGPR-mon（サル）をクローニングした。最終産物の配列は、クローン５Ｓ１０に基づく。他のほとんどのクローンは、これと類似してアミノ酸が１つ異なるか、又はこれと同一であるかのいずれかである。しかしながら、１つのクローン、５Ｓ１は、３’末端付近でＡの欠失を有し、短縮された異なるＣ’末端を生成し、第２の変異体として使用できる。サルＡＳＧＰＲをクローニングするために、以下のオリゴが使用された：ＤＣ−ＡＳＧＰＲ＿ＭｏＮ：gaattcgctagcCACCATGACATATGAAAACTTCCAAGACTTGGAGAGTGAGGAGAAAGTCCAAGGGG（配列番号１５）；及びＤＣ−ＡＳＧＰＲ＿Ｍｏ：CGAATTCGCGGCCGCTCAGTGACTCTCCTGGCTGGCCTGGGTCAGACCAGCCTCGCAGACCC（配列番号１６）、これは、GGGTCTGCGAGGCTGGTCTGACCCAGGCCAGCCAGGAGAGTCACTGAGCGGCCGCGAATTCG（配列番号１７）の逆方向相補体である。当業者に知られているように、配列比較により、オーバーラップの可能性のある領域、したがって交差反応性が指摘される。
【００８３】
以下の表は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ３３４９９８ ２００ｕｇ／ｍｌ １２．０５．０７ ｃｆｇ＃５５８抗ヒトＩｇＧ ＰＥの結合を実証した。
【００８４】
【表１】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
本明細書で論じたあらゆる実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実現し得ることが企図され、逆も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用できる。
【００９５】
本明細書中に記載された特定の実施形態は、例示の目的で示されており、本発明の限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、種々の実施形態において使用できる。当業者であれば、定常的な実験を行っただけで、本明細書中に記載された特定の手順に対する多数の均等な手順を認識又は確認することができよう。そのような均等な手順は、本発明の範囲内であると見なされ、特許請求の範囲により包含される。
【００９６】
明細書中で言及された文献及び特許出願はすべて、本発明が属する当業者の技術レベルを示す。文献及び特許出願はすべて、参照により組み込むために個々の各文献又は特許出願があたかも特に個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９７】
「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において「含む」という用語と共に使用される場合、「１つ」を意味し得るが、それは、「１又は複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１つを超えた」とも矛盾しない。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されていない限り、又は選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願の全体にわたって、「約」という用語は、ある値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法、又は研究対象に存在する変動に関する誤差の固有変動を含むことを示すために使用される。
【００９８】
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）で使用される場合、「含む（comprising）」（並びに、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに、「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに、「含む（includes）」及び「含む（include）」など、含む（including）の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに、「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」など、含有する（containing）の任意の形態）という単語は、包括的又は非限定的であり、付加的、未説明の要素又は方法ステップを除外しない。
【００９９】
「又はそれらの組合せ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語に先行する列挙された項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の文脈で順番が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つも含むと意図される。引き続きこの例で、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、及びＣＡＢＡＢＢなどの１又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せが、明示的に含まれる。当業者であれば、文脈からそうでないと明白でない限り、任意の組合せにおける項目又は用語の数に、典型的には制限がないことを理解するであろう。
【０１００】
本明細書中で開示又は特許請求された組成物及び／又は方法のすべては、本開示に照らして、過剰な実験をせずに作製及び実行できる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態の点から記載されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、本明細書中に記載された組成物及び／又は方法、並びにその方法のステップ又は一連のステップに変異が適用できることは明白であろう。当業者に明白なそのような類似した代替物及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるものとする。
（参考文献）
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44. E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、樹状細胞アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ−ＡＳＧＰＲ、dendritic cell asialoglycoprotein receptor）を介して抗原提示細胞に結合する作用物質の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を、抗原提示との関連で説明する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性の細胞間シグナルを提供し、その後病原体を認識することにより、自然免疫及び獲得免疫の橋渡しを制御するのに極めて重要な役割を果たす。ＤＣのこれらの機能は、トール様受容体（ＴＬＲ、toll-like receptor）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ、lectin-like receptor）により最も顕著に代表される「パターン認識受容体」（ＰＲＲ、pattern recognition receptor）である特化した表面受容体の発現に大きく依存する（C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)、E. Pyz, A. S. Marshall, S. Gordon, G. D. Brown, Ann Med 38, 242 (2006)、G. D. Brown, Nat Rev Immunol 6, 33 (Jan, 2006)）。
【０００４】
現在の理論的枠組において、ＴＬＲの主要な役割とは、免疫応答を開始するために、インターロイキン１２（ＩＬ−１２、interleukin 12）及び他の炎症性サイトカインを産生するようにＤＣに警告することである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉及び取り込み機序の構成要素として作用する（C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)）。しかしながら、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞遊走（T. B. Geijtenbeek et al., Nat Immunol 1, 353 (Oct, 2000)）、細胞間相互作用（T. B. Geijtenbeek et al., Cell 100, 575 (Mar 3, 2000)）を含む幅広い範囲の生物学的機能を有し得る。ＬＬＲのこれらの多機能性は、ＬＬＲがＴＬＲとは異なり、自己及び非自己の両方を認識できるという事実に起因し得る。しかしながら、多数のＬＬＲが免疫細胞中で発現されるという重複性を含むＬＬＲの複雑性は、個々のＬＬＲの詳細な機能を理解するための主要な障害の１つである。加えて、これらの受容体のほとんどに対する天然リガンドは、未同定のままである。にもかかわらず、最近の研究からの証拠は、ＬＬＲが、ＴＬＲと連携して微生物感染中の免疫細胞の活性化に寄与できることを示唆している（C. F. d'Ostiani et al., J Exp Med 191, 1661 (May 15, 2000)、C. Fradin, D. Poulain, T. Jouault, Infect Immun 68, 4391 (Aug, 2000)、A. Cambi et al., Eur J Immunol 33, 532 (Feb, 2003)、M. G. Netea, J. W. Meer, I. Verschueren, B. J. Kullberg, Eur J Immunol 32, 1455 (May, 2002)、S. J. Lee et al., Science 295, 1898 (Mar 8, 2002)、N. Maeda et al., J Biol Chem 278, 5513 (Feb 21, 2003)、L. Tailleux et al., J Exp Med 197, 121 (Jan 6, 2003)、T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)、A. M. Cooper et al., J Immunol 168, 1322 (Feb 1, 2002)）。
【０００５】
Valladeauら（The Journal of Immunology, 2001, 167: 5767-5774）は、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体と関連する未成熟なヒト樹状細胞上の新規なＬＬＲ受容体を記述しており、それが効率的にエンドサイトーシスを媒介することを実証した。ＤＣ−ＡＳＧＰＲのｍＲＮＡは、免疫組織で、ＤＣ及び顆粒球で主に認められたが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、又は単球では認められなかった。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ種は、ＣＤ３４由来の先駆細胞から得られたＣＤ１４由来のＤＣに限定されており、ＣＤ１ａ由来のサブセットには存在しなかった。単球由来のＤＣ及び扁桃間質型ＤＣの両方は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲタンパク質を発現したが、ランゲルハンス型細胞は発現しなかった。さらに、ＣＤ４０活性化の際に発現が失われたため、ＤＣ−ＡＳＧＰＲは未成熟の特徴であった。細胞質内ドメインにおけるチロシンに基づくモチーフ及びジロイシンモチーフの存在と合致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂは、３７℃でＤＣにより急速に内部移行された。最後に、細胞内ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、初期エンドソームに局在化されており、受容体がリガンドの内部移行後に細胞表面へと再利用されることが示唆された。これらの知見により、未成熟なＤＣの特徴として及びＤＣの特化したＡｇ捕捉機能に重要な別のレクチンとして、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ／ヒトマクロファージレクチンが同定された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nat Rev Immunol 2, 77 (Feb, 2002)
【非特許文献２】E. Pyz, A. S. Marshall, S. Gordon, G. D. Brown, Ann Med 38, 242 (2006)
【非特許文献３】G. D. Brown, Nat Rev Immunol 6, 33 (Jan, 2006)
【非特許文献４】T. B. Geijtenbeek et al., Nat Immunol 1, 353 (Oct, 2000)
【非特許文献５】T. B. Geijtenbeek et al., Cell 100, 575 (Mar 3, 2000)
【非特許文献６】C. F. d'Ostiani et al., J Exp Med 191, 1661 (May 15, 2000)
【非特許文献７】C. Fradin, D. Poulain, T. Jouault, Infect Immun 68, 4391 (Aug, 2000)
【非特許文献８】A. Cambi et al., Eur J Immunol 33, 532 (Feb, 2003)
【非特許文献９】M. G. Netea, J. W. Meer, I. Verschueren, B. J. Kullberg, Eur J Immunol 32, 1455 (May, 2002)
【非特許文献１０】S. J. Lee et al., Science 295, 1898 (Mar 8, 2002)
【非特許文献１１】N. Maeda et al., J Biol Chem 278, 5513 (Feb 21, 2003)
【非特許文献１２】L. Tailleux et al., J Exp Med 197, 121 (Jan 6, 2003)
【非特許文献１３】T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)
【非特許文献１４】A. M. Cooper et al., J Immunol 168, 1322 (Feb 1, 2002)
【非特許文献１５】Valladeau et al., The Journal of Immunology, 2001, 167: 5767-5774
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、代用抗原のヒトＤＣへの内部移行を指示できることが知られているが、本発明は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの新規な生物学的活性を使用し、ある場合には抗原取り込み（例えばワクチン接種）との関連で、他の場合には、ＤＣ、Ｂ細胞、及び単球上のこの受容体を介するシグナル伝達を誘発可能なＤＣ−ＡＳＧＰＲエフェクターの固有の作用を介して（単独で又は他の免疫調節分子と協調して）、免疫系において特に望ましい変化を生じさせる。本発明の開示は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する細胞を活性化することが可能である固有な作用物質を開発する手段と共に、これらのシグナルを受容する細胞にその結果生じる変化の効果が、免疫系の他の細胞に対する作用に関係することを明らかにする。これらの効果は（単独で、又は他のシグナルと協調して（つまり共刺激）のいずれかで）、ある種の疾患状態の治療結果を、又はワクチン接種との関連においては防御的結果の増強を高度に予測する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗体−抗原複合体を形成する標的作用物質が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製することにより、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる組成物及び方法を含み、この作用物質は、例えば抗体−作用物質複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される。一実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞であり、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片はコヘリン／ドックリン（Coherin/Dockerin）対の半分に結合している。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片はコヘリン／ドックリン対の半分にも結合でき、抗原はコヘリン／ドックリン対の相補的な半分に結合して、複合体を形成する。作用物質の非限定的な例には、１又は複数のペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、及びそれらの組合せが含まれる。
【０００９】
作用物質は、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ、transforming growth factor）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、platelet derived growth factor）、上皮成長因子（ＥＧＦ、epidermal growth factor）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ、connective tissue activated peptide）、骨形成因子、並びにそのような成長因子の生理活性類似体、断片、及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリトロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、並びにβトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）；骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合性成長因子（繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、insulin-like growth factor））；インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）；増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーから選択される１又は複数のサイトカインであり得る。別の実施形態では、作用物質は、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質である抗原を含む。
【００１０】
本発明は、樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させるための組成物及び方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を結合するステップを含み、その抗原が、抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される組成物及び方法も含む。別の実施形態は、防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用である。皮膚を介したワクチン接種のための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用；同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用、又は組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【００１１】
別の実施形態は、患者の樹状細胞を単離するステップ；活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に樹状細胞を曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を患者へ再導入するステップによって、樹状細胞の有効性を増大させる方法を含む。抗原は、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質であり得る。本発明は、哺乳動物細胞から分泌された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリン又はその一部、及び免疫グロブリンに結合した抗原も含む。免疫グロブリンは、コヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合し、又はモジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分、若しくは抗原との融合タンパク質であるコヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分を含んでもよい。抗原特異的ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びにＦｃドメインの一部を有するＦａｂｃ断片及び／又はＦａｂ断片であり得る。抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリンは毒素に結合してもよく、ここで毒素は、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン（seguitoxin）、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン（cyanoginosin）、α菌毒、テトロドトキシン、アコノトキシン（aconotoxin）、ヘビ毒、及びクモ毒からなる群から選択される。抗原は、免疫グロブリンとの融合タンパク質でもよく、又はそれと共有結合若しくは非共有結合で化学的に結合したものでもよい。
【００１２】
本発明は、患者の樹状細胞を単離するステップ、活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に樹状細胞を曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップ；並びに抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を患者へ再導入するステップにより、樹状細胞の有効性を増大させるための組成物及び方法も含む。作用物質を使用して、治療的又は防御的適用で、単独で又は共活性化作用物質と共にＤＣ−ＡＳＧＰＲと結合して抗原提示細胞を活性化し、防御的又は治療的ワクチン接種のために、抗原に連結されたＤＣ−ＡＳＧＰＲ及び／又は活性化作用物質を単独で又は共活性化作用物質と共に結合することができる。別の使用は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介した免疫細胞の不適切な活性化から生じることが知られている又は疑われている疾患と関連した治療目的のために毒性作用物質に連結された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ作用物質、及び抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を有し、その抗原が抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシングされ提示されるワクチンとして使用するために、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合及び活性化することが可能な特異的抗体Ｖ領域配列を開発することである。
【００１３】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、添付された図と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−１Ｅ】レクチン様受容体ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介するシグナル伝達がＤＣを活性化し、その結果、サイトカイン及びケモカインだけでなく共刺激分子のレベルが増大することを実証する図である。図１Ａは、３日間及び６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで、その後マウスモノクローナル抗ヒトＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体で染色したことを示す。図１Ｂは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂ（１〜２ｕｇ／ｍｌ）でコーティングされたプレートで、１６〜１８時間培養したことを示す。細胞は、蛍光染料で標識された抗ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。ヒストグラム中の白色バー及び黒色バーは、それぞれアイソタイプ対照ｍＡｂ及び抗レクチンｍＡｂで活性化された細胞を表す。図１Ｃは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１２時間培養し、方法の項で説明したように、ＲＮＡ単離及びAffymetrix社製Gene Chip解析に供したことを示す。抗レクチンｍＡｂによる遺伝子発現の倍増を、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣにおける遺伝子発現レベルと比較した。図１Ｄは、図１Ｂで示された実験に由来する培養上清中のサイトカイン及びケモカインを、Luminexにより測定したことを示す。図１Ｅは、６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌの存在下又は非存在下で、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１６〜１８時間培養し、その後抗ＣＤ８３抗体で染色したことを示す。図１Ｅで示された実験に由来する培養上清中のサイトカイン及びケモカインを、Luminexにより測定した。示された結果は、異なる正常供与体に由来する細胞を使用した３回の独立した実験を表す。
【図２Ａ−２Ｄ】ＤＣ上に発現したＤＣ−ＡＳＧＰＲが、体液性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。５×１０３個／ウェルの６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂでコーティングされた９６ウェルプレートで１６〜１８時間インキュベートし、その後ＣＦＳＥで染色された１×１０５個の自己ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、２０単位／ｍｌのＩＬ−２及び５０ｎＭのＣｐＧの存在下で共培養した。図２Ａは、蛍光性標識抗体で染色された６日目の細胞のＦＡＣＳである。ＣＤ３＋及び７−ＡＡＤ＋細胞はゲートをかけて除外した。ＦＡＣＳソーターによりＣＤ３８＋及びＣＦＳＥ−細胞を精製し、ギムザ染色を実施した。図２Ｂは、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＭについて、１３日目の培養上清をサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析したことを示す。図１Ｃは、５感染多重度（ｍｏｉ、multiplicity of infection）の加熱不活性化インフルエンザウィルス（ＰＲ８）でＤＣをパルスし、Ｂ細胞と共に培養したことを示す。１３日目に、インフルエンザ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）について培養上清を分析した。図１Ｄは、細胞表面ＡＰＲＩＬの発現については、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂ又は対照ｍＡｂで培養されたＤＣを染色し、可溶性ＡＰＲＩＬについては、上清をアッセイしたことを示す。
【図３Ａ−３Ｄ】Ｂ細胞上におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの細胞表面発現が、Ｂ細胞活性化及び免疫グロブリン産生に寄与することを示す図である。図３Ａは、バフィーコートに由来するＰＢＭＣを、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３、及び抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲｍＡｂ又は対照ｍＡｂで染色したことを示す。ＣＤ１９＋及びＣＤ３＋細胞にゲートをかけ、ＣＤ１９＋Ｂ細胞上の分子の発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。図３Ｂは、バフィーコートに由来するＣＤ１９＋細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１２時間培養し、方法の項で説明したように、ＲＮＡ単離及びAffymetrix社製Gene Chip解析に供したことを示す。抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂによる遺伝子発現の倍増を、対照ｍＡｂで刺激されたＣＤ１９＋Ｂ細胞における遺伝子発現レベルと比較した。図３Ｃは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１６〜１８時間培養し、その後サイトカイン及びケモカインについて、培養上清をLuminexにより分析したことを示す。図３Ｄは、１×１０５個のＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ｍＡｂでコーティングされたプレートで１３日間培養したことを示す。全Ｉｇレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。データは、３つの異なる正常供与体に由来する細胞を使用した２回の繰り返し実験を表す。
【図４Ａ−４Ｄ】精製された同種異系Ｔ細胞の増殖が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで刺激されたＤＣにより著しく増強されたことを示す図である。
【図５】ある種の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂがＤＣを活性化できることを示す図である。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４。１２種の純粋な抗ＡＳＧＰＲ ｍＡｂパネルの１つと共に、ＤＣを２４時間インキュベートした。その後、細胞表面ＣＤ８６（ＤＣ活性化マーカー）の発現については細胞を試験し、分泌されたサイトカインについては上清をアッセイした。抗ＡＳＧＰＲ ｍＡｂパネルからの３種のｍＡｂ（３６、３８、４３）が、ＤＣを活性化した。
【図６】異なる抗原がＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂと関連して発現され得ることを示す図である。そのような抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質を、任意のコヒーシン．融合タンパク質と単に混合して、ｒＡｂ．融合タンパク質と全く同様に機能する、安定した非共有結合性［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体を構築することができる。
【図７】ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＦＮａ ＤＣ（５，０００個／ウェル）を、１０ｎＭ又は１ｎＭの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１、又はｈＩｇＧ４．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１複合体で負荷した。６時間後、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞（２００，０００個／ウェル）を培養液に添加した。８日目に、ＨＬＡ−Ａ２０１免疫優性ペプチドに特異的なＴＣＲを保持する細胞の増殖について、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。内部の囲みは、四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図８】様々な抗体とサルＡＳＧＰＲとの交差反応性を実証した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の種々の実施形態の作製及び使用について以下に詳細に論じるが、本発明は、多様な特定の場面で具体化できる多数の適用可能な発明概念を提供することを理解されたい。本明細書で論じる特定の実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するに過ぎず、本発明の範囲の境界を定めるものではない。
【００１６】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関係する分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単一の実体のみを指すのではなく、その特定の例を例示で使用できる一般的な種類を含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を記述するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲で大要を記載しているのを除いて、本発明の境界を定めるものではない。
【００１７】
樹状細胞（ＤＣ、dendritic cell）は、抗原特異的免疫の調節に重要な役割を果たす抗原提示細胞である（Mellman and Steinman 2001）、（J. Banchereau et al., Annu Rev Immunol 18, 767 (2000))、（Cella, Sallusto et al. 1997）。ＤＣは、抗原を捕捉し、それらをペプチドへとプロセシングし、Ｔ細胞にこれらを提示する。したがって、抗原をＤＣに直接送達することは、ワクチンを改善するための重点領域である。そのような例の１つは、その後患者に再投与される自己ＤＣへの生体外抗原負荷を使用した、ＤＣに基づくワクチンの開発である（Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001）、（Steinman and Dhodapkar 2001）。ワクチン効能を改善するための別の戦略は、内部移行化ＤＣ特異的受容体に対する抗体に結合した抗原をＤＣに特異的にターゲッティングすることである。ワクチン接種のためにＤＣをターゲッティングする可能性は、重要なマウス研究により強調されている。インビボでは、オバルブミン（ＯＶＡ）に結合した抗ＬＯＸ−１ｍＡｂを用いたターゲッティングにより、ＭＨＣクラスＩ経路に向けた外来性抗原交差提示を介して、防御的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導された（Y. Delneste et al., Immunity 17, 353 (Sep, 2002)）。また、抗ＤＥＣ２０５ｍＡｂに結合したＯＶＡは、ＣＤ４０Ｌ成熟刺激と組み合わせると、ＤＣによるＭＨＣクラスＩ拘束性提示をインビボで増強し、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続的形成に結びついた（Bonifaz, Bonnyay et al. 2004）。これらの研究は両方とも、劇的な用量節約（つまり、非常に低い抗原用量での強力な免疫応答）を示し、他のタイプのＯＶＡ免疫で通常認められるよりも広範な応答を示唆した。ＨＩＶ ｇａｇ抗原をＤＥＣ２０５を介してＤＣにターゲッティングする最近の研究では、これらの概念が臨床的に関連する抗原に拡張され、抗原のＤＣへのターゲッティングの基本特性、すなわち劇的な用量節約、単回ワクチン接種による防御的応答、並びにＣＤ８及びＣＤ４の両区画における抗原特異的Ｔ細胞の増殖が確認された（Trumpfheller, Finke et al. 2006）。
【００１８】
本発明は、制御された多変量的な様式で、複数の抗原又はタンパク質（一次ｍＡｂから独立して工学的に作製され、発現され、精製された）の１つの単一の一次組換えｍＡｂとの複合体形成を提供する。現在、異なるタンパク質（各々は別々に工学的に作製され、ストレプトアビジンに連結される）を、１つの一次ｍＡｂに付加することをもたらす部位特異的なビオチン化部位を工学的に作製するための方法が存在する。しかしながら、本発明は、一定の等モル比率及び位置に、別々に工学的に作製されたタンパク質の複数の組合せを一次ｍＡｂに付加することを提供する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「モジュール型ｒＡｂ担体」という用語は、多様な抗原、活性化タンパク質、又は他の抗体の、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ、monoclonal antibody）への、制御されたモジュール付加をもたらすのに工学的に作製された、組換え抗体系を示すのに使用される。ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技術、組換え抗体ディスプレイ、及びヒト化モノクローナル抗体などを使用して作製されたモノクローナル抗体でありえる。モジュール型ｒＡｂ担体は、例えば、複数の抗原及び／又は抗原及び活性化サイトカインを樹状細胞（ＤＣ）にターゲッティングするのに（内部移行する受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）使用できる。モジュール型ｒＡｂ担体は、制御及び規定された方法で、２つの異なる組換えｍＡｂを端と端とで連結するためにも使用できる。
【００２０】
「モジュール型ｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変及び第１の定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びに同系統のモジュール型結合部分がアミノ酸配列に付加及び／又は結合されたＦｃドメインの一部を有するＦａｂｃ断片及び／又はＦａｂ断片であり得る。モジュール型ｒＡｂ担体に使用するための抗体は、任意のアイソタイプ又はクラス、サブクラス又は任意の供給源（動物及び／又は組換え）由来であり得る。
【００２１】
１つの非限定的な例では、モジュール型ｒＡｂ担体は、工学的に作製された組換えｍＡｂと関連して、特定の規定されたタンパク質複合体を作製するための１又は複数のモジュール型コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインを有するように工学的に作製される。ｍＡｂは、ｍＡｂの抗原結合ドメインに由来する１又は複数のモジュール型コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインのカルボキシを含む融合タンパク質の一部である。コヒーシン−ドックリンタンパク質ドメインは、例えば、化学的架橋剤及び／又はジスルフィド結合を使用することにより、翻訳後でも結合させることができる。
【００２２】
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の受容個体において体液性及び／又は細胞性免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明では２つの異なる場面で使用され得る：抗体若しくはｒＡｂの他の抗原認識ドメインの標的として、或いはモジュール型ｒＡｂ担体に相補的なドックリン／コヒーシン分子の一部として、細胞若しくは標的に及び／又は細胞若しくは標的内にｒＡｂにより運搬される分子としてである。抗原とは、通常、ワクチン接種が有利な治療となる疾患を引き起す作用物質である。抗原がＭＨＣ上に提示される場合、ペプチドは約８個〜２５個のアミノ酸であることが多い。抗原には、例えば、単純な中間代謝産物、糖類、脂質、及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、及びタンパク質などの高分子を含む任意のタイプの生体分子が含まれる。一般的な抗原の分類には、それらに制限されないが、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫性疾患、アレルギー、及び移植片拒絶反応に関与する抗原、並びに他の様々な抗原が含まれる。
【００２３】
モジュール型ｒＡｂ担体は、任意の数の活性作用物質、例えば抗生物質、抗感染症薬、抗ウィルス剤、抗腫瘍剤、下熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝血剤、ポリサッカリド、コラーゲン、細胞、及び複数の先述した活性作用物質の組合せを運搬できる。本発明を使用して送達する抗生物質の例には、限定されないが、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬物、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アムホテリシンＢ、アマンチジン（amantidine）、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アンチノマイシンＤ（antinomycin D）、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びイミダゾールカルボキサミドなどが含まれる。
【００２４】
本発明を使用して送達する抗腫瘍作用物質の例には、限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、及びメトトレキサートなどが含まれる。下熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、モトリン（登録商標）、イブプロフェン（登録商標）、ナプロシン（naprosyn）、及びアセトアミノフェンなどが含まれる。
【００２５】
本発明を使用して送達する抗炎症剤の例には、限定されないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、及びジクロフェナクＮａなどが含まれる。
【００２６】
本発明を使用して送達する、骨粗鬆症を治療するための治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定されないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド並びにその突然変異、誘導体、及び類似体が含まれる。
【００２７】
本発明を使用して送達する酵素及び酵素補助因子の例には、限定されないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、superoxide dismutase）などが含まれる。
【００２８】
本発明を使用して送達するサイトカインの例には、限定されないが、インターロイキン、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成因子、及びそのような成長因子の生理活性類似体、断片、及び誘導体が含まれる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞成長因子、分裂促進サイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成誘導因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンフォトキシン−β、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリトロポエチン、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せであり得る。他のサイトカインには、βトランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）；骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）；ヘパリン結合性成長因子（例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））；インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）；増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）；及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めたトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）遺伝子スーパーファミリーのメンバーが含まれる。
【００２９】
本発明を使用して送達する成長因子の例には、限定されないが、哺乳動物細胞からなどのように天然供給源又は自然供給源から単離できるか、又は組換えＤＮＡ技術若しくは種々の化学的工程によるなどのように合成的に調製できる成長因子が含まれる。加えて、これらの因子の類似体、断片、又は誘導体は、それらが天然分子の生物学的活性の少なくとも一部を示すという条件で、使用することができる。例えば、類似体は、部位特異的突然変異又は他の遺伝子工学技術により改変された遺伝子の発現により調製できる。
【００３０】
本発明を使用して送達する抗凝血剤の例には、限定されないが、ワルファリン、ヘパリン、及びヒルジンなどが含まれる。本発明を使用して送達する免疫系に作用する因子の例には、限定されないが、炎症及び悪性新生物を制御する因子、並びに走化性ペプチド及びブラジキニンなどの感染性微生物を攻撃する因子が含まれる。
【００３１】
ウィルス抗原の例には、これらに限定されないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、及び他のＨＩＶ構成要素などのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ、human immunodeficiency virus）抗原に由来するレトロウィルス抗原などのレトロウィルス抗原；Ｂ型肝炎ウィルスのＳ、Ｍ、及びＬタンパク質などの肝炎ウィルス抗原、Ｂ型肝炎ウィルスのプレＳ抗原、及びＣ型肝炎ウィルスＲＮＡなどの、他の肝炎、例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ型肝炎のウィルス成分；赤血球凝集素及びノイラミニダーゼなどのインフルエンザウィルス抗原及び他のインフルエンザウィルス成分；麻疹ウィルス融合タンパク質などの麻疹ウィルス抗原及び他の麻疹ウィルス成分；タンパク質Ｅｌ及びＥ２などの風疹ウィルス抗原及び他の風疹ウィルス成分；ＶＰ７ｓｃなどのロタウィルス抗原及び他のロタウィルス成分；エンベロープ糖タンパク質Ｂなどのサイトメガロウィルス抗原及び他のサイトメガロウィルス抗原成分；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などのＲＳウィルス抗原及び他のＲＳウィルス抗原成分；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄなどの単純ヘルペスウィルス抗原、及び他の単純ヘルペスウィルス抗原成分；ｇｐＩ、ｇｐIIなどの水痘帯状ヘルペスウィルス抗原、及び他の水痘帯状ヘルペスウィルス抗原成分；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅなどの日本脳炎ウィルス抗原、及び他の日本脳炎ウィルス抗原成分；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの狂犬病ウィルス抗原、及び他の狂犬病ウィルス抗原成分が含まれる。ウィルス抗原の追加の例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M.(Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３２】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを使用して送達できる抗原標的には、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウィルスには、ピコルナウィルス、コロナウィルス、トガウィルス、フラビルウィルス（flavirvirus）、ラブドウィルス、パラミクソウィルス、オルトミクソウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パピロマウィルス（papilomavirus）、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、及び海綿状ウィルス（spongiform virus）が含まれる。他のウィルス標的には、インフルエンザ、単純ヘルペスウィルス１及び２、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ、又はＨＩＶが含まれる。病原体には、トリパノソーマ、サナダムシ、円虫、蠕虫、マラリアが含まれる。胎児性抗原又は前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーは、このような方法でターゲッティングできる。他の例には、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種を目的とした本発明によるベクター投与には、ベクター関連抗原が、導入遺伝子の長期発現を可能にするのに十分なほど非免疫原性であることが必要とされ、強力な免疫応答がそのために望まれよう。幾つかの場合には、個体のワクチン接種が、年に１回又は２年に１回のように低頻度でしか必要とされず、感染物質に対して長期的な免疫学的防御を提供できる。ベクターにおいて及び最終的には抗原として本発明と共に使用するための生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸配列の特定の例は、米国特許第６，５４１，０１１号明細書、参照により本明細書中に組み込まれた関連部分、特に本発明と共に使用できる生物及び特異的配列と一致する表に見出すことができる。
【００３３】
本明細書中で開示されたｒＡｂワクチンと共に使用するための細菌抗原には、これらに限定されないが、例えば、百日咳トキシン、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼなどの細菌抗原、及び他の百日咳細菌抗原成分；ジフテリアトキシン又はトキソイドなどのジフテリア細菌抗原、及び他のジフテリア細菌抗原成分；破傷風トキシン又はトキソイドなどの破傷風細菌抗原、及び他の破傷風細菌抗原成分；Ｍタンパク質のなどの連鎖球菌細菌抗原、及び他の連鎖球菌細菌抗原成分；リポポリサッカリドなどのグラム陰性桿菌細菌抗原及び他のグラム陰性細菌抗原成分、ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５、heat shock protein 65）、３０ｋＤａの主要分泌タンパク質、抗原８５Ａなどのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）細菌抗原、及び他のマイコバクテリウム抗原成分；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌カプセルポリサッカリドなどの肺炎球菌細菌抗原、及び他の肺炎球菌細菌抗原成分；カプセルポリサッカリドなどのヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原、及び他のヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原成分；炭疽菌防御抗原などの炭疽菌細菌抗原、及び他の炭疽菌細菌抗原成分；ｒｏｍｐＡなどのリケッチア細菌抗原、及び他のリケッチア細菌抗原成分が含まれる。また、本明細書中に記載された細菌抗原と共に、任意の他の細菌抗原、マイコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リケッチア抗原、又はクラミジア抗原が含まれる。部分的又は全体的な病原体は、ヘモフィルスインフルエンザ；熱帯熱マラリア原虫；ナイセリア・メニンギティディス（neisseria meningitidis）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（streptococcus pneumoniae）；ナイセリア・ゴノロエエ（neisseria gonorrhoeae）；サルモネラ血清型チフス；赤痢菌；ビブリオ・コレラエ（vibrio cholerae）；デング熱；脳炎；日本脳炎；ライム病；エルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）；西ナイルウィルス；黄熱病；野兎病；肝炎（ウィルス性；細菌性）；ＲＳＶ（ＲＳウィルス、respiratory syncytial virus）；ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３；アデノウィルス；天然痘；アレルギー並びに癌であってもよい。
【００３４】
本発明の組成物及び方法で使用するための真菌抗原には、これらに限定されないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０、heat shock protein 60）などのヒストプラスマ真菌抗原、及び他のヒストプラスマ真菌抗原成分；カプセルポリサッカリドなどのクリプトコッカス真菌抗原、及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分；小球抗原などのコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原、及び他のコクシジオデス真菌抗原成分；並びにトリコフィチンなどの白癬真菌抗原、及び他のコクシジオデス真菌抗原成分が含まれる。
【００３５】
原生動物抗原及び他の寄生虫抗原の例には、これらに限定されないが、例えば、メロゾイド表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイド周囲抗原、生殖母細胞／生殖体表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡなどの熱帯熱マラリア原虫抗原、及び他のマラリア原虫抗原成分；ＳＡＧ−１、ｐ３０などのトキソプラズマ抗原、及び他のトキソプラズマ抗原成分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシンなどの住血吸虫抗原、及び他の住血吸虫抗原成分；ｇｐ６３、リポホスホグリカン及びその関連タンパク質などの森林型熱帯リーシュマニア及び他のリーシュマニア抗原性成分、及び他のリーシュマニア抗原成分；並びに７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原などのクルーズトリパノソーマ（trypanosoma cruzi）抗原、及び他のトリパノソーマ抗原成分が含まれる。
【００３６】
本発明のｒＡｂを使用してターゲッティングできる抗原は、一般的に、内部移行の可能性、免疫細胞特異性のレベル、ターゲッティングされる免疫細胞のタイプ、免疫細胞の成熟及び／又は活性化のレベルなどを含む、多数の因子に基づき選択される。樹状細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＡＳＰＧＲなどが含まれ、一方で幾つかの場合には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７の非存在も示す。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１及び／又はＦｃγ受容体が含まれる。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例には、それらに限定されないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲが含まれる。
【００３７】
送達用の細胞表面上の標的抗原には、典型的には腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、及び細胞小器官などに由来する腫瘍抗原に特徴的なものが含まれる。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定されないが、白血病及びリンパ腫などの血液癌、星状細胞腫又は膠芽腫などの神経性腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌又は結腸癌などの消化管腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、頚部、子宮、卵巣癌、膣癌、精巣癌、前立腺癌、又は陰茎癌などの尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽腔、咽頭及び口腔の癌、食道、直腸、胆嚢、胆管系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳、及び神経系の他の部分、甲状腺、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び白血病が含まれる。
【００３８】
本発明を使用した抗原提示のために、単独で又は組合せで免疫細胞に送達できる抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば、変異癌遺伝子；腫瘍に関連したウィルスタンパク質；並びに腫瘍ムチン及び糖脂質が含まれる。腫瘍に関連したウィルスタンパク質であり得る抗原は、上記したクラスのウィルス由来のものとなる。ある種の抗原は、腫瘍の特徴であり得るか（サブセットの１つは、通常は腫瘍前駆細胞によって発現されないタンパク質である）、又は腫瘍前駆細胞で通常発現されるが、腫瘍の突然変異特徴を有するタンパク質であり得る。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば腫瘍抗原を生じさせる遺伝子の突然変異を有する、正常なタンパク質の突然変異変異体（複数可）が含まれる。
【００３９】
腫瘍抗原の非限定的な特定の例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、prostate specific antigen）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６、及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（黒色腫抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（黒色腫抗原）βカテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫遍在性変異遺伝子産物、melanoma ubiquitous mutated gene product）、ＧＡＧＥ（黒色腫抗原）１、ＢＡＧＥ（黒色腫抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン−バーウィルス核抗原、Epstein-Barr Virus nuclear antigen）１〜６、ｇｐ７５、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ、human papilloma virus）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ、lung resistance protein）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が含まれる。加えて、免疫原性分子は、自己免疫性疾患の開始及び／又は伝播に関与する自己抗原であり得、その病態は、関連する標的器官、組織、又は細胞により発現される分子、例えばＳＬＥ又はＭＧに特異的な抗体の活性に主として起因する。そのような疾患では、関連自己抗原に対する進行中の抗体媒介性（つまり、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（つまり、Ｔｈ１型）免疫応答に向けることが望ましい場合がある。或いは、適切な自己抗原に対するＴｈ１型応答を予防的に誘導することにより、関連する自己免疫疾患を有しないが感受性があることが疑われる対象体における自己抗原に対するＴｈ２型応答の開始を予防又はそのレベルを減少させることが望ましい場合がある。所望の自己抗原には、限定されないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Ｓｍｉｔｈタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質；並びに（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体が含まれる。１又は複数のタイプの自己免疫応答に関与する他の様々な抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、濾胞刺激的ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチンなどの内因性ホルモン、及び他のホルモンが含まれる。
【００４０】
自己免疫性疾患、アレルギー、及び移植片拒絶に関与する抗原が、本発明の組成物及び方法において使用できる。例えば、以下の自己免疫性疾患又は障害の１又は複数に関与する抗原が、本発明において使用できる：糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続いて起こる乾性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬傷反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳障害、特発性両側性進行性感音性聴力損失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンズ−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症。自己免疫性疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５、glutamic acid decarboxylase 65）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体構成要素、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ、thyroid stimulating hormone）受容体が含まれる。アレルギーに関与する抗原の例には、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉抗原、イエダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が含まれる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経移植片構成要素などの移植片受容物に移植される移植片の抗原性構成要素が含まれる。抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドであり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「エピトープ（複数可）」という用語は、病原体ＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされた、多数の病原体ポリペプチドのいずれか内に位置する、エピトープに類似した一次、二次、又は三次構造を含むペプチド又はタンパク質抗原を指す。類似性のレベルは、一般的に、そのようなポリペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体もまた、ペプチド又はタンパク質抗原に結合、反応、又はその他の方法で認識する程度となる。例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、及びＲＩＡなどのような種々のイムノアッセイ法が、そのような抗体と共に使用でき、それらのすべては当業者に公知である。ワクチンに使用するために好適な病原体エピトープ、及び／又はそれらの機能的な等価物の同定は、本発明の一部である。いったん単離及び同定されれば、機能的な等価物は容易に取得できる。例えば、親水性に基づいてアミノ酸配列からエピトープを同定及び調製することを教示する、参照により本明細書中に組み込まれた米国特許第４，５５４，１０１号明細書において教示されているHoppの方法が使用できる。他の幾つかの文献に記載された方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムを使用して、エピトープコア配列を同定することもできる（例えば、Jameson and Wolf, 1988；Wolf et al., 1988；米国特許第４，５５４，１０１号明細書を参照）。これらの「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、その後、ペプチド合成又は組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチドに容易に組み込むことができる。
【００４２】
有効成分として本発明の抗原をコードする核酸を含むワクチン組成物の調製は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製することができ、感染の前に液体に溶解又は懸濁するのに好適な固体形態を調製することもできる。調製物は、乳化してリポソームに封入することができる。活性免疫原成分は、薬学的に許容され、有効成分と適合する担体と混合されることが多い。
【００４３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、それが投与される対象体にアレルギー反応又は他の悪影響を引き起さない担体を指す。好適な薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなどの１又は複数、及びそれらの組合せが含まれる。加えて、必要に応じて、ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含有できる。有効であり得るアジュバントの例には、それらに限定されないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ、N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、及び２％のスクワレン／Tween 80エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ（monophosporyl lipid A）＋ＴＤＭ（trehalose dimycolate）＋ＣＷＳ（cell wall skeleton））を含有するＲＩＢＩが含まれる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、dimethyldioctadecylammonium bromide）、フロインド完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが含まれる。加えて、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）などの免疫調節物質、又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘発因子は、本明細書中に記載のアジュバントと組み合わせて使用できる。
【００４４】
医薬品には、本発明に記載されたように、血漿リポタンパク質に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを有する裸のポリヌクレオチド（naked polynucleotide）が含まれ得る。このポリヌクレオチドは、生理活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ、又はリボザイムをコードしていてよく、生理学的に許容される投与可能な形態で提供されよう。本発明から生じ得る別の薬剤製品は、本明細書中に記述された方法により患者の血液又は他の供給源のいずれかから単離された高度に精製された血漿リポタンパク質画分、並びに血漿リポタンパク質に存在するアポリポタンパク質の特異的ＤＮＡ結合部位に結合する特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有し、生理学的に許容される投与可能な形態の精製されたリポタンパク質画分に事前に結合されたポリヌクレオチドを含み得る。
【００４５】
さらに別の医薬品は、生理学的に許容される投与可能な形態の、特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有するポリヌクレオチドに事前に結合された特異的ＤＮＡ結合モチーフの単一又は複数コピーを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含み得る。さらに別の医薬品は、生理学的に許容される投与可能な形態の、特異的ヌクレオチド配列の単一又は複数コピーを含有するポリヌクレオチドに事前に結合された特異的ＤＮＡ結合モチーフの単一又は複数コピーを含有する組換えアポリポタンパク質断片を含有する高度に精製された血漿リポタンパク質画分を含み得る。
【００４６】
投与される用量は、治療される対象体の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。高度に精製されたリポタンパク質画分に事前に結合された裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇから１ｍｇまでのポリヌクレオチド及び１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質に及ぶ量で投与できる。
【００４７】
ｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与では、患者は、化学療法剤の投与に関する一般的なプロトコールに従い、もしあれば、ベクターの毒性を考慮に入れる。治療サイクルは必要に応じて繰り返されるであろうことが予期される。記載された遺伝子治療と組み合わせて、種々の標準的治療並びに外科的介入が適用できることも企図される。
【００４８】
遺伝子治療の臨床適用が企図される場合、目的の適用に適した医薬組成物として、複合体を調製することが必要となる。一般的に、これには、発熱物質並びにヒト又は動物に有害であり得るどんな他の不純物も本質的に存在しない医薬組成物を調製することが必要となろう。また、適切な塩及び緩衝液を使用して、複合体に安定性を与え、標的細胞による複雑な取り込みを可能にすることも一般に望まれる。
【００４９】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。
【００５０】
そのような組成物は、接種物と呼ぶこともできる。そのような媒体及び作用物質を医薬活性物質用に使用することは、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用物質は、有効成分と適合性がない場合を除き、治療的組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分を組成物に組み込むこともできる。本発明の組成物には、古典的な医薬調製物が含まれ得る。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有する。
【００５１】
疾患の状態。治療される特定の疾患に依存して、最大の（又は幾つかの場合では最小の）免疫応答を生じさせるための部位への抗原送達を最大化するためには、標的組織がその経路を介して入手可能である限り、本発明による治療的組成物の投与は、任意の一般的な経路を介したものとなる。投与は、一般的に、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射による投与となる。送達する他の区域には、経口、鼻腔、頬側、直腸、膣、又は局所が含まれる。局所投与は、皮膚癌の治療に特に有利となる。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝液、又は他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与されよう。
【００５２】
本発明のワクチン又は治療用組成物は、注射により非経口的に、例えば皮下又は筋肉内のいずれかで投与できる。他の投与方法に好適である追加的製剤には、坐剤、幾つかの場合には、経口製剤、又はエアゾール剤としての流通に好適な製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバント、抗原パッケージング、又は種々の製剤への個々のサイトカインの付加を使用したＴ細胞サブセットの操作により、最適化された免疫応答を有する経口ワクチンの改善がもたらされる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれていてよく、そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、又は散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する。
【００５３】
本発明の核酸をコードする抗原は、中性又は塩の形態としてワクチン又は治療用組成物に製剤することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマレイン酸などのような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、及びプロカインなどの有機塩基から誘導できる。
【００５４】
ワクチン又は治療用組成物は、投与製剤と適合する方法で、予防上及び／又は治療上有効であろうような量で投与される。投与される量は、例えば、抗体を合成する対象体の免疫系の能力、及び所望の防御又は治療の程度を含む、治療する対象体に依存する。好適な用量範囲は、約１ｍｇから３００ｍｇまでの範囲、好ましくは約１０ｍｇから５０ｍｇまでの範囲などの、約０．１ｍｇから１０００ｍｇまでの範囲を有する、１回のワクチン接種当たり数百マイクログラムのオーダーの有効成分である。初期投与及び追加免疫接種に好適な投与計画も多様であるが、初期投与に続くその後の接種又は他の投与により典型的に表される。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各対象体に特有であり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドが他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、受容個体の免疫状態及び健康、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療的活性によって決まることは、当業者には明らかであろう。
【００５５】
組成物は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与スケジュールは、ワクチン接種の主要な経過が、例えば１〜１０回の別個投与、その後に、免疫応答を維持及び／又は増強するのに必要なその後の時間間隔で与えられる、例えば２回目の投与の場合は１〜４か月での他の投与、及びもし必要な場合には、数か月後の後続投与（複数可）を含むスケジュールである。防御免疫の所望のレベルを維持するためには、１〜５年、通常は３年間隔での定期的な追加免疫が望ましい。免疫の経過は、ＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共に共培養された末梢血リンパ球（ＰＢＬ、peripheral blood lymphocyte）のインビトロ増殖アッセイにより、及び初回抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γのレベルを測定することにより追跡できる。アッセイは、放射性ヌクレオチド、酵素、及び蛍光標識などの従来の標識を使用して実施できる。これらの技術は当業者にとって公知であり、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第４，１７４，３８４号明細書、及び第３，９４９，０６４号明細書に見出すことができ、関連部分は参照により組み込まれる。
【００５６】
モジュール型ｒＡｂ担体及び／又は結合ｒＡｂ担体−（コヒーシン／ドックリン及び／又はドックリン−コヒーシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるかどうか、最終精製タンパク質又は最終ワクチン形態が使用されるかどうかに依存して、１又は複数の「単位用量」で提供できる。単位用量は、その投与、つまり適切な経路及び治療投与計画と関連した所望の応答を生じさせるように計算された治療的組成物の所定量を含有することであると定義される。投与される量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術分野における当業者の技能内である。治療される対象体、特に、対象体の免疫系の状態及び所望の防御を評価することもできる。単位用量は、単回注射として投与する必要はないが、設定された期間にわたる持続注入を含むことができる。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／ｋｇ）体重によって好都合に記述することができ、約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１，０００ｍｇ／ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重以上の間の範囲で投与される。同様に、送達されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの量は、約０．２から約８．０ｍｇ／ｋｇ体重まで変動し得る。したがって、特定の実施形態では、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ、及び７．５ｍｇのワクチンが、インビボで個体に送達できる。投与されるｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原の用量は、治療される対象体の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療の頻度に大きく依存する。リポソーム性又はウィルス性送達ベクターに事前に結合された裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、１μｇ〜１ｍｇのポリヌクレオチドから１μｇ〜１００ｍｇのタンパク質に及ぶ量で投与できる。したがって、特定の組成物は、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ ５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、又は１００ｍｇのベクターに独立して結合した、約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、又は１，０００μｇの間のポリヌクレオチド又はタンパク質を含み得る。
【００５７】
本発明は、インフルエンザ抗原がターゲッティングされている樹状細胞によるヒトインフルエンザ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験された。本明細書中に示された結果は、それら自身がこの系で有効でない抗原の用量での、そのような抗原特異的細胞の特異的増殖を実証する。
【００５８】
本発明は、例えば、リシン、炭疽菌毒素、及びブドウ球菌Ｂエンテロトキシンに由来する防御抗原と複合体形成した組換えヒト化ｍＡｂ（特定のヒト樹状細胞受容体に対するもの）であるモジュール型ｒＡｂ担体を作製するためも使用できる。この物質の潜在的な市場は、全軍関係者のワクチン接種、及びこれらの作用物質と関連する任意の生体脅威（biothreat）に応じて大規模人口密集地に対して投与するために備蓄された保管ワクチンである。本発明は、ヒト及び動物使用の両方について、ワクチン設計一般に対する幅広い適用を有する。所望の産業には、医薬品産業及びバイオテクノロジー産業が含まれる。
【００５９】
本発明は、抗原に対する強力で幅広い免疫応答を誘発する目的のために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ、antigen-presenting cell）に特異的にターゲッティングする（送達する）、ワクチン剤を含む組成物及び方法を含む。これらの組成物は、抗原がそれから由来した作用物質（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的免疫応答を誘起する。加えて、本発明は、抗原提示細胞上に発現されるＤＣ−ＡＳＧＰＲと呼ばれる受容体にそれらが特定的に結合することにより、直接的に又は他の作用物質と協調して、治療効果のある作用物質を生成する。
【００６０】
抗体（Ａｂ）重鎖を介して、防御抗原をコードすることが知られているか又は予想される抗原と融合した新規な組換えヒト化ｍＡｂ（特定のヒト樹状細胞受容体ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する）。これらには、種々の作用物質に対するワクチン接種用の例として、インフルエンザＨ５Ｎ１型由来の赤血球凝集素；リシン由来の弱毒化トキシンに由来するＨＩＶ ｇａｇ、炭疽菌トキシン、及びブドウ球菌Ｂエンテロトキシン；黒色腫抗原由来の抗原性ペプチドの「ストリング（string）」などが含まれる。本発明は、感染リスクのある又は感染した患者用の、予防的又は治療的なワクチン接種として使用できる。本発明は、ヒト及び動物使用の両方について、多数の疾患及び癌に対するワクチン接種用の幅広い適用を有する。本発明を使用できる産業には、医薬品業及びバイオテクノロジー業が含まれる。
【００６１】
本発明は、ワクチン接種目的のために、抗原をＡＰＣにターゲッティングするために使用できる。どの抗原内部移行化受容体がこの目的に最も適するかは知られていない。本発明は、この目的に関して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの特に有利な特徴について説明する。さらに、本発明は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲとの結合が、免疫系を活性化して高度に予測された著しい治療上の有益性を有する点において有益であり得ることを示す。
【００６２】
本発明は、ヒトＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する高親和性モノクローナル抗体の開発を含む。受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、human placental alkaline phosphatase）融合タンパク質を、それぞれ、マウスの免疫及びｍＡｂのスクリーニング用に産生した。ｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＩｇＧ用の発現構築体は、過去に記述されており（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）、分泌を指示するためにマウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドが使用された（Bendtsen, Nielsen et al. 2004）。ｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＡＰ用の発現ベクターはＰＣＲを使用して生成し、ＡＰ残基１３３〜１５８１位（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅した一方で、近位のインフレームのXhoI部位並びに遠位のＴＧＡ終止コドン及びNotI部位を付加した。このXhoI−NotI断片は、上記のｈＤＣＩＲエクトドメイン．ＩｇＧベクターのＩｇＧコード配列を置換した。同じＩｇ及びＡＰベクター系列のＤＣ−ＡＳＧＰＲエクトドメイン構築体は、（ｂｐ４８４〜１２５１、ｇｉ｜５３８３２０１７）をコードするインサートを含有していた。ＤＣ−ＡＳＧＰＲ融合タンパク質は、メーカーのプロトコール（１．３ｍｌの２９３Fectin試薬／Ｌを用いた１ｍｇの全プラスミドＤＮＡの形質移入）に従って、FreeStyle（商標）２９３発現系（Invitrogen社製）を使用して産生した。ｒＡｂ産生の場合、Ｈ及びＬ鎖をコードする等量のベクターを同時形質移入した。形質移入された細胞を３日間培養し、培養上清を回収し、新しい培地を添加して２日間インキュベーションを継続した。貯留した上清は、濾過により清澄化した。受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧは、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７による溶出を用いたHiTrapプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、その後ＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂ（下記に記載の組換え抗体）は、HiTrap MabSelect（商標）カラムの使用により同様に精製した。マウスｍＡｂは、従来の細胞融合技術により産生した。手短かに言えば、２０μｇの受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質をＲｉｂｉアジュバントと共に用いて、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを腹腔内的に免疫し、次いで１０日後及び１５日後に２０μｇの抗原で追加免疫した。３か月後、脾臓を採取する３日前にマウスを再び追加免疫した。或いは、３０〜４０日間にわたって３〜４日ごとに、Ｒｉｂｉアジュバント中の１〜１０μｇの抗原をマウスの足蹠に注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を回収した。従来技術を使用して、脾臓又はリンパ節細胞に由来するＢ細胞を、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞（Shulman, Wilde et al. 1978）に融合した。ＥＬＩＳＡを使用し、融合パートナー単独と比較又はＡＰに融合した受容体エクトドメインと対比して、受容体エクトドメイン融合タンパク質について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）。その後、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３Ｆ細胞を使用して、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、CELLineフラスコ（Intergra社製）中で、単細胞クローニングし増殖させた。ハイブリドーマ上清を、等容積の１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelectレジンと共に回転させた。結合緩衝液でレジンを洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２ＭＴｒｉｓで中和した後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００６３】
直接ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体の特徴付け。幾つかの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの相対的親和性をＥＬＩＳＡにより決定した（つまり、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇタンパク質をマイクロプレート表面上に固定し、（抗マウスＩｇＧ．ＨＲＰ結合試薬により検出される）ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇに結合するそれらの能力について、抗体を連続用量滴定法で試験する）。この例において、ＰＡＢ４２及びＰＡＢ４４は、他のｍＡｂより高い親和性結合を示す。同じｍＡｂは、マイクロプレート表面に結合されたヒトＩｇに有意には結合しない。これは、ｍＡｂが、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｉｇ融合タンパク質のＤＣ−ＡＳＧＰＲエクトドメイン部分と反応することを示す（データは示さず）。
【００６４】
間接ＥＬＩＳＡによる、精製された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体の特徴付け。次に、幾つかの抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの相対的親和性をＥＬＩＳＡにより決定した（つまり、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂをマイクロプレート表面上に固定し、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．ＡＰ試薬に結合するそれらの能力について、連続用量滴定法で試験する）。ＰＡＢ４２、ＰＡＢ４４、及びＰＡＢ５４として列挙されたハイブリドーマ由来の上清は、他のｍＡｂより高い親和性結合を示すことが見出された（データは示さず）。
【００６５】
ＦＡＣＳによる抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂの特徴付け。細胞表面ＤＣ−ＡＳＧＰＲの合成を指示する発現プラスミドで形質移入された２９３Ｆ細胞と対比して、ＦＡＣＳによりｍＡｂパネルも試験した。シグナルの平均蛍光強度は、非形質移入２９３Ｆ細胞と対比した類似シグナルから差し引いた。この基準では、ｍＡｂは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する細胞表面に特異的に結合できる。幾つかのｍＡｂ、例えば３７Ａ７は、この点に関しては特に有利であると考えられる（データは示さず）。
【００６６】
図１Ａ〜１Ｄは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達がＤＣを活性化することを示す。ＤＣは、それらの活性化に依存して、誘導又は耐性のいずれかである免疫応答の結果を決定する一次免疫細胞である（J. Banchereau et al., Annu Rev Immunol 18, 767 (2000)）。ＤＣ活性化におけるＬＬＲの役割はまだ明らかではない。したがって、本発明者らは、ＬＬＲ ＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発がＤＣ活性化に帰着し得るかどうかを試験した。インビトロで３日間及び６日間培養されたＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣの両方が、ＬＯＸ−１、ＡＳＧＰＲ、及びＣＬＥＣ−６を発現する（図１Ａ）。ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで６日間のＤＣを刺激し、図１Ｂのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介するシグナルがＤＣを活性化し、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲの発現増加に帰着し得たことを示す。ＤＣ上のＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発は、ＤＣに由来するＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ４０、及びＩＬ−８の産生増加にも帰着した（図１Ｃ）。他のサイトカイン及びケモカイン、ＴＮＦａ、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−ｌａ、及びＩＬ−１０も、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達により著しく増加し（データは示さず）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが細胞シグナルを送達してＤＣを活性化できることが示唆される。それと一致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的ｍＡｂで刺激されたＤＣは、共刺激分子並びにケモカイン及びサイトカイン関連遺伝子を含む、増加したレベルの複数の遺伝子を発現した（図１Ｄ）。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４媒介性免疫細胞活性化にＬＬＲが寄与する可能性は、過去に記述されている（T. B. Geijtenbeek et al., J Exp Med 197, 7 (Jan 6, 2003)、P. Jeannin et al., Immunity 22, 551 (May, 2005)）。本発明者らは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナルが、ＤＣをさらに活性化するために、ＣＤ４０を介したシグナルと相乗作用を示し得ることを観察した（図１Ｅ）。これが重要であるのは、ＬＬＲがインビボでのＤＣ活性化中に共刺激分子として機能し得るためである。まとめると、図１のデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達がＤＣを活性化することができ、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、ＤＣを活性化するために共刺激分子として機能することを証明する。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用中のＤＣ−ＡＳＧＰＲ結合は、ＩＬ−１２ｐ７０産生の劇的な増加に帰着する。
【００６７】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣは、強力な体液性免疫応答を誘導する。ＤＣは、Ｔ細胞依存性及びＴ細胞非依存性Ｂ細胞応答の両方のためにシグナルを供給することにより（M. Wykes, G. MacPherson, Immunology 100, 1 (May, 2000)、M. Balazs, F. Martin, T. Zhou, J. Kearney, Immunity 17, 341 (Sep, 2002)、T. Kikuchi, S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, R. G. Crystal, Nat Med 6, 1154 (Oct, 2000)、B. Dubois et al., J Leukoc Biol 66, 224 (Aug, 1999)）、及びＢ細胞に抗原を移動させることにより（H. Qi, J. G. Egen, A. Y. Huang, R. N. Germain, Science 312, 1672 (Jun 16, 2006)、A. Bergtold, D. D. Desai, A. Gavhane, R. Clynes, Immunity 23, 503 (Nov, 2005)）、体液性免疫応答において重要な役割を果たす。ＤＣに加えて、第３のシグナルとしてのＴＬＲ９を介したシグナル伝達は、効率的なＢ細胞応答のために必要である（C. R. Ruprecht, A. Lanzavecchia, Eur J Immunol 36, 810 (Apr, 2006)、N. L. Bernasconi, E. Traggiai, A. Lanzavecchia, Science 298, 2199 (Dec 13, 2002)）。
【００６８】
したがって、本発明者らは、ＴＬＲ９リガンド、ＣｐＧの存在下で、ＤＣ媒介性体液性免疫応答におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割を試験した。６日間のＧＭ／ＩＬ−４ ＤＣを抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂで刺激し、その後、精製されたＢ細胞を共培養した。図２Ａで示されるように、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂで活性化されたＤＣは、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣと比較して、著しく増強されたＢ細胞増殖（ＣＦＳＥ希釈）及び形質細胞分化（ＣＤ３８＋ＣＤ２０−）に帰着した。ＣＤ３８＋ＣＤ２０−Ｂ細胞は、形質細胞の典型的な形態を有するが、それらはＣＤ１３８を発現しない。大多数の増殖細胞は、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、又はＣＣＲ７を発現しなかった。産生された全免疫グロブリン（Ｉｇ）の量は、ＥＬＩＳＡにより測定された（図２Ｂ）。図２Ａのデータと一致して、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲで刺激されたＤＣと共に培養されたＢ細胞は、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡ産生の著しい増加に帰着した。全Ｉｇに加えて、本発明者らは、Ｂ細胞によるインフルエンザウィルス特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡの産生については、ＤＣ−ＡＳＧＰＲの誘発により活性化されたＤＣが、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣより強力であることも観察し（図２Ｃ）、これは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ媒介性ＤＣ活性化が、全液性免疫応答及び抗原特異的体液性免疫応答の両方に寄与することを示唆した。本発明者らは、生体外抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの、体液性免疫応答における役割を試験した。ＣＤ１９＋及びＣＤ１４＋細胞を含む、ＰＢＭＣのＡＰＣの一部は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する（追加図２）。バフィーコート由来のＰＢＭＣを、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂでコーティングされたプレートで培養し、全Ｉｇ及びＢ細胞増殖を測定した。ＤＣから生成されたデータ（図２Ａ）と一致して、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＡＰＣは、ＴＬＲ９リガンドの非存在下（図２ｄの上パネル）又は存在下で（図２Ｄの下パネル）、増強されたＢ細胞増殖及び形質細胞分化に帰着した。ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂでコーティングされたプレートでＰＢＭＣを培養した際、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡも著しく増加した（図２ｅ）。図１に示されたように、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達により活性化されたＤＣは、表現型を成熟させ、大量の炎症性サイトカイン及びケモカインを産生し、成熟したＤＣ表現型及びＤＣ由来の可溶性因子の両方は、Ｂ細胞応答の増強に寄与できた（図２）。しかしながら、ＤＣ由来Ｂリンパ球刺激タンパク質（ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ）及び増殖誘導性リガンド（ＡＰＲＩＬ、）は、ＤＣがそれによりヒトＢ細胞の増殖及び機能を直接的に調節し得る重要な分子でもある（P. A. Moore et al., Science 285, 260 (Jul 9, 1999)、J. A. Gross et al., Nature 404, 995 (Apr 27, 2000)、A. Craxton, D. Magaletti, E. J. Ryan, E. A. Clark, Blood 101, 4464 (Jun 1, 2003)、I. MacLennan, C. Vinuesa, Immunity 17, 235 (Sep, 2002)）。したがって、本発明者らは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナルがＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬの発現レベルを変化させ得るかどうかを試験した。図２ｄのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣが、増加したレベルの細胞内ＡＰＲＩＬ及び分泌ＡＰＲＩＬを発現したが、ＢＬｙＳは発現しなかったことを示す（示さず）。混合培養液におけるＢ細胞上のＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬ受容体の発現レベルを測定したが、著しい変化はなかった（示さず）。
【００６９】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲは、Ｂ細胞活性化及びＩｇ産生に寄与する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する（図３Ａ）。したがって、本発明者らは、Ｂ細胞活性化におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割を試験した。図３Ｂのデータは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＢ細胞が、著しく高い量のケモカインを産生したことを示す。ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ａに加えて、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂでＢ細胞を刺激した際、対照ｍＡｂと比較してＩＬ−６及びＴＮＦαのわずかな増加も観察された。細胞活性化と関連する遺伝子も上方調節された（図３Ｃ）。Ｂ細胞は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されるとＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡを産生し（図３Ｄ）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、インビボでの正常な免疫グロブリンレベルの維持に重要な役割を果たし得ることが示唆される。しかしながら、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達だけでは、著しいＢ細胞増殖を誘導しなかった。
【００７０】
Ｔ細胞応答におけるＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割。ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣは、増強されたレベルの共刺激分子を発現、増加した量のサイトカイン及びケモカインを産生し（図１を参照）、ＤＣ−ＡＳＧＰＲが、細胞性免疫応答と同様に体液性免疫応答にも寄与することを示唆する。これは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ、mixed lymphocyte reaction）により試験された。精製された同種異系Ｔ細胞の増殖は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的なｍＡｂで刺激されたＤＣにより著しく増強された（図４Ａ）。ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して活性化されたＤＣは、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣよりも効率的に、Ｍａｒｔ−ｌ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を初回抗原刺激することもできた（図４Ｂの上パネル）。より重要なことに、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介したシグナル伝達は、ＤＣがＭａｒｋ−１ペプチドをＣＤ８Ｔ細胞に交差初回抗原刺激することを可能にした（図４Ｂの下パネル）。これは、ＤＣ−ＡＳＧＰＲがＤＣ機能の増強に重要な役割を果たし、ＣＤ８Ｔ細胞に対する抗原のより良好な初回抗原刺激及び交差初回抗原刺激に帰着することを示す。Ｔ細胞応答の活性化の際にＰＢＭＣ中の混合ＡＰＣ上に発現されたＤＣ−ＡＳＧＰＲの役割は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対するｍＡｂで刺激されたＰＢＭＣが、対照ｍＡｂで刺激されたＤＣと比較して、インフルエンザＭ１四量体特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度増加に帰着したことを示す図４Ｃに示されている。この増強された抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答は、図４Ｄのデータにより支持されて、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介して刺激されたＤＣが、ＣＤ４Ｔ細胞増殖を著しく増加させることを示す。
【００７１】
材料及び方法
抗体及び四量体：アイソタイプ対照Ａｂを含む、ＤＣ及びＢ細胞の表面染色用の抗体（Ａｂ）は、BD Biosciences社（米国カリフォルニア州）から購入した。ＥＬＩＳＡ用のＡｂは、Bethyl社（米国テキサス州）から購入した。抗ＢＬｙＳ及び抗ＡＰＲＩＬは、PeproTech社製（米国ニュージャージー州）であった。四量体、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号１）（インフルエンザＭ１）、及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号２）（Ｍａｒｔ−１）は、Beckman Coulter社（米国カリフォルニア州）から購入した。
【００７２】
細胞及び培養：ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）（R&D社製、米国カリフォルニア州）を含有するCellgenics社製（フランス）培地中で、正常供与体に由来する単球（１×１０６／ｍｌ）を培養した。３日目及び６日目のＤＣの場合、同量のサイトカインをそれぞれ１日目及び３日目に培地に補完した。Ｂ細胞は、ネガティブ分離キット（BD社製）で精製した。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、抗ＣＤ４又はＣＤ８でコーティングされた磁気ビーズ（Milteniy社製、米国カリフォルニア州）で精製した。ＰＢＭＣは、Percoll（商標）勾配（GE Healthcare UK Ltd社製、バッキンガムシャー、英国）を使用して、密度勾配遠心分離によりバフィーコートから単離した。ＤＣ活性化の場合、１×１０５個のＤＣを、ｍＡｂでコーティングされた９６ウェルプレートで１６〜１８時間培養した。ｍＡｂ（１〜２μｇ／ウェル）は、炭酸緩衝液、ｐＨ９．４で少なくとも３時間３７℃でインキュベートした。培養上清を回収し、Luminex（Biorad社製、米国カリフォルニア州）によりサイトカイン／ケモカインを測定した。遺伝子分析の場合、ＤＣは、ｍＡｂでコーティングされたプレートで８時間培養した。幾つかの実験では、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌ（R&D社製、米国カリフォルニア州）又は５０ｎＭのＣｐＧ（InVivogen社製、米国カリフォルニア州）を培養液に添加した。ＤＣ及びＢ細胞の共培養の場合、１０％ＦＣＳ及び抗生物質（Biosource社製、米国カリフォルニア州）と共にＲＰＭＩ１６４０に再懸濁された５×１０３個のＤＣを、まず、ｍＡｂでコーティングされたプレートで少なくとも６時間培養し、その後ＣＦＳＥ（Molecular Probes社製、米国オレゴン州）で標識された、１×１０５個の精製自己Ｂ細胞を添加した。幾つかの実験では、ＤＣを、５ｍｏｉ（感染多重度）の加熱不活性化インフルエンザウィルス（Ａ／ＰＲ／８Ｈ１Ｎ１）で２時間パルスし、その後Ｂ細胞と混合した。ＤＣ及びＴ細胞の共培養の場合、５×１０３個のＤＣを、１×１０５個の精製自己ＣＤ８Ｔ細胞又は混合同種異系Ｔ細胞と共に培養した。同種異系Ｔ細胞は、インキュベーションの最後の１８時間の間、１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンでパルスし、その後、μ−カウンター（Wallac社製、米国ミネソタ州）でｃｐｍを測定した。ｍＡｂでコーティングされたプレートで、５×１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを培養した。Ｍａｒｔ−１及びインフルエンザＭ１特異的ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、それぞれ培養の１０日目及び７日目に、抗ＣＤ８及び四量体で細胞を染色することにより測定した。１０μＭのＭａｒｔ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号２）及び２０ｎＭのＭａｒｔ−１ペプチド含有組換えタンパク質（以下を参照）を、ＤＣ及びＣＤ８Ｔ細胞培養液に添加した。２０ｎＭの精製組換えインフルエンザＭ１タンパク質（以下を参照）をＰＢＭＣ培養液に添加した。
【００７３】
モノクローナル抗体：マウスｍＡｂは従来技術により産生した。手短かに言えば、６週齢のＢＡＬＥ／ｃマウスを、Ｒｉｂｉアジュバントと共に２０μｇの受容体エクトドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質で腹腔内免疫し、その後、１０日及び１５日後に２０μｇの抗原で追加免疫した。３か月後、脾臓を採取する３日前にマウスを再び追加免疫した。或いは、３０〜４０日間にわたって３〜４日ごとに、Ｒｉｂｉアジュバント中の１〜１０μｇの抗原をマウスの足蹠に注射した。最終追加免疫の３〜４日後に、流入領域リンパ節を回収した。脾臓又はリンパ節細胞に由来するＢ細胞を、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞と融合させた。ハイブリドーマ上清をスクリーニングして、融合パートナー単独又はアルカリホスファターゼに融合した受容体エクトドメインと比較して、受容体エクトドメイン融合タンパク質に対するＡｂを分析した（E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)）。その後、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドで一時的に形質移入された２９３Ｆ細胞を使用して、陽性ウェルをＦＡＣＳでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、CELLineフラスコ（Intergra社製、米国カルフォル二ア州）中で、単細胞クローニングし増殖させた。ハイブリドーマ上清を、等容積の１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８と混合し、MabSelectレジンと共に回転させた。結合緩衝液でレジンを洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２ＭＴｒｉｓで中和した後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００７４】
ＥＬＩＳＡ：サンドイッチＥＬＩＳＡを実施して、全ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＡ、並びにインフルエンザ特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を測定した。既知量のＩｇ及びヒトＡＢ血清を含有する標準ヒト血清（Bethyl社製）を、それぞれ全Ｉｇ及びインフルエンザ特異的Ｉｇ用の標準物質として使用した。試料中のインフルエンザ特異的Ａｂの力価、単位は、同一の光学密度を示すＡＢ血清の希釈係数として定義された。ＢＡＦＦ及びＢＬｙＳの量は、ＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystem社製、米国カリフォルニア州）により測定した。
【００７５】
ＲＮＡ精製及び遺伝子分析：全ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen社製）で抽出し、２１００型Bioanalyser（Agilent社製）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion社製）を使用して調製し、Sentrix Human6 BeadChips（４６Ｋ転写物）にハイブリダイズした。これらのマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングされた微小ウェルに内蔵された３μｍビーズに取り付けられた５０ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色した後、Illumina社により製造されたサブミクロン解像度スキャナー（Beadstation 500X）を使用して、アレイ表面を画像化する。遺伝子発現分析ソフトウェアプログラム、GeneSpring、バージョン７．１（Agilent社製）を使用して、データ分析を行った。
【００７６】
組換えインフルエンザＭ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製：ＰＣＲを使用して、開始コドンに対して遠位であるNheI部位及び終止コドンに対して遠位であるNotIを組み込む一方で、インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ （Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅した。消化された断片は、pET-28b(+)（Novagen社製）にクローニングし、Ｍ１のＯＲＦをＨｉｓ６タグと共にインフレームで配置し、したがってＨｉｓ．インフルエンザＭ１タンパク質をコードした。NcoI及びNheI部位間に挿入された、Ｃ．サーモセラム（C.thermocellum）由来のＮ末端１６９残基のコヒーシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体（未発表）は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヒーシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓの発現の場合、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号３）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号４）をコードする：影付の残基は、免疫優勢ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであり、ペプチドを取り囲む下線の残基は、ＭＡＲＴ−１由来である）を、上記ベクターのNheI及びXhoI部位間に挿入した。１２０ｍｇ／ＬのＩＰＴＧを添加した際の対数増殖期の中間部まで２００回転／分で振とうし、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）で選択し３７℃のＬＢ中で増殖させた大腸菌（E.Coli）株BL21(DE3)（Novagen社製）又はT7Express（NEB社製）で、タンパク質を発現させた。３時間後、細胞を遠心分離により回収し、−８０℃で保管した。各１Ｌの発酵液からの大腸菌細胞を、０．１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルII（Calbiochem社製、米国カリフォルニア州）を有する、氷冷した３０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）に再懸濁した。リセット期間を５分間、設定を１８にして（Fisher社製Sonic Dismembrator 60）、細胞を氷上で２×５分間超音波処理し、その後、４℃で２０分間、１７，０００ｒ．ｐ．ｍ．（Sorvall社製SA-600）で回転させた。Ｈｉｓ．インフルエンザＭ１精製の場合、５０ｍｌの細胞溶解産物上清画分を、５ｍｌのＱセファロースビーズを通して通過させ、６．２５ｍｌの１６０ｍＭＴｒｉｓ、４０ｍＭイミダゾール、４ＭＮａＣｌ ｐＨ７．９をＱセファロース通過物に添加した。これを、Ｎｉ＋＋で充填された５ｍｌのHiTrap chelating HPカラムに、４ｍｌ／分で負荷した。カラムに結合したタンパク質を、２０ｍＭＮａＰＯ４、３００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ｄ）で洗浄し、その後１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でさらに洗浄した。結合したタンパク質は、１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で溶出した。ピーク画分を貯留し、１００ｍＭＨ３ＣＯＯＮａ ｐＨ５．５で平衡化された５ｍｌのHiTrap Sカラムに４ｍｌ／分で負荷し、平衡化緩衝液で洗浄し、その後０〜１ＭまでのＮａＣｌ勾配を用いて５０ｍＭＮａＰＯ４ ｐＨ５．５中で溶出した。約５００ｍＭＮａＣｌで溶出したピーク画分を貯留した。Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１．Ｈｉｓ精製の場合、２Ｌの培養液からの細胞を上記のように溶解した。遠心分離の後、２．５ｍｌのTriton X114を上清に添加し、氷上で５分間インキュベーションした。２５℃で５分間さらにインキュベーションした後、２５℃での遠心分離に引き続いて上清をTriton X114から分離した。抽出を繰り返し、上清を５ｍｌのＱセファロースビーズを通して通過させ、６．２５ｍｌの１６０ｍＭＴｒｉｓ、４０ｍＭイミダゾール、４ＭＮａＣｌ ｐＨ７．９を、Ｑセファロース通過物に添加した。その後、タンパク質をＮｉ＋＋キレートクロマトグラフィーにより上述のように精製し、緩衝液Ｄ中の０〜５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００７７】
特定の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのみがＤＣ活性化特性を有する：本発明は、ＤＣ活性化が抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体の一般的な特性ではなく、むしろある種の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのみがこの機能を有すことを開示する。図５は、ある種のｍＡｂのみがＤＣ−ＡＳＧＰＲを介してＤＣＳを活性化することを示し、それは、実際のＤＣに対するスクリーニングにより特徴付けられなければならない。
【００７８】
抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｍＡｂのＬ及びＨ可変領域に対応する特定の配列：本発明は、治療的又は防御的製品の望ましい構成要素である抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲモノクローナル抗体に対応する以下に示された特定のアミノ酸配列（例えばヒト化組換え抗体と関連した）を包含する。下記は、キメラマウスＶ領域−ヒトＣ領域組換え抗体と関連するそのような配列である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTTGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号５）である。上記の配列は、ｍＡｂ４９Ｃ１１のＨ鎖Ｖ領域（下線で示されている）とｈIｇＧ４のＣ領域との間のキメラである。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、対応するＬ鎖キメラ−QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSHMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSRLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSHPWSFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号６）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４Ｇ２．２＿Ｈｖ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQVPGKGLRWMGWMDTFTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINSLKNEDTATYFCARGGILRLNYFDYWGQGTTLTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号７）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４Ｇ２．２＿Ｋｖ−Ｖ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLGWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYALSITSLQTEDLATYYCQQCWTSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号８）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSLGKAS（配列番号９）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYSSNPYMFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１０）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ１Ｈ１１Ｈ−Ｖ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ］は、QLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVRQSHGKSLEWIGGINPINGGPTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARWDYGSRDVMDYWGQGTSVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS（配列番号１１）である。［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ１Ｈ１１Ｋ−ＬＶ−ｈＩｇＧＫ−Ｃ］は、NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQRPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSYIFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号１２）である。本発明は、これらのＶ領域配列、並びに例えばＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する親和性を増強するために当業者により修飾された関連配列、及び／又はヒトＶ領域フレームワーク配列へと組み込まれ、抗原提示細胞上のＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合できるタンパク質型の発現を指示するために発現ベクター中に工学的に作製される関連配列を起想する。
【００７９】
工学的に作製された組換え抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ組換え抗体−抗原融合タンパク質（（ｒＡｂ．抗原）は、インビトロで効果的なプロトタイプワクチンである：発現ベクターは、例えばＨ鎖コード配列にインフレームで融合した多様なタンパク質コード配列で構築できる。例えば、インフルエンザＨＡ５、インフルエンザＭ１、ＨＩＶ ｇａｇ、又は癌抗原に由来する免疫優勢ペプチドなどの抗原、又はサイトカインは、本発明との関連では、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを保持する抗原提示細胞の表面へと、抗原又はサイトカイン（又はトキシン）を直接的に導くために抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ Ｖ領域配列を使用することに由来する有用性を有し得るｒＡｂ．抗原又はｒＡｂ．サイトカイン融合タンパク質として、引き続いて発現することができる。これは、例えば抗原の内部移行を可能にし、時には受容体の活性化を伴い、治療的又は防御的作用の開始を確実にする（例えば、強力な免疫応答の開始を介して、又は標的細胞の死滅を介して）。この概念に基づいた例示的なプロトタイプワクチンは、［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿５Ｆ１０Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ５−１−６×Ｈｉｓ］又はEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGDTFYNQKFEGKATLTVDKSSRTAYMQLNSLTSEDSAVYYCGRGDYGYFDVWGAGTTVTVSSAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLAHHHHHH（配列番号１３）などのＨ鎖ベクターを使用できる。上記の配列は、可動性リンカー配列（イタリック体で示されている）を介してトリインフルエンザＨＡ５のＨＡ−１ドメイン（太字で示されている）に融合した、既示のキメラＨ鎖に対応する。これは、上記で既示の対応するＬ鎖キメラ配列と同時発現できる。同様に、配列［ｍＡｎｔｉ−ＡＳＧＰＲ＿４９Ｃ１１＿７Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｄｏｃｋｅｒｉｎ］−DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYILFSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYFCARSNYGSFASWGQGTLVTVSAAKTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI（配列番号１４）は、上記で既示の対応するＬ鎖配列の同時形質移入により、ｒＡｂ．ドックリン融合タンパク質を発現するために使用できる。
【００８０】
図６は、異なる抗原がＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂと関連して発現され得ることを示す。そのような抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂ．Ｄｏｃタンパク質は、任意のコヒーシン．融合タンパク質と単に混合して、ｒＡｂ．融合タンパク質と全く同様に機能する、安定した非共有結合性の［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体を構築できる。図６は、そのような［ｒＡｂ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．ｆｕｓｉｏｎ］複合体が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを発現する細胞の表面に抗原を集中させ得ることを示す。この図は、抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ：Ｃｏｈ．インフルエンザＭ１複合体が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲのｃＤＮＡで形質移入した２９３Ｆ細胞の表面にインフルエンザＭ１を送達することも示す。１μｇ／ｍｌ（右パネル）の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ．Ｄｏｃ ｒＡｂ（緑色で示されている）又は対照ｈＩｇＧ４．Ｄｏｃ ｒＡｂ（青色で示されている）を、ビオチン化されたＣｏｈ．インフルエンザＭ１（２μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベートした。形質移入した２９３Ｆ細胞を添加し、氷上で２０分間インキュベーションを継続した。その後、細胞を洗浄し、ＰＥ標識ストレプトアビジンで染色した。その後、ＰＥ蛍光について細胞を分析した。
【００８１】
ドックリン：コヒーシン相互作用を介してインフルエンザＭ１と複合体を形成した抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂは、抗原をヒトＤＣにターゲッティングし、その結果、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖する：例えばＤＣに抗原を送達するデバイスとしての抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ｒＡｂの潜在的有用性を下記の図に示す。図７は、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８＋細胞の劇的な増殖が、インフルエンザＭ１に対する防御免疫応答の誘発に向けられたワクチンとしてのそのような作用物質の効力を高度に予測することを示す。
【００８２】
図８は、様々な抗体とサルＡＳＧＰＲとの交差反応性を実証した。pIRESベクターのNheI−NotI部位にＰＣＲ産物を挿入することにより、pIRES_ASGPR-mon（サル）をクローニングした。最終産物の配列は、クローン５Ｓ１０に基づく。他のほとんどのクローンは、これと類似してアミノ酸が１つ異なるか、又はこれと同一であるかのいずれかである。しかしながら、１つのクローン、５Ｓ１は、３’末端付近でＡの欠失を有し、短縮された異なるＣ’末端を生成し、第２の変異体として使用できる。サルＡＳＧＰＲをクローニングするために、以下のオリゴが使用された：ＤＣ−ＡＳＧＰＲ＿ＭｏＮ：gaattcgctagcCACCATGACATATGAAAACTTCCAAGACTTGGAGAGTGAGGAGAAAGTCCAAGGGG（配列番号１５）；及びＤＣ−ＡＳＧＰＲ＿Ｍｏ：CGAATTCGCGGCCGCTCAGTGACTCTCCTGGCTGGCCTGGGTCAGACCAGCCTCGCAGACCC（配列番号１６）、これは、GGGTCTGCGAGGCTGGTCTGACCCAGGCCAGCCAGGAGAGTCACTGAGCGGCCGCGAATTCG（配列番号１７）の逆方向相補体である。当業者に知られているように、配列比較により、オーバーラップの可能性のある領域、したがって交差反応性が指摘される。
【００８３】
以下の表は、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ ３３４９９８ ２００ｕｇ／ｍｌ １２．０５．０７ ｃｆｇ＃５５８抗ヒトＩｇＧ ＰＥの結合を実証した。
【００８４】
【表１】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
本明細書で論じたあらゆる実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実現し得ることが企図され、逆も同様である。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用できる。
【００９５】
本明細書中に記載された特定の実施形態は、例示の目的で示されており、本発明の限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、種々の実施形態において使用できる。当業者であれば、定常的な実験を行っただけで、本明細書中に記載された特定の手順に対する多数の均等な手順を認識又は確認することができよう。そのような均等な手順は、本発明の範囲内であると見なされ、特許請求の範囲により包含される。
【００９６】
明細書中で言及された文献及び特許出願はすべて、本発明が属する当業者の技術レベルを示す。文献及び特許出願はすべて、参照により組み込むために個々の各文献又は特許出願があたかも特に個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００９７】
「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において「含む」という用語と共に使用される場合、「１つ」を意味し得るが、それは、「１又は複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１つを超えた」とも矛盾しない。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されていない限り、又は選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみ及び「及び／又は」を指すという定義を支持する。本出願の全体にわたって、「約」という用語は、ある値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法、又は研究対象に存在する変動に関する誤差の固有変動を含むことを示すために使用される。
【００９８】
本明細書及び特許請求の範囲（複数可）で使用される場合、「含む（comprising）」（並びに、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに、「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに、「含む（includes）」及び「含む（include）」など、含む（including）の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに、「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」など、含有する（containing）の任意の形態）という単語は、包括的又は非限定的であり、付加的、未説明の要素又は方法ステップを除外しない。
【００９９】
「又はそれらの組合せ」という用語は、本明細書で使用される場合、その用語に先行する列挙された項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び特定の文脈で順番が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つも含むと意図される。引き続きこの例で、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、及びＣＡＢＡＢＢなどの１又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組合せが、明示的に含まれる。当業者であれば、文脈からそうでないと明白でない限り、任意の組合せにおける項目又は用語の数に、典型的には制限がないことを理解するであろう。
【０１００】
本明細書中で開示又は特許請求された組成物及び／又は方法のすべては、本開示に照らして、過剰な実験をせずに作製及び実行できる。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態の点から記載されているが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに、本明細書中に記載された組成物及び／又は方法、並びにその方法のステップ又は一連のステップに変異が適用できることは明白であろう。当業者に明白なそのような類似した代替物及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるものとする。
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31. J. Banchereau, R. M. Steinman, Nature 392, 245 (Mar 19, 1998)
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33. B. Beutler et al., Annu Rev Immunol 24, 353 (2006)
34. K. Hayashida, N. Kume, M. Minami, T. Kita, FEBS Lett 511, 133 (Jan 30, 2002)
35. M. Kakutani, T. Masaki, T. Sawamura, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 360 (Jan 4, 2000)
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44. E. E. Bates et al., J Immunol 163, 1973 (Aug 15, 1999)
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示の有効性を増大させるための方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップを含み、前記抗原が、前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片が、コヘリン／ドックリン対の半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の半分に結合し、抗原が前記コヘリン／ドックリン対の相補的な半分に結合して複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原が、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原特異的ドメインが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞により比較的特異的に発現される他の受容体から選択される免疫細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させるための方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を結合するステップを含み、前記抗原が前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される方法。
【請求項９】
樹状細胞の有効性の増大が、同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用。
【請求項１１】
皮膚を介するワクチン接種のための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用。
【請求項１２】
同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用。
【請求項１３】
組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【請求項１４】
哺乳動物細胞から分泌された抗原特異的抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリン又はその断片、及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項１５】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１６】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１７】
免疫グロブリンがコヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合している、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
モジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分をさらに含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
抗原との融合タンパク質であるコヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分をさらに含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
抗原特異的ドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
免疫グロブリンが、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α菌毒、テトロドトキシン、アコノトキシン、ヘビ毒、及びクモ毒からなる群から選択される毒素に結合している、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
抗原が、Ｔ及びＢ細胞リンパ増殖性疾患、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、又は非小細胞肺癌から選択される癌細胞又はその一部を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２５】
樹状細胞の有効性を増大させるための方法であって、
患者の樹状細胞を単離するステップと、
前記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップと、
前記抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を前記患者に再導入するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
治療的又は防御的適用での、単独で又は共活性化作用物質と共にＤＣ−ＡＳＧＰＲに関与して抗原提示細胞を活性化する作用物質の使用。
【請求項２７】
防御的又は治療的ワクチン接種のために、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ結合性及び／又は活性化作用物質が、単独で又は共活性化作用物質と共に抗原に連結される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
特異的抗体Ｖ領域配列が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合し、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを活性化することが可能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介する免疫細胞の不適切な活性化から生じることが知られている又は疑われている疾患と関連した治療目的での、毒性作用物質に連結された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ作用物質の使用。
【請求項３０】
抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を含み、前記抗原が前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示されるワクチン。
【請求項１】
抗原提示の有効性を増大させるための方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を単離及び精製するステップを含み、前記抗原が、前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片が、コヘリン／ドックリン対の半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片がコヘリン／ドックリン対の半分に結合し、抗原が前記コヘリン／ドックリン対の相補的な半分に結合して複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗原が、ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、及びそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原特異的ドメインが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ランゲリン、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、又は抗原提示細胞により比較的特異的に発現される他の受容体から選択される免疫細胞表面タンパク質に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
樹状細胞による抗原提示の有効性を増大させるための方法であって、抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を結合するステップを含み、前記抗原が前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示される方法。
【請求項９】
樹状細胞の有効性の増大が、同種異系ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
防御的又は治療的免疫応答を誘発する目的で抗原を抗原提示細胞に送達するための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに対する抗体又は他の特異的結合分子の使用。
【請求項１１】
皮膚を介するワクチン接種のための、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用。
【請求項１２】
同時投与又は連結されたワクチン接種用アジュバントと併用した、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに特異的な抗原ターゲッティング試薬の使用。
【請求項１３】
組換え抗原−抗体融合タンパク質として発現することができる特異的抗原の、抗原ターゲッティング（ワクチン接種）目的での使用。
【請求項１４】
哺乳動物細胞から分泌された抗原特異的抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ免疫グロブリン又はその断片、及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項１５】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１６】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１７】
免疫グロブリンがコヒーシン／ドックリンドメインの半分に結合している、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１８】
モジュールｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分をさらに含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項１９】
抗原との融合タンパク質であるコヒーシン−ドックリン結合対の相補的な半分をさらに含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２０】
抗原特異的ドメインが、完全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの部分を伴ったＦａｂ断片を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２１】
免疫グロブリンが、放射性同位元素、金属、酵素、ボツリヌス毒素、破傷風、リシン、コレラ、ジフテリア、アフラトキシン、ウェルシュ菌毒素、マイコトキシン、志賀毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Ｔ２、セグイトキシン、サキシトキシン、アブリン、シアノジノシン、α菌毒、テトロドトキシン、アコノトキシン、ヘビ毒、及びクモ毒からなる群から選択される毒素に結合している、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２２】
抗原が免疫グロブリンとの融合タンパク質である、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２３】
抗原が、細菌性、ウィルス性、真菌性、原生動物性、又は癌性のタンパク質を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２４】
抗原が、Ｔ及びＢ細胞リンパ増殖性疾患、卵巣癌、膵臓癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、又は非小細胞肺癌から選択される癌細胞又はその一部を含む、請求項１４に記載の免疫グロブリン。
【請求項２５】
樹状細胞の有効性を増大させるための方法であって、
患者の樹状細胞を単離するステップと、
前記樹状細胞を活性化量の抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ抗体又はその断片及び抗原に曝露して、抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を形成するステップと、
前記抗原が負荷されて活性化された樹状細胞を前記患者に再導入するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
治療的又は防御的適用での、単独で又は共活性化作用物質と共にＤＣ−ＡＳＧＰＲに関与して抗原提示細胞を活性化する作用物質の使用。
【請求項２７】
防御的又は治療的ワクチン接種のために、ＤＣ−ＡＳＧＰＲ結合性及び／又は活性化作用物質が、単独で又は共活性化作用物質と共に抗原に連結される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
特異的抗体Ｖ領域配列が、ＤＣ−ＡＳＧＰＲに結合し、ＤＣ−ＡＳＧＰＲを活性化することが可能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＣ−ＡＳＧＰＲを介する免疫細胞の不適切な活性化から生じることが知られている又は疑われている疾患と関連した治療目的での、毒性作用物質に連結された抗ＤＣ−ＡＳＧＰＲ作用物質の使用。
【請求項３０】
抗体−抗原複合体を形成する抗原が結合したＤＣ−ＡＳＧＰＲ特異的抗体又はその断片を含み、前記抗原が前記抗体−抗原複合体と接触した樹状細胞によりプロセシング及び提示されるワクチン。
【図１Ａ−１Ｅ】
【図２Ａ−２Ｄ】
【図３Ａ−３Ｄ】
【図４Ａ−４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２Ａ−２Ｄ】
【図３Ａ−３Ｄ】
【図４Ａ−４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５１８０２４（Ｐ２０１０−５１８０２４Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８４８４（Ｐ２００９−５４８４８４）
【出願日】平成２０年２月２日（２００８．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８７０
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２日（２００８．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５２８６５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９７８７０
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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