測定装置および全反射蛍光測定装置
【課題】マッチングオイルなどの液体を気泡が発生することなく自動で充填することと、焦点合わせ時間が少ない基板の交換が、装置自動化に関する。
【解決手段】本発明はマッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板をターンテーブルなどの台に設置して、プリズムなどのマッチング対象物に対してスライドさせて、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化装置に関する。全反射顕微鏡や表面プラズモン共鳴装置などで行う液体のマッチング工程を自動化することで、測定対象基板の設置，試薬分注，液体のマッチング，温度調節，反応，検出，測定対象基板交換の一連の工程を完全自動化できるため、装置のスループットが向上する。
【解決手段】本発明はマッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板をターンテーブルなどの台に設置して、プリズムなどのマッチング対象物に対してスライドさせて、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化装置に関する。全反射顕微鏡や表面プラズモン共鳴装置などで行う液体のマッチング工程を自動化することで、測定対象基板の設置，試薬分注，液体のマッチング，温度調節，反応，検出，測定対象基板交換の一連の工程を完全自動化できるため、装置のスループットが向上する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定装置および全反射蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
全反射顕微鏡法は、ナノスケールの局所励起を可能とする高ＳＮ比の観察手法である。この手法の最大の特徴は、屈折率の異なる２物質界面での光の全反射に伴い発生するエバネッセント波を用いる点にある。屈折率ｎ１の物質１と屈折率ｎ２の物質２の界面に、屈折率の大きい物質２側から臨界角以上で光が入射するとその界面で光は全反射されるが、界面から屈折率の小さい物質１側に指数関数的に減衰するエバネッセント波が発生する。エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百ｎｍ程度の領域に僅かに染み出す光であるため、全反射顕微鏡法においては、蛍光染色した試料とスライドガラスの界面でエバネッセント波を発生させることで、スライド近辺の試料の極一部に限定した高いＳＮ比での蛍光観察が可能となり、１分子観察にも応用できる。
【０００３】
全反射顕微鏡を用いたアプリケーションとしては、細胞生物分野における細胞膜活性や単分子事象の観察が非特許文献１に、電気化学分野におけるコロイド粒子の電気的特性が非特許文献２に記載されている。またブラウン運動の実験的解明が非特許文献３に記載されているなど全反射顕微鏡は多分野で大きく貢献しており、近年では核酸配列解析（ＤＮＡシークエンス）への応用が試みられている。これについて以下詳細に説明する。
【０００４】
現在のＤＮＡシークエンス法は、主にサンガー法と呼ばれるＤＮＡ断片調整法と電気泳動法を組合せたキャピラリーシークエンス方式が用いられており、ヒトゲノム解析等に用いられて大きな成果をあげている。しかしながらテーラーメイド医療などの観点から個人のゲノム解析を考えたとき、キャピラリーシークエンスで一度に解析できるＤＮＡ断片の長さよりもはるかに長い断片を、迅速・簡便・安価に解析できる技術が強く求められている。従来のヒトゲノム解析では一人のヒトゲノムを解読するのに約１０００万ドルが必要であったが、将来は１００００分の１の１０００ドルでヒトゲノム解析を行うことでシークエンスの医療分野への応用が飛躍的に進むと期待されており、従来のキャピラリー法の改良のみではこれらの要求に応えることは不可能である。究極的には解読したい核酸をＰＣＲなどの核酸増幅を行うことなく、単一分子レベルでシークエンスできれば、核酸増幅が無い分、試薬代が安価であり、迅速・簡便なシークエンスが可能となる。単一分子レベルでの検出を可能とする方法が全反射顕微鏡法である。更に単一分子シークエンスでは、核酸増幅に起因する増幅効率の差が無いため、従来法と比較して細胞中で発現しているｍＲＮＡなどの個数をより高精度に定量することが可能となる。従って新たな方式に基づく単一分子ＤＮＡシークエンスが待望されている。
【０００５】
現在、光技術を用いた超並列解析法が提唱されており、既に数社から化学発光や蛍光の原理に基づく装置が市販されている。これらの方法の特徴は、マイクロビーズや微細加工技術を用いて反応場を区分けすることで、超並列解析を可能にしたことである。従来のキャピラリーシークエンス方式では、多チャンネル化（〜３８４本）によって解析効率の向上が図られているが、光技術を用いた超並列解析法では１億個以上の超並列解析も可能であり、キャピラリーシークエンス方式と比較して圧倒的に多い。従って読み取り塩基長では１００塩基以下と１０００塩基近い解読が可能なキャピラリーシークエンスに劣るものの、スループットとしては例えば１００塩基×１億個（１０８）で１日当たり１０ギガ（１０１０）塩基となり、キャピラリー方式と比較して１０００倍以上のスループットが達成できている。また超並列解析により１サンプル当たりの試薬量は少なくなるため、結果的に試薬コストの低下に繋がる。従って解析コストは現状ヒトゲノム一人当たり約１０万ドルとキャピラリーシークエンス方式の約１００分の１から１０００分の１となっている。但しこれらの方式の場合、解読したい核酸を核酸増幅してシークエンスしているため、これ以上の解析コスト低減は難しい。
【０００６】
更なる解析コスト低減を達成するために、光技術を用いた超並列解析法による単一分子ＤＮＡシークエンスする方法が非特許文献４で提唱されている。この方法では全反射顕微鏡が用いられている。また前記文献よりも更にハイスループットな単一分子ＤＮＡシークエンスの方法として、リアルタイムでの単一分子シーケンスが非特許文献５で報告されており、全反射顕微鏡が使用されている。従来のＤＮＡシークエンスの多くは、酵素としてＤＮＡポリメラーゼを利用しているが、前記文献のように伸長反応とシークエンスを一塩基ごとに行う方法では、酵素に備わっている連続的に塩基を取り込む能力を無駄にしている。ＤＮＡポリメラーゼ１分子が塩基を取り込む能力は、１秒に約１０００塩基で、１０万塩基以上の長さにわたって読み取ることができ、更に取り込む塩基の正確性も非常に高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−０８３８００号公報
【特許文献２】特開２００７−０８５９１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Alelrod, D. et al vol.2, pp. 764-774, (2001)
【非特許文献２】Prieve, D. C. and Frej, N. A., Langmuir, 6, pp. 396-403
【非特許文献３】Kihm, K. D. et al., in Fluids, 37, pp.811-824, (2004)
【非特許文献４】PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964
【非特許文献５】PNAS 105(4): 1176-1181. (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したリアルタイムでの単一分子シークエンスで想定されるプロトコルは以下の通りである。酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーをチューブに入れて、複合体を形成する。酵素活性の低下を防ぐために４℃で行うのが一般的である。次に酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーの複合体を基板に送液して、複合体を基板に固定する。この時も酵素活性の低下を防ぐために４℃で行うのが一般的である。次に酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーの複合体が固定された基板を顕微鏡に設置し、焦点をあわせてから顕微鏡撮影を開始する。次に蛍光標識されたｄＮＴＰを流して塩基の伸長反応を開始する。３７℃で酵素活性が最大となる酵素を用いるのが一般的であるため、３７℃に温度調節しながら行う。蛍光標識されたｄＮＴＰの蛍光標識部位は、塩基ではなく、末端のリン酸にホスホリンクヌクレオチドをつけることで、酵素が塩基を取り込む過程で蛍光色素を切り離す仕組みである。従って連続的に伸長反応が進むため、１回のシークエンスが終了するまでは視野を固定する必要がある。１視野あたりに要するシークエンス時間は、酵素活性が失われるまでの時間から０〜６０分程度と想定される。測定が終了したら、視野を塩基の伸長反応が起こっていない別の場所へ移動する。視野移動後に、蛍光標識されたｄＮＴＰを流して塩基の伸長反応を開始し、再びリアルタイムでのシークエンスを行う。従って視野ごとに送液を制御する必要がある。この操作を１基板あたりに存在する視野数分行う。１基板あたり１視野の場合には、１回の測定が終わったら、次の基板をセットする。但し酵素は基板上へ固定された直後から活性の低下がはじまるため、リアルタイム反応の計測可能時間は、測定最初の視野では長いが、測定終了の視野に近づくにつれて短くなる傾向がある。視野ごとの送液制御やリアルタイム反応時間を極力長くするためには、１基板を１視野としてもよい。
【００１０】
１基板に存在する全ての視野を検出し終わったら、基板を外して、新しい基板をセットする。プリズム型エバネッセント顕微鏡で基板交換を行う時には、プリズムと対物レンズの位置を基板から離して基板の着脱を行う。その後新しい基板を設置して、プリズムと基板との間にマッチングオイルを満たしてから、対物レンズを近づけて焦点を合わせる。但しマッチングオイル中に気泡が入ることでレーザーが気泡で乱反射して検出できなくなる危険性があることや、時間を要する焦点合わせの間は基板の測定ができないことから、スループットが低下するのが課題である。プリズムと対物レンズの位置を固定したまま、基板のみを引き抜くこともできるが、プリズムと対物レンズの距離は一般的に数mmしかないため、基板を引き抜いた際にプリズムと基板の間のマッチングオイルが対物レンズに接触してしまう。この場合、対物レンズ上に付着したマッチングオイルを拭き取らないと、次の基板の測定を行うことができないため、装置の自動化の障壁となっている。従って対物型／プリズム型全反射顕微鏡装置や、マッチングを必要とする表面プラズモン共鳴測定装置などの装置において、マッチングオイルなどの液体を気泡が発生することなく自動で充填することと、焦点合わせ時間が少ない基板の交換が、装置自動化への大きな課題である。
【００１１】
なお、特許文献１に欠陥検査方法及び欠陥検査装置が開示されているが、液浸する面はウエハ上面であり、ウエハ下面を液浸した場合、検出系に液体が付着し、検出できない。また、１枚のウエハを検査し終えると、液浸部を除去して、乾燥させてから次のウエハを入れる。従ってウエハを乾燥・交換する間は検査を行うことができない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題に対して鋭意検討した結果、マッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板を、プリズムなどマッチングさせたい対象物へスライドさせることで、気泡が発生することなくマッチングすることができ、本発明を完成するに至った。より具体的には、マッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板をターンテーブルなどの台に設置して、プリズムなどのマッチング対象物に対してスライドさせて、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化測定装置に関する。
【発明の効果】
【００１３】
全反射顕微鏡や表面プラズモン共鳴装置などで行う液体のマッチング工程を自動化することで、測定対象基板の設置，試薬分注，液体のマッチング，温度調節，反応，検出，測定対象基板交換の一連の工程を完全自動化できるため、装置のスループットが向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図（プリズム上）。
【図２】ターンテーブル上視図（プリズム上）。
【図３】プリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図（プリズム下）。
【図４】プリズム形状と動作機構図（プリズム上）。
【図５】プリズム形状と動作機構図（プリズム上）。
【図６】プリズム形状と動作機構図（プリズム下）。
【図７】フローセル図。
【図８】プリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図（プリズム上）。
【図９】プリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図（プリズム下）。
【図１０】ターンテーブル上視図（プリズム下）。
【図１１】ターンテーブルへの測定基板設置図（プリズム上）。
【図１２】表面プラズモン共鳴の装置構成図（プリズム下）。
【図１３】プリズム型エバネッセント顕微鏡の装置構成図（プリズム横）。
【図１４】マッチングオイル溜め付きターンテーブル上視図（プリズム上）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記の課題に対して鋭意検討した結果、マッチングオイルを滴下した測定対象基板を、気泡が発生しにくい構造のプリズムへスライドさせることで、気泡が発生することなくマッチングする。より具体的には、マッチングオイルを滴下した測定対象基板をターンテーブルに設置して、マッチングオイルをプリズムと測定対象基板との間に容易に入り込ませるためのテーパや曲面を有するプリズムに対して回転させて、マッチングオイルにプリズムが接触する近傍でターンテーブルの回転速度を遅くすることで、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化装置に関する。
【００１６】
本発明は、前述したリアルタイムでの単一分子シークエンスだけではなく、１塩基ずつ塩基を伸長させてシークエンスを行う方法（逐次方式）に適用可能である。顕微鏡を用いて検出するプロトコル全般にも適用できることは、以下の実施例から容易類推可能である。逐次方式とリアルタイム方式で想定されるプロトコルの例を以下に示す。
【００１７】
全反射顕微鏡を用いた逐次方式として、レーザー波長５３２ｎｍおよび６３５ｎｍを用い、それぞれ蛍光体Ｃｙ３および蛍光体Ｃｙ５の蛍光検出に用いる。試料溶液を２枚のスライドガラス間に挟んでから、スライドガラスと試料溶液との屈折率境界平面上の溶液層側に、単一の標的ＤＮＡ分子をビオチン−アビジン結合を利用して固定化する。次に溶液中にＣｙ３標識したプライマーを溶液交換によって一定濃度になるように導入すると、単一のＣｙ３標識プライマー分子が標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズして、核酸二本鎖を形成する。その後洗浄操作により未反応のＣｙ３標識プライマー分子を除く。標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＣｙ３標識プライマー分子はエバネッセント場の特定の位置に存在するため、標的ＤＮＡ分子の結合位置を蛍光検出によって確認することができる。標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズするＣｙ３標識プライマー分子が、エバネッセントの１視野内に複数存在する場合は、Ｃｙ３標識プライマー分子の位置を全て把握しておくことで、以降のシークエンスを並列的に行うことができる。更に標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズするＣｙ３標識プライマー分子が、エバネッセントの１視野内に複数存在し、かつ複数視野に跨って存在する場合には、スライドガラスを保持しているステージを動かすことにより、視野を移動させながらＣｙ３標識プライマー分子の位置を全て把握しておくことで、以降のシークエンスを超並列的に行うことができる。配列解析のスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野を大きくしたほうが良い。またステージの移動速度を上げて、蛍光観察できない視野間の移動時間を短くしたほうが良い。全てのプライマー分子の位置を確認後、Ｃｙ３を高出力の励起光で一定時間照射することによって蛍光退色（消光）させることで、以降の蛍光発光を抑制する。これは次工程以降でＣｙ３を用いる際に、前工程のＣｙ３が検出されてしまうことを防ぐのが目的である。次工程以降でＣｙ３と異なる蛍光色素を用いる場合には、必ずしも消光しなくてよいが、Ｃｙ３の蛍光波長領域が他の蛍光色素の蛍光波長領域とオーバーラップする可能性もあるため、極力消光しておくことが望ましい。次に二本鎖核酸に塩基を付加する酵素と、Ｃｙ５で蛍光標識したｄＮＴＰ（ＮはＡ（アデニン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン），Ｔ（チミン）のうちの１種類）を含む溶液を、溶液交換によって一定濃度になるように導入する。標的ＤＮＡ分子に対して相補鎖の関係（ＡとＴ，ＣとＧ）である場合に限り、蛍光標識したＣｙ５−ｄＮＴＰ分子が二本鎖核酸のうちのプライマー分子の伸長鎖に取り込まれる。通常Ｃｙ５で蛍光標識したｄＮＴＰがプライマー分子の伸長鎖に取り込まれると、酵素は次の塩基を取り込もうとするが、例えばＣｙ５−ｄＮＴＰ分子の塩基の部分に特定の分子を結合させておくことにより、２塩基以上は連続して取り込まないような仕組みになっている。その後洗浄操作により、未反応のＣｙ５−ｄＮＴＰ分子を除く。伸長鎖に取り込まれたＣｙ５−ｄＮＴＰは、エバネッセント場の特定の位置に存在するため、蛍光検出によってＣｙ５−ｄＮＴＰの結合位置を確認することができる。更にＣｙ５−ｄＮＴＰの結合位置と、前記標的ＤＮＡ分子の結合位置が一致する箇所を特定することにより、エバネッセント場の特定位置に固定された標的ＤＮＡ分子の配列を解読することができる。プライマー分子の伸長鎖に取り込まれるＣｙ５−ｄＮＴＰが、エバネッセントの１視野内に複数存在する場合は、結合したＣｙ５−ｄＮＴＰの位置を全て把握しておくことで、標的ＤＮＡ分子の配列を並列的に解読することができる。
【００１８】
またプライマー分子の伸長鎖に取り込まれるＣｙ５−ｄＮＴＰが、エバネッセントの１視野内に複数存在し、かつ複数視野に跨って存在する場合には、スライドガラスを保持しているステージを動かすことにより、視野を移動させながらＣｙ５−ｄＮＴＰの位置を全て把握しておくことで、標的ＤＮＡ分子の配列を超並列的に解読することができる。配列解析のスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野を大きくしたほうが良い。またステージの移動速度を上げて、蛍光観察できない視野間の移動時間を短くしたほうが良い。全てのＣｙ５−ｄＮＴＰの配列（１塩基）を確認後、Ｃｙ５を高出力の励起光で一定時間照射することによって蛍光退色（消光）させることで、以降の蛍光発光を抑制する。次工程以降でＣｙ５と異なる蛍光色素を用いる場合には、必ずしも消光しなくてよいが、Ｃｙ５の蛍光波長領域が他の蛍光色素の蛍光波長領域とオーバーラップする可能性もあるため、極力消光しておくことが望ましい。Ｃｙ５消光後、２塩基以上連続して取り込まないようにＣｙ５−ｄＮＴＰ分子に結合させた特定の分子を、触媒や光解離などの手段を用いて切り離す。これで次の塩基を伸長させることができる。以上のＣｙ５−ｄＮＴＰの伸長反応プロセスを、例えばｄＡＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＧＴＰ→ｄＴＴＰ→ｄＡＴＰのように４種類の塩基を順番に繰り返して行うことにより、固定された標的ＤＮＡ分子の塩基配列を決定することが可能である。ｄＮＴＰの伸長反応プロセスを超並列処理することによって、複数のターゲットＤＮＡ分子を超並列的にシークエンスできるのである。この単一分子シークエンスの原理はＣｙ３，Ｃｙ５の２色の蛍光色素を例に挙げて説明したが、これら２つの色素に限定されるものではなく、他の蛍光色素や方法で実現可能である。例えば４種類の異なる蛍光色素でｄＮＴＰをそれぞれ標識することにより、前記に示したｄＡＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＧＴＰ→ｄＴＴＰ→ｄＡＴＰの４種類の塩基を順番に繰り返して伸長反応させる必要がなくなるため、スループットは単純計算で４倍速くなる。またプライマー分子とｄＮＴＰを全て同じ蛍光色素（１色）で標識することもできる。
【００１９】
次に全反射顕微鏡を用いたリアルタイム方式の例を示す。従来のＤＮＡシークエンスの多くは、酵素としてＤＮＡポリメラーゼを利用しているが、逐次方式では、酵素に備わっている連続的に塩基を取り込む能力を無駄にしている。ＤＮＡポリメラーゼ１分子が塩基を取り込む能力は、１秒に約１０００塩基で、１０万塩基以上の長さにわたって読み取ることができ、更に取り込む塩基の正確性も非常に高い。そこで２つの技術を用いて、核酸を連続的に伸長させながらリアルタイムでシークエンスしている。１つ目の技術は、蛍光標識を塩基ではなく、末端のリン酸にホスホリンクヌクレオチドをつけることで、酵素が塩基を取り込む過程で蛍光色素を切り離す仕組みである。これにより塩基を取り込んだ後には、完全に自然な二本鎖ＤＮＡが残る。酵素が塩基を取り込む時の塩基に対応した蛍光を、リアルタイムに検出することで、連続的なシークエンスが可能である。但し４種類の塩基はそれぞれ異なる蛍光標識をしておく必要がある。なお酵素が取り込むまでの一定時間のみ、蛍光色素はエバネッセント場の特定の場所に存在するため、この時の位置を把握することでシークエンスできる。なお２つ目の技術により、蛍光色素が切り離された後は、蛍光色素はブラウン運動で溶液中を漂うことになるため、シークエンスへの影響はない。また伸長反応とシークエンスを一塩基ごとに行う方法のように、高出力のレーザーを照射して蛍光色素を消光する工程も必要ない。２つ目の技術は、単一分子検出を可能にしたゼロモード導波技術である。これによりナノメートルサイズの穴内部の蛍光色素のみを測定できるため、塩基から切り離された蛍光色素や、伸長反応に寄与していない未反応の蛍光標識塩基を洗浄操作により除去すること無く測定できる。これらの技術によりリアルタイムＤＮＡシークエンスの実現性が示唆されている。
【００２０】
リアルタイムでの単一分子シークエンスにおいては、連続的に伸長反応が進むため、１回のシークエンスが終了するまでは、通常視野を固定する必要がある。従ってスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野をできるだけ大きくすることが有効である。但し対物レンズ型全反射顕微鏡を使用している場合には、６０倍以上の高倍率検出に制限される。従って視野は狭くなる。以下に単一分子シークケンスなどに利用されている全反射顕微鏡として、２種類説明する。全反射顕微鏡で現在一般的に用いられているのは、対物レンズ型全反射顕微鏡である。倒立型にして対物レンズをスライドガラスの下方に油浸オイルを介して位置を決め、その対物レンズを経てエバネッセント波発生用のレーザー光をスライドガラス下方から斜めに入射させ、スライドガラス上の試料が置かれた界面近傍にエバネッセント波を発生させる。この配置の場合、対物レンズ上方（スライドガラス上方）の空間が自由に扱えるため操作性と利便性に優れており、かつ非常に明るい蛍光画像が得られるのが特徴である。しかし高開口数油浸対物レンズを用いるという原理上の制約により、倍率が６０倍以上の高倍率観察に制限されるのが欠点である。高倍率観察に制限されないもう１種類の全反射顕微鏡として、プリズムを介してレーザーを入射するプリズム型全反射顕微鏡が使用されている。この顕微鏡では、試料を２枚のスライドガラス間、またはスライドガラスとカバーガラス間などに挟み、上方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経てエバネッセント波発生用のレーザー光を上方のスライドガラスの上方に斜めに入射させ、そのスライドガラスの試料と接する界面近傍にエバネッセント波を発生させる。この配置の場合、レーザー光を効率的に入射できることから、対物レンズ型よりも更に高いＳ／Ｎ比での観察が可能である。また対物レンズ型全反射顕微鏡とは異なり、高開口数油浸対物レンズを使用する必要は無く、空浸，水浸型の対物レンズを使用できる。
【００２１】
従って倍率の制約がないため低倍率観察も容易である。低倍率観察により１視野は大きくなるため、例えば非特許文献５におけるスループットは向上する。ゆえに対物レンズ型よりもプリズム型全反射顕微鏡の方が、スループット向上の観点からは適していると言える。但しプリズム型全反射顕微鏡では、対物レンズ上方の空間がプリズムで塞がれてしまうため、試料の操作性や標本の自由度が著しく低いのが欠点である。試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易でかつ低倍率観察を可能とするプリズム型全反射顕微鏡システムの開発が期待されている。ＤＮＡシークエンスのスループット向上のためには、一度に検出できる視野を広くすることが重要である。対物レンズ型全反射顕微鏡では倍率６０倍以上の高倍率観察に限定されるが、プリズム型エバネッセント方式では倍率の制約が無いため、低倍率観察することによりスループットは向上する。例えば４０倍の対物レンズの視野は６０倍の対物レンズのそれと比較して２倍以上である。従って、プリズム型全反射顕微鏡を採用した場合、スループットは２倍以上向上すると期待される。
【００２２】
またスループット向上のためには、酵素の反応速度を上げることも重要である。酵素の反応速度を上げる方法としては、基質濃度を高くすること、至適ｐＨにすることの他に、酵素の至適温度にすることが考えられる。この中で基質濃度とｐＨに関しては、溶液中の組成を変えることで実現できる。但し酵素の至適温度（反応温度）の管理に関しては、温度調節を行う装置が別途必要となる。酵素の反応速度は温度とともに上昇するが、酵素はタンパク質であるために高温では変性する。従って酵素活性は逆に低下する。一般的に動物の酵素では４０〜５０℃、植物の酵素では５０〜６０℃である。但し好熱性細菌のように８０〜９０℃（超高熱菌には９０℃以上）のものもある。以上より、温度制御機能付きのプリズム型全反射顕微鏡を用いることで、装置としてのスループットを最大にできる。以下に実施例の詳細を記載する。
【実施例１】
【００２３】
上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参照しながら説明する。なお図面は説明のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。プリズム型エバネッセント方式の顕微鏡ステージであるターンテーブルへの基板設置，試薬分注，温度調節，マッチングオイル分注，基板上での反応，顕微鏡検出を全自動かつ連続的に行うことで、本発明を完成するに至った。本発明の構成を図１で説明する。図１はプリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図である。レーザー１０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板１０２で円偏光となり、集光レンズ１０３を通した後に、プリズム１０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７が一般的に用いられる。
【００２４】
レーザービームは、測定基板１０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板１０５ｂと溶液（測定基板１０５ｂの下面に接する溶液。実施例７参照。全ての実施例において、マッチング対象物とは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えることができる。）の界面に対して、入射角度約６８°（溶液：水）で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。測定基板１０５ｂの種類としては、石英基板，基板に金属膜などを塗布した金薄膜基板，基板に化学修飾を施して官能基を導入した基板，基板に半導体プロセスで構造体を作製した基板，微粒子や異物などを固定化した基板の他、上述の基板に対して核酸，タンパク質，抗原，抗体，低分子，アプタマー、またはそれに類する生体分子などを結合した基板が使用できるが、これらに限定されるものではない。なお図１では測定基板１０５ａ，１０５ｂは測定基板ホルダ１０６ｂに固定された状態でターンテーブル１０７にセットされている。測定基板１０５と測定基板ホルダ１０６ｂを高い平行度で固定することで、ターンテーブル１０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板１０５ａ，１０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ１０６を介さずに直接ターンテーブル１０７上に設置することもできる。なおプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル１２０ｂで充填することで、レーザービームがプリズム１０４と測定基板１０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ１０６は無いため、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にはマッチングオイル１２０ｂしか存在しない。プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル１２０ｂをプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に保持できなくなるため、３mm以下とすることが望ましい。距離が離れて少しでもプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を回転させることで、ターンテーブル１０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。更にターンテーブル押さえ１０９ａ，１０９ｂを用いてターンテーブル１０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を回転させたときの測定基板１０５ｂの高さを常に一定することができる。ターンテーブル押さえ１０９ａ，１０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１０７や測定基板１０５ａ，１０５ｂを押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１０４と対物レンズ１１０の位置は固定されている。
【００２５】
エバネッセント場では、励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、５０〜１５０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／ｅ（ｅは自然対数）になる。落射蛍光検出と比較して、励起光照射体積が大幅に低減できるため、溶液中に浮遊している遊離蛍光体の蛍光発光や、水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。エバネッセント波による蛍光は、対物レンズ用Ｚ軸ステージ１１１で焦点を合わせた対物レンズ１１０から、フィルタユニット１１２を通して不要な波長成分を除去した後に、結像レンズ１１３を経て２次元検出器であるＣＣＤ１１４上に結像する。結像した信号は制御用ＰＣ１１５で処理され、結果がモニタ１１６に表示される。また試薬容器１１７から分注ユニット１１８で吸引した試薬を、送液チューブ１１９を通して測定基板１０５ａに送液する。対物レンズ１１０は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの場合は気泡の混入が、主に水浸レンズの場合は水の蒸発があることから、これを防止する機構が必要となる。
【００２６】
測定基板１０５ａを検出するまでの手順を示す。まず送液チューブ１１９から測定基板１０５ａ上へマッチングオイル１２０ａを滴下する。送液チューブ１１９はあくまでもマッチングオイル１２０ａを滴下する機構の一例である。マッチングオイルの量は５〜５０μＬが好ましいが、プリズム１０４のマッチングオイル１０５ａが満たされる部分の面積，プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの距離により決定される。従ってこの量に制約されるものではない。マッチングオイル１２０ａの液高さが、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ａが接触して、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にマッチングオイル１２０ａを満たすことができる。マッチングオイル１２０ａの液高さが、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ａが接触しないため、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にマッチングオイル１２０ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１０７を１８０°回転させる。この際にマッチングオイル１２０ａはプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に侵入する。ターンテーブル１０７を回転させると、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ｂは接触しているため、マッチングオイル１２０ｂは、その粘性によりターンテーブル１０７の回転方向に伸長した形状となる。従って送液チューブ１１９からマッチングオイル１２０ａを滴下する位置は、測定基板１０５ａ上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を中心とした対物レンズ１１０の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム１０４と測定基板１０５ｂの中央部にマッチングオイル１２０ｂを満たすことができる。
【００２７】
またマッチングオイル１２０ａがプリズム１０４に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム１０４と測定基板１０５ｂの中央部にマッチングオイル１２０ｂを満たすことができる。測定基板１０５ｂの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。更に必要であれば、対物レンズ用Ｚ軸ステージ１１１で対物レンズ１１０を上下させて焦点を合わせるか、プリズム１０４の位置を上下させる。測定が終わった測定基板１０５ｂは、ターンテーブル回転軸１０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ１２１を用いて、基板ホルダ１０６ａの取り外しと、新しい基板ホルダ１０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。なお図１はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子蛍光検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１０４を図１から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例２】
【００２８】
図２は図１のターンテーブル上視図である。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ２０２へアクセスできる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１を中心とした点線は、分注アームまたは基板オートローダアームが回転する軌道を示している。また分注アームは分注チップ装着部２０３で分注チップを装着して、試薬容器２０４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部２０５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１は、それぞれ別々に配置することで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ２０６でマッチングオイル２０７を、ターンテーブル２０８にセットされた測定基板ホルダ２０９に分注する。その後ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ２１１でターンテーブル２０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を回転させたときの測定基板２１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ２１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル２０８や測定基板２１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム２１３と対物レンズ２１４の位置は固定されている。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させる際に、マッチングオイル２０７はプリズム２１３と測定基板２１２との間に侵入する。ターンテーブル２０８を回転させると、プリズム２１３とマッチングオイル２０７は接触しているため、マッチングオイル２０７は、その粘性によりターンテーブル２０８の回転方向に伸長した形状となる。従って分注チップ２０６からマッチングオイル２０７を滴下する位置は、測定基板２１２上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を中心とした対物レンズ２１４の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム２１３と測定基板２１２の間で、対物レンズ２１４の中心位置にマッチングオイル２０７を満たすことができる。またマッチングオイル２０７がプリズム２１３に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム２１３と測定基板２１２の間で、対物レンズ２１４の中心位置にマッチングオイル２０７を満たすことができる。測定基板２１２の高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。測定が終わった測定基板ホルダ２０９ｂは、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させることで、測定基板ホルダ２０９ａの位置へ移動させる。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１の基板オートローダアームが測定基板ホルダ２０９ａをターンテーブル２０８から外して、未測定の測定基板ホルダ２０９ａを設置する。以上のプロセスを連続して全自動で行う。
【００２９】
但し測定する基板数が増えるにつれて、ターンテーブル２０８上にはマッチングオイル２０７が溜まっていく。これはプリズム２１３に残ったマッチングオイル２０７が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転に伴い、測定基板ホルダ２０９以外のターンテーブル２０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き２１５をターンテーブル２０８に設置することができる。マッチングオイル拭き２１５の高さは、マッチングオイル２０７の付着しているプリズム２１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転に伴い、マッチングオイル拭き２１５がマッチングオイル２０７の付着しているプリズム２１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル２０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き２１５がプリズム２１３を通過後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を反対方向に回転させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル２０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ２０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル２０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル２０７の量を一定に保つことができる。図２の実施例では、測定基板ホルダ２０９とマッチングオイル拭き２１５の位置が９０°ずれているため、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転により、測定基板ホルダ２０９とマッチングオイル拭き２１５との間のターンテーブル２０８の領域に、マッチングオイル２０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き２１５を測定基板ホルダ２０９の近く、もしくは測定基板ホルダ２０９上に配置することで、マッチングオイル２０７が、ターンテーブル２０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き２１５としては、プリズム２１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き２１５はターンテーブル２０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル２０７のターンテーブル２０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き２１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き２１５はターンテーブルに設置されている必要は無く、ターンテーブル押さえ２１１の構成要素として、ターンテーブル２０８とは独立に設置してもよい。また測定基板ホルダ２０９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート２１６，試薬Ｂポート２１７を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１を回転させることで、図２に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ２０９の中央部や、試薬Ａポート２１６，試薬Ｂポート２１７上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ２１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。その例として、送液チューブ２１８を通して、水２１９をポンプ２２０で対物レンズ２１４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また２１９はマッチングオイルなど他の液体にすることができる。なお図２はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム２１３を図２から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【００３０】
更にターンテーブル２０８を部分的に温度調節することで、測定基板ホルダ２０９ａと２０９ｂを異なる温度に設定できる。温調方式としては、空気温調と局所温調がある。空気温調は加温または冷却装置と温調用の箱を用いて、保温したい箱の空気温度を調節する方法である。温度安定性は高いが、温度到達までの時間が長いこと、６０℃以上の高温は難しいといった課題がある。全反射顕微鏡で空気温調用の箱を用いる場合、スライドガラスを保持する顕微鏡ステージ，プリズム，対物レンズ全てを覆う可能性が高いため、それらの熱膨張の影響が懸念される。特に対物レンズに関しては、高温での使用はメーカーの仕様範囲外であるため、極力室温に保つことが望ましい。また局所温調は加温または冷却装置を温度制御したい部分に直接接触させることで、温度調節する方法である。従って空気温調で懸念されるような対物レンズの熱膨張は発生しない。局所温調は空気温調と比較して温度安定性に劣るものの、温度到達までの時間が短いこと、６０℃以上の高温も制御可能という特徴を持つ。例えば酵素反応と洗浄で温度を変える必要がある場合や、高耐熱性酵素を使用する場合には、空気温調よりも局所温調方式が適している。従って温度調節の方法としては、ターンテーブル２０８に対してペルチエ，ヒーターを接触させる方法や、ターンテーブル２０８に電熱線を埋め込んでおく方法，赤外線レーザーなどを用いる方法などが考えられるが、これらに限定されるものではない。ターンテーブル押さえ２１１にヒーターの役割を持たせても良い。これによりプリズム２１３と対物レンズ２１４で挟まれた測定基板２１２を検出している間に、もう一方の測定基板２１２に、試薬を送液して異なる温度で一定時間反応させた後に、検出を行うバイオアッセイが可能となる。例えばＰＣＲでは一般的に３段階の温度サイクル（例．熱変性：９５℃，ハイブリダイゼーション：５８℃，伸長：７２℃）を経ることで、核酸を２倍にすることができる。従ってターンテーブル２０８に測定基板ホルダ２０９を３枚設置して、３段階の温度設定にすることで、ターンテーブル２０８が１回転するたびに核酸が２倍になるため、その履歴を検出することで初期のＤＮＡ量を計測する定量ＰＣＲが実現できる。またその他にも、実施例に示したようにＤＮＡとプライマーの２本鎖に対して１塩基ずつ蛍光標識塩基を伸長させてＤＮＡシーケンスを行うなど、多くのアプリケーションがある。本発明のアプリケーションはこれらに限定されるものではない。
【実施例３】
【００３１】
図３はプリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図である。従って図３では、図１に示すマッチングオイル１２０が、測定基板１０５の下側にあり、対物レンズ１１０は水浸用対物レンズであるとして説明するが、これに限定されるものではない。レーザー３０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板３０２で円偏光となり、集光レンズ３０３を通した後に、プリズム３０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７が一般的に用いられる。レーザービームは、測定基板３０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板３０５ｂと溶液（測定基板３０５ｂの上面に接する溶液）の界面に対して、入射角度約６８°（溶液：水）で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。なお図３では測定基板３０５ａ，３０５ｂは測定基板ホルダ３０６ｂに固定された状態でターンテーブル３０７にセットされている。測定基板３０５と測定基板ホルダ３０６ｂを高い平行度で固定することで、ターンテーブル３０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板３０５ａ，３０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ３０６を介さずに直接ターンテーブル３０７上に設置することもできる。なおプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル３２０ｂで充填することで、レーザービームがプリズム３０４と測定基板３０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ３０６は無いため、プリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間にはマッチングオイルしか存在しない。プリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル３２０ｂをプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間に保持できなくなる。距離が離れて少しでもプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を回転させることで、ターンテーブル３０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。
【００３２】
更にターンテーブル押さえ３０９ａ，３０９ｂを用いてターンテーブル３０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を回転させたときの測定基板３０５ｂの高さを常に一定することができる。ターンテーブル押さえ３０９ａ，３０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル３０７や測定基板３０５ａ，３０５ｂを押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム３０４と対物レンズ３１０の位置は固定されている。エバネッセント場では、励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、５０〜１５０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／ｅ（ｅは自然対数）になる。落射蛍光検出と比較して、励起光照射体積が大幅に低減できるため、溶液中に浮遊している遊離蛍光体の蛍光発光や、水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。エバネッセント波による蛍光は、対物レンズ用Ｚ軸ステージ３１１で焦点を合わせた対物レンズ３１０から、フィルタユニット３１２を通して不要な波長成分を除去した後に、結像レンズ３１３を経て２次元検出器であるＣＣＤ３１４上に結像する。結像した信号は制御用ＰＣ３１５で処理され、結果がモニタ３１６に表示される。また試薬容器３１７から分注ユニット３１８で吸引した試薬を、送液チューブ３１９を通して測定基板３０５ａに送液する。対物レンズ３１０は水浸用対物レンズを用いた例を示すが、空浸，油浸レンズの使用も可能であり、限定されるものではない。液体を用いた対物レンズ３１０を用いる際には、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。
【００３３】
測定基板３０５ａを検出するまでの手順を示す。まず送液チューブ３１９から測定基板３０５ａ上へ対物レンズ用の水３２０ａを滴下する。水の量は蒸発を防ぐために５０μＬ以上であることが好ましい。この量は測定基板３０５の測定時間，水の蒸発時間，測定温度などの影響で決定される。水３２０ａの液高さが、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、対物レンズ３１０と水３２０ａが接触して、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に水３２０ａを満たすことができる。水３２０ａの液高さが、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、対物レンズ３１０と水３２０ａが接触しないため、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に水３２０ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル３０７を１８０°回転させる。この際に水３２０ａは対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に入り込む。図１に示すマッチングオイル１２０とは異なり、水の場合には、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に気泡が入ることは無い。測定基板３０５ｂの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。更に必要であれば、対物レンズ用Ｚ軸ステージ３１１で対物レンズ３１０を上下させるか、プリズム３０４を上下させる。
【００３４】
測定が終わった測定基板３０５ｂは、ターンテーブル回転軸３０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル３０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ３２１を用いて、基板ホルダ３０６ａの取り外しと、新しい基板ホルダ３０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。プリズム３０４と測定基板３０５との間のマッチングオイルに関しては、送液チューブ３２２を通して、マッチングオイル３２３をポンプ３２４でプリズム３０４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また３２３は他の液体にすることができる。また図２に示すマッチングオイル拭き２１５に相当するものをターンテーブル３０７の下面に設置することもできる。またマッチングオイル溜め容器３２５で、プリズム３０４からこぼれたマッチングオイルを回収する。なお図３はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム３０４を図１から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例４】
【００３５】
マッチングオイルと接液するプリズム面が、ターンテーブルの回転面に対して垂直である場合、プリズムと測定基板との間に気泡が混入したり、測定視野中央部にマッチングオイルが入らないことある。この場合、マッチングオイルがプリズムに接触してから時間を置くことで、マッチングオイルを広がらせ、再度ターンテーブルを回転させることで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができる。但しこの方法では時間がかかること、多量のマッチングオイルを使用すること、必ずしも気泡の混入が防げないといった課題がある。そこで筆者らが鋭意検討した結果、マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、プリズムでマッチングオイルが遮断された場合でも、ターンテーブルの回転力に伴うマッチングオイルの慣性力が、マッチングオイルとプリズムとの間に発生する摩擦力に打ち勝って、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルが引き込まれるという考えに至った。この方法では気泡の混入が無く、短時間かつ少量のマッチングオイルで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができるのが特徴である。図４にプリズム形状と動作機構図を示す。
【００３６】
これは図１〜図３のプリズム部分を拡大した図である。なおプリズム形状は例として挙げたものであり、これらに限定されるものではない。図４（ａ）〜図４（ｄ）はテーパ付きプリズムである。図４（ａ）はプリズム立体図であり、測定基板ホルダ４０１に滴下されたマッチングオイル４０２が、矢印の方向へ移動して、テーパ付きプリズム４０３へ接触する。なおレーザー４０４は図に示すようにマッチングオイルのプリズムへの進行方向とは垂直の方向から照射するのが望ましい。これはマッチングオイル４０２とテーパ付きプリズム４０３が接触する面からレーザー４０４を照射する場合、レーザー４０４の入射部分にマッチングオイル４０２があると、乱反射するなどして測定できなくなるためである。従って、マッチングオイル４０２とテーパ付きプリズム４０３が接触しない面からレーザー４０４を照射するのが好ましい。図４（ｂ）はプリズム斜視図である。測定基板ホルダ４０１に滴下されたマッチングオイル４０２が、テーパ付きプリズム４０３の方向へ移動する。レーザー４０４は紙面に垂直に照射されている。測定基板４０５は測定基板ホルダ４０１に固定されており、対物レンズ４０６が測定基板４０５の下にある。
【００３７】
図４（ｃ）はプリズム斜視図であり、マッチングオイル４０２が、テーパ付きプリズム４０３と接触して、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間に満たされた状態を示す。マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、テーパ付きプリズム４０３でマッチングオイル４０２が遮断された場合でも、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間に、マッチングオイル４０２が引き込まれる。レーザー４０４の光路には測定基板ホルダ４０１は無いため、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間にはマッチングオイルしか存在しない。図４（ｄ）はプリズム上視図である。レーザー４０４は図に示すようにマッチングオイルのプリズムへの進行方向とは垂直の方向から照射するのが望ましい。またプリズム４０３と測定基板４０５との間にマッチングオイル４０２を満たすために、プリズム形状にＲ（Ｒｏｕｎｄ）をつけた時の斜視図を図４（ｅ）に示す。Ｒ付きプリズム４０７にすることで、Ｒ付きプリズム４０７と測定基板４０５との間に、マッチングオイル４０２が引き込まれるのはもちろんのこと、図２の２１５に示すマッチングオイル拭きによるオイル残しが、テーパ付きプリズム４０３と比較してＲ付きプリズム４０７では少なくなる。これはプリズムを曲面にすることで、常に測定基板面とプリズム面との角度が変化するため、マッチングオイル拭きの移動に従い、常にプリズム面との間に摩擦力が発生するためである。一方テーパ付きプリズムでは、測定基板面とプリズム面とが平行な部分では、マッチングオイル拭きが移動しても摩擦力はＲ付きプリズムのそれと比較して小さいため、マッチングオイルを拭き取る力は弱くなるためである。
【００３８】
本実施例より、マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角となるテーパや曲面構造に設定することで、気泡の混入が無く、短時間かつ少量のマッチングオイルで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができる効果がある。
【実施例５】
【００３９】
図４では、マッチングオイルのプリズムへの進行方向に対してレーザーの照射面を垂直にすることで、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着するのを防いでいる。但しターンテーブル上のマッチングオイルを拭き取らずに測定を続けると、マッチングオイルがプリズムに溜まり、レーザー照射面へマッチングオイルが回り込む。結果としてレーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着する可能性がある。そこでレーザー照射面へマッチングオイルが回り込むのを防ぐ形状として、図５のプリズム形状が考えられる。図５にプリズム形状と動作機構図を示す。図５（ａ）はプリズム上視図であり、測定基板ホルダ５０１に滴下されたマッチングオイル５０２が、矢印の方向へ移動して、プリズム５０３へ接触する。プリズム５０３の上視図は蝶ネクタイの形をしており、中央部分の長さが短くなっている。測定基板ホルダ５０１が矢印の方向に移動することで、プリズム５０３で堰き止められて広がったマッチングオイル５０２は、測定基板ホルダ５０１の進行方向に対してプリズム５０３の面に角度がついていることから、マッチングオイル５０２は蝶ネクタイ型の中央部に集まっていく。結果として、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着する可能性が低くなる。
【００４０】
図５（ｂ）はプリズム側面図である。測定基板ホルダ５０１に滴下されたマッチングオイル５０２が、プリズム５０３の方向へ移動する。レーザー５０４は紙面に垂直に照射されている。測定基板５０５は測定基板ホルダ５０１に固定されており、対物レンズ５０６が測定基板５０５の下にある。
【００４１】
図５（ｃ）はプリズム側面図であり、マッチングオイル５０２が、プリズム５０３と接触して、プリズム５０３と測定基板５０５との間に満たされた状態を示す。マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、プリズム５０３でマッチングオイル５０２が遮断された場合でも、プリズム５０３と測定基板５０５との間に、マッチングオイル５０２が引き込まれる。レーザー５０４の光路には測定基板ホルダ５０１は無いため、テーパ付きプリズム５０３と測定基板５０５との間にはマッチングオイルしか存在しない。図５（ｄ）はプリズム側面図であり、図４（ｅ）で示したＲ付きプリズムの構成となっている。プリズムを曲面にすることで、プリズム上の点における微分値が連続的に変化するため、常に測定基板面とプリズム面の傾き（微分値）との角度が変化することになり、マッチングオイル拭きの移動に従い、常にプリズム面との間に摩擦力が発生する。一方テーパ付きプリズムでは、測定基板面とプリズム面とが平行な部分では、マッチングオイル拭きが移動しても摩擦力はＲ付きプリズムのそれと比較して小さいため、マッチングオイルを拭き取る力は弱くなる。
【実施例６】
【００４２】
図３に示すように、ターンテーブルの下にプリズムを配置する場合のプリズム形状を図６に示す。図６は図５の形状を変更したものであり、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着しないプリズム形状である。図６（ａ）はプリズム側面図である。測定基板ホルダ６０１とプリズム６０３との間にマッチングオイル６０２が保持されている。レーザー６０４は測定基板ホルダ６０１の進行方向と垂直の面で、測定基板６０５へ照射され、対物レンズ６０６を通して検出される。マッチングオイル６０２で、プリズム６０３から垂れたものは、マッチングオイル溜め容器６０７で回収される。送液チューブ６０８を通して、マッチングオイルボトル６０９からポンプ６１０を用いて、マッチングオイル６０２をプリズム６０３と測定基板６０５との間に満たす。図６（ｂ）はプリズム上視図である。マッチングオイル６０２をプリズム６０３から落とすために、図５（ａ）と比較して蝶ネクタイ型の中央部をより短くした形状としている。図６（ｃ）は図６（ｂ）をレーザー６０４の照射方向から見た時のプリズム側面図である。レーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面には、マッチングオイル６０２は付着しない。プリズム６０３から垂れるマッチングオイル６０２は、６０２ｂ，６０２ｃのいずれかの点線上を通り、６０２ｄへ到達する。そして表面張力で自重を支えきれなくなると、マッチングオイル溜め容器６０７へ、６０２ｅとして落下して回収される。マッチングオイル６０２はレーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面に付着しないが、別の問題として、レーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面を、誤って手で触れてしまうことがある。この場合手の有機物がプリズム表面に付着するため、レーザー６０４がプリズム６０３面で乱反射して、測定基板６０５を測定できなくなる。これを回避する方法として、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１だけを、手で触れることができないように、くぼみ６１２をつけておく方法がある。立方体／直方体／円柱など柱構造であることが望ましい。また柱構造の大きさは、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１に手が触れられなければよいため、１mmから２０mm程度が望ましい。柱構造の大きさが２０mm程度の場合には、アスペクト比が大きくないと手で触れることができないため、くぼみ６１２の大きさ，深さはこの大きさに限定されるものではない。またくぼみ６１２の大きさはレーザー６０４より大きいのは当然であるが、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１は、時間経過と共に埃などが堆積し、レーザー６０４の乱反射の原因となる。従って定期的にレーザー入射・反射位置６１１を洗浄できる大きさのくぼみ６１２であることが望ましい。つまり光学レンズ用の綿棒などが入る大きさであれば、手では触れられないが、定期的に洗浄はできる。従ってくぼみ６１２の一例としては５mm程度の立方体が考えられる。またくぼみ構造の加工が難しい場合には、穴あき構造を持つもの（例えばナット）をプリズム６０３に貼付することもできる。なおこの構造は、実施例１〜１２の全てのプリズムに対して適用できる。
【実施例７】
【００４３】
図２で試薬ポートに分注する際の流路の例を図７に示す。但し図はあくまでも例であり、これに限定されるものではない。測定基板はマッチング対象物であるプリズムとは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えることができる。これは全ての実施例に対して適用可能である。図７（ａ）はプリズムがターンテーブル上に配置されている場合の図である。測定基板ホルダ７０１上に、マッチングオイル７０２がプリズム７０３に挟まれた状態で存在する。測定基板７０４での反応を対物レンズ７０５で検出するために、流路付測定基板ホルダカバー７０７を測定基板ホルダ７０１と接合する。このとき測定基板７０４と対物レンズ７０５との距離は、対物レンズ固有の作動距離（ワーキングディスタンス）の条件を満たすことが必要である。図２に示す分注チップ２０６を用いて、試薬注入排出ポート７０８へ試薬を注入することで、測定基板７０４へ試薬を送液して、反応を検出する。試薬の送液は流路を親水性にして毛細管現象を利用する方法，試薬注入排出ポート７０８の一方を陰圧にして吸引する方法，遠心力を用いて外周方向に送液する方法などがある。また図７（ｂ）はプリズムがターンテーブル上に配置されている場合の図である。プリズム７０３が測定基板７０４の下に配置されていることから、マッチングオイル溜め容器７０６が設置されている。
【実施例８】
【００４４】
図１〜図３では、ターンテーブル方式を用いたマッチングオイルの自動充填方法などについて開示した。図１〜図３よりマッチングオイルの自動充填は、ターンテーブル以外の方法を用いても実現できることは言うまでもない。つまりマッチングオイルを載せた測定基板をプリズムへ移動させる方法の一例として図１〜図３ではターンテーブル型を開示した。従ってターンテーブルではなく、測定基板を設置した台が左右に移動することでも、同様の機能を実現することができる。図８にプリズムが測定基板の上に設置される場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図を開示する。図８（ａ）は基板設置台上視図、図８（ｂ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出する前の状態である。またプリズムは測定基板の上に設置されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が回転して、基板オートローダアームが基板オートローダ８０２へアクセスする。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が回転して、分注アームが分注チップ装着部８０３へアクセスし、試薬容器８０４で試薬を吸引し、所望の位置で試薬を吐出後に分注チップ廃棄部８０５で分注チップを廃棄する。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１の回転方向は、時計回り／反時計回りのどちらも可能とする。分注チップ８０６でマッチングオイル８０７を滴下した図が図８（ｂ）である。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８上に、測定基板ホルダ８０９が設置されている。この時テーブル押さえ８１０でＸＹＺステージ付基板設置台８０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させたときの測定基板８１２の高さを一定にすることができる。テーブル押さえ８１０の位置や個数に制限は無く、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８や測定基板８１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム８１３と対物レンズ８１４の位置は固定されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１の回転とＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動により、任意の位置に試薬を滴下できる。試薬Ａポート８１６，試薬Ｂポート８１７への分注や、測定基板８１２へのマッチングオイル８０７を滴下できる。図では分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が２つ配置されているが、任意の個数にすることができる。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１ではなく、任意の位置にアクセス可能な分注器や基板オートローダで代用することもできる。またレーザー８１８は、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の進行方向に平行に入射している。但し図４〜図６に示すように、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の進行方向に対して、垂直にレーザー８１８を入射する方がより望ましい。これはマッチングオイル８０７がプリズム８１３のレーザー照射位置に付着して、乱反射することで、検出できなくなるのを防ぐためである。
【００４５】
図８（ｃ）は基板設置台上視図、図８（ｄ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出している状態を示す。またプリズムは測定基板の下に設置されている。測定基板８１２ａを検出するまでの手順を示す。まず分注チップ８０６ａから測定基板８１２ａ上へマッチングオイル８０７ａを滴下する。マッチングオイルの量は５〜５０μＬが好ましいが、プリズム８１３のマッチングオイル８０７ａが満たされる部分の面積，プリズム８１３と測定基板８１２ａとの距離により決定される。従ってこの量に制約されるものではない。マッチングオイル８０７ａの液高さが、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａが接触して、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。マッチングオイル８０７ａの液高さが、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａが接触しないため、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間にマッチングオイル８０７ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付基板設置台８０８をプリズム８１３の方向に移動させる。この際にマッチングオイル８０７ａはプリズム８１３と測定基板８１２ａとの間に侵入する。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させると、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａは接触しているため、マッチングオイル８０７ａは、その粘性によりＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動方向に伸長した形状となる。従って分注チップ８０６ａからマッチングオイル８０７ａを滴下する位置は、測定基板８１２ａ上の移動方向前側かつＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動時に対物レンズ８１４の焦点を通過する位置であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム８１３と測定基板８１２ａの中央部にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。またマッチングオイル８０７ａがプリズム８１３に接触する近傍で、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム８１３と測定基板８１２ａの中央部にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。測定基板８１２ａの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させてずれを補正する。それでも焦点合わないときには、対物レンズ用Ｚ軸ステージで対物レンズ８１４を上下させるか、プリズム８１３を上下させる。測定が終わった測定基板８１２ａは、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を図８（ａ）の方向に引き戻す。
【００４６】
その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１を回転させて基板オートローダアームにより、測定基板ホルダ８０９ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ８０９ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８上にはマッチングオイル８０７が溜まっていく。これはプリズム８１３に残ったマッチングオイル８０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動に伴い、測定基板ホルダ８０９以外のＸＹＺステージ付基板設置台８０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き８１５をＸＹＺステージ付基板設置台８０８に設置することができる。マッチングオイル拭き８１５の高さは、マッチングオイル８０７の付着しているプリズム８１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動に伴い、マッチングオイル拭き８１５がマッチングオイル８０７の付着しているプリズム８１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル８０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き８０７がプリズム８１３を通過後に、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を反対方向に移動させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル８０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ８０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル８０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル８０７の量を一定に保つことができる。
【００４７】
図８の実施例では、測定基板ホルダ８０９とマッチングオイル拭き８１５の位置は間が空いているため、ＸＹＺステージ付基板設置台の移動により、測定基板ホルダ８０９とマッチングオイル拭き８１５との間のＸＹＺステージ付基板設置台８０８の領域に、マッチングオイル８０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き８１５を測定基板ホルダ８０９の近く、もしくは測定基板ホルダ８０９上に配置することで、マッチングオイル８１９が、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き８１５としては、プリズム８１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き８１５はＸＹＺステージ付基板設置台８０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル８０７のＸＹＺステージ付基板設置台８０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き８１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き８１５はＸＹＺステージ付基板設置台８０８に設置されている必要は無く、テーブル押さえ８１０として、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８とは独立に設置してもよい。対物レンズ８１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。なお図８はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム８１３を図８から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。図８の方式では、図１〜図３のターンテーブル方式と比較して、移動時の位置精度が劣る可能性が高いこと、分注機構などが複数必要になる可能性がある。
【実施例９】
【００４８】
図９にプリズムが測定基板の下に設置される場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図を開示する。図９（ａ）は基板設置台上視図、図９（ｂ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出する前の状態である。またプリズムは測定基板の上に設置されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が回転して、基板オートローダアームが基板オートローダ９０２へアクセスする。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が回転して、分注アームが分注チップ装着部９０３へアクセスし、試薬容器９０４で試薬を吸引し、所望の位置で試薬を吐出後に分注チップ廃棄部９０５で分注チップを廃棄する。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１の回転方向は、時計回り／反時計回りのどちらも可能とする。分注チップ９０６でマッチングオイル９０７を滴下した図が図９（ｂ）である。ＸＹＺステージ付基板設置台９０８上に、測定基板ホルダ９０９が設置されている。この時テーブル押さえ９１０でＸＹＺステージ付基板設置台９０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を移動させたときの測定基板９１２の高さを一定にすることができる。テーブル押さえ９１０の位置や個数に制限は無く、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８や測定基板９１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム９１３と対物レンズ９１４の位置は固定されている。対物レンズ９１４は空浸用対物レンズの場合を示したが、これに限定されるものではなく、水浸，油浸用対物レンズの使用も可能である。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１の回転とＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動により、試薬Ａポート９１６，試薬Ｂポート９１７への分注など任意の位置に試薬を滴下できる。図では分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が２つ配置されているが、任意の個数にすることができる。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１ではなく、任意の位置にアクセス可能な分注器や基板オートローダで代用することもできる。またレーザー９１８は、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の進行方向に平行に入射している。但し図４〜図６に示すように、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の進行方向に対して、垂直にレーザー９１８を入射する方がより望ましい。これはマッチングオイル９０７がプリズム９１３のレーザー照射位置に付着して、乱反射することで、検出できなくなるのを防ぐためである。マッチングオイル９０７は送液チューブ９１９を用いて、マッチングオイルボトル９２０からポンプ９２１で吸引され、プリズム９１３と測定基板９１２との間に満たされる。プリズム９１３から垂れたマッチングオイル９０７は、マッチングオイル溜め９２２に回収される。プリズム９１３のレーザー９１８照射部分にマッチングオイル９０７が付着しないプリズム構造としては、図６に開示した方法があるが、これに限定されるものではない。図９（ｃ）は基板設置台上視図、図９（ｄ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出している状態を示す。またプリズムは測定基板の下に設置されている。測定が終わった測定基板９１２ａは、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を図９（ａ）の方向に引き戻す。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１を回転させて基板オートローダアームにより、測定基板ホルダ９０９ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ９０９ａの設置を行う。
【００４９】
以上のプロセスを全自動で連続して行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８上にはマッチングオイル９０７が溜まっていく。これはプリズム９１３に残ったマッチングオイル９０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動に伴い、測定基板ホルダ９０９以外のＸＹＺステージ付基板設置台９０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き９１５をＸＹＺステージ付基板設置台９０８の下面に設置することができる。マッチングオイル拭き９１５の高さは、マッチングオイル８０７の付着しているプリズム９１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動に伴い、マッチングオイル拭き９１５がマッチングオイル９０７の付着しているプリズム９１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル９０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き９１５がプリズム９１３を通過後に、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を反対方向に移動させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル９０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ９０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル９０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル９０７の量を一定に保つことができる。図９の実施例では、測定基板ホルダ９０９とマッチングオイル拭き９１５の位置は間が空いているため、ＸＹＺステージ付基板設置台の移動により、測定基板ホルダ９０９とマッチングオイル拭き９１５との間のＸＹＺステージ付基板設置台９０８の領域に、マッチングオイル９０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き９１５を測定基板ホルダ９０９の近く、もしくは測定基板ホルダ９０９上に配置することで、マッチングオイル９０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き９１５としては、プリズム９１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き９１５はＸＹＺステージ付基板設置台９０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル９０７のＸＹＺステージ付基板設置台９０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き９１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き９１５はＸＹＺステージ付基板設置台９０８に設置されている必要は無く、テーブル押さえ９１０として、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８とは独立に設置してもよい。対物レンズ９１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。
【００５０】
なお図９はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム９１３を図９から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。図９の方式では、図１〜図３のターンテーブル方式と比較して、移動時の位置精度が劣る可能性が高いこと、分注機構などが複数必要になる可能性がある。
【実施例１０】
【００５１】
図１０は図１のターンテーブル上視図であり、図３と同じ方式でプリズムが測定基板の下に配置されている。但し図３とは異なり、マッチングオイルをターンテーブル下面へ表面張力で付着させることで、図２と同様の方式でマッチングオイルを満たしている。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ１００２へアクセスできる。また分注アームは分注チップ装着部１００３で分注チップを装着して、試薬容器１００４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部１００５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１は別々にすることで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ１００６でマッチングオイル１００７を、ターンテーブル１００８にセットされた測定基板ホルダ１００９に分注する。分注チップ１００６をターンテーブル１００８に近接させることで、マッチングオイル１００７がターンテーブル１００８下面に表面張力で付着する。分注チップ１００６を傾けておくことで、マッチングオイル１００７が垂れた場合に分注チップ１００６へのマッチングオイルの付着を防げる。またマッチングオイル１００７が垂れることを想定して、マッチングオイル１００７の下にマッチングオイル溜め容器を設置することもできる。マッチングオイル１００７を分注後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ１０１１でターンテーブル１００８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を回転させたときの測定基板１０１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ１０１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１００８や測定基板１０１２を押さえることができる。ターンテーブル１００８の回転中にマッチングオイル１００７が垂れる場合には、測定位置の直前でマッチングオイル１００７を測定基板１０１２に付着させても良い。
【００５２】
なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１０１３と対物レンズ１０１４の位置は固定されている。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させる際に、マッチングオイル１００７はプリズム１０１３と測定基板１０１２との間に侵入する。ターンテーブル１００８を回転させると、プリズム１０１３とマッチングオイル１００７は接触しているため、マッチングオイル１００７は、その粘性によりターンテーブル１００８の回転方向に伸長した形状となる。従って分注チップ１００６からマッチングオイル１００７を付着させる位置は、測定基板１０１２上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を中心とした対物レンズ１０１４の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム１０１３と測定基板１０１２の中央部にマッチングオイル１００７を満たすことができる。またマッチングオイル１００７がプリズム１０１３に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム１０１３と測定基板１０１２の中央部にマッチングオイル１００７を満たすことができる。測定基板１０１２の高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。測定が終わった測定基板ホルダ１００９ｂは、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させることで、測定基板ホルダ１００９ａの位置へ移動させる。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１の基板オートローダアームが測定基板ホルダ１００９ａをターンテーブル１００８から外して、未測定の測定基板ホルダ１００９ａを設置する。以上のプロセスを連続して全自動で行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ターンテーブル１００８上にはマッチングオイル１００７が溜まっていく。これはプリズム１０１３に残ったマッチングオイル１００７が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転に伴い、測定基板ホルダ１００９以外のターンテーブル１００８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き１０１５をターンテーブル１００８に設置することができる。マッチングオイル拭き１０１５の高さは、マッチングオイル１００７の付着しているプリズム１０１３に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転に伴い、マッチングオイル拭き１０１５がマッチングオイル１００７の付着しているプリズム１０１３を拭くことで、マッチングオイル１００７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き１０１５がプリズム１０１３を通過後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を反対方向に回転させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル１００７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ１００９の測定が終了するごとに、マッチングオイル１００７を拭き取ることで、常にマッチングオイル１００７の量を一定に保つことができる。図１０の実施例では、測定基板ホルダ１００９とマッチングオイル拭き１０１５の位置が９０°ずれているため、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転により、測定基板ホルダ１００９とマッチングオイル拭き１０１５との間のターンテーブル１００８の領域に、マッチングオイル１００７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き１０１５を測定基板ホルダ１００９の近く、もしくは測定基板ホルダ１００９上に配置することで、マッチングオイル１００７が、ターンテーブル１００８へ塗布される領域を最小にできる。プリズム１０１３から垂れたマッチングオイル１００７は、プリズム下にマッチングオイル溜め容器を配置しておくことで回収される。プリズム１０１３のレーザー照射部分にマッチングオイル１００７が付着しないプリズム構造としては、図６に開示した方法があるが、これに限定されるものではない。またマッチングオイル拭き１０１５としては、プリズム１０１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き１０１５はターンテーブル１００８の任意の場所へ設置可能である。
【００５３】
但しマッチングオイル１００７のターンテーブル１００８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き１０１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き１０１５はターンテーブルに設置されている必要は無く、ターンテーブル押さえ１０１１として、ターンテーブル１００８とは独立に設置してもよい。また測定基板ホルダ１００９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート１０１６，試薬Ｂポート１０１７を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１を回転させることで、図１０に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ１００９の中央部や、試薬Ａポート１０１６，試薬Ｂポート１０１７上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ１０１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。なお図１０はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１０１３を図１０から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例１１】
【００５４】
図１〜図３，図１０で示したターンテーブルへ測定基板ホルダを装着する方法を図１１に開示する。但し図はあくまでも例であり、これに限定されるものではない。図１１（ａ）は、測定基板の設置図であり、上視図と側面図を示した。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１を回転中心として、ターンテーブル１１０２が設置されている。測定基板ホルダ１１０３には、測定基板１１０４が固定されている。測定基板ホルダ押さえ１１０５とターンテーブル１１０２との間に、測定基板ホルダ１１０３を挿入して、その位置を固定する。測定基板ホルダ１１０３は、図１０などで説明した基板オートローダアームを用いて運搬と設置を行う。測定基板１１０４を拡大したものを、図１１（ｂ）に示す。測定基板１１０４の上にプリズム１１０６があり、下には対物レンズ１１０７がある。測定基板１１０４とプリズム１１０６との間には、マッチングオイル１１０８がある。マッチングオイル１１０８の充填方法は図２で開示されている。測定基板ホルダ１１０３のターンテーブル１１０２への設置方法を図１１（ａ）の側面図を用いて説明する。まずターンテーブル１１０２の測定基板ホルダを挿入する部分には、切り込みを入れている。これは測定基板ホルダ１１０３を、基板オートローダアームで上下からしっかりと挟んだ状態で、ターンテーブル１１０２へ挿入して位置を固定するためである。ターンテーブル１１０２のＡ−Ｏ−Ａ′面での断面図より、Ａに最も近い部分は、測定基板ホルダ１１０３しか存在しない。従ってこの領域を基板オートローダアームで上下から挟みこむ。
【００５５】
次にＢ−Ｏ′−Ｂ′面で、Ｂに最も近いターンテーブル１１０２上へ測定基板１１０４の一端をのせる。Ｂ−Ｏ′−Ｂ′面でＢに最も近い測定基板ホルダ押さえ１１０５の位置は、Ｂに最も近いターンテーブル１１０２上の位置よりもＢ′側に存在するため、測定基板ホルダ１１０３の一端を、測定基板ホルダ押さえ１１０５の左（Ｂ側）にした状態で、測定基板ホルダ１１０３をターンテーブル１１０２へ下げていくことで、測定基板ホルダ１１０３がターンテーブル１１０２にぶつかる。その後測定基板ホルダ１１０３をＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１の方向へ押し込んでいくことで、測定基板ホルダ押さえ１１０５とターンテーブル１１０２との間へ挿入される。測定基板ホルダ１１０３の一端が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１近辺の側壁へぶつかることで、測定基板ホルダ１１０３を常に同じ位置へ固定できる。測定基板ホルダ押さえ１１０５で測定基板ホルダ１１０３を押さえているため、上下左右に測定基板ホルダ１１０３の位置がずれることは無い。測定終了後には、逆の手順を行う。測定基板ホルダ１１０３を基板オートローダアームで上下から挟みこみ、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１から手前に引くことで、測定基板ホルダ１１０３をターンテーブル１１０２から外すことができる。
【００５６】
この方法は、図９のようにターンテーブルではなく、基板設置台が左右に移動する場合にも適用できることは言うまでも無い。またターンテーブル１１０２のＡ−Ｏ−Ａ′面での断面図より、Ａ−Ｏでは測定基板ホルダ１１０３が挿入されており、Ｏ−Ａ′では測定基板ホルダ１１０３が挿入されていないことがわかる。これより測定基板ホルダ１１０３が挿入されていない場合には、ターンテーブル１１０２に空洞部分が存在することがわかる。図１１（ｂ）でわかるように、この領域は少なくともプリズム１１０６と対物レンズ１１０７が入る大きさでなければならない。
【００５７】
更にターンテーブル１１０２が回転したときに、この領域の厚みは常に測定基板ホルダ１１０３と同じであることが望ましい。そうでない場合には、ターンテーブル１１０２が回転したときに、ターンテーブル１１０２の一部がプリズム１１０６または対物レンズ１１０７に接触する危険性があることや、段差部分にマッチングオイル１１０８が溜まる可能性があるためである。測定基板ホルダ１１０３を挿入したときに、プリズム１１０６と対物レンズ１１０７で挟まれる部分の高さが、Ｂ−Ｏ′−Ｂ′面と、Ｃ−Ｏ−Ｃ′面で同じにしているのは、この理由によるものである。なおターンテーブル１１０２に挿入できる測定基板ホルダ１１０３の枚数は、図１１の２枚に限定されるものではない。ターンテーブル１１０２と測定基板ホルダ１１０３の大きさ、測定したい測定基板ホルダ１１０３の数によって決定されるため、任意の数の測定基板ホルダ１１０３を設置できるターンテーブル１１０２を設計することができる。
【実施例１２】
【００５８】
図１〜図１１では、プリズム型エバネッセント顕微鏡を想定した使用方法を開示してきたが、これらはマッチングオイルなどを自動充填して、全自動で測定を行う方法に関するものであり、他の分析方法にも応用できることはいうまでもない。図１２に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）の装置構成図を開示する。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。ＳＰＲとは、厚み５０ｎｍ程度の金属薄膜表面にプリズムを介してレーザー光を入射して、全反射角領域のある一定角度において特有の光の吸収（反射光の減衰）を検出する手法で、金表面の屈折率を求めることができる。これにより生体分子間の反応・結合量の測定や速度論的解析が、蛍光などの標識無しで、かつリアルタイムに行うことができる。現在免疫応答・シグナル伝達，タンパク質・核酸など様々な物質間の相互作用の研究に利用されている。
【００５９】
図１２では、レーザー１２０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板１２０２で円偏光となり、集光レンズ１２０３を通した後に、プリズム３０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７もしくはＢＳＣ７が一般的に用いられる。レーザービームは、測定基板１２０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板１２０５ｂと溶液の界面に対して、入射角度約６８°で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。なお図１２では測定基板１２０５ａ，１２０５ｂは測定基板ホルダ１２０６ｂに固定された状態でターンテーブル１２０７にセットされている。測定基板１２０５と測定基板ホルダ１２０６を高い平行度で固定することで、ターンテーブル１２０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板１２０５ａ，１２０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ１２０６を介さずに直接ターンテーブル１２０７上に設置することもできる。なおプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル１２１２ｂで充填することで、レーザービームがプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ１２０６は無いため、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にはマッチングオイルしか存在しない。プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル１２１２ｂをプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に保持できなくなる。距離が離れて少しでもプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を回転させることで、ターンテーブル１２０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。更にターンテーブル押さえ１２０９ａ，１２０９ｂを用いてターンテーブル１２０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を回転させたときの測定基板１２０５ｂの高さを常に一定することができる。
【００６０】
ターンテーブル押さえ１２０９ａ，１２０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１２０７や測定基板１２０５ａ，１２０５ｂを押さえることができる。なおプリズム１２０４の位置は固定されている。ＳＰＲ検出器１２１０で検出した反射光信号は、制御用ＰＣ１２１４で処理され、結果がモニタ１２１５に表示される。これにより全反射角領域のある一定角度において特有の光の吸収（反射光の減衰）を検出して、金表面の屈折率を求める。分注チップ１２１１からマッチングオイル１２１２を、測定基板１２０５へ付着させる。これは図１０で開示したのと同様の方法である。またプリズム１２０４は、図４で開示したように、マッチングオイル１２１２との接液部がテーパ構造になっている。マッチングオイル１２１２ａの液高さが、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム１２０４とマッチングオイル１２１２ａが接触して、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にマッチングオイル１２１２ａを満たすことができる。マッチングオイル１２１２ａの液高さが、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム１２０４とマッチングオイル１２１２ａが接触しないため、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にマッチングオイル１２１２ａを満たすことができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１２０７を１８０°回転させる。この際にマッチングオイル１２１２ａはプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に入り込む。測定が終わった測定基板１２０５ｂは、ターンテーブル回転軸１２０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１２０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ１２１９を用いて、測定基板ホルダ１２０６ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ１２０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。必要に応じて、試薬容器１２１６から分注ユニット１２１７で吸引した試薬を、送液チューブ１２１８を通して測定基板１２０５ａへ試薬を送液することもできる。また図２に示すマッチングオイル拭き２１５に相当するものをターンテーブル１２０７の下面に設置することもできる。図６で開示したように、マッチングオイル溜め容器１２１３で、プリズム１２０４からこぼれたマッチングオイルを回収することもできる。実施例１〜１２で開示した光学素子などの配置図はあくまでも一例であり、これらに限定されるものではない。例えばλ／４波長板でレーザーを円偏光にしているが、測定のアプリケーションによっては、直線偏光させる必要がある。その場合には、λ／４波長板の替わりにλ／２波長板を挿入することができる。図１２では表面プラズモン共鳴について開示しているが、分光プリズムを設置した蛍光体分離による物質同定など多くのアプリケーションに適用可能することができる。
【実施例１３】
【００６１】
図１，図３に示すようにターンテーブルの上または下にプリズムや対物レンズを配置するのではなく、ターンテーブルを垂直にして、プリズムや対物レンズをその横に配置することもできる。もちろんターンテーブルの傾斜配置も可能であることはいうまでもない。ターンテーブルを垂直にした場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の装置構成図を図１３に示す。なおターンテーブルは割愛して記載している。測定基板ホルダ１３０１とプリズム１３０３との間にマッチングオイル１３０２が保持されている。レーザー１３０４は測定基板ホルダ１３０１の進行方向と垂直の面で、測定基板１３０５へ照射され、対物レンズ１３０６を通して検出される。マッチングオイル１３０２で、プリズム１３０３から垂れたものは、マッチングオイル溜め容器１３０７で回収される。送液チューブ１３０８を通して、マッチングオイルボトル１３０９からポンプ１３１０を用いて、マッチングオイル１３０２をプリズム１３０３と測定基板１３０５との間に満たす。但しターンテーブルが垂直に配置されているため、プリズム１３０３からマッチングオイル１３０２は垂れやすいため、１３０２ｂ，１３０２ｃを通って１３０２ｄとしてマッチングオイル溜め容器１３０７へ回収される。プリズム１３０３と測定基板１３０５との間に、マッチングオイル１３０２が表面張力で保持されることが望ましいが、そうでない場合にはマッチングオイル溜めへ回収された量を、送液チューブ１３０８を通して、マッチングオイルボトル１３０９からポンプ１３１０を用いて、マッチングオイル１３０２をプリズム１３０３と測定基板１３０５との間に満たす必要がある。図６に示すプリズム構造により、マッチングオイル１３０２がプリズム１３０３のレーザー入射部に付着しないようにすることはいうまでもない。
【実施例１４】
【００６２】
図１４はマッチングオイル溜め付きターンテーブル上視図である。但し図２とは異なり、マッチングオイルがターンテーブルの同心円状に満たされている構造を示している。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ１４０２へアクセスできる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１を中心とした点線は、分注アームまたは基板オートローダアームが回転する軌道を示している。また分注アームは分注チップ装着部１４０３で分注チップを装着して、試薬容器１４０４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部１４０５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１は、それぞれ別々に配置することで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ１４０６でマッチングオイル１４０７を、ターンテーブル１４０８にセットされた測定基板ホルダ１４０９に分注する。この時、多量のマッチングオイル１４０７を分注して、ターンテーブル１４０８の同心円状に満たすことにより、マッチングオイル１４０７の液面が、プリズム１４１３の下面よりも高くなるため、常に気泡が入らない状態でマッチングオイル１４０７をプリズム１４１３と測定基板１４１２との間に満たすことができる。埃がマッチングオイル１４０７に混入した場合、レーザーを乱反射する可能性があるため、マッチングオイルへの埃の混入を防ぐための埃よけカバー１４２１を設置することが好ましい（上視図では省略）。なお埃よけカバー１４２１は図に開示した以外にも様々な形状を取ることができるのは言うまでもない。
【００６３】
マッチングオイル１４０７を分注後にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１４１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ１４１１でターンテーブル１４０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１４１０を回転させたときの測定基板１４１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ１４１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１４０８や測定基板１４１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１４１３と対物レンズ１４１４の位置は固定されている。また測定基板ホルダ１４０９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート１４１５，試薬Ｂポート１４１６を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１を回転させることで、図１４に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ１４０９の中央部や、試薬Ａポート１４１５，試薬Ｂポート１４１６上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ１４１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。その例として、送液チューブ１４１７を通して、水１４１８をポンプ１４１９で対物レンズ１４１４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また１４１８はマッチングオイルなど他の液体にすることができる。なお図１４はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１４１３を図１４から外した構成要素となる。この場合マッチングオイル１４０７は必要ない。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【００６４】
更にターンテーブル１４０８を部分的に温度調節することで、測定基板ホルダ１４０９ａと１４０９ｂを異なる温度に設定できる。温調方式としては、空気温調と局所温調がある。空気温調は加温または冷却装置と温調用の箱を用いて、保温したい箱の空気温度を調節する方法である。温度安定性は高いが、温度到達までの時間が長いこと、６０℃以上の高温は難しいといった課題がある。全反射顕微鏡で空気温調用の箱を用いる場合、スライドガラスを保持する顕微鏡ステージ，プリズム，対物レンズ全てを覆う可能性が高いため、それらの熱膨張の影響が懸念される。特に対物レンズに関しては、高温での使用はメーカーの仕様範囲外であるため、極力室温に保つことが望ましい。また局所温調は加温または冷却装置を温度制御したい部分に直接接触させることで、温度調節する方法である。従って空気温調で懸念されるような対物レンズの熱膨張は発生しない。局所温調は空気温調と比較して温度安定性に劣るものの、温度到達までの時間が短いこと、６０℃以上の高温も制御可能という特徴を持つ。例えば酵素反応と洗浄で温度を変える必要がある場合や、高耐熱性酵素を使用する場合には、空気温調よりも局所温調方式が適している。従って温度調節の方法としては、ターンテーブル１４０８に対してペルチエ，ヒーターを接触させる方法や、ターンテーブル１４０８に電熱線を埋め込んでおく方法，赤外線レーザーなどを用いる方法などが考えられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ターンテーブル押さえ１４１１にヒーターの役割を持たせても良い。これによりプリズム１４１３と対物レンズ１４１４で挟まれた測定基板１４１２を検出している間に、もう一方の測定基板１４１２に、試薬を送液して異なる温度で一定時間反応させた後に、検出を行うバイオアッセイが可能となる。例えばＰＣＲでは一般的に３段階の温度サイクル（例．熱変性：９５℃，ハイブリダイゼーション：５８℃，伸長：７２℃）を経ることで、核酸を２倍にすることができる。従ってターンテーブル１４０８に測定基板ホルダ１４０９を３枚設置して、３段階の温度設定にすることで、ターンテーブル１４０８が１回転するたびに核酸が２倍になるため、その履歴を検出することで初期のＤＮＡ量を計測する定量ＰＣＲが実現できる。またその他にも、実施例に示したようにＤＮＡとプライマーの２本鎖に対して１塩基ずつ蛍光標識塩基を伸長させてＤＮＡシーケンスを行うなど、多くのアプリケーションがある。本発明のアプリケーションはこれらに限定されるものではない。
【符号の説明】
【００６６】
１０１，３０１，４０４，５０４，６０４，８１８，９１８，１２０１，１３０４ レーザー
１０２，３０２，１２０２ λ／４波長板
１０３，３０３，１２０３ 集光レンズ
１０４，２１３，３０４，５０３，６０３，７０３，８１３，９１３，１０１３，１１０６，１２０４，１３０３，１４１３ プリズム
１０５，２１２，３０５，４０５，５０５，６０５，７０４，８１２，１０１２，１１０４，１３０５，１４１２ 測定基板
１０６，２０９，３０６，４０１，５０１，６０１，７０１，８０９，９０９，１００９，１１０３，１２０６，１３０１，１４０９ 測定基板ホルダ
１０７，２０８，３０７，１００８，１１０２，１２０７，１４０８ ターンテーブル
１０８，２１０，３０８，１０１０，１２０８，１４１０ ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸
１０９，２１１，３０９，１０１１，１２０９，１４１１ ターンテーブル押さえ
１１０，２１４，３１０，４０６，５０６，６０６，７０５，８１４，９１４，１０１４，１１０７，１３０６，１４１４ 対物レンズ
１１１，３１１ 対物レンズ用Ｚ軸ステージ
１１２，３１２ フィルタユニット
１１３，３１３ 結像レンズ
１１４，３１４ ＣＣＤ
１１５，３１５，１２１４ 制御用ＰＣ
１１６，３１６，１２１５ モニタ
１１７，２０４，３１７，８０４，９０４，１００４，１２１６，１４０４ 試薬容器
１１８，３１８，１２１７ 分注ユニット
１１９，２１８，３１９，３２２，６０８，９１９，１２１８，１３０８，１４１７ 送液チューブ
１２０，２０７，３２３，４０２，５０２，６０２，７０２，８０７，９０７，１００７，１１０８，１２１２，１３０２，１４０７ マッチングオイル
１２１，２０２，３２１，８０２，９０２，１００２，１２１９，１４０２ 基板オートローダ
２０１，８０１，９０１，１００１，１４０１ 分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸
２０３，８０３，９０３，１００３，１４０３ 分注チップ装着部
２０５，８０５，９０５，１００５，１４０５ 分注チップ廃棄部
２０６，８０６，９０６，１００６，１２１１，１４０６ 分注チップ
２１５，８１５，９１５，１０１５ マッチングオイル拭き
２１６，８１６，９１６，１０１６，１４１５ 試薬Ａポート
２１７，８１７，９１７，１０１７，１４１６ 試薬Ｂポート
２１９，３２０，１４１８ 水
２２０，３２４，６１０，９２１，１３１０，１４１９ ポンプ
３２５，６０７，７０６，９２２，１２１３，１３０７ マッチングオイル溜め容器
４０３ テーパ付きプリズム
４０７ Ｒ付きプリズム
６０９，９２０，１３０９ マッチングオイルボトル
６１１ レーザー入射・反射位置
６１２ くぼみ
７０７ 流路付測定基板ホルダカバー
７０８ 試薬注入排出ポート
８０８，９０８ ＸＹＺステージ付基板設置台
８１０，９１０ テーブル押さえ
１１０５ 測定基板ホルダ押さえ
１２０５ （金薄膜付）測定基板
１２１０ ＳＰＲ検出器
１４２０ 埃よけカバー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定装置および全反射蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
全反射顕微鏡法は、ナノスケールの局所励起を可能とする高ＳＮ比の観察手法である。この手法の最大の特徴は、屈折率の異なる２物質界面での光の全反射に伴い発生するエバネッセント波を用いる点にある。屈折率ｎ１の物質１と屈折率ｎ２の物質２の界面に、屈折率の大きい物質２側から臨界角以上で光が入射するとその界面で光は全反射されるが、界面から屈折率の小さい物質１側に指数関数的に減衰するエバネッセント波が発生する。エバネッセント波は全反射界面から数十〜数百ｎｍ程度の領域に僅かに染み出す光であるため、全反射顕微鏡法においては、蛍光染色した試料とスライドガラスの界面でエバネッセント波を発生させることで、スライド近辺の試料の極一部に限定した高いＳＮ比での蛍光観察が可能となり、１分子観察にも応用できる。
【０００３】
全反射顕微鏡を用いたアプリケーションとしては、細胞生物分野における細胞膜活性や単分子事象の観察が非特許文献１に、電気化学分野におけるコロイド粒子の電気的特性が非特許文献２に記載されている。またブラウン運動の実験的解明が非特許文献３に記載されているなど全反射顕微鏡は多分野で大きく貢献しており、近年では核酸配列解析（ＤＮＡシークエンス）への応用が試みられている。これについて以下詳細に説明する。
【０００４】
現在のＤＮＡシークエンス法は、主にサンガー法と呼ばれるＤＮＡ断片調整法と電気泳動法を組合せたキャピラリーシークエンス方式が用いられており、ヒトゲノム解析等に用いられて大きな成果をあげている。しかしながらテーラーメイド医療などの観点から個人のゲノム解析を考えたとき、キャピラリーシークエンスで一度に解析できるＤＮＡ断片の長さよりもはるかに長い断片を、迅速・簡便・安価に解析できる技術が強く求められている。従来のヒトゲノム解析では一人のヒトゲノムを解読するのに約１０００万ドルが必要であったが、将来は１００００分の１の１０００ドルでヒトゲノム解析を行うことでシークエンスの医療分野への応用が飛躍的に進むと期待されており、従来のキャピラリー法の改良のみではこれらの要求に応えることは不可能である。究極的には解読したい核酸をＰＣＲなどの核酸増幅を行うことなく、単一分子レベルでシークエンスできれば、核酸増幅が無い分、試薬代が安価であり、迅速・簡便なシークエンスが可能となる。単一分子レベルでの検出を可能とする方法が全反射顕微鏡法である。更に単一分子シークエンスでは、核酸増幅に起因する増幅効率の差が無いため、従来法と比較して細胞中で発現しているｍＲＮＡなどの個数をより高精度に定量することが可能となる。従って新たな方式に基づく単一分子ＤＮＡシークエンスが待望されている。
【０００５】
現在、光技術を用いた超並列解析法が提唱されており、既に数社から化学発光や蛍光の原理に基づく装置が市販されている。これらの方法の特徴は、マイクロビーズや微細加工技術を用いて反応場を区分けすることで、超並列解析を可能にしたことである。従来のキャピラリーシークエンス方式では、多チャンネル化（〜３８４本）によって解析効率の向上が図られているが、光技術を用いた超並列解析法では１億個以上の超並列解析も可能であり、キャピラリーシークエンス方式と比較して圧倒的に多い。従って読み取り塩基長では１００塩基以下と１０００塩基近い解読が可能なキャピラリーシークエンスに劣るものの、スループットとしては例えば１００塩基×１億個（１０８）で１日当たり１０ギガ（１０１０）塩基となり、キャピラリー方式と比較して１０００倍以上のスループットが達成できている。また超並列解析により１サンプル当たりの試薬量は少なくなるため、結果的に試薬コストの低下に繋がる。従って解析コストは現状ヒトゲノム一人当たり約１０万ドルとキャピラリーシークエンス方式の約１００分の１から１０００分の１となっている。但しこれらの方式の場合、解読したい核酸を核酸増幅してシークエンスしているため、これ以上の解析コスト低減は難しい。
【０００６】
更なる解析コスト低減を達成するために、光技術を用いた超並列解析法による単一分子ＤＮＡシークエンスする方法が非特許文献４で提唱されている。この方法では全反射顕微鏡が用いられている。また前記文献よりも更にハイスループットな単一分子ＤＮＡシークエンスの方法として、リアルタイムでの単一分子シーケンスが非特許文献５で報告されており、全反射顕微鏡が使用されている。従来のＤＮＡシークエンスの多くは、酵素としてＤＮＡポリメラーゼを利用しているが、前記文献のように伸長反応とシークエンスを一塩基ごとに行う方法では、酵素に備わっている連続的に塩基を取り込む能力を無駄にしている。ＤＮＡポリメラーゼ１分子が塩基を取り込む能力は、１秒に約１０００塩基で、１０万塩基以上の長さにわたって読み取ることができ、更に取り込む塩基の正確性も非常に高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−０８３８００号公報
【特許文献２】特開２００７−０８５９１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Alelrod, D. et al vol.2, pp. 764-774, (2001)
【非特許文献２】Prieve, D. C. and Frej, N. A., Langmuir, 6, pp. 396-403
【非特許文献３】Kihm, K. D. et al., in Fluids, 37, pp.811-824, (2004)
【非特許文献４】PNAS 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964
【非特許文献５】PNAS 105(4): 1176-1181. (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したリアルタイムでの単一分子シークエンスで想定されるプロトコルは以下の通りである。酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーをチューブに入れて、複合体を形成する。酵素活性の低下を防ぐために４℃で行うのが一般的である。次に酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーの複合体を基板に送液して、複合体を基板に固定する。この時も酵素活性の低下を防ぐために４℃で行うのが一般的である。次に酵素，鋳型ＤＮＡ，プライマーの複合体が固定された基板を顕微鏡に設置し、焦点をあわせてから顕微鏡撮影を開始する。次に蛍光標識されたｄＮＴＰを流して塩基の伸長反応を開始する。３７℃で酵素活性が最大となる酵素を用いるのが一般的であるため、３７℃に温度調節しながら行う。蛍光標識されたｄＮＴＰの蛍光標識部位は、塩基ではなく、末端のリン酸にホスホリンクヌクレオチドをつけることで、酵素が塩基を取り込む過程で蛍光色素を切り離す仕組みである。従って連続的に伸長反応が進むため、１回のシークエンスが終了するまでは視野を固定する必要がある。１視野あたりに要するシークエンス時間は、酵素活性が失われるまでの時間から０〜６０分程度と想定される。測定が終了したら、視野を塩基の伸長反応が起こっていない別の場所へ移動する。視野移動後に、蛍光標識されたｄＮＴＰを流して塩基の伸長反応を開始し、再びリアルタイムでのシークエンスを行う。従って視野ごとに送液を制御する必要がある。この操作を１基板あたりに存在する視野数分行う。１基板あたり１視野の場合には、１回の測定が終わったら、次の基板をセットする。但し酵素は基板上へ固定された直後から活性の低下がはじまるため、リアルタイム反応の計測可能時間は、測定最初の視野では長いが、測定終了の視野に近づくにつれて短くなる傾向がある。視野ごとの送液制御やリアルタイム反応時間を極力長くするためには、１基板を１視野としてもよい。
【００１０】
１基板に存在する全ての視野を検出し終わったら、基板を外して、新しい基板をセットする。プリズム型エバネッセント顕微鏡で基板交換を行う時には、プリズムと対物レンズの位置を基板から離して基板の着脱を行う。その後新しい基板を設置して、プリズムと基板との間にマッチングオイルを満たしてから、対物レンズを近づけて焦点を合わせる。但しマッチングオイル中に気泡が入ることでレーザーが気泡で乱反射して検出できなくなる危険性があることや、時間を要する焦点合わせの間は基板の測定ができないことから、スループットが低下するのが課題である。プリズムと対物レンズの位置を固定したまま、基板のみを引き抜くこともできるが、プリズムと対物レンズの距離は一般的に数mmしかないため、基板を引き抜いた際にプリズムと基板の間のマッチングオイルが対物レンズに接触してしまう。この場合、対物レンズ上に付着したマッチングオイルを拭き取らないと、次の基板の測定を行うことができないため、装置の自動化の障壁となっている。従って対物型／プリズム型全反射顕微鏡装置や、マッチングを必要とする表面プラズモン共鳴測定装置などの装置において、マッチングオイルなどの液体を気泡が発生することなく自動で充填することと、焦点合わせ時間が少ない基板の交換が、装置自動化への大きな課題である。
【００１１】
なお、特許文献１に欠陥検査方法及び欠陥検査装置が開示されているが、液浸する面はウエハ上面であり、ウエハ下面を液浸した場合、検出系に液体が付着し、検出できない。また、１枚のウエハを検査し終えると、液浸部を除去して、乾燥させてから次のウエハを入れる。従ってウエハを乾燥・交換する間は検査を行うことができない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題に対して鋭意検討した結果、マッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板を、プリズムなどマッチングさせたい対象物へスライドさせることで、気泡が発生することなくマッチングすることができ、本発明を完成するに至った。より具体的には、マッチングオイルなどの液体を滴下した測定対象基板をターンテーブルなどの台に設置して、プリズムなどのマッチング対象物に対してスライドさせて、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化測定装置に関する。
【発明の効果】
【００１３】
全反射顕微鏡や表面プラズモン共鳴装置などで行う液体のマッチング工程を自動化することで、測定対象基板の設置，試薬分注，液体のマッチング，温度調節，反応，検出，測定対象基板交換の一連の工程を完全自動化できるため、装置のスループットが向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図（プリズム上）。
【図２】ターンテーブル上視図（プリズム上）。
【図３】プリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図（プリズム下）。
【図４】プリズム形状と動作機構図（プリズム上）。
【図５】プリズム形状と動作機構図（プリズム上）。
【図６】プリズム形状と動作機構図（プリズム下）。
【図７】フローセル図。
【図８】プリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図（プリズム上）。
【図９】プリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図（プリズム下）。
【図１０】ターンテーブル上視図（プリズム下）。
【図１１】ターンテーブルへの測定基板設置図（プリズム上）。
【図１２】表面プラズモン共鳴の装置構成図（プリズム下）。
【図１３】プリズム型エバネッセント顕微鏡の装置構成図（プリズム横）。
【図１４】マッチングオイル溜め付きターンテーブル上視図（プリズム上）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記の課題に対して鋭意検討した結果、マッチングオイルを滴下した測定対象基板を、気泡が発生しにくい構造のプリズムへスライドさせることで、気泡が発生することなくマッチングする。より具体的には、マッチングオイルを滴下した測定対象基板をターンテーブルに設置して、マッチングオイルをプリズムと測定対象基板との間に容易に入り込ませるためのテーパや曲面を有するプリズムに対して回転させて、マッチングオイルにプリズムが接触する近傍でターンテーブルの回転速度を遅くすることで、気泡の発生が無いマッチングを行うことを特徴とする自動化装置に関する。
【００１６】
本発明は、前述したリアルタイムでの単一分子シークエンスだけではなく、１塩基ずつ塩基を伸長させてシークエンスを行う方法（逐次方式）に適用可能である。顕微鏡を用いて検出するプロトコル全般にも適用できることは、以下の実施例から容易類推可能である。逐次方式とリアルタイム方式で想定されるプロトコルの例を以下に示す。
【００１７】
全反射顕微鏡を用いた逐次方式として、レーザー波長５３２ｎｍおよび６３５ｎｍを用い、それぞれ蛍光体Ｃｙ３および蛍光体Ｃｙ５の蛍光検出に用いる。試料溶液を２枚のスライドガラス間に挟んでから、スライドガラスと試料溶液との屈折率境界平面上の溶液層側に、単一の標的ＤＮＡ分子をビオチン−アビジン結合を利用して固定化する。次に溶液中にＣｙ３標識したプライマーを溶液交換によって一定濃度になるように導入すると、単一のＣｙ３標識プライマー分子が標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズして、核酸二本鎖を形成する。その後洗浄操作により未反応のＣｙ３標識プライマー分子を除く。標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＣｙ３標識プライマー分子はエバネッセント場の特定の位置に存在するため、標的ＤＮＡ分子の結合位置を蛍光検出によって確認することができる。標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズするＣｙ３標識プライマー分子が、エバネッセントの１視野内に複数存在する場合は、Ｃｙ３標識プライマー分子の位置を全て把握しておくことで、以降のシークエンスを並列的に行うことができる。更に標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズするＣｙ３標識プライマー分子が、エバネッセントの１視野内に複数存在し、かつ複数視野に跨って存在する場合には、スライドガラスを保持しているステージを動かすことにより、視野を移動させながらＣｙ３標識プライマー分子の位置を全て把握しておくことで、以降のシークエンスを超並列的に行うことができる。配列解析のスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野を大きくしたほうが良い。またステージの移動速度を上げて、蛍光観察できない視野間の移動時間を短くしたほうが良い。全てのプライマー分子の位置を確認後、Ｃｙ３を高出力の励起光で一定時間照射することによって蛍光退色（消光）させることで、以降の蛍光発光を抑制する。これは次工程以降でＣｙ３を用いる際に、前工程のＣｙ３が検出されてしまうことを防ぐのが目的である。次工程以降でＣｙ３と異なる蛍光色素を用いる場合には、必ずしも消光しなくてよいが、Ｃｙ３の蛍光波長領域が他の蛍光色素の蛍光波長領域とオーバーラップする可能性もあるため、極力消光しておくことが望ましい。次に二本鎖核酸に塩基を付加する酵素と、Ｃｙ５で蛍光標識したｄＮＴＰ（ＮはＡ（アデニン），Ｃ（シトシン），Ｇ（グアニン），Ｔ（チミン）のうちの１種類）を含む溶液を、溶液交換によって一定濃度になるように導入する。標的ＤＮＡ分子に対して相補鎖の関係（ＡとＴ，ＣとＧ）である場合に限り、蛍光標識したＣｙ５−ｄＮＴＰ分子が二本鎖核酸のうちのプライマー分子の伸長鎖に取り込まれる。通常Ｃｙ５で蛍光標識したｄＮＴＰがプライマー分子の伸長鎖に取り込まれると、酵素は次の塩基を取り込もうとするが、例えばＣｙ５−ｄＮＴＰ分子の塩基の部分に特定の分子を結合させておくことにより、２塩基以上は連続して取り込まないような仕組みになっている。その後洗浄操作により、未反応のＣｙ５−ｄＮＴＰ分子を除く。伸長鎖に取り込まれたＣｙ５−ｄＮＴＰは、エバネッセント場の特定の位置に存在するため、蛍光検出によってＣｙ５−ｄＮＴＰの結合位置を確認することができる。更にＣｙ５−ｄＮＴＰの結合位置と、前記標的ＤＮＡ分子の結合位置が一致する箇所を特定することにより、エバネッセント場の特定位置に固定された標的ＤＮＡ分子の配列を解読することができる。プライマー分子の伸長鎖に取り込まれるＣｙ５−ｄＮＴＰが、エバネッセントの１視野内に複数存在する場合は、結合したＣｙ５−ｄＮＴＰの位置を全て把握しておくことで、標的ＤＮＡ分子の配列を並列的に解読することができる。
【００１８】
またプライマー分子の伸長鎖に取り込まれるＣｙ５−ｄＮＴＰが、エバネッセントの１視野内に複数存在し、かつ複数視野に跨って存在する場合には、スライドガラスを保持しているステージを動かすことにより、視野を移動させながらＣｙ５−ｄＮＴＰの位置を全て把握しておくことで、標的ＤＮＡ分子の配列を超並列的に解読することができる。配列解析のスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野を大きくしたほうが良い。またステージの移動速度を上げて、蛍光観察できない視野間の移動時間を短くしたほうが良い。全てのＣｙ５−ｄＮＴＰの配列（１塩基）を確認後、Ｃｙ５を高出力の励起光で一定時間照射することによって蛍光退色（消光）させることで、以降の蛍光発光を抑制する。次工程以降でＣｙ５と異なる蛍光色素を用いる場合には、必ずしも消光しなくてよいが、Ｃｙ５の蛍光波長領域が他の蛍光色素の蛍光波長領域とオーバーラップする可能性もあるため、極力消光しておくことが望ましい。Ｃｙ５消光後、２塩基以上連続して取り込まないようにＣｙ５−ｄＮＴＰ分子に結合させた特定の分子を、触媒や光解離などの手段を用いて切り離す。これで次の塩基を伸長させることができる。以上のＣｙ５−ｄＮＴＰの伸長反応プロセスを、例えばｄＡＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＧＴＰ→ｄＴＴＰ→ｄＡＴＰのように４種類の塩基を順番に繰り返して行うことにより、固定された標的ＤＮＡ分子の塩基配列を決定することが可能である。ｄＮＴＰの伸長反応プロセスを超並列処理することによって、複数のターゲットＤＮＡ分子を超並列的にシークエンスできるのである。この単一分子シークエンスの原理はＣｙ３，Ｃｙ５の２色の蛍光色素を例に挙げて説明したが、これら２つの色素に限定されるものではなく、他の蛍光色素や方法で実現可能である。例えば４種類の異なる蛍光色素でｄＮＴＰをそれぞれ標識することにより、前記に示したｄＡＴＰ→ｄＣＴＰ→ｄＧＴＰ→ｄＴＴＰ→ｄＡＴＰの４種類の塩基を順番に繰り返して伸長反応させる必要がなくなるため、スループットは単純計算で４倍速くなる。またプライマー分子とｄＮＴＰを全て同じ蛍光色素（１色）で標識することもできる。
【００１９】
次に全反射顕微鏡を用いたリアルタイム方式の例を示す。従来のＤＮＡシークエンスの多くは、酵素としてＤＮＡポリメラーゼを利用しているが、逐次方式では、酵素に備わっている連続的に塩基を取り込む能力を無駄にしている。ＤＮＡポリメラーゼ１分子が塩基を取り込む能力は、１秒に約１０００塩基で、１０万塩基以上の長さにわたって読み取ることができ、更に取り込む塩基の正確性も非常に高い。そこで２つの技術を用いて、核酸を連続的に伸長させながらリアルタイムでシークエンスしている。１つ目の技術は、蛍光標識を塩基ではなく、末端のリン酸にホスホリンクヌクレオチドをつけることで、酵素が塩基を取り込む過程で蛍光色素を切り離す仕組みである。これにより塩基を取り込んだ後には、完全に自然な二本鎖ＤＮＡが残る。酵素が塩基を取り込む時の塩基に対応した蛍光を、リアルタイムに検出することで、連続的なシークエンスが可能である。但し４種類の塩基はそれぞれ異なる蛍光標識をしておく必要がある。なお酵素が取り込むまでの一定時間のみ、蛍光色素はエバネッセント場の特定の場所に存在するため、この時の位置を把握することでシークエンスできる。なお２つ目の技術により、蛍光色素が切り離された後は、蛍光色素はブラウン運動で溶液中を漂うことになるため、シークエンスへの影響はない。また伸長反応とシークエンスを一塩基ごとに行う方法のように、高出力のレーザーを照射して蛍光色素を消光する工程も必要ない。２つ目の技術は、単一分子検出を可能にしたゼロモード導波技術である。これによりナノメートルサイズの穴内部の蛍光色素のみを測定できるため、塩基から切り離された蛍光色素や、伸長反応に寄与していない未反応の蛍光標識塩基を洗浄操作により除去すること無く測定できる。これらの技術によりリアルタイムＤＮＡシークエンスの実現性が示唆されている。
【００２０】
リアルタイムでの単一分子シークエンスにおいては、連続的に伸長反応が進むため、１回のシークエンスが終了するまでは、通常視野を固定する必要がある。従ってスループットを上げるためには、顕微鏡を低倍率にして視野をできるだけ大きくすることが有効である。但し対物レンズ型全反射顕微鏡を使用している場合には、６０倍以上の高倍率検出に制限される。従って視野は狭くなる。以下に単一分子シークケンスなどに利用されている全反射顕微鏡として、２種類説明する。全反射顕微鏡で現在一般的に用いられているのは、対物レンズ型全反射顕微鏡である。倒立型にして対物レンズをスライドガラスの下方に油浸オイルを介して位置を決め、その対物レンズを経てエバネッセント波発生用のレーザー光をスライドガラス下方から斜めに入射させ、スライドガラス上の試料が置かれた界面近傍にエバネッセント波を発生させる。この配置の場合、対物レンズ上方（スライドガラス上方）の空間が自由に扱えるため操作性と利便性に優れており、かつ非常に明るい蛍光画像が得られるのが特徴である。しかし高開口数油浸対物レンズを用いるという原理上の制約により、倍率が６０倍以上の高倍率観察に制限されるのが欠点である。高倍率観察に制限されないもう１種類の全反射顕微鏡として、プリズムを介してレーザーを入射するプリズム型全反射顕微鏡が使用されている。この顕微鏡では、試料を２枚のスライドガラス間、またはスライドガラスとカバーガラス間などに挟み、上方のスライドガラス上にプリズムを載せて、そのプリズムを経てエバネッセント波発生用のレーザー光を上方のスライドガラスの上方に斜めに入射させ、そのスライドガラスの試料と接する界面近傍にエバネッセント波を発生させる。この配置の場合、レーザー光を効率的に入射できることから、対物レンズ型よりも更に高いＳ／Ｎ比での観察が可能である。また対物レンズ型全反射顕微鏡とは異なり、高開口数油浸対物レンズを使用する必要は無く、空浸，水浸型の対物レンズを使用できる。
【００２１】
従って倍率の制約がないため低倍率観察も容易である。低倍率観察により１視野は大きくなるため、例えば非特許文献５におけるスループットは向上する。ゆえに対物レンズ型よりもプリズム型全反射顕微鏡の方が、スループット向上の観点からは適していると言える。但しプリズム型全反射顕微鏡では、対物レンズ上方の空間がプリズムで塞がれてしまうため、試料の操作性や標本の自由度が著しく低いのが欠点である。試料の操作性と標本の自由度に優れ、他の光学観察手法との併用が容易でかつ低倍率観察を可能とするプリズム型全反射顕微鏡システムの開発が期待されている。ＤＮＡシークエンスのスループット向上のためには、一度に検出できる視野を広くすることが重要である。対物レンズ型全反射顕微鏡では倍率６０倍以上の高倍率観察に限定されるが、プリズム型エバネッセント方式では倍率の制約が無いため、低倍率観察することによりスループットは向上する。例えば４０倍の対物レンズの視野は６０倍の対物レンズのそれと比較して２倍以上である。従って、プリズム型全反射顕微鏡を採用した場合、スループットは２倍以上向上すると期待される。
【００２２】
またスループット向上のためには、酵素の反応速度を上げることも重要である。酵素の反応速度を上げる方法としては、基質濃度を高くすること、至適ｐＨにすることの他に、酵素の至適温度にすることが考えられる。この中で基質濃度とｐＨに関しては、溶液中の組成を変えることで実現できる。但し酵素の至適温度（反応温度）の管理に関しては、温度調節を行う装置が別途必要となる。酵素の反応速度は温度とともに上昇するが、酵素はタンパク質であるために高温では変性する。従って酵素活性は逆に低下する。一般的に動物の酵素では４０〜５０℃、植物の酵素では５０〜６０℃である。但し好熱性細菌のように８０〜９０℃（超高熱菌には９０℃以上）のものもある。以上より、温度制御機能付きのプリズム型全反射顕微鏡を用いることで、装置としてのスループットを最大にできる。以下に実施例の詳細を記載する。
【実施例１】
【００２３】
上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参照しながら説明する。なお図面は説明のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。プリズム型エバネッセント方式の顕微鏡ステージであるターンテーブルへの基板設置，試薬分注，温度調節，マッチングオイル分注，基板上での反応，顕微鏡検出を全自動かつ連続的に行うことで、本発明を完成するに至った。本発明の構成を図１で説明する。図１はプリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図である。レーザー１０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板１０２で円偏光となり、集光レンズ１０３を通した後に、プリズム１０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７が一般的に用いられる。
【００２４】
レーザービームは、測定基板１０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板１０５ｂと溶液（測定基板１０５ｂの下面に接する溶液。実施例７参照。全ての実施例において、マッチング対象物とは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えることができる。）の界面に対して、入射角度約６８°（溶液：水）で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。測定基板１０５ｂの種類としては、石英基板，基板に金属膜などを塗布した金薄膜基板，基板に化学修飾を施して官能基を導入した基板，基板に半導体プロセスで構造体を作製した基板，微粒子や異物などを固定化した基板の他、上述の基板に対して核酸，タンパク質，抗原，抗体，低分子，アプタマー、またはそれに類する生体分子などを結合した基板が使用できるが、これらに限定されるものではない。なお図１では測定基板１０５ａ，１０５ｂは測定基板ホルダ１０６ｂに固定された状態でターンテーブル１０７にセットされている。測定基板１０５と測定基板ホルダ１０６ｂを高い平行度で固定することで、ターンテーブル１０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板１０５ａ，１０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ１０６を介さずに直接ターンテーブル１０７上に設置することもできる。なおプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル１２０ｂで充填することで、レーザービームがプリズム１０４と測定基板１０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ１０６は無いため、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にはマッチングオイル１２０ｂしか存在しない。プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル１２０ｂをプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に保持できなくなるため、３mm以下とすることが望ましい。距離が離れて少しでもプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を回転させることで、ターンテーブル１０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。更にターンテーブル押さえ１０９ａ，１０９ｂを用いてターンテーブル１０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を回転させたときの測定基板１０５ｂの高さを常に一定することができる。ターンテーブル押さえ１０９ａ，１０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１０７や測定基板１０５ａ，１０５ｂを押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１０４と対物レンズ１１０の位置は固定されている。
【００２５】
エバネッセント場では、励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、５０〜１５０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／ｅ（ｅは自然対数）になる。落射蛍光検出と比較して、励起光照射体積が大幅に低減できるため、溶液中に浮遊している遊離蛍光体の蛍光発光や、水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。エバネッセント波による蛍光は、対物レンズ用Ｚ軸ステージ１１１で焦点を合わせた対物レンズ１１０から、フィルタユニット１１２を通して不要な波長成分を除去した後に、結像レンズ１１３を経て２次元検出器であるＣＣＤ１１４上に結像する。結像した信号は制御用ＰＣ１１５で処理され、結果がモニタ１１６に表示される。また試薬容器１１７から分注ユニット１１８で吸引した試薬を、送液チューブ１１９を通して測定基板１０５ａに送液する。対物レンズ１１０は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの場合は気泡の混入が、主に水浸レンズの場合は水の蒸発があることから、これを防止する機構が必要となる。
【００２６】
測定基板１０５ａを検出するまでの手順を示す。まず送液チューブ１１９から測定基板１０５ａ上へマッチングオイル１２０ａを滴下する。送液チューブ１１９はあくまでもマッチングオイル１２０ａを滴下する機構の一例である。マッチングオイルの量は５〜５０μＬが好ましいが、プリズム１０４のマッチングオイル１０５ａが満たされる部分の面積，プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの距離により決定される。従ってこの量に制約されるものではない。マッチングオイル１２０ａの液高さが、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ａが接触して、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にマッチングオイル１２０ａを満たすことができる。マッチングオイル１２０ａの液高さが、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ａが接触しないため、プリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間にマッチングオイル１２０ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１０７を１８０°回転させる。この際にマッチングオイル１２０ａはプリズム１０４と測定基板１０５ｂとの間に侵入する。ターンテーブル１０７を回転させると、プリズム１０４とマッチングオイル１２０ｂは接触しているため、マッチングオイル１２０ｂは、その粘性によりターンテーブル１０７の回転方向に伸長した形状となる。従って送液チューブ１１９からマッチングオイル１２０ａを滴下する位置は、測定基板１０５ａ上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を中心とした対物レンズ１１０の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム１０４と測定基板１０５ｂの中央部にマッチングオイル１２０ｂを満たすことができる。
【００２７】
またマッチングオイル１２０ａがプリズム１０４に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム１０４と測定基板１０５ｂの中央部にマッチングオイル１２０ｂを満たすことができる。測定基板１０５ｂの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０８を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。更に必要であれば、対物レンズ用Ｚ軸ステージ１１１で対物レンズ１１０を上下させて焦点を合わせるか、プリズム１０４の位置を上下させる。測定が終わった測定基板１０５ｂは、ターンテーブル回転軸１０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ１２１を用いて、基板ホルダ１０６ａの取り外しと、新しい基板ホルダ１０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。なお図１はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子蛍光検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１０４を図１から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例２】
【００２８】
図２は図１のターンテーブル上視図である。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ２０２へアクセスできる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１を中心とした点線は、分注アームまたは基板オートローダアームが回転する軌道を示している。また分注アームは分注チップ装着部２０３で分注チップを装着して、試薬容器２０４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部２０５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１は、それぞれ別々に配置することで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ２０６でマッチングオイル２０７を、ターンテーブル２０８にセットされた測定基板ホルダ２０９に分注する。その後ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ２１１でターンテーブル２０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を回転させたときの測定基板２１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ２１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル２０８や測定基板２１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム２１３と対物レンズ２１４の位置は固定されている。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させる際に、マッチングオイル２０７はプリズム２１３と測定基板２１２との間に侵入する。ターンテーブル２０８を回転させると、プリズム２１３とマッチングオイル２０７は接触しているため、マッチングオイル２０７は、その粘性によりターンテーブル２０８の回転方向に伸長した形状となる。従って分注チップ２０６からマッチングオイル２０７を滴下する位置は、測定基板２１２上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を中心とした対物レンズ２１４の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム２１３と測定基板２１２の間で、対物レンズ２１４の中心位置にマッチングオイル２０７を満たすことができる。またマッチングオイル２０７がプリズム２１３に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム２１３と測定基板２１２の間で、対物レンズ２１４の中心位置にマッチングオイル２０７を満たすことができる。測定基板２１２の高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。測定が終わった測定基板ホルダ２０９ｂは、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を１８０°回転させることで、測定基板ホルダ２０９ａの位置へ移動させる。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１の基板オートローダアームが測定基板ホルダ２０９ａをターンテーブル２０８から外して、未測定の測定基板ホルダ２０９ａを設置する。以上のプロセスを連続して全自動で行う。
【００２９】
但し測定する基板数が増えるにつれて、ターンテーブル２０８上にはマッチングオイル２０７が溜まっていく。これはプリズム２１３に残ったマッチングオイル２０７が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転に伴い、測定基板ホルダ２０９以外のターンテーブル２０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き２１５をターンテーブル２０８に設置することができる。マッチングオイル拭き２１５の高さは、マッチングオイル２０７の付着しているプリズム２１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転に伴い、マッチングオイル拭き２１５がマッチングオイル２０７の付着しているプリズム２１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル２０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き２１５がプリズム２１３を通過後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０を反対方向に回転させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル２０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ２０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル２０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル２０７の量を一定に保つことができる。図２の実施例では、測定基板ホルダ２０９とマッチングオイル拭き２１５の位置が９０°ずれているため、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸２１０の回転により、測定基板ホルダ２０９とマッチングオイル拭き２１５との間のターンテーブル２０８の領域に、マッチングオイル２０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き２１５を測定基板ホルダ２０９の近く、もしくは測定基板ホルダ２０９上に配置することで、マッチングオイル２０７が、ターンテーブル２０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き２１５としては、プリズム２１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き２１５はターンテーブル２０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル２０７のターンテーブル２０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き２１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き２１５はターンテーブルに設置されている必要は無く、ターンテーブル押さえ２１１の構成要素として、ターンテーブル２０８とは独立に設置してもよい。また測定基板ホルダ２０９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート２１６，試薬Ｂポート２１７を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸２０１を回転させることで、図２に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ２０９の中央部や、試薬Ａポート２１６，試薬Ｂポート２１７上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ２１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。その例として、送液チューブ２１８を通して、水２１９をポンプ２２０で対物レンズ２１４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また２１９はマッチングオイルなど他の液体にすることができる。なお図２はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム２１３を図２から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【００３０】
更にターンテーブル２０８を部分的に温度調節することで、測定基板ホルダ２０９ａと２０９ｂを異なる温度に設定できる。温調方式としては、空気温調と局所温調がある。空気温調は加温または冷却装置と温調用の箱を用いて、保温したい箱の空気温度を調節する方法である。温度安定性は高いが、温度到達までの時間が長いこと、６０℃以上の高温は難しいといった課題がある。全反射顕微鏡で空気温調用の箱を用いる場合、スライドガラスを保持する顕微鏡ステージ，プリズム，対物レンズ全てを覆う可能性が高いため、それらの熱膨張の影響が懸念される。特に対物レンズに関しては、高温での使用はメーカーの仕様範囲外であるため、極力室温に保つことが望ましい。また局所温調は加温または冷却装置を温度制御したい部分に直接接触させることで、温度調節する方法である。従って空気温調で懸念されるような対物レンズの熱膨張は発生しない。局所温調は空気温調と比較して温度安定性に劣るものの、温度到達までの時間が短いこと、６０℃以上の高温も制御可能という特徴を持つ。例えば酵素反応と洗浄で温度を変える必要がある場合や、高耐熱性酵素を使用する場合には、空気温調よりも局所温調方式が適している。従って温度調節の方法としては、ターンテーブル２０８に対してペルチエ，ヒーターを接触させる方法や、ターンテーブル２０８に電熱線を埋め込んでおく方法，赤外線レーザーなどを用いる方法などが考えられるが、これらに限定されるものではない。ターンテーブル押さえ２１１にヒーターの役割を持たせても良い。これによりプリズム２１３と対物レンズ２１４で挟まれた測定基板２１２を検出している間に、もう一方の測定基板２１２に、試薬を送液して異なる温度で一定時間反応させた後に、検出を行うバイオアッセイが可能となる。例えばＰＣＲでは一般的に３段階の温度サイクル（例．熱変性：９５℃，ハイブリダイゼーション：５８℃，伸長：７２℃）を経ることで、核酸を２倍にすることができる。従ってターンテーブル２０８に測定基板ホルダ２０９を３枚設置して、３段階の温度設定にすることで、ターンテーブル２０８が１回転するたびに核酸が２倍になるため、その履歴を検出することで初期のＤＮＡ量を計測する定量ＰＣＲが実現できる。またその他にも、実施例に示したようにＤＮＡとプライマーの２本鎖に対して１塩基ずつ蛍光標識塩基を伸長させてＤＮＡシーケンスを行うなど、多くのアプリケーションがある。本発明のアプリケーションはこれらに限定されるものではない。
【実施例３】
【００３１】
図３はプリズム型エバネッセント顕微鏡のターンテーブル図である。従って図３では、図１に示すマッチングオイル１２０が、測定基板１０５の下側にあり、対物レンズ１１０は水浸用対物レンズであるとして説明するが、これに限定されるものではない。レーザー３０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板３０２で円偏光となり、集光レンズ３０３を通した後に、プリズム３０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７が一般的に用いられる。レーザービームは、測定基板３０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板３０５ｂと溶液（測定基板３０５ｂの上面に接する溶液）の界面に対して、入射角度約６８°（溶液：水）で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。なお図３では測定基板３０５ａ，３０５ｂは測定基板ホルダ３０６ｂに固定された状態でターンテーブル３０７にセットされている。測定基板３０５と測定基板ホルダ３０６ｂを高い平行度で固定することで、ターンテーブル３０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板３０５ａ，３０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ３０６を介さずに直接ターンテーブル３０７上に設置することもできる。なおプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル３２０ｂで充填することで、レーザービームがプリズム３０４と測定基板３０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ３０６は無いため、プリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間にはマッチングオイルしか存在しない。プリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル３２０ｂをプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間に保持できなくなる。距離が離れて少しでもプリズム３０４と測定基板３０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を回転させることで、ターンテーブル３０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。
【００３２】
更にターンテーブル押さえ３０９ａ，３０９ｂを用いてターンテーブル３０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を回転させたときの測定基板３０５ｂの高さを常に一定することができる。ターンテーブル押さえ３０９ａ，３０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル３０７や測定基板３０５ａ，３０５ｂを押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム３０４と対物レンズ３１０の位置は固定されている。エバネッセント場では、励起光強度が屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、５０〜１５０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／ｅ（ｅは自然対数）になる。落射蛍光検出と比較して、励起光照射体積が大幅に低減できるため、溶液中に浮遊している遊離蛍光体の蛍光発光や、水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。エバネッセント波による蛍光は、対物レンズ用Ｚ軸ステージ３１１で焦点を合わせた対物レンズ３１０から、フィルタユニット３１２を通して不要な波長成分を除去した後に、結像レンズ３１３を経て２次元検出器であるＣＣＤ３１４上に結像する。結像した信号は制御用ＰＣ３１５で処理され、結果がモニタ３１６に表示される。また試薬容器３１７から分注ユニット３１８で吸引した試薬を、送液チューブ３１９を通して測定基板３０５ａに送液する。対物レンズ３１０は水浸用対物レンズを用いた例を示すが、空浸，油浸レンズの使用も可能であり、限定されるものではない。液体を用いた対物レンズ３１０を用いる際には、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。
【００３３】
測定基板３０５ａを検出するまでの手順を示す。まず送液チューブ３１９から測定基板３０５ａ上へ対物レンズ用の水３２０ａを滴下する。水の量は蒸発を防ぐために５０μＬ以上であることが好ましい。この量は測定基板３０５の測定時間，水の蒸発時間，測定温度などの影響で決定される。水３２０ａの液高さが、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、対物レンズ３１０と水３２０ａが接触して、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に水３２０ａを満たすことができる。水３２０ａの液高さが、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、対物レンズ３１０と水３２０ａが接触しないため、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に水３２０ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル３０７を１８０°回転させる。この際に水３２０ａは対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に入り込む。図１に示すマッチングオイル１２０とは異なり、水の場合には、対物レンズ３１０と測定基板３０５ｂとの間に気泡が入ることは無い。測定基板３０５ｂの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸３０８を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。更に必要であれば、対物レンズ用Ｚ軸ステージ３１１で対物レンズ３１０を上下させるか、プリズム３０４を上下させる。
【００３４】
測定が終わった測定基板３０５ｂは、ターンテーブル回転軸３０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル３０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ３２１を用いて、基板ホルダ３０６ａの取り外しと、新しい基板ホルダ３０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。プリズム３０４と測定基板３０５との間のマッチングオイルに関しては、送液チューブ３２２を通して、マッチングオイル３２３をポンプ３２４でプリズム３０４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また３２３は他の液体にすることができる。また図２に示すマッチングオイル拭き２１５に相当するものをターンテーブル３０７の下面に設置することもできる。またマッチングオイル溜め容器３２５で、プリズム３０４からこぼれたマッチングオイルを回収する。なお図３はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム３０４を図１から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例４】
【００３５】
マッチングオイルと接液するプリズム面が、ターンテーブルの回転面に対して垂直である場合、プリズムと測定基板との間に気泡が混入したり、測定視野中央部にマッチングオイルが入らないことある。この場合、マッチングオイルがプリズムに接触してから時間を置くことで、マッチングオイルを広がらせ、再度ターンテーブルを回転させることで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができる。但しこの方法では時間がかかること、多量のマッチングオイルを使用すること、必ずしも気泡の混入が防げないといった課題がある。そこで筆者らが鋭意検討した結果、マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、プリズムでマッチングオイルが遮断された場合でも、ターンテーブルの回転力に伴うマッチングオイルの慣性力が、マッチングオイルとプリズムとの間に発生する摩擦力に打ち勝って、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルが引き込まれるという考えに至った。この方法では気泡の混入が無く、短時間かつ少量のマッチングオイルで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができるのが特徴である。図４にプリズム形状と動作機構図を示す。
【００３６】
これは図１〜図３のプリズム部分を拡大した図である。なおプリズム形状は例として挙げたものであり、これらに限定されるものではない。図４（ａ）〜図４（ｄ）はテーパ付きプリズムである。図４（ａ）はプリズム立体図であり、測定基板ホルダ４０１に滴下されたマッチングオイル４０２が、矢印の方向へ移動して、テーパ付きプリズム４０３へ接触する。なおレーザー４０４は図に示すようにマッチングオイルのプリズムへの進行方向とは垂直の方向から照射するのが望ましい。これはマッチングオイル４０２とテーパ付きプリズム４０３が接触する面からレーザー４０４を照射する場合、レーザー４０４の入射部分にマッチングオイル４０２があると、乱反射するなどして測定できなくなるためである。従って、マッチングオイル４０２とテーパ付きプリズム４０３が接触しない面からレーザー４０４を照射するのが好ましい。図４（ｂ）はプリズム斜視図である。測定基板ホルダ４０１に滴下されたマッチングオイル４０２が、テーパ付きプリズム４０３の方向へ移動する。レーザー４０４は紙面に垂直に照射されている。測定基板４０５は測定基板ホルダ４０１に固定されており、対物レンズ４０６が測定基板４０５の下にある。
【００３７】
図４（ｃ）はプリズム斜視図であり、マッチングオイル４０２が、テーパ付きプリズム４０３と接触して、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間に満たされた状態を示す。マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、テーパ付きプリズム４０３でマッチングオイル４０２が遮断された場合でも、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間に、マッチングオイル４０２が引き込まれる。レーザー４０４の光路には測定基板ホルダ４０１は無いため、テーパ付きプリズム４０３と測定基板４０５との間にはマッチングオイルしか存在しない。図４（ｄ）はプリズム上視図である。レーザー４０４は図に示すようにマッチングオイルのプリズムへの進行方向とは垂直の方向から照射するのが望ましい。またプリズム４０３と測定基板４０５との間にマッチングオイル４０２を満たすために、プリズム形状にＲ（Ｒｏｕｎｄ）をつけた時の斜視図を図４（ｅ）に示す。Ｒ付きプリズム４０７にすることで、Ｒ付きプリズム４０７と測定基板４０５との間に、マッチングオイル４０２が引き込まれるのはもちろんのこと、図２の２１５に示すマッチングオイル拭きによるオイル残しが、テーパ付きプリズム４０３と比較してＲ付きプリズム４０７では少なくなる。これはプリズムを曲面にすることで、常に測定基板面とプリズム面との角度が変化するため、マッチングオイル拭きの移動に従い、常にプリズム面との間に摩擦力が発生するためである。一方テーパ付きプリズムでは、測定基板面とプリズム面とが平行な部分では、マッチングオイル拭きが移動しても摩擦力はＲ付きプリズムのそれと比較して小さいため、マッチングオイルを拭き取る力は弱くなるためである。
【００３８】
本実施例より、マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角となるテーパや曲面構造に設定することで、気泡の混入が無く、短時間かつ少量のマッチングオイルで、プリズムと測定基板との間にマッチングオイルを満たすことができる効果がある。
【実施例５】
【００３９】
図４では、マッチングオイルのプリズムへの進行方向に対してレーザーの照射面を垂直にすることで、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着するのを防いでいる。但しターンテーブル上のマッチングオイルを拭き取らずに測定を続けると、マッチングオイルがプリズムに溜まり、レーザー照射面へマッチングオイルが回り込む。結果としてレーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着する可能性がある。そこでレーザー照射面へマッチングオイルが回り込むのを防ぐ形状として、図５のプリズム形状が考えられる。図５にプリズム形状と動作機構図を示す。図５（ａ）はプリズム上視図であり、測定基板ホルダ５０１に滴下されたマッチングオイル５０２が、矢印の方向へ移動して、プリズム５０３へ接触する。プリズム５０３の上視図は蝶ネクタイの形をしており、中央部分の長さが短くなっている。測定基板ホルダ５０１が矢印の方向に移動することで、プリズム５０３で堰き止められて広がったマッチングオイル５０２は、測定基板ホルダ５０１の進行方向に対してプリズム５０３の面に角度がついていることから、マッチングオイル５０２は蝶ネクタイ型の中央部に集まっていく。結果として、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着する可能性が低くなる。
【００４０】
図５（ｂ）はプリズム側面図である。測定基板ホルダ５０１に滴下されたマッチングオイル５０２が、プリズム５０３の方向へ移動する。レーザー５０４は紙面に垂直に照射されている。測定基板５０５は測定基板ホルダ５０１に固定されており、対物レンズ５０６が測定基板５０５の下にある。
【００４１】
図５（ｃ）はプリズム側面図であり、マッチングオイル５０２が、プリズム５０３と接触して、プリズム５０３と測定基板５０５との間に満たされた状態を示す。マッチングオイルと接液するプリズム面を、ターンテーブルの回転面に対して鋭角に設定することで、プリズム５０３でマッチングオイル５０２が遮断された場合でも、プリズム５０３と測定基板５０５との間に、マッチングオイル５０２が引き込まれる。レーザー５０４の光路には測定基板ホルダ５０１は無いため、テーパ付きプリズム５０３と測定基板５０５との間にはマッチングオイルしか存在しない。図５（ｄ）はプリズム側面図であり、図４（ｅ）で示したＲ付きプリズムの構成となっている。プリズムを曲面にすることで、プリズム上の点における微分値が連続的に変化するため、常に測定基板面とプリズム面の傾き（微分値）との角度が変化することになり、マッチングオイル拭きの移動に従い、常にプリズム面との間に摩擦力が発生する。一方テーパ付きプリズムでは、測定基板面とプリズム面とが平行な部分では、マッチングオイル拭きが移動しても摩擦力はＲ付きプリズムのそれと比較して小さいため、マッチングオイルを拭き取る力は弱くなる。
【実施例６】
【００４２】
図３に示すように、ターンテーブルの下にプリズムを配置する場合のプリズム形状を図６に示す。図６は図５の形状を変更したものであり、レーザーのプリズムへの照射位置にマッチングオイルが付着しないプリズム形状である。図６（ａ）はプリズム側面図である。測定基板ホルダ６０１とプリズム６０３との間にマッチングオイル６０２が保持されている。レーザー６０４は測定基板ホルダ６０１の進行方向と垂直の面で、測定基板６０５へ照射され、対物レンズ６０６を通して検出される。マッチングオイル６０２で、プリズム６０３から垂れたものは、マッチングオイル溜め容器６０７で回収される。送液チューブ６０８を通して、マッチングオイルボトル６０９からポンプ６１０を用いて、マッチングオイル６０２をプリズム６０３と測定基板６０５との間に満たす。図６（ｂ）はプリズム上視図である。マッチングオイル６０２をプリズム６０３から落とすために、図５（ａ）と比較して蝶ネクタイ型の中央部をより短くした形状としている。図６（ｃ）は図６（ｂ）をレーザー６０４の照射方向から見た時のプリズム側面図である。レーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面には、マッチングオイル６０２は付着しない。プリズム６０３から垂れるマッチングオイル６０２は、６０２ｂ，６０２ｃのいずれかの点線上を通り、６０２ｄへ到達する。そして表面張力で自重を支えきれなくなると、マッチングオイル溜め容器６０７へ、６０２ｅとして落下して回収される。マッチングオイル６０２はレーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面に付着しないが、別の問題として、レーザー入射・反射位置６１１のプリズム６０３面を、誤って手で触れてしまうことがある。この場合手の有機物がプリズム表面に付着するため、レーザー６０４がプリズム６０３面で乱反射して、測定基板６０５を測定できなくなる。これを回避する方法として、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１だけを、手で触れることができないように、くぼみ６１２をつけておく方法がある。立方体／直方体／円柱など柱構造であることが望ましい。また柱構造の大きさは、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１に手が触れられなければよいため、１mmから２０mm程度が望ましい。柱構造の大きさが２０mm程度の場合には、アスペクト比が大きくないと手で触れることができないため、くぼみ６１２の大きさ，深さはこの大きさに限定されるものではない。またくぼみ６１２の大きさはレーザー６０４より大きいのは当然であるが、プリズム６０３のレーザー入射・反射位置６１１は、時間経過と共に埃などが堆積し、レーザー６０４の乱反射の原因となる。従って定期的にレーザー入射・反射位置６１１を洗浄できる大きさのくぼみ６１２であることが望ましい。つまり光学レンズ用の綿棒などが入る大きさであれば、手では触れられないが、定期的に洗浄はできる。従ってくぼみ６１２の一例としては５mm程度の立方体が考えられる。またくぼみ構造の加工が難しい場合には、穴あき構造を持つもの（例えばナット）をプリズム６０３に貼付することもできる。なおこの構造は、実施例１〜１２の全てのプリズムに対して適用できる。
【実施例７】
【００４３】
図２で試薬ポートに分注する際の流路の例を図７に示す。但し図はあくまでも例であり、これに限定されるものではない。測定基板はマッチング対象物であるプリズムとは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えることができる。これは全ての実施例に対して適用可能である。図７（ａ）はプリズムがターンテーブル上に配置されている場合の図である。測定基板ホルダ７０１上に、マッチングオイル７０２がプリズム７０３に挟まれた状態で存在する。測定基板７０４での反応を対物レンズ７０５で検出するために、流路付測定基板ホルダカバー７０７を測定基板ホルダ７０１と接合する。このとき測定基板７０４と対物レンズ７０５との距離は、対物レンズ固有の作動距離（ワーキングディスタンス）の条件を満たすことが必要である。図２に示す分注チップ２０６を用いて、試薬注入排出ポート７０８へ試薬を注入することで、測定基板７０４へ試薬を送液して、反応を検出する。試薬の送液は流路を親水性にして毛細管現象を利用する方法，試薬注入排出ポート７０８の一方を陰圧にして吸引する方法，遠心力を用いて外周方向に送液する方法などがある。また図７（ｂ）はプリズムがターンテーブル上に配置されている場合の図である。プリズム７０３が測定基板７０４の下に配置されていることから、マッチングオイル溜め容器７０６が設置されている。
【実施例８】
【００４４】
図１〜図３では、ターンテーブル方式を用いたマッチングオイルの自動充填方法などについて開示した。図１〜図３よりマッチングオイルの自動充填は、ターンテーブル以外の方法を用いても実現できることは言うまでもない。つまりマッチングオイルを載せた測定基板をプリズムへ移動させる方法の一例として図１〜図３ではターンテーブル型を開示した。従ってターンテーブルではなく、測定基板を設置した台が左右に移動することでも、同様の機能を実現することができる。図８にプリズムが測定基板の上に設置される場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図を開示する。図８（ａ）は基板設置台上視図、図８（ｂ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出する前の状態である。またプリズムは測定基板の上に設置されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が回転して、基板オートローダアームが基板オートローダ８０２へアクセスする。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が回転して、分注アームが分注チップ装着部８０３へアクセスし、試薬容器８０４で試薬を吸引し、所望の位置で試薬を吐出後に分注チップ廃棄部８０５で分注チップを廃棄する。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１の回転方向は、時計回り／反時計回りのどちらも可能とする。分注チップ８０６でマッチングオイル８０７を滴下した図が図８（ｂ）である。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８上に、測定基板ホルダ８０９が設置されている。この時テーブル押さえ８１０でＸＹＺステージ付基板設置台８０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させたときの測定基板８１２の高さを一定にすることができる。テーブル押さえ８１０の位置や個数に制限は無く、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８や測定基板８１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム８１３と対物レンズ８１４の位置は固定されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１の回転とＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動により、任意の位置に試薬を滴下できる。試薬Ａポート８１６，試薬Ｂポート８１７への分注や、測定基板８１２へのマッチングオイル８０７を滴下できる。図では分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１が２つ配置されているが、任意の個数にすることができる。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１ではなく、任意の位置にアクセス可能な分注器や基板オートローダで代用することもできる。またレーザー８１８は、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の進行方向に平行に入射している。但し図４〜図６に示すように、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の進行方向に対して、垂直にレーザー８１８を入射する方がより望ましい。これはマッチングオイル８０７がプリズム８１３のレーザー照射位置に付着して、乱反射することで、検出できなくなるのを防ぐためである。
【００４５】
図８（ｃ）は基板設置台上視図、図８（ｄ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出している状態を示す。またプリズムは測定基板の下に設置されている。測定基板８１２ａを検出するまでの手順を示す。まず分注チップ８０６ａから測定基板８１２ａ上へマッチングオイル８０７ａを滴下する。マッチングオイルの量は５〜５０μＬが好ましいが、プリズム８１３のマッチングオイル８０７ａが満たされる部分の面積，プリズム８１３と測定基板８１２ａとの距離により決定される。従ってこの量に制約されるものではない。マッチングオイル８０７ａの液高さが、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａが接触して、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。マッチングオイル８０７ａの液高さが、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａが接触しないため、プリズム８１３と測定基板８１２ａとの間にマッチングオイル８０７ａを満たすことができない。従って顕微観察ができない。次にＸＹＺステージ付基板設置台８０８をプリズム８１３の方向に移動させる。この際にマッチングオイル８０７ａはプリズム８１３と測定基板８１２ａとの間に侵入する。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させると、プリズム８１３とマッチングオイル８０７ａは接触しているため、マッチングオイル８０７ａは、その粘性によりＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動方向に伸長した形状となる。従って分注チップ８０６ａからマッチングオイル８０７ａを滴下する位置は、測定基板８１２ａ上の移動方向前側かつＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動時に対物レンズ８１４の焦点を通過する位置であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム８１３と測定基板８１２ａの中央部にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。またマッチングオイル８０７ａがプリズム８１３に接触する近傍で、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム８１３と測定基板８１２ａの中央部にマッチングオイル８０７ａを満たすことができる。測定基板８１２ａの高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を移動させてずれを補正する。それでも焦点合わないときには、対物レンズ用Ｚ軸ステージで対物レンズ８１４を上下させるか、プリズム８１３を上下させる。測定が終わった測定基板８１２ａは、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を図８（ａ）の方向に引き戻す。
【００４６】
その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸８０１を回転させて基板オートローダアームにより、測定基板ホルダ８０９ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ８０９ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８上にはマッチングオイル８０７が溜まっていく。これはプリズム８１３に残ったマッチングオイル８０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動に伴い、測定基板ホルダ８０９以外のＸＹＺステージ付基板設置台８０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き８１５をＸＹＺステージ付基板設置台８０８に設置することができる。マッチングオイル拭き８１５の高さは、マッチングオイル８０７の付着しているプリズム８１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付基板設置台８０８の移動に伴い、マッチングオイル拭き８１５がマッチングオイル８０７の付着しているプリズム８１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル８０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き８０７がプリズム８１３を通過後に、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８を反対方向に移動させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル８０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ８０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル８０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル８０７の量を一定に保つことができる。
【００４７】
図８の実施例では、測定基板ホルダ８０９とマッチングオイル拭き８１５の位置は間が空いているため、ＸＹＺステージ付基板設置台の移動により、測定基板ホルダ８０９とマッチングオイル拭き８１５との間のＸＹＺステージ付基板設置台８０８の領域に、マッチングオイル８０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き８１５を測定基板ホルダ８０９の近く、もしくは測定基板ホルダ８０９上に配置することで、マッチングオイル８１９が、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き８１５としては、プリズム８１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き８１５はＸＹＺステージ付基板設置台８０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル８０７のＸＹＺステージ付基板設置台８０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き８１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き８１５はＸＹＺステージ付基板設置台８０８に設置されている必要は無く、テーブル押さえ８１０として、ＸＹＺステージ付基板設置台８０８とは独立に設置してもよい。対物レンズ８１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。なお図８はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム８１３を図８から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。図８の方式では、図１〜図３のターンテーブル方式と比較して、移動時の位置精度が劣る可能性が高いこと、分注機構などが複数必要になる可能性がある。
【実施例９】
【００４８】
図９にプリズムが測定基板の下に設置される場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の基板設置台図を開示する。図９（ａ）は基板設置台上視図、図９（ｂ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出する前の状態である。またプリズムは測定基板の上に設置されている。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が回転して、基板オートローダアームが基板オートローダ９０２へアクセスする。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が回転して、分注アームが分注チップ装着部９０３へアクセスし、試薬容器９０４で試薬を吸引し、所望の位置で試薬を吐出後に分注チップ廃棄部９０５で分注チップを廃棄する。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１の回転方向は、時計回り／反時計回りのどちらも可能とする。分注チップ９０６でマッチングオイル９０７を滴下した図が図９（ｂ）である。ＸＹＺステージ付基板設置台９０８上に、測定基板ホルダ９０９が設置されている。この時テーブル押さえ９１０でＸＹＺステージ付基板設置台９０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を移動させたときの測定基板９１２の高さを一定にすることができる。テーブル押さえ９１０の位置や個数に制限は無く、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８や測定基板９１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム９１３と対物レンズ９１４の位置は固定されている。対物レンズ９１４は空浸用対物レンズの場合を示したが、これに限定されるものではなく、水浸，油浸用対物レンズの使用も可能である。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１の回転とＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動により、試薬Ａポート９１６，試薬Ｂポート９１７への分注など任意の位置に試薬を滴下できる。図では分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１が２つ配置されているが、任意の個数にすることができる。また分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１ではなく、任意の位置にアクセス可能な分注器や基板オートローダで代用することもできる。またレーザー９１８は、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の進行方向に平行に入射している。但し図４〜図６に示すように、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の進行方向に対して、垂直にレーザー９１８を入射する方がより望ましい。これはマッチングオイル９０７がプリズム９１３のレーザー照射位置に付着して、乱反射することで、検出できなくなるのを防ぐためである。マッチングオイル９０７は送液チューブ９１９を用いて、マッチングオイルボトル９２０からポンプ９２１で吸引され、プリズム９１３と測定基板９１２との間に満たされる。プリズム９１３から垂れたマッチングオイル９０７は、マッチングオイル溜め９２２に回収される。プリズム９１３のレーザー９１８照射部分にマッチングオイル９０７が付着しないプリズム構造としては、図６に開示した方法があるが、これに限定されるものではない。図９（ｃ）は基板設置台上視図、図９（ｄ）は基板設置台側面図であり、測定基板を検出している状態を示す。またプリズムは測定基板の下に設置されている。測定が終わった測定基板９１２ａは、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を図９（ａ）の方向に引き戻す。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸９０１を回転させて基板オートローダアームにより、測定基板ホルダ９０９ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ９０９ａの設置を行う。
【００４９】
以上のプロセスを全自動で連続して行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８上にはマッチングオイル９０７が溜まっていく。これはプリズム９１３に残ったマッチングオイル９０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動に伴い、測定基板ホルダ９０９以外のＸＹＺステージ付基板設置台９０８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き９１５をＸＹＺステージ付基板設置台９０８の下面に設置することができる。マッチングオイル拭き９１５の高さは、マッチングオイル８０７の付着しているプリズム９１３の下面部に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付基板設置台９０８の移動に伴い、マッチングオイル拭き９１５がマッチングオイル９０７の付着しているプリズム９１３の下面部を拭くことで、マッチングオイル９０７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き９１５がプリズム９１３を通過後に、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８を反対方向に移動させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル９０７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ９０９の測定が終了するごとに、マッチングオイル９０７を拭き取ることで、常にマッチングオイル９０７の量を一定に保つことができる。図９の実施例では、測定基板ホルダ９０９とマッチングオイル拭き９１５の位置は間が空いているため、ＸＹＺステージ付基板設置台の移動により、測定基板ホルダ９０９とマッチングオイル拭き９１５との間のＸＹＺステージ付基板設置台９０８の領域に、マッチングオイル９０７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き９１５を測定基板ホルダ９０９の近く、もしくは測定基板ホルダ９０９上に配置することで、マッチングオイル９０７が、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８へ塗布される領域を最小にできる。マッチングオイル拭き９１５としては、プリズム９１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き９１５はＸＹＺステージ付基板設置台９０８の任意の場所へ設置可能である。但しマッチングオイル９０７のＸＹＺステージ付基板設置台９０８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き９１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き９１５はＸＹＺステージ付基板設置台９０８に設置されている必要は無く、テーブル押さえ９１０として、ＸＹＺステージ付基板設置台９０８とは独立に設置してもよい。対物レンズ９１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。
【００５０】
なお図９はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム９１３を図９から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。図９の方式では、図１〜図３のターンテーブル方式と比較して、移動時の位置精度が劣る可能性が高いこと、分注機構などが複数必要になる可能性がある。
【実施例１０】
【００５１】
図１０は図１のターンテーブル上視図であり、図３と同じ方式でプリズムが測定基板の下に配置されている。但し図３とは異なり、マッチングオイルをターンテーブル下面へ表面張力で付着させることで、図２と同様の方式でマッチングオイルを満たしている。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ１００２へアクセスできる。また分注アームは分注チップ装着部１００３で分注チップを装着して、試薬容器１００４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部１００５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１は別々にすることで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ１００６でマッチングオイル１００７を、ターンテーブル１００８にセットされた測定基板ホルダ１００９に分注する。分注チップ１００６をターンテーブル１００８に近接させることで、マッチングオイル１００７がターンテーブル１００８下面に表面張力で付着する。分注チップ１００６を傾けておくことで、マッチングオイル１００７が垂れた場合に分注チップ１００６へのマッチングオイルの付着を防げる。またマッチングオイル１００７が垂れることを想定して、マッチングオイル１００７の下にマッチングオイル溜め容器を設置することもできる。マッチングオイル１００７を分注後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ１０１１でターンテーブル１００８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を回転させたときの測定基板１０１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ１０１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１００８や測定基板１０１２を押さえることができる。ターンテーブル１００８の回転中にマッチングオイル１００７が垂れる場合には、測定位置の直前でマッチングオイル１００７を測定基板１０１２に付着させても良い。
【００５２】
なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１０１３と対物レンズ１０１４の位置は固定されている。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させる際に、マッチングオイル１００７はプリズム１０１３と測定基板１０１２との間に侵入する。ターンテーブル１００８を回転させると、プリズム１０１３とマッチングオイル１００７は接触しているため、マッチングオイル１００７は、その粘性によりターンテーブル１００８の回転方向に伸長した形状となる。従って分注チップ１００６からマッチングオイル１００７を付着させる位置は、測定基板１０１２上の回転方向前側かつＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を中心とした対物レンズ１０１４の焦点位置の同心円上であることが望ましい。こうすることで結果的にプリズム１０１３と測定基板１０１２の中央部にマッチングオイル１００７を満たすことができる。またマッチングオイル１００７がプリズム１０１３に接触してから、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転速度を下げることで、気泡が入りにくくなり、プリズム１０１３と測定基板１０１２の中央部にマッチングオイル１００７を満たすことができる。測定基板１０１２の高さずれなどにより、画像の位置ずれや焦点ずれを生じた場合には、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を固定しているＸＹＺステージを移動させてずれを補正する。測定が終わった測定基板ホルダ１００９ｂは、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を１８０°回転させることで、測定基板ホルダ１００９ａの位置へ移動させる。その後分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１の基板オートローダアームが測定基板ホルダ１００９ａをターンテーブル１００８から外して、未測定の測定基板ホルダ１００９ａを設置する。以上のプロセスを連続して全自動で行う。但し測定する基板数が増えるにつれて、ターンテーブル１００８上にはマッチングオイル１００７が溜まっていく。これはプリズム１０１３に残ったマッチングオイル１００７が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転に伴い、測定基板ホルダ１００９以外のターンテーブル１００８上に塗布されるためである。これを防ぐ方法として、マッチングオイル拭き１０１５をターンテーブル１００８に設置することができる。マッチングオイル拭き１０１５の高さは、マッチングオイル１００７の付着しているプリズム１０１３に到達できる高さとする。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転に伴い、マッチングオイル拭き１０１５がマッチングオイル１００７の付着しているプリズム１０１３を拭くことで、マッチングオイル１００７を拭き取ることができる。１回で拭き取ることができない場合には、マッチングオイル拭き１０１５がプリズム１０１３を通過後に、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０を反対方向に回転させることで、複数回の拭き取りができるため、マッチングオイル１００７を完全に拭き取ることができる。測定基板ホルダ１００９の測定が終了するごとに、マッチングオイル１００７を拭き取ることで、常にマッチングオイル１００７の量を一定に保つことができる。図１０の実施例では、測定基板ホルダ１００９とマッチングオイル拭き１０１５の位置が９０°ずれているため、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１０１０の回転により、測定基板ホルダ１００９とマッチングオイル拭き１０１５との間のターンテーブル１００８の領域に、マッチングオイル１００７が塗布される。これを防ぐためには、マッチングオイル拭き１０１５を測定基板ホルダ１００９の近く、もしくは測定基板ホルダ１００９上に配置することで、マッチングオイル１００７が、ターンテーブル１００８へ塗布される領域を最小にできる。プリズム１０１３から垂れたマッチングオイル１００７は、プリズム下にマッチングオイル溜め容器を配置しておくことで回収される。プリズム１０１３のレーザー照射部分にマッチングオイル１００７が付着しないプリズム構造としては、図６に開示した方法があるが、これに限定されるものではない。またマッチングオイル拭き１０１５としては、プリズム１０１３を傷つけず、かつ残渣が付着しない材料であることが望ましく、フェルト，光学レンズ用ペーパーなどが挙げられる。マッチングオイル拭き１０１５はターンテーブル１００８の任意の場所へ設置可能である。
【００５３】
但しマッチングオイル１００７のターンテーブル１００８への塗布量が少ない場合や測定に影響を与えない場合には、必ずしもマッチングオイル拭き１０１５は設置しなくてもよい。またマッチングオイル拭き１０１５はターンテーブルに設置されている必要は無く、ターンテーブル押さえ１０１１として、ターンテーブル１００８とは独立に設置してもよい。また測定基板ホルダ１００９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート１０１６，試薬Ｂポート１０１７を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１００１を回転させることで、図１０に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ１００９の中央部や、試薬Ａポート１０１６，試薬Ｂポート１０１７上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ１０１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。なお図１０はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１０１３を図１０から外した構成要素となる。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【実施例１１】
【００５４】
図１〜図３，図１０で示したターンテーブルへ測定基板ホルダを装着する方法を図１１に開示する。但し図はあくまでも例であり、これに限定されるものではない。図１１（ａ）は、測定基板の設置図であり、上視図と側面図を示した。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１を回転中心として、ターンテーブル１１０２が設置されている。測定基板ホルダ１１０３には、測定基板１１０４が固定されている。測定基板ホルダ押さえ１１０５とターンテーブル１１０２との間に、測定基板ホルダ１１０３を挿入して、その位置を固定する。測定基板ホルダ１１０３は、図１０などで説明した基板オートローダアームを用いて運搬と設置を行う。測定基板１１０４を拡大したものを、図１１（ｂ）に示す。測定基板１１０４の上にプリズム１１０６があり、下には対物レンズ１１０７がある。測定基板１１０４とプリズム１１０６との間には、マッチングオイル１１０８がある。マッチングオイル１１０８の充填方法は図２で開示されている。測定基板ホルダ１１０３のターンテーブル１１０２への設置方法を図１１（ａ）の側面図を用いて説明する。まずターンテーブル１１０２の測定基板ホルダを挿入する部分には、切り込みを入れている。これは測定基板ホルダ１１０３を、基板オートローダアームで上下からしっかりと挟んだ状態で、ターンテーブル１１０２へ挿入して位置を固定するためである。ターンテーブル１１０２のＡ−Ｏ−Ａ′面での断面図より、Ａに最も近い部分は、測定基板ホルダ１１０３しか存在しない。従ってこの領域を基板オートローダアームで上下から挟みこむ。
【００５５】
次にＢ−Ｏ′−Ｂ′面で、Ｂに最も近いターンテーブル１１０２上へ測定基板１１０４の一端をのせる。Ｂ−Ｏ′−Ｂ′面でＢに最も近い測定基板ホルダ押さえ１１０５の位置は、Ｂに最も近いターンテーブル１１０２上の位置よりもＢ′側に存在するため、測定基板ホルダ１１０３の一端を、測定基板ホルダ押さえ１１０５の左（Ｂ側）にした状態で、測定基板ホルダ１１０３をターンテーブル１１０２へ下げていくことで、測定基板ホルダ１１０３がターンテーブル１１０２にぶつかる。その後測定基板ホルダ１１０３をＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１の方向へ押し込んでいくことで、測定基板ホルダ押さえ１１０５とターンテーブル１１０２との間へ挿入される。測定基板ホルダ１１０３の一端が、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１近辺の側壁へぶつかることで、測定基板ホルダ１１０３を常に同じ位置へ固定できる。測定基板ホルダ押さえ１１０５で測定基板ホルダ１１０３を押さえているため、上下左右に測定基板ホルダ１１０３の位置がずれることは無い。測定終了後には、逆の手順を行う。測定基板ホルダ１１０３を基板オートローダアームで上下から挟みこみ、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１１０１から手前に引くことで、測定基板ホルダ１１０３をターンテーブル１１０２から外すことができる。
【００５６】
この方法は、図９のようにターンテーブルではなく、基板設置台が左右に移動する場合にも適用できることは言うまでも無い。またターンテーブル１１０２のＡ−Ｏ−Ａ′面での断面図より、Ａ−Ｏでは測定基板ホルダ１１０３が挿入されており、Ｏ−Ａ′では測定基板ホルダ１１０３が挿入されていないことがわかる。これより測定基板ホルダ１１０３が挿入されていない場合には、ターンテーブル１１０２に空洞部分が存在することがわかる。図１１（ｂ）でわかるように、この領域は少なくともプリズム１１０６と対物レンズ１１０７が入る大きさでなければならない。
【００５７】
更にターンテーブル１１０２が回転したときに、この領域の厚みは常に測定基板ホルダ１１０３と同じであることが望ましい。そうでない場合には、ターンテーブル１１０２が回転したときに、ターンテーブル１１０２の一部がプリズム１１０６または対物レンズ１１０７に接触する危険性があることや、段差部分にマッチングオイル１１０８が溜まる可能性があるためである。測定基板ホルダ１１０３を挿入したときに、プリズム１１０６と対物レンズ１１０７で挟まれる部分の高さが、Ｂ−Ｏ′−Ｂ′面と、Ｃ−Ｏ−Ｃ′面で同じにしているのは、この理由によるものである。なおターンテーブル１１０２に挿入できる測定基板ホルダ１１０３の枚数は、図１１の２枚に限定されるものではない。ターンテーブル１１０２と測定基板ホルダ１１０３の大きさ、測定したい測定基板ホルダ１１０３の数によって決定されるため、任意の数の測定基板ホルダ１１０３を設置できるターンテーブル１１０２を設計することができる。
【実施例１２】
【００５８】
図１〜図１１では、プリズム型エバネッセント顕微鏡を想定した使用方法を開示してきたが、これらはマッチングオイルなどを自動充填して、全自動で測定を行う方法に関するものであり、他の分析方法にも応用できることはいうまでもない。図１２に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）の装置構成図を開示する。図はあくまでも例であるため、これに限定されるものではない。ＳＰＲとは、厚み５０ｎｍ程度の金属薄膜表面にプリズムを介してレーザー光を入射して、全反射角領域のある一定角度において特有の光の吸収（反射光の減衰）を検出する手法で、金表面の屈折率を求めることができる。これにより生体分子間の反応・結合量の測定や速度論的解析が、蛍光などの標識無しで、かつリアルタイムに行うことができる。現在免疫応答・シグナル伝達，タンパク質・核酸など様々な物質間の相互作用の研究に利用されている。
【００５９】
図１２では、レーザー１２０１から発振されたレーザービームは、λ／４波長板１２０２で円偏光となり、集光レンズ１２０３を通した後に、プリズム３０４へ垂直入射させる。プリズム用ガラスには極めて高い均質性で製造可能な光学ガラスが求められるため、合成石英または高透過率で高均質なＢＫ７もしくはＢＳＣ７が一般的に用いられる。レーザービームは、測定基板１２０５ｂの屈折率境界平面、即ち測定基板１２０５ｂと溶液の界面に対して、入射角度約６８°で入射することで、レーザービームを全反射させ、エバネッセント波を形成する。なお図１２では測定基板１２０５ａ，１２０５ｂは測定基板ホルダ１２０６ｂに固定された状態でターンテーブル１２０７にセットされている。測定基板１２０５と測定基板ホルダ１２０６を高い平行度で固定することで、ターンテーブル１２０７に高い平行度でセットできる。それぞれの平行度は１°以下であることが望ましいが、これに限定されるものではない。測定基板１２０５ａ，１２０５ｂが大きければ、測定基板ホルダ１２０６を介さずに直接ターンテーブル１２０７上に設置することもできる。なおプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間を屈折率の近いマッチングオイル１２１２ｂで充填することで、レーザービームがプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂ境界で全反射することを防いでいる。レーザーの光路には測定基板ホルダ１２０６は無いため、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にはマッチングオイルしか存在しない。プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離に制限はないが、距離が広がりすぎると、マッチングオイル１２１２ｂをプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に保持できなくなる。距離が離れて少しでもプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に空気層が入ると、その部分でレーザービームは全反射してしまう。従って気泡が入らない構造であることが必須である。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を回転させることで、ターンテーブル１２０７を回転できる。ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８はＸＹＺステージに固定されており、回転中心を任意の位置へ移動することができる。更にターンテーブル押さえ１２０９ａ，１２０９ｂを用いてターンテーブル１２０７を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を回転させたときの測定基板１２０５ｂの高さを常に一定することができる。
【００６０】
ターンテーブル押さえ１２０９ａ，１２０９ｂの位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１２０７や測定基板１２０５ａ，１２０５ｂを押さえることができる。なおプリズム１２０４の位置は固定されている。ＳＰＲ検出器１２１０で検出した反射光信号は、制御用ＰＣ１２１４で処理され、結果がモニタ１２１５に表示される。これにより全反射角領域のある一定角度において特有の光の吸収（反射光の減衰）を検出して、金表面の屈折率を求める。分注チップ１２１１からマッチングオイル１２１２を、測定基板１２０５へ付着させる。これは図１０で開示したのと同様の方法である。またプリズム１２０４は、図４で開示したように、マッチングオイル１２１２との接液部がテーパ構造になっている。マッチングオイル１２１２ａの液高さが、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離よりも高くなる液量を分注することで、プリズム１２０４とマッチングオイル１２１２ａが接触して、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にマッチングオイル１２１２ａを満たすことができる。マッチングオイル１２１２ａの液高さが、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間の距離よりも低くなる液量では、プリズム１２０４とマッチングオイル１２１２ａが接触しないため、プリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間にマッチングオイル１２１２ａを満たすことができない。次にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１２０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１２０７を１８０°回転させる。この際にマッチングオイル１２１２ａはプリズム１２０４と測定基板１２０５ｂとの間に入り込む。測定が終わった測定基板１２０５ｂは、ターンテーブル回転軸１２０８を１８０°回転させることで、ターンテーブル１２０７を１８０°回転させる。その後基板オートローダ１２１９を用いて、測定基板ホルダ１２０６ａの取り外しと、新しい測定基板ホルダ１２０６ａの設置を行う。以上のプロセスを全自動で連続して行う。必要に応じて、試薬容器１２１６から分注ユニット１２１７で吸引した試薬を、送液チューブ１２１８を通して測定基板１２０５ａへ試薬を送液することもできる。また図２に示すマッチングオイル拭き２１５に相当するものをターンテーブル１２０７の下面に設置することもできる。図６で開示したように、マッチングオイル溜め容器１２１３で、プリズム１２０４からこぼれたマッチングオイルを回収することもできる。実施例１〜１２で開示した光学素子などの配置図はあくまでも一例であり、これらに限定されるものではない。例えばλ／４波長板でレーザーを円偏光にしているが、測定のアプリケーションによっては、直線偏光させる必要がある。その場合には、λ／４波長板の替わりにλ／２波長板を挿入することができる。図１２では表面プラズモン共鳴について開示しているが、分光プリズムを設置した蛍光体分離による物質同定など多くのアプリケーションに適用可能することができる。
【実施例１３】
【００６１】
図１，図３に示すようにターンテーブルの上または下にプリズムや対物レンズを配置するのではなく、ターンテーブルを垂直にして、プリズムや対物レンズをその横に配置することもできる。もちろんターンテーブルの傾斜配置も可能であることはいうまでもない。ターンテーブルを垂直にした場合のプリズム型エバネッセント顕微鏡の装置構成図を図１３に示す。なおターンテーブルは割愛して記載している。測定基板ホルダ１３０１とプリズム１３０３との間にマッチングオイル１３０２が保持されている。レーザー１３０４は測定基板ホルダ１３０１の進行方向と垂直の面で、測定基板１３０５へ照射され、対物レンズ１３０６を通して検出される。マッチングオイル１３０２で、プリズム１３０３から垂れたものは、マッチングオイル溜め容器１３０７で回収される。送液チューブ１３０８を通して、マッチングオイルボトル１３０９からポンプ１３１０を用いて、マッチングオイル１３０２をプリズム１３０３と測定基板１３０５との間に満たす。但しターンテーブルが垂直に配置されているため、プリズム１３０３からマッチングオイル１３０２は垂れやすいため、１３０２ｂ，１３０２ｃを通って１３０２ｄとしてマッチングオイル溜め容器１３０７へ回収される。プリズム１３０３と測定基板１３０５との間に、マッチングオイル１３０２が表面張力で保持されることが望ましいが、そうでない場合にはマッチングオイル溜めへ回収された量を、送液チューブ１３０８を通して、マッチングオイルボトル１３０９からポンプ１３１０を用いて、マッチングオイル１３０２をプリズム１３０３と測定基板１３０５との間に満たす必要がある。図６に示すプリズム構造により、マッチングオイル１３０２がプリズム１３０３のレーザー入射部に付着しないようにすることはいうまでもない。
【実施例１４】
【００６２】
図１４はマッチングオイル溜め付きターンテーブル上視図である。但し図２とは異なり、マッチングオイルがターンテーブルの同心円状に満たされている構造を示している。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１が回転することにより、基板オートローダアームが基板オートローダ１４０２へアクセスできる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１を中心とした点線は、分注アームまたは基板オートローダアームが回転する軌道を示している。また分注アームは分注チップ装着部１４０３で分注チップを装着して、試薬容器１４０４で試薬吸引して、使用済みの分注チップを分注チップ廃棄部１４０５へ廃棄できる。なお分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１は、それぞれ別々に配置することで、基板設置と分注を並行処理することができる。上記機構を用いて、分注チップ１４０６でマッチングオイル１４０７を、ターンテーブル１４０８にセットされた測定基板ホルダ１４０９に分注する。この時、多量のマッチングオイル１４０７を分注して、ターンテーブル１４０８の同心円状に満たすことにより、マッチングオイル１４０７の液面が、プリズム１４１３の下面よりも高くなるため、常に気泡が入らない状態でマッチングオイル１４０７をプリズム１４１３と測定基板１４１２との間に満たすことができる。埃がマッチングオイル１４０７に混入した場合、レーザーを乱反射する可能性があるため、マッチングオイルへの埃の混入を防ぐための埃よけカバー１４２１を設置することが好ましい（上視図では省略）。なお埃よけカバー１４２１は図に開示した以外にも様々な形状を取ることができるのは言うまでもない。
【００６３】
マッチングオイル１４０７を分注後にＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１４１０を１８０°回転させる。この時ターンテーブル押さえ１４１１でターンテーブル１４０８を上下から押さえることで、ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸１４１０を回転させたときの測定基板１４１２の高さを常に一定にすることができる。ターンテーブル押さえ１４１１の位置や個数に制限は無く、ターンテーブル１４０８や測定基板１４１２を押さえることができる。なお顕微鏡測定における焦点合わせの微調整を除いて、プリズム１４１３と対物レンズ１４１４の位置は固定されている。また測定基板ホルダ１４０９の任意の場所に試薬ポートとして、試薬Ａポート１４１５，試薬Ｂポート１４１６を設けることができる。試薬ポートの数は任意に設定できる。分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸１４０１を回転させることで、図１４に示すように分注アームまたは基板オートローダアームを測定基板ホルダ１４０９の中央部や、試薬Ａポート１４１５，試薬Ｂポート１４１６上に移動して、試薬などを滴下することができる。対物レンズ１４１４は空浸，水浸，油浸レンズが知られているが、空浸レンズを用いるのが好ましい。もちろん水浸，油浸レンズの使用も可能であるが、気泡の混入と、液体（特に水）の蒸発が起こらない機構が必要となる。その例として、送液チューブ１４１７を通して、水１４１８をポンプ１４１９で対物レンズ１４１４へ送液する方法が考えられるが、これに限定されるものではない。また１４１８はマッチングオイルなど他の液体にすることができる。なお図１４はプリズム型エバネッセント顕微鏡を示しているが、１分子検出可能な対物型エバネッセント顕微鏡の場合は、プリズム１４１３を図１４から外した構成要素となる。この場合マッチングオイル１４０７は必要ない。レーザーは対物レンズの辺縁部から入射する。従ってプリズム型エバネッセント顕微鏡に限らず、対物型エバネッセント顕微鏡などの顕微鏡一般にも適用できる。
【００６４】
更にターンテーブル１４０８を部分的に温度調節することで、測定基板ホルダ１４０９ａと１４０９ｂを異なる温度に設定できる。温調方式としては、空気温調と局所温調がある。空気温調は加温または冷却装置と温調用の箱を用いて、保温したい箱の空気温度を調節する方法である。温度安定性は高いが、温度到達までの時間が長いこと、６０℃以上の高温は難しいといった課題がある。全反射顕微鏡で空気温調用の箱を用いる場合、スライドガラスを保持する顕微鏡ステージ，プリズム，対物レンズ全てを覆う可能性が高いため、それらの熱膨張の影響が懸念される。特に対物レンズに関しては、高温での使用はメーカーの仕様範囲外であるため、極力室温に保つことが望ましい。また局所温調は加温または冷却装置を温度制御したい部分に直接接触させることで、温度調節する方法である。従って空気温調で懸念されるような対物レンズの熱膨張は発生しない。局所温調は空気温調と比較して温度安定性に劣るものの、温度到達までの時間が短いこと、６０℃以上の高温も制御可能という特徴を持つ。例えば酵素反応と洗浄で温度を変える必要がある場合や、高耐熱性酵素を使用する場合には、空気温調よりも局所温調方式が適している。従って温度調節の方法としては、ターンテーブル１４０８に対してペルチエ，ヒーターを接触させる方法や、ターンテーブル１４０８に電熱線を埋め込んでおく方法，赤外線レーザーなどを用いる方法などが考えられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ターンテーブル押さえ１４１１にヒーターの役割を持たせても良い。これによりプリズム１４１３と対物レンズ１４１４で挟まれた測定基板１４１２を検出している間に、もう一方の測定基板１４１２に、試薬を送液して異なる温度で一定時間反応させた後に、検出を行うバイオアッセイが可能となる。例えばＰＣＲでは一般的に３段階の温度サイクル（例．熱変性：９５℃，ハイブリダイゼーション：５８℃，伸長：７２℃）を経ることで、核酸を２倍にすることができる。従ってターンテーブル１４０８に測定基板ホルダ１４０９を３枚設置して、３段階の温度設定にすることで、ターンテーブル１４０８が１回転するたびに核酸が２倍になるため、その履歴を検出することで初期のＤＮＡ量を計測する定量ＰＣＲが実現できる。またその他にも、実施例に示したようにＤＮＡとプライマーの２本鎖に対して１塩基ずつ蛍光標識塩基を伸長させてＤＮＡシーケンスを行うなど、多くのアプリケーションがある。本発明のアプリケーションはこれらに限定されるものではない。
【符号の説明】
【００６６】
１０１，３０１，４０４，５０４，６０４，８１８，９１８，１２０１，１３０４ レーザー
１０２，３０２，１２０２ λ／４波長板
１０３，３０３，１２０３ 集光レンズ
１０４，２１３，３０４，５０３，６０３，７０３，８１３，９１３，１０１３，１１０６，１２０４，１３０３，１４１３ プリズム
１０５，２１２，３０５，４０５，５０５，６０５，７０４，８１２，１０１２，１１０４，１３０５，１４１２ 測定基板
１０６，２０９，３０６，４０１，５０１，６０１，７０１，８０９，９０９，１００９，１１０３，１２０６，１３０１，１４０９ 測定基板ホルダ
１０７，２０８，３０７，１００８，１１０２，１２０７，１４０８ ターンテーブル
１０８，２１０，３０８，１０１０，１２０８，１４１０ ＸＹＺステージ付きターンテーブル回転軸
１０９，２１１，３０９，１０１１，１２０９，１４１１ ターンテーブル押さえ
１１０，２１４，３１０，４０６，５０６，６０６，７０５，８１４，９１４，１０１４，１１０７，１３０６，１４１４ 対物レンズ
１１１，３１１ 対物レンズ用Ｚ軸ステージ
１１２，３１２ フィルタユニット
１１３，３１３ 結像レンズ
１１４，３１４ ＣＣＤ
１１５，３１５，１２１４ 制御用ＰＣ
１１６，３１６，１２１５ モニタ
１１７，２０４，３１７，８０４，９０４，１００４，１２１６，１４０４ 試薬容器
１１８，３１８，１２１７ 分注ユニット
１１９，２１８，３１９，３２２，６０８，９１９，１２１８，１３０８，１４１７ 送液チューブ
１２０，２０７，３２３，４０２，５０２，６０２，７０２，８０７，９０７，１００７，１１０８，１２１２，１３０２，１４０７ マッチングオイル
１２１，２０２，３２１，８０２，９０２，１００２，１２１９，１４０２ 基板オートローダ
２０１，８０１，９０１，１００１，１４０１ 分注アーム兼基板オートローダアーム回転軸
２０３，８０３，９０３，１００３，１４０３ 分注チップ装着部
２０５，８０５，９０５，１００５，１４０５ 分注チップ廃棄部
２０６，８０６，９０６，１００６，１２１１，１４０６ 分注チップ
２１５，８１５，９１５，１０１５ マッチングオイル拭き
２１６，８１６，９１６，１０１６，１４１５ 試薬Ａポート
２１７，８１７，９１７，１０１７，１４１６ 試薬Ｂポート
２１９，３２０，１４１８ 水
２２０，３２４，６１０，９２１，１３１０，１４１９ ポンプ
３２５，６０７，７０６，９２２，１２１３，１３０７ マッチングオイル溜め容器
４０３ テーパ付きプリズム
４０７ Ｒ付きプリズム
６０９，９２０，１３０９ マッチングオイルボトル
６１１ レーザー入射・反射位置
６１２ くぼみ
７０７ 流路付測定基板ホルダカバー
７０８ 試薬注入排出ポート
８０８，９０８ ＸＹＺステージ付基板設置台
８１０，９１０ テーブル押さえ
１１０５ 測定基板ホルダ押さえ
１２０５ （金薄膜付）測定基板
１２１０ ＳＰＲ検出器
１４２０ 埃よけカバー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マッチング対象物と、溶液を分注する機構と、測定対象基板と、前記溶液を前記基板と前記マッチング対象物との間に移動させる移動機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の移動機構が、回転軸と、前記基板を載置する機構を備えた台であり、前記マッチング対象物が近接していることを特徴とする測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の移動機構が、平行移動する機構と、前記基板を載置する機構を備えた台であり、前記マッチング対象物が近接していることを特徴とする測定装置。
【請求項４】
請求項２または３に記載の基板を載置する機構へ該基板を載置する機構として、該基板を保持する機構と、該基板を移動する機構と、該基板を離す機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項５】
請求項４に記載の該基板を移動させる機構が、回転軸，平行移動，上下移動、またはそれらの組合せからなる機構であることを特徴とする測定装置。
【請求項６】
請求項１に記載の移動機構を、上面，下面、または上下面から押さえる押さえ機構であり、該移動機構の移動時に該押さえ機構の位置は固定されていることを特徴とする測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の移動機構が、前記溶液を拭き取る材料を載置する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項８】
請求項７に記載の材料が、フェルト，光学レンズ用ペーパー、またはそれに類する吸湿性の高い材料であることを特徴とする測定装置。
【請求項９】
請求項１に記載の溶液が、マッチングオイル，イマージョンオイル，グリセロール，水、またはそれに類する溶液であることを特徴とする測定装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の分注機構が、前記移動機構の上面に前記溶液を分注する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の分注機構が、前記移動機構の下面に前記溶液を分注する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の移動機構が、前記基板が前記マッチング対象物へ移動する方向に対して測定位置前方となる位置で停止して、前記分注機構が前記溶液を分注することを特徴とする測定装置。
【請求項１３】
請求項１記載のマッチング対象物が、前記基板を計測するためのプリズム，対物レンズ、または該基板を測定するための部品のいずれかであることを特徴とする測定装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、テーパ，曲面、またはそれに類する面で前記溶液と接液する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、前記溶液と接液する面で鈍角である構造を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項１６】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、立方体，直方体，円柱またはそれに類するくぼみ構造を持ち、該くぼみ部分に励起光を入射させることを特徴とする測定装置。
【請求項１７】
請求項１に記載の移動機構が、マッチング対象物に前記溶液が接触する近傍で、その移動速度を遅くすることを特徴とする測定装置。
【請求項１８】
請求項１に記載のマッチング対象物近傍における前記移動機構の移動方向に対して、それとは異なる角度から励起光を入射させる機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項１９】
請求項１８に記載の角度が９０°である機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２０】
請求項１に記載の測定対象基板が、プリズム型全反射顕微鏡，対物型全反射顕微鏡，１分子蛍光測定，表面プラズモン共鳴，ラマン測定，分光分析のいずれかの方法により計測されることを特徴とする測定装置。
【請求項２１】
請求項２または３に記載の台が、複数の加温冷却構造を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２２】
請求項１記載のマッチング対象物が、その下に前記溶液を回収する機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２３】
請求項１記載の測定対象基板が、前記マッチング対象物とは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２４】
請求項１記載の移動機構が、前記溶液を保持する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２５】
請求項２４記載の溶液を保持する機構が、その上部に溶液保護用のカバーを備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２６】
マッチング対象物と、溶液を分注する機構と、測定対象基板と、前記溶液を前記基板と前記マッチング対象物との間に移動させる移動機構を備えており、前記移動機構は、回転軸と、前記基板を載置する機構を備えた台で、前記マッチング対象物が近接しており、前記基板を載置する機構へ前記基板を載置する機構として、前記基板を保持する機構と、前記基板を回転軸，平行移動，上下移動、またはそれらの組合せからなる移動する機構と、前記基板を離す機構を備えており、前記溶液が、マッチングオイル，イマージョンオイル，グリセロール，水、またはそれに類する溶液のいずれかであり、前記分注機構が、前記移動機構の上面または下面に前記溶液を分注する構造であり、前記移動機構が、前記基板が前記マッチング対象物へ移動する方向に対して測定位置前方となる位置で停止して、前記分注機構が前記溶液を分注する構造であり、前記マッチング対象物が、前記基板を計測するための励起光入射用プリズム，対物レンズ、または該基板を測定するための部品のいずれかであり、前記マッチング対象物が、テーパ，曲面、またはそれに類する面で前記溶液と接液する構造であり、前記マッチング対象物が、立方体，直方体，円柱またはそれに類するくぼみ構造を持ち、前記くぼみ部分に励起光を入射させることができ、前記マッチング対象物近傍における前記移動機構の移動方向に対して、それとは異なる角度から励起光を入射させる機構を持ち、前記移動機構が、複数の加温冷却構造を持ち、前記マッチング対象物が、その下に前記溶液を回収する機構を持ち、前記測定対象基板が、プリズム型全反射顕微鏡，対物型全反射顕微鏡，１分子蛍光測定，表面プラズモン共鳴，ラマン測定，分光分析のいずれかの方法により計測されることを特徴とする測定装置。
【請求項２７】
測定対象基板上で塩基伸長反応させ、エバネッセント場を用いて蛍光観察を行う全反射蛍光測定装置であって、
測定対象基板へ励起光を照射する照射機構と、
照射機構からの励起光を測定対象基板上で全反射させるためのプリズムと、
塩基伸長反応で取り込まれた蛍光色素を観察する観察機構と、
測定対象基板と構造体との間に充填するマッチングオイルを分注するための分注機構とを有し、
測定対象基板とプリズムとの間に、マッチングオイルを移動させるための移動機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項２８】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
移動機構は、軸を中心に回転する回転台を備え、
測定対象基板はこの回転台に固定され、回転台の回転により測定対象基板はプリズムに対向する位置に移動することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項２９】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台の回転速度は可変であり、
マッチングオイルがプリズムに接触したときまたは接触する直前に、回転台の速度を下げることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３０】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台上に、マッチングオイルを拭き取る、拭き取り機構を備え、回転台が回転して拭き取り機構がマッチングオイルを拭き取ることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３１】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの測定対象基板側端部の少なくとも一部が回転台の面に対して鋭角に形成されていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３２】
請求項３１に記載の全反射蛍光測定装置であって、
鋭角に形成されている箇所は、回転台の回転によって最初にプリズムがマッチングオイルに接液する箇所であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３３】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台は、測定対象基板を固定する基板固定ホルダを備え、基板固定ホルダに試薬送液流路を設けたことを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３４】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台は、複数の測定対象基板保持部を備え、それぞれの測定対象基板保持部は独立して温度制御可能であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３５】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
移動機構は、測定対象基板を固定して載置する基台であり、この基台はプリズムに向かっていく方向およびプリズムから離れる方向に直線移動することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３６】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
マッチングオイルがプリズムに接触したときまたは接触する直前に、基台の速度を下げることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３７】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台上に、マッチングオイルを拭き取る機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３８】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの測定対象基板側端部の少なくとも一部が基台の面に対して鋭角に形成されていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３９】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
鋭角に形成されている箇所は、基台の直線移動によって最初にプリズムがマッチングオイルに接液する箇所であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４０】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台は測定対象基板を固定する基板固定ホルダを備え、基板固定ホルダに試薬送液流路を設けたことを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４１】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台は、複数の測定対象基板保持部を備え、それぞれの測定対象基板保持部は独立して温度制御可能であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４２】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの平面形状が、中心から外側に近づくほど幅が広くなる形状であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４３】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの平面形状が、蝶ネクタイの形状であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４４】
請求項４２または４３に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの幅の狭い箇所に、最初にプリズムがマッチング溶液に接液することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４５】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムのレーザー照射位置にくぼみを設けることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４６】
測定対象基板上で塩基伸長反応させ、エバネッセント場を用いて蛍光観察を行う全反射蛍光測定装置であって、
測定対象基板へ励起光を照射する照射機構と、
照射機構からの励起光を測定対象基板上で全反射させるためのプリズムと、
塩基伸長反応で取り込まれた蛍光色素を観察する観察機構と、
測定対象基板と観察機構の対物レンズとの間に充填する水を分注するための分注機構とを有し、
プリズムが測定対象基板の下方に配置され、
測定対象基板と対物レンズとの間に、水を移動させるための移動機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項１】
マッチング対象物と、溶液を分注する機構と、測定対象基板と、前記溶液を前記基板と前記マッチング対象物との間に移動させる移動機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の移動機構が、回転軸と、前記基板を載置する機構を備えた台であり、前記マッチング対象物が近接していることを特徴とする測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の移動機構が、平行移動する機構と、前記基板を載置する機構を備えた台であり、前記マッチング対象物が近接していることを特徴とする測定装置。
【請求項４】
請求項２または３に記載の基板を載置する機構へ該基板を載置する機構として、該基板を保持する機構と、該基板を移動する機構と、該基板を離す機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項５】
請求項４に記載の該基板を移動させる機構が、回転軸，平行移動，上下移動、またはそれらの組合せからなる機構であることを特徴とする測定装置。
【請求項６】
請求項１に記載の移動機構を、上面，下面、または上下面から押さえる押さえ機構であり、該移動機構の移動時に該押さえ機構の位置は固定されていることを特徴とする測定装置。
【請求項７】
請求項１に記載の移動機構が、前記溶液を拭き取る材料を載置する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項８】
請求項７に記載の材料が、フェルト，光学レンズ用ペーパー、またはそれに類する吸湿性の高い材料であることを特徴とする測定装置。
【請求項９】
請求項１に記載の溶液が、マッチングオイル，イマージョンオイル，グリセロール，水、またはそれに類する溶液であることを特徴とする測定装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の分注機構が、前記移動機構の上面に前記溶液を分注する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の分注機構が、前記移動機構の下面に前記溶液を分注する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の移動機構が、前記基板が前記マッチング対象物へ移動する方向に対して測定位置前方となる位置で停止して、前記分注機構が前記溶液を分注することを特徴とする測定装置。
【請求項１３】
請求項１記載のマッチング対象物が、前記基板を計測するためのプリズム，対物レンズ、または該基板を測定するための部品のいずれかであることを特徴とする測定装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、テーパ，曲面、またはそれに類する面で前記溶液と接液する構造であることを特徴とする測定装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、前記溶液と接液する面で鈍角である構造を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項１６】
請求項１３に記載のマッチング対象物が、立方体，直方体，円柱またはそれに類するくぼみ構造を持ち、該くぼみ部分に励起光を入射させることを特徴とする測定装置。
【請求項１７】
請求項１に記載の移動機構が、マッチング対象物に前記溶液が接触する近傍で、その移動速度を遅くすることを特徴とする測定装置。
【請求項１８】
請求項１に記載のマッチング対象物近傍における前記移動機構の移動方向に対して、それとは異なる角度から励起光を入射させる機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項１９】
請求項１８に記載の角度が９０°である機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２０】
請求項１に記載の測定対象基板が、プリズム型全反射顕微鏡，対物型全反射顕微鏡，１分子蛍光測定，表面プラズモン共鳴，ラマン測定，分光分析のいずれかの方法により計測されることを特徴とする測定装置。
【請求項２１】
請求項２または３に記載の台が、複数の加温冷却構造を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２２】
請求項１記載のマッチング対象物が、その下に前記溶液を回収する機構を持つことを特徴とする測定装置。
【請求項２３】
請求項１記載の測定対象基板が、前記マッチング対象物とは反対側の面に試薬を保持または送液する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２４】
請求項１記載の移動機構が、前記溶液を保持する機構を備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２５】
請求項２４記載の溶液を保持する機構が、その上部に溶液保護用のカバーを備えていることを特徴とする測定装置。
【請求項２６】
マッチング対象物と、溶液を分注する機構と、測定対象基板と、前記溶液を前記基板と前記マッチング対象物との間に移動させる移動機構を備えており、前記移動機構は、回転軸と、前記基板を載置する機構を備えた台で、前記マッチング対象物が近接しており、前記基板を載置する機構へ前記基板を載置する機構として、前記基板を保持する機構と、前記基板を回転軸，平行移動，上下移動、またはそれらの組合せからなる移動する機構と、前記基板を離す機構を備えており、前記溶液が、マッチングオイル，イマージョンオイル，グリセロール，水、またはそれに類する溶液のいずれかであり、前記分注機構が、前記移動機構の上面または下面に前記溶液を分注する構造であり、前記移動機構が、前記基板が前記マッチング対象物へ移動する方向に対して測定位置前方となる位置で停止して、前記分注機構が前記溶液を分注する構造であり、前記マッチング対象物が、前記基板を計測するための励起光入射用プリズム，対物レンズ、または該基板を測定するための部品のいずれかであり、前記マッチング対象物が、テーパ，曲面、またはそれに類する面で前記溶液と接液する構造であり、前記マッチング対象物が、立方体，直方体，円柱またはそれに類するくぼみ構造を持ち、前記くぼみ部分に励起光を入射させることができ、前記マッチング対象物近傍における前記移動機構の移動方向に対して、それとは異なる角度から励起光を入射させる機構を持ち、前記移動機構が、複数の加温冷却構造を持ち、前記マッチング対象物が、その下に前記溶液を回収する機構を持ち、前記測定対象基板が、プリズム型全反射顕微鏡，対物型全反射顕微鏡，１分子蛍光測定，表面プラズモン共鳴，ラマン測定，分光分析のいずれかの方法により計測されることを特徴とする測定装置。
【請求項２７】
測定対象基板上で塩基伸長反応させ、エバネッセント場を用いて蛍光観察を行う全反射蛍光測定装置であって、
測定対象基板へ励起光を照射する照射機構と、
照射機構からの励起光を測定対象基板上で全反射させるためのプリズムと、
塩基伸長反応で取り込まれた蛍光色素を観察する観察機構と、
測定対象基板と構造体との間に充填するマッチングオイルを分注するための分注機構とを有し、
測定対象基板とプリズムとの間に、マッチングオイルを移動させるための移動機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項２８】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
移動機構は、軸を中心に回転する回転台を備え、
測定対象基板はこの回転台に固定され、回転台の回転により測定対象基板はプリズムに対向する位置に移動することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項２９】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台の回転速度は可変であり、
マッチングオイルがプリズムに接触したときまたは接触する直前に、回転台の速度を下げることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３０】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台上に、マッチングオイルを拭き取る、拭き取り機構を備え、回転台が回転して拭き取り機構がマッチングオイルを拭き取ることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３１】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの測定対象基板側端部の少なくとも一部が回転台の面に対して鋭角に形成されていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３２】
請求項３１に記載の全反射蛍光測定装置であって、
鋭角に形成されている箇所は、回転台の回転によって最初にプリズムがマッチングオイルに接液する箇所であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３３】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台は、測定対象基板を固定する基板固定ホルダを備え、基板固定ホルダに試薬送液流路を設けたことを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３４】
請求項２８に記載の全反射蛍光測定装置であって、
回転台は、複数の測定対象基板保持部を備え、それぞれの測定対象基板保持部は独立して温度制御可能であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３５】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
移動機構は、測定対象基板を固定して載置する基台であり、この基台はプリズムに向かっていく方向およびプリズムから離れる方向に直線移動することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３６】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
マッチングオイルがプリズムに接触したときまたは接触する直前に、基台の速度を下げることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３７】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台上に、マッチングオイルを拭き取る機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３８】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの測定対象基板側端部の少なくとも一部が基台の面に対して鋭角に形成されていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項３９】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
鋭角に形成されている箇所は、基台の直線移動によって最初にプリズムがマッチングオイルに接液する箇所であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４０】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台は測定対象基板を固定する基板固定ホルダを備え、基板固定ホルダに試薬送液流路を設けたことを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４１】
請求項３５に記載の全反射蛍光測定装置であって、
基台は、複数の測定対象基板保持部を備え、それぞれの測定対象基板保持部は独立して温度制御可能であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４２】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの平面形状が、中心から外側に近づくほど幅が広くなる形状であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４３】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの平面形状が、蝶ネクタイの形状であることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４４】
請求項４２または４３に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムの幅の狭い箇所に、最初にプリズムがマッチング溶液に接液することを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４５】
請求項２７に記載の全反射蛍光測定装置であって、
プリズムのレーザー照射位置にくぼみを設けることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【請求項４６】
測定対象基板上で塩基伸長反応させ、エバネッセント場を用いて蛍光観察を行う全反射蛍光測定装置であって、
測定対象基板へ励起光を照射する照射機構と、
照射機構からの励起光を測定対象基板上で全反射させるためのプリズムと、
塩基伸長反応で取り込まれた蛍光色素を観察する観察機構と、
測定対象基板と観察機構の対物レンズとの間に充填する水を分注するための分注機構とを有し、
プリズムが測定対象基板の下方に配置され、
測定対象基板と対物レンズとの間に、水を移動させるための移動機構を備えていることを特徴とする、全反射蛍光測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１１２４１０（Ｐ２０１１−１１２４１０Ａ）
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６６９２０（Ｐ２００９−２６６９２０）
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２５日（２００９．１１．２５）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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