活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤
【課題】安全性の高い天然抽出物を有効成分とする活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤を提供する。
【解決手段】本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤に、キウイの摘果果実からの抽出物を含有せしめる。
【解決手段】本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤に、キウイの摘果果実からの抽出物を含有せしめる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、活性酸素としては、スーパーオキサイド（すなわち酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン：・Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）及び一重項酸素（１Ｏ２）等が挙げられる。これらの活性酸素は、食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウィルスや癌細胞の除去に重要な働きを果たしている。
【０００３】
しかしながら、活性酸素の過剰な生成は、生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。通常、生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、細胞内に含まれているスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の触媒作用により逐次消去されているが、スーパーオキサイドの産生が過剰である場合、又はＳＯＤの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分となり、スーパーオキサイド濃度が高くなり、これが関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等を引き起こす。
【０００４】
特に、皮膚は、紫外線等の環境因子の刺激を直接受けることから、スーパーオキサイドが生成しやすい器官であるため、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解し、変性し又は架橋したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素によって引き起こされる障害が、皮膚のしわ形成や皮膚の弾力低下等の老化の原因になるものと考えられている。したがって、活性酸素や生体内ラジカルの生成を阻害・抑制することにより、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害を予防、治療又は改善できるものと考えられる。
【０００５】
また、活性酸素は、炎症、過酸化脂質の生成、種々の酵素の失活及びＤＮＡの損傷等を引き起こすことが知られており、これら酸化的細胞障害は、肌荒れ、しわ形成、皮膚の弾力性低下等の皮膚老化の原因の一つと考えられている。
【０００６】
そこで、活性酸素消去物質、ラジカル消去物質等を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされており、このような作用を有するものとして、アブラナ科ブラシカ属植物からの抽出物（特許文献１参照）等が知られている。また、活性酸素に起因して生じる酸化的細胞障害を抑制し得るものとして、セイヨウクロタネソウ、コオウレン、ウォーターヒソップからの抽出物（特許文献２参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８１８４８号公報
【特許文献２】特開２００９−２２７５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性の高い天然抽出物から活性酸素消去作用、ラジカル消去作用及び酸化的細胞障害抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とする活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明において「キウイの摘果果実」とは、キウイ果実の栽培過程において、栽培されるキウイ果実の糖度及び大きさを所望の範囲に増大させることを目的として間引かれる（剪定される）果実のことを意味し、具体的には、糖度が３．０〜７．０％、好ましくは４．０〜５．５％であって、かつ大きさ（長径）が１〜４ｃｍ、好ましくは２〜３ｃｍであるキウイの果実のことを意味する。
【００１１】
また、本発明において「酸化的細胞障害」とは、活性酸素に起因して生じる細胞障害、特に炎症、過酸化脂質生成、種々の酵素の失活、ＤＮＡ損傷等の酸化障害を意味し、皮膚組織障害等の組織障害も含まれる。なお、活性酸素によって障害が生じる細胞としては、活性酸素によって障害が生じる生体細胞である限り特に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、天然物であるキウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有し、安全性の高い活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、キウイ（学名：Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の摘果果実からの抽出物を有効成分として含有する。
【００１４】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の摘果果実を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）は、マタタビ科マタタビ属に属する落葉つる性低木であり、その果実は日本各地で栽培されており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用するキウイの構成部位は摘果果実である。なお、本発明において抽出原料として使用し得るキウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の栽培品種としては、特に限定されるものではないが、レインボーレッド、アップルキウイ、紅心、ゴールデンキング、ゼスプリゴールド、小林３９、ビュアカントリー、ファーストエンペラー、ティアドロップ、紅鮮、グレープキウイ、さぬきゴールド、豊蜜等を好適に用いることができる。
【００１６】
抽出原料として使用するキウイの摘果果実は、その糖度が３．０〜７．０％であって、かつ大きさ（長径）が１〜４ｃｍのものであり、好ましくは糖度が４．０〜５．５％であって、かつ大きさ（長径）が２〜３ｃｍのものである。
【００１７】
キウイの摘果果実からの抽出物は、抽出原料を、粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。
【００１８】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、酸性・アルカリ性イオン水、海洋深層水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２０】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２１】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜１００容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜１００容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して多価アルコール１〜１００容量部を混合することが好ましい。
【００２２】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２３】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２４】
キウイの摘果果実からの抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２５】
上記のようにして得られるキウイの摘果果実からの抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有しているため、それぞれの作用を利用して活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の有効成分として用いることができる。
【００２６】
また、後述する実施例から明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物は、表皮角化細胞増殖促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用又は紫外線照射による細胞障害抑制作用をも有しているため、それぞれの作用を利用して抗老化剤、表皮角化細胞増殖促進剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤又は紫外線照射による細胞障害抑制剤の有効成分として用いることもできる。
【００２７】
上記各薬剤は、キウイの摘果果実からの抽出物のみからなるものであってもよいし、キウイの摘果果実からの抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００２８】
キウイの摘果果実からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、キウイの摘果果実からの抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができる。
【００２９】
なお、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、必要に応じて、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として用いることができる。
【００３０】
本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法（例えば、経口投与、経粘膜投与等）を適宜選択すればよい。
【００３１】
また、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３２】
本実施形態の活性酸素消去剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する活性酸素消去作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の活性酸素消去剤は、これらの用途以外にも活性酸素消去作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
本実施形態のラジカル消去剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有するラジカル消去作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素（ラジカル）が関与する各種障害を予防・改善することができる。ただし、本実施形態のラジカル消去剤は、これらの用途以外にもラジカル消去作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３４】
本実施形態の酸化的細胞障害抑制剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する酸化的細胞障害抑制作用を通じて、活性酸素に起因して生じる細胞障害を抑制することができ、この結果、肌荒れ、しわ形成、皮膚の弾力性低下等の皮膚の老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の酸化的細胞障害抑制剤は、これらの用途以外にも酸化的細胞障害抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３５】
キウイの摘果果実からの抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有しており、皮膚に適用した場合の使用感又は安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。
【００３６】
この場合において、皮膚化粧料には、キウイの摘果果実からの抽出物をそのまま配合してもよいし、キウイの摘果果実からの抽出物から製剤化した活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤を配合してもよい。
【００３７】
キウイの摘果果実からの抽出物、又は当該キウイの摘果果実からの抽出物から製剤化した活性酸素消去剤、ラジカル消去剤若しくは酸化的細胞障害抑制剤を配合することにより、皮膚化粧料に活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を付与することができる。
【００３８】
キウイの摘果果実からの抽出物等を配合し得る皮膚化粧料の種類は特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション等が挙げられる。
【００３９】
キウイの摘果果実からの抽出物等を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、０．０００５〜０．４５質量％（固形分換算）であり、特に好適な配合率は、０．００５〜０．０５質量％（固形分換算）である。なお、後述する実施例において明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物は、キウイの完熟果実からの抽出物と比較して、より低濃度において活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を奏し得ることから、キウイの摘果果実からの抽出物の皮膚化粧料における配合率を０．０００５〜０．００１質量％（固形分換算）と低濃度にしたとしても、皮膚化粧料に所望とする作用を付与することができる。
【００４０】
上記皮膚化粧料は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された上記成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００４１】
上記皮膚化粧料は、高い安全性を有しており、かつ活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用及びプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害、乾燥肌、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。
【００４２】
なお、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕キウイ摘果果実抽出物の製造
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)，レインボーレッド種）の摘果果実（糖度：４．３％，長径：２ｃｍ）の粉砕物２００ｇに抽出溶媒（精製水）４００ｍＬを加え、３０℃にて１時間加温抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理をした。得られた抽出液を合わせて減圧下で濃縮し、さらに乾燥してキウイ摘果果実抽出物５．５ｇを得た。
【００４５】
〔比較例１〕キウイ果実抽出物の製造
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)，レインボーレッド種）の完熟果実（糖度：１３．４％，長径：５ｃｍ）の粉砕物２００ｇを使用した以外は実施例１と同様にして、キウイ果実抽出物１８．５ｇを得た。
【００４６】
〔試験例１〕スーパーオキサイド消去作用試験（ＮＢＴ法）
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてスーパーオキサイド消去作用を試験した。
【００４７】
試験管に、０．０５ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）を２．４ｍＬ、並びに３ｍＭのキサンチン、３ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液及び０．７５ｍＭのＮＢＴ（nitroblue tetrazolium）を０．１ｍＬずつ加え、これに試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表１を参照）０．１ｍＬを添加し、２５℃で１０分間放置した。放置後、酵素溶液としてのキサンチンオキシダーゼ０．１ｍＬを加えて素早く攪拌し、２５℃で２０分間反応させた。その後、６ｍＭの塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させて、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４８】
酵素溶液を添加しない場合についても、同様の操作と吸光度の測定を行い、さらに、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。得られた結果から、下記式によりスーパーオキサイド消去率（％）を算出した。
【００４９】
スーパーオキサイド消去率(％)＝{１−(Ａ−Ｂ)／(Ｃ−Ｄ)}×１００
式中、Ａは「酵素溶液添加・試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｂは「酵素溶液無添加・試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃは「酵素溶液添加・試料溶液無添加時の吸光度」を表し、Ｄは「酵素溶液無添加・試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、特に高濃度（１００μｇ／ｍＬ）において極めて優れたスーパーオキサイド消去作用（活性酸素消去作用）を有することが確認された。一方、キウイ果実抽出物（比較例１）は、スーパーオキサイド消去作用をほとんど示さなかった。また、キウイ摘果果実抽出物のスーパーオキサイド消去作用の強さは、抽出物（試料）濃度に依存して向上することから、スーパーオキサイド消去作用の程度は、キウイ摘果果実抽出物の濃度によって調節できることが確認された。
【００５２】
〔試験例２〕ラジカル消去作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてラジカル消去作用を試験した。
【００５３】
１．５×１０−４ＭのＤＰＰＨ（diphenyl-p-picrylhydrazyl）エタノール溶液３ｍＬに試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表２を参照）３ｍＬを加え密栓した後、振り混ぜて３０分間放置した。放置後、波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、試料溶液の代わりに試料を溶解した溶媒のみを用いて同様の操作をして、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして、エタノールに試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果から、下記式によりラジカル消去率（％）を算出した。
【００５４】
ラジカル消去率(％)＝{１−(Ｂ−Ｃ)／Ａ}×１００
式中、Ａは「コントロールの吸光度」を表し、Ｂは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃは「ブランクの吸光度」を表す。
結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、特に高濃度（２００μｇ／ｍＬ）において優れたラジカル消去作用を有することが確認された。一方、キウイ果実抽出物（比較例１）は、ラジカル消去作用を示さなかった。また、キウイ摘果果実抽出物のラジカル消去作用の強さは、抽出物（試料）濃度に依存して向上することから、ラジカル消去作用の程度は、キウイ摘果果実抽出物の濃度によって調節できると考えられる。
【００５７】
〔試験例３〕酸化的細胞障害抑制作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして酸化的細胞障害抑制作用を試験した。
【００５８】
４０歳の健常人男性皮膚由来線維芽細胞（ＮＢＫＮ，研究同意を得て樹立したもの，継代数：１３以下）を、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum，ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified minimum essential medium，ギブコ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養した。
【００５９】
プラスミドｐＧＬ２を滅菌水で３１μｇ／ｍＬに希釈し、６０ｍｍディッシュに移した後、ローズベンガル（関東化学社製，１００μｇ／ｍＬ）を添加し、可視光線（キセノンランプ，ウシオ電機社製，３７０〜７６０ｎｍ，３０ｃｍ）を１０分間照射した。
【００６０】
２４ウェルプレートに細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）を播種し、１８時間培養した。ローズベンガル添加又は非添加のプラスミド（０．２μｇ ＤＮＡ／ウェル）に遺伝子導入剤（Qiagen社製）を添加し、３７℃で２４時間導入させた。培地交換後、試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表３を参照）を添加し、さらに２４時間培養した。
【００６１】
細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した後、滅菌水で５倍希釈した細胞溶解剤（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５），２ｍＭ ＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μＬ／ウェル添加した。その後、−８０℃で３０分保存し、室温で１５分間放置することで細胞を融解させた。
【００６２】
プレート攪拌（室温，１５分）した後、スクレーバーで細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心用チューブに回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，２分）した。上清２０μＬ及び発光基質（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２０ｍＭ Tricine／１．０７ｍＭ (ＭｇＣＯ３)４Ｍｇ(ＯＨ)２・５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ ＤＴＴ／２７０μＭ Coenzyme A／４７０μＭ luciferin／５３０μＭ ＡＴＰ）１００μＬを添加し、室温で混和後、ルミノメーター（GENELIGHT55，マイクロテック・ニチオン社製）にセットし、５６０ｎｍで測定した。
【００６３】
酸化的細胞障害抑制率（％）は、ローズベンガル非添加に対するローズベンガル添加後のＤＮＡ修復によるルシフェラーゼ活性量を算出することにより求めた。
結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
【００６５】
表３に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた酸化的細胞障害抑制作用を有することが確認された。
【００６６】
〔試験例４〕紫外線照射による細胞障害抑制作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして紫外線照射による細胞障害抑制作用を試験した。
【００６７】
４０歳の健常人男性皮膚由来線維芽細胞（ＮＢＫＮ，研究同意を得て樹立したもの，継代数：１３以下）を、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum，ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified minimum essential medium，ギブコ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養した。
【００６８】
プラスミドｐＧＬ２を滅菌水で３１μｇ／ｍＬに希釈し、６０ｍｍディッシュに移した後、氷上で紫外線を１５００Ｊ／ｍ２照射した。
【００６９】
２４ウェルプレートに細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）を播種し、１８時間培養した。紫外線照射又は未照射のプラスミド（０．２μｇ ＤＮＡ／ウェル）に遺伝子導入剤（Qiagen社製）を添加し、３７℃で２４時間導入させた。培地交換後、試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表４を参照）を添加し、さらに２４時間培養した。
【００７０】
細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した後、滅菌水で５倍希釈した細胞溶解剤（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５），２ｍＭ ＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μＬ／ウェル添加した。その後、−８０℃で３０分保存し、室温で１５分間放置することで細胞を融解させた。
【００７１】
プレート攪拌（室温，１５分）した後、スクレーバーで細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心用チューブに回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，２分）した。上清２０μＬ及び発光基質（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２０ｍＭ Tricine／１．０７ｍＭ (ＭｇＣＯ３)４Ｍｇ(ＯＨ)２・５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ ＤＴＴ／２７０μＭ Coenzyme A／４７０μＭ luciferin／５３０μＭ ＡＴＰ）１００μＬを添加し、室温で混和後、ルミノメーター（GENELIGHT55，マイクロテック・ニチオン社製）にセットし、５６０ｎｍで測定した。
【００７２】
紫外線照射による細胞障害抑制率（％）は、紫外線未照射に対する紫外線照射後のＤＮＡ修復によるルシフェラーゼ活性量を算出することにより求めた。
結果を表４に示す。
【００７３】
【表４】
【００７４】
表４に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた紫外線照射による細胞障害抑制作用を有することが確認された。
【００７５】
〔試験例５〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００７６】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となるようにEpiLife-KG2で希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、EpiLife-KG2に溶解した試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表５を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。
【００７７】
表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７８】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
【００８０】
表５に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００８１】
〔試験例６〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００８２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００８３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表６を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００８４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、プロフィラグリン及び内部標準であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）のｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。プロフィラグリンのｍＲＮＡの発現量は、試料無添加及び試料添加のそれぞれで培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに試料無添加の補正値を１００とした時の試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率（％）を算出した。
【００８５】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表６に示す。
【００８６】
【表６】
【００８７】
表６に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）において極めて優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。すなわち、キウイ摘果果実抽出物は、低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）において、皮膚の保湿機能の向上に関与するフィラグリンの前駆体であるプロフィラグリンの遺伝子発現を促進させることが判明した。
【００８８】
上述した試験例１〜６から明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物には、キウイの完熟果実からの抽出物が有しない作用（スーパーオキサイド消去作用（活性酸素消去作用），ラジカル消去作用）を有し、又はそれが有する作用（酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用，プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用）であっても、顕著に優れた作用を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤は、活性酸素種に起因する細胞障害等を含む各種障害の予防・改善に大きく貢献することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は、生体細胞内のエネルギー代謝過程で生じるものであり、活性酸素としては、スーパーオキサイド（すなわち酸素分子の一電子還元で生じるスーパーオキシドアニオン：・Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）及び一重項酸素（１Ｏ２）等が挙げられる。これらの活性酸素は、食細胞の殺菌機構にとって必須であり、ウィルスや癌細胞の除去に重要な働きを果たしている。
【０００３】
しかしながら、活性酸素の過剰な生成は、生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。通常、生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、細胞内に含まれているスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）の触媒作用により逐次消去されているが、スーパーオキサイドの産生が過剰である場合、又はＳＯＤの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分となり、スーパーオキサイド濃度が高くなり、これが関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等を引き起こす。
【０００４】
特に、皮膚は、紫外線等の環境因子の刺激を直接受けることから、スーパーオキサイドが生成しやすい器官であるため、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解し、変性し又は架橋したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素によって引き起こされる障害が、皮膚のしわ形成や皮膚の弾力低下等の老化の原因になるものと考えられている。したがって、活性酸素や生体内ラジカルの生成を阻害・抑制することにより、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害を予防、治療又は改善できるものと考えられる。
【０００５】
また、活性酸素は、炎症、過酸化脂質の生成、種々の酵素の失活及びＤＮＡの損傷等を引き起こすことが知られており、これら酸化的細胞障害は、肌荒れ、しわ形成、皮膚の弾力性低下等の皮膚老化の原因の一つと考えられている。
【０００６】
そこで、活性酸素消去物質、ラジカル消去物質等を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされており、このような作用を有するものとして、アブラナ科ブラシカ属植物からの抽出物（特許文献１参照）等が知られている。また、活性酸素に起因して生じる酸化的細胞障害を抑制し得るものとして、セイヨウクロタネソウ、コオウレン、ウォーターヒソップからの抽出物（特許文献２参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８１８４８号公報
【特許文献２】特開２００９−２２７５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性の高い天然抽出物から活性酸素消去作用、ラジカル消去作用及び酸化的細胞障害抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とする活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
本発明において「キウイの摘果果実」とは、キウイ果実の栽培過程において、栽培されるキウイ果実の糖度及び大きさを所望の範囲に増大させることを目的として間引かれる（剪定される）果実のことを意味し、具体的には、糖度が３．０〜７．０％、好ましくは４．０〜５．５％であって、かつ大きさ（長径）が１〜４ｃｍ、好ましくは２〜３ｃｍであるキウイの果実のことを意味する。
【００１１】
また、本発明において「酸化的細胞障害」とは、活性酸素に起因して生じる細胞障害、特に炎症、過酸化脂質生成、種々の酵素の失活、ＤＮＡ損傷等の酸化障害を意味し、皮膚組織障害等の組織障害も含まれる。なお、活性酸素によって障害が生じる細胞としては、活性酸素によって障害が生じる生体細胞である限り特に限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、天然物であるキウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有し、安全性の高い活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、キウイ（学名：Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の摘果果実からの抽出物を有効成分として含有する。
【００１４】
ここで、本実施形態において「抽出物」には、キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の摘果果実を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）は、マタタビ科マタタビ属に属する落葉つる性低木であり、その果実は日本各地で栽培されており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用するキウイの構成部位は摘果果実である。なお、本発明において抽出原料として使用し得るキウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)）の栽培品種としては、特に限定されるものではないが、レインボーレッド、アップルキウイ、紅心、ゴールデンキング、ゼスプリゴールド、小林３９、ビュアカントリー、ファーストエンペラー、ティアドロップ、紅鮮、グレープキウイ、さぬきゴールド、豊蜜等を好適に用いることができる。
【００１６】
抽出原料として使用するキウイの摘果果実は、その糖度が３．０〜７．０％であって、かつ大きさ（長径）が１〜４ｃｍのものであり、好ましくは糖度が４．０〜５．５％であって、かつ大きさ（長径）が２〜３ｃｍのものである。
【００１７】
キウイの摘果果実からの抽出物は、抽出原料を、粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。
【００１８】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００１９】
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水、酸性・アルカリ性イオン水、海洋深層水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２０】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２１】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜１００容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜１００容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１容量部に対して多価アルコール１〜１００容量部を混合することが好ましい。
【００２２】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２３】
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでも活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。
【００２４】
キウイの摘果果実からの抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料等に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。
【００２５】
上記のようにして得られるキウイの摘果果実からの抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有しているため、それぞれの作用を利用して活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の有効成分として用いることができる。
【００２６】
また、後述する実施例から明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物は、表皮角化細胞増殖促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用又は紫外線照射による細胞障害抑制作用をも有しているため、それぞれの作用を利用して抗老化剤、表皮角化細胞増殖促進剤、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤又は紫外線照射による細胞障害抑制剤の有効成分として用いることもできる。
【００２７】
上記各薬剤は、キウイの摘果果実からの抽出物のみからなるものであってもよいし、キウイの摘果果実からの抽出物を製剤化したものであってもよい。
【００２８】
キウイの摘果果実からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、キウイの摘果果実からの抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができる。
【００２９】
なお、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、必要に応じて、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有する他の天然抽出物等を配合して有効成分として用いることができる。
【００３０】
本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の投与方法としては、一般に経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法（例えば、経口投与、経粘膜投与等）を適宜選択すればよい。
【００３１】
また、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００３２】
本実施形態の活性酸素消去剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する活性酸素消去作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の活性酸素消去剤は、これらの用途以外にも活性酸素消去作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３３】
本実施形態のラジカル消去剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有するラジカル消去作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素（ラジカル）が関与する各種障害を予防・改善することができる。ただし、本実施形態のラジカル消去剤は、これらの用途以外にもラジカル消去作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３４】
本実施形態の酸化的細胞障害抑制剤は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する酸化的細胞障害抑制作用を通じて、活性酸素に起因して生じる細胞障害を抑制することができ、この結果、肌荒れ、しわ形成、皮膚の弾力性低下等の皮膚の老化症状等を予防・改善することができる。ただし、本実施形態の酸化的細胞障害抑制剤は、これらの用途以外にも酸化的細胞障害抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３５】
キウイの摘果果実からの抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を有しており、皮膚に適用した場合の使用感又は安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。
【００３６】
この場合において、皮膚化粧料には、キウイの摘果果実からの抽出物をそのまま配合してもよいし、キウイの摘果果実からの抽出物から製剤化した活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤を配合してもよい。
【００３７】
キウイの摘果果実からの抽出物、又は当該キウイの摘果果実からの抽出物から製剤化した活性酸素消去剤、ラジカル消去剤若しくは酸化的細胞障害抑制剤を配合することにより、皮膚化粧料に活性酸素消去作用、ラジカル消去作用又は酸化的細胞障害抑制作用を付与することができる。
【００３８】
キウイの摘果果実からの抽出物等を配合し得る皮膚化粧料の種類は特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション等が挙げられる。
【００３９】
キウイの摘果果実からの抽出物等を皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、０．０００５〜０．４５質量％（固形分換算）であり、特に好適な配合率は、０．００５〜０．０５質量％（固形分換算）である。なお、後述する実施例において明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物は、キウイの完熟果実からの抽出物と比較して、より低濃度において活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用、プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を奏し得ることから、キウイの摘果果実からの抽出物の皮膚化粧料における配合率を０．０００５〜０．００１質量％（固形分換算）と低濃度にしたとしても、皮膚化粧料に所望とする作用を付与することができる。
【００４０】
上記皮膚化粧料は、キウイの摘果果実からの抽出物が有する活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された上記成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００４１】
上記皮膚化粧料は、高い安全性を有しており、かつ活性酸素消去作用、ラジカル消去作用、酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用及びプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、しわ形成や弾力低下等の皮膚の老化や、関節リウマチやベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性等の活性酸素が関与する各種障害、乾燥肌、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。
【００４２】
なお、本実施形態の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤又は酸化的細胞障害抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕キウイ摘果果実抽出物の製造
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)，レインボーレッド種）の摘果果実（糖度：４．３％，長径：２ｃｍ）の粉砕物２００ｇに抽出溶媒（精製水）４００ｍＬを加え、３０℃にて１時間加温抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理をした。得られた抽出液を合わせて減圧下で濃縮し、さらに乾燥してキウイ摘果果実抽出物５．５ｇを得た。
【００４５】
〔比較例１〕キウイ果実抽出物の製造
キウイ（Actinidia chinensis Planch. (Actinidiaceae)，レインボーレッド種）の完熟果実（糖度：１３．４％，長径：５ｃｍ）の粉砕物２００ｇを使用した以外は実施例１と同様にして、キウイ果実抽出物１８．５ｇを得た。
【００４６】
〔試験例１〕スーパーオキサイド消去作用試験（ＮＢＴ法）
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてスーパーオキサイド消去作用を試験した。
【００４７】
試験管に、０．０５ＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０．２）を２．４ｍＬ、並びに３ｍＭのキサンチン、３ｍＭのＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液及び０．７５ｍＭのＮＢＴ（nitroblue tetrazolium）を０．１ｍＬずつ加え、これに試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表１を参照）０．１ｍＬを添加し、２５℃で１０分間放置した。放置後、酵素溶液としてのキサンチンオキシダーゼ０．１ｍＬを加えて素早く攪拌し、２５℃で２０分間反応させた。その後、６ｍＭの塩化銅０．１ｍＬを加えて反応を停止させて、波長５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４８】
酵素溶液を添加しない場合についても、同様の操作と吸光度の測定を行い、さらに、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。得られた結果から、下記式によりスーパーオキサイド消去率（％）を算出した。
【００４９】
スーパーオキサイド消去率(％)＝{１−(Ａ−Ｂ)／(Ｃ−Ｄ)}×１００
式中、Ａは「酵素溶液添加・試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｂは「酵素溶液無添加・試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃは「酵素溶液添加・試料溶液無添加時の吸光度」を表し、Ｄは「酵素溶液無添加・試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、特に高濃度（１００μｇ／ｍＬ）において極めて優れたスーパーオキサイド消去作用（活性酸素消去作用）を有することが確認された。一方、キウイ果実抽出物（比較例１）は、スーパーオキサイド消去作用をほとんど示さなかった。また、キウイ摘果果実抽出物のスーパーオキサイド消去作用の強さは、抽出物（試料）濃度に依存して向上することから、スーパーオキサイド消去作用の程度は、キウイ摘果果実抽出物の濃度によって調節できることが確認された。
【００５２】
〔試験例２〕ラジカル消去作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてラジカル消去作用を試験した。
【００５３】
１．５×１０−４ＭのＤＰＰＨ（diphenyl-p-picrylhydrazyl）エタノール溶液３ｍＬに試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表２を参照）３ｍＬを加え密栓した後、振り混ぜて３０分間放置した。放置後、波長５２０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして、試料溶液の代わりに試料を溶解した溶媒のみを用いて同様の操作をして、波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして、エタノールに試料溶液３ｍＬを加えた後、直ちに波長５２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果から、下記式によりラジカル消去率（％）を算出した。
【００５４】
ラジカル消去率(％)＝{１−(Ｂ−Ｃ)／Ａ}×１００
式中、Ａは「コントロールの吸光度」を表し、Ｂは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃは「ブランクの吸光度」を表す。
結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
表２に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、特に高濃度（２００μｇ／ｍＬ）において優れたラジカル消去作用を有することが確認された。一方、キウイ果実抽出物（比較例１）は、ラジカル消去作用を示さなかった。また、キウイ摘果果実抽出物のラジカル消去作用の強さは、抽出物（試料）濃度に依存して向上することから、ラジカル消去作用の程度は、キウイ摘果果実抽出物の濃度によって調節できると考えられる。
【００５７】
〔試験例３〕酸化的細胞障害抑制作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして酸化的細胞障害抑制作用を試験した。
【００５８】
４０歳の健常人男性皮膚由来線維芽細胞（ＮＢＫＮ，研究同意を得て樹立したもの，継代数：１３以下）を、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum，ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified minimum essential medium，ギブコ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養した。
【００５９】
プラスミドｐＧＬ２を滅菌水で３１μｇ／ｍＬに希釈し、６０ｍｍディッシュに移した後、ローズベンガル（関東化学社製，１００μｇ／ｍＬ）を添加し、可視光線（キセノンランプ，ウシオ電機社製，３７０〜７６０ｎｍ，３０ｃｍ）を１０分間照射した。
【００６０】
２４ウェルプレートに細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）を播種し、１８時間培養した。ローズベンガル添加又は非添加のプラスミド（０．２μｇ ＤＮＡ／ウェル）に遺伝子導入剤（Qiagen社製）を添加し、３７℃で２４時間導入させた。培地交換後、試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表３を参照）を添加し、さらに２４時間培養した。
【００６１】
細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した後、滅菌水で５倍希釈した細胞溶解剤（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５），２ｍＭ ＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μＬ／ウェル添加した。その後、−８０℃で３０分保存し、室温で１５分間放置することで細胞を融解させた。
【００６２】
プレート攪拌（室温，１５分）した後、スクレーバーで細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心用チューブに回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，２分）した。上清２０μＬ及び発光基質（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２０ｍＭ Tricine／１．０７ｍＭ (ＭｇＣＯ３)４Ｍｇ(ＯＨ)２・５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ ＤＴＴ／２７０μＭ Coenzyme A／４７０μＭ luciferin／５３０μＭ ＡＴＰ）１００μＬを添加し、室温で混和後、ルミノメーター（GENELIGHT55，マイクロテック・ニチオン社製）にセットし、５６０ｎｍで測定した。
【００６３】
酸化的細胞障害抑制率（％）は、ローズベンガル非添加に対するローズベンガル添加後のＤＮＡ修復によるルシフェラーゼ活性量を算出することにより求めた。
結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
【００６５】
表３に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた酸化的細胞障害抑制作用を有することが確認された。
【００６６】
〔試験例４〕紫外線照射による細胞障害抑制作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして紫外線照射による細胞障害抑制作用を試験した。
【００６７】
４０歳の健常人男性皮膚由来線維芽細胞（ＮＢＫＮ，研究同意を得て樹立したもの，継代数：１３以下）を、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum，ＪＲＨバイオサイエンス社製）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified minimum essential medium，ギブコ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養した。
【００６８】
プラスミドｐＧＬ２を滅菌水で３１μｇ／ｍＬに希釈し、６０ｍｍディッシュに移した後、氷上で紫外線を１５００Ｊ／ｍ２照射した。
【００６９】
２４ウェルプレートに細胞（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）を播種し、１８時間培養した。紫外線照射又は未照射のプラスミド（０．２μｇ ＤＮＡ／ウェル）に遺伝子導入剤（Qiagen社製）を添加し、３７℃で２４時間導入させた。培地交換後、試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表４を参照）を添加し、さらに２４時間培養した。
【００７０】
細胞をＰＢＳ（−）（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した後、滅菌水で５倍希釈した細胞溶解剤（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５），２ｍＭ ＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μＬ／ウェル添加した。その後、−８０℃で３０分保存し、室温で１５分間放置することで細胞を融解させた。
【００７１】
プレート攪拌（室温，１５分）した後、スクレーバーで細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心用チューブに回収し、遠心（１５，０００ｒｐｍ，２分）した。上清２０μＬ及び発光基質（東洋ビーネット社製，ピッカジーン，２０ｍＭ Tricine／１．０７ｍＭ (ＭｇＣＯ３)４Ｍｇ(ＯＨ)２・５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ ＤＴＴ／２７０μＭ Coenzyme A／４７０μＭ luciferin／５３０μＭ ＡＴＰ）１００μＬを添加し、室温で混和後、ルミノメーター（GENELIGHT55，マイクロテック・ニチオン社製）にセットし、５６０ｎｍで測定した。
【００７２】
紫外線照射による細胞障害抑制率（％）は、紫外線未照射に対する紫外線照射後のＤＮＡ修復によるルシフェラーゼ活性量を算出することにより求めた。
結果を表４に示す。
【００７３】
【表４】
【００７４】
表４に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた紫外線照射による細胞障害抑制作用を有することが確認された。
【００７５】
〔試験例５〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。
【００７６】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となるようにEpiLife-KG2で希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、EpiLife-KG2に溶解した試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表５を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。
【００７７】
表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに１００μＬずつ添加した。２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７８】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を表す。
結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
【００８０】
表５に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００８１】
〔試験例６〕プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用試験
実施例１のキウイ摘果果実抽出物及び比較例１のキウイ果実抽出物について、以下のようにしてプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【００８２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte，ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
【００８３】
EpiLife-KG2を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、EpiLife-KG2で必要濃度に溶解した試料溶液（実施例１及び比較例１，試料濃度は下記表６を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製，Cat.no．311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。
【００８４】
この総ＲＮＡを鋳型とし、プロフィラグリン及び内部標準であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）のｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社）を用いて、TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム2 Step RT-PCR反応により行った。プロフィラグリンのｍＲＮＡの発現量は、試料無添加及び試料添加のそれぞれで培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに試料無添加の補正値を１００とした時の試料添加の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりプロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率（％）を算出した。
【００８５】
プロフィラグリンｍＲＮＡ発現上昇促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表６に示す。
【００８６】
【表６】
【００８７】
表６に示すように、キウイ摘果果実抽出物（実施例１）は、キウイ果実抽出物（比較例１）に比して、低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）において極めて優れたプロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。すなわち、キウイ摘果果実抽出物は、低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）において、皮膚の保湿機能の向上に関与するフィラグリンの前駆体であるプロフィラグリンの遺伝子発現を促進させることが判明した。
【００８８】
上述した試験例１〜６から明らかなように、キウイの摘果果実からの抽出物には、キウイの完熟果実からの抽出物が有しない作用（スーパーオキサイド消去作用（活性酸素消去作用），ラジカル消去作用）を有し、又はそれが有する作用（酸化的細胞障害抑制作用、紫外線照射による細胞障害抑制作用、表皮角化細胞増殖促進作用，プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進作用）であっても、顕著に優れた作用を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の活性酸素消去剤、ラジカル消去剤及び酸化的細胞障害抑制剤は、活性酸素種に起因する細胞障害等を含む各種障害の予防・改善に大きく貢献することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするラジカル消去剤。
【請求項３】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする酸化的細胞障害抑制剤。
【請求項１】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする活性酸素消去剤。
【請求項２】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするラジカル消去剤。
【請求項３】
キウイの摘果果実からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする酸化的細胞障害抑制剤。
【公開番号】特開２０１１−１４４１１３（Ｐ２０１１−１４４１１３Ａ）
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４１８５（Ｐ２０１０−４１８５）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【出願人】（３００００３５２５）株式会社ブルーム・クラシック (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【出願人】（３００００３５２５）株式会社ブルーム・クラシック (6)
【Ｆターム（参考）】
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