流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置
【課題】 測定者によらず、全血液試料のような有形成分含有流体の流動性を再現性よく測定できるようにする。
【解決手段】
表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する際に、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させる。
【解決手段】
表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する際に、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料、調製血液試料などの有形成分を含む流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法、およびそれに用いる流体流動性測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
有形成分を含む流体の流動性は、有形成分がしばしば流路障害の原因になる場合があるため、管ないし流路の径が有形成分の径に近づくほど重要になる。その典型例が血液の流動性である。血液循環の役割を担う毛細血管では、多くの場合、血管径が赤血球の径や白血球の径より小さいという逆転した関係が存在し、血液の流動性、より正確には、血液細胞の流動性が血流量を左右する極めて重要な因子になる。また、近年の研究によれば、血液の流動性が、食事、運動、ストレス、気温などの環境要因により変化することが明らかになっている。このため、血液の流動性の変化から生じる毛細血管血流の良否は、組織の代謝、活動状態に直接影響し、健康と疾患に対する関わりは極めて大きいといえる。従って、健康状態の評価、疾患の予防、疾患の早期診断等の目的で血液の流動性の簡便で再現性のある測定が求められている。
【０００３】
従来、血液の流動性の測定は、種々の粘度計を用いて行われてきたが、粘度計の測定結果には、毛細血管での血液の流動性を規定する主因子である「赤血球変形能」、「白血球変形能」及びそれらの「粘着能」、あるいは「血小板凝集能」等が十分に反映されないという問題があった。このため、健康診断や臨床の場で、血液の流動性を粘度計で測定することは、実際に行われることは殆どなかった。
【０００４】
また、血液以外の有形成分を含む流体の流動性の測定も種々の粘度計で行われてきたが、血液の場合と同様に、有形成分のサイズが微小でかつ流路も微小である場合には、有形成分の挙動が流体の流動性に直接的な影響を及ぼさないような測定条件で測定されてきたというのが実情であった。
【０００５】
このため、相対向する基板間に微細な流路をアレイ状に形成した血液フィルタもしくは血流回路（以下、マイクロチャネルアレイと称する）に、有形成分を含む流体を流し、その流動性を測定することが提案されている（特許文献１および２参照）。具体的には、マイクロチャネルアレイに抗凝固処置した全血を流し、全血通過時間から流動性を測定するものであるが、マイクロチャネルの径が毛細血管の径にほぼ等しいため、毛細血管における血液の流動性と全血通過時間との間に高い相関関係が成立する。更に、マイクロチャネルアレイを通過する血液細胞の挙動を、顕微鏡画像により極めて鮮明に観察することができる。このため、血液の流動性の測定を、前述したようなマイクロチャネルアレイを用いて行う方法が、現在医学・医療界に普及しつつある。また、このような方法では、測定条件を選択することにより、赤血球変形能、白血球変形能および粘着能、血小板凝集能のより直接的な測定も可能となる。また、このようなマイクロチャネルアレイをエマルジョンの製造に利用する際に、ホルダーに装着してその取り扱い性を高めることも提案されている（特許文献３）。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−１３０４７１号公報（特許請求の範囲、実施例等）
【特許文献２】特開平３−２５７３６６号公報（特許請求の範囲、実施例等
【特許文献３】特開平１１−１６５０６２号公報（段落００１６、図３等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、マイクロチャネルアレイのマイクロチャネルの径と毛細血管の径とをほぼ等しくするという測定条件を有効なものとするには、赤血球変形能、白血球変形能および粘着能、血小板凝集能が血液内外の物理化学的因子などの他の測定条件因子の変化に影響を受けやすいことから、それらの測定条件因子の厳密な制御を必要とする。例えば、実際の測定の場面においては、測定前の全血液試料採取・注入の際に使用する採取・注入管について、管径や長さが相違するものを何気なく使用しているため、使用する採取・注入管によって測定結果が異なるという問題が生じる。また、同じ全血液試料と同じ装置とを用いた場合であっても、全血液試料の測定操作の際に、測定者が特に意識することなく行う操作条件（例えば、撹拌回数や撹拌速度）については、それらの測定条件が測定者間で相違するために、測定者によって測定結果が場合により著しく相違するという問題もある。
【０００８】
このような全血液試料の流動性の測定における問題は、マイクロチャネルアレイを用いて血液以外の組織液や尿、あるいは他の有形成分を含有する流体の流動性を測定する際にも生ずる。
【０００９】
本発明は、以上の問題を解決しようとするものであり、測定者によらず、全血液試料のような有形成分含有流体の流動性を簡便で良好な再現性で測定できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、抗凝固処置した全血液試料をマイクロチャネルアレイに流し、全血液通過時間から流動性を測定する上述したような方法において、全血液試料を採血管から採取してマイクロチャネルアレイホルダーの流入口ないしそれに接続された試料容器に注入する際には、細管を含む採取・注入器具を使用するが、そのような器具としてマイクロピペット及びピペットチップを使用した場合と注射器及び針を使用した場合とで、全血通過時間が異なる（即ち、流動性が変化する）という現象に着目した。そして、本発明者らは、この現象の主原因が、器具の種類、その器具による血液の採取速度や注入速度が測定者によって相違しているために、採取・注入操作毎に全血液試料に異なる大きさのずり応力が印加されている点、及び全血液試料に印加されるずり応力の差が血小板凝集能の差（換言すれば、血小板凝集能のずり応力感受性の差）となってその流動性を変化させた点、にあることを見出した。
【００１１】
本発明者ら、この新たに見出した知見に基づき、有形成分を含む流体試料をマイクロチャネルアレイに流す前に、予め流体試料に所定範囲のずり応力を印加しておくことにより、上述の課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
即ち、表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする流体流動性測定方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、（イ）表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板と該ベース基板に密着した透明基板とからなり、それらの間に該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイ；
（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部；
（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン；、
（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部；
（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン；及び
（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部
を有する流体流動性測定装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置によれば、有形成分を含有する流体試料をマイクロチャネルアレイに通過させる前に、予め流体試料に所期のずり応力を印加する。結果的に、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予め制御することになる。従って、測定者によらず、再現性の良好な流体の流動性の測定結果が得られる。
【００１５】
特に、液体試料として血小板を含有する血液試料を用いた場合、血小板は体内を循環している際に血管の狭小部があればそこで強いずり応力を受けることになる。このずり応力による血小板凝集は血栓の原因になるので、血液試料に印加されるずり応力の差が血小板凝集能の差（換言すれば、血小板凝集能のずり応力感受性の差）を測定することは、全血液試料の流動性を評価する上で極めて重要である。また、血小板のずり応力感受性は体内でどれだけのずり応力を受けたかで変わるので、体内の血管の狭小化の程度を評価することが可能となる。本発明においては、前述したように、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予め制御することになるので、全血液試料の血小板凝集能のずり応力感受性が測定可能となる。
【００１６】
また、血小板凝集は、すでに凝集した血小板の塊がある所で進みやすい性質があり、体内ではその効果が重要である。本発明においては、ずり応力履歴がコントロールされた試料を用いるので、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集を評価可能となる。同様の理由で、本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置は、流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性を評価できる。たとえば、細胞組織含有試料の場合には、測定前にずり応力をかけることで、その活性度を測定することが可能となる。高分子ポリマー粒子含有エマルジョン試料の場合には、測定前にずり応力をかけることで、粒子間の架橋度や凝集力を測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の流体流動性測定方法では、表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイを使用し、そのマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする。
【００１９】
本発明の測定の対象となる流体は、有形成分を含有するものであり、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料または調製血液試料、細胞組織（粒子）含有液体試料、高分子ポリマー粒子含有エマルジョン試料などが該当する。
【００２０】
本発明で使用するマイクロチャネルアレイとは、シリコン等の金属板、アルミナ等のセラミック板、熱可塑性樹脂板の表面にミクロンサイズの複数の溝がアレイ状に形成されたベース基板に、ガラスや透明樹脂（アクリル系樹脂等）からなる透明基板を密着させ、両基板間にベース基板に形成された溝に対応したマイクロチャネルアレイを構成するものである。ここで、ミクロンサイズとは、測定対象等に応じて適宜設定されるものであるが、一般には幅が１〜５０μｍ、深さが１〜５０μｍ、長さが２〜１０００μｍであり、好ましくは幅が２〜２０μｍ、深さが２〜２０μｍ、長さが５〜５００μｍである。因みに、測定対象が全血液試料である場合には、幅が２〜１５μｍ、深さが２〜１５μｍ、長さが５〜２００μｍであることが好ましい。
【００２１】
溝の形成は、ベース基板の材料や溝のサイズ等に応じて、公知の手法、例えば、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の手法を適宜利用して行うことができる。また、熱可塑性樹脂板を、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等により作製する際に、同時に溝を形成することもできる。例えば、フォトレジストパターンから起こしたＮｉ電鋳を用いて、射出成形することで微細な溝のアレイを表面に有するプラスチックス材料からなるベース基板を作製できる。このベース基板を、透明基板で漏れのないように覆えば、マイクロチャネルアレイを実現することができる。また、微細な溝のアレイを加工する基板にシリコン単結晶基板を用い、密着させる透明基板にガラス基板を用いることで精度の高いマイクロチャネルアレイを実現することもできる。すなわち、フォトリソグラフィーやエッチングの技法を用いることでシリコン単結晶基板表面にミクロンサイズの溝のアレイをサブミクロン精度で加工できる。
【００２２】
また、ベース基板と透明基板との密着は、それぞれの素材の種類に応じて公知の密着法から選択して行うことができる。例えば、ベース基板がシリコン単結晶基板であり、透明基板がガラス基板である場合には、陽極接合法で溶着することができる。ベース基板と透明基板が共にプラスチック基板である場合には、熱溶着法やエキシマ光照射溶着法等の溶着法により密着させることができる。なお、両基板の対向面が、通常、光学研磨面であるため、圧着法だけでも、流体の漏れが生じないレベルで密着させることができる。特に、気泡の障害を防ぐことや洗浄などのためにはマイクロチャネルアレイの分解組立が可能な圧着の方が優れている。
【００２３】
なお、ベース基板の熱可塑性樹脂としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、酢酸ビニル系樹脂（商品名：エクセバール）、ポリビニルブチラール系樹脂等を使用することができる。また、これらの中で透明なものを、透明基板の材料として使用することができる。
【００２４】
本発明において、マイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させるには、マイクロチャネルアレイの流入口と流出口との間に流出側が低くなるような圧力差を設定すればよく、流体液面に差をつけることや、流出側を強制的に減圧すること、流入側を強制的に加圧することなどにより行うことできる。
【００２５】
本発明において、流体試料に予め印加するずり応力は、所期の大きさにコントロールすることが肝要であり、その大きさの範囲としては、低すぎたり高すぎたりすると流動性の差異が判別しにくくなるので、好ましくは１０dyn/cm2〜１０，０００dyn/cm2の範囲、より好ましくは２０dyn/cm2〜５,０００dyn/cm2の範囲、特に好ましくは５００dyn/cm2〜３,０００ dyn/cm2の範囲である。
【００２６】
流体試料にずり応力を印加する方法としては、丸底瓶に液体試料を入れ、その内径よりも僅かに小さい直径の円筒体を瓶に押し込む方法、流体試料を２枚の平板の間に挟み、平板を互いにずらす方法、流体試料を細管中に通過させる方法等が挙げられる。中でも、ずり応力の制御が容易な点から、ガラス管、樹脂管、金属管等の細管中に液体試料を通過させる方法が好ましい。この場合、ずり応力の大きさは、細管の内径、細管の内壁の材質や平滑度、流体試料が細管中を移動する速度等を適宜選択することによりコントロールすることができる。特に、細管の内径および／または細管中の流体試料の流速を調整することが、管理の容易性から好ましい。例えば、内径０．６ｍｍの管を用いた場合、血小板凝集が起こらず、０．４ｍｍの管を用いた場合に血小板凝集が発生するといった被験者の健康状態に応じたずり応力に対する凝集の挙動を正確に測定することが可能となる。
【００２７】
また、血小板凝集は、すでに凝集した血小板の塊がある所で進みやすい性質があり、体内ではその効果が重要である。本発明においては、ずり応力履歴がコントロールされた試料を用いるので、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集を評価可能となる。同様の理由で、本発明の流体流動性測定方法は、全血液試料をはじめとする流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性を評価できる。
【００２８】
また、本発明において、印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、ずり応力の大きさ毎に別体のマイクロチャネルアレイに通過させることや、一つのマイクロチャネルアレイに連続的に通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定することになる。これらのように測定することにより、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集をより再現性良く評価可能となる。同様に、流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性をより再現よく評価可能となる。特に、前者のように測定することは、微小循環における閉塞の度合いの測定結果による疾病の発生可能性の評価に適しており、後者のように測定することは、架橋度等の有形成分の性状の評価に適している。
【００２９】
本発明において、流体試料の流動性の測定は、例えば、マイクロチャネルアレイを流体試料が通過する速度、通過時間等を測定する方法、通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法、酵素、FETセンサ等を使用した電気化学検出方法、超音波を照射する方法、表面プラズモン共鳴測定方法等により行うことができる。なお、この測定の際には、ずり応力を印加してから測定までの時間を一定に保つことが、測定結果の良好な再現性にとって好ましい。また、人手が入らない自動化装置を使用して所定のずり応力をかけることが望ましい。
【００３０】
次に、本発明の流体流動性測定装置について説明する。図１に毛細血管床のモデルとなりうるマイクロチャネルアレイの一例の部分の下面図Ｘとその側面図Ｙとを示す。また、図２に流体流動性測定装置一例の概略図を示す。
【００３１】
本発明の流体流動性測定装置は、図１に示すようなマイクロチャネルアレイを使用する。このマイクロチャネルアレイ１０は、表面に微細な溝土手１ａが形成され、隣接する溝土手１ａに挟まれた窪みが溝（１ｂ）となり、そのような複数の溝（１ｂ）がアレイ状に形成されたベース基板１と、これに密着した透明基板２とからなるものである。そして、両基板の間にはアレイ状に配された溝（１ｂ）（即ち、溝アレイ）に対応してアレイ状に配されたマイクロチャネル３（即ち、マイクロチャネルアレイ）が形成される。また、マイクロチャネルの流入口３ａ側には平坦な流入テラス部１ｃが形成され、流出口３ｂ側には平坦な流出テラス部１ｄが形成されている。また、流入テラス部１ｃにつながる大きな空間は流入路１ｅを構成し、流出テラス部１ｄにつながる大きな空間は流出路１ｆを構成する。このマイクロチャネルアレイに赤血球４が通過する様子を図１に示す。赤血球４は、流入路１ｅから流入テラス１ｃに入り込み、更に、変形してマイクロチャネル３を通過し、流出テラス部１ｄから流出路１ｆへと移動する。
【００３２】
本発明の流体流動性測定装置は、このような（イ）マイクロチャネルアレイ、（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部、（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン、（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部、（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン、及び（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部を有する。
【００３３】
（ロ）ずり応力印可部としては、ガラス細管、金属細管、プラスチックチューブ等が挙げられる。これらの細管には、その中へ液体試料を通過させるためのシリンジやポンプ等を接続することができる。
【００３４】
（ハ）液体試料流入ラインとしては、液体試料にずり応力があまりかからないある程度径の太い管、内壁をフッ素加工処理した細管などを例示することができるが、（ロ）ずり応力印加部に、（ハ）液体試料流入ラインを兼ねさせることが好ましい。また、（ロ）ずり応力印加部に、液体試料を採取する機能を持たせてもよい。また、（ホ）液体試料回収ラインに、流体試料の流量を制御するバルブを設けてもよい。
【００３５】
液体試料をマイクロチャネルアレイに通過させるためには、すでに説明したように、マイクロチャネルアレイの流入口と流出口との間に流出側が低くなるような圧力差を設定すればよい。具体的には、マイクロチャネルアレイの流出口よりも液体試料回収ラインの出口が低位置になるようにすればよい。この高低差を可変とすることが好ましい。
【００３６】
（ヘ）測定部としては、マイクロチャネルアレイを流体試料が通過する速度、通過時間等を測定する方法、通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法、酵素、FETセンサ等を使用した電気化学検出方法、超音波を照射する方法、表面プラズモン共鳴測定方法等により行うための装置を挙げることができる。
【００３７】
本発明の流体流動性測定装置は、マイクロチャネルアレイを使い捨てとする場合には、更に（ト）マイクロチャネルアレイを保持するホルダー部を有することが好ましい。このような態様において、一つのベース基板に、流入路→マイクロチャネルアレイ→流出路という経路が独立した複数のマイクロチャネルアレイを設けたものを使用することが測定コストの低減という点から好ましい。これは、ベース基板の製造コストがほぼ基板の面積に比例するので、一つのベース基板に複数のマイクロチャネルアレイを組み込むことができると、一つあたりのマイクロチャネルの製造コストが大きく減少するからであり、それに伴うホルダー部への加工コストの増大があまり大きくないからである。
【００３８】
また、本発明の流体流動性測定装置には、更に生理食塩水注入装置、制御装置を有する圧力発生装置等の装置を、測定対象に応じて適宜設けてもよい。
【００３９】
本発明の流体流動性測定装置の好ましい一態様のより具体的な構成を図２に示す。流体流動性測定装置２０は、試料管２４から試料を採取するための採取・注入管２３を有し、駆動装置２５によって試料管２４から試料を採取したり、チップホルダー２２へ試料を注入する。採取・注入管２４の管径は、試料にずり応力をかけるために、所望の管径とすることができる。図２では、２種類の管径の採取・注入管２３を使用する。マイクロチャネルチップ２１を保持するチップホルダー２２に注入された試料は、回収ライン２６に設けられた遮断・流量可変手段の１種であるバルブ２７が開となることにより、落差圧で回収容器２８に導かれる。落差圧は、マイクロチャネルアレイチップ２１の流出口と回収ライン２８の出口との高低差を調整することで、任意に設定できる。高低差の調節により、マイクロチャネルアレイチップ２１のマイクロチャネルアレイを通過する試料の観察を、より緻密に行うことが可能となる。その高低差は、通常、１〜５０ｃｍ、好ましくは３〜３０ｃｍである。マイクロチャネルアレイチップ２１のマイクロチャネルを通過する試料の様子は、光源２９、顕微鏡３０及びハーフミラー３１を備えたＣＣＤカメラ３２で、マイクロチャネルアレイの透明基板側から観察することができる。観察結果はリアルタイムでディスプレイ３３に表示することが好ましい。なお、チップホルダー２２の上部、または回収ライン２６に液面計、または光による変位量測定を行うことにより、所定の血液量に対する通過時間を測定することも可能となる
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を、全血液試料を測定する場合を例にとり、具体的に説明する。
【００４１】
フォトレジストパターンから起こしたＮｉ電鋳を用いて、射出成形することで微細な溝のアレイを表面に有するプラスチック基板を作製する。このプラスチック基板をガラス透明基板で漏れのないように覆うことより、図１に示す構造のマイクロチャネルアレイを作製する。この場合、マイクロチャネルのサイズは、血液成分における血球成分のサイズと同等か、それより小さいことが好ましいから、マイクロチャネルの幅、深さを好ましくは２〜１５μｍの範囲、より好ましくは３〜１２μｍの範囲とする。このマイクロチャネルアレイ素子を用いて、図２の流体流動性装置に組み上げる。ここで、赤血球などの有形成分のサイズを考慮して、マイクロチャネルの底面とテラス面をガラス透明基板面から４．５μｍ前後の距離にとる。
【００４２】
次に、血液試料を、通常人の肘静脈から真空採血管を用いて採取し、例えば、ヘパリン抗凝固処理を施した後に、流体流動性装置の試料管に入れ、採取・注入管で所定量をサンプリングすることによりずり応力を印可する。そして、この全血液試料を、採取・注入管からチップホルダー中のマイクロチャネルアレイに移動させる。図２に示す装置では採取管（注入管）の太さを２種類用いているが、管径と採取速度（注入速度）で決まる平均ずり応力を全血液試料に印加することができる。径の違うマイクロピペットチップを用いてもよい。
【００４３】
図３に径が相違する２種類のマイクロピペットチップを用いた時に実際に同一全血液試料のマイクロチャネルアレイ通過時間が異なることを示す。
【００４４】
ところで、管内の平均流速ｖと管の半径ｒから管壁のずり速度は４ｖ／ｒで与えられる。内径０．６ｍｍおよび０．４ｍｍの管を用いて２００μｍ／ｓｅｃの採取速度あるいは注入速度で全血液試料を採取あるいは注入すると、管壁でのずり応力はそれぞれ３．６８×１０2ｄｙｎ／ｃｍ2、１．１１×１０3ｄｙｎ／ｃｍ2になる。
【００４５】
ちなみに毛細血管の管径を６μｍ、その中の流速を１ｍｍ／ｓｅｃとすると管壁のずり応力は４．６６×１０ｄｙｎ／ｃｍ２になる。この値の１０倍程度のずり応力が働くと血小板凝集が起きはじめることが知られている。例えば、内径０．６ｍｍの管を用いると血小板凝集が起きたり起きなかったりし、一方、内径０．４ｍｍの管を用いると多くの場合血小板凝集が起きる。
【００４６】
従って、２種類の管を用いて測定すれば血小板凝集能のずり応力感受性の指標を得ることができる。管の径をさらに増やせばそれだけ詳細なデータを得ることができる。採取速度あるいは注入速度を変えても同様である。
【００４７】
なお、内径２．４ｍｍのチューブ管を用い、５．１６ｄｙｎ／ｃｍ2のずり応力で採取した全血液試料では、血小板凝集が発生せず、ずり応力に対する血小板凝集を測定することはできない。また、内径０．１８ｍｍの針を用い、１．２２×１０4ｄｙｎ／ｃｍ2のずり応力で採取した全血液試料の場合にも、どの試料に対しても血小板凝集が発生してしまうため、ずり応力に対する血小板凝集を測定することはできない。
【００４８】
また、通常、１測定毎にマイクロチャネルアレイチップを新品に交換するか、もしくは洗浄して再使用するが、それに対して、マイクロチャネルアレイチップを新品に交換しないで、もしくは洗浄しないで連続して使用すれば、前の測定でできた血小板凝集塊が残っている状態でのずり応力印加の影響を評価することができる。その場合、印加するずり応力の小さい順に測定するのがよい。
【００４９】
なお、１測定毎に使い捨てのマイクロチャネルアレイチップを新品に代えていると、測定コストの増大が著しくなるので、図４に示すように、一つのベース基板に２つのマイクロチャネルアレイ素子を有するマイクロチャネルアレイチップ４１をホルダー５０（図５）に装着すれば、１個のチップとホルダーで２回の独立した測定が可能になる。この場合、マイクロチャネルアレイ素子の流入口４１ａと流出口４１ｂとには、ホルダー５０の流入路５１ａと流出路５１ｂとがそれぞれ接続され、マイクロチャネルアレイ素子の流入口４２ａと流出口４２ｂとには、ホルダー５０の流入路５２ａと流出路５２ｂとがそれぞれ接続される。ここで、ホルダー５０は、下受け部５０ａと押さえ部５０ｂとキャップ部５０ｃとから構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置によれば、有形成分を含有する流体試料をマイクロチャネルアレイに通過させる前に、予め流体試料に所期のずり応力を印加する。結果的に、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予めコントロールすることになる。従って、測定者によらず、簡便で再現性の良好な流体の流動性の測定結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明で使用するマイクロチャネルアレイの構造模式図である。
【図２】本発明の流体流動測定装置の概略図である。
【図３】異なるマイクロピペットチップを用いた時の全血通過時間の変化を示す図である。
【図４】本発明で用いるマイクロチャネルアレイ２個を含むマイクロチャネルアレイチップの一実施態様を示す図である。
【図５】マイクロチャネルアレイ２個を含むマイクロチャネルアレイチップ用のホルダーの一実施態様を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１ａ 溝土手
１ｂ 溝
１ｃ 流入テラス部
１ｄ 流出テラス部
１ｅ 流入路
１ｆ 流出路
１０ マイクロチャネルアレイ
１ ベース基板
２ 透明基板
３ マイクロチャネル
４ 赤血球
２０ 流体流動性測定装置
２１、４１ マイクロチャネルアレイチップ
２２ チップホルダー
２３ 採取・注入管
２４ 試料管
２５ 駆動装置
２６ 回収ライン
２７ バルブ
２８ 回収容器
２９ 光源
３０ 顕微鏡
３１ ハーフミラー
３２ ＣＣＤカメラ
３３ ディスプレイ
５０ ホルダー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料、調製血液試料などの有形成分を含む流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法、およびそれに用いる流体流動性測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
有形成分を含む流体の流動性は、有形成分がしばしば流路障害の原因になる場合があるため、管ないし流路の径が有形成分の径に近づくほど重要になる。その典型例が血液の流動性である。血液循環の役割を担う毛細血管では、多くの場合、血管径が赤血球の径や白血球の径より小さいという逆転した関係が存在し、血液の流動性、より正確には、血液細胞の流動性が血流量を左右する極めて重要な因子になる。また、近年の研究によれば、血液の流動性が、食事、運動、ストレス、気温などの環境要因により変化することが明らかになっている。このため、血液の流動性の変化から生じる毛細血管血流の良否は、組織の代謝、活動状態に直接影響し、健康と疾患に対する関わりは極めて大きいといえる。従って、健康状態の評価、疾患の予防、疾患の早期診断等の目的で血液の流動性の簡便で再現性のある測定が求められている。
【０００３】
従来、血液の流動性の測定は、種々の粘度計を用いて行われてきたが、粘度計の測定結果には、毛細血管での血液の流動性を規定する主因子である「赤血球変形能」、「白血球変形能」及びそれらの「粘着能」、あるいは「血小板凝集能」等が十分に反映されないという問題があった。このため、健康診断や臨床の場で、血液の流動性を粘度計で測定することは、実際に行われることは殆どなかった。
【０００４】
また、血液以外の有形成分を含む流体の流動性の測定も種々の粘度計で行われてきたが、血液の場合と同様に、有形成分のサイズが微小でかつ流路も微小である場合には、有形成分の挙動が流体の流動性に直接的な影響を及ぼさないような測定条件で測定されてきたというのが実情であった。
【０００５】
このため、相対向する基板間に微細な流路をアレイ状に形成した血液フィルタもしくは血流回路（以下、マイクロチャネルアレイと称する）に、有形成分を含む流体を流し、その流動性を測定することが提案されている（特許文献１および２参照）。具体的には、マイクロチャネルアレイに抗凝固処置した全血を流し、全血通過時間から流動性を測定するものであるが、マイクロチャネルの径が毛細血管の径にほぼ等しいため、毛細血管における血液の流動性と全血通過時間との間に高い相関関係が成立する。更に、マイクロチャネルアレイを通過する血液細胞の挙動を、顕微鏡画像により極めて鮮明に観察することができる。このため、血液の流動性の測定を、前述したようなマイクロチャネルアレイを用いて行う方法が、現在医学・医療界に普及しつつある。また、このような方法では、測定条件を選択することにより、赤血球変形能、白血球変形能および粘着能、血小板凝集能のより直接的な測定も可能となる。また、このようなマイクロチャネルアレイをエマルジョンの製造に利用する際に、ホルダーに装着してその取り扱い性を高めることも提案されている（特許文献３）。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−１３０４７１号公報（特許請求の範囲、実施例等）
【特許文献２】特開平３−２５７３６６号公報（特許請求の範囲、実施例等
【特許文献３】特開平１１−１６５０６２号公報（段落００１６、図３等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、マイクロチャネルアレイのマイクロチャネルの径と毛細血管の径とをほぼ等しくするという測定条件を有効なものとするには、赤血球変形能、白血球変形能および粘着能、血小板凝集能が血液内外の物理化学的因子などの他の測定条件因子の変化に影響を受けやすいことから、それらの測定条件因子の厳密な制御を必要とする。例えば、実際の測定の場面においては、測定前の全血液試料採取・注入の際に使用する採取・注入管について、管径や長さが相違するものを何気なく使用しているため、使用する採取・注入管によって測定結果が異なるという問題が生じる。また、同じ全血液試料と同じ装置とを用いた場合であっても、全血液試料の測定操作の際に、測定者が特に意識することなく行う操作条件（例えば、撹拌回数や撹拌速度）については、それらの測定条件が測定者間で相違するために、測定者によって測定結果が場合により著しく相違するという問題もある。
【０００８】
このような全血液試料の流動性の測定における問題は、マイクロチャネルアレイを用いて血液以外の組織液や尿、あるいは他の有形成分を含有する流体の流動性を測定する際にも生ずる。
【０００９】
本発明は、以上の問題を解決しようとするものであり、測定者によらず、全血液試料のような有形成分含有流体の流動性を簡便で良好な再現性で測定できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような状況の中で、本発明者らは、抗凝固処置した全血液試料をマイクロチャネルアレイに流し、全血液通過時間から流動性を測定する上述したような方法において、全血液試料を採血管から採取してマイクロチャネルアレイホルダーの流入口ないしそれに接続された試料容器に注入する際には、細管を含む採取・注入器具を使用するが、そのような器具としてマイクロピペット及びピペットチップを使用した場合と注射器及び針を使用した場合とで、全血通過時間が異なる（即ち、流動性が変化する）という現象に着目した。そして、本発明者らは、この現象の主原因が、器具の種類、その器具による血液の採取速度や注入速度が測定者によって相違しているために、採取・注入操作毎に全血液試料に異なる大きさのずり応力が印加されている点、及び全血液試料に印加されるずり応力の差が血小板凝集能の差（換言すれば、血小板凝集能のずり応力感受性の差）となってその流動性を変化させた点、にあることを見出した。
【００１１】
本発明者ら、この新たに見出した知見に基づき、有形成分を含む流体試料をマイクロチャネルアレイに流す前に、予め流体試料に所定範囲のずり応力を印加しておくことにより、上述の課題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
即ち、表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする流体流動性測定方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、（イ）表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板と該ベース基板に密着した透明基板とからなり、それらの間に該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイ；
（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部；
（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン；、
（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部；
（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン；及び
（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部
を有する流体流動性測定装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置によれば、有形成分を含有する流体試料をマイクロチャネルアレイに通過させる前に、予め流体試料に所期のずり応力を印加する。結果的に、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予め制御することになる。従って、測定者によらず、再現性の良好な流体の流動性の測定結果が得られる。
【００１５】
特に、液体試料として血小板を含有する血液試料を用いた場合、血小板は体内を循環している際に血管の狭小部があればそこで強いずり応力を受けることになる。このずり応力による血小板凝集は血栓の原因になるので、血液試料に印加されるずり応力の差が血小板凝集能の差（換言すれば、血小板凝集能のずり応力感受性の差）を測定することは、全血液試料の流動性を評価する上で極めて重要である。また、血小板のずり応力感受性は体内でどれだけのずり応力を受けたかで変わるので、体内の血管の狭小化の程度を評価することが可能となる。本発明においては、前述したように、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予め制御することになるので、全血液試料の血小板凝集能のずり応力感受性が測定可能となる。
【００１６】
また、血小板凝集は、すでに凝集した血小板の塊がある所で進みやすい性質があり、体内ではその効果が重要である。本発明においては、ずり応力履歴がコントロールされた試料を用いるので、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集を評価可能となる。同様の理由で、本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置は、流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性を評価できる。たとえば、細胞組織含有試料の場合には、測定前にずり応力をかけることで、その活性度を測定することが可能となる。高分子ポリマー粒子含有エマルジョン試料の場合には、測定前にずり応力をかけることで、粒子間の架橋度や凝集力を測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の流体流動性測定方法では、表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイを使用し、そのマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする。
【００１９】
本発明の測定の対象となる流体は、有形成分を含有するものであり、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料または調製血液試料、細胞組織（粒子）含有液体試料、高分子ポリマー粒子含有エマルジョン試料などが該当する。
【００２０】
本発明で使用するマイクロチャネルアレイとは、シリコン等の金属板、アルミナ等のセラミック板、熱可塑性樹脂板の表面にミクロンサイズの複数の溝がアレイ状に形成されたベース基板に、ガラスや透明樹脂（アクリル系樹脂等）からなる透明基板を密着させ、両基板間にベース基板に形成された溝に対応したマイクロチャネルアレイを構成するものである。ここで、ミクロンサイズとは、測定対象等に応じて適宜設定されるものであるが、一般には幅が１〜５０μｍ、深さが１〜５０μｍ、長さが２〜１０００μｍであり、好ましくは幅が２〜２０μｍ、深さが２〜２０μｍ、長さが５〜５００μｍである。因みに、測定対象が全血液試料である場合には、幅が２〜１５μｍ、深さが２〜１５μｍ、長さが５〜２００μｍであることが好ましい。
【００２１】
溝の形成は、ベース基板の材料や溝のサイズ等に応じて、公知の手法、例えば、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の手法を適宜利用して行うことができる。また、熱可塑性樹脂板を、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等により作製する際に、同時に溝を形成することもできる。例えば、フォトレジストパターンから起こしたＮｉ電鋳を用いて、射出成形することで微細な溝のアレイを表面に有するプラスチックス材料からなるベース基板を作製できる。このベース基板を、透明基板で漏れのないように覆えば、マイクロチャネルアレイを実現することができる。また、微細な溝のアレイを加工する基板にシリコン単結晶基板を用い、密着させる透明基板にガラス基板を用いることで精度の高いマイクロチャネルアレイを実現することもできる。すなわち、フォトリソグラフィーやエッチングの技法を用いることでシリコン単結晶基板表面にミクロンサイズの溝のアレイをサブミクロン精度で加工できる。
【００２２】
また、ベース基板と透明基板との密着は、それぞれの素材の種類に応じて公知の密着法から選択して行うことができる。例えば、ベース基板がシリコン単結晶基板であり、透明基板がガラス基板である場合には、陽極接合法で溶着することができる。ベース基板と透明基板が共にプラスチック基板である場合には、熱溶着法やエキシマ光照射溶着法等の溶着法により密着させることができる。なお、両基板の対向面が、通常、光学研磨面であるため、圧着法だけでも、流体の漏れが生じないレベルで密着させることができる。特に、気泡の障害を防ぐことや洗浄などのためにはマイクロチャネルアレイの分解組立が可能な圧着の方が優れている。
【００２３】
なお、ベース基板の熱可塑性樹脂としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、酢酸ビニル系樹脂（商品名：エクセバール）、ポリビニルブチラール系樹脂等を使用することができる。また、これらの中で透明なものを、透明基板の材料として使用することができる。
【００２４】
本発明において、マイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させるには、マイクロチャネルアレイの流入口と流出口との間に流出側が低くなるような圧力差を設定すればよく、流体液面に差をつけることや、流出側を強制的に減圧すること、流入側を強制的に加圧することなどにより行うことできる。
【００２５】
本発明において、流体試料に予め印加するずり応力は、所期の大きさにコントロールすることが肝要であり、その大きさの範囲としては、低すぎたり高すぎたりすると流動性の差異が判別しにくくなるので、好ましくは１０dyn/cm2〜１０，０００dyn/cm2の範囲、より好ましくは２０dyn/cm2〜５,０００dyn/cm2の範囲、特に好ましくは５００dyn/cm2〜３,０００ dyn/cm2の範囲である。
【００２６】
流体試料にずり応力を印加する方法としては、丸底瓶に液体試料を入れ、その内径よりも僅かに小さい直径の円筒体を瓶に押し込む方法、流体試料を２枚の平板の間に挟み、平板を互いにずらす方法、流体試料を細管中に通過させる方法等が挙げられる。中でも、ずり応力の制御が容易な点から、ガラス管、樹脂管、金属管等の細管中に液体試料を通過させる方法が好ましい。この場合、ずり応力の大きさは、細管の内径、細管の内壁の材質や平滑度、流体試料が細管中を移動する速度等を適宜選択することによりコントロールすることができる。特に、細管の内径および／または細管中の流体試料の流速を調整することが、管理の容易性から好ましい。例えば、内径０．６ｍｍの管を用いた場合、血小板凝集が起こらず、０．４ｍｍの管を用いた場合に血小板凝集が発生するといった被験者の健康状態に応じたずり応力に対する凝集の挙動を正確に測定することが可能となる。
【００２７】
また、血小板凝集は、すでに凝集した血小板の塊がある所で進みやすい性質があり、体内ではその効果が重要である。本発明においては、ずり応力履歴がコントロールされた試料を用いるので、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集を評価可能となる。同様の理由で、本発明の流体流動性測定方法は、全血液試料をはじめとする流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性を評価できる。
【００２８】
また、本発明において、印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、ずり応力の大きさ毎に別体のマイクロチャネルアレイに通過させることや、一つのマイクロチャネルアレイに連続的に通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定することになる。これらのように測定することにより、マイクロチャネル内に血小板が凝集した塊があるときの血小板凝集をより再現性良く評価可能となる。同様に、流体試料中の有形成分の凝集・解離に関する安定性をより再現よく評価可能となる。特に、前者のように測定することは、微小循環における閉塞の度合いの測定結果による疾病の発生可能性の評価に適しており、後者のように測定することは、架橋度等の有形成分の性状の評価に適している。
【００２９】
本発明において、流体試料の流動性の測定は、例えば、マイクロチャネルアレイを流体試料が通過する速度、通過時間等を測定する方法、通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法、酵素、FETセンサ等を使用した電気化学検出方法、超音波を照射する方法、表面プラズモン共鳴測定方法等により行うことができる。なお、この測定の際には、ずり応力を印加してから測定までの時間を一定に保つことが、測定結果の良好な再現性にとって好ましい。また、人手が入らない自動化装置を使用して所定のずり応力をかけることが望ましい。
【００３０】
次に、本発明の流体流動性測定装置について説明する。図１に毛細血管床のモデルとなりうるマイクロチャネルアレイの一例の部分の下面図Ｘとその側面図Ｙとを示す。また、図２に流体流動性測定装置一例の概略図を示す。
【００３１】
本発明の流体流動性測定装置は、図１に示すようなマイクロチャネルアレイを使用する。このマイクロチャネルアレイ１０は、表面に微細な溝土手１ａが形成され、隣接する溝土手１ａに挟まれた窪みが溝（１ｂ）となり、そのような複数の溝（１ｂ）がアレイ状に形成されたベース基板１と、これに密着した透明基板２とからなるものである。そして、両基板の間にはアレイ状に配された溝（１ｂ）（即ち、溝アレイ）に対応してアレイ状に配されたマイクロチャネル３（即ち、マイクロチャネルアレイ）が形成される。また、マイクロチャネルの流入口３ａ側には平坦な流入テラス部１ｃが形成され、流出口３ｂ側には平坦な流出テラス部１ｄが形成されている。また、流入テラス部１ｃにつながる大きな空間は流入路１ｅを構成し、流出テラス部１ｄにつながる大きな空間は流出路１ｆを構成する。このマイクロチャネルアレイに赤血球４が通過する様子を図１に示す。赤血球４は、流入路１ｅから流入テラス１ｃに入り込み、更に、変形してマイクロチャネル３を通過し、流出テラス部１ｄから流出路１ｆへと移動する。
【００３２】
本発明の流体流動性測定装置は、このような（イ）マイクロチャネルアレイ、（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部、（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン、（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部、（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン、及び（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部を有する。
【００３３】
（ロ）ずり応力印可部としては、ガラス細管、金属細管、プラスチックチューブ等が挙げられる。これらの細管には、その中へ液体試料を通過させるためのシリンジやポンプ等を接続することができる。
【００３４】
（ハ）液体試料流入ラインとしては、液体試料にずり応力があまりかからないある程度径の太い管、内壁をフッ素加工処理した細管などを例示することができるが、（ロ）ずり応力印加部に、（ハ）液体試料流入ラインを兼ねさせることが好ましい。また、（ロ）ずり応力印加部に、液体試料を採取する機能を持たせてもよい。また、（ホ）液体試料回収ラインに、流体試料の流量を制御するバルブを設けてもよい。
【００３５】
液体試料をマイクロチャネルアレイに通過させるためには、すでに説明したように、マイクロチャネルアレイの流入口と流出口との間に流出側が低くなるような圧力差を設定すればよい。具体的には、マイクロチャネルアレイの流出口よりも液体試料回収ラインの出口が低位置になるようにすればよい。この高低差を可変とすることが好ましい。
【００３６】
（ヘ）測定部としては、マイクロチャネルアレイを流体試料が通過する速度、通過時間等を測定する方法、通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法、酵素、FETセンサ等を使用した電気化学検出方法、超音波を照射する方法、表面プラズモン共鳴測定方法等により行うための装置を挙げることができる。
【００３７】
本発明の流体流動性測定装置は、マイクロチャネルアレイを使い捨てとする場合には、更に（ト）マイクロチャネルアレイを保持するホルダー部を有することが好ましい。このような態様において、一つのベース基板に、流入路→マイクロチャネルアレイ→流出路という経路が独立した複数のマイクロチャネルアレイを設けたものを使用することが測定コストの低減という点から好ましい。これは、ベース基板の製造コストがほぼ基板の面積に比例するので、一つのベース基板に複数のマイクロチャネルアレイを組み込むことができると、一つあたりのマイクロチャネルの製造コストが大きく減少するからであり、それに伴うホルダー部への加工コストの増大があまり大きくないからである。
【００３８】
また、本発明の流体流動性測定装置には、更に生理食塩水注入装置、制御装置を有する圧力発生装置等の装置を、測定対象に応じて適宜設けてもよい。
【００３９】
本発明の流体流動性測定装置の好ましい一態様のより具体的な構成を図２に示す。流体流動性測定装置２０は、試料管２４から試料を採取するための採取・注入管２３を有し、駆動装置２５によって試料管２４から試料を採取したり、チップホルダー２２へ試料を注入する。採取・注入管２４の管径は、試料にずり応力をかけるために、所望の管径とすることができる。図２では、２種類の管径の採取・注入管２３を使用する。マイクロチャネルチップ２１を保持するチップホルダー２２に注入された試料は、回収ライン２６に設けられた遮断・流量可変手段の１種であるバルブ２７が開となることにより、落差圧で回収容器２８に導かれる。落差圧は、マイクロチャネルアレイチップ２１の流出口と回収ライン２８の出口との高低差を調整することで、任意に設定できる。高低差の調節により、マイクロチャネルアレイチップ２１のマイクロチャネルアレイを通過する試料の観察を、より緻密に行うことが可能となる。その高低差は、通常、１〜５０ｃｍ、好ましくは３〜３０ｃｍである。マイクロチャネルアレイチップ２１のマイクロチャネルを通過する試料の様子は、光源２９、顕微鏡３０及びハーフミラー３１を備えたＣＣＤカメラ３２で、マイクロチャネルアレイの透明基板側から観察することができる。観察結果はリアルタイムでディスプレイ３３に表示することが好ましい。なお、チップホルダー２２の上部、または回収ライン２６に液面計、または光による変位量測定を行うことにより、所定の血液量に対する通過時間を測定することも可能となる
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の実施例を、全血液試料を測定する場合を例にとり、具体的に説明する。
【００４１】
フォトレジストパターンから起こしたＮｉ電鋳を用いて、射出成形することで微細な溝のアレイを表面に有するプラスチック基板を作製する。このプラスチック基板をガラス透明基板で漏れのないように覆うことより、図１に示す構造のマイクロチャネルアレイを作製する。この場合、マイクロチャネルのサイズは、血液成分における血球成分のサイズと同等か、それより小さいことが好ましいから、マイクロチャネルの幅、深さを好ましくは２〜１５μｍの範囲、より好ましくは３〜１２μｍの範囲とする。このマイクロチャネルアレイ素子を用いて、図２の流体流動性装置に組み上げる。ここで、赤血球などの有形成分のサイズを考慮して、マイクロチャネルの底面とテラス面をガラス透明基板面から４．５μｍ前後の距離にとる。
【００４２】
次に、血液試料を、通常人の肘静脈から真空採血管を用いて採取し、例えば、ヘパリン抗凝固処理を施した後に、流体流動性装置の試料管に入れ、採取・注入管で所定量をサンプリングすることによりずり応力を印可する。そして、この全血液試料を、採取・注入管からチップホルダー中のマイクロチャネルアレイに移動させる。図２に示す装置では採取管（注入管）の太さを２種類用いているが、管径と採取速度（注入速度）で決まる平均ずり応力を全血液試料に印加することができる。径の違うマイクロピペットチップを用いてもよい。
【００４３】
図３に径が相違する２種類のマイクロピペットチップを用いた時に実際に同一全血液試料のマイクロチャネルアレイ通過時間が異なることを示す。
【００４４】
ところで、管内の平均流速ｖと管の半径ｒから管壁のずり速度は４ｖ／ｒで与えられる。内径０．６ｍｍおよび０．４ｍｍの管を用いて２００μｍ／ｓｅｃの採取速度あるいは注入速度で全血液試料を採取あるいは注入すると、管壁でのずり応力はそれぞれ３．６８×１０2ｄｙｎ／ｃｍ2、１．１１×１０3ｄｙｎ／ｃｍ2になる。
【００４５】
ちなみに毛細血管の管径を６μｍ、その中の流速を１ｍｍ／ｓｅｃとすると管壁のずり応力は４．６６×１０ｄｙｎ／ｃｍ２になる。この値の１０倍程度のずり応力が働くと血小板凝集が起きはじめることが知られている。例えば、内径０．６ｍｍの管を用いると血小板凝集が起きたり起きなかったりし、一方、内径０．４ｍｍの管を用いると多くの場合血小板凝集が起きる。
【００４６】
従って、２種類の管を用いて測定すれば血小板凝集能のずり応力感受性の指標を得ることができる。管の径をさらに増やせばそれだけ詳細なデータを得ることができる。採取速度あるいは注入速度を変えても同様である。
【００４７】
なお、内径２．４ｍｍのチューブ管を用い、５．１６ｄｙｎ／ｃｍ2のずり応力で採取した全血液試料では、血小板凝集が発生せず、ずり応力に対する血小板凝集を測定することはできない。また、内径０．１８ｍｍの針を用い、１．２２×１０4ｄｙｎ／ｃｍ2のずり応力で採取した全血液試料の場合にも、どの試料に対しても血小板凝集が発生してしまうため、ずり応力に対する血小板凝集を測定することはできない。
【００４８】
また、通常、１測定毎にマイクロチャネルアレイチップを新品に交換するか、もしくは洗浄して再使用するが、それに対して、マイクロチャネルアレイチップを新品に交換しないで、もしくは洗浄しないで連続して使用すれば、前の測定でできた血小板凝集塊が残っている状態でのずり応力印加の影響を評価することができる。その場合、印加するずり応力の小さい順に測定するのがよい。
【００４９】
なお、１測定毎に使い捨てのマイクロチャネルアレイチップを新品に代えていると、測定コストの増大が著しくなるので、図４に示すように、一つのベース基板に２つのマイクロチャネルアレイ素子を有するマイクロチャネルアレイチップ４１をホルダー５０（図５）に装着すれば、１個のチップとホルダーで２回の独立した測定が可能になる。この場合、マイクロチャネルアレイ素子の流入口４１ａと流出口４１ｂとには、ホルダー５０の流入路５１ａと流出路５１ｂとがそれぞれ接続され、マイクロチャネルアレイ素子の流入口４２ａと流出口４２ｂとには、ホルダー５０の流入路５２ａと流出路５２ｂとがそれぞれ接続される。ここで、ホルダー５０は、下受け部５０ａと押さえ部５０ｂとキャップ部５０ｃとから構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の流体流動性測定方法およびそれに用いる測定装置によれば、有形成分を含有する流体試料をマイクロチャネルアレイに通過させる前に、予め流体試料に所期のずり応力を印加する。結果的に、マイクロチャネルアレイを通過させる流体試料のずり応力履歴を、通過前に予めコントロールすることになる。従って、測定者によらず、簡便で再現性の良好な流体の流動性の測定結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明で使用するマイクロチャネルアレイの構造模式図である。
【図２】本発明の流体流動測定装置の概略図である。
【図３】異なるマイクロピペットチップを用いた時の全血通過時間の変化を示す図である。
【図４】本発明で用いるマイクロチャネルアレイ２個を含むマイクロチャネルアレイチップの一実施態様を示す図である。
【図５】マイクロチャネルアレイ２個を含むマイクロチャネルアレイチップ用のホルダーの一実施態様を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１ａ 溝土手
１ｂ 溝
１ｃ 流入テラス部
１ｄ 流出テラス部
１ｅ 流入路
１ｆ 流出路
１０ マイクロチャネルアレイ
１ ベース基板
２ 透明基板
３ マイクロチャネル
４ 赤血球
２０ 流体流動性測定装置
２１、４１ マイクロチャネルアレイチップ
２２ チップホルダー
２３ 採取・注入管
２４ 試料管
２５ 駆動装置
２６ 回収ライン
２７ バルブ
２８ 回収容器
２９ 光源
３０ 顕微鏡
３１ ハーフミラー
３２ ＣＣＤカメラ
３３ ディスプレイ
５０ ホルダー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする流体流動性測定方法。
【請求項２】
所期のずり応力が、１０dyn/cm2〜１０，０００dyn/cm2の範囲である請求項１記載の流体流動性測定方法。
【請求項３】
流体試料が、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料または調製血液試料である請求項１または２記載の流体流動性測定方法。
【請求項４】
印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、ずり応力の大きさ毎に別体のマイクロチャネルアレイに通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項５】
印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、一つのマイクロチャネルアレイに連続的に通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項６】
流体試料を細管に通過させることにより、流体試料にずり応力を印加する請求項１〜５のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項７】
細管の内径および／または細管中の流体試料の流速を調整することにより、流体試料に印加されるずり応力の大きさを調整する請求項６記載の流体流動性測定方法。
【請求項８】
（イ）表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板と該ベース基板に密着した透明基板とからなり、それらの間に該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイ；
（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部；
（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン；、
（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部；
（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン；及び
（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部
を有する流体流動性測定装置。
【請求項９】
（ロ）のずり応力印加部が、（ハ）の液体試料流入ラインを兼ねている請求項８記載の流体流動性測定装置。
【請求項１０】
（ホ）の液体試料回収ラインに、流体試料の流量を制御するためのバルブを有する請求項８又は９記載の流体流動性測定装置。
【請求項１１】
（ロ）のずり応力印加部が、液体試料を採取する機能を有する請求項８〜１０のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１２】
マイクロチャネルアレイの流出口と液体試料回収ラインの出口との高低差を変化させることができるようになっている請求項８〜１１のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１３】
（ト）該マイクロチャネルアレイを保持するホルダー部を有する請求項８〜１２のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１４】
複数のマイクロチャネルアレイが、一つのホルダー部に保持されている請求項１３記載の流体流動性測定装置。
【請求項１】
表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させることにより該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料を通過させることにより、流体試料の流動性を測定する流体流動性測定方法であって、予め流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることを特徴とする流体流動性測定方法。
【請求項２】
所期のずり応力が、１０dyn/cm2〜１０，０００dyn/cm2の範囲である請求項１記載の流体流動性測定方法。
【請求項３】
流体試料が、ヒトないし動物の抗凝固処置した全血液試料または調製血液試料である請求項１または２記載の流体流動性測定方法。
【請求項４】
印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、ずり応力の大きさ毎に別体のマイクロチャネルアレイに通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項５】
印加されたずり応力の大きさが互いに異なる複数の流体試料を、一つのマイクロチャネルアレイに連続的に通過させることにより、大きさの異なるずり応力に対応した流動性の変化を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項６】
流体試料を細管に通過させることにより、流体試料にずり応力を印加する請求項１〜５のいずれかに記載の流体流動性測定方法。
【請求項７】
細管の内径および／または細管中の流体試料の流速を調整することにより、流体試料に印加されるずり応力の大きさを調整する請求項６記載の流体流動性測定方法。
【請求項８】
（イ）表面に微細な溝のアレイを備えたベース基板と該ベース基板に密着した透明基板とからなり、それらの間に該溝のアレイに対応して形成されたマイクロチャネルアレイ；
（ロ）マイクロチャネルアレイに流入させる前の液体試料にずり応力を印加するためのずり応力印加部；
（ハ）ずり応力が印加された液体試料をマイクロチャネルアレイの流入口に誘導する液体試料流入ライン；、
（ニ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出する液体試料を回収する回収部；
（ホ）マイクロチャネルアレイの流出口から流出した液体試料を回収部に誘導する液体試料回収ライン；及び
（ヘ）マイクロチャネルアレイを移動する液体試料の流動性を測定するための測定部
を有する流体流動性測定装置。
【請求項９】
（ロ）のずり応力印加部が、（ハ）の液体試料流入ラインを兼ねている請求項８記載の流体流動性測定装置。
【請求項１０】
（ホ）の液体試料回収ラインに、流体試料の流量を制御するためのバルブを有する請求項８又は９記載の流体流動性測定装置。
【請求項１１】
（ロ）のずり応力印加部が、液体試料を採取する機能を有する請求項８〜１０のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１２】
マイクロチャネルアレイの流出口と液体試料回収ラインの出口との高低差を変化させることができるようになっている請求項８〜１１のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１３】
（ト）該マイクロチャネルアレイを保持するホルダー部を有する請求項８〜１２のいずれかに記載の流体流動性測定装置。
【請求項１４】
複数のマイクロチャネルアレイが、一つのホルダー部に保持されている請求項１３記載の流体流動性測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１４５３４５（Ｐ２００６−１４５３４５Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３４７４４（Ｐ２００４−３３４７４４）
【出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５９７１６８４１３）
【出願人】（０００００１０８５）株式会社クラレ (1,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５９７１６８４１３）
【出願人】（０００００１０８５）株式会社クラレ (1,607)
【Ｆターム（参考）】
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