治療的処置のための粘液腫ウイルスとラパマイシンの組み合わせの使用
本発明は、ラパマイシンとの併用など、粘液腫ウイルスを組み合わせて治療上使用することに関係する。ラパマイシンによる処理は、インターフェロンに応答しない細胞など、先天的な抗ウイルス応答が欠損した細胞に粘液腫ウイルスが選択的に感染する能力を増進させる。ラパマイシンと粘液腫ウイルスの組み合わせを利用して、前記細胞が存在することを特徴とする、癌などの病気を治療することができる。また、本発明は、機能的Ｍ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを治療上使用することにも関係する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６５８，８１６号（２００５年３月７日出願）の優先権を主張し、その内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、粘液腫ウイルスとラパマイシンの治療的利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
さまざまな種類の癌を治療するために使用される現在の治療法は、癌細胞を毒殺または死滅させることによって効果を発揮するというものになりがちである。残念なことに、癌細胞に対して毒性のある治療法は、健常な細胞にも有毒になりがちである。さらに、腫瘍の異質性が、依然として有効な癌治療が得られないことの主な理由の一つとなっている。化学療法や放射線療法など、現在主流の治療法は、狭い治療毒性濃度域内で使用されがちである。多様な種類の腫瘍細胞があり、これらの治療法を行うことができる濃度域が限られているため、この種の療法は、切れ味の鈍い手段と見なされている。
【０００４】
現在開発中の新しい抗癌療法は、腫瘍細胞を選択的に標的とする一方で、健常な細胞に対する毒性をより低くして、健常細胞が影響を受けないままでいる可能性をより高くしようと試みている。
【０００５】
腫瘍退縮性ウイルス療法が、腫瘍細胞と正常細胞との細胞間の違いを利用することを目的とする方法の一つである。この療法は、複製能のある腫瘍選択的なウイルスベクターを抗癌剤として使用する。腫瘍退縮性ウイルスは、感染のために癌細胞を特異的に標的するか、または、正常細胞よりも癌細胞において効率的に複製するのに適している。これら複製能のある腫瘍退縮性ウイルスは、不均一な腫瘍集団を標的する非常に選択的かつ強力な手段となる天然または遺伝子操作されている。複製選択的な腫瘍退縮性ウイルスは、正常な細胞では効率的に複製しないため、特に、放射線療法や化学療法のような伝統的な療法と比較して患者に対する毒性が低いはずである。
【０００６】
数多くの研究で、さまざまなウイルス株について腫瘍退縮活性が報告されているが、最も有望な腫瘍退縮性ウイルスは、天然または遺伝子改変されたアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ１」）、レオウイルス、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス（「ＶＳＶ」）、またはポリオウイルスである。抗癌剤として現在検討されている改変型腫瘍退縮性ウイルスは、ＨＳＶ、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）、レオウイルス、およびワクシニアウイルス、麻疹、ＶＳＶ、およびポリオウイルスなどである。さまざまな腫瘍退縮性ウイルスが、第一相および第二相で臨床試験されており、いくつかは持続した効能を示している。しかし、どのウイルスが、持続的複製、特異的かつ強力な退縮活性という目標をもっともよく達成するかは分かっていない。腫瘍退縮性ウイルスベクターの完全に効率的な候補は、生活環が短く、すぐに成熟したビリオンを形成し、細胞から細胞へ効率的に伝播し、すぐに挿入可能なゲノムをもつものである。その上、初期の先天的な免疫応答を阻害し、Ｔｈ１応答の発達を遅延させることが、腫瘍退縮療法の有効性にとって重要なことが、証拠によって示唆されている。腫瘍退縮性ウイルスの開発用に想定されているウイルスの多くに対して正常な集団で見られる大量の抗体およびＴ細胞反応から見て、ヒトのウイルスが非常に免疫原性であることは明らかである。
【０００７】
臨床実験によって、現在の腫瘍退縮性ウイルスは実際に安全であるが、単剤療法として臨床上十分に有効であるとするほど強力でではない。腫瘍細胞への不十分または不効率な感染が普通に見られるため、現在の動きは、候補ウイルスの効率を上げるために、それらを遺伝子操作して治療用の導入遺伝子を発現させることによりそれらを武装させようとするものである。上記した腫瘍退縮性ウイルスのほとんどは、他の一般的な腫瘍退縮療法と組み合わせてテストされている。
【０００８】
アデノウイルスは、容易に遺伝子操作することができ、よく知られた関連するウイルスタンパク質機能を持っており、また、非常に軽度の病態に関連している。ＯＮＹＸ−０１５ヒトアデノウイルス（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）は、最も広範に試験されている。臨床使用用に最適化された腫瘍退縮性ウイルスであり、ｐ５３陰性腫瘍の中で選択的に複製すると考えられて、頭頸部癌患者での臨床試験において可能性を見せている。しかし、報告によれば、ＯＮＹＸ−０１５は、治療した患者の１４％で客観的な臨床反応を示しているにすぎない（非特許文献１）。
【０００９】
特許文献１と特許文献２は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、神経細胞に特異的な変異型腫瘍退縮性ＨＳＶを記載している。さらなる利点は、ＨＳＶは簡単に遺伝子改変することができ、不要なウイルス増殖を止める薬剤が存在していることである。しかし、一般の集団はこのウイルスに曝露されて免疫反応を獲得していて、このウイルスの腫瘍退縮効果が弱まっていると考えられるため、このような普遍的ヒト病原体の使用には限界がある。また、ＨＳＶは、重大な副作用または死に至る可能性がある病気を引き起こす可能性もある。
【００１０】
ＩＩＩ型レオウイルスは、比較的軽度な病気と関連し、そのウイルス遺伝子の機能がかなり十分に理解されている。ＩＩＩ型レオウイルスは、変異型ｒａｓ発癌遺伝子を発現する細胞において増進された複製特性を示し、かつＰＫＲ −／−細胞の中で選択的に増殖する癌治療剤として、現在、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ社によって開発されているところである（非特許文献２）。しかし、レオウイルスは、遺伝子操作することが難しく、そのウイルス複製を簡単に止めることができない。
【００１１】
ＶＳＶは、比較的軽度な病気に関連しており、よく知られたウイルス遺伝子機能をもっている。ＷＯ９９／０４０２６には、さまざまな疾患に広く治療効果を表すためにＶＳＶをベクターとして遺伝子治療法に使用することが記載されている。しかし、ＶＳＶは、遺伝子操作が困難であり、また、そのウイルス複製を簡単に止めることができないという点で、レオウイルスと同じ問題を抱えている。
【００１２】
ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスは、当技術分野において記載のある別の腫瘍退縮性ウイルス候補であるが、重大であるか、または死に至る可能性がある病気と関連している。
【００１３】
特許文献３は、ヒト腫瘍細胞に対してガンマインターフェロンとＩＦＮγの断片を使用することを開示している。特許文献４は、病気の細胞がインターフェロンが介在する抗ウイルス応答に欠損をもつヒトの病気を治療する方法であって、治療上有効な量のインターフェロン感受性で複製能をもつクローンウイルスをヒトに投与することを含む方法を開示している。具体的には、ＶＳＶ粒子が腫瘍細胞に対して毒性活性を有するが、インターフェロン存在下では、正常細胞においてＶＳＶによる細胞毒性の改善が起こることを開示している。また、特許文献４は、インターフェロン処理された腫瘍細胞でＮＤＶに誘導された感受性が見られたが、正常な細胞にインターフェロンを加えると、これらの細胞はＮＤＶに対して抵抗性になることも開示している。この方法は、細胞にインターフェロン感受性のウイルスを感染させることによって、それらをインターフェロン感受性にすることを目的としている。
【特許文献１】国際公開第９６／０３９９７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／２６９０４号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４，８０６，３４７号明細書
【特許文献４】国際公開第９９／１８７９９号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，Ｋｈｕｒｉ Ｆ，Ｇａｎｌｙ Ｉ５ Ａｒｓｅｎｅａｕ Ｊ，Ｐｏｓｎｅｒ Ｍ，Ｖｏｋｅｓ Ｅ，Ｋｕｈｎ Ｊ，ＭｃＣａｒｔｙ Ｔ，Ｌａｎｄｅｒｓ Ｓ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ Ａ，Ｒｏｍｅｌ Ｌ，Ｒａｎｄｌｅｖ Ｂ，Ｋａｙｅ Ｓ，およびＫｉｒｎ Ｄ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ，２００１年１月１５日，第１９巻，第２号，ｐ．２８９−９８
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．およびＰ．Ｗ．Ｌｅｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６年，第７０巻，ｐ．６１２−６１６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、機能的なＭ１３５Ｒタンパク質を発現しない新規の粘液腫ウイルスを含む、ウサギ粘液腫ウイルスが、インターフェロンに対して非反応性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した、ヒト腫瘍細胞などの細胞に選択的に感染することができ、このような感染が、薬剤であるラパマイシンで前記細胞を処理することにより促進されるという予想外の発見に基づいている。これと関連して使用される場合、「先天的」という用語は、非抗原特異的な免疫反応を表している。粘液腫ウイルスは、正常なヒト細胞では効率的に複製できないため、インターフェロンに対して非感受性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を特徴とするさまざまな疾患および症状に対する治療法として、例えば、癌に対する腫瘍退縮治療法として、このウイルスを使用することができる。また、このウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を同定するため、また、これらの細胞をインビボで画像化するために使用することもできる。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、粘液腫ウイルスとラパマイシンを組み合わせたものの有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に粘液腫ウイルスとラパマイシンを組み合わせたものの有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、および、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造するための、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの合剤の使用をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するため、および患者におけるそのような病状を治療するための薬剤を製造するための、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの合剤の使用をさらに提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルスとラパマイシンを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために役立つことができる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルス、ラパマイシン、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための説明書を含むキットを提供する。この病状は、癌および慢性ウイルス感染症を含む。
【００２１】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、細胞集団を、粘液腫ウイルスとラパマイシンの混合物に曝露すること、ウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染させること、および細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを決定することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、ウサギ粘液腫ウイルスタンパク質Ｍ１３５Ｒが、ウサギにおける免疫応答を誘発するのに関与していること、および機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス株は、インビトロで細胞を死滅させることができるが、動物では粘液腫症を引き起こさないという予想外の発見に基づいている。このようなウイルス株は、薬剤であるラパマイシンと併用して投与される治療法など、インターフェロンに対して非感受性の細胞を含む、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理するために使用することができ、ウイルスの混入を増加させる必要がないため、安全性を向上させる結果となる。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するために、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造する際に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して使用することをさらに提供する。
【００２６】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するために、および患者におけるそのような病状を治療するための薬剤を製造する際に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して使用することをさらに提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するか、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するのに役立ちうる。この医薬組成物は、ラパマイシンをさらに含むことができる。
【００２９】
別の態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための説明書を含むキットを提供する。このキットは、さらにラパマイシンを含むことが可能である。この病状は、癌および慢性ウイルス感染症を含む。
【００３０】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、細胞集団を、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスに、任意にはラパマイシンとの混合物に曝露すること、ウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染させること、および細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを決定することを含む方法を提供する。
【００３１】
以下の発明の具体的態様の説明を、添付の図面とともに検討すれば、本発明のその他の態様および特徴が当業者に明らかとなろう。しかし、当然ながら、本発明の主旨と範囲に含まれる多様な改変および修正が、詳細な説明から当業者に明らかとなるのであるから、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好適な実施態様を示しつつも、例示のためだけに提示されていると理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（詳細な説明）
これまでに、本発明者らは、通常はウサギに感染するウイルスである野生型の粘液腫ウイルスが、その全体が参照されて本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００３４１に記載されているように、例えば、インターフェロンに非応答性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した、ヒト細胞などの細胞に選択的に感染して死滅させうることを発見した。粘液腫ウイルスは、正常なヒト細胞の中では効率的に複製しない。多くの病気または症状が、インターフェロンに対して応答性でない細胞、例えば、癌など、先天的な抗ウイルス応答を欠損している細胞が存在することを特徴としているため、正常な健常細胞に対する毒性が低い粘液腫ウイルスを使用して、癌を含むそのような病気および症状を治療することができる。また、慢性的に感染した細胞は、先天的な抗ウイルス応答を欠損しているため、粘液腫ウイルスを使用して、そのような細胞を治療することができる。例えば、多くのウイルスが、細胞の抗ウイルス性インターフェロン応答を阻害するように機能する遺伝子産物をコードするが、粘液腫ウイルスはそのような細胞に選択的に感染することができる。
【００３３】
粘液腫ウイルス（「ＭＶ」）は、ウサギの粘液腫症の病原因子である。ＭＶは、ＤＮＡウイルスの中で最大のポックスウイルス科のレポリポックスウイルス属に属している。ＭＶは、その自然宿主であるアメリカ大陸のワタオウサギ（Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｒａｂｂｉｔ）において良性の病気を引き起こす。しかし、それは、全身に見られるが、特に粘膜部周辺に見られる病変部を特徴とする、欧州大陸のウサギにおいては致命的な病気を引き起こす、病原性かつ宿主特異的なポックスウイルスである（Ｃａｍｅｒｏｎ Ｃ， Ｈｏｔａ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｂａｒｒｅｔｔ Ｊ， Ｃａｏ ＪＸ， Ｍａｃａｕｌａｙ Ｃ， Ｗｉｌｌｅｒ Ｄ， Ｅｖａｎｓ Ｄ， ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９， ２６４（２）： ２９８−３１８； Ｋｅｒｒ Ｐ ＆ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ． Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２， １５（２）： ２２９−２４６）。
【００３４】
ＭＶは、感染細胞の細胞質の中で複製する１６３ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ大型のウイルスである（Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， Ｐ． Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ， Ｅｄｓ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２ｎｄ ｅｄ．， １９９６）。ＭＶは、宿主の免疫反応および炎症反応の下方制御ならびにウイルス感染細胞のアポトーシスに関与するとされてきた、多様な細胞結合型タンパク質および細胞分泌型タンパク質をコードすることが知られている。ＭＶは全てのヒト体細胞に取り込まれることができる。しかし、細胞が先天的な抗ウイルス応答性を持っている場合、正常なウサギ体細胞以外には、ウイルスは細胞に増殖できる形で感染することができないが、このことは、ウイルスが複製して細胞死を引き起こすことができないことを意味している。
【００３５】
インターフェロン（「ＩＮＦ」）は、多様な刺激に反応して分泌されるサイトカインのファミリーである。インターフェロンは細胞表面受容体に結合して、抗ウイルス応答、ならびに増殖阻害シグナルおよび／またはアポトーシスシグナルの誘導など、細胞応答を導くシグナル伝達カスケードを活性化させる。インターフェロンはＩ型またはＩＩ型に分類される。Ｉ型インターフェロンはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−τ、およびＩＦＮ−ωなどであり、これらはすべて単量体であるが、唯一のＩＩ型ＩＦＮはＩＦＮ−γであり、二量体である。ＩＦＮ−αの１２種の異なったサブタイプは、１４の遺伝子によって産生されるが、他のＩＦＮはすべて一遺伝子性のものである（Ａｒｄｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＩＦＮは、癌遺伝子発現を調節することによって、直接的な抗腫瘍活性を発揮する。増殖促進性癌遺伝子が過剰発現されるか、または腫瘍抑制癌遺伝子の発現が消失すると、悪性の形質転換が生じることがある。癌の発生に関係する癌遺伝子には、ｐ５３、Ｒｂ、ＰＣ、ＮＦｌ、ＷＴｌ、ＤＣＣがある。
【００３６】
粘液腫ウイルス、また、レオウイルスおよびＶＳＶなど、その他の腫瘍退縮性ウイルスは、細胞の中で複製できるようになるためには、正常な健常細胞に存在する抗ウイルス防御を迂回する必要がある。ＭＶおよびその他の腫瘍退縮性ウイルスはインターフェロン産生を誘導し、かつ、ＩＦＮ経路の抗ウイルス効果に対して、通常は感受性である。ＩＦＮの抗ウイルス応答によって生じた関連タンパク質であって、主にウイルス増殖に影響を及ぼすものはＰＫＲ、ＯＡＳシンテターゼおよびリボヌクレアーゼＬヌクレアーゼなどである。ＰＫＲはｅＩＦ２αを活性化させ、その結果、翻訳の阻害とアポトーシスの誘導をもたらす。図１にＩＦＮ応答経路の概略を示す。正常な細胞においては、ＭＶは、直接ＰＫＲおよびｅＩＦ２αによる影響を受ける。
【００３７】
抗ウイルス応答経路は、しばしば癌細胞の中で破壊されている。例えば、ＩＦＮに対する応答の低下または欠損は、形質転換または腫瘍発生の過程でしばしば生じる遺伝子欠損である。腫瘍細胞株の８０％以上がインターフェロンに応答しないか、応答低下を示す（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ （２００３） ４： ２６３−２７５ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ； Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９７） ２７２（４５）：２８７７９−８５； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ． （１９９８） ９１（２）：５７０−６； Ｍａｔｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００１） ６１（５）：２２６１−６； Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ （２００４） ５（ｌ）：５１−６５）。ＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００３４１で既に開示されているように、ＭＶはヒト腫瘍細胞などの癌細胞に感染して死滅させることができ、また、これらの細胞は先天的な抗ウイルス応答を欠損しているために、ＭＶはそれらに感染することができると、特定の理論に制約されることなく考えられている。
【００３８】
初期先天性免疫応答を阻害すること、およびＴｈｌ応答の発生を遅くすることが腫瘍退縮療法の有効性に重要であることが、証拠から示唆されている。粘液腫ウイルスは毒性ウイルスであるが、宿主特異的で宿主域が非常に狭いため、ヒトまたはマウスには感染しない。特定の理論に拘泥することなく、粘液腫ウイルスは非ヒトウイルスであるために、ヒトの既存の免疫認識と出会うはずがないと考えられる。したがって、その腫瘍退縮性ウイルスとしての可能性は、より障害をもたらしにくいため、天然のヒトウイルスよりも粘液腫ウイルスの方が、許容性腫瘍細胞により強く感染して、癌に対する有効な腫瘍退縮治療を行うことができるはずである。
【００３９】
粘液腫ウイルスの宿主域遺伝子Ｍ−Ｔ５は、粘液腫ウイルスが多くのヒト腫瘍細胞株に感染する際に決定的な役割を果たしているように見える（Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ， （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８：１０３）。このＭＴ−５遺伝子は、ウサギリンパ球において粘液腫が複製するために必要とされるアンキリン反復タンパク質をコードし、ＭＴ−５遺伝子を欠失した粘液腫ウイルスは、感受性のウサギにおいても粘液腫症を発症させることができない（Ｍｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ４３９４）。入手可能な証拠から、感染ヒト細胞の中での細胞内シグナル伝達における違いが、粘液腫ウイルスの感染および増殖複製に対して許容性のあるヒト腫瘍細胞を区別するのに決定的であることが示唆されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ， （２００３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １１： ５８７７）。
【００４０】
さらに、粘液腫ウイルスは、インターフェロンα／β受容体（「ＩＦＮα／β−Ｒ」）のアミノ末端部分に相同性を示すＭ１３５Ｒタンパク質を持っている。Ｍ１３５Ｒは、宿主の抗ウイルス応答を開始させないために、宿主のＩＮＦα／β−Ｒを模倣することが示唆されている（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００１）１３：７３−８４）。この予測は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ由来のウイルスＩＮＦα／β−Ｒとの配列相同性に基づくものであり、ワクシニアウイルス（「ＶＶ」）がそのような免疫回避戦略を採ることが実証されている。しかし、Ｍ１３５Ｒは、ＶＶＢ１８Ｒ、およびその他配列決定されたポックスウイルス由来のＩＮＦα／β−Ｒ相同体の大きさの半分しかないため、すべての場合で、相同体のアミノ末端側の半分だけにしかアラインメントされない。
【００４１】
本発明者らは、免疫蛍光法の結果はＭ１３５Ｒが細胞表面に局在していることを示唆しているにもかかわらず、Ｍ１３５ＲがＩＮＦα／βと相互作用できることを実証する試みは否定的であったことを発見した。このような結果にも関わらず、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒの欠失は、粘液腫ウイルスが宿主動物において病気を引き起こす能力を大幅に減弱させるが、一方、このような欠失をもつ粘液腫ウイルスは、野生型ＭＶとインビトロで比較すると、細胞に感染して死滅させるのに同等の効果をもつことを発見した。このように、一つの態様において、本発明は、治療を受けている患者に尋常でない封じ込めストラテジーを行う必要がなく、粘液腫ウイルスを腫瘍退縮性ウイルス治療のためのより安全な代替法として提供できるため、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスは、腫瘍退縮性の研究など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理する上で有用であるという発見に関する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルス感染に許容性のあるヒト腫瘍細胞において、抗癌剤であるラパマイシンが粘液腫ウイルスの感染力のレベルを高める働きをするという発見、および、ラパマイシンが存在しなければ、粘液腫ウイルスのある株の複製を制限するヒト腫瘍細胞において、ラパマイシンがあれば粘液腫ウイルスの一定の株の複製が可能となるという発見に関する。粘液腫ウイルス感染に許容性のある細胞とは、このウイルスが入り込むことができ、かつその中でウイルスが増殖的に繁殖できる細胞である。許容細胞は、タンパク質ＰＴＥＮ、ＰＤＫ、ＡＫＴ、ＧＳＫ、Ｒａｆ、ｍＴＯＲまたはＰ７０Ｓ６Ｋを含む１つ以上の経路に欠損また変異があってもよい。制限細胞は、一定の条件下でのみ粘液腫ウイルスに対して許容的であるが、その他の条件下では増殖性感染を許容しない。例えば、制限細胞は、このウイルスの野生株に許容性があるが、変異型粘液腫株、例えば、ＭＴ−５遺伝子をノックアウトされた株は増殖的に繁殖させない。別の例において、粘液腫ウイルスに対して制限的な細胞は、粘液腫ウイルス単独での増殖的な感染を許容しないかもしれないが、ラパマイシンで処理すると、同じ粘液腫ウイルスが細胞に増殖的に感染することができるようになる。非増殖性の細胞株は、粘液腫ウイルス感染に対し非許容性であって、すなわち、ウイルスは細胞に入り込むことはできるかもしれないが、細胞に増殖的に感染はしないことを意味している。
【００４３】
このように、ラパマイシンは、粘液腫ウイルスと併用すると、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に対する粘液腫ウイルスの感染力を高める。本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理するために、ラパマイシンを粘液腫ウイルスと併用することに関する。
【００４４】
ラパマイシンは、土壌細菌であるストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から精製された活性抗真菌化合物であることが示されている大環状ラクトンである。本明細書において、ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２と複合体を形成してｍＴＯＲを阻害することができるラパマイシン（シロリムスとも称される）およびそのアナログまたは誘導体を意味し、アナログであるＣＣＩ−７７９（細胞周期阻害剤−７７９またはラパマイシン−４２，２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸とも称される）およびＲＡＤ００１（エベロリムスまたは４０−Ο−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンとも称される）などを含む。ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９およびＲＡＤ００１は市販されており、ラパマイシンは、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔから商標Ｒａｐａｍｕｎｅという名称で購入可能である。ラパマイシンという用語は、さらに、ラパマイシンの医薬上許容される塩およびエステル、その水和物、溶媒和物、多形体、アナログまたは誘導体、ならびに、使用される過程、例えば、患者に投与されると、代謝または転換されてラパマイシンまたはそのアナログもしくは誘導体となるプロドラッグまたは前駆体も含む。
【００４５】
細胞内シグナル伝達阻害剤としてのラパマイシンは極めて特異的であり、細胞に入り込んで、ＦＫＢＰ１２として知られる細胞タンパク質に結合する。次に、ラパマイシン／ＦＫＢＰ１２複合体は特異的な細胞内標的ｍＴＯＲ（哺乳類のラパマイシン標的）に結合する。多くの癌が、Ｐ１３Ｋなどのシグナル伝達分子の過活性、または腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮの欠如から発生することが示されている。これらの分子はどちらもｍＴＯＲの上流に存在する。ｍＴＯＲは、細胞の増殖、成長、分化、遊走および生存の中心的調節因子であることが示されており、そのため、癌細胞の非制御成長を阻止する上で理想的な標的である。ラパマイシンに感受性の癌細胞株は、通常、ｍＴＯＲを介した経路の活性化の結果生じたものである。
【００４６】
ラパマイシンは、シクロスポリン治療の代替治療または補完治療として、主に臓器移植患者に使用されている。臓器移植患者において、ラパマイシン治療は、一般にシクロポリンＡまたはＦＫ５０６よりも副作用が少ない。加えて、ラパマイシン治療を受けた患者のほうが一般に、癌の発生が少なく、かつＣＭＶ（ヘルペスウイルスであるサイトメガロウイルス）の発生率が低いことが、遡及研究によって示されている。したがって、特に、ＣＭＶ複製がラパマイシンによって減少するはずであると仮定する研究を考慮すると、ラパマイシン治療によって粘液腫ウイルスの癌細胞への感染が促進されるのは意外なことである（Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉによる“Ｔｈｅ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ” ｉｎ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２００４； １７： ７６２のレビュー）。特定の理論に制限されなくても、粘液腫ウイルスが、これらの細胞の腫瘍性表現型に関係しているかもしれないｍＴＯＲ経路を介する異常なシグナル伝達を利用している可能性がある。そうであれば、ｍＴＯＲ阻害剤によってこの経路を操作することは、このウイルスにとって選択的な利益となるかもしれない。
【００４７】
このようにして、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための方法であって、このような細胞に有効量の粘液腫ウイルスを投与することを含む方法が提供される。さらなる実施態様において、このウイルスを、有効量のラパマイシンと併用して投与する。
【００４８】
この粘液腫ウイルスは、ポックスウイルスのレポリポックスウイルス属に属する、複製可能なウイルスであればよい。この粘液腫ウイルスは粘液腫ウイルスの野生株でよく、または、粘液腫のＭＴ−５ノックアウト株のように、遺伝子改変された粘液腫ウイルス株でもよい。この粘液腫ウイルスは、下記のように、機能的Ｍ１３５Ｒタンパク質を発現しない株など、ウサギにおいて弱毒化された効果を示し、その結果、病気のリスクが低くなっている株であってもよい。
【００４９】
特定の実施態様において、粘液腫ウイルスは、機能的Ｍ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスである。
【００５０】
機能的Ｍ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスは、遺伝子産物、安定型遺伝子産物、または機能的遺伝子産物が発現されないように欠失、置換または中断されたＭ１３５Ｒをコードするオープンリーディングフレームの一部または全部を持つ粘液腫ウイルスを含む。このようなウイルスは、Ｍ１３５Ｒをコードする遺伝子からタンパク質が発現されることがないように欠失、置換または中断された、Ｍ１３５Ｒの遺伝子調節領域の一部または全部を有する粘液腫ウイルスも含む。機能的Ｍ１３５Ｒタンパク質とは、転写され、翻訳され、折り畳まれ、翻訳後に修飾され、細胞の内部に局在化されるＭ１３５Ｒであり、粘液腫ウイルスが感染した宿主の中で粘液腫症を引き起こすことを可能にするものである。Ｍ１３５Ｒタンパク質が、全く、または適正に、または十分に転写されず、翻訳されず、折り畳まれず、翻訳後に修飾されず、細胞内に局在化されないために、感染した宿主が粘液腫症を発生しなければ、その時には、機能的Ｍ１３５Ｒが細胞内で発現されていない。
【００５１】
さらなる実施態様において、細胞はインターフェロンに対して非応答性である。
【００５２】
特定の実施態様において、細胞は哺乳動物の癌細胞である。一つの実施態様において、細胞は、ヒト固形腫瘍などのヒト癌細胞である。
【００５３】
別の実施態様において、細胞はウイルスに慢性的に感染している。
【００５４】
ラパマイシンと粘液腫ウイルスの投与するための「併用」は、同一の投薬形態で一緒に処方するか、または別々の投与形態で処方することができ、別々の投与形態の場合には、同じ様式で投与するため、または異なった投与様式で投与するために同じ形であっても、異なった形であってもよい。さらに、同じ投薬形態で一緒に投与しない場合に、ラパマイシンと粘液腫ウイルスを併用して投与するとは、ラパマイシンおよび粘液腫ウイルスを治療中の哺乳動物に同時に投与することを意味し、同時に、または任意の順序で連続的に、または異なった時点で投与することができることを意味する。このように、ラパマイシンと粘液腫ウイルスを別々に投与することも可能であるが、望ましい治療効果をもたらすよう時間的に十分近接させて投与することができる。
【００５５】
本明細書において「有効量」という用語は、所望の結果を得るのに必要な投薬形態または期間において有効な量を意味する。
【００５６】
本明細書において「先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞」という用語は、ウイルスに曝露されるか、ウイルスの侵入を受けた場合に、ウイルスの複製、インターフェロンの産生、インターフェロン応答経路の誘導、およびインターフェロンが介在しているか否かに関わらないアポトーシスなどの抗ウイルス防御機構を誘導せず、そのため、ＭＶが、単独で、またはラパマイシン療法と併用すると感染することができる細胞を意味する。この用語は、ウイルスに曝露または感染したときに、正常な細胞、例えば、非感染細胞または非癌細胞と比較すると、先天的な抗ウイルス応答が低下または欠損している細胞を含む。これは、インターフェロンに対して非応答性である細胞、およびアポトーシス応答またはアポトーシス経路誘導が低下もしくは欠損している細胞を含む。この欠損は、感染、遺伝子欠損、または環境ストレスなど、さまざまな原因によって生じうる。しかしながら、この欠損が既存の感染によって生じている場合、ＭＶによる重感染は排除され、当業者はそのような例を容易に同定することができる。当業者は、過度の実験を行うことなく、いずれか所定の細胞型が先天的な抗ウイルス応答を欠損しているために、単独の、またはラパマイシン治療と併用した粘液腫ウイルスによって感染されうるか否かを容易に決定することができる。例えば、ＶＳＶを普通に用いて、細胞の抗ウイルス応答を測定することができる。
【００５７】
所定の細胞型、例えば、所定の癌細胞型が先天性抗ウイルス応答不全であるか否かを評価するために、当業者は外植片を採取し、インビトロでこれらの細胞のいくつかを培養して、ＶＳＶによる、あるいは、ラパマイシンと併用した粘液腫ウイルスを含む粘液腫ウイルスによる感染の可能性を測定することができる。
【００５８】
本明細書を通して、「インターフェロンに対して非応答性である細胞」という用語は、インターフェロンの活性、例えば、インターフェロンの抗ウイルス活性もしくは抗腫瘍活性に応答しない細胞、または異常なインターフェロン応答、例えば、インターフェロンに対する低下した、もしくは無効な応答を示すか、または、例えば、転写因子、例えば、ＳＴＡＴｌなどのシグナル伝達分子のリン酸化もしくは活性化によって測定すると異常なインターフェロンシグナル伝達を示す細胞を意味する。例えば、制限はないが、この細胞は、インターフェロンに対して応答性である細胞の中でそのような応答を誘導するのに十分な濃度のインターフェロンに曝露されても、増殖を阻害されず、または、死滅しないかもしれない。インターフェロンに対して非応答性の細胞は、細胞内シグナル伝達経路、または通常は応答性細胞の中で活性化されている経路に欠損があるかもしれない。典型的には、ＶＳＶによる感染に対する感受性は、インターフェロンに対する非応答性の指標であり、当業者は、インターフェロン存在下でＶＳＶ感染を阻止することができるか、またはその能力を欠いているかによって、あるいは、当技術分野において周知のインターフェロン活性のマーカーとなる他のもの、例えば、ＰＫＲ、ＳＴＡＴ、ＯＡＳ、ＭＸのように、ＩＮＦによって刺激される遺伝子の発現レベルを用いて、特定の細胞がインターフェロンに対して非応答性であるか否かを簡単に判定することができる。
【００５９】
本明細書を通して、「複製能がある」という用語は、特定の宿主の内部で感染および複製することができるウイルスを意味する。これは、特定の宿主の中では単独で複製を制限されているが、宿主細胞をラパマイシンで処理すると、ウイルスがその細胞に増殖的に感染することができるウイルスを含む。
【００６０】
本明細書において、「細胞」という用語は、単一細胞および複数の細胞または細胞群を含む。細胞に薬剤を投与するとは、インビトロおよびインビボにおける投与を含む。
【００６１】
本明細書において、「動物」という用語は、動物界の全生物を含み、具体的には哺乳動物、特にヒトを含む。
【００６２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を「阻害する」という用語は、細胞を成長もしくは分裂できないようにすること、または細胞の増殖または分裂を低下もしくは遅延させることに加えて、溶解またはアポトーシスまたはその他の細胞死機構による細胞死を含む。
【００６３】
当業者に周知で、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている標準的な分子生物学技術を用いて、粘液腫ウイルスのゲノムを容易に改変して、１つ以上の治療用導入遺伝子を発現させることができる。当業者は、粘液腫ウイルスのどの部分を欠失させれば、そのウイルスが依然として増殖性感染できるかを容易に決めることができるようになる。例えば、公表されたウイルスのゲノム配列を、特徴がはっきりした他のウイルスのゲノムと比較して、欠失させることができるウイルスゲノムの非必須領域を推定することができる（例えば、Ｃ． Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｓ． Ｈｏｔａ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｌ． Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｊ．−Ｘ． Ｃａｏ， Ｃ． Ｍａｃａｕｌａｙ， Ｄ． Ｗｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｅｖａｎｓ， ａｎｄ Ｇ． ＭｃＦａｄｄｅｎ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２６４： ２９８−３１８）参照）。
【００６４】
本明細書において、「治療用遺伝子」または「治療導入遺伝子」という用語は、その発現が所望の結果、例えば、抗癌作用をもたらす任意の遺伝子を広く説明しようとするものである。例えば、このウイルスを改変して、ウイルス治療の抗癌作用を増進する遺伝子を担持させることができる。このような遺伝子は、アポトーシスを開始させることに関与するか、または免疫を破壊するために感染細胞を標的とすることに関与する遺伝子であり、例えば、インターフェロンに対する応答の欠如を修復する遺伝子、または、細菌の細胞表面の抗原など、抗体の応答を刺激する細胞表面マーカーの発現をもたらす遺伝子などである。また、このウイルスを改変して、腫瘍性細胞または癌細胞の増殖および成長を遮断して、細胞が分裂できなくなることに関与する遺伝子を発現させることもできる。さらに、このウイルスを改変して、化学治療剤の合成に関与する遺伝子のような治療用遺伝子を含ませることができ、または、例えば、ヒト細胞など、阻害されるか死滅させられる細胞が由来する特定の生物種の細胞における複製量が増加するよう改変することができる。粘液腫ウイルスに挿入されて、その抗癌作用を高めることができる遺伝子の具体例は、ＴＲＡＩＬタンパク質に関するヒト遺伝子、またはＥ４ ｏｒｆ４ポリペプチドをコードするアデノウイルス遺伝子などであるが、これらのタンパク質はいずれもヒト腫瘍細胞を死滅させることに関与する。
【００６５】
当然のことながら、ラパマイシンと併用して使用される場合を含め、粘液腫ウイルスの治療効果は、このウイルスによる細胞溶解によって、またはこのウイルスによる治療薬の送達によって達成することができる。粘液腫ウイルスと併用してラパマイシンが含まれることによって、粘液腫ウイルス単独の効果を増強することが可能になるはずである。すなわち、粘液腫ウイルスは、ラパマイシンと併用して投与すると、粘液腫ウイルス単独のときよりも多数の標的細胞に増殖的に感染することができるか、またはラパマイシン不在下では粘液腫ウイルスによる増殖的感染を制限する、先天的な抗ウイルス応答を欠損した標的細胞に増殖的に感染することができるはずである。
【００６６】
このウイルスは、当技術分野において周知の標準的な技術を用いて調製することができる。例えば、培養ウサギ細胞に使用すべき粘液腫ウイルス株を感染させてウイルスを調製することができ、感染を進行させて、ウイルスが培養細胞の中で複製し、当技術分野において既知の標準的な細胞表面破砕法によって細胞表面を崩壊させるとウイルスが遊離できるようにし、それによって、回収のためウイルス粒子を放出させることができる。ウイルスを回収したところで、ウサギ細胞のコンフルエントな細胞層に感染させてから、プラークアッセイを行なうことによって、ウイルス力価を測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５：１７−３０参照）。
【００６７】
また、先天的な抗ウイルス応答が欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための方法であって、有効量の粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して患者に投与することを含む方法が、そのような治療を必要とする患者に提供される。患者は、ヒトを含む哺乳動物など、任意の動物であってよい。
【００６８】
本明細書において、「先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状」とは、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞であって、これらの細胞を死滅させることによって病気、疾患、病状、もしくはその症状を治療することができる細胞が存在することに付随、関連、またはそれを特徴とする病気、疾患もしくは病状を意味する。例えば、病気の状態は癌であってよい。病気の状態はウイルスによる慢性感染症も含む。
【００６９】
病状を「治療すること」は、臨床結果など、有益または所望の結果を得るための方法を意味する。有益または所望の臨床結果は、１つ以上の症状もしくは病状を緩和もしくは改善すること、病気の範囲が縮小すること、病状が安定すること、病気の発生を予防すること、病気の広がりを予防すること、病気の進行を遅延もしくは緩徐化すること、発病を遅延もしくは緩徐化すること、病状を改善もしくは緩和すること、ならびに（部分的もしくは全体的な）寛解を含むが、これらに限定されるものではない。「治療する」とは、治療を行わない場合に予想された生存期間を超えて患者の生存期間を伸ばすことを意味することも可能である。また、「治療する」とは、病気が進行するのを阻害して、病気の進行を一時的に緩徐化することを意味することも可能であるが、より好ましくは、病気の進行を永続的に停止させることを含む。
【００７０】
一つの実施態様において、病状は癌である。癌は、必ずしも細胞の全部である必要はないが、細胞の少なくとも一部が先天的な抗ウイルス応答を欠損した任意の型の細胞であればよい。一つの実施態様において、癌は、細胞の少なくとも一部がインターフェロンに対して非応答性である癌であればよい。本明細書において、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」という用語は（互換的に使用され）、細胞増殖の調節が顕著に失われることを特徴とする、異常な増殖を示す細胞または不死化している細胞を意味する。「癌」または「腫瘍」という用語は、転移性および非転移性の癌もしくは腫瘍を含む。本明細書において、「腫瘍性」または「腫瘍」という用語は、正常な増殖抑制機構なしに増殖する単一または複数の細胞を広く意味し、したがって、癌および異形成細胞もしくは過形成細胞に加えて、良性腫瘍を含む。
【００７１】
癌は、悪性腫瘍の存在など、当技術分野において一般に受け入れられている診断基準を用いて診断することができる。
【００７２】
本発明に従って治療することができる癌の型は、白血病、リンパ腫などの造血細胞癌、大腸癌、肺癌、腎癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、直腸結腸癌、黒色腫およびその他の腫瘍を含むが、これらに限定されない。肉腫および癌腫などの固形腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、およびその他の肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞腫、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肺細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
別の実施態様において、病状は慢性ウイルス感染症である。
【００７４】
慢性的に感染するウイルスは、長期間にわたり持続的な形で動物の細胞内で感染および複製して、病態を引き起こすような任意のウイルスであってもよい。慢性感染ウイルスは、癌の発生と付随または関連するウイルスであってもよい。
【００７５】
ウイルスの慢性感染症は、当技術分野において周知の標準的な方法を用いて診断することができる。例えば、慢性ウイルス感染症は、患者に抗ウイルス抗体が存在することによって、または患者の細胞の中にウイルスのＲＮＡもしくはＤＮＡが存在するかについて陽性試験することによって検出することができる。
【００７６】
患者に投与する場合、有効量の粘液腫ウイルス、および任意には粘液腫ウイルスとラパマイシンを併用したものが、その投薬量または十分な期間において、このウイルスが病気を軽減、改善、緩和、寛解させ、その広がりを抑制し、その進行を緩徐もしくは遅延させ、または治療するのに必要とされる量である。例えば、癌性細胞または腫瘍細胞の数を減らしたり、破壊したりする効果、またはウイルスに慢性的に感染した細胞の数を減らしたり、破壊したりする効果、またはそのような細胞の成長および／または増殖を阻止する効果を達成するのに十分な量であろう。
【００７７】
患者に投与すべき有効量は、粘液腫ウイルスおよび任意にはラパマイシンの薬力学的特性、投与方式、患者の年齢、健康状態および体重、病状の性質および範囲、治療頻度および、行っているならば、併用治療の種類、ならびにウイルスの毒性ならびに力価など、多くの因子に依存して変わりうる。
【００７８】
当業者は、上記の因子に基づいて、投与する粘液腫ウイルスの適正な量を決定することができる。まず、患者の臨床反応に応じて、必要に応じて調整を加えることができる適当量にして、このウイルスを投与することができる。ウイルスの有効量は経験的に決定してもよく、それは安全に投与することができるウイルスの最大量、および所望の結果を生むウイルスの最小量に依存する。
【００７９】
粘液腫ウイルスは、標準的な投与法を用いて患者に投与することができる。一つの実施態様において、このウイルスを全身的に投与する。別の実施態様において、このウイルスを病気の部位に投与する。特定の実施態様において、この病状は固形腫瘍であり、この腫瘍部位に注射によってウイルスを投与する。さまざまな実施態様において、ウイルスは、経口的もしくは非経口的に投与するか、または当技術分野において周知の標準的な方法によって投与することが可能である。
【００８０】
全身にウイルスを投与する場合に、病気の部位にウイルスを注射することにより達成される効果と同じ臨床効果をもたらすためには、かなり高用量のウイルスを投与することが必要とされるであろう。しかし、適切な服用レベルは、所望の結果を得る最少量のはずである。
【００８１】
投与するウイルスの濃度は、投与すべき粘液腫の具体的な株の毒性、および標的となる細胞の性質に応じて変わる。一つの実施態様において、約１０９プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）よりも少ない量をヒト患者に投与する。さまざまな実施態様において、約１０２から約１０９ｐｆｕの間、約１０２から約１０７ｐｆｕの間、約１０３から約１０６ｐｆｕの間、または約１０４から約１０５ｐｆｕの間を単一用量にして投与することができる。
【００８２】
当業者は、上記の因子を用いて、患者に投与するラパマイシンの適正量を決定することができる。ラパマイシンの有効量は経験的に決定することができ、投与されるウイルスの量と株、安全に投与することができるウイルスの最大量、および粘液腫ウイルスの感染力の増強を実現するために投与することができるラパマイシンの最小量に応じて変わる。
【００８３】
ラパマイシンは、標準的な投与法を用いて患者に投与することができる。一つの実施態様において、パマイシンを全身に投与する。別の実施態様において、ラパマイシンを病気の部位に注射して投与する。特定の実施態様において、病状は固形腫瘍であり、ラパマイシンをその腫瘍部位に注射によって投与する。さまざまな実施態様において、ラパマイシンを経口的もしくは非経口的に投与するか、または当技術分野において周知のいずれかの標準的な方法によって投与することができる。
【００８４】
ラパマイシンの全量を単一用量にして、または１日または数日間にわたる多回用量にして投与することができる。用量の投与頻度および期間は容易に決定することができる。投薬計画は、粘液腫ウイルスを投与する期間に応じて決まる。例えば、ラパマイシンは、患者に単一回投与することもでき、または１日あたり２〜４回投与することもできる。
【００８５】
さまざまな実施態様において、ラパマイシンの用量は１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０１〜約２５０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０１〜５０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０５〜１０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．１〜７．５ｍｇであろう。
【００８６】
有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの併用剤を、初期治療計画の効果に基づいて、繰り返し投与してよい。投与は、典型的には、任意の反応をモニターしながら定期的に行われる。上記した用量よりも少ないかまたは多い用量を、選択された投与計画または経路に応じて投与してもよいと当業者は認識していよう。
【００８７】
粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して、単独療法として投与することができ、または、化学療法、放射線療法またはその他の抗ウイルス療法など、他の療法と併用して投与することができる。例えば、原発腫瘍の摘出手術の前もしくは後に、または、放射線療法もしくは従来型化学療法剤を投与するなどの治療の前、同時もしくは後に、粘液腫ウイルスを、任意には、ラパマイシンと併用して投与することができる。一つの実施態様において、その他の腫瘍退縮性ウイルスであって、多様な腫瘍細胞型に対して特異性を示しうるようなウイルスと組み合わせて、または逐次的に、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して投与することもできる。
【００８８】
投与を容易にするために、粘液腫ウイルスを、任意には、ラパマイシンと併用して、医薬組成物の成分として調製することができる。したがって、さらなる実施態様において、粘液腫ウイルス、および任意にはラパマイシン、ならびに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が提供される。したがって、本発明は、一つの態様において、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する際、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する際に使用するための医薬組成物も含む。この組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、およびさまざまな適合担体を通常含むことができる。すべての送達形態について、組換え粘液腫ウイルスを生理食塩水内で処方することができる。
【００８９】
この医薬組成物は、追加的な抗癌剤など、別の治療薬をさらに含むことが可能である。一つの実施態様において、この組成物は化学療法剤を含む。この化学療法剤は、例えば、患者の癌細胞または腫瘍細胞に対して腫瘍退縮効果を示すが、粘液腫ウイルスの腫瘍殺傷効果を阻害または低下させないものであれば、実質的にいずれの薬剤であってもよい。例えば、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであってよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、化学療法剤は、癌性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものである。
【００９０】
医薬上許容される希釈剤の比率および同一性は、選択された投与経路、生ウイルスとの適合性、および適用可能な場合には、ラパマイシンの化学的安定性との適合性、ならびに標準的な薬学的実施慣行によって決定される。通常、医薬組成物は、生きた粘液腫ウイルスの生物学的特性を顕著には損なわず、ラパマイシンが含まれている場合には、その分解をもたらしたり、その安定性または効力を低下させたりしない成分とともに処方される。
【００９１】
この医薬組成物は、有効な量の単一または複数の活性物質を医薬上許容される賦形剤との混合物として併用されるよう、患者に投与するのに適した医薬上許容される組成物を調製するための周知の方法によって調製することができる。適当な賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡ １９８５）に記載されている。これに基づいて、組成物は、一つ以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤とともに、適当なｐＨおよび生理液と等張の緩衝液に含まれている、任意にはラパマイシンが入った粘液腫ウイルス溶液を、これらに限定されずに含む。
【００９２】
当業者には当然のことながら、医薬組成物は、選択された投与経路に応じて、さまざまな形で患者に投与することができる。経口的または非経口的に、本発明の組成物を投与することができる。非経口投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、くも膜下腔内、直腸および局所的な投与方式を含む。非経口投与は、選択された期間にわたる持続注入によるものであってもよい。
【００９３】
医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な担体とともに経口投与することができ、または、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルの中に封入することができ、または、圧縮して錠剤にすることもできる。経口的に治療薬として投与するには、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと一緒に、賦形剤に取り込み、消化可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、ウエハースなどの形態にして使用することができる。
【００９４】
粘液腫ウイルス溶液を、任意にはラパマイシンと一緒に、生理学的に適した緩衝剤の中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を阻止するための保存剤を含むが、それで生ウイルスが不活化されることはない。当業者ならば、適当な処方剤の調製法を知っているであろう。適当な処方剤を選択および調製するための従来の手順および成分については、例えば、１９９９年に出版されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載されている。
【００９５】
さまざまな実施態様において、組成物は、腫瘍部位など病気の部位に直接（皮下、静脈内、筋肉内などに）注射によって投与されるか、または経口投与、あるいは、経皮投与によって投与される。
【００９６】
注射液として使用するのに適した医薬組成物の形態は、無菌の水溶液もしくは分散液、ならびに無菌の注射用の溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末などであるが、ここで、無菌という用語は、投与される粘液腫ウイルス自体には及ばない。すべての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易に注射できる程度に流動性でなければならない。
【００９７】
使用される医薬組成物の用量は、治療中の特定の症状、症状の重症度、年齢、体調、体格および体重など個々の患者のパラメーター、治療継続期間、（もしあれば）併用療法の性質、具体的な投与経路、ならびに医療専門家の知識および専門技術範囲内にあるその他の類似要素なに応じて変わる。これらの要素は、当業者に周知のものであり、最小限の日常的実験作業によって扱うことができる。
【００９８】
また、任意にはラパマイシンと併用される粘液腫ウイルス、または粘液腫ウイルスおよびラパマイシンを含む医薬組成物は、同じ処方剤の中で一緒に、または異なる処方剤にして、キットとしてパッケージにすることもでき、このキットは、それを必要とする患者に、粘液腫ウイルスを使用して、もしくはラパマイシンとともに粘液腫ウイルスを使用して、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または粘液腫ウイルスを使用して、もしくはラパマイシンとともに粘液腫ウイルスを使用して、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するためなど、粘液腫ウイルスおよびラパマイシンを使用するための説明書を含む。この病状は癌、または慢性ウイルス感染症であってよい。それを必要とする患者において、
また、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するために、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用することを想定している。一つの実施態様において、細胞はインターフェロンに対して非応答性である。先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために、それを必要とする患者に、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用することがさらに提供されている。一つの実施態様において、病状は癌である。また、薬剤の製造において、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、またはそれを必要とする患者において先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用すること提供されている。
【００９９】
ＭＶは、ＭＶの自然宿主以外の動物の細胞、またはそれらに由来する細胞、すなわち、先天的な抗ウイルス応答を欠損している細胞集団に由来する細胞に選択的に感染することができる。ＭＶにこのような能力があるため、培養中の、または動物の体内にある細胞の集団から、インターフェロンに対して非応答性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠失した細胞を検出する際にＭＶを使用することができる。このような細胞、例えば、蝕知可能な腫瘤にまで進行していないか、または動物の中で顕著な症状を誘起していない一定の癌細胞は、別の方法では容易に検出できないかもしれない。
【０１００】
したがって、一つの実施態様において、患者の中で先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出するための方法であって、検出可能なマーカーを発現するように改変された粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して患者に投与すること；患者の中で、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞にこのウイルス感染させること；および、患者の中で検出マーカーを発現する細胞を検出することを含む方法が提供される。
【０１０１】
感染細胞は、診断画像を視覚化するための従来の方法を用いて検出することができる。この検出法は、使用する具体的な検出用マーカーによって決まる。例えば、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変された粘液腫ウイルスに感染した細胞は、蛍光デジタル画像顕微鏡を使用して検出することができる。その他の方法は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出撮影法（ＰＥＴ）などの全身走査法、核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、および超音波検査法などである。当業者は、具体的な検出マーカーを検出するための適切な方法を決めることができるだろう。
【０１０２】
検出可能なマーカーには、改変ウイルスに感染した細胞の内部で、マーカーの発現または合成が起きるように、それを発現または合成する遺伝子を粘液腫ゲノムに挿入することができる任意のマーカーがあるが、これらに限定されるものではない。例えば、一つの実施態様において、検出可能なマーカーは蛍光タンパク質でもよい。感染細胞は、改変ウイルスが先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染して、検出可能マーカーをそのような細胞の中で検出可能なレベルで発現させることができるようにするため、改変ウイルスを患者に投与した後適当な時間をおいて検出することができる。例えば、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変したウイルスを患者に投与した後、２〜２０日間のいずれかの時点で検出することができる。
【０１０３】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することをモニターするために、その患者において、間隔をおきながら繰り返し検出法を実施することができる。例えば、粘液腫ウイルスを用いて、そのような細胞を検出する方法は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞の性質、および患者の体内にそのような細胞が存在する結果として引き起こされたいずれかの病状の性質に基づき、必要に応じて、６ケ月、１年または２年の間隔で実施することができる。ある期間にわたりこの方法を繰り返すと、病状の進行もしくは寛解、または患者の体内での病気の広がりをモニターすることが可能になる。
【０１０４】
粘液腫ウイルスは、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に選択的に感染する能力があるため、細胞におけるそのような欠損の指示薬として使用することができる。したがって、本発明の方法を用いて、先天的な抗ウイルス応答の欠損について、患者から摘出した細胞をアッセイすることができる。このような測定法は、他の指示薬と併用すると、その患者が特定の病状、例えば、癌に罹患していることを表示することができる。
【０１０５】
したがって、一つの実施態様において、試料中で先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出するための方法であって、細胞を培養すること、培養細胞を、任意にはラパマイシンと併用した粘液腫ウイルスに曝露すること、および粘液腫ウイルスによる細胞の感染力を測定することを含む方法が提供される。
【０１０６】
周知の生検法を用いて、ヒト被験者など、被験対象から細胞を取り出すことができる。生検法は、検査すべき細胞の存在する場所およびその型に応じて決められる。
【０１０７】
周知の培養技術に従って細胞を培養してから、培養液に生きた粘液腫ウイルス、および任意にはラパマイシンを添加することにより、細胞をＭＶに、任意にはラパマイシンに曝露する。粘液腫ウイルスをラパマイシンと併用して添加する場合、ウイルスとラパマイシンは、同時または経時的に添加することができる。ラパマイシンが存在する場合など、感染多重度（「ＭＯＩ」）を変えて、所定の細胞型、密度および培養技術、および具体的なラパマイシン濃度に対して最適なＭＯＩを、ＭＶに曝露すると感染することが知られている陽性対照細胞の培養物を用いて決定することができる。
【０１０８】
ラパマイシンの量、ならびにラパマイシンおよび粘液腫ウイルスを培養細胞に添加するタイミングは、細胞型、培養方法、およびウイルス株に応じて変えることができる。このようなパラメーターは、常法を用いた最小限の検査法によって試験および調整することができる。
【０１０９】
ＭＶの細胞死を引き起こす能力など、ラパマイシンが存在する場合も含んだＭＶによる培養細胞への感染力は、当業者に周知のさまざまな方法によって決定することができる。また、これは、ウイルスの発現産物との酵素反応または化学反応を完了させるために、細胞培養液に試薬を添加することも含むかもしれない。ウイルス発現産物は、ＭＶゲノムに挿入されたレポーター遺伝子から発現されたものであってもよい。
【０１１０】
一つの実施態様において、ＭＶを改変して、感染状態を検出するのを容易にすることができる。例えば、ＭＶを遺伝子改変して、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、または放射性イメージングによって容易に検出することができるマーカーを発現させることができる。このマーカーは、発現された蛍光タンパク質、または比色反応または放射標識反応に関与する可能性のある発現酵素であってもよい。別の実施態様において、このマーカーは、試験されている細胞の特定の機能を妨害または阻害する遺伝子産物であってもよい。
【０１１１】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに具体的に説明される。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１：粘液腫ウイルスによるマウス細胞株およびヒト細胞株への感染）
（ウイルス株）
使用したウイルス株は、野生型ＭＶ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）またはβ−ガラクトシダーゼ（「ＬａｃＺ」）を発現するように改変されたＭＶ、および死滅（「不活化」）ウイルスを含む。標準的な技術を用いて、ウイルスを調製し滴定した。
【０１１３】
（細胞株）
野生型マウス、および以下のノックアウトマウスに由来するマウス胚線維芽細胞（「ＭＥＦ」）を使用して、マウス実験を行った。すなわち、ＩＦＮα／β受容体ホモ接合ノックアウト、ＳＴＡＴｌホモ接合ノックアウト、ＰＫＲヘテロ接合ノックアウト、ＲＮａｓｅ Ｌヘテロ接合ノックアウト、Ｍｘ１ヘテロ接合ノックアウト、ＰＫＲ／ＲＮａｓｅＬ／Ｍｘ１ホモ接合三重ノックアウト。
【０１１４】
Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００３）４：２６３−２７５に記載されているように、ＢＧＭＫ対照細胞および以下のヒト腫瘍細胞株に対してヒトに関する実験を行った。すなわち、ＨＴ２９、ＨＯＰ９２、ＯＶＣＡＲ５、ＳＫ−ＭＥＬ３、ＳＫ−ＭＥＬ２８、Ｍ１４、ＳＫＯＶ３、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＣＡＫＩ−１、７８６−０、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡＭＢ４３５、ＳＦ０４、Ｕ８７、Ａ１７２、Ｕ３７３、ＤａｏｙおよびＤ３８４。
【０１１５】
（方法）
一般的には、Ｌａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２５６： ２３３−２４５； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００３） ７７（１３）： ７６８２−７６８８； ａｎｄ Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２００４） ８： １０３の記載に従って、アッセイ法および実験を行った。
【０１１６】
インビボでのマウス研究では、ヒト頭蓋内神経膠腫Ｕ８７をヌードマウスに移植した。移植後１５日目に、生きたＭＶ ＧＦＰまたは不活化ＭＶ ＧＦＰを５×１０６の力価でマウスの腫瘍内に注射するか、擬似感染させた。感染後７２時間目に、動物を殺してから、その脳を摘出してＯＣＴ（至適温度化合物）の中に埋め込み、凍結切片を切り出した。蛍光顕微鏡によって全脳切片の中で粘液腫ＧＦＰを可視化した。その後、切片を固定し、Ｈ＆Ｅ（ヘモトキシリンおよびエオシン）を用いて染色して、腫瘍を可視化した。
【０１１７】
ヒト腫瘍細胞アッセイ法では、手術後直ちに、腫瘍をトリプシン処理して平板培養し、翌日、ＭＯＩ０．１、１．０または１０でウイルスに感染させた。感染後２４時間目および４８時間目に、位相差顕微鏡法および蛍光顕微鏡法を用いて、それぞれ細胞毒性およびウイルス発現に関するデータを集めた。黄色テトラゾリウム塩ＭＴＴを用いるアッセイ法を行って、感染後４８、７２または９６時間目の細胞生存率（％）（擬似感染後生存していた細胞に対するパーセンテージ）を定量した。
【０１１８】
ヒト小児髄芽腫細胞株ＤａｏｙおよびＤ３８４を、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の粘液腫ＧＦＰに感染させた。感染後７２時間目に、ＭＴＴを用いて細胞生存率を測定した。
【０１１９】
（結果：マウス細胞株の感染）
従来の研究では、ケモカイン受容体でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞のいくつかのクローンに、粘液腫ウイルスを感染させることができたが、その他のクローンには感染させることができなかったことが示されていた。他のマウス細胞において粘液腫ウイルス指向性がいずれか特定の受容体に依存しているか否かを調べるために、本発明者らは、野生型（ＷＴ）マウスおよび多様な遺伝子ノックアウト由来の初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を利用した。
【０１２０】
ＩＦＮは抗ウイルス応答を開始する上で重要な役割を果たしているため、本発明者らはこの制限的な表現型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が、ＩＦＮを介した「抗ウイルス状態」に関係があると仮定した。ＩＦＮ系の事象の連鎖を断つか、抗体によって循環ＩＮＦを中和するか、またはＩＦＮ受容体陰性マウスもしくは細胞内シグナル伝達経路の遺伝子を欠失したマウスを作成すると、通常は正常なマウス細胞には感染しない粘液腫ウイルスに対する宿主の抵抗性が著しく損なわれると考えた。
【０１２１】
この仮説を検証するために、本発明者らは、非許容性細胞における粘液腫ウイルスの非感染性がＩＦＮの抗ウイルス活性のせいであるか否かを明らかにする必要があった。細胞内ＩＦＮシグナル応答に関与する１つ以上のタンパク質をノックアウトしたさまざまなＭＥＦ細胞型について、ＩＦＮ経路に対するＭＶ感染の効果を調べた。
【０１２２】
初代ＭＥＦに対して行われた実験によって、野生型（「ＷＴ」）ＭＥＦは粘液腫ウイルスによって感染可能ではないことが実証された。ＩＮＦ経路がＩＮＦα／βに対する中和抗体によってブロックされた場合、前記ＭＥＦは粘液腫ウイルスによって完全に感染可能になる（図２）。しかし、ＩＮＦγに対する中和抗体に曝露されたＭＥＦは非許容性のままであった。このことは、粘液腫ウイルスがインビトロでＭＥＦに感染するのを許容する環境を作り出すことに、ＩＦＮγではなくＩＦＮα／βが重要であることが大まかに示している。ＩＮＦα／βおよびＩＮＦγに対するさまざまな細胞内シグナル伝達経路が文献中で同定されてきた。しかし、ＩＮＦα／βおよびＩＮＦγはともに、培養された線維芽細胞とは異なり、感染宿主中において重要な役割を果たしている可能性が高い。本発明者らは、ＩＮＦα／βおよび／またはＩＮＦγの経路のいずれかを欠損したヒト腫瘍がインビボでの粘液腫ウイルス感染に感受性になるものと予想している。
【０１２３】
本発明者らは、ＭＶに感染した非許容性ＷＴ ＭＥＦの中でＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２の活性を調べた。図３に示す結果は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２が活性化されることを示した。さらなる研究によって、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ５は活性化されないことが示された（図４）。
【０１２４】
ＭＥＦの非許容性状態を維持する上でＩＦＮα／β細胞内経路が重要性であることを確認するために、遺伝子欠失実験を行って、ＩＮＦα／β受容体および細胞内カスケードを破壊したものを用意した。ＩＮＦ受容体またはＪＡＫ１もしくはＳＴＡＴ１の遺伝子を欠失させ、ＭＶを使用して、ＷＴ ＭＥＦ、ＩＦＮα／β Ｒ−／−ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦを感染させた。ＩＦＮα／β Ｒ−／−ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦはＭＶに対して許容性であり、ＩＮＦα／βおよびＳＴＡＴ１カスケードがＭＶ感染にとって重大な意味を持つことを明らかにした（図５）。
【０１２５】
プリテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）は、さまざまな細胞の中でＩＮＦα／βによって誘導される酵素である。このキナーゼは、ｄｓＲＮＡの存在下で自己リン酸化を受け、次に、リン酸化によってタンパク質翻訳およびアポトーシスの阻害を誘導することができる、真核生物のタンパク質合成開始因子（ｅＩＦ−２α）など、いくつかの細胞タンパク質をリン酸化する。また、ＰＫＲはＲＮａｓｅＬの活性化にも示される。本発明者らは、ＭＶ感染後、非許容性ＭＥＦにおけるＰＫＲの活性化を調べた。抗ウイルス状態が十分に確立している非許容性ＭＥＦでは、ＰＫＲはリン酸化されない（図６）。さらに、ＭＶ感染によって、ＰＫＲのリン酸化が阻害される（図７）。また、ＰＥＲＫ（ＰＫＲ様のＥＲキナーゼ）は、粘液腫ウイルス感染後の初期の野生型ＭＥＦ内でリン酸化されない（図８）。
【０１２６】
ＭＶを用いて、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬまたはＭｘ１の単一遺伝子ノックアウトを有するＭＥＦに感染させた（図９）。ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬまたはＭｘ１は、粘液腫ウイルス感染に対する非許容性を維持するためには非必須であることが発見された。ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１の役割が必須でないことをさらに確かめるために、ＭＥＦにおいてＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−およびＭｘ１−／−という三重ノックアウトを行った。ＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−およびＭｘ１−／−の三重ノックアウトは、ＭＶ感染を支持しない（図１０）が、しかし、インターフェロンα／βに対する中和抗体で処理された、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１の三重ノックアウトＭＥＦは粘液腫ウイルス感染に対して許容性となる（図１０および１１を比較せよ）。これらの実験は、ＭＶに対するＭＥＦの非許容性をもたらす上で、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１は必須ではないことを示している。
【０１２７】
さらなる実験を行って、ＭＶ感染後の非許容性野生型ＭＥＦおよび許容性のＩＮＦα／β Ｒ−／−ＭＥＦならびにＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦにおけるｅＩＦ２αおよびＰＫＲの活性化を調べた。ＭＶ感染後に、ｅＩＦ２αは非許容性ＭＥＦおよび許容性ＭＥＦの中でリン酸化されるが、ＰＫＲはどちらの場合においてもリン酸化されない（図１２）。このことは、ＰＫＲおよびＰＥＲＫの関与がなくても、ｅＩＦ２αリン酸化を引き起こす別の経路によって、抗ウイルス状態がもたらされることを示している。
【０１２８】
ＳＴＡＴ１は、非許容性のＰＫＲ、ＲＮａｓｅおよびＭｘ１の三重ノックアウトＭＥＦにおいて、ＭＶ感染後にセリンおよびチロシンのリン酸化を受ける（図１３）。また、粘液腫ウイルス感染後の非許容性ＰＫＲ−／−＋ＲＮａｓｅＬ−／−＋Ｍｘ１−／−ＭＥＦにおけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ１の細胞内局在化も示されている（図１４）。
【０１２９】
要約すれば、これらの結果は、ＩＦＮ／ＳＴＡＴ１を含む並行したＰＫＲ／ＰＥＲＫ非依存的な抗ウイルス経路が、ポックスウイルス指向性にとって重大な意味を持つことを示している。さらに、ｅＩＦ２αのリン酸化は、ＩＮＦによる抗ウイルス作用の最良のマーカーである。
【０１３０】
（結果：ヒト腫瘍研究）
本発明者らは、ＭＶがインビボ系の中でヒト腫瘍細胞に感染することができるかを調べた。ヌードマウスにヒト神経膠腫細胞を注射したところ、引き続いて、頭蓋内神経膠腫を発症した。生ウイルスは、これらのヒト腫瘍細胞に感染することができたが、周囲の細胞には感染しなかった（図１５）。ＧＦＰ由来の蛍光シグナルが腫瘍に局在化することを図１６に示す。
【０１３１】
多くのヒト腫瘍がインターフェロンに対して非応答性であること、および、正常なヒト細胞の中に存在するＩＮＦシグナル伝達カスケードと比較すると、これらの腫瘍細胞は正常なＩＮＦシグナル伝達カスケードを持たないことから、ヒト腫瘍に対する粘液腫ウイルスの効果を調べるために実験を行った。結果を下記に要約する。
【０１３２】
最初に、粘液腫ウイルスを用いて、さまざまな対照腫瘍細胞株およびヒト腫瘍細胞株であるＢＧＭＫ、ＨＴ２９、ＨＯＰ９２、ＯＶＣＡＲ４、ＳＫ−ＭＥＬ３、およびＳＫ−ＭＥＬ２８に対する感染力および細胞溶解性効果を調べた。ＭＶは多様な感染力および細胞溶解作用の結果を示した：ＨＴ２９（図１７）、ＨＯＰ９２（図１８）、ＯＶＣＡＲ４（図１９）、ＳＫ−ＭＥＬ３（図２０）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（図２１）およびＢＧＭＫ（図２２）。
【０１３３】
さらなる腫瘍細胞を検査し、下記の表１は、検査した多様な腫瘍型を許容性および非許容性に分類している。
【０１３４】
（表１ 粘液腫ウイルスのヒト腫瘍細胞に対する指向性）
【０１３５】
【表１】
ＭＶ−ＬａｃＺの濃度を増加させて感染させると、多様なヒト腫瘍株がさまざまな反応性を示した。例えば、Ｕ３７３細胞では、Ｕ８７において低いウイルス力価で行われた細胞殺傷のレベルを達成するのに高いウイルス力価を必要とした（図２３および図２４）。粘液腫は星状細胞腫細胞（図２５）および神経膠腫細胞（図２６）を効率的に感染させた。粘液腫は感染４８時間後、死滅したヒト星状細胞種および髄芽細胞腫において効率的だった。
【０１３６】
（実施例２：制限細胞株におけるにおける粘液腫ウイルス複製の動態に対するラパマイシンの効果）
（ウイルス株）
使用されたウイルス株は、野生型ＭＶ（「ｖＭｙｘＬａｃ」）、およびＭＴ−５遺伝子がノックアウトされるよう改変されたＭＶ（「ｖＭｙｘＬａｃＴ５−」）を含む。標準的な技術を用いて、ウイルスを調製および滴定した。
【０１３７】
（細胞株）
ヒトに関する実験を、ＢＧＭＫ霊長類対照細胞、ＲＫ−１３ウサギ対照細胞、および正常なヒト線維芽細胞Ａ９、制限ヒト腫瘍細胞株７８６−０（腎臓癌）、ＡＣＨＮ（腎臓癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（乳癌）、Ｍ１４（黒色腫）およびＣＯＬＯ２０５（結腸癌）に対して行った。
【０１３８】
（方法）
一般的に、Ｌａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２５６： ２３３−２４５； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００３） ７７（１３）： ７６８２−７６８８；およびＳｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ （２００４） ８： １０３に記載されているとおりに、アッセイ法および実験を行った。
【０１３９】
ウイルスの増殖曲線には、細胞をインビトロで単層に増殖させ、ウイルスに感染させる前に２０ｎＭのラパマイシンまたは対照（ＤＭＳＯを１：５０００に希釈したもの）で処理した。
【０１４０】
表示されたウイルス株に感染した表示された細胞株の試料を、感染後７２時間目に集めて、溶解させた。細胞溶解物の中に含まれるウイルスを滴定して、ＢＧＭＫの単層を感染させるのに使用した。感染後４８時間目に細胞を固定して、Ｘ−ｇａｌを用いて染色した。
【０１４１】
（結果）
粘液腫ウイルスは多くの種類のヒト腫瘍細胞に感染して複製できることが、本発明者らによって既に明らかにされている（Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８：１０３）。このウサギ特異的ウイルスは、ＮＣＩ参照用コレクションに由来するヒト癌細胞株の大多数（約７０％）に選択的に感染することができる。また、宿主域遺伝子Ｍ−Ｔ５が、これら多くの細胞株に粘液腫ウイルスが感染する際に重大な役割を果たすことが分かっている。
【０１４２】
ヒト腫瘍細胞の内部で粘液腫ウイルスが選択的に複製する能力に影響を与えることができる細胞内分子の可能性があるものを今回調査した際に、ラパマイシンの効果を調べた。
【０１４３】
図２９から分かるように、低多重度感染（ＭＯＩ）の後、粘液腫ウイルスが複製および拡散できることを、多段階増殖曲線を用い、ＢＧＭＫ（対照用霊長類細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（対照用ウサギ細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳおよびＰＣ３（許容性ヒト細胞株）、７８６−０、ＨＣＴ１１６、およびＡＣＨＮ（制限ヒト癌細胞株）、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（不全型ヒト癌細胞）を用いて行うことができる。野生型ｖＭｙｘＬａｃと、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスｖＭｙｘＴ５ＫＯの両方を試験して、ラパマイシンによる予備処理した場合としない場合に、この２つのウイルスが単層全体に感染して拡散することができるかを調べた。ＢＧＭＫ細胞上で病巣形成させて、ウイルスの力価を測定した。感染させる６時間前に、２０ｎＭのラパマイシンまたは適当な賦形剤対照（ＤＭＳＯを１：５０００に希釈したもの）で細胞を事前処理した。
【０１４４】
実証されているように、ラパマイシンは、対照ＢＧＭＫ細胞に対しても、ＭＴ−５ノックアウトウイルスに対して非許容的なＲＬ−５細胞を含む試験したウサギ細胞株のいずれに対しても何の効果も示さない。しかし、ラパマイシンは、マウス腫瘍細胞株の中では粘液腫ウイルスの複製を促進し、ＰＣ−３などの許容性（Ｉ型）細胞株の中では僅かに促進する。ラパマイシンは、ＨＯＳ細胞のように非常に許容的な細胞に対しては効果が少ないが、それは、このような細胞株は既に粘液腫ウイルスに対して最大限許容的であるという事実による可能性が高い。ラパマイシンによる最大の効果は、制限性（ＩＩ型）細胞株（７８６−０、ＨＣＴ１１６およびＡＣＨＮ）で観察されたが、これらは、野生型ウイルスに対しては許容性があるが、ｖＭｙｘＴ５ＫＯ株に対しては非許容性である。不全型（ＩＩＩ型）細胞株であるＭＣＦ−７およびＣＯＬＯ２０５においてさえもいくらかの効果が見られたが、不全型細胞株Ｍ１４では見られなかった。
【０１４５】
次に、ＢＧＭＫおよび７８６−０の感染細胞の試料を回収して溶解し、単離したウイルスを用いて、ＢＧＭＫ細胞の単層を感染させた（図３０）。Ｘ−Ｇａｌ染色を用いて、ウイルス感染した細胞を可視化した。
【０１４６】
粘液腫ウイルス感染に対して「制限的」な腫瘍細胞、すなわち、野生型粘液腫ウイルスの複製は許容するが、ＭＴ−５ノックアウトウイルスの複製は許容しない細胞をラパマイシンで処理すると、粘液腫ウイルスが、腎臓癌、結腸癌、および卵巣癌の細胞株を含む癌細胞株において複製する能力を回復する結果となった（図２９および３０）。
【０１４７】
さらに、ラパマイシンで処理すると、野生型ウイルスがこれらと同じ細胞の中では複製する能力は増強されたが、対照であるウサギ細胞または霊長類細胞では増強されなかった。これらの結果は、ラパマイシンが粘液腫ウイルスの感染を促進するように作用することを示している。また、ラパマイシンは、このウイルスに感染されにくい癌細胞がウイルス複製を許容する能力に影響を与えると考えられる。
【０１４８】
その後の実験で、野生型粘液腫ウイルスの感染を支持することができなかったヒト腫瘍細胞に対するラパマイシン処理の効果を調べた（図３１）。この事前処理は、対照である霊長類細胞や正常なヒト線維芽細胞に対してほとんど効果を示さなかったが、乳癌細胞株ＭＣＦ−７など、いくつかの細胞株におけるウイルスの感染力を増強することができた。ヒト腫瘍細胞のいくつかが、対照細胞株と同じように、ラパマイシン処理に対して抵抗性のままであったため、ラパマイシン処理によって、粘液腫ウイルスが、非形質転換組織に増殖性感染できるようになったとは考えにくい。
【０１４９】
（実施例３：改良型腫瘍退縮性ウイルス候補としての粘液腫ウイルスＭ１３５ＫＯ変異型。）
（Ｍ１３５Ｒは、初期遺伝子として粘液腫ウイルスから発現される）
粘液腫ウイルスは、ＭＶゲノムの配列決定から同定されたタンパク質（Ｍ１３５Ｒ）をコードし（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２６４： ２９８−３１８）、宿主のＩＦＮα／β受容体を模倣し、ＩＦＮα／βが宿主の抗ウイルス応答を開始させないようにしていると予測されている （Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００１） １３：７３−８４）。この予測は、そのような免疫回避戦略を採ることが明らかになっている（Ｓｙｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ （１９９５） ８１ ：５５１−５６０）ワクシニアウイルス（Ｂ１８Ｒ）に由来するウイルスＩＦＮα／β受容体のホモログに対する配列相同性に基づいている。しかし、Ｍ１３５Ｒは、ＶＶＢ１８Ｒ、およびその他配列決定されたポックスウイルス由来のＩＮＦα／β−Ｒ相同体の大きさの半分しかないため、すべての場合で、ポックスウイルスＩＦＮα／β−Ｒの相同体のアミノ末端側の半分だけにしかアラインメントされない。図３２は、ＭＶのＭ１３５ＲとＶＶのＢ１８Ｒの間で予測された構造および配列の類似性を示している。Ｂ１８Ｒの最初の１７９アミノ酸残基だけが、配列アラインメントで示されている。表２は、Ｍ１４５Ｒと、表示されたポックスウイルスＩＦＮα／β−Ｒの相同体との一致率（％）を示している。対角線の上の数字は、一致率（％）を表し、対角線の下の数字は、２つの種間における類似性（％）を表している。上部を横切る括弧内の数字は、推定されたタンパク質のアミノ酸数を表している。予測されたＭ１３５Ｒ（１７８アミノ酸）の全長コピーと各相同体の最初の１７８残基だけの間で比較を行った。
【０１５０】
（表２ Ｍ１３５Ｒと他のポックスウイルス相同体との比較）
【０１５１】
【表２】
Ｍ１３５Ｒの推定免疫原領域に対するペプチドを合成して、ウエスタンブロット解析、免疫沈殿、および免疫蛍光法で使用したポリクローナル抗体をウサギの中で作製した。免疫ブロッティングによって、Ｍ１３５Ｒが、感染後早くも３時間でその発現を検出できる初期遺伝子として合成されていることを確認した（図３３Ａ；レーン１：模擬感染ＢＧＭＫ細胞；レーン２〜６：それぞれ感染後０、３、６、１８、および３６時間目のｖＭｙｘＬａｕに感染したＢＧＭＫ細胞）。感染細胞をＡｒａＣで処理すると、Ｍ１３５Ｒの合成は、後期のタンパク質発現を阻害しても変化することがないため、これは初期遺伝子であることが示される（図３３Ｂ）。しかし、ツニカマイシンで処理すると、おそらく、配列から予測された単一の部位で、Ｍ１３５ＲはＮ結合型グリコシル化されていることが示される（図３３Ｂ）。モネンシン処理によって、Ｏ結合型グルコシル化は存在しないことが示唆されている。図３３に示されている結果について、ＢＧＭＫには、ｍｏｉ１０で粘液腫ウイルスを感染させた。４０μｇ／ｍｌの濃度のＡｒａＣ、１μｇ／ｍｌのツニカマイシン、および１μｇ／ｍｌのモネンシンで、表示された時間に細胞を処理したか、処理しなかった。ペプチド抗体を用いてＭ１３５Ｒを検出した。
【０１５２】
（Ｍ１３５Ｒはシグナル配列をコードするが分泌されない）
Ｍ１３５Ｒの配列解析によって、推定シグナル配列が存在することが示されている（図３２Ｂ）。しかし、カルボキシ末端には膜貫通ドメインと推定されるものもある（図３２Ｂ）。感染ＢＧＭＫ細胞から得た上清の免疫ブロットは、Ｍ１３５Ｒが分泌されないことを示している。しかし、Ｍ１３５Ｒは、全細胞溶解液の中で簡単に検出される（図３３）。シグナル配列が、Ｍ１３５Ｒを細胞表面に追いやるよう機能したか否かを調べるために、本発明者らは、膜貫通ドメインを欠失させ、この変異体をバキュロウイルス発現系にクローニングした。Ａｃ１３５ＲとＡｃ１３５ΔＴＭに感染した上清を比較したところ、全長のＭ１３５Ｒが細胞溶解液中に見られ、分泌された証拠はない。これに対し、Ａｃ１３５ΔＴＭは分泌され、シグナル配列がＭ１３５Ｒを細胞外環境に追いやるよう機能していることが確認できる（データは示さず）。
【０１５３】
（Ｍ１３５Ｒタンパク質は、感染細胞の表面に局在する）
Ｍ１３５Ｒが機能的なシグナル配列と膜貫通ドメインをもつという観察結果から、本発明者らは、急いでＭ１３５Ｒの局在を調べた。２つの証拠が、Ｍ１３５Ｒが細胞表面に局在することを示している。まず、ＢＧＭＫをカバーガラスの上に播種して、２４時間ｖＭｙｘＬａｕ（ｍｏｉは１０）に感染させると、アフィニティー精製された抗Ｍ１３５Ｒ、次いでＦＩＴＣ結合二次抗体による免疫染色でＭ１３５Ｒが検出された（図３４Ａ）。Ｍ１３５Ｒの染色パターンは、感染した細胞の細胞表面への局在を示している。ｖＭｙｘＬａｕは、β−ｇａｌ遺伝子やＥＧＦＰ遺伝子の挿入によって改変されていない真正な粘液腫ウイルスの野生型である。
【０１５４】
第二の証拠は、Ｍ１３５Ｒが、ｖＭｙｚｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯのどちらかに感染したＧＨＯＳＴ細胞の細胞表面タンパク質のビオチン化に付随することである。感染後２４時間で細胞溶解液を調製した。ストレプトアビジンアガロースビーズを、細胞溶解液から得た全細胞タンパク質５００μｇと４５分間混合した。このビーズを洗浄して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離してから、抗Ｍ１３５Ｒでプローブした。感染した細胞の溶解液から得た５０μｇの全細胞タンパク質を対照として泳動した。ビオチン化した表面タンパク質を免疫沈殿すると、ｍ１３５Ｒが感染した細胞の表面に存在することが示される（図３４Ｂ）。
【０１５５】
（Ｍ１３５Ｒはインビトロにおける粘液腫ウイルスの複製に必須ではない）
Ｍ１３５Ｒが病原性因子として作用することができるかを調べるために、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒを欠失し、ＶＶ早期／後期プロモーター下でＥＧＦＰおよびｇｐｔをコードするカセット（４６０ヌクレオチド、すなわちｏｒｆの８６％が欠失している）で置換されている組換えウイルスを構築した。クローニング法およびカセットを図３５Ａに示す。ＥＧＦＰを発現するウイルスクローンを選択して、組換体をプラーク精製した。組換体の精製度をＰＣＲで確認した（図３５Ｂ；レーン１は１Ｋｂ＋ＤＮＡラダー、レーン２および３は、２つの精製ｖＭｙｘ１３５ＫＯクローンからのＰＣＲ産物。ＰＣＲ産物は、Ｍ１３５Ｒのコード領域が欠失されて、ＥＧＦＰ／ｇｐｔマーカーが挿入されている領域を表している。レーン２はプラーク１であり、レーン３はプラーク２である。レーン４は、同じ領域を示し、本来の切断されていないＭ１３５Ｒ遺伝子座をカバーしている）。ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯのいずれかに感染したＢＧＭＫ細胞の免疫ブロッティングによって、ｖＭｙｘ１３５ＫＯがＭ１３５Ｒ発現を失ってしまったことが確認された（図３５Ｃ；Ｍ１３５Ｒの発現の経時変化：レーン１は未感染のＢＧＭＫ細胞。レーン２〜６は、感染後０時間（レーン２）、３時間（レーン３）、６時間（レーン４）、１８時間（レーン５）、および３６時間（レーン６）における、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染したＢＧＭＫ細胞を示している。レーン７および８は、感染後６時間（レーン７）および１８時間（レーン８）における、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染したＢＧＭＫ細胞を示している。レーン９は、ＡｃＮＰＶで発現するＭ１３５Ｒをもつ陽性対照である）。
【０１５６】
一段階増殖曲線を用いて、ｖＭｙｘ１３５ＫＯがＢＧＭＫ細胞の中で複製できるかを調べた。ＢＧＭＫ細胞を、ｍｏｉ５でｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させ、表示された時間に細胞を回収した。ウイルスの力価をＢＧＭＫ細胞上で測定した。ｖＭｙｘｇｆｐとｖＭｙｘ１３５ＫＯの間で複製パターンの違いはなかった（図３６）。これらの結果は、Ｍ１３５Ｒがインビトロでの複製には必要でないことを示している。
【０１５７】
粘液腫ウイルスの別の遺伝子が、ウサギの初代胚線維芽細胞（ＲＥＦ）における粘液腫ウイルスの複製に影響できないかを調べた本発明者らの実験の際に、ノックアウト対照としてｖＭｙｘ１３５ＫＯを用いたが、奇妙な現象を観察した。ＲＥＦにｖＭｙｘｇｆｐを感染させると、正常な感染病巣が生じたが、ｖＭｙｘ１３５ＫＯは、感染のプラーク様ゾーンを生じさせた（図３７）。本発明者らが、この表現型を確認するために別の細胞を調べたとき、別のウサギ線維芽細胞（ＨＩＧ−８２、図３８）およびヒト初代線維芽細胞（ｃｃｄ９２２−ｓｋ、図３９）では、プラーク形成を反復させることができた。
【０１５８】
（Ｍ１３５Ｒはウサギにおける病原性に対する重大な病原因子である）
次に、本発明者らは、ｖＭｙｘ１３５ＫＯが実験用ウサギの中で粘液腫を発生させることができるかを調べた。ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘｇｆｐを感染させて、感染後９から１０日の安楽死させなければならない動物とは対照的に、ｖＭｙｘ１３５ＫＯを注射されたウサギは完全に回復した（表３）。Ｍ１３５Ｒの消失がｖＭｙｘ１３５ＫＯの弱毒化をもたらすことを確認するために、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒが回復された復帰変異体ウイルスを作製し、この復帰変異体（ｖＭｙｘ１３５ＲＥＶ）が、粘液腫を生じさせる能力を回復することができるかを調べた。４つのウサギの処理グループはすべて、各ウイルスを注射してから最初の６日間は同じように応答した（表３）。本発明者らは、感染後４日目までは、すべての処理グループで、注射した部位に大きく赤い盛り上がった病変部ができるのを観察した。しかし、６日目に始まり、その後引き続き３〜４日間にわたって、さまざまなウイルスの間の違いが明らかになった。野生型または復帰変異型ウイルスを注射した動物は、耳、眼、および鼻に、ｖＭｙｘ１３５ＫＯを注射した動物には見られなかった数多くの二次的病変部を持っていた（表３）。本発明者らは、動物モデルにおいて、Ｍ１３５Ｒの消失は劇的にＭＶを弱毒化すると結論づけ、Ｍ１３５Ｒが重大な病原因子であることを示している。
【０１５９】
（表３ 野生型対照と比較したときのｖＭｙｘ１３５ＫＯの病原性）
【０１６０】
【表３】
実験前の３日間、ウサギの体温を毎日測った。これを動物の基礎体温と見なした。実験の間中、各動物の体温を毎日測り続けた。しかし、処理グループ間に体温の違いはなかった（図４０）。これは、Ｍ１３５Ｒが、感染動物の発熱反応に関与していないことを示唆するものである。
【０１６１】
（Ｍ１３５ＲはウサギＩＦＮα／βに結合または阻害しない）
Ｍ１３５Ｒの配列は、ＩＦＮα／β受容体の模倣体であるワクシニアＢ１８Ｒに類似している。本発明者らは、Ｍ１３５Ｒがウサギの１型ＩＦＮに結合できるかを調べた。まず、ウサギＩＦＮ（５μｇ、ヨードビーズを用いて）をヨウ素化して、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染した細胞が、ｖＭｙｘｇｆｐを（ｍｏｉ１０で）感染させた細胞と比較して、１２５Ｉ−ウサギＩＦＮに結合できるかを調べた。細胞を回収して、洗浄し、ガンマ線計測装置で計測した。Ｍ１３５Ｒの欠失は、感染細胞へのＩＦＮα／βの結合に影響せず、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞のいずれかの細胞表面に結合しているＩＦＮの量に差異は見られなかった（図４１）。また、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞を外来性のウサギ１型ＩＦＮで処理しても、ｖＭｙｘ１３５ＫＯによる細胞への感染には影響を与えなかった（図４２；細胞を１２穴培養皿に播種し、表示されたウイルスにｍｏｉ０．０１で感染させた；感染後７２〜９６時間目に蛍光巣の数を数えた；２００ユニットのウサギＩＦＮα／βを、感染させる２４時間前に添加するか、細胞を処理しなかった）。この同じ結果が、感染させる２４時間前に事前処理して、細胞の中で抗ウイルス状態を誘導したときにも見られた。ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞のいずれかで感染後に形成される巣に顕著な違いがあることに気づかなかった（データは示さず）。また、この現象は、細胞をヒトＩＦＮＡ／Ｄで処理した場合にも当てはまる（データは示さず）。また、Ａｃ１３５ΔＴＭの上清を、ＢＩＡｃｏｒｅチップに付着させたウサギＩＦＮα／βに適用すると、結合を全く観察できなくなった（データは示さず）。
【０１６２】
（実施例３：粘液腫ウイルス感染に関連してｍＴＯＲを阻害することの分子的影響）
ラパマイシンが粘液腫ウイルス感染を促進するＩＩ型癌細胞株である７８６−０細胞の細胞溶解液を用いてウエスタンブロット解析を行った（図４３）。ｖＭｙｘＬａｃまたはｖＭｙｘＴ５ＫＯのいずれかをＭＯＩ３で感染させたか、ウイルス感染させないままで１６時間経過した後に溶解液を回収した。表示したレーンには、感染前６時間２０ｎＭのラパマイシン（Ｒと命名）、または適当な賦形剤対照（ＤＭＳＯを１：５０００で希釈したもの、Ｄと命名）で事前処理した細胞からのタンパク質を含む。表示したタンパク質に対する一次抗体を用いてブロットをプローブした。
【０１６３】
実証されたように、粘液腫ウイルス感染は、ラパマイシンの生理学的標的であるｍＴＯＲに収束する多くのシグナル伝達経路に影響を与える。ラパマイシンがウイルス複製に大して有利な効果をもつ、野生型ウイルス（ｖＭｙｘＬａｃ）またはＭＴ−５欠損型ウイルス（ｖＭｙｘＴ５ＫＯ）のいずれかによる感染に関しては、ラパマイシン単独処理に基づいては予測しえなかった広範囲の効果が、これらのシグナル伝達分子の多くで見られた（模擬感染レーンを参照）。これらの効果には、ＡＫＴ−１、Ｒａｆ−１、ＧＳＫ−３β、およびｍＴＯＲ自身のキナーゼ活性が増加すること、ならびにＰＴＥＮおよびｐ７０Ｓ６Ｋのキナーゼ活性が低下することが含まれる。このデータは、これらの経路が、ヒト癌細胞株における粘液腫ウイルスの許容性に関与している可能性を示している。
【０１６４】
当業者には理解できるように、本明細書に記載した例示的な実施態様に多くの変更を加えることが可能である。それどころか、本発明は、請求項に記載されているように、そのような変更もすべてその範囲に含もうとするものである。
【０１６５】
本発明のさまざまな実施態様が本明細書に開示されているが、当技術分野における技術常識に従って、多くの適応および変更を本発明の範囲内で行うことができる。そのような変更には、同じ結果を実質的に同じ方法で得るために、本発明の何らかの態様について同等物であることが知られているものと置換することを含む。本明細書で使用される科学技術用語はすべて、別段の記載がない限り、本発明の技術分野における当業者に広く理解されている意味と同じ意味を有する。
【０１６６】
本明細書で引用されている参考文献はすべて参照されて、全部が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
図面は、本発明の実施態様が具体的に説明されているが、あくまで例示のためのものである。
【図１】細胞にウイルスが感染すると誘導される、インターフェロンによって誘導抗ウイルスシグナル伝達スキームの概略図である。
【図２】粘液腫ウイルスに曝露された後の非許容性の野生型マウス胎仔線維芽細胞（「ＭＥＦ」）の位相差顕微鏡写真であり、インターフェロンα／βを中和抗体で阻害した後にＭＥＦ細胞が許容性になることを示している。
【図３】粘液腫ウイルス感染後のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化（活性化）状態を示すウエスタンブロットであり、ＭＥＦ細胞への非許容感染（ｎｏｎｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化と関連することを示している。
【図４】粘液腫ウイルス感染後のＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５およびＳＴ６のリン酸化（活性化）状態を示すウエスタンブロットであり、ＭＥＦ細胞への非許容感染は、これらの分子種のいずれも活性化しないことを示している
【図５】粘液腫ウイルス感染後のＩＮＦα／β Ｒ−／−型ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−型ＭＥＦの位相差顕微鏡写真であり、ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＪＡＫシグナル伝達の不活性化は、細胞を粘液腫ウイルスに対して許容性にすることを示している。
【図６】粘液腫ウイルス感染後の非許容性野生型ＭＥＦにおけるＰＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、ＰＲＫは粘液腫ウイルス感染によって活性化されないことを示している。
【図７】模擬感染したか、粘液腫ウイルスに前感染した野生型ＭＥＦにおけるＰＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、粘液腫ウイルスが、ＭＥＦ細胞におけるＰＫＲ活性化を阻止することを示している。
【図８】粘液腫ウイルス感染後の野生型ＭＥＦにおけるＰＥＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、粘液腫ウイルスが、ＭＥＦ細胞におけるＰＥＫＲの活性化を阻止することを示している。
【図９】粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−という三重のノックアウトの位相差顕微鏡写真であり、ＭＥＦ細胞における抗ウイルス状態は別の経路によってもたらされていることを示している。
【図１０】粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−の三重ノックアウトの位相差顕微鏡写真である。
【図１１】ＩＮＦα／βに対する中和抗体で処理した後、および粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅ Ｌ−／−、およびＭｘ１−／−という三重のノックアウトの位相差顕微鏡写真である。
【図１２】ＩＮＦα／βに対する中和抗体で処理した後、および粘液腫ウイルスに曝露した後の非許容性ＭＥＦにおけるｅＩＦ２αおよびＰＫＲのリン酸化レベルを示すウエスタンブロットであり、非応答性細胞におけるｅＩＦ２αのリン酸化は、ＰＫＲ非依存的経路によって触媒されることを示している。
【図１３】粘液腫ウイルス感染後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−三重のノックアウトにおけるＳＴＡＴ１のリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、正常なＩＦＮ誘導シグナル応答を示している。
【図１４】感染１２時間後の非許容性ＰＫＲ−／−＋ＲＮａｓｅＬ−／−＋Ｍｘ１−／−細胞におけるチロシンリン酸化型ＳＴＡＴ１の細胞内の局在を示す位相差顕微鏡写真であり、正常なＩＦＮ／ＳＴＡＴシグナル応答で予測されたように、活性化されたＳＴＡＴ１は核に局在することを示している。
【図１５】模擬感染させたか、ＧＦＰを発現する死菌または生菌の粘液腫ウイルスに感染させた、頭蓋骨内に神経膠腫を有するヌードマウスの脳の蛍光画像であり、粘液腫ウイルスが神経膠腫細胞を標的とすることを示している。
【図１６】ＧＦＰを発現する粘液腫ウイルスに感染したマウスの薄層切片の蛍光画像および写真であり、粘液腫ウイルスが腫瘍細胞だけで複製することを示している。
【図１７】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＨＴ２９ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における非許容感染の例を示すものである。
【図１８】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＨＯＰ９２ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図１９】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＯＶＣＡＲ４ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図２０】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＳＫ−ＭＥＬ３ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図２１】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＳＫ−ＭＥＬ２８ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における半許容感染の例を示すものである。
【図２２】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＢＧＭＫ細胞の位相差顕微鏡写真であり、典型的な許容性対照感染の例を示すものである。
【図２３】ＬａｃＺタンパク質を発現する粘液腫ウイルスの高濃度液を感染させた陽性対照ＢＧＭＫ細胞、およびヒト腫瘍細胞株Ｕ８７、Ａ１７２、およびＵ３７３を、Ｘ−Ｇａｌで染色したものの位相差顕微鏡写真であり、これらのヒト神経膠腫はすべて、粘液腫ウイルスの複製に対して許容性であったことを示している。
【図２４】高濃度の粘液腫ウイルスに感染させたＢＧＭＫ、Ｕ８７、Ａ１７２、およびＵ３７３の各細胞の感染７２時間後の生存率を示す図であり、粘液腫ウイルスがこれらの細胞をすべて死滅させることができることを示している。
【図２５】ＭＶ ＧＦＰに感染させたＳＦ０４ １５８５星状細胞腫細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光画像であり、初代ヒト神経膠腫細胞で感染が起きたことを示している。
【図２６】ＬａｃＺタンパク質を発現する粘液腫ウイルスに感染させたＵ３７３神経膠腫細胞をＸ−Ｇａｌで染色したものの位相差顕微鏡写真であり、これらのヒト腫瘍細胞で感染が起きたことを示している。
【図２７】ＭＶ ＧＦＰに感染させたＳＦ０４ １５８５細胞の感染４８時間後の生存率を示す図であり、これらの感染ヒト腫瘍細胞が死滅したことを示している。
【図２８】ＧＦＰを発現する粘液腫ウイルスに感染させたＤａｏｙ髄芽細胞およびＤ３８４髄芽細胞の蛍光顕微鏡写真であり、これらのヒト腫瘍細胞で感染が起きたことを示している。
【図２９−１】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−２】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−３】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−４】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−５】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図３０】ｖＭｙｘＬａｃまたはｖＭｙｘＬａｃＴ５−のいずれかに感染させたウイルス感染細胞株の写真である。
【図３１−１】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３１−２】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３１−３】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３２】（Ａ）粘液腫ウイルスタンパク質Ｍ１３５Ｒおよびワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒのアラインメントの略図である。（Ｂ）Ｍ１３５Ｒと、Ｂ１８Ｒの最初の１７９アミノ酸のアミノ酸配列アラインメントである。
【図３３】（Ａ）粘液腫ウイルスのローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株（ｖＭｙｘＬａｕ）に感染させたＢＧＭＫ細胞で発現したＭ１３５Ｒのウエスタンブロット。（Ｂ）ｖＭｙｘＬａｕに感染させ、ａｒａＣ、ツニカマイシン、またはたモネンシンで処理したＢＧＭＫ細胞で発現したＭ１３５Ｒのウエスタンブロット。
【図３４】（Ａ）模擬感染させたか、粘液腫ウイルスに感染させ、Ｍ１３５Ｒについて染色したＢＧＭＫ細胞の蛍光画像。（Ｂ）野生型粘液腫ウイルス（ｖＭｙｘｇｆｐ）またはＭ１３５Ｒノックアウト株（ｖＭｙｘ１３５ＫＯ）に感染させた細胞の免疫沈殿物または細胞可溶化物に対する、抗Ｍ１３５Ｒ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図３５】（Ａ）ｖＭｙｘ１３５ＫＯを作出するためのクローニング法の概略図。（Ｂ）ＰＣＲ挿入配列産物のアガロースゲル。（Ｃ）野生型粘液腫ウイルスおよびＭ１３５Ｒノックアウト粘液腫ウイルスに感染させた細胞のウエスタンブロット。
【図３６】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたＢＧＭＫ細胞におけるウイルス増殖巣の増殖曲線である。
【図３７】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギ胚線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図３８】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギＨＩＧ８２線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図３９】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたヒト初代線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図４０】ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギの体温のグラフである。
【図４１】模擬感染させたか、またはｖＭｙｘｇｆｐもしくはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させ、１２５Ｉで標識したウサギインターフェロンα／βで処理した細胞の１２５Ｉ放射のグラフである。
【図４２】感染させる２４時間前にウサギインターフェロンα／βで処理するか、無処理のままで、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞にｖＭｙｘｇｆｐもしくはｖＭｙｘ１３５ＫＯを感染させることによって形成された増殖巣のグラフである。
【図４３】２０ｎＭラパマイシン（Ｒ）、または賦形剤対照（Ｄ）で予め処理した７８６−０ヒト癌細胞の細胞可溶化物を用い、図に示したタンパク質に対する抗体を用いてプローブ検索したウエスタンブロットの写真である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６５８，８１６号（２００５年３月７日出願）の優先権を主張し、その内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、粘液腫ウイルスとラパマイシンの治療的利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
さまざまな種類の癌を治療するために使用される現在の治療法は、癌細胞を毒殺または死滅させることによって効果を発揮するというものになりがちである。残念なことに、癌細胞に対して毒性のある治療法は、健常な細胞にも有毒になりがちである。さらに、腫瘍の異質性が、依然として有効な癌治療が得られないことの主な理由の一つとなっている。化学療法や放射線療法など、現在主流の治療法は、狭い治療毒性濃度域内で使用されがちである。多様な種類の腫瘍細胞があり、これらの治療法を行うことができる濃度域が限られているため、この種の療法は、切れ味の鈍い手段と見なされている。
【０００４】
現在開発中の新しい抗癌療法は、腫瘍細胞を選択的に標的とする一方で、健常な細胞に対する毒性をより低くして、健常細胞が影響を受けないままでいる可能性をより高くしようと試みている。
【０００５】
腫瘍退縮性ウイルス療法が、腫瘍細胞と正常細胞との細胞間の違いを利用することを目的とする方法の一つである。この療法は、複製能のある腫瘍選択的なウイルスベクターを抗癌剤として使用する。腫瘍退縮性ウイルスは、感染のために癌細胞を特異的に標的するか、または、正常細胞よりも癌細胞において効率的に複製するのに適している。これら複製能のある腫瘍退縮性ウイルスは、不均一な腫瘍集団を標的する非常に選択的かつ強力な手段となる天然または遺伝子操作されている。複製選択的な腫瘍退縮性ウイルスは、正常な細胞では効率的に複製しないため、特に、放射線療法や化学療法のような伝統的な療法と比較して患者に対する毒性が低いはずである。
【０００６】
数多くの研究で、さまざまなウイルス株について腫瘍退縮活性が報告されているが、最も有望な腫瘍退縮性ウイルスは、天然または遺伝子改変されたアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（「ＨＳＶ１」）、レオウイルス、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス（「ＶＳＶ」）、またはポリオウイルスである。抗癌剤として現在検討されている改変型腫瘍退縮性ウイルスは、ＨＳＶ、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）、レオウイルス、およびワクシニアウイルス、麻疹、ＶＳＶ、およびポリオウイルスなどである。さまざまな腫瘍退縮性ウイルスが、第一相および第二相で臨床試験されており、いくつかは持続した効能を示している。しかし、どのウイルスが、持続的複製、特異的かつ強力な退縮活性という目標をもっともよく達成するかは分かっていない。腫瘍退縮性ウイルスベクターの完全に効率的な候補は、生活環が短く、すぐに成熟したビリオンを形成し、細胞から細胞へ効率的に伝播し、すぐに挿入可能なゲノムをもつものである。その上、初期の先天的な免疫応答を阻害し、Ｔｈ１応答の発達を遅延させることが、腫瘍退縮療法の有効性にとって重要なことが、証拠によって示唆されている。腫瘍退縮性ウイルスの開発用に想定されているウイルスの多くに対して正常な集団で見られる大量の抗体およびＴ細胞反応から見て、ヒトのウイルスが非常に免疫原性であることは明らかである。
【０００７】
臨床実験によって、現在の腫瘍退縮性ウイルスは実際に安全であるが、単剤療法として臨床上十分に有効であるとするほど強力でではない。腫瘍細胞への不十分または不効率な感染が普通に見られるため、現在の動きは、候補ウイルスの効率を上げるために、それらを遺伝子操作して治療用の導入遺伝子を発現させることによりそれらを武装させようとするものである。上記した腫瘍退縮性ウイルスのほとんどは、他の一般的な腫瘍退縮療法と組み合わせてテストされている。
【０００８】
アデノウイルスは、容易に遺伝子操作することができ、よく知られた関連するウイルスタンパク質機能を持っており、また、非常に軽度の病態に関連している。ＯＮＹＸ−０１５ヒトアデノウイルス（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）は、最も広範に試験されている。臨床使用用に最適化された腫瘍退縮性ウイルスであり、ｐ５３陰性腫瘍の中で選択的に複製すると考えられて、頭頸部癌患者での臨床試験において可能性を見せている。しかし、報告によれば、ＯＮＹＸ−０１５は、治療した患者の１４％で客観的な臨床反応を示しているにすぎない（非特許文献１）。
【０００９】
特許文献１と特許文献２は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、神経細胞に特異的な変異型腫瘍退縮性ＨＳＶを記載している。さらなる利点は、ＨＳＶは簡単に遺伝子改変することができ、不要なウイルス増殖を止める薬剤が存在していることである。しかし、一般の集団はこのウイルスに曝露されて免疫反応を獲得していて、このウイルスの腫瘍退縮効果が弱まっていると考えられるため、このような普遍的ヒト病原体の使用には限界がある。また、ＨＳＶは、重大な副作用または死に至る可能性がある病気を引き起こす可能性もある。
【００１０】
ＩＩＩ型レオウイルスは、比較的軽度な病気と関連し、そのウイルス遺伝子の機能がかなり十分に理解されている。ＩＩＩ型レオウイルスは、変異型ｒａｓ発癌遺伝子を発現する細胞において増進された複製特性を示し、かつＰＫＲ −／−細胞の中で選択的に増殖する癌治療剤として、現在、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ社によって開発されているところである（非特許文献２）。しかし、レオウイルスは、遺伝子操作することが難しく、そのウイルス複製を簡単に止めることができない。
【００１１】
ＶＳＶは、比較的軽度な病気に関連しており、よく知られたウイルス遺伝子機能をもっている。ＷＯ９９／０４０２６には、さまざまな疾患に広く治療効果を表すためにＶＳＶをベクターとして遺伝子治療法に使用することが記載されている。しかし、ＶＳＶは、遺伝子操作が困難であり、また、そのウイルス複製を簡単に止めることができないという点で、レオウイルスと同じ問題を抱えている。
【００１２】
ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスは、当技術分野において記載のある別の腫瘍退縮性ウイルス候補であるが、重大であるか、または死に至る可能性がある病気と関連している。
【００１３】
特許文献３は、ヒト腫瘍細胞に対してガンマインターフェロンとＩＦＮγの断片を使用することを開示している。特許文献４は、病気の細胞がインターフェロンが介在する抗ウイルス応答に欠損をもつヒトの病気を治療する方法であって、治療上有効な量のインターフェロン感受性で複製能をもつクローンウイルスをヒトに投与することを含む方法を開示している。具体的には、ＶＳＶ粒子が腫瘍細胞に対して毒性活性を有するが、インターフェロン存在下では、正常細胞においてＶＳＶによる細胞毒性の改善が起こることを開示している。また、特許文献４は、インターフェロン処理された腫瘍細胞でＮＤＶに誘導された感受性が見られたが、正常な細胞にインターフェロンを加えると、これらの細胞はＮＤＶに対して抵抗性になることも開示している。この方法は、細胞にインターフェロン感受性のウイルスを感染させることによって、それらをインターフェロン感受性にすることを目的としている。
【特許文献１】国際公開第９６／０３９９７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／２６９０４号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４，８０６，３４７号明細書
【特許文献４】国際公開第９９／１８７９９号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，Ｋｈｕｒｉ Ｆ，Ｇａｎｌｙ Ｉ５ Ａｒｓｅｎｅａｕ Ｊ，Ｐｏｓｎｅｒ Ｍ，Ｖｏｋｅｓ Ｅ，Ｋｕｈｎ Ｊ，ＭｃＣａｒｔｙ Ｔ，Ｌａｎｄｅｒｓ Ｓ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ Ａ，Ｒｏｍｅｌ Ｌ，Ｒａｎｄｌｅｖ Ｂ，Ｋａｙｅ Ｓ，およびＫｉｒｎ Ｄ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ，２００１年１月１５日，第１９巻，第２号，ｐ．２８９−９８
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｎｇ Ｊ．Ｅ．およびＰ．Ｗ．Ｌｅｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６年，第７０巻，ｐ．６１２−６１６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、機能的なＭ１３５Ｒタンパク質を発現しない新規の粘液腫ウイルスを含む、ウサギ粘液腫ウイルスが、インターフェロンに対して非反応性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した、ヒト腫瘍細胞などの細胞に選択的に感染することができ、このような感染が、薬剤であるラパマイシンで前記細胞を処理することにより促進されるという予想外の発見に基づいている。これと関連して使用される場合、「先天的」という用語は、非抗原特異的な免疫反応を表している。粘液腫ウイルスは、正常なヒト細胞では効率的に複製できないため、インターフェロンに対して非感受性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を特徴とするさまざまな疾患および症状に対する治療法として、例えば、癌に対する腫瘍退縮治療法として、このウイルスを使用することができる。また、このウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を同定するため、また、これらの細胞をインビボで画像化するために使用することもできる。
【００１５】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、粘液腫ウイルスとラパマイシンを組み合わせたものの有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に粘液腫ウイルスとラパマイシンを組み合わせたものの有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、および、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造するための、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの合剤の使用をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するため、および患者におけるそのような病状を治療するための薬剤を製造するための、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの合剤の使用をさらに提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルスとラパマイシンを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために役立つことができる。
【００２０】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルス、ラパマイシン、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための説明書を含むキットを提供する。この病状は、癌および慢性ウイルス感染症を含む。
【００２１】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、細胞集団を、粘液腫ウイルスとラパマイシンの混合物に曝露すること、ウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染させること、および細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを決定することを含む方法を提供する。
【００２２】
本発明は、さらに、ウサギ粘液腫ウイルスタンパク質Ｍ１３５Ｒが、ウサギにおける免疫応答を誘発するのに関与していること、および機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス株は、インビトロで細胞を死滅させることができるが、動物では粘液腫症を引き起こさないという予想外の発見に基づいている。このようなウイルス株は、薬剤であるラパマイシンと併用して投与される治療法など、インターフェロンに対して非感受性の細胞を含む、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理するために使用することができ、ウイルスの混入を増加させる必要がないため、安全性を向上させる結果となる。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
一つの態様において、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するために、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造する際に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して使用することをさらに提供する。
【００２６】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するために、および患者におけるそのような病状を治療するための薬剤を製造する際に、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量を、任意には、有効量のラパマイシンと併用して使用することをさらに提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するか、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする患者の病状を治療するのに役立ちうる。この医薬組成物は、ラパマイシンをさらに含むことができる。
【００２９】
別の態様において、本発明は、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス、および先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための説明書を含むキットを提供する。このキットは、さらにラパマイシンを含むことが可能である。この病状は、癌および慢性ウイルス感染症を含む。
【００３０】
本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、細胞集団を、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスに、任意にはラパマイシンとの混合物に曝露すること、ウイルスを、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染させること、および細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを決定することを含む方法を提供する。
【００３１】
以下の発明の具体的態様の説明を、添付の図面とともに検討すれば、本発明のその他の態様および特徴が当業者に明らかとなろう。しかし、当然ながら、本発明の主旨と範囲に含まれる多様な改変および修正が、詳細な説明から当業者に明らかとなるのであるから、詳細な説明および具体的実施例は、本発明の好適な実施態様を示しつつも、例示のためだけに提示されていると理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（詳細な説明）
これまでに、本発明者らは、通常はウサギに感染するウイルスである野生型の粘液腫ウイルスが、その全体が参照されて本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００３４１に記載されているように、例えば、インターフェロンに非応答性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した、ヒト細胞などの細胞に選択的に感染して死滅させうることを発見した。粘液腫ウイルスは、正常なヒト細胞の中では効率的に複製しない。多くの病気または症状が、インターフェロンに対して応答性でない細胞、例えば、癌など、先天的な抗ウイルス応答を欠損している細胞が存在することを特徴としているため、正常な健常細胞に対する毒性が低い粘液腫ウイルスを使用して、癌を含むそのような病気および症状を治療することができる。また、慢性的に感染した細胞は、先天的な抗ウイルス応答を欠損しているため、粘液腫ウイルスを使用して、そのような細胞を治療することができる。例えば、多くのウイルスが、細胞の抗ウイルス性インターフェロン応答を阻害するように機能する遺伝子産物をコードするが、粘液腫ウイルスはそのような細胞に選択的に感染することができる。
【００３３】
粘液腫ウイルス（「ＭＶ」）は、ウサギの粘液腫症の病原因子である。ＭＶは、ＤＮＡウイルスの中で最大のポックスウイルス科のレポリポックスウイルス属に属している。ＭＶは、その自然宿主であるアメリカ大陸のワタオウサギ（Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｒａｂｂｉｔ）において良性の病気を引き起こす。しかし、それは、全身に見られるが、特に粘膜部周辺に見られる病変部を特徴とする、欧州大陸のウサギにおいては致命的な病気を引き起こす、病原性かつ宿主特異的なポックスウイルスである（Ｃａｍｅｒｏｎ Ｃ， Ｈｏｔａ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｓ， Ｃｈｅｎ Ｌ， Ｂａｒｒｅｔｔ Ｊ， Ｃａｏ ＪＸ， Ｍａｃａｕｌａｙ Ｃ， Ｗｉｌｌｅｒ Ｄ， Ｅｖａｎｓ Ｄ， ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９， ２６４（２）： ２９８−３１８； Ｋｅｒｒ Ｐ ＆ ＭｃＦａｄｄｅｎ Ｇ． Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２， １５（２）： ２２９−２４６）。
【００３４】
ＭＶは、感染細胞の細胞質の中で複製する１６３ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ大型のウイルスである（Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， Ｐ． Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ， Ｅｄｓ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２ｎｄ ｅｄ．， １９９６）。ＭＶは、宿主の免疫反応および炎症反応の下方制御ならびにウイルス感染細胞のアポトーシスに関与するとされてきた、多様な細胞結合型タンパク質および細胞分泌型タンパク質をコードすることが知られている。ＭＶは全てのヒト体細胞に取り込まれることができる。しかし、細胞が先天的な抗ウイルス応答性を持っている場合、正常なウサギ体細胞以外には、ウイルスは細胞に増殖できる形で感染することができないが、このことは、ウイルスが複製して細胞死を引き起こすことができないことを意味している。
【００３５】
インターフェロン（「ＩＮＦ」）は、多様な刺激に反応して分泌されるサイトカインのファミリーである。インターフェロンは細胞表面受容体に結合して、抗ウイルス応答、ならびに増殖阻害シグナルおよび／またはアポトーシスシグナルの誘導など、細胞応答を導くシグナル伝達カスケードを活性化させる。インターフェロンはＩ型またはＩＩ型に分類される。Ｉ型インターフェロンはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−τ、およびＩＦＮ−ωなどであり、これらはすべて単量体であるが、唯一のＩＩ型ＩＦＮはＩＦＮ−γであり、二量体である。ＩＦＮ−αの１２種の異なったサブタイプは、１４の遺伝子によって産生されるが、他のＩＦＮはすべて一遺伝子性のものである（Ａｒｄｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＩＦＮは、癌遺伝子発現を調節することによって、直接的な抗腫瘍活性を発揮する。増殖促進性癌遺伝子が過剰発現されるか、または腫瘍抑制癌遺伝子の発現が消失すると、悪性の形質転換が生じることがある。癌の発生に関係する癌遺伝子には、ｐ５３、Ｒｂ、ＰＣ、ＮＦｌ、ＷＴｌ、ＤＣＣがある。
【００３６】
粘液腫ウイルス、また、レオウイルスおよびＶＳＶなど、その他の腫瘍退縮性ウイルスは、細胞の中で複製できるようになるためには、正常な健常細胞に存在する抗ウイルス防御を迂回する必要がある。ＭＶおよびその他の腫瘍退縮性ウイルスはインターフェロン産生を誘導し、かつ、ＩＦＮ経路の抗ウイルス効果に対して、通常は感受性である。ＩＦＮの抗ウイルス応答によって生じた関連タンパク質であって、主にウイルス増殖に影響を及ぼすものはＰＫＲ、ＯＡＳシンテターゼおよびリボヌクレアーゼＬヌクレアーゼなどである。ＰＫＲはｅＩＦ２αを活性化させ、その結果、翻訳の阻害とアポトーシスの誘導をもたらす。図１にＩＦＮ応答経路の概略を示す。正常な細胞においては、ＭＶは、直接ＰＫＲおよびｅＩＦ２αによる影響を受ける。
【００３７】
抗ウイルス応答経路は、しばしば癌細胞の中で破壊されている。例えば、ＩＦＮに対する応答の低下または欠損は、形質転換または腫瘍発生の過程でしばしば生じる遺伝子欠損である。腫瘍細胞株の８０％以上がインターフェロンに応答しないか、応答低下を示す（Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ （２００３） ４： ２６３−２７５ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｃｉｔｅｄ ｔｈｅｒｅｉｎ； Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９７） ２７２（４５）：２８７７９−８５； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ． （１９９８） ９１（２）：５７０−６； Ｍａｔｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００１） ６１（５）：２２６１−６； Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ （２００４） ５（ｌ）：５１−６５）。ＰＣＴ／ＣＡ２００４／０００３４１で既に開示されているように、ＭＶはヒト腫瘍細胞などの癌細胞に感染して死滅させることができ、また、これらの細胞は先天的な抗ウイルス応答を欠損しているために、ＭＶはそれらに感染することができると、特定の理論に制約されることなく考えられている。
【００３８】
初期先天性免疫応答を阻害すること、およびＴｈｌ応答の発生を遅くすることが腫瘍退縮療法の有効性に重要であることが、証拠から示唆されている。粘液腫ウイルスは毒性ウイルスであるが、宿主特異的で宿主域が非常に狭いため、ヒトまたはマウスには感染しない。特定の理論に拘泥することなく、粘液腫ウイルスは非ヒトウイルスであるために、ヒトの既存の免疫認識と出会うはずがないと考えられる。したがって、その腫瘍退縮性ウイルスとしての可能性は、より障害をもたらしにくいため、天然のヒトウイルスよりも粘液腫ウイルスの方が、許容性腫瘍細胞により強く感染して、癌に対する有効な腫瘍退縮治療を行うことができるはずである。
【００３９】
粘液腫ウイルスの宿主域遺伝子Ｍ−Ｔ５は、粘液腫ウイルスが多くのヒト腫瘍細胞株に感染する際に決定的な役割を果たしているように見える（Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ， （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８：１０３）。このＭＴ−５遺伝子は、ウサギリンパ球において粘液腫が複製するために必要とされるアンキリン反復タンパク質をコードし、ＭＴ−５遺伝子を欠失した粘液腫ウイルスは、感受性のウサギにおいても粘液腫症を発症させることができない（Ｍｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ４３９４）。入手可能な証拠から、感染ヒト細胞の中での細胞内シグナル伝達における違いが、粘液腫ウイルスの感染および増殖複製に対して許容性のあるヒト腫瘍細胞を区別するのに決定的であることが示唆されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ， （２００３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １１： ５８７７）。
【００４０】
さらに、粘液腫ウイルスは、インターフェロンα／β受容体（「ＩＦＮα／β−Ｒ」）のアミノ末端部分に相同性を示すＭ１３５Ｒタンパク質を持っている。Ｍ１３５Ｒは、宿主の抗ウイルス応答を開始させないために、宿主のＩＮＦα／β−Ｒを模倣することが示唆されている（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００１）１３：７３−８４）。この予測は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ由来のウイルスＩＮＦα／β−Ｒとの配列相同性に基づくものであり、ワクシニアウイルス（「ＶＶ」）がそのような免疫回避戦略を採ることが実証されている。しかし、Ｍ１３５Ｒは、ＶＶＢ１８Ｒ、およびその他配列決定されたポックスウイルス由来のＩＮＦα／β−Ｒ相同体の大きさの半分しかないため、すべての場合で、相同体のアミノ末端側の半分だけにしかアラインメントされない。
【００４１】
本発明者らは、免疫蛍光法の結果はＭ１３５Ｒが細胞表面に局在していることを示唆しているにもかかわらず、Ｍ１３５ＲがＩＮＦα／βと相互作用できることを実証する試みは否定的であったことを発見した。このような結果にも関わらず、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒの欠失は、粘液腫ウイルスが宿主動物において病気を引き起こす能力を大幅に減弱させるが、一方、このような欠失をもつ粘液腫ウイルスは、野生型ＭＶとインビトロで比較すると、細胞に感染して死滅させるのに同等の効果をもつことを発見した。このように、一つの態様において、本発明は、治療を受けている患者に尋常でない封じ込めストラテジーを行う必要がなく、粘液腫ウイルスを腫瘍退縮性ウイルス治療のためのより安全な代替法として提供できるため、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスは、腫瘍退縮性の研究など、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理する上で有用であるという発見に関する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、粘液腫ウイルス感染に許容性のあるヒト腫瘍細胞において、抗癌剤であるラパマイシンが粘液腫ウイルスの感染力のレベルを高める働きをするという発見、および、ラパマイシンが存在しなければ、粘液腫ウイルスのある株の複製を制限するヒト腫瘍細胞において、ラパマイシンがあれば粘液腫ウイルスの一定の株の複製が可能となるという発見に関する。粘液腫ウイルス感染に許容性のある細胞とは、このウイルスが入り込むことができ、かつその中でウイルスが増殖的に繁殖できる細胞である。許容細胞は、タンパク質ＰＴＥＮ、ＰＤＫ、ＡＫＴ、ＧＳＫ、Ｒａｆ、ｍＴＯＲまたはＰ７０Ｓ６Ｋを含む１つ以上の経路に欠損また変異があってもよい。制限細胞は、一定の条件下でのみ粘液腫ウイルスに対して許容的であるが、その他の条件下では増殖性感染を許容しない。例えば、制限細胞は、このウイルスの野生株に許容性があるが、変異型粘液腫株、例えば、ＭＴ−５遺伝子をノックアウトされた株は増殖的に繁殖させない。別の例において、粘液腫ウイルスに対して制限的な細胞は、粘液腫ウイルス単独での増殖的な感染を許容しないかもしれないが、ラパマイシンで処理すると、同じ粘液腫ウイルスが細胞に増殖的に感染することができるようになる。非増殖性の細胞株は、粘液腫ウイルス感染に対し非許容性であって、すなわち、ウイルスは細胞に入り込むことはできるかもしれないが、細胞に増殖的に感染はしないことを意味している。
【００４３】
このように、ラパマイシンは、粘液腫ウイルスと併用すると、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に対する粘液腫ウイルスの感染力を高める。本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を処理するために、ラパマイシンを粘液腫ウイルスと併用することに関する。
【００４４】
ラパマイシンは、土壌細菌であるストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から精製された活性抗真菌化合物であることが示されている大環状ラクトンである。本明細書において、ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２と複合体を形成してｍＴＯＲを阻害することができるラパマイシン（シロリムスとも称される）およびそのアナログまたは誘導体を意味し、アナログであるＣＣＩ−７７９（細胞周期阻害剤−７７９またはラパマイシン−４２，２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−プロピオン酸とも称される）およびＲＡＤ００１（エベロリムスまたは４０−Ο−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンとも称される）などを含む。ラパマイシン、ＣＣＩ−７７９およびＲＡＤ００１は市販されており、ラパマイシンは、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔから商標Ｒａｐａｍｕｎｅという名称で購入可能である。ラパマイシンという用語は、さらに、ラパマイシンの医薬上許容される塩およびエステル、その水和物、溶媒和物、多形体、アナログまたは誘導体、ならびに、使用される過程、例えば、患者に投与されると、代謝または転換されてラパマイシンまたはそのアナログもしくは誘導体となるプロドラッグまたは前駆体も含む。
【００４５】
細胞内シグナル伝達阻害剤としてのラパマイシンは極めて特異的であり、細胞に入り込んで、ＦＫＢＰ１２として知られる細胞タンパク質に結合する。次に、ラパマイシン／ＦＫＢＰ１２複合体は特異的な細胞内標的ｍＴＯＲ（哺乳類のラパマイシン標的）に結合する。多くの癌が、Ｐ１３Ｋなどのシグナル伝達分子の過活性、または腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮの欠如から発生することが示されている。これらの分子はどちらもｍＴＯＲの上流に存在する。ｍＴＯＲは、細胞の増殖、成長、分化、遊走および生存の中心的調節因子であることが示されており、そのため、癌細胞の非制御成長を阻止する上で理想的な標的である。ラパマイシンに感受性の癌細胞株は、通常、ｍＴＯＲを介した経路の活性化の結果生じたものである。
【００４６】
ラパマイシンは、シクロスポリン治療の代替治療または補完治療として、主に臓器移植患者に使用されている。臓器移植患者において、ラパマイシン治療は、一般にシクロポリンＡまたはＦＫ５０６よりも副作用が少ない。加えて、ラパマイシン治療を受けた患者のほうが一般に、癌の発生が少なく、かつＣＭＶ（ヘルペスウイルスであるサイトメガロウイルス）の発生率が低いことが、遡及研究によって示されている。したがって、特に、ＣＭＶ複製がラパマイシンによって減少するはずであると仮定する研究を考慮すると、ラパマイシン治療によって粘液腫ウイルスの癌細胞への感染が促進されるのは意外なことである（Ｐｏｎｔｉｃｅｌｌｉによる“Ｔｈｅ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ” ｉｎ Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２００４； １７： ７６２のレビュー）。特定の理論に制限されなくても、粘液腫ウイルスが、これらの細胞の腫瘍性表現型に関係しているかもしれないｍＴＯＲ経路を介する異常なシグナル伝達を利用している可能性がある。そうであれば、ｍＴＯＲ阻害剤によってこの経路を操作することは、このウイルスにとって選択的な利益となるかもしれない。
【００４７】
このようにして、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための方法であって、このような細胞に有効量の粘液腫ウイルスを投与することを含む方法が提供される。さらなる実施態様において、このウイルスを、有効量のラパマイシンと併用して投与する。
【００４８】
この粘液腫ウイルスは、ポックスウイルスのレポリポックスウイルス属に属する、複製可能なウイルスであればよい。この粘液腫ウイルスは粘液腫ウイルスの野生株でよく、または、粘液腫のＭＴ−５ノックアウト株のように、遺伝子改変された粘液腫ウイルス株でもよい。この粘液腫ウイルスは、下記のように、機能的Ｍ１３５Ｒタンパク質を発現しない株など、ウサギにおいて弱毒化された効果を示し、その結果、病気のリスクが低くなっている株であってもよい。
【００４９】
特定の実施態様において、粘液腫ウイルスは、機能的Ｍ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスである。
【００５０】
機能的Ｍ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスは、遺伝子産物、安定型遺伝子産物、または機能的遺伝子産物が発現されないように欠失、置換または中断されたＭ１３５Ｒをコードするオープンリーディングフレームの一部または全部を持つ粘液腫ウイルスを含む。このようなウイルスは、Ｍ１３５Ｒをコードする遺伝子からタンパク質が発現されることがないように欠失、置換または中断された、Ｍ１３５Ｒの遺伝子調節領域の一部または全部を有する粘液腫ウイルスも含む。機能的Ｍ１３５Ｒタンパク質とは、転写され、翻訳され、折り畳まれ、翻訳後に修飾され、細胞の内部に局在化されるＭ１３５Ｒであり、粘液腫ウイルスが感染した宿主の中で粘液腫症を引き起こすことを可能にするものである。Ｍ１３５Ｒタンパク質が、全く、または適正に、または十分に転写されず、翻訳されず、折り畳まれず、翻訳後に修飾されず、細胞内に局在化されないために、感染した宿主が粘液腫症を発生しなければ、その時には、機能的Ｍ１３５Ｒが細胞内で発現されていない。
【００５１】
さらなる実施態様において、細胞はインターフェロンに対して非応答性である。
【００５２】
特定の実施態様において、細胞は哺乳動物の癌細胞である。一つの実施態様において、細胞は、ヒト固形腫瘍などのヒト癌細胞である。
【００５３】
別の実施態様において、細胞はウイルスに慢性的に感染している。
【００５４】
ラパマイシンと粘液腫ウイルスの投与するための「併用」は、同一の投薬形態で一緒に処方するか、または別々の投与形態で処方することができ、別々の投与形態の場合には、同じ様式で投与するため、または異なった投与様式で投与するために同じ形であっても、異なった形であってもよい。さらに、同じ投薬形態で一緒に投与しない場合に、ラパマイシンと粘液腫ウイルスを併用して投与するとは、ラパマイシンおよび粘液腫ウイルスを治療中の哺乳動物に同時に投与することを意味し、同時に、または任意の順序で連続的に、または異なった時点で投与することができることを意味する。このように、ラパマイシンと粘液腫ウイルスを別々に投与することも可能であるが、望ましい治療効果をもたらすよう時間的に十分近接させて投与することができる。
【００５５】
本明細書において「有効量」という用語は、所望の結果を得るのに必要な投薬形態または期間において有効な量を意味する。
【００５６】
本明細書において「先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞」という用語は、ウイルスに曝露されるか、ウイルスの侵入を受けた場合に、ウイルスの複製、インターフェロンの産生、インターフェロン応答経路の誘導、およびインターフェロンが介在しているか否かに関わらないアポトーシスなどの抗ウイルス防御機構を誘導せず、そのため、ＭＶが、単独で、またはラパマイシン療法と併用すると感染することができる細胞を意味する。この用語は、ウイルスに曝露または感染したときに、正常な細胞、例えば、非感染細胞または非癌細胞と比較すると、先天的な抗ウイルス応答が低下または欠損している細胞を含む。これは、インターフェロンに対して非応答性である細胞、およびアポトーシス応答またはアポトーシス経路誘導が低下もしくは欠損している細胞を含む。この欠損は、感染、遺伝子欠損、または環境ストレスなど、さまざまな原因によって生じうる。しかしながら、この欠損が既存の感染によって生じている場合、ＭＶによる重感染は排除され、当業者はそのような例を容易に同定することができる。当業者は、過度の実験を行うことなく、いずれか所定の細胞型が先天的な抗ウイルス応答を欠損しているために、単独の、またはラパマイシン治療と併用した粘液腫ウイルスによって感染されうるか否かを容易に決定することができる。例えば、ＶＳＶを普通に用いて、細胞の抗ウイルス応答を測定することができる。
【００５７】
所定の細胞型、例えば、所定の癌細胞型が先天性抗ウイルス応答不全であるか否かを評価するために、当業者は外植片を採取し、インビトロでこれらの細胞のいくつかを培養して、ＶＳＶによる、あるいは、ラパマイシンと併用した粘液腫ウイルスを含む粘液腫ウイルスによる感染の可能性を測定することができる。
【００５８】
本明細書を通して、「インターフェロンに対して非応答性である細胞」という用語は、インターフェロンの活性、例えば、インターフェロンの抗ウイルス活性もしくは抗腫瘍活性に応答しない細胞、または異常なインターフェロン応答、例えば、インターフェロンに対する低下した、もしくは無効な応答を示すか、または、例えば、転写因子、例えば、ＳＴＡＴｌなどのシグナル伝達分子のリン酸化もしくは活性化によって測定すると異常なインターフェロンシグナル伝達を示す細胞を意味する。例えば、制限はないが、この細胞は、インターフェロンに対して応答性である細胞の中でそのような応答を誘導するのに十分な濃度のインターフェロンに曝露されても、増殖を阻害されず、または、死滅しないかもしれない。インターフェロンに対して非応答性の細胞は、細胞内シグナル伝達経路、または通常は応答性細胞の中で活性化されている経路に欠損があるかもしれない。典型的には、ＶＳＶによる感染に対する感受性は、インターフェロンに対する非応答性の指標であり、当業者は、インターフェロン存在下でＶＳＶ感染を阻止することができるか、またはその能力を欠いているかによって、あるいは、当技術分野において周知のインターフェロン活性のマーカーとなる他のもの、例えば、ＰＫＲ、ＳＴＡＴ、ＯＡＳ、ＭＸのように、ＩＮＦによって刺激される遺伝子の発現レベルを用いて、特定の細胞がインターフェロンに対して非応答性であるか否かを簡単に判定することができる。
【００５９】
本明細書を通して、「複製能がある」という用語は、特定の宿主の内部で感染および複製することができるウイルスを意味する。これは、特定の宿主の中では単独で複製を制限されているが、宿主細胞をラパマイシンで処理すると、ウイルスがその細胞に増殖的に感染することができるウイルスを含む。
【００６０】
本明細書において、「細胞」という用語は、単一細胞および複数の細胞または細胞群を含む。細胞に薬剤を投与するとは、インビトロおよびインビボにおける投与を含む。
【００６１】
本明細書において、「動物」という用語は、動物界の全生物を含み、具体的には哺乳動物、特にヒトを含む。
【００６２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を「阻害する」という用語は、細胞を成長もしくは分裂できないようにすること、または細胞の増殖または分裂を低下もしくは遅延させることに加えて、溶解またはアポトーシスまたはその他の細胞死機構による細胞死を含む。
【００６３】
当業者に周知で、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている標準的な分子生物学技術を用いて、粘液腫ウイルスのゲノムを容易に改変して、１つ以上の治療用導入遺伝子を発現させることができる。当業者は、粘液腫ウイルスのどの部分を欠失させれば、そのウイルスが依然として増殖性感染できるかを容易に決めることができるようになる。例えば、公表されたウイルスのゲノム配列を、特徴がはっきりした他のウイルスのゲノムと比較して、欠失させることができるウイルスゲノムの非必須領域を推定することができる（例えば、Ｃ． Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｓ． Ｈｏｔａ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｌ． Ｃｈｅｎ， Ｊ． Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｊ．−Ｘ． Ｃａｏ， Ｃ． Ｍａｃａｕｌａｙ， Ｄ． Ｗｉｌｌｅｒ， Ｄ． Ｅｖａｎｓ， ａｎｄ Ｇ． ＭｃＦａｄｄｅｎ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２６４： ２９８−３１８）参照）。
【００６４】
本明細書において、「治療用遺伝子」または「治療導入遺伝子」という用語は、その発現が所望の結果、例えば、抗癌作用をもたらす任意の遺伝子を広く説明しようとするものである。例えば、このウイルスを改変して、ウイルス治療の抗癌作用を増進する遺伝子を担持させることができる。このような遺伝子は、アポトーシスを開始させることに関与するか、または免疫を破壊するために感染細胞を標的とすることに関与する遺伝子であり、例えば、インターフェロンに対する応答の欠如を修復する遺伝子、または、細菌の細胞表面の抗原など、抗体の応答を刺激する細胞表面マーカーの発現をもたらす遺伝子などである。また、このウイルスを改変して、腫瘍性細胞または癌細胞の増殖および成長を遮断して、細胞が分裂できなくなることに関与する遺伝子を発現させることもできる。さらに、このウイルスを改変して、化学治療剤の合成に関与する遺伝子のような治療用遺伝子を含ませることができ、または、例えば、ヒト細胞など、阻害されるか死滅させられる細胞が由来する特定の生物種の細胞における複製量が増加するよう改変することができる。粘液腫ウイルスに挿入されて、その抗癌作用を高めることができる遺伝子の具体例は、ＴＲＡＩＬタンパク質に関するヒト遺伝子、またはＥ４ ｏｒｆ４ポリペプチドをコードするアデノウイルス遺伝子などであるが、これらのタンパク質はいずれもヒト腫瘍細胞を死滅させることに関与する。
【００６５】
当然のことながら、ラパマイシンと併用して使用される場合を含め、粘液腫ウイルスの治療効果は、このウイルスによる細胞溶解によって、またはこのウイルスによる治療薬の送達によって達成することができる。粘液腫ウイルスと併用してラパマイシンが含まれることによって、粘液腫ウイルス単独の効果を増強することが可能になるはずである。すなわち、粘液腫ウイルスは、ラパマイシンと併用して投与すると、粘液腫ウイルス単独のときよりも多数の標的細胞に増殖的に感染することができるか、またはラパマイシン不在下では粘液腫ウイルスによる増殖的感染を制限する、先天的な抗ウイルス応答を欠損した標的細胞に増殖的に感染することができるはずである。
【００６６】
このウイルスは、当技術分野において周知の標準的な技術を用いて調製することができる。例えば、培養ウサギ細胞に使用すべき粘液腫ウイルス株を感染させてウイルスを調製することができ、感染を進行させて、ウイルスが培養細胞の中で複製し、当技術分野において既知の標準的な細胞表面破砕法によって細胞表面を崩壊させるとウイルスが遊離できるようにし、それによって、回収のためウイルス粒子を放出させることができる。ウイルスを回収したところで、ウサギ細胞のコンフルエントな細胞層に感染させてから、プラークアッセイを行なうことによって、ウイルス力価を測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５：１７−３０参照）。
【００６７】
また、先天的な抗ウイルス応答が欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための方法であって、有効量の粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して患者に投与することを含む方法が、そのような治療を必要とする患者に提供される。患者は、ヒトを含む哺乳動物など、任意の動物であってよい。
【００６８】
本明細書において、「先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状」とは、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞であって、これらの細胞を死滅させることによって病気、疾患、病状、もしくはその症状を治療することができる細胞が存在することに付随、関連、またはそれを特徴とする病気、疾患もしくは病状を意味する。例えば、病気の状態は癌であってよい。病気の状態はウイルスによる慢性感染症も含む。
【００６９】
病状を「治療すること」は、臨床結果など、有益または所望の結果を得るための方法を意味する。有益または所望の臨床結果は、１つ以上の症状もしくは病状を緩和もしくは改善すること、病気の範囲が縮小すること、病状が安定すること、病気の発生を予防すること、病気の広がりを予防すること、病気の進行を遅延もしくは緩徐化すること、発病を遅延もしくは緩徐化すること、病状を改善もしくは緩和すること、ならびに（部分的もしくは全体的な）寛解を含むが、これらに限定されるものではない。「治療する」とは、治療を行わない場合に予想された生存期間を超えて患者の生存期間を伸ばすことを意味することも可能である。また、「治療する」とは、病気が進行するのを阻害して、病気の進行を一時的に緩徐化することを意味することも可能であるが、より好ましくは、病気の進行を永続的に停止させることを含む。
【００７０】
一つの実施態様において、病状は癌である。癌は、必ずしも細胞の全部である必要はないが、細胞の少なくとも一部が先天的な抗ウイルス応答を欠損した任意の型の細胞であればよい。一つの実施態様において、癌は、細胞の少なくとも一部がインターフェロンに対して非応答性である癌であればよい。本明細書において、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」という用語は（互換的に使用され）、細胞増殖の調節が顕著に失われることを特徴とする、異常な増殖を示す細胞または不死化している細胞を意味する。「癌」または「腫瘍」という用語は、転移性および非転移性の癌もしくは腫瘍を含む。本明細書において、「腫瘍性」または「腫瘍」という用語は、正常な増殖抑制機構なしに増殖する単一または複数の細胞を広く意味し、したがって、癌および異形成細胞もしくは過形成細胞に加えて、良性腫瘍を含む。
【００７１】
癌は、悪性腫瘍の存在など、当技術分野において一般に受け入れられている診断基準を用いて診断することができる。
【００７２】
本発明に従って治療することができる癌の型は、白血病、リンパ腫などの造血細胞癌、大腸癌、肺癌、腎癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、直腸結腸癌、黒色腫およびその他の腫瘍を含むが、これらに限定されない。肉腫および癌腫などの固形腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、およびその他の肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞腫、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肺細胞腫、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
別の実施態様において、病状は慢性ウイルス感染症である。
【００７４】
慢性的に感染するウイルスは、長期間にわたり持続的な形で動物の細胞内で感染および複製して、病態を引き起こすような任意のウイルスであってもよい。慢性感染ウイルスは、癌の発生と付随または関連するウイルスであってもよい。
【００７５】
ウイルスの慢性感染症は、当技術分野において周知の標準的な方法を用いて診断することができる。例えば、慢性ウイルス感染症は、患者に抗ウイルス抗体が存在することによって、または患者の細胞の中にウイルスのＲＮＡもしくはＤＮＡが存在するかについて陽性試験することによって検出することができる。
【００７６】
患者に投与する場合、有効量の粘液腫ウイルス、および任意には粘液腫ウイルスとラパマイシンを併用したものが、その投薬量または十分な期間において、このウイルスが病気を軽減、改善、緩和、寛解させ、その広がりを抑制し、その進行を緩徐もしくは遅延させ、または治療するのに必要とされる量である。例えば、癌性細胞または腫瘍細胞の数を減らしたり、破壊したりする効果、またはウイルスに慢性的に感染した細胞の数を減らしたり、破壊したりする効果、またはそのような細胞の成長および／または増殖を阻止する効果を達成するのに十分な量であろう。
【００７７】
患者に投与すべき有効量は、粘液腫ウイルスおよび任意にはラパマイシンの薬力学的特性、投与方式、患者の年齢、健康状態および体重、病状の性質および範囲、治療頻度および、行っているならば、併用治療の種類、ならびにウイルスの毒性ならびに力価など、多くの因子に依存して変わりうる。
【００７８】
当業者は、上記の因子に基づいて、投与する粘液腫ウイルスの適正な量を決定することができる。まず、患者の臨床反応に応じて、必要に応じて調整を加えることができる適当量にして、このウイルスを投与することができる。ウイルスの有効量は経験的に決定してもよく、それは安全に投与することができるウイルスの最大量、および所望の結果を生むウイルスの最小量に依存する。
【００７９】
粘液腫ウイルスは、標準的な投与法を用いて患者に投与することができる。一つの実施態様において、このウイルスを全身的に投与する。別の実施態様において、このウイルスを病気の部位に投与する。特定の実施態様において、この病状は固形腫瘍であり、この腫瘍部位に注射によってウイルスを投与する。さまざまな実施態様において、ウイルスは、経口的もしくは非経口的に投与するか、または当技術分野において周知の標準的な方法によって投与することが可能である。
【００８０】
全身にウイルスを投与する場合に、病気の部位にウイルスを注射することにより達成される効果と同じ臨床効果をもたらすためには、かなり高用量のウイルスを投与することが必要とされるであろう。しかし、適切な服用レベルは、所望の結果を得る最少量のはずである。
【００８１】
投与するウイルスの濃度は、投与すべき粘液腫の具体的な株の毒性、および標的となる細胞の性質に応じて変わる。一つの実施態様において、約１０９プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）よりも少ない量をヒト患者に投与する。さまざまな実施態様において、約１０２から約１０９ｐｆｕの間、約１０２から約１０７ｐｆｕの間、約１０３から約１０６ｐｆｕの間、または約１０４から約１０５ｐｆｕの間を単一用量にして投与することができる。
【００８２】
当業者は、上記の因子を用いて、患者に投与するラパマイシンの適正量を決定することができる。ラパマイシンの有効量は経験的に決定することができ、投与されるウイルスの量と株、安全に投与することができるウイルスの最大量、および粘液腫ウイルスの感染力の増強を実現するために投与することができるラパマイシンの最小量に応じて変わる。
【００８３】
ラパマイシンは、標準的な投与法を用いて患者に投与することができる。一つの実施態様において、パマイシンを全身に投与する。別の実施態様において、ラパマイシンを病気の部位に注射して投与する。特定の実施態様において、病状は固形腫瘍であり、ラパマイシンをその腫瘍部位に注射によって投与する。さまざまな実施態様において、ラパマイシンを経口的もしくは非経口的に投与するか、または当技術分野において周知のいずれかの標準的な方法によって投与することができる。
【００８４】
ラパマイシンの全量を単一用量にして、または１日または数日間にわたる多回用量にして投与することができる。用量の投与頻度および期間は容易に決定することができる。投薬計画は、粘液腫ウイルスを投与する期間に応じて決まる。例えば、ラパマイシンは、患者に単一回投与することもでき、または１日あたり２〜４回投与することもできる。
【００８５】
さまざまな実施態様において、ラパマイシンの用量は１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０１〜約２５０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０１〜５０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．０５〜１０ｍｇ、１日あたり体重１ｋｇにつき約０．１〜７．５ｍｇであろう。
【００８６】
有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの併用剤を、初期治療計画の効果に基づいて、繰り返し投与してよい。投与は、典型的には、任意の反応をモニターしながら定期的に行われる。上記した用量よりも少ないかまたは多い用量を、選択された投与計画または経路に応じて投与してもよいと当業者は認識していよう。
【００８７】
粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して、単独療法として投与することができ、または、化学療法、放射線療法またはその他の抗ウイルス療法など、他の療法と併用して投与することができる。例えば、原発腫瘍の摘出手術の前もしくは後に、または、放射線療法もしくは従来型化学療法剤を投与するなどの治療の前、同時もしくは後に、粘液腫ウイルスを、任意には、ラパマイシンと併用して投与することができる。一つの実施態様において、その他の腫瘍退縮性ウイルスであって、多様な腫瘍細胞型に対して特異性を示しうるようなウイルスと組み合わせて、または逐次的に、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して投与することもできる。
【００８８】
投与を容易にするために、粘液腫ウイルスを、任意には、ラパマイシンと併用して、医薬組成物の成分として調製することができる。したがって、さらなる実施態様において、粘液腫ウイルス、および任意にはラパマイシン、ならびに薬学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が提供される。したがって、本発明は、一つの態様において、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する際、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する際に使用するための医薬組成物も含む。この組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、およびさまざまな適合担体を通常含むことができる。すべての送達形態について、組換え粘液腫ウイルスを生理食塩水内で処方することができる。
【００８９】
この医薬組成物は、追加的な抗癌剤など、別の治療薬をさらに含むことが可能である。一つの実施態様において、この組成物は化学療法剤を含む。この化学療法剤は、例えば、患者の癌細胞または腫瘍細胞に対して腫瘍退縮効果を示すが、粘液腫ウイルスの腫瘍殺傷効果を阻害または低下させないものであれば、実質的にいずれの薬剤であってもよい。例えば、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸アナログ、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであってよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、化学療法剤は、癌性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものである。
【００９０】
医薬上許容される希釈剤の比率および同一性は、選択された投与経路、生ウイルスとの適合性、および適用可能な場合には、ラパマイシンの化学的安定性との適合性、ならびに標準的な薬学的実施慣行によって決定される。通常、医薬組成物は、生きた粘液腫ウイルスの生物学的特性を顕著には損なわず、ラパマイシンが含まれている場合には、その分解をもたらしたり、その安定性または効力を低下させたりしない成分とともに処方される。
【００９１】
この医薬組成物は、有効な量の単一または複数の活性物質を医薬上許容される賦形剤との混合物として併用されるよう、患者に投与するのに適した医薬上許容される組成物を調製するための周知の方法によって調製することができる。適当な賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ＵＳＡ １９８５）に記載されている。これに基づいて、組成物は、一つ以上の医薬上許容される賦形剤または希釈剤とともに、適当なｐＨおよび生理液と等張の緩衝液に含まれている、任意にはラパマイシンが入った粘液腫ウイルス溶液を、これらに限定されずに含む。
【００９２】
当業者には当然のことながら、医薬組成物は、選択された投与経路に応じて、さまざまな形で患者に投与することができる。経口的または非経口的に、本発明の組成物を投与することができる。非経口投与は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、くも膜下腔内、直腸および局所的な投与方式を含む。非経口投与は、選択された期間にわたる持続注入によるものであってもよい。
【００９３】
医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または同化可能な担体とともに経口投与することができ、または、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルの中に封入することができ、または、圧縮して錠剤にすることもできる。経口的に治療薬として投与するには、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと一緒に、賦形剤に取り込み、消化可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、ウエハースなどの形態にして使用することができる。
【００９４】
粘液腫ウイルス溶液を、任意にはラパマイシンと一緒に、生理学的に適した緩衝剤の中で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を阻止するための保存剤を含むが、それで生ウイルスが不活化されることはない。当業者ならば、適当な処方剤の調製法を知っているであろう。適当な処方剤を選択および調製するための従来の手順および成分については、例えば、１９９９年に出版されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＵＳＰ ２４ ＮＦ１９）に記載されている。
【００９５】
さまざまな実施態様において、組成物は、腫瘍部位など病気の部位に直接（皮下、静脈内、筋肉内などに）注射によって投与されるか、または経口投与、あるいは、経皮投与によって投与される。
【００９６】
注射液として使用するのに適した医薬組成物の形態は、無菌の水溶液もしくは分散液、ならびに無菌の注射用の溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末などであるが、ここで、無菌という用語は、投与される粘液腫ウイルス自体には及ばない。すべての場合において、剤形は無菌でなければならず、そして容易に注射できる程度に流動性でなければならない。
【００９７】
使用される医薬組成物の用量は、治療中の特定の症状、症状の重症度、年齢、体調、体格および体重など個々の患者のパラメーター、治療継続期間、（もしあれば）併用療法の性質、具体的な投与経路、ならびに医療専門家の知識および専門技術範囲内にあるその他の類似要素なに応じて変わる。これらの要素は、当業者に周知のものであり、最小限の日常的実験作業によって扱うことができる。
【００９８】
また、任意にはラパマイシンと併用される粘液腫ウイルス、または粘液腫ウイルスおよびラパマイシンを含む医薬組成物は、同じ処方剤の中で一緒に、または異なる処方剤にして、キットとしてパッケージにすることもでき、このキットは、それを必要とする患者に、粘液腫ウイルスを使用して、もしくはラパマイシンとともに粘液腫ウイルスを使用して、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または粘液腫ウイルスを使用して、もしくはラパマイシンとともに粘液腫ウイルスを使用して、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するためなど、粘液腫ウイルスおよびラパマイシンを使用するための説明書を含む。この病状は癌、または慢性ウイルス感染症であってよい。それを必要とする患者において、
また、本発明は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するために、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用することを想定している。一つの実施態様において、細胞はインターフェロンに対して非応答性である。先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために、それを必要とする患者に、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用することがさらに提供されている。一つの実施態様において、病状は癌である。また、薬剤の製造において、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、またはそれを必要とする患者において先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するために、粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して使用すること提供されている。
【００９９】
ＭＶは、ＭＶの自然宿主以外の動物の細胞、またはそれらに由来する細胞、すなわち、先天的な抗ウイルス応答を欠損している細胞集団に由来する細胞に選択的に感染することができる。ＭＶにこのような能力があるため、培養中の、または動物の体内にある細胞の集団から、インターフェロンに対して非応答性の細胞など、先天的な抗ウイルス応答を欠失した細胞を検出する際にＭＶを使用することができる。このような細胞、例えば、蝕知可能な腫瘤にまで進行していないか、または動物の中で顕著な症状を誘起していない一定の癌細胞は、別の方法では容易に検出できないかもしれない。
【０１００】
したがって、一つの実施態様において、患者の中で先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出するための方法であって、検出可能なマーカーを発現するように改変された粘液腫ウイルスを、任意にはラパマイシンと併用して患者に投与すること；患者の中で、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞にこのウイルス感染させること；および、患者の中で検出マーカーを発現する細胞を検出することを含む方法が提供される。
【０１０１】
感染細胞は、診断画像を視覚化するための従来の方法を用いて検出することができる。この検出法は、使用する具体的な検出用マーカーによって決まる。例えば、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変された粘液腫ウイルスに感染した細胞は、蛍光デジタル画像顕微鏡を使用して検出することができる。その他の方法は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出撮影法（ＰＥＴ）などの全身走査法、核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）、および超音波検査法などである。当業者は、具体的な検出マーカーを検出するための適切な方法を決めることができるだろう。
【０１０２】
検出可能なマーカーには、改変ウイルスに感染した細胞の内部で、マーカーの発現または合成が起きるように、それを発現または合成する遺伝子を粘液腫ゲノムに挿入することができる任意のマーカーがあるが、これらに限定されるものではない。例えば、一つの実施態様において、検出可能なマーカーは蛍光タンパク質でもよい。感染細胞は、改変ウイルスが先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に感染して、検出可能マーカーをそのような細胞の中で検出可能なレベルで発現させることができるようにするため、改変ウイルスを患者に投与した後適当な時間をおいて検出することができる。例えば、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変したウイルスを患者に投与した後、２〜２０日間のいずれかの時点で検出することができる。
【０１０３】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することをモニターするために、その患者において、間隔をおきながら繰り返し検出法を実施することができる。例えば、粘液腫ウイルスを用いて、そのような細胞を検出する方法は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞の性質、および患者の体内にそのような細胞が存在する結果として引き起こされたいずれかの病状の性質に基づき、必要に応じて、６ケ月、１年または２年の間隔で実施することができる。ある期間にわたりこの方法を繰り返すと、病状の進行もしくは寛解、または患者の体内での病気の広がりをモニターすることが可能になる。
【０１０４】
粘液腫ウイルスは、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に選択的に感染する能力があるため、細胞におけるそのような欠損の指示薬として使用することができる。したがって、本発明の方法を用いて、先天的な抗ウイルス応答の欠損について、患者から摘出した細胞をアッセイすることができる。このような測定法は、他の指示薬と併用すると、その患者が特定の病状、例えば、癌に罹患していることを表示することができる。
【０１０５】
したがって、一つの実施態様において、試料中で先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出するための方法であって、細胞を培養すること、培養細胞を、任意にはラパマイシンと併用した粘液腫ウイルスに曝露すること、および粘液腫ウイルスによる細胞の感染力を測定することを含む方法が提供される。
【０１０６】
周知の生検法を用いて、ヒト被験者など、被験対象から細胞を取り出すことができる。生検法は、検査すべき細胞の存在する場所およびその型に応じて決められる。
【０１０７】
周知の培養技術に従って細胞を培養してから、培養液に生きた粘液腫ウイルス、および任意にはラパマイシンを添加することにより、細胞をＭＶに、任意にはラパマイシンに曝露する。粘液腫ウイルスをラパマイシンと併用して添加する場合、ウイルスとラパマイシンは、同時または経時的に添加することができる。ラパマイシンが存在する場合など、感染多重度（「ＭＯＩ」）を変えて、所定の細胞型、密度および培養技術、および具体的なラパマイシン濃度に対して最適なＭＯＩを、ＭＶに曝露すると感染することが知られている陽性対照細胞の培養物を用いて決定することができる。
【０１０８】
ラパマイシンの量、ならびにラパマイシンおよび粘液腫ウイルスを培養細胞に添加するタイミングは、細胞型、培養方法、およびウイルス株に応じて変えることができる。このようなパラメーターは、常法を用いた最小限の検査法によって試験および調整することができる。
【０１０９】
ＭＶの細胞死を引き起こす能力など、ラパマイシンが存在する場合も含んだＭＶによる培養細胞への感染力は、当業者に周知のさまざまな方法によって決定することができる。また、これは、ウイルスの発現産物との酵素反応または化学反応を完了させるために、細胞培養液に試薬を添加することも含むかもしれない。ウイルス発現産物は、ＭＶゲノムに挿入されたレポーター遺伝子から発現されたものであってもよい。
【０１１０】
一つの実施態様において、ＭＶを改変して、感染状態を検出するのを容易にすることができる。例えば、ＭＶを遺伝子改変して、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、または放射性イメージングによって容易に検出することができるマーカーを発現させることができる。このマーカーは、発現された蛍光タンパク質、または比色反応または放射標識反応に関与する可能性のある発現酵素であってもよい。別の実施態様において、このマーカーは、試験されている細胞の特定の機能を妨害または阻害する遺伝子産物であってもよい。
【０１１１】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに具体的に説明される。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１：粘液腫ウイルスによるマウス細胞株およびヒト細胞株への感染）
（ウイルス株）
使用したウイルス株は、野生型ＭＶ、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）またはβ−ガラクトシダーゼ（「ＬａｃＺ」）を発現するように改変されたＭＶ、および死滅（「不活化」）ウイルスを含む。標準的な技術を用いて、ウイルスを調製し滴定した。
【０１１３】
（細胞株）
野生型マウス、および以下のノックアウトマウスに由来するマウス胚線維芽細胞（「ＭＥＦ」）を使用して、マウス実験を行った。すなわち、ＩＦＮα／β受容体ホモ接合ノックアウト、ＳＴＡＴｌホモ接合ノックアウト、ＰＫＲヘテロ接合ノックアウト、ＲＮａｓｅ Ｌヘテロ接合ノックアウト、Ｍｘ１ヘテロ接合ノックアウト、ＰＫＲ／ＲＮａｓｅＬ／Ｍｘ１ホモ接合三重ノックアウト。
【０１１４】
Ｓｔｏｊｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００３）４：２６３−２７５に記載されているように、ＢＧＭＫ対照細胞および以下のヒト腫瘍細胞株に対してヒトに関する実験を行った。すなわち、ＨＴ２９、ＨＯＰ９２、ＯＶＣＡＲ５、ＳＫ−ＭＥＬ３、ＳＫ−ＭＥＬ２８、Ｍ１４、ＳＫＯＶ３、ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＣＡＫＩ−１、７８６−０、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡＭＢ４３５、ＳＦ０４、Ｕ８７、Ａ１７２、Ｕ３７３、ＤａｏｙおよびＤ３８４。
【０１１５】
（方法）
一般的には、Ｌａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２５６： ２３３−２４５； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００３） ７７（１３）： ７６８２−７６８８； ａｎｄ Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （２００４） ８： １０３の記載に従って、アッセイ法および実験を行った。
【０１１６】
インビボでのマウス研究では、ヒト頭蓋内神経膠腫Ｕ８７をヌードマウスに移植した。移植後１５日目に、生きたＭＶ ＧＦＰまたは不活化ＭＶ ＧＦＰを５×１０６の力価でマウスの腫瘍内に注射するか、擬似感染させた。感染後７２時間目に、動物を殺してから、その脳を摘出してＯＣＴ（至適温度化合物）の中に埋め込み、凍結切片を切り出した。蛍光顕微鏡によって全脳切片の中で粘液腫ＧＦＰを可視化した。その後、切片を固定し、Ｈ＆Ｅ（ヘモトキシリンおよびエオシン）を用いて染色して、腫瘍を可視化した。
【０１１７】
ヒト腫瘍細胞アッセイ法では、手術後直ちに、腫瘍をトリプシン処理して平板培養し、翌日、ＭＯＩ０．１、１．０または１０でウイルスに感染させた。感染後２４時間目および４８時間目に、位相差顕微鏡法および蛍光顕微鏡法を用いて、それぞれ細胞毒性およびウイルス発現に関するデータを集めた。黄色テトラゾリウム塩ＭＴＴを用いるアッセイ法を行って、感染後４８、７２または９６時間目の細胞生存率（％）（擬似感染後生存していた細胞に対するパーセンテージ）を定量した。
【０１１８】
ヒト小児髄芽腫細胞株ＤａｏｙおよびＤ３８４を、１０Ｍ．Ｏ．Ｉ．の粘液腫ＧＦＰに感染させた。感染後７２時間目に、ＭＴＴを用いて細胞生存率を測定した。
【０１１９】
（結果：マウス細胞株の感染）
従来の研究では、ケモカイン受容体でトランスフェクトされたマウス３Ｔ３細胞のいくつかのクローンに、粘液腫ウイルスを感染させることができたが、その他のクローンには感染させることができなかったことが示されていた。他のマウス細胞において粘液腫ウイルス指向性がいずれか特定の受容体に依存しているか否かを調べるために、本発明者らは、野生型（ＷＴ）マウスおよび多様な遺伝子ノックアウト由来の初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を利用した。
【０１２０】
ＩＦＮは抗ウイルス応答を開始する上で重要な役割を果たしているため、本発明者らはこの制限的な表現型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が、ＩＦＮを介した「抗ウイルス状態」に関係があると仮定した。ＩＦＮ系の事象の連鎖を断つか、抗体によって循環ＩＮＦを中和するか、またはＩＦＮ受容体陰性マウスもしくは細胞内シグナル伝達経路の遺伝子を欠失したマウスを作成すると、通常は正常なマウス細胞には感染しない粘液腫ウイルスに対する宿主の抵抗性が著しく損なわれると考えた。
【０１２１】
この仮説を検証するために、本発明者らは、非許容性細胞における粘液腫ウイルスの非感染性がＩＦＮの抗ウイルス活性のせいであるか否かを明らかにする必要があった。細胞内ＩＦＮシグナル応答に関与する１つ以上のタンパク質をノックアウトしたさまざまなＭＥＦ細胞型について、ＩＦＮ経路に対するＭＶ感染の効果を調べた。
【０１２２】
初代ＭＥＦに対して行われた実験によって、野生型（「ＷＴ」）ＭＥＦは粘液腫ウイルスによって感染可能ではないことが実証された。ＩＮＦ経路がＩＮＦα／βに対する中和抗体によってブロックされた場合、前記ＭＥＦは粘液腫ウイルスによって完全に感染可能になる（図２）。しかし、ＩＮＦγに対する中和抗体に曝露されたＭＥＦは非許容性のままであった。このことは、粘液腫ウイルスがインビトロでＭＥＦに感染するのを許容する環境を作り出すことに、ＩＦＮγではなくＩＦＮα／βが重要であることが大まかに示している。ＩＮＦα／βおよびＩＮＦγに対するさまざまな細胞内シグナル伝達経路が文献中で同定されてきた。しかし、ＩＮＦα／βおよびＩＮＦγはともに、培養された線維芽細胞とは異なり、感染宿主中において重要な役割を果たしている可能性が高い。本発明者らは、ＩＮＦα／βおよび／またはＩＮＦγの経路のいずれかを欠損したヒト腫瘍がインビボでの粘液腫ウイルス感染に感受性になるものと予想している。
【０１２３】
本発明者らは、ＭＶに感染した非許容性ＷＴ ＭＥＦの中でＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２の活性を調べた。図３に示す結果は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２が活性化されることを示した。さらなる研究によって、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４およびＳＴＡＴ５は活性化されないことが示された（図４）。
【０１２４】
ＭＥＦの非許容性状態を維持する上でＩＦＮα／β細胞内経路が重要性であることを確認するために、遺伝子欠失実験を行って、ＩＮＦα／β受容体および細胞内カスケードを破壊したものを用意した。ＩＮＦ受容体またはＪＡＫ１もしくはＳＴＡＴ１の遺伝子を欠失させ、ＭＶを使用して、ＷＴ ＭＥＦ、ＩＦＮα／β Ｒ−／−ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦを感染させた。ＩＦＮα／β Ｒ−／−ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦはＭＶに対して許容性であり、ＩＮＦα／βおよびＳＴＡＴ１カスケードがＭＶ感染にとって重大な意味を持つことを明らかにした（図５）。
【０１２５】
プリテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）は、さまざまな細胞の中でＩＮＦα／βによって誘導される酵素である。このキナーゼは、ｄｓＲＮＡの存在下で自己リン酸化を受け、次に、リン酸化によってタンパク質翻訳およびアポトーシスの阻害を誘導することができる、真核生物のタンパク質合成開始因子（ｅＩＦ−２α）など、いくつかの細胞タンパク質をリン酸化する。また、ＰＫＲはＲＮａｓｅＬの活性化にも示される。本発明者らは、ＭＶ感染後、非許容性ＭＥＦにおけるＰＫＲの活性化を調べた。抗ウイルス状態が十分に確立している非許容性ＭＥＦでは、ＰＫＲはリン酸化されない（図６）。さらに、ＭＶ感染によって、ＰＫＲのリン酸化が阻害される（図７）。また、ＰＥＲＫ（ＰＫＲ様のＥＲキナーゼ）は、粘液腫ウイルス感染後の初期の野生型ＭＥＦ内でリン酸化されない（図８）。
【０１２６】
ＭＶを用いて、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬまたはＭｘ１の単一遺伝子ノックアウトを有するＭＥＦに感染させた（図９）。ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬまたはＭｘ１は、粘液腫ウイルス感染に対する非許容性を維持するためには非必須であることが発見された。ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１の役割が必須でないことをさらに確かめるために、ＭＥＦにおいてＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−およびＭｘ１−／−という三重ノックアウトを行った。ＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−およびＭｘ１−／−の三重ノックアウトは、ＭＶ感染を支持しない（図１０）が、しかし、インターフェロンα／βに対する中和抗体で処理された、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１の三重ノックアウトＭＥＦは粘液腫ウイルス感染に対して許容性となる（図１０および１１を比較せよ）。これらの実験は、ＭＶに対するＭＥＦの非許容性をもたらす上で、ＰＫＲ、ＲＮａｓｅＬおよびＭｘ１は必須ではないことを示している。
【０１２７】
さらなる実験を行って、ＭＶ感染後の非許容性野生型ＭＥＦおよび許容性のＩＮＦα／β Ｒ−／−ＭＥＦならびにＳＴＡＴ１−／−ＭＥＦにおけるｅＩＦ２αおよびＰＫＲの活性化を調べた。ＭＶ感染後に、ｅＩＦ２αは非許容性ＭＥＦおよび許容性ＭＥＦの中でリン酸化されるが、ＰＫＲはどちらの場合においてもリン酸化されない（図１２）。このことは、ＰＫＲおよびＰＥＲＫの関与がなくても、ｅＩＦ２αリン酸化を引き起こす別の経路によって、抗ウイルス状態がもたらされることを示している。
【０１２８】
ＳＴＡＴ１は、非許容性のＰＫＲ、ＲＮａｓｅおよびＭｘ１の三重ノックアウトＭＥＦにおいて、ＭＶ感染後にセリンおよびチロシンのリン酸化を受ける（図１３）。また、粘液腫ウイルス感染後の非許容性ＰＫＲ−／−＋ＲＮａｓｅＬ−／−＋Ｍｘ１−／−ＭＥＦにおけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ１の細胞内局在化も示されている（図１４）。
【０１２９】
要約すれば、これらの結果は、ＩＦＮ／ＳＴＡＴ１を含む並行したＰＫＲ／ＰＥＲＫ非依存的な抗ウイルス経路が、ポックスウイルス指向性にとって重大な意味を持つことを示している。さらに、ｅＩＦ２αのリン酸化は、ＩＮＦによる抗ウイルス作用の最良のマーカーである。
【０１３０】
（結果：ヒト腫瘍研究）
本発明者らは、ＭＶがインビボ系の中でヒト腫瘍細胞に感染することができるかを調べた。ヌードマウスにヒト神経膠腫細胞を注射したところ、引き続いて、頭蓋内神経膠腫を発症した。生ウイルスは、これらのヒト腫瘍細胞に感染することができたが、周囲の細胞には感染しなかった（図１５）。ＧＦＰ由来の蛍光シグナルが腫瘍に局在化することを図１６に示す。
【０１３１】
多くのヒト腫瘍がインターフェロンに対して非応答性であること、および、正常なヒト細胞の中に存在するＩＮＦシグナル伝達カスケードと比較すると、これらの腫瘍細胞は正常なＩＮＦシグナル伝達カスケードを持たないことから、ヒト腫瘍に対する粘液腫ウイルスの効果を調べるために実験を行った。結果を下記に要約する。
【０１３２】
最初に、粘液腫ウイルスを用いて、さまざまな対照腫瘍細胞株およびヒト腫瘍細胞株であるＢＧＭＫ、ＨＴ２９、ＨＯＰ９２、ＯＶＣＡＲ４、ＳＫ−ＭＥＬ３、およびＳＫ−ＭＥＬ２８に対する感染力および細胞溶解性効果を調べた。ＭＶは多様な感染力および細胞溶解作用の結果を示した：ＨＴ２９（図１７）、ＨＯＰ９２（図１８）、ＯＶＣＡＲ４（図１９）、ＳＫ−ＭＥＬ３（図２０）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（図２１）およびＢＧＭＫ（図２２）。
【０１３３】
さらなる腫瘍細胞を検査し、下記の表１は、検査した多様な腫瘍型を許容性および非許容性に分類している。
【０１３４】
（表１ 粘液腫ウイルスのヒト腫瘍細胞に対する指向性）
【０１３５】
【表１】
ＭＶ−ＬａｃＺの濃度を増加させて感染させると、多様なヒト腫瘍株がさまざまな反応性を示した。例えば、Ｕ３７３細胞では、Ｕ８７において低いウイルス力価で行われた細胞殺傷のレベルを達成するのに高いウイルス力価を必要とした（図２３および図２４）。粘液腫は星状細胞腫細胞（図２５）および神経膠腫細胞（図２６）を効率的に感染させた。粘液腫は感染４８時間後、死滅したヒト星状細胞種および髄芽細胞腫において効率的だった。
【０１３６】
（実施例２：制限細胞株におけるにおける粘液腫ウイルス複製の動態に対するラパマイシンの効果）
（ウイルス株）
使用されたウイルス株は、野生型ＭＶ（「ｖＭｙｘＬａｃ」）、およびＭＴ−５遺伝子がノックアウトされるよう改変されたＭＶ（「ｖＭｙｘＬａｃＴ５−」）を含む。標準的な技術を用いて、ウイルスを調製および滴定した。
【０１３７】
（細胞株）
ヒトに関する実験を、ＢＧＭＫ霊長類対照細胞、ＲＫ−１３ウサギ対照細胞、および正常なヒト線維芽細胞Ａ９、制限ヒト腫瘍細胞株７８６−０（腎臓癌）、ＡＣＨＮ（腎臓癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（乳癌）、Ｍ１４（黒色腫）およびＣＯＬＯ２０５（結腸癌）に対して行った。
【０１３８】
（方法）
一般的に、Ｌａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２５６： ２３３−２４５； Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００３） ７７（１３）： ７６８２−７６８８；およびＳｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ （２００４） ８： １０３に記載されているとおりに、アッセイ法および実験を行った。
【０１３９】
ウイルスの増殖曲線には、細胞をインビトロで単層に増殖させ、ウイルスに感染させる前に２０ｎＭのラパマイシンまたは対照（ＤＭＳＯを１：５０００に希釈したもの）で処理した。
【０１４０】
表示されたウイルス株に感染した表示された細胞株の試料を、感染後７２時間目に集めて、溶解させた。細胞溶解物の中に含まれるウイルスを滴定して、ＢＧＭＫの単層を感染させるのに使用した。感染後４８時間目に細胞を固定して、Ｘ−ｇａｌを用いて染色した。
【０１４１】
（結果）
粘液腫ウイルスは多くの種類のヒト腫瘍細胞に感染して複製できることが、本発明者らによって既に明らかにされている（Ｓｙｐｕｌａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８：１０３）。このウサギ特異的ウイルスは、ＮＣＩ参照用コレクションに由来するヒト癌細胞株の大多数（約７０％）に選択的に感染することができる。また、宿主域遺伝子Ｍ−Ｔ５が、これら多くの細胞株に粘液腫ウイルスが感染する際に重大な役割を果たすことが分かっている。
【０１４２】
ヒト腫瘍細胞の内部で粘液腫ウイルスが選択的に複製する能力に影響を与えることができる細胞内分子の可能性があるものを今回調査した際に、ラパマイシンの効果を調べた。
【０１４３】
図２９から分かるように、低多重度感染（ＭＯＩ）の後、粘液腫ウイルスが複製および拡散できることを、多段階増殖曲線を用い、ＢＧＭＫ（対照用霊長類細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（対照用ウサギ細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳおよびＰＣ３（許容性ヒト細胞株）、７８６−０、ＨＣＴ１１６、およびＡＣＨＮ（制限ヒト癌細胞株）、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（不全型ヒト癌細胞）を用いて行うことができる。野生型ｖＭｙｘＬａｃと、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスｖＭｙｘＴ５ＫＯの両方を試験して、ラパマイシンによる予備処理した場合としない場合に、この２つのウイルスが単層全体に感染して拡散することができるかを調べた。ＢＧＭＫ細胞上で病巣形成させて、ウイルスの力価を測定した。感染させる６時間前に、２０ｎＭのラパマイシンまたは適当な賦形剤対照（ＤＭＳＯを１：５０００に希釈したもの）で細胞を事前処理した。
【０１４４】
実証されているように、ラパマイシンは、対照ＢＧＭＫ細胞に対しても、ＭＴ−５ノックアウトウイルスに対して非許容的なＲＬ−５細胞を含む試験したウサギ細胞株のいずれに対しても何の効果も示さない。しかし、ラパマイシンは、マウス腫瘍細胞株の中では粘液腫ウイルスの複製を促進し、ＰＣ−３などの許容性（Ｉ型）細胞株の中では僅かに促進する。ラパマイシンは、ＨＯＳ細胞のように非常に許容的な細胞に対しては効果が少ないが、それは、このような細胞株は既に粘液腫ウイルスに対して最大限許容的であるという事実による可能性が高い。ラパマイシンによる最大の効果は、制限性（ＩＩ型）細胞株（７８６−０、ＨＣＴ１１６およびＡＣＨＮ）で観察されたが、これらは、野生型ウイルスに対しては許容性があるが、ｖＭｙｘＴ５ＫＯ株に対しては非許容性である。不全型（ＩＩＩ型）細胞株であるＭＣＦ−７およびＣＯＬＯ２０５においてさえもいくらかの効果が見られたが、不全型細胞株Ｍ１４では見られなかった。
【０１４５】
次に、ＢＧＭＫおよび７８６−０の感染細胞の試料を回収して溶解し、単離したウイルスを用いて、ＢＧＭＫ細胞の単層を感染させた（図３０）。Ｘ−Ｇａｌ染色を用いて、ウイルス感染した細胞を可視化した。
【０１４６】
粘液腫ウイルス感染に対して「制限的」な腫瘍細胞、すなわち、野生型粘液腫ウイルスの複製は許容するが、ＭＴ−５ノックアウトウイルスの複製は許容しない細胞をラパマイシンで処理すると、粘液腫ウイルスが、腎臓癌、結腸癌、および卵巣癌の細胞株を含む癌細胞株において複製する能力を回復する結果となった（図２９および３０）。
【０１４７】
さらに、ラパマイシンで処理すると、野生型ウイルスがこれらと同じ細胞の中では複製する能力は増強されたが、対照であるウサギ細胞または霊長類細胞では増強されなかった。これらの結果は、ラパマイシンが粘液腫ウイルスの感染を促進するように作用することを示している。また、ラパマイシンは、このウイルスに感染されにくい癌細胞がウイルス複製を許容する能力に影響を与えると考えられる。
【０１４８】
その後の実験で、野生型粘液腫ウイルスの感染を支持することができなかったヒト腫瘍細胞に対するラパマイシン処理の効果を調べた（図３１）。この事前処理は、対照である霊長類細胞や正常なヒト線維芽細胞に対してほとんど効果を示さなかったが、乳癌細胞株ＭＣＦ−７など、いくつかの細胞株におけるウイルスの感染力を増強することができた。ヒト腫瘍細胞のいくつかが、対照細胞株と同じように、ラパマイシン処理に対して抵抗性のままであったため、ラパマイシン処理によって、粘液腫ウイルスが、非形質転換組織に増殖性感染できるようになったとは考えにくい。
【０１４９】
（実施例３：改良型腫瘍退縮性ウイルス候補としての粘液腫ウイルスＭ１３５ＫＯ変異型。）
（Ｍ１３５Ｒは、初期遺伝子として粘液腫ウイルスから発現される）
粘液腫ウイルスは、ＭＶゲノムの配列決定から同定されたタンパク質（Ｍ１３５Ｒ）をコードし（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （１９９９） ２６４： ２９８−３１８）、宿主のＩＦＮα／β受容体を模倣し、ＩＦＮα／βが宿主の抗ウイルス応答を開始させないようにしていると予測されている （Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００１） １３：７３−８４）。この予測は、そのような免疫回避戦略を採ることが明らかになっている（Ｓｙｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ （１９９５） ８１ ：５５１−５６０）ワクシニアウイルス（Ｂ１８Ｒ）に由来するウイルスＩＦＮα／β受容体のホモログに対する配列相同性に基づいている。しかし、Ｍ１３５Ｒは、ＶＶＢ１８Ｒ、およびその他配列決定されたポックスウイルス由来のＩＮＦα／β−Ｒ相同体の大きさの半分しかないため、すべての場合で、ポックスウイルスＩＦＮα／β−Ｒの相同体のアミノ末端側の半分だけにしかアラインメントされない。図３２は、ＭＶのＭ１３５ＲとＶＶのＢ１８Ｒの間で予測された構造および配列の類似性を示している。Ｂ１８Ｒの最初の１７９アミノ酸残基だけが、配列アラインメントで示されている。表２は、Ｍ１４５Ｒと、表示されたポックスウイルスＩＦＮα／β−Ｒの相同体との一致率（％）を示している。対角線の上の数字は、一致率（％）を表し、対角線の下の数字は、２つの種間における類似性（％）を表している。上部を横切る括弧内の数字は、推定されたタンパク質のアミノ酸数を表している。予測されたＭ１３５Ｒ（１７８アミノ酸）の全長コピーと各相同体の最初の１７８残基だけの間で比較を行った。
【０１５０】
（表２ Ｍ１３５Ｒと他のポックスウイルス相同体との比較）
【０１５１】
【表２】
Ｍ１３５Ｒの推定免疫原領域に対するペプチドを合成して、ウエスタンブロット解析、免疫沈殿、および免疫蛍光法で使用したポリクローナル抗体をウサギの中で作製した。免疫ブロッティングによって、Ｍ１３５Ｒが、感染後早くも３時間でその発現を検出できる初期遺伝子として合成されていることを確認した（図３３Ａ；レーン１：模擬感染ＢＧＭＫ細胞；レーン２〜６：それぞれ感染後０、３、６、１８、および３６時間目のｖＭｙｘＬａｕに感染したＢＧＭＫ細胞）。感染細胞をＡｒａＣで処理すると、Ｍ１３５Ｒの合成は、後期のタンパク質発現を阻害しても変化することがないため、これは初期遺伝子であることが示される（図３３Ｂ）。しかし、ツニカマイシンで処理すると、おそらく、配列から予測された単一の部位で、Ｍ１３５ＲはＮ結合型グリコシル化されていることが示される（図３３Ｂ）。モネンシン処理によって、Ｏ結合型グルコシル化は存在しないことが示唆されている。図３３に示されている結果について、ＢＧＭＫには、ｍｏｉ１０で粘液腫ウイルスを感染させた。４０μｇ／ｍｌの濃度のＡｒａＣ、１μｇ／ｍｌのツニカマイシン、および１μｇ／ｍｌのモネンシンで、表示された時間に細胞を処理したか、処理しなかった。ペプチド抗体を用いてＭ１３５Ｒを検出した。
【０１５２】
（Ｍ１３５Ｒはシグナル配列をコードするが分泌されない）
Ｍ１３５Ｒの配列解析によって、推定シグナル配列が存在することが示されている（図３２Ｂ）。しかし、カルボキシ末端には膜貫通ドメインと推定されるものもある（図３２Ｂ）。感染ＢＧＭＫ細胞から得た上清の免疫ブロットは、Ｍ１３５Ｒが分泌されないことを示している。しかし、Ｍ１３５Ｒは、全細胞溶解液の中で簡単に検出される（図３３）。シグナル配列が、Ｍ１３５Ｒを細胞表面に追いやるよう機能したか否かを調べるために、本発明者らは、膜貫通ドメインを欠失させ、この変異体をバキュロウイルス発現系にクローニングした。Ａｃ１３５ＲとＡｃ１３５ΔＴＭに感染した上清を比較したところ、全長のＭ１３５Ｒが細胞溶解液中に見られ、分泌された証拠はない。これに対し、Ａｃ１３５ΔＴＭは分泌され、シグナル配列がＭ１３５Ｒを細胞外環境に追いやるよう機能していることが確認できる（データは示さず）。
【０１５３】
（Ｍ１３５Ｒタンパク質は、感染細胞の表面に局在する）
Ｍ１３５Ｒが機能的なシグナル配列と膜貫通ドメインをもつという観察結果から、本発明者らは、急いでＭ１３５Ｒの局在を調べた。２つの証拠が、Ｍ１３５Ｒが細胞表面に局在することを示している。まず、ＢＧＭＫをカバーガラスの上に播種して、２４時間ｖＭｙｘＬａｕ（ｍｏｉは１０）に感染させると、アフィニティー精製された抗Ｍ１３５Ｒ、次いでＦＩＴＣ結合二次抗体による免疫染色でＭ１３５Ｒが検出された（図３４Ａ）。Ｍ１３５Ｒの染色パターンは、感染した細胞の細胞表面への局在を示している。ｖＭｙｘＬａｕは、β−ｇａｌ遺伝子やＥＧＦＰ遺伝子の挿入によって改変されていない真正な粘液腫ウイルスの野生型である。
【０１５４】
第二の証拠は、Ｍ１３５Ｒが、ｖＭｙｚｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯのどちらかに感染したＧＨＯＳＴ細胞の細胞表面タンパク質のビオチン化に付随することである。感染後２４時間で細胞溶解液を調製した。ストレプトアビジンアガロースビーズを、細胞溶解液から得た全細胞タンパク質５００μｇと４５分間混合した。このビーズを洗浄して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離してから、抗Ｍ１３５Ｒでプローブした。感染した細胞の溶解液から得た５０μｇの全細胞タンパク質を対照として泳動した。ビオチン化した表面タンパク質を免疫沈殿すると、ｍ１３５Ｒが感染した細胞の表面に存在することが示される（図３４Ｂ）。
【０１５５】
（Ｍ１３５Ｒはインビトロにおける粘液腫ウイルスの複製に必須ではない）
Ｍ１３５Ｒが病原性因子として作用することができるかを調べるために、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒを欠失し、ＶＶ早期／後期プロモーター下でＥＧＦＰおよびｇｐｔをコードするカセット（４６０ヌクレオチド、すなわちｏｒｆの８６％が欠失している）で置換されている組換えウイルスを構築した。クローニング法およびカセットを図３５Ａに示す。ＥＧＦＰを発現するウイルスクローンを選択して、組換体をプラーク精製した。組換体の精製度をＰＣＲで確認した（図３５Ｂ；レーン１は１Ｋｂ＋ＤＮＡラダー、レーン２および３は、２つの精製ｖＭｙｘ１３５ＫＯクローンからのＰＣＲ産物。ＰＣＲ産物は、Ｍ１３５Ｒのコード領域が欠失されて、ＥＧＦＰ／ｇｐｔマーカーが挿入されている領域を表している。レーン２はプラーク１であり、レーン３はプラーク２である。レーン４は、同じ領域を示し、本来の切断されていないＭ１３５Ｒ遺伝子座をカバーしている）。ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯのいずれかに感染したＢＧＭＫ細胞の免疫ブロッティングによって、ｖＭｙｘ１３５ＫＯがＭ１３５Ｒ発現を失ってしまったことが確認された（図３５Ｃ；Ｍ１３５Ｒの発現の経時変化：レーン１は未感染のＢＧＭＫ細胞。レーン２〜６は、感染後０時間（レーン２）、３時間（レーン３）、６時間（レーン４）、１８時間（レーン５）、および３６時間（レーン６）における、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染したＢＧＭＫ細胞を示している。レーン７および８は、感染後６時間（レーン７）および１８時間（レーン８）における、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染したＢＧＭＫ細胞を示している。レーン９は、ＡｃＮＰＶで発現するＭ１３５Ｒをもつ陽性対照である）。
【０１５６】
一段階増殖曲線を用いて、ｖＭｙｘ１３５ＫＯがＢＧＭＫ細胞の中で複製できるかを調べた。ＢＧＭＫ細胞を、ｍｏｉ５でｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させ、表示された時間に細胞を回収した。ウイルスの力価をＢＧＭＫ細胞上で測定した。ｖＭｙｘｇｆｐとｖＭｙｘ１３５ＫＯの間で複製パターンの違いはなかった（図３６）。これらの結果は、Ｍ１３５Ｒがインビトロでの複製には必要でないことを示している。
【０１５７】
粘液腫ウイルスの別の遺伝子が、ウサギの初代胚線維芽細胞（ＲＥＦ）における粘液腫ウイルスの複製に影響できないかを調べた本発明者らの実験の際に、ノックアウト対照としてｖＭｙｘ１３５ＫＯを用いたが、奇妙な現象を観察した。ＲＥＦにｖＭｙｘｇｆｐを感染させると、正常な感染病巣が生じたが、ｖＭｙｘ１３５ＫＯは、感染のプラーク様ゾーンを生じさせた（図３７）。本発明者らが、この表現型を確認するために別の細胞を調べたとき、別のウサギ線維芽細胞（ＨＩＧ−８２、図３８）およびヒト初代線維芽細胞（ｃｃｄ９２２−ｓｋ、図３９）では、プラーク形成を反復させることができた。
【０１５８】
（Ｍ１３５Ｒはウサギにおける病原性に対する重大な病原因子である）
次に、本発明者らは、ｖＭｙｘ１３５ＫＯが実験用ウサギの中で粘液腫を発生させることができるかを調べた。ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘｇｆｐを感染させて、感染後９から１０日の安楽死させなければならない動物とは対照的に、ｖＭｙｘ１３５ＫＯを注射されたウサギは完全に回復した（表３）。Ｍ１３５Ｒの消失がｖＭｙｘ１３５ＫＯの弱毒化をもたらすことを確認するために、本発明者らは、Ｍ１３５Ｒが回復された復帰変異体ウイルスを作製し、この復帰変異体（ｖＭｙｘ１３５ＲＥＶ）が、粘液腫を生じさせる能力を回復することができるかを調べた。４つのウサギの処理グループはすべて、各ウイルスを注射してから最初の６日間は同じように応答した（表３）。本発明者らは、感染後４日目までは、すべての処理グループで、注射した部位に大きく赤い盛り上がった病変部ができるのを観察した。しかし、６日目に始まり、その後引き続き３〜４日間にわたって、さまざまなウイルスの間の違いが明らかになった。野生型または復帰変異型ウイルスを注射した動物は、耳、眼、および鼻に、ｖＭｙｘ１３５ＫＯを注射した動物には見られなかった数多くの二次的病変部を持っていた（表３）。本発明者らは、動物モデルにおいて、Ｍ１３５Ｒの消失は劇的にＭＶを弱毒化すると結論づけ、Ｍ１３５Ｒが重大な病原因子であることを示している。
【０１５９】
（表３ 野生型対照と比較したときのｖＭｙｘ１３５ＫＯの病原性）
【０１６０】
【表３】
実験前の３日間、ウサギの体温を毎日測った。これを動物の基礎体温と見なした。実験の間中、各動物の体温を毎日測り続けた。しかし、処理グループ間に体温の違いはなかった（図４０）。これは、Ｍ１３５Ｒが、感染動物の発熱反応に関与していないことを示唆するものである。
【０１６１】
（Ｍ１３５ＲはウサギＩＦＮα／βに結合または阻害しない）
Ｍ１３５Ｒの配列は、ＩＦＮα／β受容体の模倣体であるワクシニアＢ１８Ｒに類似している。本発明者らは、Ｍ１３５Ｒがウサギの１型ＩＦＮに結合できるかを調べた。まず、ウサギＩＦＮ（５μｇ、ヨードビーズを用いて）をヨウ素化して、ｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染した細胞が、ｖＭｙｘｇｆｐを（ｍｏｉ１０で）感染させた細胞と比較して、１２５Ｉ−ウサギＩＦＮに結合できるかを調べた。細胞を回収して、洗浄し、ガンマ線計測装置で計測した。Ｍ１３５Ｒの欠失は、感染細胞へのＩＦＮα／βの結合に影響せず、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞のいずれかの細胞表面に結合しているＩＦＮの量に差異は見られなかった（図４１）。また、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞を外来性のウサギ１型ＩＦＮで処理しても、ｖＭｙｘ１３５ＫＯによる細胞への感染には影響を与えなかった（図４２；細胞を１２穴培養皿に播種し、表示されたウイルスにｍｏｉ０．０１で感染させた；感染後７２〜９６時間目に蛍光巣の数を数えた；２００ユニットのウサギＩＦＮα／βを、感染させる２４時間前に添加するか、細胞を処理しなかった）。この同じ結果が、感染させる２４時間前に事前処理して、細胞の中で抗ウイルス状態を誘導したときにも見られた。ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞のいずれかで感染後に形成される巣に顕著な違いがあることに気づかなかった（データは示さず）。また、この現象は、細胞をヒトＩＦＮＡ／Ｄで処理した場合にも当てはまる（データは示さず）。また、Ａｃ１３５ΔＴＭの上清を、ＢＩＡｃｏｒｅチップに付着させたウサギＩＦＮα／βに適用すると、結合を全く観察できなくなった（データは示さず）。
【０１６２】
（実施例３：粘液腫ウイルス感染に関連してｍＴＯＲを阻害することの分子的影響）
ラパマイシンが粘液腫ウイルス感染を促進するＩＩ型癌細胞株である７８６−０細胞の細胞溶解液を用いてウエスタンブロット解析を行った（図４３）。ｖＭｙｘＬａｃまたはｖＭｙｘＴ５ＫＯのいずれかをＭＯＩ３で感染させたか、ウイルス感染させないままで１６時間経過した後に溶解液を回収した。表示したレーンには、感染前６時間２０ｎＭのラパマイシン（Ｒと命名）、または適当な賦形剤対照（ＤＭＳＯを１：５０００で希釈したもの、Ｄと命名）で事前処理した細胞からのタンパク質を含む。表示したタンパク質に対する一次抗体を用いてブロットをプローブした。
【０１６３】
実証されたように、粘液腫ウイルス感染は、ラパマイシンの生理学的標的であるｍＴＯＲに収束する多くのシグナル伝達経路に影響を与える。ラパマイシンがウイルス複製に大して有利な効果をもつ、野生型ウイルス（ｖＭｙｘＬａｃ）またはＭＴ−５欠損型ウイルス（ｖＭｙｘＴ５ＫＯ）のいずれかによる感染に関しては、ラパマイシン単独処理に基づいては予測しえなかった広範囲の効果が、これらのシグナル伝達分子の多くで見られた（模擬感染レーンを参照）。これらの効果には、ＡＫＴ−１、Ｒａｆ−１、ＧＳＫ−３β、およびｍＴＯＲ自身のキナーゼ活性が増加すること、ならびにＰＴＥＮおよびｐ７０Ｓ６Ｋのキナーゼ活性が低下することが含まれる。このデータは、これらの経路が、ヒト癌細胞株における粘液腫ウイルスの許容性に関与している可能性を示している。
【０１６４】
当業者には理解できるように、本明細書に記載した例示的な実施態様に多くの変更を加えることが可能である。それどころか、本発明は、請求項に記載されているように、そのような変更もすべてその範囲に含もうとするものである。
【０１６５】
本発明のさまざまな実施態様が本明細書に開示されているが、当技術分野における技術常識に従って、多くの適応および変更を本発明の範囲内で行うことができる。そのような変更には、同じ結果を実質的に同じ方法で得るために、本発明の何らかの態様について同等物であることが知られているものと置換することを含む。本明細書で使用される科学技術用語はすべて、別段の記載がない限り、本発明の技術分野における当業者に広く理解されている意味と同じ意味を有する。
【０１６６】
本明細書で引用されている参考文献はすべて参照されて、全部が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
図面は、本発明の実施態様が具体的に説明されているが、あくまで例示のためのものである。
【図１】細胞にウイルスが感染すると誘導される、インターフェロンによって誘導抗ウイルスシグナル伝達スキームの概略図である。
【図２】粘液腫ウイルスに曝露された後の非許容性の野生型マウス胎仔線維芽細胞（「ＭＥＦ」）の位相差顕微鏡写真であり、インターフェロンα／βを中和抗体で阻害した後にＭＥＦ細胞が許容性になることを示している。
【図３】粘液腫ウイルス感染後のＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化（活性化）状態を示すウエスタンブロットであり、ＭＥＦ細胞への非許容感染（ｎｏｎｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）は、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２のリン酸化と関連することを示している。
【図４】粘液腫ウイルス感染後のＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５およびＳＴ６のリン酸化（活性化）状態を示すウエスタンブロットであり、ＭＥＦ細胞への非許容感染は、これらの分子種のいずれも活性化しないことを示している
【図５】粘液腫ウイルス感染後のＩＮＦα／β Ｒ−／−型ＭＥＦおよびＳＴＡＴ１−／−型ＭＥＦの位相差顕微鏡写真であり、ＩＦＮ／ＳＴＡＴ／ＪＡＫシグナル伝達の不活性化は、細胞を粘液腫ウイルスに対して許容性にすることを示している。
【図６】粘液腫ウイルス感染後の非許容性野生型ＭＥＦにおけるＰＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、ＰＲＫは粘液腫ウイルス感染によって活性化されないことを示している。
【図７】模擬感染したか、粘液腫ウイルスに前感染した野生型ＭＥＦにおけるＰＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、粘液腫ウイルスが、ＭＥＦ細胞におけるＰＫＲ活性化を阻止することを示している。
【図８】粘液腫ウイルス感染後の野生型ＭＥＦにおけるＰＥＫＲのリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、粘液腫ウイルスが、ＭＥＦ細胞におけるＰＥＫＲの活性化を阻止することを示している。
【図９】粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−という三重のノックアウトの位相差顕微鏡写真であり、ＭＥＦ細胞における抗ウイルス状態は別の経路によってもたらされていることを示している。
【図１０】粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−の三重ノックアウトの位相差顕微鏡写真である。
【図１１】ＩＮＦα／βに対する中和抗体で処理した後、および粘液腫ウイルスに曝露した後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅ Ｌ−／−、およびＭｘ１−／−という三重のノックアウトの位相差顕微鏡写真である。
【図１２】ＩＮＦα／βに対する中和抗体で処理した後、および粘液腫ウイルスに曝露した後の非許容性ＭＥＦにおけるｅＩＦ２αおよびＰＫＲのリン酸化レベルを示すウエスタンブロットであり、非応答性細胞におけるｅＩＦ２αのリン酸化は、ＰＫＲ非依存的経路によって触媒されることを示している。
【図１３】粘液腫ウイルス感染後のＰＫＲ−／−、ＲＮａｓｅＬ−／−、およびＭｘ１−／−三重のノックアウトにおけるＳＴＡＴ１のリン酸化状態を示すウエスタンブロットであり、正常なＩＦＮ誘導シグナル応答を示している。
【図１４】感染１２時間後の非許容性ＰＫＲ−／−＋ＲＮａｓｅＬ−／−＋Ｍｘ１−／−細胞におけるチロシンリン酸化型ＳＴＡＴ１の細胞内の局在を示す位相差顕微鏡写真であり、正常なＩＦＮ／ＳＴＡＴシグナル応答で予測されたように、活性化されたＳＴＡＴ１は核に局在することを示している。
【図１５】模擬感染させたか、ＧＦＰを発現する死菌または生菌の粘液腫ウイルスに感染させた、頭蓋骨内に神経膠腫を有するヌードマウスの脳の蛍光画像であり、粘液腫ウイルスが神経膠腫細胞を標的とすることを示している。
【図１６】ＧＦＰを発現する粘液腫ウイルスに感染したマウスの薄層切片の蛍光画像および写真であり、粘液腫ウイルスが腫瘍細胞だけで複製することを示している。
【図１７】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＨＴ２９ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における非許容感染の例を示すものである。
【図１８】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＨＯＰ９２ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図１９】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＯＶＣＡＲ４ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図２０】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＳＫ−ＭＥＬ３ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における許容感染の例を示すものである。
【図２１】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＳＫ−ＭＥＬ２８ヒト腫瘍細胞の位相差顕微鏡写真であり、ヒト細胞における半許容感染の例を示すものである。
【図２２】粘液腫ウイルスに感染した後にＸ−Ｇａｌまたはクリスタルバイオレットのいずれかで染色したＢＧＭＫ細胞の位相差顕微鏡写真であり、典型的な許容性対照感染の例を示すものである。
【図２３】ＬａｃＺタンパク質を発現する粘液腫ウイルスの高濃度液を感染させた陽性対照ＢＧＭＫ細胞、およびヒト腫瘍細胞株Ｕ８７、Ａ１７２、およびＵ３７３を、Ｘ−Ｇａｌで染色したものの位相差顕微鏡写真であり、これらのヒト神経膠腫はすべて、粘液腫ウイルスの複製に対して許容性であったことを示している。
【図２４】高濃度の粘液腫ウイルスに感染させたＢＧＭＫ、Ｕ８７、Ａ１７２、およびＵ３７３の各細胞の感染７２時間後の生存率を示す図であり、粘液腫ウイルスがこれらの細胞をすべて死滅させることができることを示している。
【図２５】ＭＶ ＧＦＰに感染させたＳＦ０４ １５８５星状細胞腫細胞の位相差顕微鏡写真および蛍光画像であり、初代ヒト神経膠腫細胞で感染が起きたことを示している。
【図２６】ＬａｃＺタンパク質を発現する粘液腫ウイルスに感染させたＵ３７３神経膠腫細胞をＸ−Ｇａｌで染色したものの位相差顕微鏡写真であり、これらのヒト腫瘍細胞で感染が起きたことを示している。
【図２７】ＭＶ ＧＦＰに感染させたＳＦ０４ １５８５細胞の感染４８時間後の生存率を示す図であり、これらの感染ヒト腫瘍細胞が死滅したことを示している。
【図２８】ＧＦＰを発現する粘液腫ウイルスに感染させたＤａｏｙ髄芽細胞およびＤ３８４髄芽細胞の蛍光顕微鏡写真であり、これらのヒト腫瘍細胞で感染が起きたことを示している。
【図２９−１】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−２】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−３】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−４】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図２９−５】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである：ＢＧＭＫ（初代対照用細胞株）；ＲＫ−１３およびＲＬ５（ウサギ対照細胞株）；４ＴｌおよびＢ１６Ｆ１０（マウス癌細胞株）；ＨＯＳ、ＰＣ３、７８６−０、ＨＣＴｌ１６、ＡＣＨＮ、ＭＣＦ−７、Ｍ１４ならびにＣＯＬＯ２０５（ヒト癌細胞）、野生型ウイルスをｖＭｙｘＬａｃ、Ｍ−Ｔ５ノックアウトウイルスをｖＭｙｘＴ５ＫＯとして表示する。
【図３０】ｖＭｙｘＬａｃまたはｖＭｙｘＬａｃＴ５−のいずれかに感染させたウイルス感染細胞株の写真である。
【図３１−１】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３１−２】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３１−３】ラパマイシンで事前処理した場合としない場合のさまざまな細胞株（ＢＧＭＫ；Ａ９；ＭＣＦ−７；ＭＤＡ−ＭＢ−４３５；Ｍ１４；およびＣＯＬＯ２０５）におけるウイルス産生速度をグラフ表示したものである。
【図３２】（Ａ）粘液腫ウイルスタンパク質Ｍ１３５Ｒおよびワクシニアウイルスタンパク質Ｂ１８Ｒのアラインメントの略図である。（Ｂ）Ｍ１３５Ｒと、Ｂ１８Ｒの最初の１７９アミノ酸のアミノ酸配列アラインメントである。
【図３３】（Ａ）粘液腫ウイルスのローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株（ｖＭｙｘＬａｕ）に感染させたＢＧＭＫ細胞で発現したＭ１３５Ｒのウエスタンブロット。（Ｂ）ｖＭｙｘＬａｕに感染させ、ａｒａＣ、ツニカマイシン、またはたモネンシンで処理したＢＧＭＫ細胞で発現したＭ１３５Ｒのウエスタンブロット。
【図３４】（Ａ）模擬感染させたか、粘液腫ウイルスに感染させ、Ｍ１３５Ｒについて染色したＢＧＭＫ細胞の蛍光画像。（Ｂ）野生型粘液腫ウイルス（ｖＭｙｘｇｆｐ）またはＭ１３５Ｒノックアウト株（ｖＭｙｘ１３５ＫＯ）に感染させた細胞の免疫沈殿物または細胞可溶化物に対する、抗Ｍ１３５Ｒ抗体を用いたウエスタンブロット。
【図３５】（Ａ）ｖＭｙｘ１３５ＫＯを作出するためのクローニング法の概略図。（Ｂ）ＰＣＲ挿入配列産物のアガロースゲル。（Ｃ）野生型粘液腫ウイルスおよびＭ１３５Ｒノックアウト粘液腫ウイルスに感染させた細胞のウエスタンブロット。
【図３６】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたＢＧＭＫ細胞におけるウイルス増殖巣の増殖曲線である。
【図３７】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギ胚線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図３８】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギＨＩＧ８２線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図３９】ｖＭｙｘｇｆｐまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたヒト初代線維芽細胞の光学顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真である。
【図４０】ｖＭｙｘＬａｕまたはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させたウサギの体温のグラフである。
【図４１】模擬感染させたか、またはｖＭｙｘｇｆｐもしくはｖＭｙｘ１３５ＫＯに感染させ、１２５Ｉで標識したウサギインターフェロンα／βで処理した細胞の１２５Ｉ放射のグラフである。
【図４２】感染させる２４時間前にウサギインターフェロンα／βで処理するか、無処理のままで、ＲＫ１３細胞またはＢＧＭＫ細胞にｖＭｙｘｇｆｐもしくはｖＭｙｘ１３５ＫＯを感染させることによって形成された増殖巣のグラフである。
【図４３】２０ｎＭラパマイシン（Ｒ）、または賦形剤対照（Ｄ）で予め処理した７８６−０ヒト癌細胞の細胞可溶化物を用い、図に示したタンパク質に対する抗体を用いてプローブ検索したウエスタンブロットの写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、該細胞に有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染したヒト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記病状が癌である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスと前記ラパマイシンは注射によって前記癌の部位に投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスと前記ラパマイシンは全身に投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用。
【請求項２２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤の製造における、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用。
【請求項２３】
前記細胞がインターフェロン非応答性である、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染している、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項２０から２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項２０から２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項３０】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
患者における病状を治療するための有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする、使用。
【請求項３２】
患者における病状を治療するための薬剤の製造における有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することを特徴とする、使用。
【請求項３３】
前記病状が癌である、請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３４】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項３３記載の使用。
【請求項３６】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３７】
前記患者がヒトである、請求項３１から３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３８】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項３１から３７のいずれか一項記載の使用。
【請求項３９】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項３１から３７のいずれか一項記載の使用。
【請求項４０】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
粘液腫ウイルスとラパマイシンを含む医薬組成物。
【請求項４２】
さらに付加的治療薬を含む、請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記付加的治療薬が化学療法薬である、請求項４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための、粘液腫ウイルス、ラパマイシンおよび使用説明書を含むキット。
【請求項４５】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物に細胞の集団を曝露する工程、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に該ウイルスを感染させる工程、および該細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを判定する工程を含む方法。
【請求項４６】
前記細胞集団が患者の体内にあり、前記曝露工程が、前記粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を該患者に投与することを含み、該粘液腫ウイルスが、検出可能なマーカーを発現するよう遺伝子改変されており、かつ、前記判定工程が、該患者の中で該検出可能なマーカーを発現する細胞を検出することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞集団が培養されている、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスを、随意で有効量のラパマイシンと組み合わせて細胞に投与することを含む、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法。
【請求項４９】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染しているヒト細胞である、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスを投与することを含む方法。
【請求項５６】
さらに、有効量のラパマイシンを前記患者に投与することを含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記病状が癌である、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項５８】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記患者がヒトである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
前記癌の部位に注射することによって前記投与が行われる、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項６３】
前記投与が全身性である、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項６４】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項５５記載の方法。
【請求項６５】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量の使用。
【請求項６６】
有効量のラパマイシンをさらに配合する、請求項６５記載の使用。
【請求項６７】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量の使用。
【請求項６８】
薬剤が、有効量のラパマイシンと配合して投与されるように処方されている、請求項６７記載の使用。
【請求項６９】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項６５から６８のいずれか一項記載の使用。
【請求項７０】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項６９記載の使用。
【請求項７１】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染している、請求項７０記載の使用。
【請求項７２】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項７０記載の使用。
【請求項７３】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項７２記載の使用。
【請求項７４】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項６５から７３のいずれか一項記載の使用。
【請求項７５】
患者における病状を治療するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスの使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することを特徴とする、使用。
【請求項７６】
有効量のラパマイシンをさらに含む、請求項７５記載の使用。
【請求項７７】
前記患者における病状を治療するための薬剤の製造のための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスの使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする、使用。
【請求項７８】
前記薬剤が、有効量のラパマイシンと配合して投与されるように処方されている、請求項７７記載の使用。
【請求項７９】
前記病状が癌である、請求項７５から７８のいずれか一項記載の使用。
【請求項８０】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項７９記載の使用。
【請求項８１】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項７９記載の使用。
【請求項８２】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項７５から７８のいずれか一項記載の使用。
【請求項８３】
前記患者がヒトである、請求項７５から８２のいずれか一項記載の使用。
【請求項８４】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項７５から８３のいずれか一項記載の使用。
【請求項８５】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス。
【請求項８６】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを含む医薬組成物。
【請求項８７】
さらにラパマイシンを含む、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項８８】
さらに付加的治療薬を含む、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項８９】
前記付加的治療薬が化学療法薬である、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項９０】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスおよび使用説明書を含むキット。
【請求項９１】
さらにラパマイシンを含む、請求項９０記載のキット。
【請求項９２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスに細胞の集団を曝露する工程、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に該ウイルスを感染させる工程、および該細胞集団のどの細胞が該粘液腫ウイルスに感染したかを判定する工程を含む方法。
【請求項９３】
前記細胞集団が患者の体内にあり、前記曝露工程が、前記機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを該患者に投与することを含み、該機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスが、検出可能なマーカーを発現するよう遺伝子改変されており、かつ、前記判定工程が、該患者の中で該検出可能なマーカーを発現する細胞を検出することを含む、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
ラパマイシンと組み合わせて前記曝露が行われる、請求項９２または９３記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞集団が培養されている、請求項９２記載の方法。
【請求項１】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法であって、該細胞に有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染したヒト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記病状が癌である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記患者がヒトである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスと前記ラパマイシンは注射によって前記癌の部位に投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスと前記ラパマイシンは全身に投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用。
【請求項２２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤の製造における、有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用。
【請求項２３】
前記細胞がインターフェロン非応答性である、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染している、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項２０から２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項２０から２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項３０】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
患者における病状を治療するための有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする、使用。
【請求項３２】
患者における病状を治療するための薬剤の製造における有効量の粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物の使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することを特徴とする、使用。
【請求項３３】
前記病状が癌である、請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３４】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項３３記載の使用。
【請求項３６】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項３１または３２記載の使用。
【請求項３７】
前記患者がヒトである、請求項３１から３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３８】
前記粘液腫ウイルスが野生型ウイルスである、請求項３１から３７のいずれか一項記載の使用。
【請求項３９】
前記粘液腫ウイルスが遺伝子改変されている、請求項３１から３７のいずれか一項記載の使用。
【請求項４０】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
粘液腫ウイルスとラパマイシンを含む医薬組成物。
【請求項４２】
さらに付加的治療薬を含む、請求項４１記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記付加的治療薬が化学療法薬である、請求項４２記載の医薬組成物。
【請求項４４】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための、粘液腫ウイルス、ラパマイシンおよび使用説明書を含むキット。
【請求項４５】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物に細胞の集団を曝露する工程、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に該ウイルスを感染させる工程、および該細胞集団のどの細胞が粘液腫ウイルスに感染したかを判定する工程を含む方法。
【請求項４６】
前記細胞集団が患者の体内にあり、前記曝露工程が、前記粘液腫ウイルスとラパマイシンの配合物を該患者に投与することを含み、該粘液腫ウイルスが、検出可能なマーカーを発現するよう遺伝子改変されており、かつ、前記判定工程が、該患者の中で該検出可能なマーカーを発現する細胞を検出することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞集団が培養されている、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスを、随意で有効量のラパマイシンと組み合わせて細胞に投与することを含む、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害する方法。
【請求項４９】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染しているヒト細胞である、請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療する方法であって、それを必要とする患者に機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスを投与することを含む方法。
【請求項５６】
さらに、有効量のラパマイシンを前記患者に投与することを含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記病状が癌である、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項５８】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記患者がヒトである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
前記癌の部位に注射することによって前記投与が行われる、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項６３】
前記投与が全身性である、請求項５５または５６記載の方法。
【請求項６４】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項５５記載の方法。
【請求項６５】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量の使用。
【請求項６６】
有効量のラパマイシンをさらに配合する、請求項６５記載の使用。
【請求項６７】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するための薬剤を製造するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスの有効量の使用。
【請求項６８】
薬剤が、有効量のラパマイシンと配合して投与されるように処方されている、請求項６７記載の使用。
【請求項６９】
前記細胞がインターフェロンに非応答性である、請求項６５から６８のいずれか一項記載の使用。
【請求項７０】
前記細胞が異常なインターフェロンシグナル伝達を示す、請求項６９記載の使用。
【請求項７１】
前記細胞が慢性的にウイルスに感染している、請求項７０記載の使用。
【請求項７２】
前記細胞がヒト癌細胞である、請求項７０記載の使用。
【請求項７３】
前記細胞が肺癌細胞、黒色腫細胞、腎臓癌細胞、神経膠腫細胞、または星状細胞腫細胞である、請求項７２記載の使用。
【請求項７４】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項６５から７３のいずれか一項記載の使用。
【請求項７５】
患者における病状を治療するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスの使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が患者に存在することを特徴とする、使用。
【請求項７６】
有効量のラパマイシンをさらに含む、請求項７５記載の使用。
【請求項７７】
前記患者における病状を治療するための薬剤の製造のための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない有効量の粘液腫ウイルスの使用であって、該病状は、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする、使用。
【請求項７８】
前記薬剤が、有効量のラパマイシンと配合して投与されるように処方されている、請求項７７記載の使用。
【請求項７９】
前記病状が癌である、請求項７５から７８のいずれか一項記載の使用。
【請求項８０】
前記癌が固形癌、造血細胞癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、口腔癌、卵巣癌、喉頭癌、肝細胞癌、胆管癌、扁平上皮細胞癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌または黒色腫である、請求項７９記載の使用。
【請求項８１】
前記癌が肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、神経膠腫、または星状細胞腫である、請求項７９記載の使用。
【請求項８２】
前記病状が慢性ウイルス感染症である、請求項７５から７８のいずれか一項記載の使用。
【請求項８３】
前記患者がヒトである、請求項７５から８２のいずれか一項記載の使用。
【請求項８４】
前記粘液腫ウイルスが、治療用遺伝子を発現するよう遺伝子改変されている、請求項７５から８３のいずれか一項記載の使用。
【請求項８５】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルス。
【請求項８６】
機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを含む医薬組成物。
【請求項８７】
さらにラパマイシンを含む、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項８８】
さらに付加的治療薬を含む、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項８９】
前記付加的治療薬が化学療法薬である、請求項８６記載の医薬組成物。
【請求項９０】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を阻害するため、または先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞が存在することを特徴とする病状を治療するための、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスおよび使用説明書を含むキット。
【請求項９１】
さらにラパマイシンを含む、請求項９０記載のキット。
【請求項９２】
先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞を検出する方法であって、機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスに細胞の集団を曝露する工程、先天的な抗ウイルス応答を欠損した細胞に該ウイルスを感染させる工程、および該細胞集団のどの細胞が該粘液腫ウイルスに感染したかを判定する工程を含む方法。
【請求項９３】
前記細胞集団が患者の体内にあり、前記曝露工程が、前記機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスを該患者に投与することを含み、該機能的なＭ１３５Ｒを発現しない粘液腫ウイルスが、検出可能なマーカーを発現するよう遺伝子改変されており、かつ、前記判定工程が、該患者の中で該検出可能なマーカーを発現する細胞を検出することを含む、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
ラパマイシンと組み合わせて前記曝露が行われる、請求項９２または９３記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞集団が培養されている、請求項９２記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図２９−４】
【図２９−５】
【図３０】
【図３１−１】
【図３１−２】
【図３１−３】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図２９−４】
【図２９−５】
【図３０】
【図３１−１】
【図３１−２】
【図３１−３】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【公表番号】特表２００８−５３１７３９（Ｐ２００８−５３１７３９Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０００１６（Ｐ２００８−５０００１６）
【出願日】平成１８年３月６日（２００６．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４３８５
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５３１０５３０）ロバーツ リサーチ インスティテュート (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月６日（２００６．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９４３８５
【国際公開日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５３１０５３０）ロバーツ リサーチ インスティテュート (6)
【Ｆターム（参考）】
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