溶媒交流蒸発法による徐放性マイクロスフェアの製造方法
本発明は、薬物の放出を長期間調節し得る徐放性マイクロスフェアの製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、生分解性高分子を含む担体中に薬物が封入されたマイクロスフェアの製造において、生理活性物質の初期過多放出を抑制し、生理活性物質を体内で持続的かつ均一に放出するために、共溶媒の手段による溶媒交流蒸発法を用いる、徐放性マイクロスフェアの製造方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の長期間放出を調節し得る徐放性マイクロスフェアの製造方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、生分解性高分子を含む担体に薬物を封入したマイクロスフェアの製造法として、共溶媒を用いた溶媒交流蒸発法を採用することによって、生理活性物質の初期過多放出を抑制して、体内で生理活性物質が持続的、かつ均一に放出されるようにした、徐放性マイクロスフェアの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、徐放性注射製剤の一般的な製造方法として、コアセルベーション法、溶融押出法、噴霧乾燥法および溶媒蒸発法などが知られている。これらの方法のうち、二重エマルジョン溶媒蒸発法（Ｗ／Ｏ／Ｗ；水／油／水型）と単一エマルジョン溶媒蒸発法（Ｏ／Ｗ；油／水型）とに分類される溶媒蒸発法が、一般的に使われてきた。
このような徐放性注射製剤を改善するために、薬物封入効率の向上、製造工程の単純化および初期過多放出の低減のような、多くの試みが行われてきた。
【０００３】
韓国特許出願２００３−００２３１３０号は、生分解性高分子と薬物を溶媒に溶解する工程、噴霧乾燥法を用いて溶液を一定流量で噴霧する工程、および減圧下に乾燥する工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法を開示している。
しかしながら、この発明は、高価な噴霧乾燥機の設置費用、設備の無菌処理および生理活性物質の初期過多放出のような短所を有していた。
【０００４】
韓国特許出願２００４−７００９９９９号は、浸透圧調節剤を加えてマイクロスフェア内への薬物封入を増大させ、マイクロスフェアの分散性を改善する、マイクロスフェアの製造方法を開示している。
しかしながら、この発明は、薬物の過剰封入により引き起こされるマイクロスフェア表面に分布する薬物量の増加による初期過多放出という短所を依然として有している。
【０００５】
韓国特許第４０９４１３号は、水中乾燥法によりマイクロカプセルを製造した後、得られたマイクロカプセルを生分解性高分子のガラス転移温度以上の温度で加熱乾燥して、生理活性物質の初期過多放出を抑制し、残存有機溶媒を最小化する方法を開示している。
しかしながら、この発明は、生理活性物質が熱変性されるという短所を有している。
【０００６】
米国特許第５３６６７３４号は、薬物と生分解性高分子との混合物をインプラントの形態に固形化し、該インプラントをコーティングして、連続投与用の医薬活性ペプチド製剤を製造する方法を開示している。
しかしながら、このようなインプラントは大きすぎるため、皮下注射用の注射針のサイズを大きくしなければならない。その結果、患者に恐怖感を与え、また注射時の疼痛ゆえに局所麻酔を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものである。本発明により解決されるべき技術的な課題は、従来技術の有する問題がなく、かつ生理活性物質の初期過多放出を効率よく抑制する徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明は、生理活性物質および生分解性高分子を含むエマルジョンに共溶媒を加えた後、該エマルジョンを水性溶液に加えることを含む、生理活性物質の初期過多放出に対して優れた抑制効果を有する徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供する。
また、本発明は、上記の製造方法によって製造される徐放性マイクロスフェアを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、生理活性物質、特にペプチドまたはその塩を含む徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供するものであり、この方法では製造工程中に除去され得る共溶媒を加えることにより、初期過多放出を抑制することができ、その他の添加剤や工程を必要としない。
【００１０】
さらに、本発明で用いられる共溶媒は、溶媒除去工程を経て完全に除去されるため、本発明は、人体に安全で優れた初期過多放出抑制効果を有する徐放性のマイクロスフェアを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、
ｉ）生理活性物質を水性溶媒に、生分解性高分子を非水性溶媒にそれぞれ溶解し、前記の水性溶媒、非水性溶媒、または水性溶媒と非水性溶媒の両方に界面活性剤をさらに溶解する；
ｉｉ）上記の工程ｉ）の水性溶液および非水性溶液を混合してエマルジョンを形成する；
ｉｉｉ）上記の工程ｉｉ）で形成されたエマルジョンに共溶媒を加える；
ｉｖ）上記の工程ｉｉｉ）のエマルジョンを水性溶媒に加えてマイクロスフェアを形成する；そして
ｖ）有機溶媒を除去する
工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供する。
【００１２】
この明細書では、上記の方法を、「溶媒交流蒸発法」（solvent intra-exchange evaporation）という。
【００１３】
本発明において、生理活性物質は特に限定されないが、黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）同族体のようなペプチド薬物またはこれらの塩から選択されるのが好ましい。
【００１４】
例えば、ＬＨＲＨ同族体のうち、アゴニストはゴセレリン、ロイプロリド、トリプトレリン、ブセレリン、ナファレリンなどを含み、アンタゴニストはセトロレリクスを含む。さらに、その他の利用可能なペプチド薬物はオクトレオチドなどを含む。
【００１５】
ＬＨＲＨ同族体のアゴニストは、それが投与されたとき、脳下垂体に作用して黄体形成ホルモンの分泌を抑制（アゴニストは初期には分泌を促進するが、それが持続的に放出されたときには分泌を抑制する）することにより、性ホルモン−テストステロンおよびエストロゲン−の分泌を抑制するペプチド分子である。
その結果として、ＬＨＲＨ同族体のアゴニストは、ホルモン−センシティブである前立腺癌、乳癌、子宮内膜症などに対して治療効果を有する。
【００１６】
本発明において、生理活性物質は、マイクロスフェアの全重量に対して、１．０〜３０重量％、好ましくは２．０〜２０重量％、より好ましくは３．０〜１５重量％の量で含まれ得る。生理活性物質が１．０重量％未満であると、投与されるマイクロスフェアの量が注射するには多くなりすぎ、あるいは注射時に問題が生じるおそれがある。生理活性物質の量が３０重量％を超えると、初期の過多放出を抑制するのが困難となる。
本発明において、工程ｉ）で生理活性物質を溶解するのに用いられる水性溶媒は注射用の水である。
【００１７】
本発明では、上記の工程ｉ）の水性溶媒および／または非水性溶媒に界面活性剤が加えられる。使用可能な界面活性剤は、ポリソルベート、スパン８０、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、トコフェロールなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、界面活性剤は前記の水性溶液および非水性溶液の全重量、１００重量部に対して、０.０１〜５.０重量部の量で添加され得る。界面活性剤の量が０．０１重量部未満であると、界面活性剤の効果が低下するため、エマルジョンの形成に問題が生じるおそれがある。界面活性剤の量が５．０重量部を超えると、大量の界面活性剤が注射部位に皮膚発赤や掻痒感のような局所的な副作用を引き起こすおそれがある。
【００１９】
本発明でマイクロスフェアの製造に通常用いられる生分解性の高分子は、制限なしに用いることができる。生分解性の高分子は、例えばポリラクチド、ポリグリコライド、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコライド）グルコースを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明では、６００００以下の重量平均分子量を有する生分解性高分子が用いられ得る。例えば、約１３０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）；約３３０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）；約５２０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）、約２００００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（７５：２５）、約１６０００の分子量を有するポリ（ラクチド）（１００：０）などが用いられ得る。そのような生分解性高分子は、例えば、ベーリンガー・インゲルハイム社製のＲｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ５０２Ｈ、ＲＧ５０３Ｈ、ＲＧ５０４Ｈ、ＲＧ７５２Ｈ、ＲＧ７５２ＳおよびＲ２０２Ｈを含む。
【００２１】
本発明では、生分解性高分子は０．１〜０．７ｄＬ／ｇの固有粘度を有していてもよい。本発明において、生分解性高分子の固有粘度が０．１ｄＬ／ｇ未満であると、生理活性物質の持続的な放出を所望の時間にわたって調節するには、高分子の分解が早過ぎる。生分解性高分子の固有粘度が０．７ｄＬ／ｇを超えると、高分子の分解が遅過ぎて、生理活性物質の放出量が少なくなるため、薬効が示されないおそれがある。
【００２２】
本発明では、生分解性の高分子は、マイクロスフェアの全重量に対して、７０．０〜９９．０重量％、好ましくは８０．０〜９８．０重量％、より好ましくは８５．０〜９７．０重量％の量で含まれ得る。
【００２３】
本発明で、マイクロスフェアに含まれる生分解性高分子の量が７０．０重量％未満であると、マイクロスフェア中の生理活性物質の相対的な量が増えるため、初期過多放出が抑制されないとか、あるいは所望の期間にわたって薬効が持続されないという問題がある。
また、マイクロスフェア中に含まれる生分解性高分子の量が９９．０重量％を超えると、患者に注射されるべきマイクロスフェアの量が多くなり、注射が困難となるか、または不可能になるおそれさえある。
【００２４】
本発明の前記の工程ｉ）において、生分解性高分子を溶解するのに用いられる非水性溶媒は、生分解性高分子を溶解でき、前記の工程ｉｉｉ）で添加される共溶媒と混和し得るものである限り、特に限定されない。例えば、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド、酢酸エチルなどが用いられ得る。
【００２５】
本発明において、前記の工程ｉｉｉ）で添加される共溶媒は、前記の工程ｉ）で用いられる水性および非水性の溶媒と混和し得るものであり、生理活性物質の溶解度が低く、製造工程中に残留する溶媒を容易に除去できるように低い沸点を有するものが好ましい。
【００２６】
本発明における共溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸、アセトニトリルおよびこれらの混合溶媒を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明において、共溶媒は、前記の工程ｉ）で用いられる溶媒、すなわち水性溶媒および非水性溶媒の全重量、１００重量部に対して、１．０〜２０重量部、好ましくは５．０〜１５重量部、より好ましくは５．０〜１０重量部の量で加えられ得る。
加えられる共溶媒の量が１．０重量部未満であると、初期過多放出に対する抑制効果がないおそれがある。加えられる共溶媒の量が２０重量部を超えると、残留溶媒の除去が困難になるおそれがある。
【００２８】
本発明では、共溶媒の添加が、水相内の生理活性物質を析出させることにより、溶媒の蒸発時に生理活性物質の表面への移動を抑制することにより、また生分解性高分子の硬化を助けてエマルジョンを比較的により硬くし、表面の多孔性を低下させることにより、初期の過多放出を成功裡に抑制するものと考えられる。
【００２９】
本発明において、前記の工程ｉｖ）で用いられる水性溶媒としては注射用の水を用いることができ、エマルジョンの分離を抑制するために、これに低粘度の高分子を任意に添加してもよい。この低粘度の高分子の例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、製造されたマイクロスフェアの表面の写真である（前：共溶媒使用前、後：共溶媒使用後）。
【図２】図２は、インビトロ長期溶出試験の結果を示すグラフである（●：実施例５、▲：実施例４、×：比較例）。
【図３】図３は、ゴセレリンの血中濃度の結果を示すグラフである（▲：マイクロスフェアで注射されたラット）。
【図４】図４は、ゴセレリン注射後のテストステロンの濃度変化を示すグラフである（▲：マイクロスフェアで注射されたラットのホルモン濃度、○：マイクロスフェアで注射されていないラットのホルモン濃度、‐‐‐：去勢レベルの濃度）。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。しかしながら、本発明の保護範囲はこれらの実施例に限定されないことが理解されるべきである。
【００３２】
実施例１〜６
酢酸ゴセレリン含有エマルジョンの製造
表１に記載の含量に従って、注射用の水（３７５ｍｇ）に酢酸ゴセレリン（１２０ｍｇ）（スイス、Bachem社製）を加えた後、撹拌・溶解して澄明な水相を得た。生分解性高分子としてのＲＧ５０２Ｈ（１,２５０ｍｇ）およびＲＧ５０３Ｈ（６３０ｍｇ）（ベーリンガーインゲルハイム社製)、スパン８０（５．０ｍｇ）（メルク社製）および塩化メチレン（５，０００ｍｇ）（メルク社製）を、激しく撹拌して溶解し、これを上記の水相に加え、激しく撹拌してエマルジョンを形成した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
共溶媒の種類によるマイクロスフェアの製造
表２に記載の含量に従って、共溶媒を上記で得られたエマルジョンにそれぞれ加え、激しく撹拌した。得られた溶液を、Ｌ４Ｒミキサー（英国、Silverson社製、）により激しく撹拌中の０．５％ポリビニルアルコール（５００ｍＬ）（Ｍｎ＝３０，０００〜７０，０００、シグマ社製）溶液に２５℃でゆっくり注入した。１０分後、温度を４０℃に上げ、撹拌速度を下げて、添加された有機溶媒を２時間で蒸発させた。温度を２５℃に下げ、３０分間放冷した後、５．０μｍ フィルタ（材質：ＳＶＬＰ、ミリポア社製）を用いて真空ろ過した。次いで、蒸留水で数回洗浄し、７２時間凍結乾燥して、マイクロスフェアを得た。
【００３５】
【表２】
【００３６】
比較例１
前記の実施例で製造された酢酸ゴセレリン含有エマルジョンに共溶媒を添加しない点を除いて、実施例１〜６と同じ方法に従ってマイクロスフェアを製造した。
【００３７】
比較例２
市販の酢酸ゴセレリンのインプラント製剤（Zoladex（商標）、アストラゼネカ社製）を、同じ条件で、本発明のマイクロスフェアと比較した。
【００３８】
試験例１
マイクロスフェア形態の観察
マイクロスフェアの表面を観察するために、マイクロスフェア約１０ｍｇをアルミニウムのスタブ（stub）に固定し、真空度０．１torrおよび高電圧（１０kV）下で３分間、パラジウムでコーティングした。白金で被覆されたマイクロスフェアを、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Hitachi S-4800 FE-SEM）にインストールし、イメージ分析プログラムを用いて、マイクロスフェアの表面を観察した。
結果を図１に示す。その結果から、共溶媒を用いることにより、表面の多孔性が相対的に減少していることが分かる。
【００３９】
試験例２
マイクロスフェアのゴセレリン封入率
マイクロスフェア約１００ｍｇをジメチルホルムアミド（メルク社製 ）２５ｍＬ中に完全に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルタでろ過した。マイクロスフェア内に封入されているゴセレリンの含量を、次の条件でＨＰＬＣにより測定した。
カラム：ＹＭＣ Ｃ１８ ＯＤＳ ５μｍ、４．６×５０ｍｍ
注入量：１０μＬ
検出波長：２８０ｎｍ
移動相：リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ３．０）
結果を表３に示す。その結果から、当初の添加量に基づいて約９０％以上のゴセレリンがマイクロスフェア中に十分に封入されていることが分かる。
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験例３
マイクロスフェアのインビトロ長期溶出試験
マイクロスフェア約５０ｍｇを５０ｍＬ試験管に入れた後、これに５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）を加え、３９℃で培養した。１、３、７、１４、２１および２８日目に上澄液を採取し、マイクロスフェアから溶出するゴセレリンの量をＨＰＬＣにより測定した。その測定結果を表４および図２に示す。
その測定結果から、共溶媒を添加したマイクロスフェアの初期溶出率が、共溶媒を添加しないマイクロスフェアの溶出率の半分以下に低下していることが分かる。また、本発明のマイクロスフェアは、低い初期溶出率を有する比較例２のインプラント製剤と同程度に初期過多放出を抑制していることが分かる。
【００４２】
【表４】
【００４３】
試験例４
マイクロスフェアのインビボ試験
製剤化されたゴセレリンを懸濁液１．５ｍＬに希釈し、ゴセレリン（１００μｇ／ｋｇ）を１０匹のラットに皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した。注射後、６時間、１、２、４、７、１４、２１および２８日目に、血液試料約１．５ｍＬを採取した。採取した血液を遠心分離して、上澄液から血漿を得た。血漿中のゴセレリンの濃度および性ホルモン濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびテストステロンＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ）を用いて測定した。
その測定結果を図３および４に示す。その結果から、本発明により製造されたマイクロスフェアは、薬物を血中に持続的に放出し、かつホルモンの濃度も標準レベル以下に維持されていることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の長期間放出を調節し得る徐放性マイクロスフェアの製造方法に関する。
さらに詳しくは、本発明は、生分解性高分子を含む担体に薬物を封入したマイクロスフェアの製造法として、共溶媒を用いた溶媒交流蒸発法を採用することによって、生理活性物質の初期過多放出を抑制して、体内で生理活性物質が持続的、かつ均一に放出されるようにした、徐放性マイクロスフェアの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、徐放性注射製剤の一般的な製造方法として、コアセルベーション法、溶融押出法、噴霧乾燥法および溶媒蒸発法などが知られている。これらの方法のうち、二重エマルジョン溶媒蒸発法（Ｗ／Ｏ／Ｗ；水／油／水型）と単一エマルジョン溶媒蒸発法（Ｏ／Ｗ；油／水型）とに分類される溶媒蒸発法が、一般的に使われてきた。
このような徐放性注射製剤を改善するために、薬物封入効率の向上、製造工程の単純化および初期過多放出の低減のような、多くの試みが行われてきた。
【０００３】
韓国特許出願２００３−００２３１３０号は、生分解性高分子と薬物を溶媒に溶解する工程、噴霧乾燥法を用いて溶液を一定流量で噴霧する工程、および減圧下に乾燥する工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法を開示している。
しかしながら、この発明は、高価な噴霧乾燥機の設置費用、設備の無菌処理および生理活性物質の初期過多放出のような短所を有していた。
【０００４】
韓国特許出願２００４−７００９９９９号は、浸透圧調節剤を加えてマイクロスフェア内への薬物封入を増大させ、マイクロスフェアの分散性を改善する、マイクロスフェアの製造方法を開示している。
しかしながら、この発明は、薬物の過剰封入により引き起こされるマイクロスフェア表面に分布する薬物量の増加による初期過多放出という短所を依然として有している。
【０００５】
韓国特許第４０９４１３号は、水中乾燥法によりマイクロカプセルを製造した後、得られたマイクロカプセルを生分解性高分子のガラス転移温度以上の温度で加熱乾燥して、生理活性物質の初期過多放出を抑制し、残存有機溶媒を最小化する方法を開示している。
しかしながら、この発明は、生理活性物質が熱変性されるという短所を有している。
【０００６】
米国特許第５３６６７３４号は、薬物と生分解性高分子との混合物をインプラントの形態に固形化し、該インプラントをコーティングして、連続投与用の医薬活性ペプチド製剤を製造する方法を開示している。
しかしながら、このようなインプラントは大きすぎるため、皮下注射用の注射針のサイズを大きくしなければならない。その結果、患者に恐怖感を与え、また注射時の疼痛ゆえに局所麻酔を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものである。本発明により解決されるべき技術的な課題は、従来技術の有する問題がなく、かつ生理活性物質の初期過多放出を効率よく抑制する徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明は、生理活性物質および生分解性高分子を含むエマルジョンに共溶媒を加えた後、該エマルジョンを水性溶液に加えることを含む、生理活性物質の初期過多放出に対して優れた抑制効果を有する徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供する。
また、本発明は、上記の製造方法によって製造される徐放性マイクロスフェアを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、生理活性物質、特にペプチドまたはその塩を含む徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供するものであり、この方法では製造工程中に除去され得る共溶媒を加えることにより、初期過多放出を抑制することができ、その他の添加剤や工程を必要としない。
【００１０】
さらに、本発明で用いられる共溶媒は、溶媒除去工程を経て完全に除去されるため、本発明は、人体に安全で優れた初期過多放出抑制効果を有する徐放性のマイクロスフェアを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、
ｉ）生理活性物質を水性溶媒に、生分解性高分子を非水性溶媒にそれぞれ溶解し、前記の水性溶媒、非水性溶媒、または水性溶媒と非水性溶媒の両方に界面活性剤をさらに溶解する；
ｉｉ）上記の工程ｉ）の水性溶液および非水性溶液を混合してエマルジョンを形成する；
ｉｉｉ）上記の工程ｉｉ）で形成されたエマルジョンに共溶媒を加える；
ｉｖ）上記の工程ｉｉｉ）のエマルジョンを水性溶媒に加えてマイクロスフェアを形成する；そして
ｖ）有機溶媒を除去する
工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法を提供する。
【００１２】
この明細書では、上記の方法を、「溶媒交流蒸発法」（solvent intra-exchange evaporation）という。
【００１３】
本発明において、生理活性物質は特に限定されないが、黄体形成ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）同族体のようなペプチド薬物またはこれらの塩から選択されるのが好ましい。
【００１４】
例えば、ＬＨＲＨ同族体のうち、アゴニストはゴセレリン、ロイプロリド、トリプトレリン、ブセレリン、ナファレリンなどを含み、アンタゴニストはセトロレリクスを含む。さらに、その他の利用可能なペプチド薬物はオクトレオチドなどを含む。
【００１５】
ＬＨＲＨ同族体のアゴニストは、それが投与されたとき、脳下垂体に作用して黄体形成ホルモンの分泌を抑制（アゴニストは初期には分泌を促進するが、それが持続的に放出されたときには分泌を抑制する）することにより、性ホルモン−テストステロンおよびエストロゲン−の分泌を抑制するペプチド分子である。
その結果として、ＬＨＲＨ同族体のアゴニストは、ホルモン−センシティブである前立腺癌、乳癌、子宮内膜症などに対して治療効果を有する。
【００１６】
本発明において、生理活性物質は、マイクロスフェアの全重量に対して、１．０〜３０重量％、好ましくは２．０〜２０重量％、より好ましくは３．０〜１５重量％の量で含まれ得る。生理活性物質が１．０重量％未満であると、投与されるマイクロスフェアの量が注射するには多くなりすぎ、あるいは注射時に問題が生じるおそれがある。生理活性物質の量が３０重量％を超えると、初期の過多放出を抑制するのが困難となる。
本発明において、工程ｉ）で生理活性物質を溶解するのに用いられる水性溶媒は注射用の水である。
【００１７】
本発明では、上記の工程ｉ）の水性溶媒および／または非水性溶媒に界面活性剤が加えられる。使用可能な界面活性剤は、ポリソルベート、スパン８０、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、トコフェロールなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、界面活性剤は前記の水性溶液および非水性溶液の全重量、１００重量部に対して、０.０１〜５.０重量部の量で添加され得る。界面活性剤の量が０．０１重量部未満であると、界面活性剤の効果が低下するため、エマルジョンの形成に問題が生じるおそれがある。界面活性剤の量が５．０重量部を超えると、大量の界面活性剤が注射部位に皮膚発赤や掻痒感のような局所的な副作用を引き起こすおそれがある。
【００１９】
本発明でマイクロスフェアの製造に通常用いられる生分解性の高分子は、制限なしに用いることができる。生分解性の高分子は、例えばポリラクチド、ポリグリコライド、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコライド）グルコースを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明では、６００００以下の重量平均分子量を有する生分解性高分子が用いられ得る。例えば、約１３０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）；約３３０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）；約５２０００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（５０：５０）、約２００００の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（７５：２５）、約１６０００の分子量を有するポリ（ラクチド）（１００：０）などが用いられ得る。そのような生分解性高分子は、例えば、ベーリンガー・インゲルハイム社製のＲｅｓｏｍｅｒ（商標）ＲＧ５０２Ｈ、ＲＧ５０３Ｈ、ＲＧ５０４Ｈ、ＲＧ７５２Ｈ、ＲＧ７５２ＳおよびＲ２０２Ｈを含む。
【００２１】
本発明では、生分解性高分子は０．１〜０．７ｄＬ／ｇの固有粘度を有していてもよい。本発明において、生分解性高分子の固有粘度が０．１ｄＬ／ｇ未満であると、生理活性物質の持続的な放出を所望の時間にわたって調節するには、高分子の分解が早過ぎる。生分解性高分子の固有粘度が０．７ｄＬ／ｇを超えると、高分子の分解が遅過ぎて、生理活性物質の放出量が少なくなるため、薬効が示されないおそれがある。
【００２２】
本発明では、生分解性の高分子は、マイクロスフェアの全重量に対して、７０．０〜９９．０重量％、好ましくは８０．０〜９８．０重量％、より好ましくは８５．０〜９７．０重量％の量で含まれ得る。
【００２３】
本発明で、マイクロスフェアに含まれる生分解性高分子の量が７０．０重量％未満であると、マイクロスフェア中の生理活性物質の相対的な量が増えるため、初期過多放出が抑制されないとか、あるいは所望の期間にわたって薬効が持続されないという問題がある。
また、マイクロスフェア中に含まれる生分解性高分子の量が９９．０重量％を超えると、患者に注射されるべきマイクロスフェアの量が多くなり、注射が困難となるか、または不可能になるおそれさえある。
【００２４】
本発明の前記の工程ｉ）において、生分解性高分子を溶解するのに用いられる非水性溶媒は、生分解性高分子を溶解でき、前記の工程ｉｉｉ）で添加される共溶媒と混和し得るものである限り、特に限定されない。例えば、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド、酢酸エチルなどが用いられ得る。
【００２５】
本発明において、前記の工程ｉｉｉ）で添加される共溶媒は、前記の工程ｉ）で用いられる水性および非水性の溶媒と混和し得るものであり、生理活性物質の溶解度が低く、製造工程中に残留する溶媒を容易に除去できるように低い沸点を有するものが好ましい。
【００２６】
本発明における共溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸、アセトニトリルおよびこれらの混合溶媒を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明において、共溶媒は、前記の工程ｉ）で用いられる溶媒、すなわち水性溶媒および非水性溶媒の全重量、１００重量部に対して、１．０〜２０重量部、好ましくは５．０〜１５重量部、より好ましくは５．０〜１０重量部の量で加えられ得る。
加えられる共溶媒の量が１．０重量部未満であると、初期過多放出に対する抑制効果がないおそれがある。加えられる共溶媒の量が２０重量部を超えると、残留溶媒の除去が困難になるおそれがある。
【００２８】
本発明では、共溶媒の添加が、水相内の生理活性物質を析出させることにより、溶媒の蒸発時に生理活性物質の表面への移動を抑制することにより、また生分解性高分子の硬化を助けてエマルジョンを比較的により硬くし、表面の多孔性を低下させることにより、初期の過多放出を成功裡に抑制するものと考えられる。
【００２９】
本発明において、前記の工程ｉｖ）で用いられる水性溶媒としては注射用の水を用いることができ、エマルジョンの分離を抑制するために、これに低粘度の高分子を任意に添加してもよい。この低粘度の高分子の例は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、製造されたマイクロスフェアの表面の写真である（前：共溶媒使用前、後：共溶媒使用後）。
【図２】図２は、インビトロ長期溶出試験の結果を示すグラフである（●：実施例５、▲：実施例４、×：比較例）。
【図３】図３は、ゴセレリンの血中濃度の結果を示すグラフである（▲：マイクロスフェアで注射されたラット）。
【図４】図４は、ゴセレリン注射後のテストステロンの濃度変化を示すグラフである（▲：マイクロスフェアで注射されたラットのホルモン濃度、○：マイクロスフェアで注射されていないラットのホルモン濃度、‐‐‐：去勢レベルの濃度）。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。しかしながら、本発明の保護範囲はこれらの実施例に限定されないことが理解されるべきである。
【００３２】
実施例１〜６
酢酸ゴセレリン含有エマルジョンの製造
表１に記載の含量に従って、注射用の水（３７５ｍｇ）に酢酸ゴセレリン（１２０ｍｇ）（スイス、Bachem社製）を加えた後、撹拌・溶解して澄明な水相を得た。生分解性高分子としてのＲＧ５０２Ｈ（１,２５０ｍｇ）およびＲＧ５０３Ｈ（６３０ｍｇ）（ベーリンガーインゲルハイム社製)、スパン８０（５．０ｍｇ）（メルク社製）および塩化メチレン（５，０００ｍｇ）（メルク社製）を、激しく撹拌して溶解し、これを上記の水相に加え、激しく撹拌してエマルジョンを形成した。
【００３３】
【表１】
【００３４】
共溶媒の種類によるマイクロスフェアの製造
表２に記載の含量に従って、共溶媒を上記で得られたエマルジョンにそれぞれ加え、激しく撹拌した。得られた溶液を、Ｌ４Ｒミキサー（英国、Silverson社製、）により激しく撹拌中の０．５％ポリビニルアルコール（５００ｍＬ）（Ｍｎ＝３０，０００〜７０，０００、シグマ社製）溶液に２５℃でゆっくり注入した。１０分後、温度を４０℃に上げ、撹拌速度を下げて、添加された有機溶媒を２時間で蒸発させた。温度を２５℃に下げ、３０分間放冷した後、５．０μｍ フィルタ（材質：ＳＶＬＰ、ミリポア社製）を用いて真空ろ過した。次いで、蒸留水で数回洗浄し、７２時間凍結乾燥して、マイクロスフェアを得た。
【００３５】
【表２】
【００３６】
比較例１
前記の実施例で製造された酢酸ゴセレリン含有エマルジョンに共溶媒を添加しない点を除いて、実施例１〜６と同じ方法に従ってマイクロスフェアを製造した。
【００３７】
比較例２
市販の酢酸ゴセレリンのインプラント製剤（Zoladex（商標）、アストラゼネカ社製）を、同じ条件で、本発明のマイクロスフェアと比較した。
【００３８】
試験例１
マイクロスフェア形態の観察
マイクロスフェアの表面を観察するために、マイクロスフェア約１０ｍｇをアルミニウムのスタブ（stub）に固定し、真空度０．１torrおよび高電圧（１０kV）下で３分間、パラジウムでコーティングした。白金で被覆されたマイクロスフェアを、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Hitachi S-4800 FE-SEM）にインストールし、イメージ分析プログラムを用いて、マイクロスフェアの表面を観察した。
結果を図１に示す。その結果から、共溶媒を用いることにより、表面の多孔性が相対的に減少していることが分かる。
【００３９】
試験例２
マイクロスフェアのゴセレリン封入率
マイクロスフェア約１００ｍｇをジメチルホルムアミド（メルク社製 ）２５ｍＬ中に完全に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルタでろ過した。マイクロスフェア内に封入されているゴセレリンの含量を、次の条件でＨＰＬＣにより測定した。
カラム：ＹＭＣ Ｃ１８ ＯＤＳ ５μｍ、４．６×５０ｍｍ
注入量：１０μＬ
検出波長：２８０ｎｍ
移動相：リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ３．０）
結果を表３に示す。その結果から、当初の添加量に基づいて約９０％以上のゴセレリンがマイクロスフェア中に十分に封入されていることが分かる。
【００４０】
【表３】
【００４１】
試験例３
マイクロスフェアのインビトロ長期溶出試験
マイクロスフェア約５０ｍｇを５０ｍＬ試験管に入れた後、これに５０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）を加え、３９℃で培養した。１、３、７、１４、２１および２８日目に上澄液を採取し、マイクロスフェアから溶出するゴセレリンの量をＨＰＬＣにより測定した。その測定結果を表４および図２に示す。
その測定結果から、共溶媒を添加したマイクロスフェアの初期溶出率が、共溶媒を添加しないマイクロスフェアの溶出率の半分以下に低下していることが分かる。また、本発明のマイクロスフェアは、低い初期溶出率を有する比較例２のインプラント製剤と同程度に初期過多放出を抑制していることが分かる。
【００４２】
【表４】
【００４３】
試験例４
マイクロスフェアのインビボ試験
製剤化されたゴセレリンを懸濁液１．５ｍＬに希釈し、ゴセレリン（１００μｇ／ｋｇ）を１０匹のラットに皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した。注射後、６時間、１、２、４、７、１４、２１および２８日目に、血液試料約１．５ｍＬを採取した。採取した血液を遠心分離して、上澄液から血漿を得た。血漿中のゴセレリンの濃度および性ホルモン濃度を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびテストステロンＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ）を用いて測定した。
その測定結果を図３および４に示す。その結果から、本発明により製造されたマイクロスフェアは、薬物を血中に持続的に放出し、かつホルモンの濃度も標準レベル以下に維持されていることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）生理活性物質を水性溶媒に、生分解性高分子を非水性溶媒にそれぞれ溶解し、前記の水性溶媒、非水性溶媒、または水性溶媒と非水性溶媒の両方に界面活性剤をさらに溶解する；
ｉｉ）上記の工程ｉ）の水性溶液および非水性溶液を混合してエマルジョンを形成する；
ｉｉｉ）上記の工程ｉｉ）で形成されたエマルジョンに共溶媒を加える；
ｉｖ）上記の工程ｉｉｉ）のエマルジョンを水性溶媒に加えてマイクロスフェアを形成する；そして
ｖ）有機溶媒を除去する
工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法。
【請求項２】
共溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸およびアセトニトリルからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共溶媒が、工程ｉ）の水性溶媒および非水性溶媒１００重量部に対して、１．０〜２０重量部の量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生理活性物質が、ゴセレリン、ロイプロリド、トリプトレリン、ブセレリン、オクトレオチドおよびセトロレリクスまたはそれらの塩から選択される１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生理活性物質の含量が、マイクロスフェアの全重量に対して、１．０〜３０重量％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生分解性高分子が、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコライド）グルコースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生分解性高分子の固有粘度が、０．１〜０．７ｄＬ／ｇである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生分解性高分子の含量が、マイクロスフェアの全重量に対して、７０．０〜９９.０重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤が、ポリソルベート、スパン、ポロキサマー、ポリエチレングリコールおよびトコフェロールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が、工程ｉ）の水性溶媒および非水性溶媒１００重量部に対して、０．０１〜５．０重量部の量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により製造される徐放性マイクロスフェア。
【請求項１】
ｉ）生理活性物質を水性溶媒に、生分解性高分子を非水性溶媒にそれぞれ溶解し、前記の水性溶媒、非水性溶媒、または水性溶媒と非水性溶媒の両方に界面活性剤をさらに溶解する；
ｉｉ）上記の工程ｉ）の水性溶液および非水性溶液を混合してエマルジョンを形成する；
ｉｉｉ）上記の工程ｉｉ）で形成されたエマルジョンに共溶媒を加える；
ｉｖ）上記の工程ｉｉｉ）のエマルジョンを水性溶媒に加えてマイクロスフェアを形成する；そして
ｖ）有機溶媒を除去する
工程を含む、徐放性マイクロスフェアの製造方法。
【請求項２】
共溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸およびアセトニトリルからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共溶媒が、工程ｉ）の水性溶媒および非水性溶媒１００重量部に対して、１．０〜２０重量部の量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生理活性物質が、ゴセレリン、ロイプロリド、トリプトレリン、ブセレリン、オクトレオチドおよびセトロレリクスまたはそれらの塩から選択される１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生理活性物質の含量が、マイクロスフェアの全重量に対して、１．０〜３０重量％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生分解性高分子が、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコライド）グルコースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生分解性高分子の固有粘度が、０．１〜０．７ｄＬ／ｇである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生分解性高分子の含量が、マイクロスフェアの全重量に対して、７０．０〜９９.０重量％である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤が、ポリソルベート、スパン、ポロキサマー、ポリエチレングリコールおよびトコフェロールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
界面活性剤が、工程ｉ）の水性溶媒および非水性溶媒１００重量部に対して、０．０１〜５．０重量部の量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により製造される徐放性マイクロスフェア。
【図２】
【図３】
【図４】
【図１】
【図３】
【図４】
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５０１３２１（Ｐ２０１２−５０１３２１Ａ）
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２４９０４（Ｐ２０１１−５２４９０４）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４８２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２４６１５
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５０１２４１７２６）ドン クック ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (3)
【住所又は居所原語表記】９９７−８ Ｄａｅｃｈｉ ３−ｄｏｎｇ，Ｋａｎｇｎａｍ−ｋｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４８２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２４６１５
【国際公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（５０１２４１７２６）ドン クック ファーマシューティカル カンパニー リミテッド (3)
【住所又は居所原語表記】９９７−８ Ｄａｅｃｈｉ ３−ｄｏｎｇ，Ｋａｎｇｎａｍ−ｋｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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