澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用プライマー
【課題】澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用プライマーセット等を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列で表される４種または５種のポリヌクレオチドまたはそれぞれの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット。
【解決手段】特定の塩基配列で表される４種または５種のポリヌクレオチドまたはそれぞれの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用プライマーに関し、より詳細には、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェ、すなわち、サッカロミセス・セレビシェの変種ディアスタティカス（Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus）（本明細書において単に「サッカロミセス・ディアスタティカス」と表記することがある）は、ＳＴＡ１等の遺伝子によってコードされるグルコアミラーゼ遺伝子を生産し、澱粉の側鎖をグルコースに分解して発酵することが出来る（Pretorius, I. S. et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, 53-76, 1991）。AndrewsおよびGilliland（J. Inst. Brew., 58,189, 1952）は、麦汁のデキストリンを発酵性糖に変換して、その糖を発酵する酵母株を分離し、その株をサッカロミセス・ディアスタティカスという菌種に分類した。サッカロミセス・セレビシェとサッカロミセス・ディアスタティカスはかなり近縁な関係にあり、胞子形成可能な交雑体を作ることも可能であった（Tamaki, H., Mol. Gen. Genet., 164, 205, 1978）。サッカロミセス・ディアスタティカスは、現在ではサッカロミセス・セレビシェの中に分類されている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands）。
【０００３】
この菌株がビールに汚染すると、ビール中の残エキス（低分子量、あるいは高分子量のデキストリン）を消費して過剰に発酵し、製品中の混濁や沈殿物形成の原因となる。サッカロミセス・ディアスタティカスは全てのビールで製品の発酵度に関係なく増殖するため、強力なビール混濁菌に格付けされている（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００４】
伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、サッカロミセス・セレビシェとサッカロミセス・ディアスタティカスは表現型的に互いに非常に似通っているため、デキストリン資化性以外に区別できない（Barnett, J.A. et al.：Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK）。
【０００５】
山内らはサッカロミセス・ディアスタティカスを検出するＰＣＲプライマーを報告している（特開平９−２９９０９０号公報（特許文献１））。サッカロミセス・ディアスタティカスのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１は、サッカロミセス・セレビシェにおいては異なる位置にある３つのＤＮＡ領域（Ｓ２、Ｓ１、ＳＧＡ）が進化の過程で融合したと考えられており、それぞれの領域には酵素分泌のためのシグナル配列、スレオニンとセリンを多く含むＴＳ領域、およびサッカロミセス・セレビシェのグルコアミラーゼの触媒領域とほとんど同じ配列がコードされている（Yamashita, I. et al., J. Bacteriol., 169, 2142-2149, 1987（非特許文献１）)。特開平９−２９９０９０号公報（特許文献１）におけるＰＣＲプライマーは、サッカロミセス・ディアスタティカスのＳＴＡ１遺伝子がＳ２−Ｓ１−ＳＧＡの構造をとり、Ｓ２、Ｓ１に相当する領域とＳＧＡに相当する領域が隣接するが、サッカロミセス・セレビシェでは分離して存在する性質を利用し、ＰＣＲ用プライマーの一つをＳ１およびＳ２に相当する領域に、もう一つをＳＧＡに相当する領域に設定された。
【０００６】
しかし、ＰＣＲは高度な温度制御が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。
【０００７】
これまでにサッカロミセス属酵母検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献２））、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。また、サッカロミセス・ディアスタティカスをサッカロミセス・セレビシェ、あるいはその近縁種の集団であるSaccharomyces sensu strictoの菌株から区別するＬＡＭＰ法プライマーセットは、これまでに報告されていない。
【特許文献１】特開平９−２９９０９０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【非特許文献１】Yamashita, I. et al., J. Bacteriol., 169, 2142-2149, 1987
【発明の概要】
【０００８】
本発明者は、サッカロミセス・ディアスタティカスのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１（accession No. X02649）のＳ２およびＳ１に相当する領域についてＬＡＭＰ法プライマーセットを設計することにより、ＳＧＡに相当する領域を含まなくとも、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に識別できるＬＡＭＰ法プライマーセットを開発することに成功した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明は、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に識別できるプライマーおよびプライマーセットを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明によれば、また、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出方法が提供される。
【００１２】
本発明によるプライマーセットによれば、極めて高い検出感度で、サッカロミセス・ディアスタティカスを菌種あるいは変種レベルで正確に識別することができる。また、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス・ディアスタティカスを、菌種あるいは変種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、また、試料中の菌体数を測定することができる。従って、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に定量することができる。
【００１４】
サッカロミセス・ディアスタティカスは、酒類など各種飲料の品質に影響する原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１５】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるプライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００１６】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００１７】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００１８】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００１９】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２０】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２２】
具体的には、本発明によるプライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２３】
本発明では、配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーとして用いることができる。
【００２４】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００２５】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００２６】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも３８塩基（例えば、３８〜５７塩基）とすることができる。また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２５塩基）とすることができる。
【００２７】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００２８】
配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３８個（３８〜４９個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも２０個（２０〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３８個（３８〜４５個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で４９塩基とすることができる）
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも２０個（２０〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも２０個（２０〜２５個）、より好ましくは、２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２７塩基とすることができる）
【００２９】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、配列番号１〜５の塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００３１】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００３２】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００３３】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００３４】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。より具体的には、以下の通りである。
【００３５】
本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・ディアスタティカスの存在を示す、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出方法が提供される。
【００３６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００３７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００３８】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００３９】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、サッカロミセス・ディアスタティカスの定量方法が提供される。
【００４０】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの定量方法が提供される。
【００４１】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【００４２】
本発明によるプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によるプライマーセットと、場合によっては他のサッカロミセス属酵母用プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される。
【００４３】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明によるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施すると、各種飲料の品質に影響を与えるサッカロミセス・ディアスタティカスを菌種あるいは変種レベルで正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００４５】
サッカロミセス・ディアスタティカスは、ビールおよび発泡酒の製造工程および最終製品の品質に影響する能力を持つ酵母種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【００４６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【００４７】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００４８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００４９】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００５０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００５１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００５２】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００５３】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００５４】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００５５】
これらをＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００５６】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００５７】
まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、サッカロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１：サッカロミセス・ディアスタティカスの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
【００６０】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
下記のサッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［サッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーセット（ＳＴＡ２ＬＦ１）］
FIP：GAGGAGGATCCTCTAGGAACTAGTGCTTCTACTCGCTTATTTGGTCCTT （配列番号１）
F3：CATATACGCACACTATGCAAAGAC （配列番号２）
BIP：GCAACATCACTTCCTCCGGTCCGACAGTAGTGCCAGTAGAAAAGC （配列番号３）
B3：GGGTATTTGGATGATGATGGAGT （配列番号４）
LF：CCAAAGCTGAGTTAAATAGAAGCGA （配列番号５）
【００６１】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
【００６２】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００６３】
（ｅ）プライマーの評価
サッカロミセス・ディアスタティカスに対して作成した特異的プライマーについてSaccharomyces sensu strictoの各菌種を含むサッカロミセス属酵母標準株を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。結果は表１〜４に示される通りであった。
表１：各種サッカロミセス属酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
表３：各種ビール醸造用酵母、ビール醸造所分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
表４：ワイン分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表４】
【００６４】
ＳＴＡ２ＬＦ１プライマーを用いた場合はサッカロミセス・ディアスタティカスと反応させた時のみに、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた（表１）。また、プライマーが検出対象にしている菌株と反応した場合に、反応開始から６０分以内に増幅が起こり、反応チューブ内の濁度が上昇した（図１）。
【００６５】
さらに、ＳＴＡ２ＬＦ１プライマーについて各種酵母標準株、ビール醸造用酵母、ビール工場分離野生酵母、ワイン分離野生酵母株を使用して各プライマーの特異性を評価した所、プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られず、菌種に対する特異性が非常に高いことが分かった（表２、表３、および表４）。
【００６６】
以上により、サッカロミセス・ディアスタティカスに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とする菌種の株を正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーセットを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでサッカロミセス・ディアスタティカスが同定・検出できる。
【００６７】
実施例２：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、寒天平板培地で培養したサッカロミセス・ディアスタティカスの菌体を滅菌水に段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０３ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
【００６８】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似により非常に高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９９９）。これを検量線とすることにより、１０３−１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のサッカロミセス・ディアスタティカスの存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
プライマーの検出限界と検量線の相関係数
検出限界 検量線近似式 検量線相関係数（Ｒ２）
STA2LF1 4.4x103cfu y=629.38x-1.3965 0.999
【００６９】
実施例３：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のサッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）について、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）はｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域を標的としている。
［サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）］
FIP： TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC （配列番号６）
F3： AGACCGATAGCGAACAAGTA （配列番号７）
BIP： CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG （配列番号８）
B3： CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC （配列番号９）
LB： CAAGGATGCTGGCATAATGGTT （配列番号１０）
【００７０】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図２に示される通りであった。
【００７１】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＳＣ１ＬＢ１は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】サッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーセット（ＳＴＡ２ＬＦ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシェＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシェ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図２】サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシェＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシェ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用プライマーに関し、より詳細には、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェの検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェ、すなわち、サッカロミセス・セレビシェの変種ディアスタティカス（Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus）（本明細書において単に「サッカロミセス・ディアスタティカス」と表記することがある）は、ＳＴＡ１等の遺伝子によってコードされるグルコアミラーゼ遺伝子を生産し、澱粉の側鎖をグルコースに分解して発酵することが出来る（Pretorius, I. S. et al., Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26, 53-76, 1991）。AndrewsおよびGilliland（J. Inst. Brew., 58,189, 1952）は、麦汁のデキストリンを発酵性糖に変換して、その糖を発酵する酵母株を分離し、その株をサッカロミセス・ディアスタティカスという菌種に分類した。サッカロミセス・セレビシェとサッカロミセス・ディアスタティカスはかなり近縁な関係にあり、胞子形成可能な交雑体を作ることも可能であった（Tamaki, H., Mol. Gen. Genet., 164, 205, 1978）。サッカロミセス・ディアスタティカスは、現在ではサッカロミセス・セレビシェの中に分類されている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands）。
【０００３】
この菌株がビールに汚染すると、ビール中の残エキス（低分子量、あるいは高分子量のデキストリン）を消費して過剰に発酵し、製品中の混濁や沈殿物形成の原因となる。サッカロミセス・ディアスタティカスは全てのビールで製品の発酵度に関係なく増殖するため、強力なビール混濁菌に格付けされている（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。
【０００４】
伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、サッカロミセス・セレビシェとサッカロミセス・ディアスタティカスは表現型的に互いに非常に似通っているため、デキストリン資化性以外に区別できない（Barnett, J.A. et al.：Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK）。
【０００５】
山内らはサッカロミセス・ディアスタティカスを検出するＰＣＲプライマーを報告している（特開平９−２９９０９０号公報（特許文献１））。サッカロミセス・ディアスタティカスのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１は、サッカロミセス・セレビシェにおいては異なる位置にある３つのＤＮＡ領域（Ｓ２、Ｓ１、ＳＧＡ）が進化の過程で融合したと考えられており、それぞれの領域には酵素分泌のためのシグナル配列、スレオニンとセリンを多く含むＴＳ領域、およびサッカロミセス・セレビシェのグルコアミラーゼの触媒領域とほとんど同じ配列がコードされている（Yamashita, I. et al., J. Bacteriol., 169, 2142-2149, 1987（非特許文献１）)。特開平９−２９９０９０号公報（特許文献１）におけるＰＣＲプライマーは、サッカロミセス・ディアスタティカスのＳＴＡ１遺伝子がＳ２−Ｓ１−ＳＧＡの構造をとり、Ｓ２、Ｓ１に相当する領域とＳＧＡに相当する領域が隣接するが、サッカロミセス・セレビシェでは分離して存在する性質を利用し、ＰＣＲ用プライマーの一つをＳ１およびＳ２に相当する領域に、もう一つをＳＧＡに相当する領域に設定された。
【０００６】
しかし、ＰＣＲは高度な温度制御が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。
【０００７】
これまでにサッカロミセス属酵母検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報（特許文献２））、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。また、サッカロミセス・ディアスタティカスをサッカロミセス・セレビシェ、あるいはその近縁種の集団であるSaccharomyces sensu strictoの菌株から区別するＬＡＭＰ法プライマーセットは、これまでに報告されていない。
【特許文献１】特開平９−２９９０９０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００５／０９３０５９号公報
【非特許文献１】Yamashita, I. et al., J. Bacteriol., 169, 2142-2149, 1987
【発明の概要】
【０００８】
本発明者は、サッカロミセス・ディアスタティカスのグルコアミラーゼ遺伝子ＳＴＡ１（accession No. X02649）のＳ２およびＳ１に相当する領域についてＬＡＭＰ法プライマーセットを設計することにより、ＳＧＡに相当する領域を含まなくとも、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に識別できるＬＡＭＰ法プライマーセットを開発することに成功した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
本発明は、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に識別できるプライマーおよびプライマーセットを提供することを目的とする。
【００１０】
本発明によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド。
【００１１】
本発明によれば、また、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出方法が提供される。
【００１２】
本発明によるプライマーセットによれば、極めて高い検出感度で、サッカロミセス・ディアスタティカスを菌種あるいは変種レベルで正確に識別することができる。また、本発明によるプライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス・ディアスタティカスを、菌種あるいは変種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００１３】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、また、試料中の菌体数を測定することができる。従って、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、サッカロミセス・ディアスタティカスを正確に定量することができる。
【００１４】
サッカロミセス・ディアスタティカスは、酒類など各種飲料の品質に影響する原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１５】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるプライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００１６】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００１７】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００１８】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００１９】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００２０】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
【００２１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００２２】
具体的には、本発明によるプライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００２３】
本発明では、配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーとして用いることができる。
【００２４】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００２５】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００２６】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも３８塩基（例えば、３８〜５７塩基）とすることができる。また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２５塩基）とすることができる。
【００２７】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００２８】
配列番号１〜５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも３８個（３８〜４９個）、より好ましくは、少なくとも４５個（４５〜４９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で５２塩基とすることができる）
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも２０個（２０〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３８個（３８〜４５個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基、より好ましくは最大で４９塩基とすることができる）
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも２０個（２０〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも２０個（２０〜２５個）、より好ましくは、２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２７塩基とすることができる）
【００２９】
相同ポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、配列番号１〜５の塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００３１】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００３２】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００３３】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００３４】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。より具体的には、以下の通りである。
【００３５】
本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・ディアスタティカスの存在を示す、サッカロミセス・ディアスタティカスの検出方法が提供される。
【００３６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００３７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【００３８】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【００３９】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、サッカロミセス・ディアスタティカスの定量方法が提供される。
【００４０】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス・ディアスタティカスの定量方法が提供される。
【００４１】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【００４２】
本発明によるプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によるプライマーセットと、場合によっては他のサッカロミセス属酵母用プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される。
【００４３】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明によるプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施すると、各種飲料の品質に影響を与えるサッカロミセス・ディアスタティカスを菌種あるいは変種レベルで正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビールおよび発泡酒）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００４５】
サッカロミセス・ディアスタティカスは、ビールおよび発泡酒の製造工程および最終製品の品質に影響する能力を持つ酵母種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【００４６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
【００４７】
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【００４８】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【００４９】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【００５０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【００５１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【００５２】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【００５３】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００５４】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００５５】
これらをＬＡＭＰ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００５６】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００５７】
まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法を実施し、サッカロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１：サッカロミセス・ディアスタティカスの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。
【００６０】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
下記のサッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［サッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーセット（ＳＴＡ２ＬＦ１）］
FIP：GAGGAGGATCCTCTAGGAACTAGTGCTTCTACTCGCTTATTTGGTCCTT （配列番号１）
F3：CATATACGCACACTATGCAAAGAC （配列番号２）
BIP：GCAACATCACTTCCTCCGGTCCGACAGTAGTGCCAGTAGAAAAGC （配列番号３）
B3：GGGTATTTGGATGATGATGGAGT （配列番号４）
LF：CCAAAGCTGAGTTAAATAGAAGCGA （配列番号５）
【００６１】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。
【００６２】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
【００６３】
（ｅ）プライマーの評価
サッカロミセス・ディアスタティカスに対して作成した特異的プライマーについてSaccharomyces sensu strictoの各菌種を含むサッカロミセス属酵母標準株を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。結果は表１〜４に示される通りであった。
表１：各種サッカロミセス属酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表１】
表２：各種酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表２】
表３：各種ビール醸造用酵母、ビール醸造所分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
表４：ワイン分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表４】
【００６４】
ＳＴＡ２ＬＦ１プライマーを用いた場合はサッカロミセス・ディアスタティカスと反応させた時のみに、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた（表１）。また、プライマーが検出対象にしている菌株と反応した場合に、反応開始から６０分以内に増幅が起こり、反応チューブ内の濁度が上昇した（図１）。
【００６５】
さらに、ＳＴＡ２ＬＦ１プライマーについて各種酵母標準株、ビール醸造用酵母、ビール工場分離野生酵母、ワイン分離野生酵母株を使用して各プライマーの特異性を評価した所、プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られず、菌種に対する特異性が非常に高いことが分かった（表２、表３、および表４）。
【００６６】
以上により、サッカロミセス・ディアスタティカスに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とする菌種の株を正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーセットを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでサッカロミセス・ディアスタティカスが同定・検出できる。
【００６７】
実施例２：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、寒天平板培地で培養したサッカロミセス・ディアスタティカスの菌体を滅菌水に段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０３ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
【００６８】
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似により非常に高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９９９）。これを検量線とすることにより、１０３−１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のサッカロミセス・ディアスタティカスの存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
プライマーの検出限界と検量線の相関係数
検出限界 検量線近似式 検量線相関係数（Ｒ２）
STA2LF1 4.4x103cfu y=629.38x-1.3965 0.999
【００６９】
実施例３：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のサッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）について、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）はｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域を標的としている。
［サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）］
FIP： TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC （配列番号６）
F3： AGACCGATAGCGAACAAGTA （配列番号７）
BIP： CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG （配列番号８）
B3： CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC （配列番号９）
LB： CAAGGATGCTGGCATAATGGTT （配列番号１０）
【００７０】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図２に示される通りであった。
【００７１】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＳＣ１ＬＢ１は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】サッカロミセス・ディアスタティカス検出用プライマーセット（ＳＴＡ２ＬＦ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシェＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシェ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図２】サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシェＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシェ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、澱粉分解能を持つサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項５】
配列番号１〜５の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基対のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプライマーセット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２７９５１（Ｐ２００９−２７９５１Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９３４６４（Ｐ２００７−１９３４６４）
【出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２５日（２００７．７．２５）
【出願人】（３０７０２７５７７）麒麟麦酒株式会社 (350)
【Ｆターム（参考）】
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