水生生物の卵質の遺伝子診断法
【課題】魚類の良質卵関連遺伝子群の網羅的単離方法および単離された遺伝子群を用いた卵質の診断方法を提供することを課題とする。
【解決手段】遺伝子のサブトラクション解析によって、良質卵関連遺伝子群を網羅的に単離し、この遺伝子群を用いたマイクアレイ等を作製することで卵質の診断方法を得た。
【解決手段】遺伝子のサブトラクション解析によって、良質卵関連遺伝子群を網羅的に単離し、この遺伝子群を用いたマイクアレイ等を作製することで卵質の診断方法を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子の網羅的な単離方法およびその利用に関するものである。さらに詳しくは、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析を行うことで、良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＮＥＡＴ）を単離し、それらを利用して卵質の診断方法や卵質改善技術を開発することで、増養殖対象魚の安定的・効率的な種苗生産を可能とすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内において、消費者ニーズの多様化によって多岐に渡る魚種での種苗生産技術および飼育技術の確立が強く望まれている。また、世界的にも天然資源に依存しない安定的な種苗量産技術および飼育技術の確立が求められている。このため、近年飛躍的に増大した内分泌学的知見をもとに、ホルモンによる養殖対象魚種の人為催熟技術の開発がなされてきた（非特許文献１）。とりわけ、効率的なホルモンの投与方法の開発は著しく、実用化された種々の方法が実際の種苗生産現場で使用されている（非特許文献２）。
【０００３】
さらに、魚類のホルモン投与時期においても、事前に親魚の卵径に基づいた採卵成績予測（排卵時間、卵量、卵質）を行う安定的および効率的な採卵方法が提案されている（特許文献１）。この方法では、ホルモン投与時に親魚から一部採取した卵の卵径に基づいて、ホルモン投与から排卵に至るまでの経過時間を調査したり、ホルモン投与により得られる卵量と卵質を調査したりすることで、採卵成績予測データを作成し、作成した採卵成績予測データに基づいて、採卵と人工授精を最適なタイミングで実施できるようにし、また、実際に使用する個体の選定と使用数量の決定を可能にしている。
【０００４】
このように多くの養殖対象魚種で人為催熟が可能となったが、催熟によって得られた卵からは、発生・形態異常魚が高頻度で発生する等の生産者にとって新たな問題が生じている。例えば、本発明者らは、我が国の養殖最重要魚種の一つであるニホンウナギにおいて、孵化後１０日目の生残個体のうち半数で心臓肥大等のなんらかの形態異常や初期胚の発生異常があることを見いだしている（非特許文献３）。また、マダイの人工種苗では、ほとんどの個体で鼻（鼻孔隔皮）の形成に異常があることが判明している（非特許文献４）。このように良質な種苗が安定的に得られない原因の一つは、これまでの種苗生産技術が産卵などの繁殖特性を指標とした所謂「いかにして養殖対象魚種から卵や精子を得るか」に主眼をおいた技術開発に終始してきた点にある。このため今後は対象魚種の配偶子形成のみならず、得られた卵の質や仔稚魚の質も考慮した技術開発が重要と考えられる。
【０００５】
卵質とは、排卵された卵のうちどれぐらいの割合の卵が健康な稚仔魚に育つかを示したもので、得られた卵や仔稚魚の質を科学的に評価するにあたって最も重要な指標となる。一般に、卵が健康な稚仔魚に育つまでには、卵黄形成後の卵が１）正常に卵成熟・排卵し、２）排卵した卵が精子と正常に受精し、３）受精卵が正常な卵割や胚発生を遂げて、最終的に４）仔魚が正常に発育しなければならない。このため、これまで、それぞれの段階を数値化した１）排卵率、２）受精率、３）正常卵割率・孵化率および４）孵化後の正常仔魚生残率等が卵質の診断に用いられてきた。しかし、これらの診断方法は死滅や変異などの表現型に基くため、厳密性や普遍性に欠けるという問題があった。例えば、本発明者らは、ニホンウナギにおいて、これまで卵質の指標として一般的に使用されてきた受精率や孵化率が必ずしも稚仔魚における正常発生率とは相関しないことを明らかにしている（非特許文献３）。そこで、水産増養殖上、卵質を評価するために、より直接的で普遍的な
卵質評価マーカーの単離とそれを用いた診断方法の開発が求められている。
【０００６】
近年、ゼブラフィッシュで発生に関わる突然変異体の大規模スクリーニングが行われ、発生異常に係わる原因遺伝子の染色体マッピング、およびその同定が行われてきた。その結果、単離された原因遺伝子の多くが、卵の形成の時に母親の遺伝子から転写され、卵中に蓄えられる母性遺伝子（母性ｍＲＮＡ）であることが明らかとなっている（非特許文献５）。さらに、これら母性遺伝子の質的または量的な異常が、種々の形態異常、例えば前頭部欠落、上顎の形成不全、体節変形などと密接に関連していることがトランスジェニック魚を用いた解析によって見出されている（非特許文献６、７）。したがって、正常発生に関わる母性遺伝子群をスクリーニングできれば、新たな卵質評価マーカーとなりうる良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングすることが可能となる。さらに、得られたｃＤＮＡを利用すれば、ＤＮＡチップや抗体などの作製が可能となり、被検卵での良質卵関連遺伝子の質的・量的な解析が遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで可能となり、それに基づいた卵質診断法の開発が期待できる。
【特許文献１】特開２００６−１０９９１８号公報
【非特許文献１】足立伸次 成熟・産卵の人為的制御と卵質 月刊海洋 ３２（２）：１２０−１２６，２０００
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｇｅｎ Ｋ．， Ｏｋｕｚａｗａ Ｋ．， Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｍ． Ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７・ ａｎｄ １１−ｋｅｔｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｔｏ ｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２３９ （１−４）， ４８５−４９６． ２００４
【非特許文献３】黒川忠英、鵜沼辰哉、宇治督、玄浩一郎、野村和晴、田中秀樹、人工生産ウナギ初期仔魚にみられる形態異常 平成１８年度日本水産学会大会講演要旨集 ２６２， ２００６
【非特許文献４】安楽和彦、舛田知子、川村軍蔵、Ｒａｌｐｈ Ｒ． Ｍａｎａ、人工種苗マダイの鼻孔隔皮形成過程 日本水産学会誌６５（３）： ５０１−５０２， １９９９
【非特許文献５】Ｐｅｌｅｇｒｉ Ｆ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８（３）， ５３５−５５４． ２００３
【非特許文献６】Ｄｏｓｃｈ Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ ＤＳ．， Ｍｉｎｔｚｅｒ ＫＡ．， Ｒｕｎｋｅ Ｇ．， Ｗｉｅｍｅｌｔ ＡＰ．， Ｍｕｌｌｉｎｓ ＭＣ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｍｉｄｂｌａｓｔｕｌａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ： ｍｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ６（６）， ７７１−７８０．２００４
【非特許文献７】Ｗａｇｎｅｒ ＤＳ．， Ｄｏｓｃｈ Ｒ．， Ｍｉｎｔｚｅｒ ＫＡ．， Ｗｉｅｍｅｌｔ ＡＰ．， Ｍｕｌｌｉｎｓ ＭＣ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｍｉｄｂｌａｓｔｕｌａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ： ｍｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ＩＩ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ６（６）， ７８１−７９０．２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、種苗生産現場では人為催熟によって得られた稚仔魚の形態異常が大きな問題となっており、解決すべき緊急課題となっている。しかし、魚類の形態異常の発症メカニズムは様々な因子が関与していることから非常に複雑であり、発症のメカニズムは未
だ解明されていない。特に、魚類の胚発生または形態形成と密接に関連していると考えられている母性遺伝子に関する解明は未だ、遅々として進んでいない。
【０００８】
他方、もし魚類の正常発生に関与する母性遺伝子群が明らかにされれば、当該遺伝子群の機能解析を通じて、母性遺伝子群による胚発生や形態形成の分子機構の詳細がより一層明らかにされる。さらに、これにより得られる知見の活用によって、例えば増養殖対象魚種において、母性遺伝子の異常によって引き起こされる発生・形態異常の発症メカニズムの研究やそれを用いた卵質の診断法などの開発にも利用できる可能性があり、人為催熟技術や種苗生産技術等において幅広い利用が期待できる。
【０００９】
このような状況を鑑みて、本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子群の網羅的単離方法および単離された遺伝子群を用いた卵質の診断方法を提供することを課題としている。より詳細には、魚類の良質卵に関連する母性遺伝子群を網羅的・効率的に単離し、非検査卵について、関連遺伝子群の遺伝子レベルまたはタンパク質レベルでの定性検査や発現量の定量によって、被検卵について卵質を簡便に診断できる新たな方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、個別飼育に基づく魚類の仔魚の発生・形態異常率測定法を開発し、この方法を用いて各親魚から得られた卵から生じる種々の発生・形態異常を解析してきた。そして、それら解析から親魚ごとに発生・形態異常の種類が異なること、また、発生・形態異常が見られた不良卵を異なる雄由来の精子と受精させても同様の異常が生じることを見いだし、発生・形態異常が出現する不良卵では、胚発生や形態形成に重要な母性遺伝子が有効に機能していないことを示唆した。このような研究背景をもとで鋭意検討した結果、正常卵と不良卵を用いた遺伝子のサブトラクション解析によって、良質卵関連遺伝子群の網羅的な単離ができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は産業上有用な下記第１から第１３の発明を包含するものである。
【００１２】
第１には、良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法によって、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ
Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ： ＮＥＡＴ）を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１３】
第２には、良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法が、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析によるものである、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１４】
第３には、正常卵由来の遺伝子ライブラリーと不良卵由来の遺伝子を用いたサブトラクション法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供し、第４には、ＰＣＲを用いるディファレンシャル・ディスプレイ法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１５】
第５には、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供し、第６には、第１から第５のいずれかに記載の方法によりクローニングされる魚類の良質卵関連遺伝子群も提供する。
【００１６】
第７には、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質であって、第１から第５のいずれかに記載の方法によりクローニングされるクローンから産生される組換えタンパク質または未受精卵から精製されたタンパク質である、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質を提供し、第８には、第６に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群をプローブとすることを特徴とするマイクロアレイを提供する。
【００１７】
また、第９には、第７に記載のタンパク質に対する抗体を提供し、第１０には、第８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、被検卵における良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法を提供する。
【００１８】
第１１には、第９に記載の抗体を用いて、良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法を提供し、第１２には、第８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法を提供する。
さらに、第１３には、第９に記載の抗体を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
上記のように、本発明に係わる良質卵関連遺伝子群の網羅的単離によって、増養殖対象魚種の被検卵におけるそれら遺伝子群の遺伝子レベルまたはタンパク質の発現レベルが、正常卵のそれの範囲内に含まれるのか否かについて、正確かつ簡便に診断することができる。このため、本発明に係わる診断方法を用いることで、被検卵が健康な稚仔魚に育つ卵であるかどうかを未受精卵の段階で診断できるという効果を奏する。さらに、母性遺伝子群の卵への蓄積は卵黄形成の初期から始まることから、非常に早い段階で親魚が生産する卵の質についても評価できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子の網羅的な単離方法およびそれを利用した卵質の診断方法を提供するものである。そこで、本発明に係わる良質卵関連遺伝子群の単離方法および、その方法によって単離された遺伝子を利用する卵質の診断方法について説明する。
【００２１】
＜良質卵関連遺伝子の網羅的の単離方法＞
本発明に係わる良質卵関連遺伝子の単離方法は、魚類の発生や形態形成に関与する母性遺伝子を、正常卵と不良卵とのサブトラクション解析によって単離・同定する方法である。従って、少なくとも単離方法を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は下記に限定されるものではない。
なお、本実施の形態では主にニホンウナギ由来の良質卵関連遺伝子群をあげて説明しているが、本発明の対象とする魚種はニホンウナギに限られるものではない。例えば、マダイ等のスズキ目、ヒラメ等のカレイ目、マイワシ等のニシン目、トラフグ等のフグ目、サケ科魚類等が挙げられる。具体的にはトラフグ、ブリ、カンパチ、チョウザメ、マイワシ、サケ科魚類等が挙げられる。
【００２２】
ここで、本発明の「良質卵」とは、正常な胚発生または形態形成を示す正常卵のことをいう。また、本発明の「不良卵」とは、異常な胚発生または形態形成において異常を示す卵のことをいう。
本発明の「良質卵関連遺伝子」とは、魚類の卵質に関与する遺伝子群のうち、正常な胚
発生や形態形成に係わる母性遺伝子群のことをいい、正常卵には存在するが不良卵には存在しない遺伝子群、正常卵および不良卵のいずれにも存在するが、正常卵にのみ発現する遺伝子群や、正常卵にのみ発現量が多い遺伝子群等をさす。
【００２３】
本発明に係わる良質卵関連遺伝子群は、対象とする魚類の稚仔魚で発生・形態異常がみられなかった未受精卵から得られるＤＮＡ、ＲＮＡのことをいい、ｍＲＮＡ自体や、それに逆転写酵素等を用いてｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡであってもよい。また、魚類のゲノムＤＮＡ中に含まれる形態、例えばイントロン等の非コード配列を含むＤＮＡ等であってもよい。さらに、遺伝子配列情報をもとに、該配列を持つポリヌクレオチドをＤＮＡ合成機等によって化学合成したものや、合成ポリヌクレオチド受託サービスを利用して取得したものであってもよい。
【００２４】
本発明に係わる良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法としては、従来公知の方法を利用することが可能である。例えば、正常卵ｃＤＮＡライブラリーとビオチン化標識した不良卵由来のｍＲＮＡを用いたサブトラクション法によって魚類の発生や形態形成に係わる母性遺伝子を網羅的にクローニングすることで、良質卵関連遺伝子群を単離する方法を用いることができる。正常卵由来の遺伝子ライブラリーに用いる遺伝子や、サブトラクション法に用いる不良卵由来の遺伝子としては、ｍＲＮＡ以外にＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも用いることができる。なお、遺伝子ライブラリーの構築に用い得る公知の方法としては、いずれの方法も用いることができるが、例えば、正常卵から調整したｍＲＮＡから逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを用いたリンカープライマー法等に従って構築することができる。
【００２５】
本発明のサブトラクション法には、公知のいずれの方法も用いることができるが、発現量の差のある遺伝子を網羅的に単離するという点において、わずかな発現量の差のある分子でも単離できる高効率なサブトラクション法を用いることが好ましい。
この高効率なサブトラクション法として、例えば近年、Ｋｏｂｏｒｉらによって開発された、ある状態Ａの細胞から調整したｃＤＮＡライブラリーと、それとは異なる状態Ｂの細胞由来のｍＲＮＡを用いることで、両者に共通の不必要な遺伝子を効率的に除外し、わずかな発現量の差のある分子でも単離できるという「高効率ｃＤＮＡサブトラクション法」（参考文献１、参照）等を用いることが好ましい。
［参考文献１］ Ｋｏｂｏｒｉ Ｍ．， Ｉｋｅｄａ Ｙ．， Ｎａｒａ Ｈ．， Ｋａｔｏ Ｍ．， Ｋｕｍｅｇａｗａ Ｍ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ．， Ｋａｗａｓｈｉｍａ
Ｈ． Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， ３：４５９−４７５， １９９８
【００２６】
また、上記の単離方法に特に限定されるものではなく、ディファレンシャル・ディスプレイ法やディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等による正常卵と不良卵とのサブトラクション解析方法であればよい。例えば、ディファレンシャル・ディスプレイ法のように、サンプルから抽出した全ＲＮＡやｍＲＮＡ等に対し、各種プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、正常卵と比較して不良卵で、その発現が顕著に異なる遺伝子のＤＮＡ増幅断片を取得する方法によっても良質卵関連遺伝子群の単離が可能である。
【００２７】
本発明では例えば、ニホンウナギ由来の上記良質卵関連遺伝子群を用いて、他の増養殖対象魚種からニホンウナギ良質卵関連遺伝子群と相同性を有する遺伝子をクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来の公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００２８】
ゲノムＤＮＡの少なくとも一部がデータベース化している魚種では、上記ニホンウナギ良質卵関連遺伝子群の塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベースより検索することができる。例えば、汎用されている相同性アルゴリズムであ
るＢＬＡＳＴによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。
【００２９】
ゲノムＤＮＡがデータベース化されていない魚種の場合には、本発明で得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群のｃＤＮＡを用いて、それぞれの魚種で作製された適当なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる魚種由来の相同遺伝子を単離することができる。また、本発明で単離された遺伝子の塩基配列の情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー等から遺伝子を単離することができる。
【００３０】
本発明では、上記良質卵関連遺伝子にコードされるタンパク質またはそのペプチドに対する抗体を用いて他の魚種から相同性を有する遺伝子をクローニングすることもできる。
【００３１】
本発明に係わるタンパク質またはそのペプチドは、上記良質卵関連遺伝子に全部または一部をコードされるタンパク質またはペプチドであればよい。また、上記アミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ魚類の正常発生に係わるタンパク質も含むことができる。
【００３２】
さらに、上記良質卵関連遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内に発現させた状態のものも含み、上記良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質として、未受精卵または生殖腺等の天然資源から単離・精製された状態のものも含む。また、他のタンパク質やポリペプチドとつながった融合タンパク質や化学合成なされたタンパク質であってもよい。
【００３３】
なお、これらのタンパク質は、良質卵関連遺伝子の網羅的なスクリーニング法と同様に、良質卵関連遺伝子にコードされるタンパク質の網羅的なスクリーニング法に用いることができる。例えば、２次元電気泳動等の生化学的な手法によって、良性卵由来のタンパク質と不良卵由来のタンパク質とにおける差のあるタンパク質を明らかにして、それらを単離・精製すること等が挙げられる。
【００３４】
得られた組み換え体タンパク質や精製タンパク質を用いれば、これらを認識する抗体を調整することが可能となる。本発明の良質卵関連遺伝子がコードされるタンパク質に対する抗体は、周知の方法で作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、合成または精製した本発明のタンパク質もしくはその一部のペプチドをウサギやラット等の動物に免疫し、一定期間後に血液を採取することで調整することが可能となる。他方、モノクローナル抗体は、上記タンパク質もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫細胞とを融合させ、目的の抗体を産生するハイブリドーマを単離し、該細胞から抗体を調整することが可能である。
【００３５】
＜良質卵関連遺伝子群を用いた診断方法＞
本発明に係わる診断方法は、魚類未受精卵における発生や形態形成に係わる母性遺伝子群が、正常範囲内になるか否かを、遺伝子レベルやタンパク質レベルで質的または量的に診断する方法であって、診断にあたり、少なくとも遺伝子レベルやタンパク質レベルを測定できる過程や工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は以下の記載に限定されるものではない。
【００３６】
本診断方法において、良性卵関連遺伝子群の遺伝子レベルを定性または定量を行う場合、増養殖対象魚から未受精卵を採取した後、該試料から核酸を抽出する操作を行う。この試料から核酸を抽出する方法としては、例えばグアニジン・塩化セシウム超遠心法、フェノール・クロロホルム法、など任意の抽出方法を使用することができる。また、オリゴ（
ｄＴ）カラムを用いて、全ＲＮＡからｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ選択することでｍＲＮＡを調整してもよい。得られた核酸の量が微量な場合は、必要に応じてＰＣＲ反応によって核酸を増幅する操作を行ってもよい。
【００３７】
上記単離方法によって得られた試料を用いて、良質卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量を行うことができる。これには例えば、マイクロアレイ法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、およびそれらの組み合わせを含む当業者であれば容易かつ確実な方法を使用することができる。
【００３８】
本発明の実施例で示すように、例えば、マイクロアレイ法を用いる定性的または定量的な解析によって、良質卵関連遺伝子群の診断が可能である。ここで、「定性的」というのは、遺伝子の発現の有無をさし、「定量的」というのは、遺伝子の発現量のことをさす。
マイクロアレイ法を用いる場合には、まず、サブトラクション解析によって得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群をスポットしたマイクロアレイガラスを作製する。次に、正常な発生を示す未受精卵（良質卵）および発生・形態異常がみられた未受精卵（不良卵）から抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等を用いて、Ｃｙ３またはＣｙ５等の検出可能な標識物質でラベルを行う。マイクロアレイガラスと標識したプローブのハイブリダイゼーションによって、良性卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量ができる（参考文献２、参照）。
［参考文献２］ ＤＮＡ マイクロアレイ実験マニュアル、林崎良英 監修、２００１ （羊土社）；ＤＮＡチップ実験まるわかり、佐々木博己、青柳一彦 編、２００４ （羊土社）；ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ− Ｅｄ． Ｍａｒｋ Ｓｃｈｅｎｅ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９９
【００３９】
具体的には、マイクロアレイに固定した良質卵関連遺伝子群の塩基配列を有するプローブと、蛍光物質や放射線物質などで標識した被検卵に含まれるターゲットとなる遺伝子とを、マイクロアレイ上でハイブリダイズさせることで、ハイブリダイズしたターゲット遺伝子が、各スポットからの蛍光シグナルや放射線シグナルなどとして検出される。この検出したシグナル強度をコンピューターで定性的または定量的に解析することにより、被検卵における良質卵関連遺伝子群の遺伝子発現や含量プロファイルを測定することができる。
【００４０】
また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ等を用いたインタカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法等の従来公知の方法を用いることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるプライマーは、対象となる遺伝子を特異的検出できるものであれば特に制限されるものではないが、２０〜３０塩基からなり、エクソンーイントロンをまたぐ形で設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、良質卵関連遺伝子群の塩基配列情報によって決定し、それら配列を有するプライマーの作製はＤＮＡ合成機によって可能である。
【００４１】
さらに、ノーザンブロット法を用いることができる。まず、本発明で単離された良質卵関連遺伝子群を放射性同位体、蛍光物質、ビオチン等の検出可能な標識物質でラベルする。次に、未受精卵から抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む試料をアガロース電気泳動で分離した後、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の支持体へ転写する。試料を転写した支持体と標識したプローブとのハイブリダイゼーションを行うことで、良性卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量が解析できる。
【００４２】
これらの良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法を用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改
善法をスクリーニングすることができる。
ここで、「遺伝子の動態をモニタリングする」とは、ある人為催熟を施した時の良質卵関連遺伝子群の蓄積量や蓄積されている分子種を明らかにすることをいう。正常な胚発生や形態形成に係わる母性遺伝子は、卵形成の過程で卵内に蓄積される。天然の親魚では、これら母性遺伝子群の蓄積が正常に進行するため、得られた卵は正常な胚発生や形態形成を示すものと考えられる。他方、ホルモン投与等の人為催熟を行った親魚は、天然と比較して母性遺伝子群の蓄積に量的な偏り等が生じるため、結果としてなんらかの形態異常が発症しているものと思われる。これらを比較することで、ある人為催熟を施した時の良質卵関連遺伝子群の蓄積量や蓄積されている分子種を明らかにすることができる。このように、「遺伝子の動態をモニタリングする」ことは、実施した催熟技術の有効性を科学的に明らかにする上で重要である。
【００４３】
また、「良質卵を合理的に生産するための卵質改善法」とは、上記の「遺伝子の動態をモニタリングする」ことによって明らかになった実施した催熟技術の有効性を利用して、例えば蓄積がうまくいかなかった分子種について、人為催熟時の種々のパラメーター（例えばホルモンの投与量、投与期間、投与時期等）を変化させることで、これら分子種を正常なレベルにもっていき、結果的によりより良質卵の生産を可能する方法のことをいう。
【００４４】
良性卵関連遺伝子がコードするタンパク質の定量を行う場合には、増養殖対象魚から未受精卵を採取した後、該試料からタンパク質を抽出する操作を行う必要がある。この操作にあたり、例えば、ホモジナイザーによる抽出法など任意の抽出方法を使用することができる。
【００４５】
抽出操作を行った試料を用いて、上記良質卵関連遺伝子群がコードするタンパク質の発現量の定量を行うことができる。例えば、これら遺伝子がコードするタンパク質に対する特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いた固層酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法、およびそれらの組み合わせを含む本分野で周知の任意の方法を使用することができる。
【００４６】
具体的には、抗体を用いた測定系によって、被検卵における良質卵関連遺伝子から合成されたタンパク質量を定量し、その値が正常卵の範囲内に含まれるのか否かについて、正確かつ簡便に判断するという定量的な解析によって、被検卵が正常な発生や形態形成をするか否かをタンパク質レベルで明らかにすることができる。ここで、「定量的」というのは合成されたタンパク質量を調べることをさす。
【００４７】
例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いて良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルの診断が可能である。まず、良質卵関連遺伝子群をコードするタンパク質に対するポリクローナル抗体を吸着させたＥＬＩＳＡ用プレートを作製する。次に、被検卵をホモジナイズした後、遠心分離によって上清を回収し、タンパク質を含む試料を作製する。この試料を作製したＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、１次抗体および２次抗体（酵素標識された抗免疫グロブリン）と反応させる。反応後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、酵素に対する基質を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーによってタンパク質量を定量する。このようにして、被検卵内における良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルが測定することができる。なお、２次抗体の標識として用いられる酵素としては、例えばアルカリホスファターゼをあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
さらに、ウエスタンブロット法による解析も可能である。すなわち、被検卵から調整した試料をアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離した後、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜などに転写し、放射性物質や蛍光物質等の検出可能な標識物質でラベルされた抗体を
用いて良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルでの発現量の定量が可能となる。
【００４９】
これらの良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングすることができる。
ここで、「タンパク質の動態をモニタリングする」とは、ある人為催熟を施した時の母性遺伝子由来のタンパク質の合成を明らかにすることをいう。卵形成の過程で卵内に蓄積された良質卵関連遺伝子群は、発生の過程でタンパク質に翻訳されて、正常な胚発生や形態形成に関与すると考えられる。天然の親魚では、これら母性遺伝子由来のタンパク質の合成が正常に進行するため、得られた卵は正常な胚発生や形態形成を示すものと考えられる。他方、ホルモン投与等の人為催熟を行った親魚は、天然と比較して母性遺伝子由来のタンパク質の合成が不完全であり、その結果としてなんらかの発生・形態異常を発症しているものと思われる。これらを比較することで、ある人為催熟を施した時の母性遺伝子由来のタンパク質の合成を明らかにすることができる。このように、「タンパク質の動態をモニタリングする」ことは、実施した催熟技術の有効性を科学的に明らかにする上で重要である。
【００５０】
また、「良質卵を合理的に生産するための卵質改善法」とは、上記の「タンパク質の動態をモニタリングする」ことによって明らかになった実施した催熟技術の有効性を利用して、例えば蓄積がうまくいかなかった分子種について、人為催熟時の種々のパラメーター（例えばホルモンの投与量、投与期間、投与時期等）を変化させることで、これら分子種を正常なレベルにもっていき、結果的によりより良質卵の生産を可能する方法のことをいう。
【００５１】
この出願の発明におけるその他の定義等については、以下の発明の実施形態において詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出展を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物的技術は、参考文献３、４等に記載されている。
［参考文献３］ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２nd ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， １９８９
［参考文献４］ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ．， Ｂｒｅｎｔ Ｒ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．， Ｍｏｏｒｅ ＤＤ．， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ．， Ｓｍｉｔｈ ＪＡ．， Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５
【実施例１】
【００５２】
＜遺伝子の単離方法＞
１−１：サンプル
愛知県水産試験場より譲渡された実験用のニホンウナギを用いて、下記の方法（参考文献５、参照）によって人為催熟を行った。
［参考文献５］ Ｏｈｔａ Ｈ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｏｋｕｚａｗａ Ｋ．， Ｉｉｎｕｍａ Ｎ．， Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ．， Ｆｉｓｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：１６３−１６９， １９９７
【００５３】
人為催熟方法：
ニホンウナギは海水に一定期間馴致後、雌魚にはサケ脳下垂体抽出物（２０ｍｇ／尾）を毎週１回注射により投与し、卵黄形成を誘導した。これらのウナギの卵径を指標にして卵の成長をモニタリングし、卵径８００μｍ以上の卵を有する個体に排卵誘発ステロイドホルモン（１７α，２０β−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン：ＤＨＰ）を体重１ｋｇ当たり２ｍｇ投与することで排卵卵を得た。他方、雄にはヒト胎盤性ゴナドトロピンを毎週１回（１０００ ＩＵ／ｋｇ）、５回投与することで精子を得た。得られた卵と精子は速やかに受精させ、受精卵は２２℃の水槽で飼育を行った。
【００５４】
人為催熟によって得られた卵は速やかに受精させ、一部をマイクロプレート法（参考文献６、参照）によって解析した。
残りはサブトラクション、ｃＤＮＡライブラリー作製等に用いた。マイクロプレート法およびその解析としては４８穴プレートに、孵化斃死防止剤としてポリエチレングリコール６０００を加えた濾過海水を１ｍｌずつ入れ、それぞれにニホンウナギ受精卵を１個ずつ収容し、摂餌開始期まで換水を行わずに２２℃で個別飼育をして、その後の孵化率・生残率および接餌開始期（受精後１０日目）における形態異常率を実体顕微鏡下で観察した。飼育終了後は、仔魚をホルマリン固定し、顕微鏡下で形態異常の分類（前頭部欠落、上顎の形成不全等）を行い、各ロットにおける各種形態異常の割合を数値化した。
［参考文献６］ Ｕｎｕｍａ Ｔ．， Ｋｏｎｄｏ Ｓ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｎｏｍｕｒａ Ｋ．， Ｏｈｔａ Ｈ， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ， ２４１：３４５−３５６， ２００４
【００５５】
１−２：ＲＮＡの調整
接餌開始期において、正常な発生を示したロット（図１Ａ）および形態異常（例えば、上顎形成不全）がみられたロット（図１Ｂ）の未受精卵から、下記の方法（参考文献７、参照）に記載の方法によって全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。
［参考文献７］ Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ， Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６２：１５６−１５９，１９８７
【００５６】
ＲＮＡの調製方法：
チオシアン酸グアニジンを含む水溶液中でニホンウナギ未受精卵を破砕し、卵内に含まれるＲＮａｓｅを失活させた。次に、抽出物をフェノール・クロロホルム抽出し、得られた上清をエタノール沈殿することで、全ＲＮＡを精製した。
さらに、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で全ＲＮＡからｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ選択操作を２回繰り返すことで得た試料をｍＲＮＡとし、正常卵ｃＤＮＡおよびサブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
【００５７】
１−３：正常卵ｃＤＮＡライブラリーの作製
正常卵から得られたｍＲＮＡから、Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｔａｋａｒａ社）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行った。次に、下記のｐＡＰ３ｎｅｏベクターを用いたリンカープライマー法（参考文献８、参照）に従い、１．０ｘ１０6ｐｆｕの独立したクロー
ンを含み、挿入ｃＤＮＡの平均鎖長が１．２ｋｂのニホンウナギ正常卵ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
［参考文献８］ Ｆｕｊｉｉ Ｔ．， Ｔａｍｕｒａ Ｋ．， Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＮＧ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ ＤＪ．， Ｊｅｎｋｉｎｓ ＮＡ．， Ｙｏｍｏｇｉｄａ Ｋ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ Ｙ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ．， Ａｂｉｋｏ Ｙ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ５７：９４−１０１，１９９９
【００５８】
リンカープライマー法：
オリゴ（ｄＴ）と制限酵素部位を含むプライマー（リンカープライマー）を用いて、ｍＲＮＡから逆転写酵素によって１本鎖ＤＮＡの合成を行った。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩならびにＲＮａｓｅＨによって２本鎖ＤＮＡを合成し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる５’末端の平滑化、および制限酵素突出端を含むアダプターを付加した。アダプターを付加した２本鎖ＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、スピンカラムによってｃＤＮＡのサイズ分画した後、ベクターに連結し、大腸菌に形質転換させて、正常卵由来の遺伝子ライブラリーを構築した。
【００５９】
１−４：サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製
図２（※Ｋｏｂｏｒｉらが方法を示した図に加筆・修正を行ったもの）に概要を示した作製手順によって、良質卵関連遺伝子群を単離するためのサブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
まず、形態異常がみられた未受精卵（不良卵）から調整したｍＲＮＡ（１０μｇ）を、水銀ランプ下でＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と反応させビオチン化ｍＲＮＡを作製した。別途、正常卵由来のｍＲＮＡより構築したｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させ、正常卵一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、下記に記載の方法に基づいて、ビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【００６０】
ハイブリダイズ方法：
ビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡ（６μｇ）を、正常卵一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）およびポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むハイブリダイゼーション液（最終濃度：４０％脱イオンホルムアミド、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ）で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）−フェノール・クロロホルム処理によって、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を回収した。次に、回収したｓｓＤＮＡとビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡ（４μｇ）を用いて、上記と同じ条件で再度ハイブリダイゼーションを行った。
【００６１】
ハイブリダイズ後にストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）処理を行うことで、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしたクローンを除外した。
他方、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしなかったクローンは、ＢｃａＢＥＳＴ
Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）によって二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法を用いてコンピテント大腸菌（ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１２Ｓ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換した。得られたライブラリーは第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとし、ランダムに選抜した１１５２クローンの５’側塩基をＭｅｇａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で決定した。
得られた配列の重複について調べると、結果として合計で７０４の独立したクローンが得られた。これらクローンをＮＣＢＩデータベースのｔＢＬＡＳＴｘによりホモロジー検索した結果、６０％が発生・分化、遺伝子の転写、情報伝達系、イオン輸送等に関わる既知の遺伝子と高い相同性を示すものであり、約４０％は機能不明または全く未知の遺伝子であることが判明した（図３）。
【００６２】
１−５：段階的サブトラクション
第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定後、３５０クローンのプラスミドＤＮＡを各々０．１μｇ集めて１本チューブにまとめた後、Ｎｏｔ Ｉ処理によって直鎖状ＤＮＡを調整した。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって直鎖状ＤＮＡ
（５μｇ）からｃＲＮＡの合成し、ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてビオチン化を行った。
【００６３】
別途、第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させ、第１次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。第１次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）とビオチン化ｃＲＮＡ（１０μｇ）は、ポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および配列表配列番号１に記載のマスキングオリゴヌクレオチド（１２０ｐｍｏｌ、参考文献９、参照）を含むハイブリダイゼーション液で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせ、反応後はストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）処理−フェノール・クロロホルム処理によって、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしたｓｓＤＮＡクローンを除外した。
［参考文献９］ Ｆｕｊｉｉ Ｔ．， Ｔａｍｕｒａ Ｋ．， Ｍａｓａｉ Ｋ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， ＮＩｓｈｉｍｕｎｅ Ｙ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ３： ３６７−３７２， ２００２
【００６４】
他方、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかった第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリー由来のｓｓＤＮＡクローンは、ＢｃａＢＥＳＴ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）によって二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法でコンピテント大腸菌に形質転換した。得られたライブラリーは第２次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとし、ランダムに選抜した１１５２クローンの５’側塩基をＭｅｇａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で決定した。得られた配列の重複について調べると、結果として合計で２０５の独立したクローンが得られた。
【００６５】
第３次サブトラクション用ライブラリーの調整は、上記、サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製で得られたクローンのうち第２次サブトラクション用ライブラリーの調整に使用しなかった残り３５４クローンを用いて行った。まず、３５４クローンのプラスミドＤＮＡを各々０．１μｇ集めて１本チューブにまとめた後、Ｎｏｔ Ｉ処理を行った。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって直鎖状ＤＮＡ（５μｇ）よりｃＲＮＡを合成し、ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてビオチン化を行った。別途、第２次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させることで第２次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。第２次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）とビオチン化ｃＲＮＡ（１０μｇ）は、ポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および配列表配列番号１のマスキングオリゴヌクレオチド（１２０ｐｍｏｌ）含む溶液内で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせた。
【００６６】
反応後、ストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）−フェノール・クロロホルム処理を行うことで、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしたｓｓＤＮＡクローンを除外した。他方、ビオチン化ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったクローンは、二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法を用いてコンピテント大腸菌に形質転換した。
得られたライブラリーは第３次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとして、ランダムに選抜した１５００クローンの５’側塩基を決定した。その結果、１０３種類の独立したクローンを同定でき、最終的に段階的サブトラクションで正常卵ｃＤＮＡライブラリーより、１１６０種類のニホンウナギ良質卵関連遺伝子（ｅｅｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ｅＮＥＡＴ）が単離できた。単離された１１６０種類の遺伝子については、塩基配列を配列表配列番号２〜１１６１に示し、遺伝子配列から類推したアミノ酸配列に対するホモロジー検索や、遺伝子配列に対するホ
モロジー検索の結果を表１に示した。ホモロジー検索はＢＬＡＳＴ解析を用いて行い、Ｅ−ｖａｌｕｅが９．９〜１．００Ｅ−１５０のものをＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎに示した。
【００６７】
【表１】
※遺伝子配列に対するホモロジー検索の結果を示したものは、Ｐｒｏｇｒａｍでｂｌａｓｔｎと記載した。
【００６８】
なお、上記ニホンウナギの良性卵関連遺伝子群には発生・分化、遺伝子の転写、情報伝達系、イオン輸送等に関わる既知の遺伝子と高い相同性を示すものが４０％含まれる一方で、約６０％は機能不明または全く未知の遺伝子、またこれまでニホンウナギで同定された既知の遺伝子が約０．５％（６クローン）含まれていた（図４）。この頻度は、段階的サブトラクションを実施することにより、正常卵と不良卵で共通の不必要なｃＤＮＡクローンの単離を回避できたことを示すものであった。
【実施例２】
【００６９】
＜診断方法＞
２−１：マイクロアレイ作製
サブトラクション解析によって得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群を有しているマイクロアレイガラスを開発した。まず、良質卵関連遺伝子群が挿入されたプラスミドベクター（ｐＡＰ３ｎｅｏ：Ｔａｋａｒａ社）を鋳型にして、ｅｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社）を用いたＰＣＲ反応によって表１の遺伝子を目的の遺伝子としてそれぞれ増幅した。
増幅された各ＤＮＡ断片は、ＭｏｎｔａｇｅＰＣＲ９６ Ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製した後、最終ＤＮＡ濃度が１００ｎＭになるように調整した。調整した各ＤＮＡは、アレイ作製装置（カケンジェネックス製）を用いて、ＫＧスライドグラス上にスポットした。スポットした各ＤＮＡは８０℃で１時間ベーキングした後、２ＸＳＳＣ−０．２％ＳＤＳおよび超純水による洗浄を行い、ニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイを作製した。
【００７０】
本実施例で作製したニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイは、正常卵と不良卵のサブトラクション解析によって得られた母性遺伝子群を全てディプリケートでスポットしておりその総数は１１６０種類、２３２４個である。別途、調整したニホンウナギβアクチンおよびλｃｏｎｔｒｏｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ （Ｔａｋａｒａ社）をそれぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして、同一マイクロアレイガラス上にスポットした。
【００７１】
２−２：サンプル
孵化後１０日目に奇形率が低い未受精卵（正常卵：Ｋ１９）および全て奇形であった未受精卵（不良卵：Ｋ８８）をそれぞれ用いて、これらから、上記実施例１に記載した方法によって全ＲＮＡをそれぞれ抽出し、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、それぞれからｍＲＮＡを調整した。ウナギでは孵化後１０日目における奇形率は極めて高いため、正常率が３３％を示す卵は卵の質としてはかなり良好と考えられた。これを鋳型として、図５に示すようにＣｙ３またはＣｙ５で標識したｃＤＮＡの調整を行い、マイクロアレイ解析を行った。
【００７２】
【表２】
【００７３】
２−３：解析
合成したＣｙ３標識ｃＤＮＡ（正常卵由来）とＣｙ５標識ｃＤＮＡ（不良卵由来）は混和後、ニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、ＰｅｒｆｅｃｔＨｈｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて６８℃、１８時間行い、反応後は洗浄と乾燥を行い、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度をスキャナー（富士写真フイルム社）で読み取り、不良卵における良質卵関連遺伝子群を質的および量的に解析した。
その結果、正常卵と比較して不良卵において蓄積量が半分以下の遺伝子が１７種類あることが示された（表２）。これらは配列番号９９６、１６１、１０７１、４８１、３００、１１０８、２０７、５２５、５８５、１０３１、６０４、５７５、６４５、４７７、７４１、１８６および３４２に示す遺伝子であり、そのほとんどが既知の遺伝子と相同性を示さず、全く新規の機能不明な遺伝子であった。
この結果により、本発明において遺伝子マーカーを用いることで卵の良し悪しを判断できることが初めて示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の方法によって、新たな卵質評価マーカーとなりうる良質卵関連遺伝子群が単離できる。これによって、増養殖対象魚の被検卵における良質卵関連遺伝子群が正常卵のそれの範囲内に含まれるのか否かが正確かつ簡便に判定することができる。従って、学術的な利用価値だけでなく、卵質診断技術、人為催熟時の卵質改善技術など、広範な用途に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】サンプルとして用いたニホンウナギの形態異常個体を示した図である。Ａ：正常個体、Ｂ：形態異常個体（上顎の形成不全）を示した（実施例１）。
【図２】ニホンウナギの良質卵関連遺伝子の網羅的の単離方法の概略を示した図である（実施例１）。
【図３】第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーから単離し、塩基配列決定した７０４クローンのホモロジー検索の結果を示す図である（実施例１）。
【図４】段階的サブトラクションで正常卵ｃＤＮＡライブラリーより最終的に単離された１１６０種類の良質卵関連遺伝子のホモロジー検索の結果を示す図である（実施例１）。
【図５】マイクロアレイ解析の概要を示した図である（実施例２）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子の網羅的な単離方法およびその利用に関するものである。さらに詳しくは、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析を行うことで、良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＮＥＡＴ）を単離し、それらを利用して卵質の診断方法や卵質改善技術を開発することで、増養殖対象魚の安定的・効率的な種苗生産を可能とすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内において、消費者ニーズの多様化によって多岐に渡る魚種での種苗生産技術および飼育技術の確立が強く望まれている。また、世界的にも天然資源に依存しない安定的な種苗量産技術および飼育技術の確立が求められている。このため、近年飛躍的に増大した内分泌学的知見をもとに、ホルモンによる養殖対象魚種の人為催熟技術の開発がなされてきた（非特許文献１）。とりわけ、効率的なホルモンの投与方法の開発は著しく、実用化された種々の方法が実際の種苗生産現場で使用されている（非特許文献２）。
【０００３】
さらに、魚類のホルモン投与時期においても、事前に親魚の卵径に基づいた採卵成績予測（排卵時間、卵量、卵質）を行う安定的および効率的な採卵方法が提案されている（特許文献１）。この方法では、ホルモン投与時に親魚から一部採取した卵の卵径に基づいて、ホルモン投与から排卵に至るまでの経過時間を調査したり、ホルモン投与により得られる卵量と卵質を調査したりすることで、採卵成績予測データを作成し、作成した採卵成績予測データに基づいて、採卵と人工授精を最適なタイミングで実施できるようにし、また、実際に使用する個体の選定と使用数量の決定を可能にしている。
【０００４】
このように多くの養殖対象魚種で人為催熟が可能となったが、催熟によって得られた卵からは、発生・形態異常魚が高頻度で発生する等の生産者にとって新たな問題が生じている。例えば、本発明者らは、我が国の養殖最重要魚種の一つであるニホンウナギにおいて、孵化後１０日目の生残個体のうち半数で心臓肥大等のなんらかの形態異常や初期胚の発生異常があることを見いだしている（非特許文献３）。また、マダイの人工種苗では、ほとんどの個体で鼻（鼻孔隔皮）の形成に異常があることが判明している（非特許文献４）。このように良質な種苗が安定的に得られない原因の一つは、これまでの種苗生産技術が産卵などの繁殖特性を指標とした所謂「いかにして養殖対象魚種から卵や精子を得るか」に主眼をおいた技術開発に終始してきた点にある。このため今後は対象魚種の配偶子形成のみならず、得られた卵の質や仔稚魚の質も考慮した技術開発が重要と考えられる。
【０００５】
卵質とは、排卵された卵のうちどれぐらいの割合の卵が健康な稚仔魚に育つかを示したもので、得られた卵や仔稚魚の質を科学的に評価するにあたって最も重要な指標となる。一般に、卵が健康な稚仔魚に育つまでには、卵黄形成後の卵が１）正常に卵成熟・排卵し、２）排卵した卵が精子と正常に受精し、３）受精卵が正常な卵割や胚発生を遂げて、最終的に４）仔魚が正常に発育しなければならない。このため、これまで、それぞれの段階を数値化した１）排卵率、２）受精率、３）正常卵割率・孵化率および４）孵化後の正常仔魚生残率等が卵質の診断に用いられてきた。しかし、これらの診断方法は死滅や変異などの表現型に基くため、厳密性や普遍性に欠けるという問題があった。例えば、本発明者らは、ニホンウナギにおいて、これまで卵質の指標として一般的に使用されてきた受精率や孵化率が必ずしも稚仔魚における正常発生率とは相関しないことを明らかにしている（非特許文献３）。そこで、水産増養殖上、卵質を評価するために、より直接的で普遍的な
卵質評価マーカーの単離とそれを用いた診断方法の開発が求められている。
【０００６】
近年、ゼブラフィッシュで発生に関わる突然変異体の大規模スクリーニングが行われ、発生異常に係わる原因遺伝子の染色体マッピング、およびその同定が行われてきた。その結果、単離された原因遺伝子の多くが、卵の形成の時に母親の遺伝子から転写され、卵中に蓄えられる母性遺伝子（母性ｍＲＮＡ）であることが明らかとなっている（非特許文献５）。さらに、これら母性遺伝子の質的または量的な異常が、種々の形態異常、例えば前頭部欠落、上顎の形成不全、体節変形などと密接に関連していることがトランスジェニック魚を用いた解析によって見出されている（非特許文献６、７）。したがって、正常発生に関わる母性遺伝子群をスクリーニングできれば、新たな卵質評価マーカーとなりうる良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングすることが可能となる。さらに、得られたｃＤＮＡを利用すれば、ＤＮＡチップや抗体などの作製が可能となり、被検卵での良質卵関連遺伝子の質的・量的な解析が遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで可能となり、それに基づいた卵質診断法の開発が期待できる。
【特許文献１】特開２００６−１０９９１８号公報
【非特許文献１】足立伸次 成熟・産卵の人為的制御と卵質 月刊海洋 ３２（２）：１２０−１２６，２０００
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｇｅｎ Ｋ．， Ｏｋｕｚａｗａ Ｋ．， Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｍ． Ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７・ ａｎｄ １１−ｋｅｔｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｔｏ ｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ Ｐａｇｒｕｓ ｍａｊｏｒ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２３９ （１−４）， ４８５−４９６． ２００４
【非特許文献３】黒川忠英、鵜沼辰哉、宇治督、玄浩一郎、野村和晴、田中秀樹、人工生産ウナギ初期仔魚にみられる形態異常 平成１８年度日本水産学会大会講演要旨集 ２６２， ２００６
【非特許文献４】安楽和彦、舛田知子、川村軍蔵、Ｒａｌｐｈ Ｒ． Ｍａｎａ、人工種苗マダイの鼻孔隔皮形成過程 日本水産学会誌６５（３）： ５０１−５０２， １９９９
【非特許文献５】Ｐｅｌｅｇｒｉ Ｆ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ２２８（３）， ５３５−５５４． ２００３
【非特許文献６】Ｄｏｓｃｈ Ｒ．， Ｗａｇｎｅｒ ＤＳ．， Ｍｉｎｔｚｅｒ ＫＡ．， Ｒｕｎｋｅ Ｇ．， Ｗｉｅｍｅｌｔ ＡＰ．， Ｍｕｌｌｉｎｓ ＭＣ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｅｆｏｒｅ ｔｈｅ ｍｉｄｂｌａｓｔｕｌａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ： ｍｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ６（６）， ７７１−７８０．２００４
【非特許文献７】Ｗａｇｎｅｒ ＤＳ．， Ｄｏｓｃｈ Ｒ．， Ｍｉｎｔｚｅｒ ＫＡ．， Ｗｉｅｍｅｌｔ ＡＰ．， Ｍｕｌｌｉｎｓ ＭＣ． Ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ ｍｉｄｂｌａｓｔｕｌａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ： ｍｕｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ＩＩ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ６（６）， ７８１−７９０．２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、種苗生産現場では人為催熟によって得られた稚仔魚の形態異常が大きな問題となっており、解決すべき緊急課題となっている。しかし、魚類の形態異常の発症メカニズムは様々な因子が関与していることから非常に複雑であり、発症のメカニズムは未
だ解明されていない。特に、魚類の胚発生または形態形成と密接に関連していると考えられている母性遺伝子に関する解明は未だ、遅々として進んでいない。
【０００８】
他方、もし魚類の正常発生に関与する母性遺伝子群が明らかにされれば、当該遺伝子群の機能解析を通じて、母性遺伝子群による胚発生や形態形成の分子機構の詳細がより一層明らかにされる。さらに、これにより得られる知見の活用によって、例えば増養殖対象魚種において、母性遺伝子の異常によって引き起こされる発生・形態異常の発症メカニズムの研究やそれを用いた卵質の診断法などの開発にも利用できる可能性があり、人為催熟技術や種苗生産技術等において幅広い利用が期待できる。
【０００９】
このような状況を鑑みて、本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子群の網羅的単離方法および単離された遺伝子群を用いた卵質の診断方法を提供することを課題としている。より詳細には、魚類の良質卵に関連する母性遺伝子群を網羅的・効率的に単離し、非検査卵について、関連遺伝子群の遺伝子レベルまたはタンパク質レベルでの定性検査や発現量の定量によって、被検卵について卵質を簡便に診断できる新たな方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、個別飼育に基づく魚類の仔魚の発生・形態異常率測定法を開発し、この方法を用いて各親魚から得られた卵から生じる種々の発生・形態異常を解析してきた。そして、それら解析から親魚ごとに発生・形態異常の種類が異なること、また、発生・形態異常が見られた不良卵を異なる雄由来の精子と受精させても同様の異常が生じることを見いだし、発生・形態異常が出現する不良卵では、胚発生や形態形成に重要な母性遺伝子が有効に機能していないことを示唆した。このような研究背景をもとで鋭意検討した結果、正常卵と不良卵を用いた遺伝子のサブトラクション解析によって、良質卵関連遺伝子群の網羅的な単離ができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は産業上有用な下記第１から第１３の発明を包含するものである。
【００１２】
第１には、良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法によって、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ
Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ： ＮＥＡＴ）を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１３】
第２には、良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法が、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析によるものである、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１４】
第３には、正常卵由来の遺伝子ライブラリーと不良卵由来の遺伝子を用いたサブトラクション法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供し、第４には、ＰＣＲを用いるディファレンシャル・ディスプレイ法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供する。
【００１５】
第５には、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法が採用される第１または第２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法を提供し、第６には、第１から第５のいずれかに記載の方法によりクローニングされる魚類の良質卵関連遺伝子群も提供する。
【００１６】
第７には、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質であって、第１から第５のいずれかに記載の方法によりクローニングされるクローンから産生される組換えタンパク質または未受精卵から精製されたタンパク質である、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質を提供し、第８には、第６に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群をプローブとすることを特徴とするマイクロアレイを提供する。
【００１７】
また、第９には、第７に記載のタンパク質に対する抗体を提供し、第１０には、第８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、被検卵における良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法を提供する。
【００１８】
第１１には、第９に記載の抗体を用いて、良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法を提供し、第１２には、第８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法を提供する。
さらに、第１３には、第９に記載の抗体を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
上記のように、本発明に係わる良質卵関連遺伝子群の網羅的単離によって、増養殖対象魚種の被検卵におけるそれら遺伝子群の遺伝子レベルまたはタンパク質の発現レベルが、正常卵のそれの範囲内に含まれるのか否かについて、正確かつ簡便に診断することができる。このため、本発明に係わる診断方法を用いることで、被検卵が健康な稚仔魚に育つ卵であるかどうかを未受精卵の段階で診断できるという効果を奏する。さらに、母性遺伝子群の卵への蓄積は卵黄形成の初期から始まることから、非常に早い段階で親魚が生産する卵の質についても評価できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、魚類の良質卵関連遺伝子の網羅的な単離方法およびそれを利用した卵質の診断方法を提供するものである。そこで、本発明に係わる良質卵関連遺伝子群の単離方法および、その方法によって単離された遺伝子を利用する卵質の診断方法について説明する。
【００２１】
＜良質卵関連遺伝子の網羅的の単離方法＞
本発明に係わる良質卵関連遺伝子の単離方法は、魚類の発生や形態形成に関与する母性遺伝子を、正常卵と不良卵とのサブトラクション解析によって単離・同定する方法である。従って、少なくとも単離方法を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は下記に限定されるものではない。
なお、本実施の形態では主にニホンウナギ由来の良質卵関連遺伝子群をあげて説明しているが、本発明の対象とする魚種はニホンウナギに限られるものではない。例えば、マダイ等のスズキ目、ヒラメ等のカレイ目、マイワシ等のニシン目、トラフグ等のフグ目、サケ科魚類等が挙げられる。具体的にはトラフグ、ブリ、カンパチ、チョウザメ、マイワシ、サケ科魚類等が挙げられる。
【００２２】
ここで、本発明の「良質卵」とは、正常な胚発生または形態形成を示す正常卵のことをいう。また、本発明の「不良卵」とは、異常な胚発生または形態形成において異常を示す卵のことをいう。
本発明の「良質卵関連遺伝子」とは、魚類の卵質に関与する遺伝子群のうち、正常な胚
発生や形態形成に係わる母性遺伝子群のことをいい、正常卵には存在するが不良卵には存在しない遺伝子群、正常卵および不良卵のいずれにも存在するが、正常卵にのみ発現する遺伝子群や、正常卵にのみ発現量が多い遺伝子群等をさす。
【００２３】
本発明に係わる良質卵関連遺伝子群は、対象とする魚類の稚仔魚で発生・形態異常がみられなかった未受精卵から得られるＤＮＡ、ＲＮＡのことをいい、ｍＲＮＡ自体や、それに逆転写酵素等を用いてｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡであってもよい。また、魚類のゲノムＤＮＡ中に含まれる形態、例えばイントロン等の非コード配列を含むＤＮＡ等であってもよい。さらに、遺伝子配列情報をもとに、該配列を持つポリヌクレオチドをＤＮＡ合成機等によって化学合成したものや、合成ポリヌクレオチド受託サービスを利用して取得したものであってもよい。
【００２４】
本発明に係わる良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法としては、従来公知の方法を利用することが可能である。例えば、正常卵ｃＤＮＡライブラリーとビオチン化標識した不良卵由来のｍＲＮＡを用いたサブトラクション法によって魚類の発生や形態形成に係わる母性遺伝子を網羅的にクローニングすることで、良質卵関連遺伝子群を単離する方法を用いることができる。正常卵由来の遺伝子ライブラリーに用いる遺伝子や、サブトラクション法に用いる不良卵由来の遺伝子としては、ｍＲＮＡ以外にＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも用いることができる。なお、遺伝子ライブラリーの構築に用い得る公知の方法としては、いずれの方法も用いることができるが、例えば、正常卵から調整したｍＲＮＡから逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを用いたリンカープライマー法等に従って構築することができる。
【００２５】
本発明のサブトラクション法には、公知のいずれの方法も用いることができるが、発現量の差のある遺伝子を網羅的に単離するという点において、わずかな発現量の差のある分子でも単離できる高効率なサブトラクション法を用いることが好ましい。
この高効率なサブトラクション法として、例えば近年、Ｋｏｂｏｒｉらによって開発された、ある状態Ａの細胞から調整したｃＤＮＡライブラリーと、それとは異なる状態Ｂの細胞由来のｍＲＮＡを用いることで、両者に共通の不必要な遺伝子を効率的に除外し、わずかな発現量の差のある分子でも単離できるという「高効率ｃＤＮＡサブトラクション法」（参考文献１、参照）等を用いることが好ましい。
［参考文献１］ Ｋｏｂｏｒｉ Ｍ．， Ｉｋｅｄａ Ｙ．， Ｎａｒａ Ｈ．， Ｋａｔｏ Ｍ．， Ｋｕｍｅｇａｗａ Ｍ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ．， Ｋａｗａｓｈｉｍａ
Ｈ． Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， ３：４５９−４７５， １９９８
【００２６】
また、上記の単離方法に特に限定されるものではなく、ディファレンシャル・ディスプレイ法やディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法等による正常卵と不良卵とのサブトラクション解析方法であればよい。例えば、ディファレンシャル・ディスプレイ法のように、サンプルから抽出した全ＲＮＡやｍＲＮＡ等に対し、各種プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、正常卵と比較して不良卵で、その発現が顕著に異なる遺伝子のＤＮＡ増幅断片を取得する方法によっても良質卵関連遺伝子群の単離が可能である。
【００２７】
本発明では例えば、ニホンウナギ由来の上記良質卵関連遺伝子群を用いて、他の増養殖対象魚種からニホンウナギ良質卵関連遺伝子群と相同性を有する遺伝子をクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来の公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００２８】
ゲノムＤＮＡの少なくとも一部がデータベース化している魚種では、上記ニホンウナギ良質卵関連遺伝子群の塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベースより検索することができる。例えば、汎用されている相同性アルゴリズムであ
るＢＬＡＳＴによる塩基配列の相同性検索を好適に用いることができる。
【００２９】
ゲノムＤＮＡがデータベース化されていない魚種の場合には、本発明で得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群のｃＤＮＡを用いて、それぞれの魚種で作製された適当なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる魚種由来の相同遺伝子を単離することができる。また、本発明で単離された遺伝子の塩基配列の情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー等から遺伝子を単離することができる。
【００３０】
本発明では、上記良質卵関連遺伝子にコードされるタンパク質またはそのペプチドに対する抗体を用いて他の魚種から相同性を有する遺伝子をクローニングすることもできる。
【００３１】
本発明に係わるタンパク質またはそのペプチドは、上記良質卵関連遺伝子に全部または一部をコードされるタンパク質またはペプチドであればよい。また、上記アミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ魚類の正常発生に係わるタンパク質も含むことができる。
【００３２】
さらに、上記良質卵関連遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内に発現させた状態のものも含み、上記良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質として、未受精卵または生殖腺等の天然資源から単離・精製された状態のものも含む。また、他のタンパク質やポリペプチドとつながった融合タンパク質や化学合成なされたタンパク質であってもよい。
【００３３】
なお、これらのタンパク質は、良質卵関連遺伝子の網羅的なスクリーニング法と同様に、良質卵関連遺伝子にコードされるタンパク質の網羅的なスクリーニング法に用いることができる。例えば、２次元電気泳動等の生化学的な手法によって、良性卵由来のタンパク質と不良卵由来のタンパク質とにおける差のあるタンパク質を明らかにして、それらを単離・精製すること等が挙げられる。
【００３４】
得られた組み換え体タンパク質や精製タンパク質を用いれば、これらを認識する抗体を調整することが可能となる。本発明の良質卵関連遺伝子がコードされるタンパク質に対する抗体は、周知の方法で作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、合成または精製した本発明のタンパク質もしくはその一部のペプチドをウサギやラット等の動物に免疫し、一定期間後に血液を採取することで調整することが可能となる。他方、モノクローナル抗体は、上記タンパク質もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫細胞とを融合させ、目的の抗体を産生するハイブリドーマを単離し、該細胞から抗体を調整することが可能である。
【００３５】
＜良質卵関連遺伝子群を用いた診断方法＞
本発明に係わる診断方法は、魚類未受精卵における発生や形態形成に係わる母性遺伝子群が、正常範囲内になるか否かを、遺伝子レベルやタンパク質レベルで質的または量的に診断する方法であって、診断にあたり、少なくとも遺伝子レベルやタンパク質レベルを測定できる過程や工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件等は以下の記載に限定されるものではない。
【００３６】
本診断方法において、良性卵関連遺伝子群の遺伝子レベルを定性または定量を行う場合、増養殖対象魚から未受精卵を採取した後、該試料から核酸を抽出する操作を行う。この試料から核酸を抽出する方法としては、例えばグアニジン・塩化セシウム超遠心法、フェノール・クロロホルム法、など任意の抽出方法を使用することができる。また、オリゴ（
ｄＴ）カラムを用いて、全ＲＮＡからｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ選択することでｍＲＮＡを調整してもよい。得られた核酸の量が微量な場合は、必要に応じてＰＣＲ反応によって核酸を増幅する操作を行ってもよい。
【００３７】
上記単離方法によって得られた試料を用いて、良質卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量を行うことができる。これには例えば、マイクロアレイ法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、およびそれらの組み合わせを含む当業者であれば容易かつ確実な方法を使用することができる。
【００３８】
本発明の実施例で示すように、例えば、マイクロアレイ法を用いる定性的または定量的な解析によって、良質卵関連遺伝子群の診断が可能である。ここで、「定性的」というのは、遺伝子の発現の有無をさし、「定量的」というのは、遺伝子の発現量のことをさす。
マイクロアレイ法を用いる場合には、まず、サブトラクション解析によって得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群をスポットしたマイクロアレイガラスを作製する。次に、正常な発生を示す未受精卵（良質卵）および発生・形態異常がみられた未受精卵（不良卵）から抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等を用いて、Ｃｙ３またはＣｙ５等の検出可能な標識物質でラベルを行う。マイクロアレイガラスと標識したプローブのハイブリダイゼーションによって、良性卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量ができる（参考文献２、参照）。
［参考文献２］ ＤＮＡ マイクロアレイ実験マニュアル、林崎良英 監修、２００１ （羊土社）；ＤＮＡチップ実験まるわかり、佐々木博己、青柳一彦 編、２００４ （羊土社）；ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ− Ｅｄ． Ｍａｒｋ Ｓｃｈｅｎｅ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９９
【００３９】
具体的には、マイクロアレイに固定した良質卵関連遺伝子群の塩基配列を有するプローブと、蛍光物質や放射線物質などで標識した被検卵に含まれるターゲットとなる遺伝子とを、マイクロアレイ上でハイブリダイズさせることで、ハイブリダイズしたターゲット遺伝子が、各スポットからの蛍光シグナルや放射線シグナルなどとして検出される。この検出したシグナル強度をコンピューターで定性的または定量的に解析することにより、被検卵における良質卵関連遺伝子群の遺伝子発現や含量プロファイルを測定することができる。
【００４０】
また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ等を用いたインタカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法、サイクリングプローブ法等の従来公知の方法を用いることができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法に用いるプライマーは、対象となる遺伝子を特異的検出できるものであれば特に制限されるものではないが、２０〜３０塩基からなり、エクソンーイントロンをまたぐ形で設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、良質卵関連遺伝子群の塩基配列情報によって決定し、それら配列を有するプライマーの作製はＤＮＡ合成機によって可能である。
【００４１】
さらに、ノーザンブロット法を用いることができる。まず、本発明で単離された良質卵関連遺伝子群を放射性同位体、蛍光物質、ビオチン等の検出可能な標識物質でラベルする。次に、未受精卵から抽出した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む試料をアガロース電気泳動で分離した後、ナイロン膜やニトロセルロース膜等の支持体へ転写する。試料を転写した支持体と標識したプローブとのハイブリダイゼーションを行うことで、良性卵関連遺伝子群の定性検査や発現量の定量が解析できる。
【００４２】
これらの良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法を用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改
善法をスクリーニングすることができる。
ここで、「遺伝子の動態をモニタリングする」とは、ある人為催熟を施した時の良質卵関連遺伝子群の蓄積量や蓄積されている分子種を明らかにすることをいう。正常な胚発生や形態形成に係わる母性遺伝子は、卵形成の過程で卵内に蓄積される。天然の親魚では、これら母性遺伝子群の蓄積が正常に進行するため、得られた卵は正常な胚発生や形態形成を示すものと考えられる。他方、ホルモン投与等の人為催熟を行った親魚は、天然と比較して母性遺伝子群の蓄積に量的な偏り等が生じるため、結果としてなんらかの形態異常が発症しているものと思われる。これらを比較することで、ある人為催熟を施した時の良質卵関連遺伝子群の蓄積量や蓄積されている分子種を明らかにすることができる。このように、「遺伝子の動態をモニタリングする」ことは、実施した催熟技術の有効性を科学的に明らかにする上で重要である。
【００４３】
また、「良質卵を合理的に生産するための卵質改善法」とは、上記の「遺伝子の動態をモニタリングする」ことによって明らかになった実施した催熟技術の有効性を利用して、例えば蓄積がうまくいかなかった分子種について、人為催熟時の種々のパラメーター（例えばホルモンの投与量、投与期間、投与時期等）を変化させることで、これら分子種を正常なレベルにもっていき、結果的によりより良質卵の生産を可能する方法のことをいう。
【００４４】
良性卵関連遺伝子がコードするタンパク質の定量を行う場合には、増養殖対象魚から未受精卵を採取した後、該試料からタンパク質を抽出する操作を行う必要がある。この操作にあたり、例えば、ホモジナイザーによる抽出法など任意の抽出方法を使用することができる。
【００４５】
抽出操作を行った試料を用いて、上記良質卵関連遺伝子群がコードするタンパク質の発現量の定量を行うことができる。例えば、これら遺伝子がコードするタンパク質に対する特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いた固層酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法、およびそれらの組み合わせを含む本分野で周知の任意の方法を使用することができる。
【００４６】
具体的には、抗体を用いた測定系によって、被検卵における良質卵関連遺伝子から合成されたタンパク質量を定量し、その値が正常卵の範囲内に含まれるのか否かについて、正確かつ簡便に判断するという定量的な解析によって、被検卵が正常な発生や形態形成をするか否かをタンパク質レベルで明らかにすることができる。ここで、「定量的」というのは合成されたタンパク質量を調べることをさす。
【００４７】
例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いて良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルの診断が可能である。まず、良質卵関連遺伝子群をコードするタンパク質に対するポリクローナル抗体を吸着させたＥＬＩＳＡ用プレートを作製する。次に、被検卵をホモジナイズした後、遠心分離によって上清を回収し、タンパク質を含む試料を作製する。この試料を作製したＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、１次抗体および２次抗体（酵素標識された抗免疫グロブリン）と反応させる。反応後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、酵素に対する基質を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーによってタンパク質量を定量する。このようにして、被検卵内における良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルが測定することができる。なお、２次抗体の標識として用いられる酵素としては、例えばアルカリホスファターゼをあげることができるが、これに限定されるものではない。
【００４８】
さらに、ウエスタンブロット法による解析も可能である。すなわち、被検卵から調整した試料をアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離した後、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜などに転写し、放射性物質や蛍光物質等の検出可能な標識物質でラベルされた抗体を
用いて良質卵関連遺伝子群のタンパク質レベルでの発現量の定量が可能となる。
【００４９】
これらの良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングすることができる。
ここで、「タンパク質の動態をモニタリングする」とは、ある人為催熟を施した時の母性遺伝子由来のタンパク質の合成を明らかにすることをいう。卵形成の過程で卵内に蓄積された良質卵関連遺伝子群は、発生の過程でタンパク質に翻訳されて、正常な胚発生や形態形成に関与すると考えられる。天然の親魚では、これら母性遺伝子由来のタンパク質の合成が正常に進行するため、得られた卵は正常な胚発生や形態形成を示すものと考えられる。他方、ホルモン投与等の人為催熟を行った親魚は、天然と比較して母性遺伝子由来のタンパク質の合成が不完全であり、その結果としてなんらかの発生・形態異常を発症しているものと思われる。これらを比較することで、ある人為催熟を施した時の母性遺伝子由来のタンパク質の合成を明らかにすることができる。このように、「タンパク質の動態をモニタリングする」ことは、実施した催熟技術の有効性を科学的に明らかにする上で重要である。
【００５０】
また、「良質卵を合理的に生産するための卵質改善法」とは、上記の「タンパク質の動態をモニタリングする」ことによって明らかになった実施した催熟技術の有効性を利用して、例えば蓄積がうまくいかなかった分子種について、人為催熟時の種々のパラメーター（例えばホルモンの投与量、投与期間、投与時期等）を変化させることで、これら分子種を正常なレベルにもっていき、結果的によりより良質卵の生産を可能する方法のことをいう。
【００５１】
この出願の発明におけるその他の定義等については、以下の発明の実施形態において詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出展を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物的技術は、参考文献３、４等に記載されている。
［参考文献３］ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２nd ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， １９８９
［参考文献４］ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ．， Ｂｒｅｎｔ Ｒ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ．， Ｍｏｏｒｅ ＤＤ．， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ．， Ｓｍｉｔｈ ＪＡ．， Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５
【実施例１】
【００５２】
＜遺伝子の単離方法＞
１−１：サンプル
愛知県水産試験場より譲渡された実験用のニホンウナギを用いて、下記の方法（参考文献５、参照）によって人為催熟を行った。
［参考文献５］ Ｏｈｔａ Ｈ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｏｋｕｚａｗａ Ｋ．， Ｉｉｎｕｍａ Ｎ．， Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ．， Ｆｉｓｈ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：１６３−１６９， １９９７
【００５３】
人為催熟方法：
ニホンウナギは海水に一定期間馴致後、雌魚にはサケ脳下垂体抽出物（２０ｍｇ／尾）を毎週１回注射により投与し、卵黄形成を誘導した。これらのウナギの卵径を指標にして卵の成長をモニタリングし、卵径８００μｍ以上の卵を有する個体に排卵誘発ステロイドホルモン（１７α，２０β−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３−オン：ＤＨＰ）を体重１ｋｇ当たり２ｍｇ投与することで排卵卵を得た。他方、雄にはヒト胎盤性ゴナドトロピンを毎週１回（１０００ ＩＵ／ｋｇ）、５回投与することで精子を得た。得られた卵と精子は速やかに受精させ、受精卵は２２℃の水槽で飼育を行った。
【００５４】
人為催熟によって得られた卵は速やかに受精させ、一部をマイクロプレート法（参考文献６、参照）によって解析した。
残りはサブトラクション、ｃＤＮＡライブラリー作製等に用いた。マイクロプレート法およびその解析としては４８穴プレートに、孵化斃死防止剤としてポリエチレングリコール６０００を加えた濾過海水を１ｍｌずつ入れ、それぞれにニホンウナギ受精卵を１個ずつ収容し、摂餌開始期まで換水を行わずに２２℃で個別飼育をして、その後の孵化率・生残率および接餌開始期（受精後１０日目）における形態異常率を実体顕微鏡下で観察した。飼育終了後は、仔魚をホルマリン固定し、顕微鏡下で形態異常の分類（前頭部欠落、上顎の形成不全等）を行い、各ロットにおける各種形態異常の割合を数値化した。
［参考文献６］ Ｕｎｕｍａ Ｔ．， Ｋｏｎｄｏ Ｓ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｋａｇａｗａ Ｈ．， Ｎｏｍｕｒａ Ｋ．， Ｏｈｔａ Ｈ， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ， ２４１：３４５−３５６， ２００４
【００５５】
１−２：ＲＮＡの調整
接餌開始期において、正常な発生を示したロット（図１Ａ）および形態異常（例えば、上顎形成不全）がみられたロット（図１Ｂ）の未受精卵から、下記の方法（参考文献７、参照）に記載の方法によって全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。
［参考文献７］ Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ Ｐ， Ｓａｃｃｈｉ Ｎ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６２：１５６−１５９，１９８７
【００５６】
ＲＮＡの調製方法：
チオシアン酸グアニジンを含む水溶液中でニホンウナギ未受精卵を破砕し、卵内に含まれるＲＮａｓｅを失活させた。次に、抽出物をフェノール・クロロホルム抽出し、得られた上清をエタノール沈殿することで、全ＲＮＡを精製した。
さらに、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で全ＲＮＡからｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ選択操作を２回繰り返すことで得た試料をｍＲＮＡとし、正常卵ｃＤＮＡおよびサブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いた。
【００５７】
１−３：正常卵ｃＤＮＡライブラリーの作製
正常卵から得られたｍＲＮＡから、Ｒｏｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｔａｋａｒａ社）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行った。次に、下記のｐＡＰ３ｎｅｏベクターを用いたリンカープライマー法（参考文献８、参照）に従い、１．０ｘ１０6ｐｆｕの独立したクロー
ンを含み、挿入ｃＤＮＡの平均鎖長が１．２ｋｂのニホンウナギ正常卵ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
［参考文献８］ Ｆｕｊｉｉ Ｔ．， Ｔａｍｕｒａ Ｋ．， Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＮＧ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ ＤＪ．， Ｊｅｎｋｉｎｓ ＮＡ．， Ｙｏｍｏｇｉｄａ Ｋ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ Ｙ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ．， Ａｂｉｋｏ Ｙ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ５７：９４−１０１，１９９９
【００５８】
リンカープライマー法：
オリゴ（ｄＴ）と制限酵素部位を含むプライマー（リンカープライマー）を用いて、ｍＲＮＡから逆転写酵素によって１本鎖ＤＮＡの合成を行った。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩならびにＲＮａｓｅＨによって２本鎖ＤＮＡを合成し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる５’末端の平滑化、および制限酵素突出端を含むアダプターを付加した。アダプターを付加した２本鎖ＤＮＡは適当な制限酵素で切断し、スピンカラムによってｃＤＮＡのサイズ分画した後、ベクターに連結し、大腸菌に形質転換させて、正常卵由来の遺伝子ライブラリーを構築した。
【００５９】
１−４：サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製
図２（※Ｋｏｂｏｒｉらが方法を示した図に加筆・修正を行ったもの）に概要を示した作製手順によって、良質卵関連遺伝子群を単離するためのサブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
まず、形態異常がみられた未受精卵（不良卵）から調整したｍＲＮＡ（１０μｇ）を、水銀ランプ下でＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と反応させビオチン化ｍＲＮＡを作製した。別途、正常卵由来のｍＲＮＡより構築したｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させ、正常卵一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。一本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、下記に記載の方法に基づいて、ビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【００６０】
ハイブリダイズ方法：
ビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡ（６μｇ）を、正常卵一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）およびポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むハイブリダイゼーション液（最終濃度：４０％脱イオンホルムアミド、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ）で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）−フェノール・クロロホルム処理によって、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を回収した。次に、回収したｓｓＤＮＡとビオチン化した不良卵由来のｍＲＮＡ（４μｇ）を用いて、上記と同じ条件で再度ハイブリダイゼーションを行った。
【００６１】
ハイブリダイズ後にストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）処理を行うことで、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしたクローンを除外した。
他方、不良卵由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしなかったクローンは、ＢｃａＢＥＳＴ
Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）によって二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法を用いてコンピテント大腸菌（ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１２Ｓ： Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換した。得られたライブラリーは第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとし、ランダムに選抜した１１５２クローンの５’側塩基をＭｅｇａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で決定した。
得られた配列の重複について調べると、結果として合計で７０４の独立したクローンが得られた。これらクローンをＮＣＢＩデータベースのｔＢＬＡＳＴｘによりホモロジー検索した結果、６０％が発生・分化、遺伝子の転写、情報伝達系、イオン輸送等に関わる既知の遺伝子と高い相同性を示すものであり、約４０％は機能不明または全く未知の遺伝子であることが判明した（図３）。
【００６２】
１−５：段階的サブトラクション
第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定後、３５０クローンのプラスミドＤＮＡを各々０．１μｇ集めて１本チューブにまとめた後、Ｎｏｔ Ｉ処理によって直鎖状ＤＮＡを調整した。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって直鎖状ＤＮＡ
（５μｇ）からｃＲＮＡの合成し、ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてビオチン化を行った。
【００６３】
別途、第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させ、第１次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。第１次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）とビオチン化ｃＲＮＡ（１０μｇ）は、ポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および配列表配列番号１に記載のマスキングオリゴヌクレオチド（１２０ｐｍｏｌ、参考文献９、参照）を含むハイブリダイゼーション液で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせ、反応後はストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）処理−フェノール・クロロホルム処理によって、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしたｓｓＤＮＡクローンを除外した。
［参考文献９］ Ｆｕｊｉｉ Ｔ．， Ｔａｍｕｒａ Ｋ．， Ｍａｓａｉ Ｋ．， Ｔａｎａｋａ Ｈ．， ＮＩｓｈｉｍｕｎｅ Ｙ．， Ｎｏｊｉｍａ Ｈ． ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ３： ３６７−３７２， ２００２
【００６４】
他方、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかった第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリー由来のｓｓＤＮＡクローンは、ＢｃａＢＥＳＴ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）によって二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法でコンピテント大腸菌に形質転換した。得られたライブラリーは第２次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとし、ランダムに選抜した１１５２クローンの５’側塩基をＭｅｇａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で決定した。得られた配列の重複について調べると、結果として合計で２０５の独立したクローンが得られた。
【００６５】
第３次サブトラクション用ライブラリーの調整は、上記、サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーの作製で得られたクローンのうち第２次サブトラクション用ライブラリーの調整に使用しなかった残り３５４クローンを用いて行った。まず、３５４クローンのプラスミドＤＮＡを各々０．１μｇ集めて１本チューブにまとめた後、Ｎｏｔ Ｉ処理を行った。次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって直鎖状ＤＮＡ（５μｇ）よりｃＲＮＡを合成し、ＰＨＯＴＯＰＲＯＢＥ Ｂｉｏｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いてビオチン化を行った。別途、第２次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーにヘルパーファージ（Ｒ４０８：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を感染させることで第２次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを調整した。第２次サブトラクション用一本鎖ｃＤＮＡライブラリー（０．１μｇ）とビオチン化ｃＲＮＡ（１０μｇ）は、ポリ（Ａ）（２μｇ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および配列表配列番号１のマスキングオリゴヌクレオチド（１２０ｐｍｏｌ）含む溶液内で４２℃、４８時間ハイブリダイズさせた。
【００６６】
反応後、ストレプトアビジン（Ｔａｋａｒａ社）−フェノール・クロロホルム処理を行うことで、合成ｃＲＮＡとハイブリダイズしたｓｓＤＮＡクローンを除外した。他方、ビオチン化ｃＲＮＡとハイブリダイズしなかったクローンは、二本鎖ＤＮＡに転換した後、エレクトロポーション法を用いてコンピテント大腸菌に形質転換した。
得られたライブラリーは第３次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーとして、ランダムに選抜した１５００クローンの５’側塩基を決定した。その結果、１０３種類の独立したクローンを同定でき、最終的に段階的サブトラクションで正常卵ｃＤＮＡライブラリーより、１１６０種類のニホンウナギ良質卵関連遺伝子（ｅｅｌ Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ｅＮＥＡＴ）が単離できた。単離された１１６０種類の遺伝子については、塩基配列を配列表配列番号２〜１１６１に示し、遺伝子配列から類推したアミノ酸配列に対するホモロジー検索や、遺伝子配列に対するホ
モロジー検索の結果を表１に示した。ホモロジー検索はＢＬＡＳＴ解析を用いて行い、Ｅ−ｖａｌｕｅが９．９〜１．００Ｅ−１５０のものをＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎに示した。
【００６７】
【表１】
※遺伝子配列に対するホモロジー検索の結果を示したものは、Ｐｒｏｇｒａｍでｂｌａｓｔｎと記載した。
【００６８】
なお、上記ニホンウナギの良性卵関連遺伝子群には発生・分化、遺伝子の転写、情報伝達系、イオン輸送等に関わる既知の遺伝子と高い相同性を示すものが４０％含まれる一方で、約６０％は機能不明または全く未知の遺伝子、またこれまでニホンウナギで同定された既知の遺伝子が約０．５％（６クローン）含まれていた（図４）。この頻度は、段階的サブトラクションを実施することにより、正常卵と不良卵で共通の不必要なｃＤＮＡクローンの単離を回避できたことを示すものであった。
【実施例２】
【００６９】
＜診断方法＞
２−１：マイクロアレイ作製
サブトラクション解析によって得られたニホンウナギ良質卵関連遺伝子群を有しているマイクロアレイガラスを開発した。まず、良質卵関連遺伝子群が挿入されたプラスミドベクター（ｐＡＰ３ｎｅｏ：Ｔａｋａｒａ社）を鋳型にして、ｅｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社）を用いたＰＣＲ反応によって表１の遺伝子を目的の遺伝子としてそれぞれ増幅した。
増幅された各ＤＮＡ断片は、ＭｏｎｔａｇｅＰＣＲ９６ Ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製した後、最終ＤＮＡ濃度が１００ｎＭになるように調整した。調整した各ＤＮＡは、アレイ作製装置（カケンジェネックス製）を用いて、ＫＧスライドグラス上にスポットした。スポットした各ＤＮＡは８０℃で１時間ベーキングした後、２ＸＳＳＣ−０．２％ＳＤＳおよび超純水による洗浄を行い、ニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイを作製した。
【００７０】
本実施例で作製したニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイは、正常卵と不良卵のサブトラクション解析によって得られた母性遺伝子群を全てディプリケートでスポットしておりその総数は１１６０種類、２３２４個である。別途、調整したニホンウナギβアクチンおよびλｃｏｎｔｒｏｌ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ （Ｔａｋａｒａ社）をそれぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして、同一マイクロアレイガラス上にスポットした。
【００７１】
２−２：サンプル
孵化後１０日目に奇形率が低い未受精卵（正常卵：Ｋ１９）および全て奇形であった未受精卵（不良卵：Ｋ８８）をそれぞれ用いて、これらから、上記実施例１に記載した方法によって全ＲＮＡをそれぞれ抽出し、オリゴ（ｄＴ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、それぞれからｍＲＮＡを調整した。ウナギでは孵化後１０日目における奇形率は極めて高いため、正常率が３３％を示す卵は卵の質としてはかなり良好と考えられた。これを鋳型として、図５に示すようにＣｙ３またはＣｙ５で標識したｃＤＮＡの調整を行い、マイクロアレイ解析を行った。
【００７２】
【表２】
【００７３】
２−３：解析
合成したＣｙ３標識ｃＤＮＡ（正常卵由来）とＣｙ５標識ｃＤＮＡ（不良卵由来）は混和後、ニホンウナギ良質卵関連遺伝子マイクロアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、ＰｅｒｆｅｃｔＨｈｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて６８℃、１８時間行い、反応後は洗浄と乾燥を行い、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度をスキャナー（富士写真フイルム社）で読み取り、不良卵における良質卵関連遺伝子群を質的および量的に解析した。
その結果、正常卵と比較して不良卵において蓄積量が半分以下の遺伝子が１７種類あることが示された（表２）。これらは配列番号９９６、１６１、１０７１、４８１、３００、１１０８、２０７、５２５、５８５、１０３１、６０４、５７５、６４５、４７７、７４１、１８６および３４２に示す遺伝子であり、そのほとんどが既知の遺伝子と相同性を示さず、全く新規の機能不明な遺伝子であった。
この結果により、本発明において遺伝子マーカーを用いることで卵の良し悪しを判断できることが初めて示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の方法によって、新たな卵質評価マーカーとなりうる良質卵関連遺伝子群が単離できる。これによって、増養殖対象魚の被検卵における良質卵関連遺伝子群が正常卵のそれの範囲内に含まれるのか否かが正確かつ簡便に判定することができる。従って、学術的な利用価値だけでなく、卵質診断技術、人為催熟時の卵質改善技術など、広範な用途に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】サンプルとして用いたニホンウナギの形態異常個体を示した図である。Ａ：正常個体、Ｂ：形態異常個体（上顎の形成不全）を示した（実施例１）。
【図２】ニホンウナギの良質卵関連遺伝子の網羅的の単離方法の概略を示した図である（実施例１）。
【図３】第１次サブトラクション用ｃＤＮＡライブラリーから単離し、塩基配列決定した７０４クローンのホモロジー検索の結果を示す図である（実施例１）。
【図４】段階的サブトラクションで正常卵ｃＤＮＡライブラリーより最終的に単離された１１６０種類の良質卵関連遺伝子のホモロジー検索の結果を示す図である（実施例１）。
【図５】マイクロアレイ解析の概要を示した図である（実施例２）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法によって、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＮＥＡＴ）を網羅的にクローニングする方法。
【請求項２】
良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法が、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析によるものである、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項３】
正常卵由来の遺伝子ライブラリーと不良卵由来の遺伝子を用いたサブトラクション法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項４】
ＰＣＲを用いるディファレンシャル・ディスプレイ法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項５】
ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法によりクローニングされる魚類の良質卵関連遺伝子群。
【請求項７】
魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりクローニングされるクローンから産生される組換えタンパク質または未受精卵から精製されたタンパク質である、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群をプローブとすることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、被検卵における良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の抗体を用いて、良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法。
【請求項１２】
請求項８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の抗体を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法。
【請求項１】
良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法によって、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群（Ｎｏｒｍａｌ Ｅｇｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ＮＥＡＴ）を網羅的にクローニングする方法。
【請求項２】
良質卵に存在する母性遺伝子を網羅的にクローニングする方法が、正常卵と不良卵から調整した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡ、またはそれらから逆転写酵素等によって得られた全ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いた差分化（サブトラクション）解析によるものである、正常な胚発生または形態形成を示す卵に存在する魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項３】
正常卵由来の遺伝子ライブラリーと不良卵由来の遺伝子を用いたサブトラクション法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項４】
ＰＣＲを用いるディファレンシャル・ディスプレイ法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項５】
ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法が採用される請求項１または２に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群を網羅的にクローニングする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法によりクローニングされる魚類の良質卵関連遺伝子群。
【請求項７】
魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質であって、請求項１から５のいずれかに記載の方法によりクローニングされるクローンから産生される組換えタンパク質または未受精卵から精製されたタンパク質である、魚類の良質卵関連遺伝子によってコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載の魚類の良質卵関連遺伝子群をプローブとすることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項７に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、被検卵における良質卵関連遺伝子群を定性的または定量的に解析する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の抗体を用いて、良質卵関連遺伝子群のタンパク質の発現レベルを定量的に解析する方法。
【請求項１２】
請求項８に記載のマイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザンブロット法のいずれかを用いて、人為催熟の過程における遺伝子の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の抗体を用いて、人為催熟の過程におけるタンパク質の動態をモニタリングし、良質卵を合理的に生産するための卵質改善法をスクリーニングする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１７８４０２（Ｐ２００８−１７８４０２Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３４８６０（Ｐ２００７−３３４８６０）
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２６日（２００７．１２．２６）
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
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