炎症遺伝子活性およびコレステロール生合成の阻害剤
短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の阻害剤として有効な薬剤を同定する方法であって、プロモーター、細胞系およびベクターが上記の方法にて使用される。対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成に関連した状態を防止および／または治療するために同等物を使用する方法を含む、短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）の阻害剤として有効な薬剤を調製および使用する方法。対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成を低下させるのに有効な組成物を含む、短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を阻害剤として有効な薬剤および同等物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を同定する方法であって、アテローム動脈硬化、炎症性腸疾患、腎疾患などの、炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成に関連した状態を防止および／または治療するための薬剤を含む組成物を調製および使用する方法に関する。本発明は炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤に関する。例えば、短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）などの、核受容体の阻害剤に関する。本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関する疾患または状態を防止および／または治療するのに有効な組成物を含む、このような阻害剤を含む組成物に関する。本発明はさらに炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を阻害する薬剤を調製および同定するのに用いられる感染細胞系およびベクターに関する。
【０００２】
（背景技術）
炎症遺伝子発現は増え続ける病状および疾患に関連する。例えば、アテローム動脈硬化、腎および炎症性腸疾患は科学文献にて炎症遺伝子発現と関連付けられている。炎症性疾患に感受性を与えるまたはこれらの疾患の一部によって共有される異常な炎症過程に寄与する共通の遺伝的変異が存在する可能性があると仮定されている。これらの状態を組み合わさった影響が実質的な公衆衛生的な問題を表し、特にこれらの状態の各々が単独でこのような深刻な医学的な問題を表す。
コレステロール生合成経路もまたヒトにて有意な病状と関連付けられる。例えば、アテローム動脈硬化、または動脈硬化は、先進国における全死亡率の半分以上の原因で米国における死因の第１位である。冠動脈に影響する場合（例えば、冠動脈疾患（ＣＨＤ））、大部分の心臓発作の根本原因で鬱血性心不全および不整脈の一般的な原因である。
病理学的過程はごく初期に動脈内膜に沈着した脂質から成る脂肪線条を伴って始まる。泡沫細胞として知られる修飾マクロファージがプラーク領域に蓄積する。これらの泡沫細胞が脂質、特に酸化低比重リポタンパク（ＬＤＬ）を蓄積する。これらのリポタンパクおよびコレステロールエステルは内膜下線維芽細胞によるコラーゲン合成を誘発する。病変が線維性物質で浸潤されると、動脈内腔に突出する。病変自体が動脈を閉塞することは稀であり、むしろ血餅がプラークの先端に形成され、それが通路を閉鎖する。
【０００３】
慢性病変は石灰化して血管の弾性は低下する。この動脈硬化は血流抵抗の増加および血圧の増加を引き起こす。体内のいずれの血管も理論的にはアテローム動脈硬化によって影響されるが、大動脈、冠状動脈、頸動脈および腸骨動脈が最もよく影響される。特定領域の虚血または梗塞は特定の症状および臨床転帰を引き起こす。
高血圧、高コレステロール、低ＨＤＬ（高比重リポタンパク）、喫煙、糖尿病、年齢、性別、運動不足、および心臓疾患の家族歴はアテローム動脈硬化の進行の危険因子である。
アテローム動脈硬化は動態過程であって血漿リポタンパクが低下すればアテローム形成の進行は緩徐となるだろう。いくつかの薬理学的アプローチは高脂血症の根本原因によく依存する。食事療法が第一に行われるが薬物療法の一部として継続されなければならない。
ナイアシン（ニコチン酸）は最も有意にＬＤＬ産生を阻害して血漿ＬＤＬ値を低下させる。肝臓でのコレステロール合成もまた阻害される。ＨＤＬ値はＨＤＬ崩壊の低下によって増加する。血餅タンパクのフィブリノーゲンは低下して「クロットバスター」組織プラスミノーゲンアクチベーターが増加し、共にプラークにおける血餅形成を制限するのに重要であるだろう。
【０００４】
副作用は皮膚の血管拡張および温熱覚、悪心、腹部不快感、皮疹または皮膚乾燥を含む。たとえビタミンであるとしてもコレステロールを低下させる投与量においていくつかの重篤な副作用を有し、それ故ナイアシンを受ける患者は内科医によってモニターされるべきである。
クロフィブレートはトリグリセリドに富むリポタンパクのクリアランスを増加させて間接的に肝臓におけるコレステロール合成を阻害する。最も一般的な副作用は腹部不快感および悪心である。稀に起こる毒性効果として、皮膚炎、肝機能異常、骨髄抑制、および時に男性の性欲減退が挙げられる。
コレスチポールのような胆汁酸結合樹脂は経口摂取される非常に大きな陽イオン交換樹脂である。腸にて、胆汁酸と結合して再吸収を阻害する。結果として胆汁酸の排泄が増加して血漿におけるＬＤＬ値が低下する。最も一般的な副作用は便秘、膨満感、胸焼け、および下痢である。
ネオマイシンはコレステロールの腸内再吸収を阻害する抗生剤でそれによって胆汁酸は血漿ＬＤＬを低下させる。重篤な副作用は低用量のネオマイシンでも生じるだろう。悪心、腹部疝痛、下痢および吸収不良が生じるだろう。また、耐性微生物が増殖して全腸炎（小腸および大腸の炎症）を引き起こすだろう。
【０００５】
スタチンは現在入手可能な最も有効なコレステロールを低下させる薬物である。それらはアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンを含む。それらは血液内のＬＤＬコレステロール（悪玉コレステロールと見なされる）およびトリグリセリドを低下させる一方でＨＤＬコレステロールを増加させる。ＨＤＬコレステロールはコレステロールを崩壊することができる肝臓にコレステロールを輸送するので「善玉コレステロール」と見なされる。これらの薬物は主にトリグリセリドを低下させる有効性、能力および費用によって異なる。しかしながら、スタチンは一般に期間の約５０％またはそれ以下しか有効でない。
コレステロールはアテローム動脈硬化にて観察される血管を損傷するプラーク形成に関与するその深刻な悪影響でよく知られるが、コレステロールはまたステロイドホルモンおよび胆汁酸の合成に使用され、細胞膜の成分として重要である。食事にて消費されるコレステロールに加えて、体もまたコレステロールを作る。細胞内コレステロール合成の律速段階はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素と呼ばれる酵素の作用に関係すると一般に考えられている。スタチンは、またＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とも呼ばれ、この酵素を阻害して、細胞のコレステロール合成能を低下させる。
【０００６】
アテローム動脈硬化による損傷は狭窄した血管を通る血流を制限するアテローム動脈硬化性プラークだけでなく、脆弱なプラークの破裂からも生じる。実際、ほとんどの問題は血餅形成を開始する物質を放出する破裂したプラーク由来である。プラーク内のコレステロールで満たされたスカベンジャー型の細胞は破裂しそうなプラークを作る物質を分泌する。スタチンはプラークを安定化するようである。最近の研究でまたスタチンが内膜を改善することが示された。内皮細胞は血餅形成および溶解に関係し、冠状動脈疾患を有する人々の機能不全に関係するようである。
スタチンは様々な副作用に関連してそれ故多くの患者にはあまり耐えられない。例えば、スタチンの有する肝毒性の危険性があるので血液検査が定期的に観察される。さらに、多くの薬物およびある食物はこれらの薬物と相互作用する。特定の人に、スタチンは筋炎（ミオパチー）を引き起こす。実際、これはいくつかの他のコレステロールを低下させる薬物またはエリスロマイシンを受けている人によく生じる。筋肉痛の発生は非常に重篤だろう。多くの場合で、筋攣縮が横紋筋融解症として知られる重篤な筋炎を形成するまで進行して腎不全を引き起こすだろう。これらの薬物の閉経後女性への副効用は骨成長刺激による骨粗鬆症および結果的な骨折の危険性を低下させることである。
【０００７】
コレステロールを低下させる様々な市販の（ＯＴＣ）栄養補助食品が糠油から作られる。それらはビタミンＥに類似の活性を有するトコトリエノールを含有する。それらは体によるコレステロール合成を低下させるスタチンのように作用する。今のところ、それらの有効性および安全性は確立されていない。
上記の治療法の欠点を考えて、アテローム動脈硬化に関与する経路を理解する本質的な努力がなされた。特に、コレステロールのホメオスタシス経路を理解する、例えば、コレステロール低下を改善する薬剤を同定する努力がなされた。例えば、ＳＨＰはコレステロールホメオスタシス経路に示された。具体的には、肝性胆汁酸ホメオスタシスが胆汁酸の取り込みおよび合成に関連する遺伝子のネガティブフィードバックを阻害して調節され、胆汁酸が胆汁酸合成の律速遺伝子、コレステロール７アルファ−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）を阻害性の核受容体として作用する、ＳＨＰの胆汁酸受容体（ｆｘｒ）活性化を通して、ダウンレギュレーションすることが報告された。Densonら、Gastroenterology、121（1）：218-20（2001）を参照。ＳＨＰ遺伝子によりコードされるタンパクは推定リガンド結合ドメインを含有するが従来のＤＮＡ結合ドメインを欠くオーファン受容体である。該タンパクは核ホルモン受容体ファミリーのメンバーであり、小型の疎水性ホルモンによって調節される転写因子の一群であり、そのサブセットは既知のリガンドを有さず、オーファン核受容体と呼ばれる。ヒトオーファン核ホルモン受容体であるＳＨＰタンパクはSeol,W.ら、Science、272：1336-39（1996）によって最初に特徴付けられた。しかしながら、今までに誰一人としてＳＨＰを阻害できる化合物を同定したことはない。
【０００８】
アテローム動脈硬化の例は例示であり、同様のケースが腎疾患および炎症性腸疾患などの多種の他の状態および疾患に当てはまる。各例にて、状態の以前の防止法および／治療法は患者によるそれらの有効性および／または許容範囲の点で不完全である。それ故、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関連した状態に対して有効で、患者に十分に許容される薬剤の必要が残る。
さらに、以前は炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰまたはＦＸＲの活性を阻害するのに有効である薬剤を効果的に、確実に費用効率高く同定することができる、または対象における炎症性疾患発現および／またはコレステロール生合成に関連した状態に対して有効なそれらに基づいた製品を発展させることができる方法は全くなかった。
従って、薬剤を同定するのに用いられる細胞系、ベクターおよびプロモーター同様に、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を低下させるのに有効な薬剤を同定する必要が残る。さらに、同等物を含む治療組成物と同様に、ＳＨＰおよびＦＸＲのような、核受容体の阻害剤として有効な薬剤の必要が残る。また炎症性腸疾患および腎疾患のような、炎症性疾患に対して有効な組成物の必要と同様に、コレステロール高値を減らしてアテローム動脈硬化および他のコレステロール高値に関連した状態を防止および治療するのに有効な組成物の必要も残る。さらに、また炎症遺伝子活性およびコレステロール生合成に関連した状態のような、多数の関連状態に対して一般に有効な組成物および治療法の必要も残る。また上記の組成物の有効な調製法および投与法の必要も残る。
【０００９】
（発明の開示）
これらおよび他の必要を満たすために、およびその目的の観点にて、本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を同定、調製および投与する方法を提供し、上記の方法にて用いられる感染細胞系、ベクターおよびプロモーターを同様に提供する。薬剤を同定する本発明の方法は確実で、効率良く費用効率が高い。
本発明の具体例は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を阻害するのに有効な薬剤を同定する方法であって：（ｉ）短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）または（ｉｉ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に薬剤を投与すること；および細胞培養にて検出物質の増加を引き起こす薬剤を選択することを含む方法を提供する。
本発明のさらなる具体例は対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成に関連した状態を防止または改善する方法であって：本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって選択される薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらなる具体例は本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって選択される薬剤を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例は核転写因子ＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染、トランスフェクトまたは改変した細胞培養に投与した場合にルシフェラーゼの増加を引き起こすと特徴付けられる薬剤を含む組成物であって、上記の細胞培養が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現する組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例はＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含む：プロモーター／検出物質遺伝子レポーターであって、上記のＮＦ−κＢプロモーターが検出物質遺伝子の前に位置するプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを提供する。
【００１１】
本発明のさらなる具体例は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８またはそれらの組み合わせの核酸配列を含むポリヌクレオチド：を含む単離したＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１またはＳＨＰプロモーターを提供する。
本発明のさらなる具体例は非天然脱活性型短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）：を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例は配列番号：１−４のいずれかに結合する薬剤：を含む組成物を提供する。
上記の概要および以下の詳細な説明は本発明の模範であるが、本発明を制限するものでないことが理解されるだろう。
【００１２】
（図面の簡単な記載）
図１はエチニルエストラジオールによるＩＬ−１βの阻害を説明する線グラフである。
図２はＩＬ−１βによるＨｅｐＧ２におけるＳＨＰ発現の阻害を説明する線グラフである。
図３ａ、３ｂおよび３ｃはＦｎｋ、ＪＡＢおよびＬＩＸのエチニルエストラジオールによる阻害がＩＬ−１βに特異的であることを説明する棒グラフである。
図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、および４ｅはエチニルエストラジオールがエストロゲン受容体（ＥＲ）依存性メカニズムによってＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を遮断することを説明する棒グラフである。
図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、および５ｅはＥＲαが肝にてエチニルエストラジオールによる調節に必要とされることを説明する棒グラフである。
【００１３】
図６ａおよび６ｂはエチニルエストラジオールによる遺伝子発現の誘導がＥＲαによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に必要とされないことを説明する棒グラフである。
図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、および７ｅはエチニルエストラジオールによるＩＬ−１βの阻害が肺にはないことを説明する棒グラフである。
図８はＨｅｐＧ２細胞におけるＥＲαおよびＥｒβによるＩＬ−１βによるＮＦ−κＢ活性の誘導の阻害を表す棒グラフである。
図９はＥＲαによるマウス肝におけるＳＨＰ発現の調節を表す棒グラフである。
図１０はラット肝におけるエストロゲンによるＳＨＰの調節を説明する棒グラフである。
【００１４】
図１１ａおよび１１ｂはＥＲαがヒト細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する棒グラフである。
図１２ａおよび１２ｂはＥＲαが２９３細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する棒グラフである。
図１２ｃはＥＲαが２９３細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する線グラフである。
図１３は２９３細胞にてＥ２応答配列の位置を説明するマップである。
図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃはＥＲによるＳＨＰの誘導がＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１を抑制できないことを説明する棒グラフである。
【００１５】
図１５はコール酸によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の抑制がＳＨＰの誘導を必要としないことを説明する線グラフである。
図１６はＨｅｐＧ２にてＨＮＦ１／ｐＳＩによって促進されるＣＹＰ８Ｂ１プロモーターに対するＳＨＰ／ｐＳＩを滴定することからわかるルシフェラーゼ活性を表す。
図１７はＴＮＦ−アルファ、ＶＣＡＭ−１およびＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡの肝レベルの用量依存的な誘導を説明するグラフである。
図１８ａおよび１８ｂはＵＤＣＡおよびＣＡの相対的なＳＨＰ発現を説明するグラフである。
図１９はＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤＣＡの相対的な発現を説明するグラフである。
【００１６】
図２０ａはＨｅｐＧ２細胞におけるＧＷ４０６４の相対的な発現を説明するグラフである。
図２０ｂはＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理による用量依存的に誘導されるＭ−ＣＳＦ発現を説明するグラフである。
図２１ａ−ｄはコール酸塩に依存する炎症遺伝子発現を説明する棒グラフである。
図２２ａ−ｄは急速コール酸塩処理が用量依存的に炎症遺伝子発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２３ａ−ｄはＵＤＣＡが炎症遺伝子発現を誘導しないことを説明する棒グラフである。
【００１７】
図２４ａ−ｄはＦＸＲアゴニストがＨｅｐＧ２細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２５はＧＷ４０６４がインビボでＩＣＡＭ−１発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２６はＧＷ４０６４がＩＣＡＭ−１プロモーター発現を誘導することを説明する棒グラフである。
【００１８】
（発明の詳細な記載）
胆汁酸は腸からの脂溶性栄養素の消化および吸収に必要な両親媒性ステロイド洗剤であって胆汁酸およびコレステロール代謝を調節する核受容体ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のリガンドであることが示された。胆汁酸は肝にて合成され、胆汁中に分泌され、回腸にて再吸収されて、門脈循環を通して肝に再輸送されて律速酵素、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）をコードする遺伝子を抑制して胆汁酸合成を阻害する。オーファン核受容体ＳＨＰ（短鎖ヘテロ二量体共役物質）のＦＸＲ介在誘導はＳＨＰのアンタゴニストであるＬＲＨ−１（肝受容体ホモログ−１）活性、ｃｙｐ７ａ発現を制御する転写因子を介してｃｙｐ７ａの抑制を引き起こす（Goodwin 00 Cell & Lu 00 Cell）。それ故、高脂血症および胆汁鬱滞性肝疾患を制御する場合にＦＸＲおよびＳＨＰアンタゴニストの治療可能性が提供された。
ＦＸＲシグナル伝達経路における新規の機能が肝にて炎症遺伝子発現を誘導する可能性に関することが予期せず発見された。胆汁酸が非特異的な機序で肝マクロファージにて炎症性サイトカインを誘導することは以前に証明された（Miyakeら、00 JBC 275：21805）。ＦＸＲを介したシグナル伝達に加えて、胆汁酸はまた炎症遺伝子発現を引き起こすことが可能なタンパクキナーゼＣシグナル伝達経路を直接活性化することが示された（Stravitz 95 JLR）。本明細書にて我々は肝細胞系、ＨｅｐＧ２にて炎症遺伝子発現を直接活性化する活性化ＦＸＲの能力を証明する。ＨｅｐＧ２細胞の胆汁酸、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、または合成ＦＸＲリガンドのＧＷ４０６４による処理は炎症遺伝子の細胞間接着分子（intracellular adhesion molecule）（ＩＣＡＭ−１）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の誘導を引き起こす。さらに以下の証拠はＦＸＲシグナル伝達がＳＨＰ発現の誘導を介してＮＦ−κＢ介在炎症遺伝子発現を誘導することを示す。これらの結果は炎症遺伝子発現を促進する活性化ＦＸＲの新規の役割を示唆する。ＦＸＲは大部分が肝、腸、副腎および腎にて発現するため、ＦＸＲまたはＳＨＰアンタゴニストは例えば、アテローム動脈硬化、炎症性腸疾患のような疾患および腎疾患にて抗炎症活性を証明できた。
【００１９】
上記の予期せぬ発見に基づいて、本明細書ではコレステロール合成経路および／または炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する薬剤を同定する方法が提供される。
本明細書で「組成物」または「治療組成物」および「複数の組成物」または「複数の治療組成物」なる語は、各々、同義的に使用される。それ故、複数形は単数形を含んで単数形は各用語の複数形を含む。
ある成分を「含む」組成物の説明はまた同様の成分から本質的に成るまたはそれらから成るその組成物を含む。
本明細書で用いられる「治療組成物」なる語は内部および外部の両方にて、細胞、組織、器官または系を治療するのに有用な組成物を意味する。
本明細書で用いられる「治療有効量」なる語は標的の病状を治療するのに有効な量を意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる、「医薬上許容される」なる語は、記載される組成物またはその成分が十分に高純度で不当な毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答、およびその類似物なく皮膚、組織、または膜に接触させて使用するのに適することを意味する。
「コレステロール高値」なる語は当業者によって不健康である種の治療の適当な標的であると考えられる血清低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール値のことを言う。現在、１ｄＬ当たり２２０ｍｇ（１Ｌ当たり５．７ｍｍｏｌ）以上の血清ＬＤＬコレステロール値が不健康と考えられて治療の標的である。
本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤および組成物を調製および同定する方法であって対象におけるコレステロール生合成に関連した炎症性疾患または状態を防止および／または治療する組成物を使用する方法に関する。さらに本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を阻害する薬剤の調製および同定に使用される感染細胞系およびベクターに関する。
【００２１】
本発明はまた本発明の方法によって同定した炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を提供する。例えば、本発明は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）およびファルネソイド受容体（ＦＸＲ）のような、核受容体の阻害剤、特に炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路におけるＳＨＰおよびＦＸＲの阻害剤に関する。本発明はアテローム動脈硬化、炎症性腸疾患および腎疾患のような、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関連する疾患または状態を防止および／または治療するのに有効な組成物を含む、このような阻害剤を含む組成物に関する。
さらに、本発明はコレステロール高値およびアテローム動脈硬化のような、関連疾患を改善および防止する組成物および方法を提供する。コレステロール高値および関連状態の改善および防止に有用な組成物を同定するために、本明細書ではコレステロールホメオスタシス経路におけるＳＨＰ活性を阻害する薬剤のスクリーニングに高性能および有効である方法が提供される。
本発明の治療組成物は単独またはいずれの他の医学的アプローチおよび／または治療法と組み合わせても使用可能である。本発明の治療組成物の使用に関連した副作用または問題は全く確認されていない。
【００２２】
例えば、本発明の組成物および方法はまたコレステロール高値ではないが、コレステロール高値またはそれに関連した疾患の危険性のあることが証明される個人の場合に適している。高血圧、高コレステロール、低ＨＤＬ（高比重リポタンパク）、喫煙、糖尿病、年齢、性別（３５ないし４４歳の白人男性の死亡率は白人女性の６倍である）、運動不足、心臓疾患の家族歴、などのような、広範囲の危険因子が当業者に公知であるとして考慮されるだろう。例えば、制限されないが、本発明の組成物はコレステロール高値またはアテローム動脈硬化のような、一般にそれに関連した疾患に遺伝的な傾向のあることが見出される人々、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）低値を有する人々、高血圧の人々、特定のライフステージの人々、などに投与されるだろう。例えば低ＬＤＬの場合、血清高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール高値は心臓を保護すると考えられるが、低値は早期ＣＨＤ（冠動脈疾患）の有力な兆候である。ＨＤＬ低値単独はＨＤＬコレステロール値１ｄＬ当たり３５ｍｇ（１Ｌ当たり０．９０ｍｍｏｌ）またはそれ以下、ＬＤＬコレステロール値１ｄＬ当たり１６０ｍｇ（１Ｌ当たり４．１５ｍｍｏｌ）以下およびトリグリセリド値１ｄＬ当たり２５０ｍｇ（１Ｌ当たり２．８３ｍｍｏｌ）以下と定義される。もちろん、これらの危険因子のいずれも新規の研究が行われるにつれて時間とともに変化するだろう。本発明はいずれかのこのような変化を考慮するように意図される。さらに、当業者はこのような状況を容易に同定して、本明細書にて提供される案内に基づいて、本発明の組成物を適当に投与することが可能である。
【００２３】
核ホルモン受容体は様々な生理学的、発生学的、および毒物学的過程に関連するリガンド活性化転写因子である（Mangelsdolfら、1995；BlumbergおよびEvans、1998；Kliewerら、1999）。これらの受容体は高度に保存されたＤＮＡおよびリガンド結合ドメインを有してそれらの二量化能に基づいて２つの群に細分される。第１群はエストロゲン、プロゲステロン、および糖質コルチコイド受容体を含み、それら全てはホモ二量体としてそれらの同族ＤＮＡ応答配列に結合する。第２群はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ビタミンＤ受容体、および甲状腺ホルモン受容体を含み、それら全てはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）として知られる共通の相手とヘテロ二量体を形成する。
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、高度に保存された核受容体スーパーファミリーＤＮＡ結合ドメイン由来の変性オリゴヌクレオチドプローブを使用してラット肝ｃＤＮＡライブラリから単離され、この第２群に属する。高濃度のファルネゾール、メバロン酸経路のイソプレン代謝産物は、活性化ＦＸＲであることが見出された（Formanら、1995）。マウスオーソログＲＩＰ１４が酵母２方向ハイブリッドアッセイを餌としてヒトＲＸＲリガンド結合ドメインを使用してクローニングされてファルネソイドによってほとんど活性化されないことが見出された（Seolら、1995）。その代わりに、レチノイン酸および合成レチノイドのＴＴＮＰＢ｛（Ｅ）−４−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチレニル）−１プロペニル］安息香酸｝が生理的濃度を超えるが、ＦＸＲの有力な活性剤であることが証明された（Zaviackiら、1997）。ファルネソイドおよびレチノイドはＦＸＲの有用な初特性を可能にするが、活性化に高濃度が必要とされるのはこれらの化合物が内因性リガンドの前駆物質であるまたは特定の他の関連生理的リガンドの作用を模倣していることを示す。
【００２４】
ＳＨＰはリガンドが未知の核ホルモン受容体スーパーファミリーの１つである。ＳＨＰタンパクのホモロジーによる分子モデリングはＳＨＰ（白ストランド）がゲイエレチノイン酸とＲＸＲの複合体（赤ストランド）のリガンド結合ドメイン上にモデリングされる下図に示されるように、古典的リガンド結合受容体構造を達成可能であることを示す。ＳＨＰは必要な疎水性アミノ酸およびコアクチベーターまたはコリプレッサーとの電荷で固定された相互作用の形成に必要な負に帯電したアミノ酸を含む古典的なヘリックス１２を含有する。
以下は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）をコードする遺伝子の核酸配列であって、本明細書では配列番号：１と指定される。
【００２５】
【表１】
【００２６】
以下は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）ポリペプチドのアミノ酸配列であって、本明細書では配列番号：２と指定される。
【００２７】
【表２】
【００２８】
以下はＦＸＲをコードする遺伝子の核酸配列である：
【００２９】
【表３】
【００３０】
以下はＦＸＲのアミノ酸配列である。
【００３１】
【表４】
【００３２】
本発明は例えばＳＨＰまたはＦＸＲと結合または競合して、炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲの活性を阻害する薬剤（小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換え受容体、抗体、など）の同定および／または改善に関する。これらの薬剤はコレステロールホメオスタシス経路にて胆汁酸合成におけるＳＨＰまたはＦＸＲの負の効果を阻害してそれによって血清ＬＤＬコレステロール値を有効に低下させるおよび／または炎症遺伝子発現経路におけるＳＨＰまたはＦＸＲの負の効果を阻害することができる。
【００３３】
ＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤の同定法
ＳＨＰまたはＦＸＲのリガンドは未知であるため、それらの活性に影響する分子を同定する結合アッセイは不可能である。本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲ活性を阻害する薬剤を同定する新規の方法を対象とする。
本明細書の実施例が証明するように、我々はエストロゲンがＥＲα依存機序を介してＳＨＰの発現を誘導することができることを立証した。このＳＨＰ誘導は肝細胞における胆汁酸合成および胆汁酸値を低下させると予想されるだろう。これはＦＸＲ活性低下および血漿トリグリセリドの上昇を伴うアポＣＩＩ産生低下を引き起こすことができる。さらに、胆汁酸合成の低下は胆汁における胆汁酸のコレステロールに対する比率低下によって胆石形成傾向の増加を引き起こすことができる。興味深いことに、ホルモン補充療法中の女性はこれら２つの効果を示す：トリグリセリド値の増加および胆石罹患率の増加を有する。これはＳＨＰ活性の薬理学的操作が観察可能な生理的変化を引き起こすことを示す。それ故ＳＨＰ活性の阻害はコレステロールの胆汁酸への転換を増加させてトリグリセリド値を上昇させる。これらはアテローム動脈硬化の患者において非常に好ましい効果である。
【００３４】
本発明の具体例に従って、炎症遺伝子発現経路および／またはコレステロール生合成経路におけるＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤を同定する方法はスクリーニングアッセイを含む。スクリーニングアッセイは候補薬剤を得て候補薬剤を（ｉ）ＳＨＰまたは（ｉｉ）ＦＸＲを発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に投与することに関する。ＳＨＰおよび／またはＦＸＲを阻害する候補薬剤は検出物質の増加を引き起こす。それ故、有効な薬剤は各候補物質の投与後に感染細胞にて検出物質の増加をモニターして多数の可能な候補薬剤のいずれかから選択されるだろう。
ある具体例に従って、ＮＦ−κＢプロモーターはチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを含んでＴＫプロモーターの上流に２つのＮＦ−κＢ応答配列の複製がある。
本発明の具体例に従ってＳＨＰ阻害剤を同定する別の方法は、一般にＬＲＨ−１およびＳＨＰクローンの全長を構築し、ＬＲＨ−１受容体を作製して、アデノウイルス構造を発現し、細胞系を選択してスクリーニングパラダイムを確立することに関する。本発明の実施例に従って、その過程は：ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有する、ＳＨＰ、および任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染、トランスフェクトまたは改変して感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出することに関する。
【００３５】
本明細書ではコレステロール生合成経路および／または炎症遺伝子発現経路の両方における阻害剤として有効な特定の薬剤を同定する方法が提供される。本発明の別の実施例に従って、その過程は：ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有するＳＨＰおよび任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染させて感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出する；ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有する、ＳＨＰ、および任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染させて感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出することに関する。
ある具体例に従って、ＳＨＰおよび／またはＦＸＲのタンパク値は薬剤がタンパクにまたはおそらくヌクレオチドレベルで作用しているか否かを証明するためにモニターされる。例えば、ＳＨＰを発現する細胞は（例えば、エピトープ標識によってまたは６または７個のアミノ酸のフラグ標識を使用して）標識されても当業者に公知であるような、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはある適当な技術を使用してレベルモニターされてもよい。
【００３６】
以下の開示は上記の方法を実施するための様々な具体例を記載する。さらに、ＳＨＰ阻害剤としてのいずれの候補化合物を同定するための特別なアッセイの全過程を示す特別な実施例が以下（実施例３および４を参照）に提供される。実施例３は細胞培養のプラスミドでのトランスフェクトを使用して本発明のある実施例に従ってアッセイを行う特別な方法を提供する。実施例４は細胞培養をアデノウイルスで感染させる好ましい特別な方法を提供する。本発明の方法を使用すれば、ＳＨＰおよびＦＸＲ阻害剤が同定されるだろう。本明細書にて提供される開示に基づいて、当業者は本発明の様々な具体例に従って容易に上記の方法を行えるだろう。それ故、当業者は本明細書にて提供される情報に基づいて容易にＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤を同定するアッセイを構築できるだろう。
【００３７】
発現系およびベクター
宿主細胞（および同等物を含む細胞培養）は一般に本発明の発現系、それらの一部、またはポリヌクレオチドを組み込んで設計される。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はDavisら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）およびSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Mannual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、または感染によって、行われる。
適当な宿主の代表例はラット細胞（例えば、ラットヘパトーマ培養細胞）、マウス細胞（例えば、マウスヘパトーマ細胞）、ウサギ細胞、ヒト細胞およびそれらの類似物のような、哺乳類細胞を含む。例えば、適当な細胞はＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ細胞、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせを含む。
組換え産生ポリペプチドは高性能液体クロマトグラフィ、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含む、既知の方法によって組換え細胞培養から再生および精製される。
【００３８】
多くの様々な発現系が使用される。このような発現系は特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド、サルモネラのような弱毒化細菌（米国特許番号第４，８３７，１５１号）、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、ワクシニアウイルスおよび他のポックスウイルス、シンドビスウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのような、パポバウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのようなアルファウイルス（米国特許番号第５，６４３，５７６号）、水疱性口内炎ウイルスのような非分節性マイナス鎖ＲＮＡウイルス（米国特許番号第６，１６８，９４３号）のようなウイルス由来のベクター、およびプラスミドおよびコスミドおよびファージミドのような、バクテリオファージ遺伝因子由来のベクターのような、それらの組み合わせ由来のベクター、を含む。発現系はプロモーターおよび（ポリアデニル化シグナルのような）他の調節因子のような、発現を生じさせると共に調節する制御領域を含むべきである。一般に、宿主におけるポリペプチドを産生するポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するのに適したいずれの系またはベクターが使用されてもよい。適当なヌクレオチド配列は例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual（supra）；またZhangら、Journal of Biological Chemistry、276（45）：41690-41699（2001）；Goodwinら、Molecular Cell、6：517-526（2000）；およびSinalら、Cell、102：731-744（2000）を参照、に示されるような、様々な既知および通常の技術のいずれかによって発現系に挿入されてもよく、各々はその全体を明示することによって本明細書の一部とする。
【００３９】
本発明はまた本発明のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター、配列ベクター、クローニングベクター）、一般に本発明のベクターで設計される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生を提供する。無細胞翻訳系はまた本発明のＤＮＡ構造由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパクを産生するのに行うことができる。
好ましいベクターはレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および所望の細胞親和性を有する他の組換えウイルスのような、ウイルスベクターである。それ故、機能的または変異タンパクまたはポリペプチド、またはそれらの断片をコードする遺伝子はウイルスベクターを使用してまたはＤＮＡの直接導入を介してインビトロで導入可能である。標的組織における発現はウイルスベクターまたは受容体リガンドを有するような、トランスジェニックベクターを特異的な細胞にターゲティングして、または組織特異的プロモーターを使用して、またはその両方で実行可能である。標的遺伝子デリバリーはＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２８４９４に記載される。
一般にインビトロ法にて使用されるウイルスベクターはＤＮＡを基本としたベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築および使用する方法は当該分野にて公知である（例えば、MillerおよびRosman、BioTechniques、1992、7：980-990）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損である、すなわち、標的細胞にて自己複製できない。好ましくは、複製欠損ウイルスは最小ウイルスである、すなわち、ウイルス粒子を増殖させるためのゲノム封入に必要なゲノム配列のみを残す。
【００４０】
ＤＮＡウイルスベクターは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプシュタインバールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびそれらの類似物のような、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを含むが、それらに制限されない。欠損ウイルスが、ウイルスゲノム全体またはほとんど全体を欠損している、好ましい。欠損ウイルスは細胞導入後には感染しない。欠損ウイルスベクターの使用は特異的、局所的領域における細胞への投与を考慮して、ベクターが他の細胞に感染可能であるかは考慮しない。それ故、特異的な組織が特異的に標的可能である。特別なベクターの例は欠損単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.、1991、2：320-330）、糖タンパクＬ遺伝子を欠損した欠損ヘルペスウイルスベクター、または他の欠損ヘルペスウイルス（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２１８０７およびＷＯ９２／０５２６３）；Stratford-Perricaudetら（J.Clin.Invest.、1992、90：626-630；またLa Salleら、Science、1993、259：988-990を参照）によって記載されるベクターのような、弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Samulskiら、J.Virol.、1987、61：3096-3101；Samulskiら、J.Virol.、1989、63：3822-3828；Lebkowskiら、Mol.Cell.Biol.、1988、8：3988-3996）を含むが、それらに制限されない。
アビゲン社（アラメダ、カリフォルニア；ＡＡＶベクター）、セルジェネシス社（フォスターシティ、カリフォルニア；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、クローンテック社（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、ジェノボ社（シャロンヒル、ペンシルベニア；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、ジェンベック社（アデノウイルスベクター）、イントロジェン社（ライデン、オランダ；アデノウイルスベクター）、モレキュラーメディシン社（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、ノージェン社（アデノウイルスベクター）、オックスフォードバイオメディカ社（オックスフォード、イギリス；レンチウイルベクター）、およびトランスジーン社（ストラスブルク、フランス；アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含むが、それらに制限されない、様々な会社が市販ウイルスベクターを製造している。
【００４１】
アデノウイルスは本発明のヌクレオチドを様々な型の細胞に有効にデリバリーするのに修飾可能な真核ＤＮＡウイルスである。様々な標準型のアデノウイルスがある。これらの標準型の中で、本発明の範囲内にて、２型または５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２６９１４を参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲内にて使用可能な動物起源のアデノウイルスはイヌ、ウシ、ネズミ（例えば、Ｍａｖ１、Beardら、Virology、1990、75-81）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを含む。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルスで、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、マンハッタンまたはＡ２６／６１株、例えば、ＡＴＣＣＶＲ−８００）である。様々な複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載された（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本発明に記載の複製欠損組換えアデノウイルスはいずれの当業者に公知の技術によって調製可能である（例えば、Levreroら、Gene、1991、101：195；欧州出願番号ＥＰ１８５５７３；Graham、EMBO J.、1984、3：2917；Grahamら、J.Gen.Virol.、1977、36：59）。組換えアデノウイルスは当業者に公知の、標準の分子生物学的手法を用いて再生および精製される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は安定した部位特異的な方法で、感染する細胞のゲノムに組み込むことができる比較的サイズの小さいＤＮＡウイルスである。それらは細胞の成長、形態、または分化に影響せず広範囲の細胞に感染可能であり、ヒトの病原性に関連が見られない。ＡＡＶゲノムはクローニング、配列決定、および特徴付けられた。インビトロにおける遺伝子輸送に関するＡＡＶ由来のベクターの使用が記載された（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許番号第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１；欧州出願番号ＥＰ４８８５２８、を参照）。本発明に記載の複製欠損組換えＡＡＶは２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によって興味深く挟まれた核酸配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶ封入遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を、ヒトヘルパー細胞（例えば、アデノウイルス）で感染させた細胞系に輸送するプラスミドをコトランスフェクトして調製可能である。生成したＡＡＶ組換え体は標準的な技術によって精製される。
【００４２】
別の具体例にて、遺伝子は例えば、米国特許番号第５，３９９，３４６号；Mannら、Cell、1983、33：153；米国特許番号第４，６５０，７６４号および第４，９８０２８９号；Markowitzら、J.Virol.、1988、62：1120；米国特許番号第５，１２４，２６３号；欧州出願番号ＥＰ４５３２４２およびＥＰ１７８２２０；Bernsteinら、Genet.Eng.、1985、7：235；McCormick、BioTechnology、1985、3：689；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０７３５８；およびKuoら、Blood、1993、82：845に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入可能である。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは２つのＬＴＲ、１つの封入配列、および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全体的にまたは部分的に、欠失され、重要な異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「ネズミモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「ネズミモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハービー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、および類似ウイルスのような、異型のレトロウイルスから構築可能である。適当なパッケージング細胞系、特に細胞系ＰＡ３１７（米国特許番号第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／０２８０６）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１５０）が記載された。加えて、組換えレトロウイルスベクターは一部のｇａｇ遺伝子を含む封入配列の伸長と同様に転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾を含有する（Benderら、J.Virol.、61：1639）。組換えレトロウイルスベクターは当業者に公知の標準の技術によって精製される。
レトロウイルスベクターは感染粒子として機能するまたは１ラウンドのトランスフェクションを行うために構築可能である。前者の場合、ウイルスは癌化能に関与することを除いてその遺伝子全てを維持し、異種遺伝子を発現するように修飾される。非感染ウイルスベクターはウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、異種遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するように設計される共誘導ウイルスをパッケージングするのに必要な構造遺伝子を維持するように増殖する。それ故、産生されるウイルス粒子は別のウイルスを産生することができない。
【００４３】
レトロウイルスベクターはまたＤＮＡウイルスによって誘導可能であって、それは１周期のレトロウイルス複製を可能にしてトランスフェクションの効率を増幅する（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２２６１７、ＷＯ９５／２６４１１、ＷＯ９６／３９０３６およびＷＯ９７／１９１８２を参照）。
別の具体例において、レンチウイルスベクターが直接デリバリーして、脳、網膜、筋、肝、および血液を含む、いくつかの組織型におけるトランス遺伝子の発現を維持する媒介物として使用可能である。ベクターは効果的にこれらの組織にて分裂および非分裂細胞を変換して重要な遺伝子の長期発現を維持することができる。概説として、Naldini、Curr.Opin.Biotechnol.、1998、9：457-63を参照；またZuffereyら、J.Virol.、1998、72：9873-80、を参照。レンチウイルスパッケージング細胞系は入手可能であって一般に当該分野に公知である。それらは遺伝子治療に関する高性能滴定レンチウイルスベクターの産生を容易にする。一例は少なくとも３ないし４日間で１０６ＩＵ／ｍｌ以上の滴定でウイルス粒子を産生可能なテトラサイクリン誘導ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスパッケージング細胞系である（Kafriら、J.Virol.、1999、73：576-584）。誘導可能な細胞系によって産生されるベクターはインビトロにおける非分裂細胞の効果的な変換の必要に応じて濃縮可能である。
陽イオン性オリゴペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク由来ペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／２５５０８）、または陽イオン性ポリマー（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２１９３１）、またはブピバカイン（米国特許第５，５９３，９７２号）のような、他の分子はまたインビトロにおける核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。
本発明の単離したポリペプチドはポリペプチドまたは外来ポリペプチドのような免疫原性断片の発現に必要な遺伝物質を含有する、生きたベクターを使用して、特に生きた組換え細菌、ウイルス、または他の生きた媒介物を使用して哺乳類にデリバリー可能である。特に、サルモネラ属、シゲラ属、エルシニア属、ビブリオ属、エシェリキア属およびＢＣＧのような、消化管にコロニーを形成する細菌はワクチンベクターとして改良されて、これらおよび他の例はKolmgrenら（1992）およびMcGheeら（1992）によって記載される。
【００４４】
以下は一連のベクターの一部として使用されるが、それらに制限されない：
モノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスの分類
パラミクソウイルス科
パラミクソウイルス亜科
パラミクソウイルス属
センダイウイルス（マウスパラインフルエンザウイルス１型）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型および３型
ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）３型
ルブラウイルス属
シミアンウイルス５（ＳＶ）（イヌパラインフルエンザウイルス２型）
ムンプスウイルス
ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（トリパラミクソウイルス１型）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ−２、４ａおよび４ｂ型）
モルビリウイルス属
麻疹ウイルス（ＭＶ）
イルカモルビリウイルス
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）
小反芻獣疫ウイルス
アザラシジステンパーウイルス
牛疫ウイルス
未分類
ヘンドラウイルス
ニパウイルス
ニューモウイルス亜科
ニューモウイルス属
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
ウシ呼吸器合胞体ウイルス
マウス肺炎ウイルス
メタニューモウイルス属
ヒトメタニューモウイルス
トリニューモウイルス（以前の七面鳥鼻気管炎ウイルス）
ラブドウイルス科
リッサウイルス属
狂犬病ウイルス
ベシクロウイルス属
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
エフェメロウイルス属
ウシ流行熱ウイルス
フィロウイルス科
フィロウイルス属
マールブルグウイルス
【００４５】
ＲＮＡウイルスベクターは基本的に少なくとも１つのモノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする配列を含む単離した核酸分子である。単離した核酸分子はゲノム、アンチゲノム、またはそれらの修飾形態をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ある具体例において、ポリヌクレオチドは結合可能なプロモーター、所望のゲノムまたはアンチゲノム、および転写ターミネータをコードする。
本発明の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはヌクレオチド挿入、転位、欠失、または置換によって野生型ＲＮＡウイルスから修飾されたゲノムまたはアンチゲノムをコードする。ゲノムまたはアンチゲノム配列はヒトまたは非ヒトウイルス由来であるだろう。ポリヌクレオチド配列はまたゲ２つまたはそれ以上のソースからのゲノムまたはアンチゲノムを組み換えて結合して形成されるキメラゲノムをコードしてもよい。例えば、Ａ群のＲＳＶ由来の１つまたはそれ以上の遺伝子をＢ群のＲＳＶの対応する遺伝子と置換して挿入する；またはウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ）、ＰＩＶ−１またはＰＩＶ−２由来の１つまたはそれ以上の遺伝子をＰＩＶ−３のＲＳＶの対応する遺伝子と置換して挿入する；またはＲＳＶをＰＩＶの遺伝子に置換してもよいなど。さらなる具体例において、ポリヌクレオチドはヒト、ウシ、またはネズミウイルスであるモノネガウイルス目のＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする。本発明の方法によって形成される組換えウイルスは治療または防止目的にて使用されるため、ポリヌクレオチドはまた選択されるＲＮＡウイルスの弱毒化または感染形態をコードしてもよい。多くの具体例において、ポリヌクレオチドはＲＮＡウイルスの弱毒化、感染形態をコードする。特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは刊行された国際特許出願ＷＯ９８／１３５０１、参照として本明細書の一部とする、に記載されるように、３’ゲノムプロモーター領域に少なくとも１つ弱毒変異を有してＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に少なくとも１つ弱毒変異を有するモノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする。
【００４６】
ベクターとして、上記のような所望のゲノムおよびアンチゲノムの修飾形態をコードするポリヌクレオチド配列はまた本発明の免疫原性タンパクに関する１つまたはそれ以上の遺伝子またはヌクレオチド配列をコードする。加えて、１つまたはそれ以上の異種遺伝子はまた所望されるような、所望の免疫原性組成物／ベクターを形成する場合含まれてもよい。所望の組換えウイルスの使用によって、異種遺伝子は補因子、（インターロイキンのような）サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または異なる微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）のタンパク、特に免疫応答保護によって誘導可能なタンパクをコードしてもよい。異種遺伝子はまた遺伝子治療に使用される薬剤を提供するのに使用されてもよい。好ましい具体例において、異種遺伝子は組換えウイルスの防止能または治療能を改善するのに選択される、インターロイキン−１２のような、サイトカインをコードする。
好ましくは、ベクターはアデノウイルスである。より好ましくは、アデノウイルスは複製欠損アデノウイルスである。さらにより好ましくは、複製欠損アデノウイルスはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む。さらにより好ましくは、複製欠損アデノウイルスはＳＶ４０プロモーターを含む。
【００４７】
ハイスループットスクリーニング
本発明に記載の生物学的サンプルにおけるＳＨＰ阻害剤を検出および同定する方法はハイスループットスクリーニングの使用を意図する。ハイスループットスクリーニングからの情報量には３つの異なる相：生化学アッセイに関する実験設計、データ完全性の問題およびデータ分析がある。実験設計はスクリーニングを設定する場合最も重要であって瞬時に最適なアッセイ条件を同定して結果データの質を確保するのに使用される。データ完全性の問題は異なる組の化合物に関するアッセイ変動性の計算、系統的な効果の同定およびおそらく修正およびデータがその意図した使用に適当であるという検証に関係する。最終的に、データ分析はＫｉのような結果から未加工データを要約するためにデータ整理することまたはＳＡＲ、ＱＳＡＲまたは神経ネットワーク分析からのデータからパターンおよび情報を抽出することのいずれかの、データ処理に関係する。総合すれば、これらの方法は大量のデータから情報を抽出する仕事に取り組むことである。
実験設計は最適な条件を見出して応答曲面法をモデリングするのに必要とする多くの分野での利用が見出されるがしばしば生物学において十分に利用されていない古典的な統計学的方法である。実験設計の理論的基礎は多くの統計学の教科書、例えば、Cochran、W.G.およびCox、G.M.、Experimental Designs、John Wiley and Sons：New York、1957；Hicks、C.R.、Fundamental Concepts of Design of Experiments、Holt、Rhinehart and Winston、1974；Box、G.E.、Hunter、W.G.およびHunter、S.、Statistics for Experimenters：An Introduction to Design、Data Analysis and Model Building、John Wiley and Sons：New York、1978；Montgomery、D.C.、Design and Analysis of Experiments、John Wiley and Sons：New York、1984、各々はその全体を明示することによって参照として本明細書の一部とする、に詳細に記載される。適用の事例研究は特定の分野に関連の文献に見出すことができる。例はDaniel、C.、Applications of Statistics to Industrial Experimentation、John Willey and sons：New York、1976；Murphy、T.D.、design and analysis of industrial experiments、Chemical Engineering、June 6、1977、168-182に記載されるような工業的プロセス最適化；およびDeming、S.N.およびMorgan、S.L.、Experimental Design：a chemometric approach；Elsevier、1987；Austel、V.、Design of Test Series by Combined Apllication of 2n Factorial Schemes and Pattern Recognition Techniques. Quantitative Approaches to Drug Discovery；Dearden、J.C.、Ed.；Elsevier、1983に記載されるような化学を含む。生物学的および化学的適用に関して実験設計を使用することに関連した問題および方法論はHaaland、Experimental Design in Biotechnology、Marcel Dekker、1989によって記載される。
【００４８】
最も少ない実行において最も多くの情報を抽出するために系統的な方法において最適化する手段への考慮が必要とされる。多くの場合、最適条件の同定は十分である。他の場合、因子および応答の関係は数学的にモデリングされている。相互作用は生物学において例外というよりむしろ標準であって問題の複雑さを大きく助長させるまたは最も悪い場合、データの解釈を不可能にさせるため特に重要である。特定の集団の実験設計は分散低減実験設計である。このような設計では、応答それ自体というよりむしろ応答の分散が最適化される。分散を最小にすることによってアッセイはより信頼できるのでこれらの設計は生物学において重要である。他の適用において、費用は重要な因子であって最適化はタンパクのような希少資源の使用を最小にするために所望される。多くの場合複数の応答が考慮される：例えば、タンパクを節約するために受容体濃度を低く維持しながら分散を最小にするが、それに制限されない。最終的に、モデル、古典的な実験設計の基礎を形成する線形モデルのような単純なものであっても、有する利点は、予測可能であるということである。
古典的な実験設計では、研究者が応答に影響すると考える多数の因子を選択する。因子の数および可能な範囲によって、これらの因子によって定義される余白を抽出するために異型の設計が選択される。後に特定の因子または因子間の相互作用の影響を測定することを可能にする系統的な方法で因子は全て同時に異なる。典型的には因子は処理範囲の際で抽出されて線形または多項式補間機能が設計点間の領域をモデリングするために使用される。
異なる実験設計が特定の対象にて選択される。ロボットアッセイが最初に設定される場合、しばしばアッセイの信頼性に潜在的に影響可能な多くの因子がある。重要な因子を見出すために、低分解能の一部実施要因設計が実行されるだろう。重要な因子が同定された後、因子に最適な設定を見出すために十分な要因設計が設定されるだろう。因子の感度を評価して高度な交互作用を試験するために、応答曲面モデリングが最適な設定領域を探索するのに実行可能である。
【００４９】
最近の科学技術の進歩は薬物発見研究に関する新規のパラダイムを導入した。生物学アッセイにおける化学ライブラリおよびロボット系の有用性は１日に何百または何千もの化合物の合成および試験を可能にする。これはアッセイの自動化およびデータ分析を提供する。組み合わせライブラリは試験する大多数の化合物を提供する。ライブラリが分子標的の配列に対して試験される場合入手可能となる大量のデータは構造−活性関係分析の新規の機会を創りデータの完全性を確保してデータにおける傾向および関係を同定するための有効な統計学的方法の必要を増幅する。
本発明は特定の組織または細胞型にて発現するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤の新規の、大規模スクリーニングを提供する。アプローチはハイスループットin-situ法およびそれに続く分析と薬剤ライブラリを組み合わせる。大多数の化合物がロボット技術を使用して１つの実行において試験されてもよい。例えば、約１，０００ないし４０，０００個の化合物が１日に試験されてもよい。好ましくは、約４０，０００個の化合物１日に試験される。
本発明の具体例に従って、スクリーニングはロボットでウェルプレートにアリコートされる細胞の冷凍バイアルを利用する。ウェルプレートをインキュベートしプレートを除去してレポーターに関してアッセイする。好ましくは、４千万個の細胞が１回に使用されて、１０００個の細胞が１００個の３８４ウェルプレート（３８４個のウェルを有するウェルプレート）の各ウェルにアリコートされる。好ましくは、インキュベーションは約３７℃で約２４ないし約４８時間行われる。
【００５０】
薬剤
本発明の上記の方法は炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲを阻害するのに有効な薬剤を同定可能である。本発明の方法によって同定されてもよい薬剤は小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換え受容体（例えば、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲ、可溶性組換えＳＨＰ、可溶性組換えＦＸＲ）抗体およびそれらの類似物を含むが、それらに制限されない。
本発明のある具体例に従って、本発明はＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染させた細胞培養に投与される場合ルシフェラーゼの増加を引き起こすように特徴付けられる小分子のような、炎症遺伝子発現経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲ活性を阻害するのに有効な小分子を提供し、上記の細胞培養はＳＨＰまたはＦＸＲを発現する。
本発明のある実施例に従って、小分子はＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染させた細胞培養に投与される場合ルシフェラーゼの増加を引き起こすように特徴付けられて、上記の細胞培養は短鎖へテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）および任意に肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）を発現する。
「小分子」なる語は本発明が関係する分野にて当業者に容易に理解されるような、その通常の意味および一般的な用法で使用される。好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する。より好ましくは、薬剤の分子量は約５０ないし約７５０である。さらにより好ましくは、小分子の分子量は約５０ないし約５００である。分子量は当業者に公知の小分子の分子量を測定するいずれの許容される方法に従っても定量される。
【００５１】
小分子は多種多様の分類の化合物であってもよい。例えば、小分子は天然または合成脂質であってもよいが、それらに制限されない。さらに、小分子は脂溶性ないし水溶性の範囲であってもよい。本発明のある実施例に従って、小分子は脂溶性である。
本発明のある実施例に従って、小分子は天然または合成ステロイドである。ステロイドは天然に存在するおよび合成脂質または多様な生理活性を示す脂溶性化学物質の大群である。確かにステロイドの中には特定のアルコール（ステロール）、胆汁酸、多くの重要なホルモン、いくつかの天然の薬物、およびいくつかのヒキガエルの皮膚に見出される毒がある。ヒトの皮膚に見出される様々なステロールが日光の紫外線に曝される場合ビタミンＤに転換される。実際、コレステロール自体はステロールである。
ステロイドホルモンは、ステロールと同一ではないが類似していて、副腎皮質ヒドロコルチゾン、コルチゾン、アルドステロン、およびプロゲステロン；および女性および男性性ホルモンのエストロゲンおよびテストステロンを含む。大部分の経口避妊薬は排卵を阻害する女性性ホルモンから成る合成ステロイドである。コルチゾンおよび様々なコルチゾン合成誘導体は医学にて広く使用されている。例えば、このようなステロイドは様々な皮膚疾患、関節リウマチ、喘息およびアレルギー、および様々な眼疾患、および副腎機能不全、または副腎皮質機能不全の場合に使用される。本発明の小分子全てがステロイドというわけではなくステロイド全てが本発明の小分子というわけではない。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明の特定の小分子を同定する方法を容易に理解するだろう。
本発明のさらなる実施例に従って、小分子は非ステロイド化合物である。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明のこの実施例に従って特定の小分子を同定する方法を容易に理解するだろう。
【００５２】
本発明のある実施例に従って、小分子は非ステロイド化合物であるのが好ましい。より好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する非ステロイド化合物である。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約７５０を有する非ステロイド化合物である。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約５００を有する非ステロイド化合物である。
本発明のある実施例に従って、小分子は非エストロゲンステロイドホルモンであるのが好ましい。より好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約７５０を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約５００を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。
本発明のある実施例に従って、小分子はＳＨＰまたはＦＸＲの成熟または未熟形態または同等物をコードする遺伝子に結合する。さらに、本発明のある実施例は受容体またはリガンドに関してＳＨＰまたはＦＸＲの成熟または未熟形態と競合する小分子を意図し、上記の小分子はアテローム動脈硬化に対して有効量の組成物中にある。加えて、本発明はＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストである小分子を意図する。アンタゴニストは受容体に結合するが通常のリガンドによる通常の効果を誘導せず、それによって通常のリガンドの効果を遮断する構造アナログである。従って、ＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストはリガンドおよび／または受容体結合部位にて競合してＳＨＰまたはＦＸＲが結合するのを防止し、ＳＨＰまたはＦＸＲの活性を阻害するだろう。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明の実施例に従って容易にＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストを同定して同等物を調製することが可能だろう。
【００５３】
治療組成物
また治療組成物が提供される。本発明の組成物は上記のような、広範囲の状態を治療するのに有用である。例えば、本発明の治療組成物はヒト（好ましい）および非ヒト動物のような、哺乳類の血清低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール高値に使用可能である。例えば、動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、およびブタであってもよい。特別な適用はアテローム動脈硬化およびＬＤＬコレステロール高値に関係した他の状態の治療を含むが、それらに制限されない。
本発明の治療組成物は防止（すなわち、感染を防止するまたは感染の発症を低下させるため）または治療（すなわち、疾患または感染後の感染によって引き起こされる副作用を治療するため）のいずれかであってもよい。
組成物は本発明の薬剤を含んでもよい。そうするために、１つまたはそれ以上の薬剤が適当な濃度に調整されていずれの適当な希釈剤、担体、またはそれらのいずれの組み合わせによっても処方可能である。生理上許容される媒体が担体および／または希釈剤として使用されてもよい。これらは水、適当な等張性媒体、グリセロール、エタノールおよび他の従来の溶媒、リン酸緩衝生理食塩水、およびそれらの類似物を含むが、それらに制限されない。
処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与され、対象由来の細胞にエクスビボで、またはインビトロでデリバリー可能である。対象に直接デリバリーするために、投与は鼻腔内、非経口、経口、腹腔内、静脈内、皮下、またはエアロゾルスプレーによってのように、鼻腔内、経口、眼、肺、膣、または直腸表面のようないずれの粘膜表面に局所適用されるいずれの従来の形態によってもよい。
【００５４】
いずれの生物学上許容される投与形、およびそれらの組み合わせも、本発明の対象によって意図される。このような投与形の例はチュアブル錠、急速溶解錠、発泡錠、復元散剤、エリキシル、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、カプレット、ロゼンジ、チュアブルロゼンジ、ビーズ、散剤、顆粒、粒子、微粒子、分散顆粒、サケット、圧注剤、坐剤、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、持続性インプラント、内服剤、注射剤、注入剤、ヘルスバー、糖菓剤、家畜飼料、シリアル剤、シリアルコーティング剤、食品、栄養食品、機能性食品またはそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない。上記の投与形の調製は当業者に公知である。本発明の組成物は経口投与形であるのが好ましい。これらの投与形全ては当業者に公知である。
本明細書で使用される、「医薬上許容される」なる語は投与形が十分に高純度で不当な毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答、およびその類似物なく細胞、組織、または膜に接触させて使用するのに適することを意味する。
好ましい具体例において、本発明の治療組成物は生物学的対象に経口投与される。また、本発明の治療組成物はスープ形態で投与される。所望の味に変えるためにいずれのフレーバまたは食品をスープに加えてもよいと考えられる。
【００５５】
様々な添加剤が本発明の組成物に組み込まれてもよい。本発明の任意の添加剤はスターチ、砂糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク、それらの誘導体またはそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない。
また即時放出、拡張放出、パルス放出、可変放出、制御放出、時間放出、持続放出、遅延放出、長時間作用型、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない、様々な放出形態を組み合わせる投与形において本発明の対象の医薬組成物にて可能である。即時放出、拡張放出、パルス放出、可変放出、制御放出、時間放出、持続放出、遅延放出、長時間作用型特性、およびそれらの組み合わせを得る能力は当業者に入手可能な既知の方法および技術を使用して行われる。放出特性を得るためのこれらの各々の特定の技術または方法は当業者に公知である。本明細書にて使用される、「制御放出形態」なる語は制御放出として処方された成分を少なくとも１つ有するいずれの形態も意味する。本明細書にて使用される、「即時放出形態」なる語は即時放出として処方された医薬活性成分を少なくともいくつか有するいずれの形態も意味する。
以下の方法は本発明の対象の範囲内で行われない処方を調製する許容される方法を表すが、それらに制限されない。
急速溶解錠は例えば、経口投与後通常３０秒以内に、合成錠の溶解または崩壊を促進する、砂糖およびセルロース誘導体のような薬剤と処方を混合して、調製されてもよいが、それらに制限されない。
【００５６】
シリアルコーティング剤は例えば、フィルム状の活性成分、および賦形剤を形成した成分の表面に付着させるための精密なスプレーコーティング装置下でペレット、フレーク、または他の幾何学的形状に形成した後、シリアル形態を通して、調製されてもよいが、それらに制限されない。それ故治療される単位はシリアルコーティング剤を形成するために乾燥させる。
ヘルスバーは、処方および賦形剤（例えば、結合剤、充填剤、フレーバ、着色料、など）を混合してプラスチック硬度の塊に調製されてもよいが、それらに制限されない。塊は「キャンディーバー」形状を形成するように伸長または鋳造されて乾燥または凝固させて最終生成物を形成する。
ソフトゲルまたはソフトゼラチンカプセルは例えば、適当なビヒクル（植物油が一般に使用される）に処方を分散させて高粘度の混合物を形成して、調製されてもよいが、それらに制限されない。この混合物はソフトゲル産業に公知の技術および機械を使用してゼラチンを基礎にしたフィルムでカプセル封入される。それ故形成した産業単位は一定の重量まで乾燥する。
チュワブル錠は例えば、処方を設計した賦形剤と混合して飲み込むというよりむしろ噛むことを意図した比較的柔らかく、味付けされた錠剤投与形を形成することによって調製されてもよいが、それらに制限されない。従来の錠剤化機械および方法は、直接圧縮および圧縮前の、顆粒化、または強打の両方であるが、利用可能である。チュアブル投与形は医薬産業にて非常に一般的な投与形であるので医薬固形投与形製品に関係した人々は使用法および機械に精通している。
フィルムコーティング錠は例えば、錠剤上に隣接するフィルム層を付着させるための回転パンコーティング法またはエアサスペンション法のような技術を使用するコーティング錠剤によって調製されてもよいが、それらに制限されない。この方法はしばしば錠剤の美的外観を改善するのに行われるが、また錠剤の飲み込みを改善する、または不快な臭いまたは味を隠す、または不格好な未コーティング錠の性質を改善するために行われてもよい。
【００５７】
圧縮錠剤は例えば、結合能を崩壊能に加えることを意図した賦形剤と処方を混合して調製されてもよいが、それらに制限されない。混合物は直接圧縮または顆粒化のいずれかが行われて、当産業に公知の方法および機械を使用して圧縮される。生成した圧縮錠剤投与単位は市場の需要に従って、すなわち、単位投与量、ロール、バルク瓶、透明包装、などに包装される。
例えば、動物飼料は当業者に公知の方法によって製造されてもよい。動物飼料は処方を結合成分と混合してプラスチック塊を形成することによって調製されてもよい。塊は高圧下で押し出されて管状（または「スパゲッティ様」）構造を形成しペレットサイズに切断されて乾燥する。
本発明の対象は、経口、バッカル、舌下、直腸、非経口、局所、吸入、注射および経皮、好ましくは経口を含むがそれらに制限されない、いずれの経路によっても投与される処方した医薬組成物を意図する。栄養組成物、それらの処方、および投与経路の物理化学的性質は吸収にて重要である。吸収とは投与部位から体循環への栄養組成物の移動の過程のことをいう。経口投与した栄養組成物は第一に利便性、経済性、安定性、および患者受容性に関して錠剤またはカプセル形態であるだろう。それらは吸収が生じる前に崩壊および溶解しなければならない。本発明の対象の、上記の投与経路または投与形のいずれかでの、使用は当業者に入手可能な公知の方法および技術を使用して行われる。
本発明の対象は広範囲の物質から調製されてもよい生物学上許容される担体の使用を意図する。このような物質は希釈剤、溶媒、結合剤および接着剤、潤沢剤、可塑剤、崩壊剤、着色料、充填物質、フレーバ、甘味料および雑多な組成物を含むが、それらに制限されない。
【００５８】
結合剤は当業者に公知の他の従来の結合剤同様に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、または他の適当なセルロース誘導体、ポビドン、アクリル乾燥メタクリル酸コポリマー、医薬シロップ、ガム、乳清のような、ミルク誘導体、スターチ、およびそれらの誘導体のような広範囲の物質から選択されてもよい。制限しない毒性のない溶媒の例は水、エタノール、イソプロピルアルコール、塩化メチレンまたはそれらの混合物および組み合わせである。制限しない毒性のない充填物質の例は砂糖、ラクトース、ゼラチン、スターチ、および二酸化ケイ素を含む。
溶解修飾系に使用される可塑剤は前もって有機溶媒に溶解して溶液形態で加えられるのが好ましい。好ましい可塑剤はフタル酸ジエチル、セバシン酸ジエチル、クエン酸トリエチル、クロノチル酸、プロピレングリコール、フタル酸ブチル、セバシン酸ジブチル、ヒマシ油およびそれらの混合物から成るが、それらに制限されない群から選択されてもよい。明確であるように、可塑剤は事実上親水性と同時に疎水性であってもよい。フタル酸ジエチル、セバシン酸ジエチルおよびヒマシ油のような、非水溶性疎水性物質は水溶性物質の放出を遅延させるために使用される。対照的に、親水性可塑剤はカプセル封入フィルムを溶解する、表面にチャネルを作る、組成物を放出するのに有用な非水溶性物質が使用される場合に使用される。
本発明の対象の組成物は２４時間中１回またはそれ以上に分けて、すなわち、分割量にて、２４時間中単回投与、２４時間中２回投与、または２４時間中２回以上の投与で投与されてもよい。分割、２回または他の複数回投与は同時にまたは２４時間中の別の時間に投与されてもよい。
本発明の組成物はヒトおよび他の動物に関する使用を意図する。投与量は体重に従って調整されて体重に基づいて本明細書にて示されてもよい。例えば、処方が５５ｋｇの人に対して約１０−１０００ｍｇの範囲を指定する場合、その範囲は３５ｋｇの人に対して約６．３−６３０ｍｇ（例えば、より低い範囲限界（３５ｋｇ／５５ｋｇ）＊１０ｍｇ＝６．３ｍｇ）に調整されるだろう。小数の量は最も近い整数に四捨五入されてもよい。上記の方法にて本発明の組成物はサイズに関わりなく、いずれの動物も含む、いずれの個人にも適するように調整されるだろう。
【００５９】
ポリペプチド
本発明の方法はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を阻害する薬剤をスクリーニングする。ＳＨＰおよびＦＸＲに加えて、本発明はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を有するいずれの化合物の利用も意図する。例えば、ＳＨＰまたはＦＸＲアゴニストまたは配列において軽度の変異を有するがＳＨＰまたはＦＸＲと同様の効果を有する化合物。このような化合物はＳＨＰまたはＦＸＲ活性の阻害剤としてスクリーニングにて有用性を有するだろう。
例えば、標的化合物は配列番号：２または４の参考配列と同一の、すなわち１００％同一のポリペプチド配列を有しても、また参考配列と比較して％同一性が１００％以下であるようなある整数のアミノ酸変化まで含んでもよい。このような変化は少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的な置換を含む、置換、または挿入を含む。変化は参考ポリペプチド配列のアミノ末端部位またはカルボキシ末端部位またはそれらの末端部位間のいずれにも生じて、参考アミノ酸配列内または参考アミノ酸配列内の１つまたはそれ以上の連続する群内のアミノ酸間に各々個々に散在してもよい。
それ故、本発明はまた配列表に含有されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号：２または４）と配列同一性を有する単離したポリペプチドの使用を意図する。特定の配列によって、配列同一性の程度は５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上）であるのが好ましい。これらの同種タンパクは突然変異体および対立遺伝子多型を含む。
【００６０】
当該分野にて公知の、「同一性」は、配列を比較して定量されるような、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の関係である。当該分野にて、「同一性」はまたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の、場合によっては、このような配列の列間の一致によって定量されるような、配列関係性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」はComputational Molecular Biology、Lesk、A.M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993；Computer Analysis of Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M.およびDevereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991；およびCarillo、H.、およびLipman、D.、SIAM J.Applied Math.、48：1073（1988）に記載されるものに含むがそれらに制限されない、既知の方法によって容易に計算可能である。同一性を定量する好ましい方法は試験される配列間に最も多い一致を与えるように設計される。同一性および類似性を定量する方法は公的に入手可能なコンピュータプログラムに含まれる。２つの配列間の同一性および類似性を定量する好ましいコンピュータプログラム法はＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux、J.ら、1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul、S.F.ら、1990）を含むが、それらに制限されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である（BLAST Manual、Altschul、S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、Md.20894；Altschul、S.ら、1990）。既知のスミスウォーターマンアルゴリズムはまた同一性を定量するのに使用されてもよい。
【００６１】
例えば、一定の％同一性に関するアミノ酸変化数は複数の配列の１つからのアミノ酸総数を各パーセント同一性の数値パーセント（１００で割った値）と掛けて上記の複数の配列からのアミノ酸総数から上記の積を引くこと、すなわち：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸変化数であって、ｘａは複数の配列のアミノ酸総数であり、いずれのｙも、例えば、７０％で０．７０、８０％で０．８０、８５％で０．８５などであって、ｘａおよびｙの非整数積はそれをｘａから引く前に最も近い整数に四捨五入される
によって定量可能である。
修飾および変化はＳＨＰまたはＦＸＲの構造において生じるが、化合物はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を維持するだろう。あるアミノ酸は活性および／または抗原性をそれほど喪失せずに配列内の他のアミノ酸に置換可能である。なぜならポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのはポリペプチドの相互作用能および性質であって、あるアミノ酸配列置換はポリペプチド配列（または、当然、その基礎をなす配列をコードするＤＮＡ）内に作られるためであり、いずれにせよ類似能を有するポリペプチドを得ることができる。
それ故本発明は当業者に公知であるような本明細書に記載の反応性と本質的に同様の活性を提供する生物学的な同等物であるいずれの単離したポリペプチドも意図する。
【００６２】
本発明は配列番号：２または４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体であるポリペプチドを使用することを意図する。本明細書にて使用される、「変異体」なる語は参考ポリペプチドとは異なるポリペプチドを含むが、本質的な性質を維持する。一般に、相違は限定されていてその結果参考ポリペプチドおよび変異体の配列は全体として非常に類似していて、多くの領域にて、同一である（すなわち、生物学的に同等である）。変異体および参考ポリペプチドは１つまたはそれ以上の置換、付加、または欠失によっていずれの組み合わせにおいてもアミノ酸配列にて異なってもよい。置換または挿入アミノ酸残基は遺伝コードにコードされていてもされていなくてもよい。対立遺伝子多型のようなポリペプチドの変異体は自然に生じ、または自然に生じるか未知である変異体であるだろう。ポリペプチドの非自然的に生じる変異体は直接合成してまたは突然変異技術によって作られてもよい。
このような変化をつくる際に、アミノ酸ハイドロパシック指数が考慮されるだろう。ポリペプチドに相互作用する生物学的機能を与えるアミノ酸ハイドロパシック指数の重要性は当該分野にて一般に理解される（Kyte&Doolittle、1982）。あるアミノ酸が類似のハイドロパシック指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換可能であってそれでも類似の生物学的活性を有するポリペプチドであることが知られている。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシック指数を与えられた。それらの指数は以下の各アミノ酸に続く括弧内に記載される：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００６３】
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシック特性は生成したポリペプチドの２次および３次構造を決定し、同様にそれがポリペプチドの酵素、基質、受容体、抗体、抗原、およびそれらの類似物のような、他の分子との相互作用を定義すると考えられる。アミノ酸が類似のハイドロパシック指数を有する別のアミノ酸によって置換可能であって機能的に類似のポリペプチドを得られることが当該分野にて知られている。このような変化において、ハイドロパシック指数が＋／−２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１以内であるのが特に好ましく、＋／−０．５以内であるのがさらにより特に好ましい。
類似のアミノ酸の置換はまた親水性に基づいて行うことができ、特にそれらによって作られる生物学的機能が同等なポリペプチドまたはペプチドが免疫学的具体例における使用を意図される。米国特許番号第４，５５４，１０１号は、参照として本明細書の一部とする、隣接するアミノ酸の親水性に影響されるような、ポリペプチドの最も大きな局所的な平均親水性はその免疫原性および抗原性、すなわち、ポリペプチドの生物学的特性と相関することを記載する。
米国特許番号第４，５５４，１０１号にて詳述されるように、以下の親水性度はアミノ酸残基に与えられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似の親水性度を有する別のものに置換可能であって生物学的に同等の特に、免疫学的に同等のポリペプチドを得られることが理解される。このような変化において、親水性度が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるのが特に好ましく、±０．５以内であるのがさらにより特に好ましい。
【００６４】
上記に概説したように、それ故、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズおよびそれらの類似物に基づく。様々な上記の特性を考慮する模範的な置換基は当業者に公知であって：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。以下の表ＸＩＩＩに示されるように、適当なアミノ酸置換基は以下を含む：
【００６５】
【表５】
【００６６】
ポリペプチドの生物学的または機能的同等物はまた本発明の実施例に従って使用されてもよいような部位特異的突然変異を使用して調製可能である。部位特異的突然変異は第２世代ポリペプチド、または基礎をなすＤＮＡの特異的突然変異誘発を介する、その配列由来の、生物学的または機能的に同等のポリペプチドの調製に有用な技術である。上記に示されるように、このような変化はアミノ酸置換基が所望される場合に所望可能である。さらに技術は例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、１つまたはそれ以上の上記の考慮を入れる、配列変異体を容易に調製および試験する能力を提供する。部位特異的突然変異は十分な数の隣接するヌクレオチド同様に、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を介して突然変異体を産生し、両側の欠失連結部が妨害される安定した２本鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供することを可能にする。典型的には、長さ約１７ないし２５のヌクレオチドが好ましく、両側の配列連結部の約５ないし１０残基が変化する。
一般に、部位特異的突然変異の技術は当該分野に公知である。理解されるように、技術は典型的には１本鎖および２本鎖形態の両方で存在可能なファージベクターを使用する。典型的には、本明細書に従って部位特異的突然変異誘発法は最初にその配列内に選択されるＳＨＰポリペプチド配列の全てまたは一部をコードするＤＮＡ配列を含む１本鎖ベクターを得ることによって行われる。所望の変異配列を産生するオリゴヌクレオチドプライマーは例えば、既知の技術によって（例えば、合成して）、調製される。このプライマーは変異産生鎖の合成を完了させるために、１本鎖ベクターにアニールされて、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノー断片のような、酵素によって伸長される。それ故、ヘテロ２本鎖は一方の鎖が原型の非変異配列をコードして他方の鎖が所望の変異を産生するように形成される。このヘテロ２本鎖ベクターはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような、適当な細胞を転換するのに使用されて、変異を産生する組換えベクターを含むクローンが選択される。市販のキットが必要な試薬を提供する。
【００６７】
ポリペプチドはさらなる構造または機能分析、または試薬の産生における使用のために断片に有利に分裂されてもよい。これは精製または未精製のポリペプチドをエンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（ボエリンガー社、インディアナポリス、ＩＮ）のようなペプチダーゼで処理して達成可能である。ＣＮＢｒによる処理はペプチド断片が天然のＳＨＰまたはＦＸＲポリペプチドから産生されてもよい別法である。組換え技術はまたＳＨＰまたｈＦＸＲポリペプチドの特異的な断片を産生するのに使用可能である。
ポリペプチドは「成熟」または「未熟」タンパクの形態であっても融合タンパクのような大規模タンパクまたは中間物質の一部であってもよい。ポリペプチドは例えば、分泌またはリーダー配列、前配列、複数のヒスチジン残基のような精製を促進する配列、または組換え産物間の安定性に付加する配列を、含有する付加的なアミノ酸配列を含んでもよい。
ポリペプチド断片はまた本発明によって意図される。断片は全体的にアミノ酸配列の一部同様であるが、全てではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は例えば、少なくとも７個またはそれ以上の（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０個、またはそれ以上）アミノ酸配列の連続するアミノ酸を、を含むことができる。断片は「独立」していてもそれらが領域の一部、最も好ましくは単一の、連続する領域として形成するより大きなポリペプチド内に含まれてもよい。
ＳＨＰ活性の阻害剤を同定する方法にて使用されるポリペプチドはいずれの適当な方法にても調製可能である。このようなポリペプチドは天然に生じるポリペプチド、組換えて製造したポリペプチド、合成して製造したポリペプチド、およびこれらの方法を組み合わせて製造したポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの製法は当該分野に十分に理解される。
【００６８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびそれらに密接に関係したポリヌクレオチドを含む単離したポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは例えば、本発明の実施例に従って、細胞系にてＳＨＰまたは受容体遺伝子を発現するのに、使用されてもよい。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは単離したＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターを含むがそれらに制限されない。以下は本発明のある具体例に従って使用される２つのプロモーターである。
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
本発明のある具体例に従って、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターはヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列を含む。ヒトＣＹＰ８Ｂ１−５１４ないし＋３０３（配列番号：７）のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００７２】
【表８】
【００７３】
さらに、ポリヌクレオチドは検出物質（本明細書では検出物質遺伝子という）をコードする遺伝子を含んでもよい。例えば、検出物質は蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせを含んでもよいがそれらに制限されない。好ましくは、検出物質遺伝子は蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である。本発明のある実施例に従って、ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター（例えば、ヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列を含むＣＹＰ８Ｂ１プロモーター）および検出物質遺伝子を含むヌクレオチド配列はプラスミドまたはアデノウイルスのような、ベクターにクローニングされ、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子受容体のような構築物を形成するが、それらに制限されない。ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子
レポーターは細胞系を感染またはトランスフェクトさせてＣＹＰ８Ｂ１プロモーターが活性化された場合細胞系が検出物質を発現するのに使用されてもよい。
本発明のヌクレオチドはプロモーターまたはＳＨＰおよび／またはＦＸＲをコードする遺伝子を含んでもよい。プロモーターまたは遺伝子はＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含むベクターにクローニングされてもよい。
本発明のある具体例に従って、ＳＨＰプロモーターはベクターにクローニングされる。好ましくは、ＳＨＰプロモーターは以下の核酸配列を有する：
【００７４】
【表９】
【００７５】
本発明は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）をコードする遺伝子および／または肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）をコードする遺伝子を含んでもよい。ＳＨＰおよび任意にＨＮＦ４αをコードする遺伝子はＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターおよび検出物質遺伝子を含むベクターにクローニングされてもよい。ヌクレオチドは制限されない、単一のベクターまたは複数のベクターにクローニングされてもよい。
本明細書にて使用される「変異体」なる語は、参考ポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な性質を維持するポリヌクレオチドである。変異体のヌクレオチド配列における変化は参考ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもさせなくてもよい。ヌクレオチドの変化は参考配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合、および切断を生じてもよい。ポリヌクレオチドの変異体は対立遺伝子多型のような天然に生じるものであっても天然に生じるか未知である変異体であってもよい。天然に生じないポリヌクレオチドの変異体は突然変異誘発法または直接合成によって作られてもよい。
本発明はまた本明細書に記載のポリヌクレオチドに低ストリンジェント条件、より好ましくはストリンジェント条件、最も好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドを含む。ストリンジェント条件の例は以下のストリンジェント条件表に示される：高ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ａ−Ｆと同じくらいストリンジェントである；ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ｇ−Ｌと同じくらいストリンジェントである；および低ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ｍ−Ｒと同じくらいストリンジェントである。
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
ｂｐ１：ハイブッリド長はハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションした領域に対して予想されるものである。あるヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場合、ハイブリッド長はハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの長さであると予想される。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションされる場合、ハイブリッド長はポリヌクレオチドの配列を調整して最適な配列相補性を有する１つの領域または複数の領域を同定して定量可能である。
緩衝液Ｈ：ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はハイブリダイゼーションにてＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）で置換可能であるおよび洗浄緩衝液；洗浄はハイブリダイゼーションの完了１５分後に行われる。
ＴＢないしＴＲ：長さ５０塩基対以下と予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度はＴｍが以下の式に従って定量される場合、ハイブリッド融点（Ｔｍ）以下の５−１０ＥＣであるべきである。長さ１８塩基対以下のハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａの＃＋Ｔ塩基）＋（Ｇの＃＋Ｃ塩基）である。長さ１８ないし４９塩基対のハイブッリドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であって、Ｎはハイブッリド内の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣでは［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍである）。
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関するストリンジェント条件の別の例がSambrook、J.、E.F.Fritsch、およびT.Maniatis、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、chapters 9および11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology、1995、F.M.Ausubelら、eds.、John Wiley&Sons、Inc.、sections 2.10および6.3-6.4にて提供されて、参照として本明細書の一部とする。
【００７９】
本発明はまたこれらのヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチドを提供してまたアンチセンス配列を提供する。本発明のアンチセンス配列は、またアンチセンスオリゴヌクレオチドというが、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの発現を遮断する内部で産生される配列および外部から投与した配列の両方を含む。本発明のアンチセンス配列は、例えば、約１５−２０塩基対を含む。アンチセンス配列は、例えば、プロモーターが上流の非翻訳配列に結合するのを防止するまたはリボソームが結合するのを防止して本発明のポリペプチドをコードする転写産物の翻訳を防止することによって転写を阻害するように設計可能である。
本発明のポリヌクレオチドは多くの方法（例えば、ＤＮＡライブラリ、有機体自身から化学合成によって）で調製されて様々な形態（例えば、１本鎖、２本鎖、ベクター、プローブ、プライマー）を成すことができる。「ポリヌクレオチド」なる語はＤＮＡおよびＲＮＡ、およびまた修飾骨格を含有するようなそれらのアナログを含む。
本発明のポリヌクレオチドがポリペプチドの組換え製品用に使用される場合、ポリヌクレオチドは単独で、成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列、リーダー配列または分泌配列をコードするような、他のコード配列と共に読み枠内にある成熟ポリペプチドまたは断片のコード配列、プレ、プロ、またはプレプロタンパク配列、または他の融合タンパク部分を含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列はコード配列に結合可能である。ポリヌクレオチドはまた転写された、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡを安定化する配列のような、非コード５’および３’配列を含有してもよい。
【００８０】
投与法
本発明は対象に上記の組成物を投与する方法を意図する。対象は哺乳類または鳥類が可能である。好ましくは、対象はヒトである。適量の投与量で有効量の組成物が対象に投与されて所望の応答を引き出す。本明細書にて使用される、「有効量」は、哺乳類宿主に単一投与または一連の投与の一部のいずれかで、少なくとも治療される個人の系が所望の応答、例えば、アテローム動脈硬化の場合、血清ＬＤＬコレステロール値を減らす応答を生むようにするのに十分な量を投与することを意味する。保護は免疫原性組成物の単一投与によって与えられても、保護を維持するための後期の追加投与量に加えて、いくつかの投与量の投与を必要としてもよい。
投与量は年齢および体重のような、個人に特異的な条件によって変化可能である。この量は当業者に公知の方法による通常の試験にて定量可能である。
患者に本発明の組成物を投与するための様々な投与形が上記される。当業者によって定量される組成物を投与するためのいずれの適当な投与形も本発明によって意図される。
【００８１】
実施例
以下の実施例は説明であって本発明はそれらに制限されることを意図しない。
【００８２】
実施例１−エチニルエストラジオールはマウス肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害する
心臓血管疾患の発生率は閉経期前の女性に非常に低いが、閉経期以降で劇的に上昇するという観察に基づいてある研究が行われた。多くの研究はホルモン補充療法が閉経後の女性にて心臓血管疾患の発生率を低下させることができることを示した。エストロゲンは脂質プロフィールに有利な効果を有するが、脂質の変化は疾患の発生率の低下を部分的にしか説明できない。炎症はアテローム動脈硬化の過程の重要な成分である。エストロゲンのインビボにおける炎症を阻害する能力を研究するために、卵巣摘除メスＣ５７ＢＬ／６マウスをビヒクルまたはエチニルエストラジオール（ＥＥ）で４日間処理して続いてＩＬ−１βで１時間処理した。肝ＲＮＡの遺伝子チップ分析は約１００個の遺伝子がＩＬ−１βによって誘導されることを証明した。ＥＥによる処理はこれらの遺伝子の約３分の１の誘導を阻害した。ＥＥは発現基礎レベルを変化させないため、この効果は遺伝子活性に特異的であった。ＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害はＥＲαノックアウトマウスでは見られなかった。ＥＥによる処理はまた、その発現がＮＦ−κＢ活性を阻害することで知られる、プロスタグランジンＤシンターゼを含む、肝にて多くの遺伝子発現を阻害した。しかしながら、ゲニステインまたはラロキシフェンによる処理はＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害を維持するがプロスタグランジンＤまたは他の遺伝子発現を刺激しなかった。これらの結果はインビボのＥＲαが古典的なＥＲ介在遺伝子誘導を必要としない機序でＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害できることを示す。
マウス肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現の調節を評価するために実験が行われた。卵巣摘除Ｃ５７ＢＬ／６マウスをコーン油／エタノールビヒクルまたは１００μｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（ＥＥ）のいずれかの皮下投与で５日間前処理した。５日目に、マウスにＰＢＳまたはＰＢＳ中２０μｇ／ｋｇのＩＬ−１βのいずれかの腹腔内注射を行った。１時間後肝を除去してポリＡ化ＲＮＡを調製した。アフィメトリックス社製ネズミ１１Ｋ遺伝子チップを使用する分析によって広範囲の遺伝子発現を定量した。各遺伝子で、ビヒクル前処理およびＰＢＳを受けた動物における発現レベルを１．０と定義し、これに対してビヒクル前処理±ＩＬ−１βまたはＥＥ前処理±ＩＬ−１βを受けたマウスにおける発現レベルを定義した。示された結果は２つの独立した実験からの平均である。７５個の遺伝子がＩＬ−１βによる処理によって２倍以上増殖して誘導された。逆に、５個の遺伝子の発現がＩＬ−１βによって阻害された。
【００８３】
【表１２】
【００８４】
【表１３】
【００８５】
【表１４】
【００８６】
図１を参照して、エチニルエストラジオールがＩＬ−１βによる遺伝子発現の調節を遮断するかどうかを定量する研究結果を提供する。ビヒクル前処理を受けた動物（ｘ軸）対ＥＥによる処理を受けた動物（ｙ軸）で各遺伝子の折りたたみ調節をプロットする。ＥＥ前処理に影響されないＩＬ−１βによる誘導を伴う遺伝子は対角線上に沿って点在するだろう。大部分の遺伝子で、そうである。しかしながら、多くの遺伝子は有意に対角線の下にあり、ＥＥがこれらの遺伝子誘導を阻害したことを示す。例えば、ＩＬ−１βによるｂｃｌ−３、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびＦｎｋの誘導は全てＥＥ前処理によって低下した（また表ＩＩＩを参照）。トランスグルタミナーゼのようないくつかの遺伝子の発現はＥＥ＋ＩＬ−１β処理マウスにて増加して、トランスグルタミナーゼの発現を増加させるＩＬ−１βおよびエストロゲンの両方の既知の能力に一致した。逆に、ＥＥ前処理は有意に対角線の上にあるこれらの点によって示されるように、ＩＬ−１β介在ＳＨＰおよびＨｅｓ−１の抑制を阻害した。
図２を参照して、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＨＰ発現のＩＬ−１βによる阻害を以下のように試験した。ＩＬ−１βは典型的に遺伝子発現の抑制に関連しない。ＩＬ−１β介在ＳＨＰ発現の直接的な抑制を証明するために、ＨｅｐＧ２細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βで処理した。リアルタイムＰＣＲを使用してその後様々な時間で調製した総ＲＮＡをＳＨＰ発現に関して分析した。ＩＬ−１βによる処理３および６時間後でＳＨＰ発現を有意に低下させた（＊ｐ＜０．０５対時間０）。これはＳＨＰｍＲＮＡレベルがＩＬ−１β処理９時間後による基準レベルまで復帰するような細胞の生存を一般に低下させるためではなかった。
図３ａ、３ｂおよび３ｃを参照して、Ｆｎｋ、ＪＡＢ、およびＬＩＸのＥＥによる阻害がＩＬ−１βによる誘導に特異的であることを研究した。２つの可能な機序が遺伝子発現における明らかなＥＥ効果を引き起こすことができた。最初に、ＥＥはＩＬ−１β処理によって誘導される折りたたみ誘導に影響するのではなくて、遺伝子発現の基本レベルを変化させるだろう。別法として、ＥＥは基本的な遺伝子発現には全く影響しないがむしろＩＬ−１β介在遺伝子誘導を特異的に遮断するだろう。
【００８７】
図３ａを参照して、これら２つの機序を判別するために、ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の折りたたみ誘導およびＩＬ−１βによるＳＨＰの折りたたみ抑制をビヒクル（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のＥＥ（灰棒）で前処理した動物にて定量化した。各遺伝子の肝ＲＮＡレベル（平均＋／−標準誤差）を各々個々の動物由来のＲＮＡのリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、およびＬＩＸにおける折りたたみ誘導（ＩＬ−１βを受けた動物における発現のＰＢＳを受けた動物における発現に対する比率として定義される）はＥＥ前処理動物にて低下した。対照的に、ＩＬ−１βによるｂｃｌ−３およびＳＨＰにおける折りたたみ抑制はビヒクルおよびＥＥ処理動物にて同様であった。
図３ｂを参照して、ＥＥはｂｃｌ−３の基本的な発現を抑制してＳＨＰの基本的な発現を増加させた（ＥＥ処理マウスのビヒクル処理マウスに対する比較による）。ＥＥはこれらの遺伝子を調節するためのＩＬ−１βの直接的な能力に影響しなかった：ＩＬ−１によるｂｃｌ−３の誘導はビヒクル処理マウスで６．２倍およびＥＥ処理マウスで５．２倍であり、一方ＩＬ−１はビヒクル処理マウスで８６％およびＥＥ処理マウスで８５％ＳＨＰを抑制した。
図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅを参照して、ＥＥがエストロゲン受容体（ＥＲ）依存機序によってＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を遮断するかどうかを定量するための実験を行った。エストロゲンは抗酸化機序のようなＥＲ依存経路を含む多くの機序によって遺伝子発現を調節することができる。ＥＲがＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子調節の調節を媒介したことを証明するために、マウスをビヒクル＋ＰＢＳ（灰棒）、ビヒクル＋ＩＬ−１β（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（ＥＥ）、１または１０ｍｇ／ｋｇ／日の１７β−エストラジオール（各々、１個のＥ２および１０個のＥ２）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のゲニステイン、５ｍｇ／ｋｇ／日のラロキシフェン、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０で処理した。Ｆｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、ｂｃｌ−３およびＳＨＰの肝発現レベル（平均＋／−標準誤差）をリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＥＥおよびＥ２はこれらの遺伝子の調節に最も影響した（＊ｐ＜０．０５対ＩＬ−１β単独）。ゲニステインおよびＳＥＲＭラロキシフェンはまた効果はＥＥおよびＥ２で見られたほど大きくないが、同様の調節パターンを示した。最後に、純粋なＥＲアンタゴニストのＩＣＩ１８２７８０はこれらの遺伝子のいずれの発現にも影響しなかった。それ故これらの遺伝子の全ての調節はＥＲが仲介すると考えられる。
【００８８】
図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅを参照して、ＥＲαが肝におけるＥＥによる遺伝子発現の調節に必要されるかどうかを定量するために実験を行った。ＥＲαまたはＥＲβが肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現に対するＥＥの影響を仲介するかどうかを定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ＥＲαＫＯマウス、または１２９ＥＲβＫＯマウスをビヒクル（黒棒）または１０μｇ／ｋｇ／日のＥＥ（灰棒）で５日間前処理してその後ＩＬ−１βで１時間処理した。Ｆｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、ｂｃｌ−３、およびＳＨＰの肝発現レベル（平均＋／−標準誤差）をビヒクル＋ＰＢＳを受けた動物における発現を１．０と定義して、リアルタイムＰＣＲによって定量した。これらの遺伝子全てのＥＥによるＩＬ−１βによる調節の阻害パターンは野生型動物およびＥＲβ欠損動物にて比較可能であった（ビヒクルおよびＥＥ処理動物間の遺伝子発現の変化の比較に関するｐ＊＜０．０５）。対照的に、ＥＥはＥＲα欠損動物にてＩＬ−１βによるこれらの遺伝子の調節に全く影響しなかった。
表ＩＶを参照して、マウス肝におけるＥＥによる遺伝子発現の誘導を研究した。ＩＬ−１βによる遺伝子誘導のＥＥ調節に関する１つの可能な機序はＳＨＰ、既知の転写リプレッサーの誘導を介してであった。しかしながら、ラロキシフェンはＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸおよびｂｃｌ−３の誘導を阻害できるが、ラロキシフェンはＳＨＰ発現を増加させず、それ故この機序を薬理学的に除外した（図４）。ＥＥによるいずれの他の遺伝子誘導もＩＬ−１βによる誘導の阻害を説明できるかどうかを定量するために、遺伝子チップの結果をＥＥによる遺伝子発現の誘導に関して分析した。イノシトール−１−ホスフェートシンターゼ（ＩＰＳ）、腸管トレフォイル因子、クレアチンキナーゼ、および補体ファミリーの一員を含む、ＥＥ前処理によって誘導される多くの遺伝子がＥＥによって調節されていることがわかった。加えて、プロスタグランジンＤ２シンターゼはＥＥ処理によって強力に誘導された。インビトロにおけるプロスタグランジンＤシンターゼの過剰発現はＩＫＫ活性を遮断してＮＦ−κＢ活性化を阻害し、おそらくＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に関する別の機序を提供する。
【００８９】
【表１５】
【００９０】
図６ａおよび６ｂを参照して、ＥＥによる遺伝子発現の誘導がＥＲαによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に必要でないことを確認するために実験を行った。ＥＥによるプロスタグランジンＤシンターゼの誘導がＩＬ−１βによる遺伝子誘導のＥＲα介在阻害に必要であるかどうかを定量するために、ビヒクル＋ＰＢＳ（灰棒）、ビヒクル＋ＩＬ−１β（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のＥＥ、３０ｍｇ／ｋｇ／日のゲニステイン、５ｍｇ／ｋｇ／日のラロキシフェン、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０で処理したマウスにおけるプロスタグランジンＤシンターゼの肝発現レベルを定量した。ビヒクル＋ＰＢＳ処理マウスにおける発現レベルを１．０と定義した。これらのＲＮＡサンプルは図４にて使用されるものと同様であり、ＥＥ、ゲニステインおよびラロキシフェンのこれらの投与量は全てＩＬ−１βによる誘導を阻害した。しかしながら、これらの化合物のＩＬ−１βによる遺伝子誘導を阻害する能力（ＥＥ＞ゲニステイン＞ラロキシフェン）およびこれらの化合物のプロスタグランジンＤシンターゼの発現を刺激する能力（ＥＥ＞＞ラロキシフェン＞ゲニステイン）の間に相関は全くなかった。ＩＰＳの誘導に関して類似のパターンが見出され、ラロキシフェンによる誘導は非常に弱くゲニステインによる誘導は全くなかった。これはＥＲαによる遺伝子誘導がＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害する能力に必要でないことを示す。
図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅを参照して、肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害の有無を試験した。肝のＥＥ活性に関するＥＲαの必要性は肝にＥＲαがほとんど独占的に存在することに一致する（リアルタイムＰＣＲによって定量、パネルＡ）。対照的に、肺は比較的低レベルのＥＲαおよび高レベルのＥＲβを発現する。ＥＲβがまたＩＬ−１βの遺伝子発現を誘導する能力を修飾するかどうかを定量するために、ＥＥのＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の誘導を変化させる能力を肝、脾、および肺にて定量した。上記のように、ＩＬ−１βによるこれらの遺伝子誘導は肝にて有意に遮断された。脾におけるＩＬ−１βによるＦｎｋおよびＪＡＢの誘導もまたＥＥ前処理によって遮断された。脾は、肺に比べてある程度高いが、肝に比べて有意に低いレベルのＥＲαを発現する。対照的に、ＥＥ前処理は肺にてＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、またはｂｃｌ−３の誘導に全く影響しなかった。組織特異因子はこれらの結果に影響するだろうが、肺における調節の欠如はＥＲβがこれらの効果を仲介できず実際ＥＲαのＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を変化させる能力を阻害するという仮説に一致する。
【００９１】
図８を参照して、ＨｅｐＧ２細胞にてＥＲａおよびＥＲαによるＩＬ−１βによるＮＦκＢ活性誘導の阻害を評価した。肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３発現誘導の阻害の欠如はＥＲβが固有にこの阻害を仲介できないこと、または肝、脾、および肺間の組織特異的な相違のいずれかによるものであるだろう。ＥＲβのＩＬ−１βシグナル伝達を直接阻害する能力を定量するために、ＮＦκＢ誘導ルシフェラーゼレポータープラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照プラスミドと共にヒトＥＲαまたはＥＲβのいずれかを発現するプラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後細胞をビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール、または１０ｎＭの１７β−エストラジオール＋１ｕＭのＩＣＩ１８２７８０で処理した。後日細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間処理してルシフェラーゼ発現をアッセイした。ＥＲαおよびＥＲβは共にルシフェラーゼ活性を有意に抑制したが（＊ｐ＜０．０１）、ＥＲβはＥＲαに比べて常に有効でなかった。それ故肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の調節の欠如はＥＲβが固有にＩＬ−１βシグナル伝達を阻害できないことによるとは考えられない。確かに、肺における調節の欠如はＥＲによるＩＬ−１βシグナル伝達の阻害に必要な補助タンパクにおける組織特異的な発現の相違を反映するだろう。
以下の結論はこれらの実験結果から明らかである：（１）ＩＬ−１βによる１時間処理はマウス肝にて７５個の遺伝子の発現を誘導して５個の遺伝子の発現を阻害する；（２）ＥＥ前処理はＥＲα依存的にこれらのＩＬ−１βによる調節を阻害する；（３）ＥＥは基本的な発現を変化させるまたは遺伝子誘導を特異的に阻害することで遺伝子発現を調節できる；（４）ＥＲαによる遺伝子発現の誘導はＥＲαのＩＬ−１β介在遺伝子調節を遮断する能力に必要でない；および（５）ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の誘導は肝にて阻害されるが、高レベルのＥＲβを有する、肺ではない。これはＥＲβが固有にＩＬ−１βシグナル伝達を阻害できないことによらないが、おそらくＥＥによるＩＬ−１βシグナル伝達の阻害に必要な補因子における特異的な相違を反映するだろう。
【００９２】
実施例２−ＳＨＰ発現の調節
以下のように、ＳＨＰ発現の調節を調査するためにいくつかの実験を行った。図９を参照して、マウス肝におけるＥＲαによるＳＨＰ発現の調節を研究した。卵巣摘除野生型マウス、ＥＲαＥＲβダブルノックアウトマウス、ＥＲαＫＯマウス、またはＥＲβＫＯマウスをビヒクル、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２＋５ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０、５ｍｇ／ｋｇ／日のタモキシフェン、または５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＴの皮下注射で６週間処理した。ＳＨＰの肝発現をリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、モニターした。ＷＴ動物、Ｅ２、タモキシフェン、およびＥＲα選択的アゴニストのＰＰＴは全てＳＨＰｍＲＮＡレベルを誘導した。ＩＣＩ１８２７８０はこの誘導を阻害した。Ｅ２はＥＲαＫＯマウスまたはＥＲαβＫＯマウスの両方でＳＨＰの発現を誘導しなかった。ＥＲβＫＯマウスにおいてＳＨＰの基本的な発現は増加したが、Ｅ２はさらにＳＨＰの発現を誘導した。総合して、これらの結果はマウス肝におけるエストロゲンによるＳＨＰ誘導は主にＥＲαによって媒介されることを示す。
図１０を参照して、エストロゲンがラット肝にてＳＨＰを調節するかどうかを定量するためにある研究を行った。卵巣摘除スプラーグ−ドーリーラットをビヒクル、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２、または５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＴで６週間処理した。ＳＨＰの肝発現をリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、モニターした。Ｅ２およびＰＰＴの両方ともＳＨＰ発現を有意に誘導し、ＥＲａはまたラット肝にてもＳＨＰを誘導することを示す。
図１１ａおよび１１ｂを参照して、ヒト細胞におけるＥＲαによるｈＳＨＰプロモーター活性の調節を試験した。ヒトＨｅｐＧ２または２９３細胞に対照ＳＶ４０誘導β−ガラクトシダーゼプラスミド、１．４ｋｂのヒトＳＨＰプロモーターによって誘導されるルセリフェラーゼプラスミド、およびタンパクもヒトＥＲαもコードしない発現プラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクション後細胞をＤＭＳＯビヒクルまたは１０ｎＭのＥ２で２４時間処理した。β−ガラクトシダーゼ活性を正常化したルシフェラーゼ活性に関して細胞抽出物を分析した。Ｅ２はＥＲαを発現する細胞においてのみＳＨＰプロモーター活性を誘導した。これらの結果はＥ２がヒト肝にてＳＨＰ発現を調節することを示す。
【００９３】
図１２ａ、１２ｂ、および１２ｃを参照して、２９３細胞におけるＥＲαによるｈＳＨＰプロモーター活性の調節を試験した。図１２ａおよび１２ｂを参照して、２９３細胞に対照ＳＶ４０誘導β−ガラクトシダーゼプラスミド、１．４ｋｂのヒトＳＨＰプロモーターまたは合成２ｘＥＲＥ／ＴＫプロモーターによって誘導されるルセリフェラーゼプラスミド、およびヒトＥＲα発現プラスミドをコトランスフェクトした。後日細胞を１ｕＭの示される化合物（ＩＣＩ１８２７８０、４−ヒドロキシタモキシフェン、またはラロキシフェン）およびＤＭＳＯビヒクル（−）または１０ｎＭのＥ２（＋）で２４時間処理した。β−ガラクトシダーゼ活性を正常化したルシフェラーゼ活性に関して細胞抽出物を分析した。マウスで見られたように、Ｅ２およびタモキシフェンはＳＨＰプロモーター活性を刺激した。ＩＣＩおよびラロキシフェンは単独で不活でＥ２活性に拮抗した。ＳＨＰプロモーターはＥＲＥ誘導プロモーターとは有意に異なり、Ｅ２によるＳＨＰプロモーター活性の調節は古典的なエストロゲン応答配列を介して作用しないことを示す。
図１２ｃを参照して、Ｅ２によるＳＨＰの誘導および２ｘＥＲＥプロモーター活性に関する用量応答曲線を提供する。Ｅ２の約１０倍高い濃度がＳＨＰプロモーター活性に比べてＳＨＰプロモーター活性の誘導に必要とされた。ＳＨＰはＥＲ活性のネガティブレギュレーターであるため、ＳＨＰプロモーター活性化に必要とされる高いＥＣ５０はＥ２レベルが多量に達する場合このネガティブフィードバックループを誘導するだけの方法を反映するだろう。
図１３を参照して、２９３細胞においてＥ２応答配列をマッピングするためにある研究が行われた。一連のＳＨＰプロモーター切断レポータープラスミドをＥＲα発現プラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミドと共に２９３細胞にコトランスフェクトした。正常化ルシフェラーゼ活性をビヒクルまたは１０ｎＭのＥ２のいずれかで処理した２４時間後定量した。ビヒクルで処理した細胞における１４６０ｂｐのＳＨＰプロモーターの発現を１．０と定義した。２９３細胞における基本的な発現に影響する配列は−７９５ないし−５４９間に局在し、一方Ｅ２調節は−１４６０ないし−１２６０間に局在した。
【００９４】
図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃを参照して、ＥＲによる誘導によってＳＨＰがＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１を抑制できないかどうかを定量するためにある研究を行った。卵巣摘除マウスに対照食餌（−）またはコール酸塩を含有する食餌（＋）のいずれかを与えてビヒクル（−）または１０ｕｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（＋）の毎日の皮下注射によって５週間または５日間のいずれかで処理した。研究の最後で、ＳＨＰ、ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、定量した。ＥＥは５日間または５週間の処理のいずれかでコール酸塩によって見られた誘導に比べて少し低いレベルまでＳＨＰの発現を誘導した。しかしながら、ＥＥ処理はいずれの期間においてもＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の発現を有意に変化させず、対照的に、コール酸塩は９５％以上までＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の発現を抑制した。これらの結果はＳＨＰ発現の単純な誘導はＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１の強い抑制に適さないことを示す。
図１５を参照して、コール酸塩によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の抑制がＳＨＰ誘導に必要であるかどうかを試験するために実験を行った。卵巣摘除マウスにコール酸塩の濃度を増加させて５日間与えた。ＳＨＰ、ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによってＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら定量した。ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の有意な抑制が食餌中０．０３％のコール酸塩でのみ生じ、一方０．３％のコール酸塩が食餌に加えられるまでＳＨＰｍＲＮＡレベルの有意な増加は生じなかった。ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１抑制に比べてＳＨＰ誘導に１０倍のレベルのコール酸塩が必要であることはＳＨＰ発現の誘導がコール酸塩によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１発現の調節に関する唯一の機序ではないことを示す。
【００９５】
実施例３−化合物を同定してコレステロール生合成経路にてＳＨＰを阻害するための一時的トランスフェクション
ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター（転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってゲノムＤＮＡから単離した。生成したＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ２．１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）にＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を使用してＴＯＰＯクローニングした。正確な配列の確認後、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをＥｃｏＲＩ切断によって除去した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して生成したＤＮＡ断端を平滑にした。断片をＳｍａＩ切断ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシンから入手可能）にライゲーションして、ヒトＣＹＰ８Ｂ１プロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼレポーターを有する、ｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬを作製した。ヒトＨＮＦ４およびＳＨＰコード領域をＳＶ４０プロモーター発現ベクターｐＳＩ（プロメガ社）に類似の標準分子法によってクローニングした。
プラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトする。残りのＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、フェノールレッド媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１９９５−０６５）で維持する。トランスフェクションの間に、細胞をフェノールレッド除去ＤＭＥＭ高グルコース媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号３１０５３−０２８）、１０％チャコール処理ＦＢＳ（ハイクローン社、ローガン、ユタ、カタログ番号ＳＨ３００６８．０３）から成るアッセイ媒体に１２ウェルプレートの１ウェル当たり１ｘ１０５細胞でプレートする。後日、トランスフェクション試薬のＴｆｘ−２０（プロメガ社；Ｅ２３９１）を血清除去、フェノールレッド除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１０３９−０２１）中０．５μｇのｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、０．４μｇのｐＳＩ−ＨＮＦ４および１μｇ以下のｐＳＩ−ＳＨＰとＴｆｘ―２０のＤＮＡに対する比率２：１で混合し、室温で１０分間インキュベートする。細胞を血清除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄して媒体を吸引する。Ｔｆｘ−２０／ＤＮＡ混合物を加えて細胞を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション終了後、アッセイ媒体を加えて細胞をさらに２３−４８時間インキュベートする。アッセイ媒体を除去して細胞をＰＢＳで洗浄する。洗浄溶液を除去して２５０μｌの１ｘウミシイタケ溶解緩衝液（プロメガ社；Ｅ２８１０）を加える。プレートを１５分間振動プラットフォームに置く。溶解物を微小遠心チューブに移して３０秒間遠心して除去する。２０μｌのアリコートを微小蛍光プレート（テルモラボシステム社）に移す。１００μｌのウミシイタケアッセイ試薬を１回１ウェルに注入してＤｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計にて３０秒間隔でリーディングを行った。
【００９６】
図１６を参照して、得られたルシフェラーゼ活性をグラフに表す。ＳＨＰ発現プラスミドの付加はＨＮＦ４誘導ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター活性を用量依存的に抑制した。
試験化合物がＳＨＰ活性を阻害できるかどうかを定量するために、トランスフェクション後試験化合物をアッセイ媒体に加える。ルシフェラーゼ活性はＳＨＰアンタゴニストの存在下で増加するだろう。
上記方法の別の具体例はネオマイシン、ヒグロマイシン、またはピューロマイシンを含む標準の選択マーカーを使用して細胞にｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、ｐＳＩ−ＨＮＦ４、およびｐＳＩ−ＳＨＰプラスミドを安定してトランスフェクトすることである。
【００９７】
実施例４−化合物を同定してコレステロール生合成経路にてＳＨＰを阻害するためのアデノウイルス感染
ＡＤＥＡＳＹ系（キューバイオジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）に記載されるような標準技術を使用してレポーター遺伝子（例えば、蛍光ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）のヒトＣＹＰ８Ｂ１プロモーター誘導発現領域を含有するレポーターアデノウイルスを構築した。ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターレポーター構築物をまず転送ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅまたはｐＱＢＩ−ＡｄＢＮにクローニングする。生成したプラスミドをＰｍｅＩで直線化してｐＡｄＥａｓｙ−１、ウイルスベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３にコトランスフェクトする。組換え体をカナマイシンで選択してＰＣＲまたは制限酵素分析でスクリーニングする。
正確なプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａに形質転換してトランスフェクション性ＤＮＡをキアゲンマキシキットのような典型的な方法によって精製する。組換えアデノウイルス構築物をＰａｃＩで切断してそのＩＴＲ（逆方向末端反復）を暴露しウイルス粒子を産生するためにＱＢＩ−２９３Ａ細胞にトランスフェクトする。生成したプラークは標準法による増幅のために使用される。最終的に増幅させたアデノウイルスの塩化セシウム勾配法のような方法による精製に続いて、２９３細胞を使用して最終のアデノウイルスの残りを滴定する。ＨＮＦ４および／またはＳＨＰを発現するアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのような別の転送ベクターが使用されてもよいことを除いて、同様に調製する。
別の具体例はＨＮＦ４ａに反応することが知られている他のいずれのプロモーターを使用して（Naikiら、JBC 277：14011、2001を参照、このような遺伝子の表に関して、参照として一部とする）レポーター遺伝子の発現を誘導することである。
上記方法のさらに別の具体例はＨＮＦ４およびＳＨＰの両方を発現するために単一のアデノウイルを使用することである。この場合転送ベクターのｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰが使用される。ＳＨＰｃＤＮＡをＣＭＶ５プロモーター下流でクローニングする。ＧＦＰ遺伝子はＨＮＦ４ａ遺伝子に置換される。これらの工程は制限酵素断片組換え法またはより好ましくはオーバーラップＰＣＲ法のような標準技術によって達成される。生成した転送プラスミドはＣＭＶプロモーターさらにＳＨＰｃＤＮＡさらに内部リボソーム進入部分（ＩＲＥＳ）を含有してさらにＨＮＦ４ｃＤＮＡを含有してもよい。転送プラスミドｐＱＢＩ−ＡｄＢＭ５−ＰＡＧにて主要遅延プロモーター（ＭＬＰ）のような他のプロモーターをＣＭＶプロモーターの代わりに使用してもよい。この好ましい方法はＨＮＦ４が発現する全ての細胞にてＳＨＰが発現することを保証する。
【００９８】
さらに別の具体例はレポーター遺伝子の発現を誘導するヒトＣＹＰ７Ａ１プロモーター領域を含有するレポーターアデノウイルスと組み合わせてＣＰＦ（ＬＲＨ−１）を発現するアデノウイルスを使用することである。
アデノウイルスベクターが完成すれば、それらは感染ヒト細胞、最も好ましくはヒトヘパトーマＨｅｐＧ２細胞に使用される。細胞をアデノウイルスに媒体中３７℃で、典型的には５時間暴露する。細胞を洗浄してアデノウイルスと共に新鮮な媒体で栄養補充する。レポータープラスミドおよびＨＮＦ４発現プラスミドに適した感染の多重度（ＭＯＩ）を各ウイルスの様々なＭＯＩの重感染を使用するマトリックス分析によって定量する。同様に、ＳＨＰを発現するアデノウイルスに最適なＭＯＩを定量する。それ故最終アッセイにて、ｘＭＯＩとしてＣＹＰ８Ｂ１レポーターアデノウイルス、ｙＭＯＩとしてＨＮＦ４発現アデノウイルス、およびｚＭＯＩとしてＳＨＰ発現アデノウイルスで細胞を感染させる。感染後、細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。典型的には試験化合物をＤＭＳＯに溶解させて最終濃度約１０μＭで培養媒体に加える。２４ないし４８時間後、レポーター活性の発現を測定する。例えば、ルシフェラーゼ活性はＬＵＣ−ＳＣＲＥＥＮ蛍光ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニアから入手可能）または細胞を溶解させてルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）を使用することを含む多くの方法でモニターされてもよい。ルシフェラーゼ活性を増加させる化合物はＳＨＰ阻害剤として作用するだろう。
試験化合物がＳＨＰ阻害剤として作用していることを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞をｘＭＯＩとしてＣＹＰ８Ｂ１レポーターアデノウイルスおよびｙＭＯＩとしてＨＮＦ４発現アデノウイルスで感染させる。細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。ルシフェラーゼ活性を上記のようにモニターする。ＳＨＰ阻害剤はＳＨＰのないこれらの細胞内ではルシフェラーゼ活性を変化させないだろう。
【００９９】
実施例５−コール酸塩は炎症遺伝子発現を媒介する
卵巣摘除Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１６−２０ｇ）（タコニック社）を８群に分離した。５−７日後、マウスにカゼイン中心の食餌（＃８１１７、テストダイエット社、リッチモンド、ＩＮ）を５日間与えた。カゼイン食餌は粉末でコール酸（ＣＡ；Ｃ−１１２９、シグマ社、セントルイス、ＭＯ）またはウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ；Ｕ−５１２７、シグマ社、セントルイス、ＭＯ）の濃度を増加させて混合補充されていた。実験期間の終了時に、肝をＲＮＡ分析のために収集した。
【０１００】
ＲＮＡ分析
トリゾール試薬（ＢＲＬ）を使用して総肝ＲＮＡを調製して製造元のプロトコールに従ってＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００検出系（アプライドバイオシステムズ社）を使用するリアルタイムＰＣＲによって定量した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｃｔｏｒ ｖ１．７ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）を使用してデータを分析してアプライドバイオシステムズ社のプライマーキットを使用してＧＡＰＤＨまで正常化した。
【０１０１】
細胞実験
ＨｅｐＧ２細胞を培養基で５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で維持した。細胞を不完全培養基（熱不活化１０％ＦＢＳ、１％グルタマックス、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｉのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充したフェノールレッド除去ＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ））に６ウェルディッシュ（ファルコン社）の１ウェル当たり４−５ｘ１０５で播種した。細胞を血清除去媒体に移して２４時間後化合物をさらに２４時間加えた。細胞をＲＮＡ分析のために採取した。
【０１０２】
結果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコール酸塩含有高脂肪食を与えると３−５週間後マウス肝にて炎症遺伝子発現を誘導することが以前に示された（Liaoら、'93 JCI 91：2572、Evansら、'01 Circ Res 89：823＆Miyakeら、'00 JBC 275：21805）。これらの誘導を媒介する際のコール酸塩の相対的な寄与を定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＡ（０．０１−１．０％）の濃度を増加させて補充した普通の食餌を５日間与えた。図１Ａに示されるように、ＴＮＦα（４倍）、ＶＣＡＭ−１（３倍）およびＲＡＮＴＥＳ（１．７５倍）のｍＲＮＡの肝レベルの用量依存的な誘導が観察された。予想通り、７α−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）の用量依存的な抑制もまた観察された。
これらの結果はより慢性の研究における高脂肪食によって生じる酸化ストレスまたは高レベルの胆汁酸の作用に付随する潜在的な毒性がない場合で胆汁酸への急性暴露が炎症遺伝子発現を促進するのに十分であることを示した。インビボで、ＣＡは腸管にてＦＸＲと選択的に相互作用することが証明されたデオキシコール酸に変換される（Wang、'99 Mol Cell 3：543＆Makishima、'99 Science 284：1362）一方ＵＤＣＡのようなより親水性の胆汁酸はＦＸＲではなくプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）への結合を介して機能する（Heuman、'89 JLR 30：1161）。ＦＸＲを介するシグナル伝達が炎症遺伝子発現を生じるのに必要であるかどうかを定量するために、ＦＸＲへの結合を介する胆汁酸シグナル伝達は胆汁酸の主要なメカニズムの１つである１％ＵＤＣＡを普通の食餌に補充した。図１Ｂに示されるように、炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されなかったが一方ＵＤＣＡ処理はｃｙｐ７ａ発現を抑制してＰＸＲへの結合を介して機能する能力に一致してｃｙｐ３ａ発現を誘導した。
加えて、ＳＨＰ発現の誘導もまたＣＡのみで観察されてＵＤＣＡでは観察されずＣＡシグナル伝達におけるＦＸＲの必要性を支持した。
【０１０３】
実施例６−ＦＸＲ特異的胆汁酸によるＳＨＰおよびＲＪＰ１４Ｏの誘導
さらにＦＸＲを介する胆汁酸シグナル伝達が炎症遺伝子活性を促進できる可能性を調査するために、肝細胞系、ＨｅｐＧ２にて実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）（１−１００ｕＭ）または選択的合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４（１−１０００ｎＭ）の濃度を増加させて２４時間処理した。ＣＤＣＡはＣＡに比べてＨｅｐＧ２細胞におけるｃｙｐ７ａ発現のより強力な阻害剤であるため（Makishimaら、'99 Science 284：1362）これらの実験でＣＤＣＡを使用した。ＨｅｐＧ２細胞は常時ＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦを含む多くの炎症遺伝子を発現する（Stonansら、'99 Cytokine 11：151）。ＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理は用量依存的にＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦ発現の両方を誘導した。ポジティブコントロールとして、ＳＨＰｍＲＮＡの誘導およびｃｙｐ７ａの抑制を確認した。これらの結果はＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４を介する選択的なＦＸＲの活性化が炎症遺伝子誘導を引き起こすことができることを証明する。
図１９、２０ａおよび２０ｂを参照してＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤＣＡおよびＧＷ４０６４の相対的な発現が説明される。
【０１０４】
これらの実験は炎症遺伝子発現を促進するＦＸＲの新規の機能を証明する。胆汁酸含有高脂肪食がマウス肝にて炎症遺伝子誘導を３−５週間後引き起こすことができることは以前に証明された（Liaoら、'93 JCI 91：2572＆Evansら、'01 Circ Res 89：823）。しかしながら、これらの誘導は胆汁酸と組み合わせた高脂肪食によって引き起こされる酸化ストレスを介して生じて肝毒性を反映すると考えられた（Delzenneら、'92 Toxicity Letters 61：291）。これらの起こり得る紛らわしい問題を避けるために、これらの研究を普通の食餌マウスにおける急性の胆汁酸暴露で行った。結果は０．３％ＣＡの補充が炎症遺伝子発現を誘導するのに十分であることを証明した。この濃度のＣＡはまたＦＸＲ介在遺伝子調節の予想した生物学的活性を確認するｃｙｐ７ａ遺伝子を有意に阻害した。より親水性の胆汁酸、ＵＤＣＡが、普通の食餌に補充された場合炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されなかったが、それでもｃｙｐ７ａの抑制は確認された。これはＵＤＣＡのＰＸＲ結合能によると考えられる（Schuetzら、'01 JBC 276：39411）。これに一致するのはよく特徴付けられたＰＸＲ調節遺伝子の、ｃｙｐ３ａ活性の誘導であった。これらの結果はＰＸＲではなくＦＸＲのリガンドが肝にて炎症遺伝子発現を誘導できることを証明する。これらの結論はＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦの炎症遺伝子誘導がまた胆汁酸ＣＤＣＡまたは合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４の存在下で観察されたＨｅｐＧ２細胞実験にて支持された。ＧＷ４０６４は同様にＩＣＡＭ−１誘導で観察されたものと比較して９０ｎＭのＥＣ５０を有するＦＸＲの特異的リガンドであることが以前に特徴付けられた（Goodwinら、'00 Mol Cell 6：5 17）。
ＳＨＰ発現はＦＸＲに結合する胆汁酸またはＧＷ４０６４によって誘導可能であるため（Goodwinら、'00 Mol Cell 6：5 17＆Sinal、'00 Cell 102：73 1）、ＳＨＰｍＲＮＡレベルもまたモニターした。ＦＸＲリガンドのＣＤＣＡおよびＧＷ４０６４のみがＳＨＰ発現を誘導可能であってＰＸＲリガンドのＵＤＣＡでは不可能であることを確認した。近年、ＳＨＰがインビトロでＮＩＰ−ＫＢのコアクチベーターであることが示された（Kim、'01 JBC）。ＮＩＰ−ＫＢは炎症遺伝子発現における主要な転写因子であってＦＸＲリガンドが如何にして炎症遺伝子発現を可能にするかの説明を可能にする。
【０１０５】
実施例７−発現誘導を仲介する際のコール酸塩の相対的寄与率
これらの誘導を仲介する際のコール酸塩の相対的寄与率を定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコール酸（ＣＡ；０．０１−１．０％）の濃度を増加させて補充した普通の食餌を５日間与えた。ＴＮＦＯＣ、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの肝レベルでの用量依存的な誘導を観察した。７（ｘ−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）の用量依存的な抑制もまた観察した。インビボにて、ＣＡは腸管でデオキシコール酸に変換されて、選択的にＦＸＲと相互作用し、一方ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）のようなより親水性の胆汁酸はＦＸＲではなくＰＸＲへの結合を介して機能する。ＦＸＲを介するシグナル伝達が炎症遺伝子発現を引き起こすのに必要であるかどうかを定量するために、１％ＵＤＣＡを普通の食餌に補充した。
特に、図２１ａ−ｄを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに示されるような、普通の食餌、アテローム性食餌または高脂肪食（コール酸ナトリウム除去アテローム性食餌）のいずれか与えた。５週間後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。＊ｐ＜０．０１対普通の食餌のマウス。図２２ａ−ｂを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに示されるようなコール酸の濃度を増加させて補充した普通の食餌を与えた。５日後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。図２３ａ−ｂを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１％デオキシコール酸で補充した普通の食餌を与えた。５日後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。Ｂ。１％コール酸（ＣＡ）またはＵＤＣＡのいずれかを５日間与えたマウスにおける肝ＳＨＰｍＲＮＡ発現の比較。データを各群の平均±標準誤差として報告した。
炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されず一方ＵＤＣＡ処理はｃｙｐ７ａを抑制してそのＰＸＲ結合を介して機能する能力に一致してｃｙｐ３ａ発現を誘導した。加えて、ＳＨＰ発現の誘導もまたＵＤＣＡではなくＣＡ処理で観察されてＣＡシグナル伝達におけるＦＸＲの必要性を支持した。
【０１０６】
ＦＸＲを介する胆汁酸シグナル伝達が炎症遺伝子発現を促進できる可能性をさらに調査するために、肝細胞系、ＨｅｐＧ２細胞にて実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）または選択的合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４の濃度を増加させて２４時間処理した。ＩＣＡＭ−１発現がＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理によって用量依存的に誘導された。
図２４ａ−ｄを参照して、ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）の濃度を増加させて２４時間処理した。示した遺伝子の内因性ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各Ｂ群の平均±標準誤差として報告した。上記と同様の実験設計は細胞をＧＷ４０６４に対する高濃度のＦＸＲで処理することを除く。データを各群の平均±標準誤差として報告した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス。図２５を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＧＷ４０６４の経口単回投与で（５０ｍｇ／ｋｇ）処理した。投与後の様々な時間で、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。
図２６を参照して、ＨｅｐＧ２細胞にヒトＳＨＰの近位プロモーター領域（−３６０ないし＋４０）またはヒトＩＣＡＭ−１プロモーターの配列欠失（−１１０８または−８１０ないし＋１８）を含有するヒトＦＸＲおよびＲＸＲα発現プラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＧＷ４０６４（１ｕＭ）で２４または４８時間処理した。データは３つの独立したトランスフェクションの平均±標準偏差を表す。
ポジティブコントロールとして、両化合物でＳＨＰｍＲＮＡの誘導およびｃｙｐ７ａの抑制を確認した。ＨｅｐＧ２細胞にて、これはＩＣＡＭ−１プロモーター活性がまたＧＷ４０６４によって刺激されてその活性において近位ＮＦ−κＢ応答配列を必要としたことを証明する。ＳＨＰは炎症遺伝子発現に関連した主要な転写因子である、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットにおいてコアクチベーターとして作用することが証明された。これはＦＸＲシグナル伝達がＳＨＰ発現の誘導を介するＮＦ−κＢ介在炎症遺伝子発現を誘導するという証拠を提供する。
【０１０７】
実施例８−炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する化合物を同定する一過性トランスフェクション
ＮＦ−κＢプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってゲノムＤＮＡから単離する。ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を使用して生成したＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ２．１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）へＴＯＰＯクローニングする。正確な配列の確認後、ＮＦ−κＢプロモーターをＥｃｏＲＩ切断によって除去する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して生成したＤＮＡ断片の末端を平滑化する。断片をＳｍａＩ切断ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシンから入手可能）へライゲーションしてＮＦ−κＢプロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼレポーターを有する、ｐＮＦ−κＢ−ＲＬを作製する。ヒトＳＨＰまたはＦＸＲコード領域をＳＶ４０プロモーター発現ベクターｐＳＩ（プロメガ社）へ類似の標準分子法でクローニングする。
プラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトする。残りのＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、フェノールレッド媒体（インビトロジェン社、ギブコカタログ番号１１９９５−０６５）で維持する。トランスフェクションの間に、細胞をフェノールレッド除去ＤＭＥＭ高グルコース媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号３１０５３−０２８）、１０％チャコール処理ＦＢＳ（ハイクローン社、ローガン、ユタ、カタログ番号ＳＨ３００６８．０３）から成るアッセイ媒体に１２ウェルプレートの１ウェル当たり１ｘ１０５細胞でプレートする。後日、トランスフェクション試薬のＴｆｘ−２０（プロメガ社；Ｅ２３９１）を血清除去、フェノールレッド除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１０３９−０２１）中０．５μｇのｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、０．４μｇのｐＳＩ−ＨＮＦ４または１μｇ以下のｐＳＩ−ＳＨＰとＴｆｘ―２０のＤＮＡに対する比率２：１で混合し、室温で１０分間インキュベートする。細胞を血清除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄して媒体を吸引する。Ｔｆｘ−２０／ＤＮＡ混合物を加えて細胞を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション終了後、アッセイ媒体を加えて細胞をさらに２３−４８時間インキュベートする。アッセイ媒体を除去して細胞をＰＢＳで洗浄する。洗浄溶液を除去して２５０μｌの１ｘウミシイタケ溶解緩衝液（プロメガ社；Ｅ２８１０）を加える。プレートを１５分間振動プラットフォームに置く。溶解物を微小遠心チューブに移して３０秒間遠心して除去する。２０μｌのアリコートを微小蛍光プレート（テルモラボシステム社）に移す。１００μｌのウミシイタケアッセイ試薬を１回１ウェルに注入してＤｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計にて３０秒間隔でリーディングを行った。
【０１０８】
試験化合物がＳＨＰ活性を阻害できるかどうかを定量するために、試験化合物をトランスフェクション後アッセイ媒体に加える。ルシフェラーゼ活性はＳＨＰアンタゴニスト存在によって増加する。
上記の方法の別の具体例はネオマイシン、ヒグロマイシン、またはピューロマイシンを含む標準の選択マーカーを使用して細胞にｐＮＦ−κＢ−ＲＬおよびｐＳＩ−ＳＨＰプラスミドを安定してトランスフェクトすることである。
【０１０９】
実施例９−炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する化合物を同定するアデノウイルス感染
ＡＤＥＡＳＹシステム（キューバイオジェン、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）に記載されるような標準的な技術を使用してレポーター遺伝子（例えば蛍光ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）のヒトＮＦ−κＢプロモーター誘導発現領域を含有するレポーターアデノウイルスを構築する。ＮＦ−κＢプロモーターレポーター構築物をまず転送ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅまたはｐＱＢＩ−ＡｄＢＮにクローニングする。生成したプラスミドをＰｍｅＩで直線化してＥ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３へｐＡｄＥａｓｙ−１、ウイルスプラスミドと共にコトランスフェクトする。組換え体をカナマイシンで選択してＰＣＲまたは制限酵素分析でスクリーニングする。
正確なプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａへ形質転換してトランスフェクション性ＤＮＡをキアゲンマキシキットのような典型的な方法によって精製する。組換えアデノウイルス構築物をＰａｃＩで切断してそのＩＴＲ（逆方向末端反復）を暴露しウイルス粒子を産生するためにＱＢＩ−２９３Ａ細胞にトランスフェクトする。生成したプラークは標準法による増幅のために使用される。最終的に増幅させたアデノウイルスの塩化セシウム勾配法のような方法による精製に続いて、２９３細胞を使用して最終のアデノウイルスの残りを滴定する。ＦＸＲまたはＳＨＰのいずれかを発現するアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのような別の転送ベクターが使用されてもよいことを除いて、同様に調製する。
別の具体例はＨＮＦ４ａに反応することが知られている他のいずれのプロモーターを使用して（Naikiら、JBC 277：14011、2001を参照、このような遺伝子の表に関して、参照として一部とする）レポーター遺伝子の発現を誘導することである。
【０１１０】
上記方法のさらに別の具体例はＨＮＦ４およびＳＨＰまたはＦＸＲの両方を発現するために単一のアデノウイルを使用することである。この場合転送ベクターのｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰが使用される。ＳＨＰｃＤＮＡをＣＭＶ５プロモーター下流でクローニングする。ＧＦＰ遺伝子はＨＮＦ４ａ遺伝子に置換される。これらの工程は制限酵素断片組換え法またはより好ましくはオーバーラップＰＣＲ法のような標準技術によって達成される。生成した転送プラスミドはＣＭＶプロモーターさらにＳＨＰｃＤＮＡさらに内部リボソーム進入部分（ＩＲＥＳ）を含有してさらにＨＮＦ４ｃＤＮＡを含有してもよい。転送プラスミドｐＱＢＩ−ＡｄＢＭ５−ＰＡＧにて主要遅延プロモーター（ＭＬＰ）のような他のプロモーターをＣＭＶプロモーターの代わりに使用してもよい。この方法はＨＮＦ４が発現する全ての細胞にてＳＨＰが発現することを保証する。
さらに別の具体例はレポーター遺伝子の発現を誘導するヒトＮＦ−κＢプロモーター領域を含有するレポーターアデノウイルスと組み合わせてＣＰＦ（ＬＲＨ−１）を発現するアデノウイルスを使用することである。
アデノウイルスベクターが完成すれば、それらは感染ヒト細胞、最も好ましくはヒトヘパトーマＨｅｐＧ２細胞に使用される。細胞をアデノウイルスに媒体中３７℃で、典型的には５時間暴露することによって感染を達成する。細胞を洗浄してアデノウイルスと共に新鮮な媒体で栄養補充する。レポータープラスミドおよびＳＨＰ発現プラスミドに適した感染の多重度（ＭＯＩ）を各ウイルスの様々なＭＯＩの重感染を使用するマトリックス分析によって定量する。それ故最終アッセイにて、ｘＭＯＩとしてＮＦ−κＢレポーターアデノウイルスおよびｙＭＯＩとしてＳＨＰ発現アデノウイルスで細胞を感染させる。感染後、細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。典型的には試験化合物をＤＭＳＯに溶解させて最終濃度約１０μＭで培養媒体に加える。２４ないし４８時間後、レポーター活性の発現を測定する。例えば、ルシフェラーゼ活性はＬＵＣ−ＳＣＲＥＥＮ蛍光ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニアから入手可能）または細胞を溶解させてルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）を使用することを含む多くの方法でモニターされてもよい。ルシフェラーゼ活性を増加させる化合物はＳＨＰ阻害剤として作用するだろう。
【０１１１】
試験化合物がＳＨＰ阻害剤として作用していることを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞をｘＭＯＩとしてＮＦ−κＢレポーターアデノウイルスで感染させる。細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。ルシフェラーゼ活性を上記のようにモニターする。ＳＨＰ阻害剤はＳＨＰのないこれらの細胞内ではルシフェラーゼ活性を変化させないだろう。
具体例を参照して上記に説明および記載されるが、本発明は示した詳細に制限されることを意図しない。むしろ、様々な修飾が請求項と同等の範疇および範囲内で本発明の精神から離れず詳細になされてもよい。それ故、本発明はその精神または本質的な特性から離れず他の具体的な形態で具体化されてもよい。本具体例は、それ故、あらゆる点で説明であって制限するものではなく、本発明の範疇は添付の請求書によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
（原文に記載なし）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を同定する方法であって、アテローム動脈硬化、炎症性腸疾患、腎疾患などの、炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成に関連した状態を防止および／または治療するための薬剤を含む組成物を調製および使用する方法に関する。本発明は炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤に関する。例えば、短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）およびファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）などの、核受容体の阻害剤に関する。本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関する疾患または状態を防止および／または治療するのに有効な組成物を含む、このような阻害剤を含む組成物に関する。本発明はさらに炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を阻害する薬剤を調製および同定するのに用いられる感染細胞系およびベクターに関する。
【０００２】
（背景技術）
炎症遺伝子発現は増え続ける病状および疾患に関連する。例えば、アテローム動脈硬化、腎および炎症性腸疾患は科学文献にて炎症遺伝子発現と関連付けられている。炎症性疾患に感受性を与えるまたはこれらの疾患の一部によって共有される異常な炎症過程に寄与する共通の遺伝的変異が存在する可能性があると仮定されている。これらの状態を組み合わさった影響が実質的な公衆衛生的な問題を表し、特にこれらの状態の各々が単独でこのような深刻な医学的な問題を表す。
コレステロール生合成経路もまたヒトにて有意な病状と関連付けられる。例えば、アテローム動脈硬化、または動脈硬化は、先進国における全死亡率の半分以上の原因で米国における死因の第１位である。冠動脈に影響する場合（例えば、冠動脈疾患（ＣＨＤ））、大部分の心臓発作の根本原因で鬱血性心不全および不整脈の一般的な原因である。
病理学的過程はごく初期に動脈内膜に沈着した脂質から成る脂肪線条を伴って始まる。泡沫細胞として知られる修飾マクロファージがプラーク領域に蓄積する。これらの泡沫細胞が脂質、特に酸化低比重リポタンパク（ＬＤＬ）を蓄積する。これらのリポタンパクおよびコレステロールエステルは内膜下線維芽細胞によるコラーゲン合成を誘発する。病変が線維性物質で浸潤されると、動脈内腔に突出する。病変自体が動脈を閉塞することは稀であり、むしろ血餅がプラークの先端に形成され、それが通路を閉鎖する。
【０００３】
慢性病変は石灰化して血管の弾性は低下する。この動脈硬化は血流抵抗の増加および血圧の増加を引き起こす。体内のいずれの血管も理論的にはアテローム動脈硬化によって影響されるが、大動脈、冠状動脈、頸動脈および腸骨動脈が最もよく影響される。特定領域の虚血または梗塞は特定の症状および臨床転帰を引き起こす。
高血圧、高コレステロール、低ＨＤＬ（高比重リポタンパク）、喫煙、糖尿病、年齢、性別、運動不足、および心臓疾患の家族歴はアテローム動脈硬化の進行の危険因子である。
アテローム動脈硬化は動態過程であって血漿リポタンパクが低下すればアテローム形成の進行は緩徐となるだろう。いくつかの薬理学的アプローチは高脂血症の根本原因によく依存する。食事療法が第一に行われるが薬物療法の一部として継続されなければならない。
ナイアシン（ニコチン酸）は最も有意にＬＤＬ産生を阻害して血漿ＬＤＬ値を低下させる。肝臓でのコレステロール合成もまた阻害される。ＨＤＬ値はＨＤＬ崩壊の低下によって増加する。血餅タンパクのフィブリノーゲンは低下して「クロットバスター」組織プラスミノーゲンアクチベーターが増加し、共にプラークにおける血餅形成を制限するのに重要であるだろう。
【０００４】
副作用は皮膚の血管拡張および温熱覚、悪心、腹部不快感、皮疹または皮膚乾燥を含む。たとえビタミンであるとしてもコレステロールを低下させる投与量においていくつかの重篤な副作用を有し、それ故ナイアシンを受ける患者は内科医によってモニターされるべきである。
クロフィブレートはトリグリセリドに富むリポタンパクのクリアランスを増加させて間接的に肝臓におけるコレステロール合成を阻害する。最も一般的な副作用は腹部不快感および悪心である。稀に起こる毒性効果として、皮膚炎、肝機能異常、骨髄抑制、および時に男性の性欲減退が挙げられる。
コレスチポールのような胆汁酸結合樹脂は経口摂取される非常に大きな陽イオン交換樹脂である。腸にて、胆汁酸と結合して再吸収を阻害する。結果として胆汁酸の排泄が増加して血漿におけるＬＤＬ値が低下する。最も一般的な副作用は便秘、膨満感、胸焼け、および下痢である。
ネオマイシンはコレステロールの腸内再吸収を阻害する抗生剤でそれによって胆汁酸は血漿ＬＤＬを低下させる。重篤な副作用は低用量のネオマイシンでも生じるだろう。悪心、腹部疝痛、下痢および吸収不良が生じるだろう。また、耐性微生物が増殖して全腸炎（小腸および大腸の炎症）を引き起こすだろう。
【０００５】
スタチンは現在入手可能な最も有効なコレステロールを低下させる薬物である。それらはアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンを含む。それらは血液内のＬＤＬコレステロール（悪玉コレステロールと見なされる）およびトリグリセリドを低下させる一方でＨＤＬコレステロールを増加させる。ＨＤＬコレステロールはコレステロールを崩壊することができる肝臓にコレステロールを輸送するので「善玉コレステロール」と見なされる。これらの薬物は主にトリグリセリドを低下させる有効性、能力および費用によって異なる。しかしながら、スタチンは一般に期間の約５０％またはそれ以下しか有効でない。
コレステロールはアテローム動脈硬化にて観察される血管を損傷するプラーク形成に関与するその深刻な悪影響でよく知られるが、コレステロールはまたステロイドホルモンおよび胆汁酸の合成に使用され、細胞膜の成分として重要である。食事にて消費されるコレステロールに加えて、体もまたコレステロールを作る。細胞内コレステロール合成の律速段階はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素と呼ばれる酵素の作用に関係すると一般に考えられている。スタチンは、またＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤とも呼ばれ、この酵素を阻害して、細胞のコレステロール合成能を低下させる。
【０００６】
アテローム動脈硬化による損傷は狭窄した血管を通る血流を制限するアテローム動脈硬化性プラークだけでなく、脆弱なプラークの破裂からも生じる。実際、ほとんどの問題は血餅形成を開始する物質を放出する破裂したプラーク由来である。プラーク内のコレステロールで満たされたスカベンジャー型の細胞は破裂しそうなプラークを作る物質を分泌する。スタチンはプラークを安定化するようである。最近の研究でまたスタチンが内膜を改善することが示された。内皮細胞は血餅形成および溶解に関係し、冠状動脈疾患を有する人々の機能不全に関係するようである。
スタチンは様々な副作用に関連してそれ故多くの患者にはあまり耐えられない。例えば、スタチンの有する肝毒性の危険性があるので血液検査が定期的に観察される。さらに、多くの薬物およびある食物はこれらの薬物と相互作用する。特定の人に、スタチンは筋炎（ミオパチー）を引き起こす。実際、これはいくつかの他のコレステロールを低下させる薬物またはエリスロマイシンを受けている人によく生じる。筋肉痛の発生は非常に重篤だろう。多くの場合で、筋攣縮が横紋筋融解症として知られる重篤な筋炎を形成するまで進行して腎不全を引き起こすだろう。これらの薬物の閉経後女性への副効用は骨成長刺激による骨粗鬆症および結果的な骨折の危険性を低下させることである。
【０００７】
コレステロールを低下させる様々な市販の（ＯＴＣ）栄養補助食品が糠油から作られる。それらはビタミンＥに類似の活性を有するトコトリエノールを含有する。それらは体によるコレステロール合成を低下させるスタチンのように作用する。今のところ、それらの有効性および安全性は確立されていない。
上記の治療法の欠点を考えて、アテローム動脈硬化に関与する経路を理解する本質的な努力がなされた。特に、コレステロールのホメオスタシス経路を理解する、例えば、コレステロール低下を改善する薬剤を同定する努力がなされた。例えば、ＳＨＰはコレステロールホメオスタシス経路に示された。具体的には、肝性胆汁酸ホメオスタシスが胆汁酸の取り込みおよび合成に関連する遺伝子のネガティブフィードバックを阻害して調節され、胆汁酸が胆汁酸合成の律速遺伝子、コレステロール７アルファ−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）を阻害性の核受容体として作用する、ＳＨＰの胆汁酸受容体（ｆｘｒ）活性化を通して、ダウンレギュレーションすることが報告された。Densonら、Gastroenterology、121（1）：218-20（2001）を参照。ＳＨＰ遺伝子によりコードされるタンパクは推定リガンド結合ドメインを含有するが従来のＤＮＡ結合ドメインを欠くオーファン受容体である。該タンパクは核ホルモン受容体ファミリーのメンバーであり、小型の疎水性ホルモンによって調節される転写因子の一群であり、そのサブセットは既知のリガンドを有さず、オーファン核受容体と呼ばれる。ヒトオーファン核ホルモン受容体であるＳＨＰタンパクはSeol,W.ら、Science、272：1336-39（1996）によって最初に特徴付けられた。しかしながら、今までに誰一人としてＳＨＰを阻害できる化合物を同定したことはない。
【０００８】
アテローム動脈硬化の例は例示であり、同様のケースが腎疾患および炎症性腸疾患などの多種の他の状態および疾患に当てはまる。各例にて、状態の以前の防止法および／治療法は患者によるそれらの有効性および／または許容範囲の点で不完全である。それ故、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関連した状態に対して有効で、患者に十分に許容される薬剤の必要が残る。
さらに、以前は炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰまたはＦＸＲの活性を阻害するのに有効である薬剤を効果的に、確実に費用効率高く同定することができる、または対象における炎症性疾患発現および／またはコレステロール生合成に関連した状態に対して有効なそれらに基づいた製品を発展させることができる方法は全くなかった。
従って、薬剤を同定するのに用いられる細胞系、ベクターおよびプロモーター同様に、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を低下させるのに有効な薬剤を同定する必要が残る。さらに、同等物を含む治療組成物と同様に、ＳＨＰおよびＦＸＲのような、核受容体の阻害剤として有効な薬剤の必要が残る。また炎症性腸疾患および腎疾患のような、炎症性疾患に対して有効な組成物の必要と同様に、コレステロール高値を減らしてアテローム動脈硬化および他のコレステロール高値に関連した状態を防止および治療するのに有効な組成物の必要も残る。さらに、また炎症遺伝子活性およびコレステロール生合成に関連した状態のような、多数の関連状態に対して一般に有効な組成物および治療法の必要も残る。また上記の組成物の有効な調製法および投与法の必要も残る。
【０００９】
（発明の開示）
これらおよび他の必要を満たすために、およびその目的の観点にて、本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を同定、調製および投与する方法を提供し、上記の方法にて用いられる感染細胞系、ベクターおよびプロモーターを同様に提供する。薬剤を同定する本発明の方法は確実で、効率良く費用効率が高い。
本発明の具体例は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を阻害するのに有効な薬剤を同定する方法であって：（ｉ）短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）または（ｉｉ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に薬剤を投与すること；および細胞培養にて検出物質の増加を引き起こす薬剤を選択することを含む方法を提供する。
本発明のさらなる具体例は対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成に関連した状態を防止または改善する方法であって：本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって選択される薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらなる具体例は本明細書に記載される本発明の方法のいずれかによって選択される薬剤を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例は核転写因子ＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染、トランスフェクトまたは改変した細胞培養に投与した場合にルシフェラーゼの増加を引き起こすと特徴付けられる薬剤を含む組成物であって、上記の細胞培養が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現する組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例はＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含む：プロモーター／検出物質遺伝子レポーターであって、上記のＮＦ−κＢプロモーターが検出物質遺伝子の前に位置するプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを提供する。
【００１１】
本発明のさらなる具体例は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８またはそれらの組み合わせの核酸配列を含むポリヌクレオチド：を含む単離したＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１またはＳＨＰプロモーターを提供する。
本発明のさらなる具体例は非天然脱活性型短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）：を含む組成物を提供する。
本発明のさらなる具体例は配列番号：１−４のいずれかに結合する薬剤：を含む組成物を提供する。
上記の概要および以下の詳細な説明は本発明の模範であるが、本発明を制限するものでないことが理解されるだろう。
【００１２】
（図面の簡単な記載）
図１はエチニルエストラジオールによるＩＬ−１βの阻害を説明する線グラフである。
図２はＩＬ−１βによるＨｅｐＧ２におけるＳＨＰ発現の阻害を説明する線グラフである。
図３ａ、３ｂおよび３ｃはＦｎｋ、ＪＡＢおよびＬＩＸのエチニルエストラジオールによる阻害がＩＬ−１βに特異的であることを説明する棒グラフである。
図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、および４ｅはエチニルエストラジオールがエストロゲン受容体（ＥＲ）依存性メカニズムによってＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を遮断することを説明する棒グラフである。
図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、および５ｅはＥＲαが肝にてエチニルエストラジオールによる調節に必要とされることを説明する棒グラフである。
【００１３】
図６ａおよび６ｂはエチニルエストラジオールによる遺伝子発現の誘導がＥＲαによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に必要とされないことを説明する棒グラフである。
図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、および７ｅはエチニルエストラジオールによるＩＬ−１βの阻害が肺にはないことを説明する棒グラフである。
図８はＨｅｐＧ２細胞におけるＥＲαおよびＥｒβによるＩＬ−１βによるＮＦ−κＢ活性の誘導の阻害を表す棒グラフである。
図９はＥＲαによるマウス肝におけるＳＨＰ発現の調節を表す棒グラフである。
図１０はラット肝におけるエストロゲンによるＳＨＰの調節を説明する棒グラフである。
【００１４】
図１１ａおよび１１ｂはＥＲαがヒト細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する棒グラフである。
図１２ａおよび１２ｂはＥＲαが２９３細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する棒グラフである。
図１２ｃはＥＲαが２９３細胞にてｈＳＨＰプロモーター活性を調節することを説明する線グラフである。
図１３は２９３細胞にてＥ２応答配列の位置を説明するマップである。
図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃはＥＲによるＳＨＰの誘導がＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１を抑制できないことを説明する棒グラフである。
【００１５】
図１５はコール酸によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の抑制がＳＨＰの誘導を必要としないことを説明する線グラフである。
図１６はＨｅｐＧ２にてＨＮＦ１／ｐＳＩによって促進されるＣＹＰ８Ｂ１プロモーターに対するＳＨＰ／ｐＳＩを滴定することからわかるルシフェラーゼ活性を表す。
図１７はＴＮＦ−アルファ、ＶＣＡＭ−１およびＲＡＮＴＥＳｍＲＮＡの肝レベルの用量依存的な誘導を説明するグラフである。
図１８ａおよび１８ｂはＵＤＣＡおよびＣＡの相対的なＳＨＰ発現を説明するグラフである。
図１９はＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤＣＡの相対的な発現を説明するグラフである。
【００１６】
図２０ａはＨｅｐＧ２細胞におけるＧＷ４０６４の相対的な発現を説明するグラフである。
図２０ｂはＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理による用量依存的に誘導されるＭ−ＣＳＦ発現を説明するグラフである。
図２１ａ−ｄはコール酸塩に依存する炎症遺伝子発現を説明する棒グラフである。
図２２ａ−ｄは急速コール酸塩処理が用量依存的に炎症遺伝子発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２３ａ−ｄはＵＤＣＡが炎症遺伝子発現を誘導しないことを説明する棒グラフである。
【００１７】
図２４ａ−ｄはＦＸＲアゴニストがＨｅｐＧ２細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２５はＧＷ４０６４がインビボでＩＣＡＭ−１発現を誘導することを説明する線グラフである。
図２６はＧＷ４０６４がＩＣＡＭ−１プロモーター発現を誘導することを説明する棒グラフである。
【００１８】
（発明の詳細な記載）
胆汁酸は腸からの脂溶性栄養素の消化および吸収に必要な両親媒性ステロイド洗剤であって胆汁酸およびコレステロール代謝を調節する核受容体ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のリガンドであることが示された。胆汁酸は肝にて合成され、胆汁中に分泌され、回腸にて再吸収されて、門脈循環を通して肝に再輸送されて律速酵素、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）をコードする遺伝子を抑制して胆汁酸合成を阻害する。オーファン核受容体ＳＨＰ（短鎖ヘテロ二量体共役物質）のＦＸＲ介在誘導はＳＨＰのアンタゴニストであるＬＲＨ−１（肝受容体ホモログ−１）活性、ｃｙｐ７ａ発現を制御する転写因子を介してｃｙｐ７ａの抑制を引き起こす（Goodwin 00 Cell & Lu 00 Cell）。それ故、高脂血症および胆汁鬱滞性肝疾患を制御する場合にＦＸＲおよびＳＨＰアンタゴニストの治療可能性が提供された。
ＦＸＲシグナル伝達経路における新規の機能が肝にて炎症遺伝子発現を誘導する可能性に関することが予期せず発見された。胆汁酸が非特異的な機序で肝マクロファージにて炎症性サイトカインを誘導することは以前に証明された（Miyakeら、00 JBC 275：21805）。ＦＸＲを介したシグナル伝達に加えて、胆汁酸はまた炎症遺伝子発現を引き起こすことが可能なタンパクキナーゼＣシグナル伝達経路を直接活性化することが示された（Stravitz 95 JLR）。本明細書にて我々は肝細胞系、ＨｅｐＧ２にて炎症遺伝子発現を直接活性化する活性化ＦＸＲの能力を証明する。ＨｅｐＧ２細胞の胆汁酸、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、または合成ＦＸＲリガンドのＧＷ４０６４による処理は炎症遺伝子の細胞間接着分子（intracellular adhesion molecule）（ＩＣＡＭ−１）およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の誘導を引き起こす。さらに以下の証拠はＦＸＲシグナル伝達がＳＨＰ発現の誘導を介してＮＦ−κＢ介在炎症遺伝子発現を誘導することを示す。これらの結果は炎症遺伝子発現を促進する活性化ＦＸＲの新規の役割を示唆する。ＦＸＲは大部分が肝、腸、副腎および腎にて発現するため、ＦＸＲまたはＳＨＰアンタゴニストは例えば、アテローム動脈硬化、炎症性腸疾患のような疾患および腎疾患にて抗炎症活性を証明できた。
【００１９】
上記の予期せぬ発見に基づいて、本明細書ではコレステロール合成経路および／または炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する薬剤を同定する方法が提供される。
本明細書で「組成物」または「治療組成物」および「複数の組成物」または「複数の治療組成物」なる語は、各々、同義的に使用される。それ故、複数形は単数形を含んで単数形は各用語の複数形を含む。
ある成分を「含む」組成物の説明はまた同様の成分から本質的に成るまたはそれらから成るその組成物を含む。
本明細書で用いられる「治療組成物」なる語は内部および外部の両方にて、細胞、組織、器官または系を治療するのに有用な組成物を意味する。
本明細書で用いられる「治療有効量」なる語は標的の病状を治療するのに有効な量を意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる、「医薬上許容される」なる語は、記載される組成物またはその成分が十分に高純度で不当な毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答、およびその類似物なく皮膚、組織、または膜に接触させて使用するのに適することを意味する。
「コレステロール高値」なる語は当業者によって不健康である種の治療の適当な標的であると考えられる血清低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール値のことを言う。現在、１ｄＬ当たり２２０ｍｇ（１Ｌ当たり５．７ｍｍｏｌ）以上の血清ＬＤＬコレステロール値が不健康と考えられて治療の標的である。
本発明は炎症性疾患活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤および組成物を調製および同定する方法であって対象におけるコレステロール生合成に関連した炎症性疾患または状態を防止および／または治療する組成物を使用する方法に関する。さらに本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成を阻害する薬剤の調製および同定に使用される感染細胞系およびベクターに関する。
【００２１】
本発明はまた本発明の方法によって同定した炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成の阻害剤として有効な薬剤を提供する。例えば、本発明は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）およびファルネソイド受容体（ＦＸＲ）のような、核受容体の阻害剤、特に炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路におけるＳＨＰおよびＦＸＲの阻害剤に関する。本発明はアテローム動脈硬化、炎症性腸疾患および腎疾患のような、炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成に関連する疾患または状態を防止および／または治療するのに有効な組成物を含む、このような阻害剤を含む組成物に関する。
さらに、本発明はコレステロール高値およびアテローム動脈硬化のような、関連疾患を改善および防止する組成物および方法を提供する。コレステロール高値および関連状態の改善および防止に有用な組成物を同定するために、本明細書ではコレステロールホメオスタシス経路におけるＳＨＰ活性を阻害する薬剤のスクリーニングに高性能および有効である方法が提供される。
本発明の治療組成物は単独またはいずれの他の医学的アプローチおよび／または治療法と組み合わせても使用可能である。本発明の治療組成物の使用に関連した副作用または問題は全く確認されていない。
【００２２】
例えば、本発明の組成物および方法はまたコレステロール高値ではないが、コレステロール高値またはそれに関連した疾患の危険性のあることが証明される個人の場合に適している。高血圧、高コレステロール、低ＨＤＬ（高比重リポタンパク）、喫煙、糖尿病、年齢、性別（３５ないし４４歳の白人男性の死亡率は白人女性の６倍である）、運動不足、心臓疾患の家族歴、などのような、広範囲の危険因子が当業者に公知であるとして考慮されるだろう。例えば、制限されないが、本発明の組成物はコレステロール高値またはアテローム動脈硬化のような、一般にそれに関連した疾患に遺伝的な傾向のあることが見出される人々、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）低値を有する人々、高血圧の人々、特定のライフステージの人々、などに投与されるだろう。例えば低ＬＤＬの場合、血清高比重リポタンパク（ＨＤＬ）コレステロール高値は心臓を保護すると考えられるが、低値は早期ＣＨＤ（冠動脈疾患）の有力な兆候である。ＨＤＬ低値単独はＨＤＬコレステロール値１ｄＬ当たり３５ｍｇ（１Ｌ当たり０．９０ｍｍｏｌ）またはそれ以下、ＬＤＬコレステロール値１ｄＬ当たり１６０ｍｇ（１Ｌ当たり４．１５ｍｍｏｌ）以下およびトリグリセリド値１ｄＬ当たり２５０ｍｇ（１Ｌ当たり２．８３ｍｍｏｌ）以下と定義される。もちろん、これらの危険因子のいずれも新規の研究が行われるにつれて時間とともに変化するだろう。本発明はいずれかのこのような変化を考慮するように意図される。さらに、当業者はこのような状況を容易に同定して、本明細書にて提供される案内に基づいて、本発明の組成物を適当に投与することが可能である。
【００２３】
核ホルモン受容体は様々な生理学的、発生学的、および毒物学的過程に関連するリガンド活性化転写因子である（Mangelsdolfら、1995；BlumbergおよびEvans、1998；Kliewerら、1999）。これらの受容体は高度に保存されたＤＮＡおよびリガンド結合ドメインを有してそれらの二量化能に基づいて２つの群に細分される。第１群はエストロゲン、プロゲステロン、および糖質コルチコイド受容体を含み、それら全てはホモ二量体としてそれらの同族ＤＮＡ応答配列に結合する。第２群はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ビタミンＤ受容体、および甲状腺ホルモン受容体を含み、それら全てはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）として知られる共通の相手とヘテロ二量体を形成する。
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、高度に保存された核受容体スーパーファミリーＤＮＡ結合ドメイン由来の変性オリゴヌクレオチドプローブを使用してラット肝ｃＤＮＡライブラリから単離され、この第２群に属する。高濃度のファルネゾール、メバロン酸経路のイソプレン代謝産物は、活性化ＦＸＲであることが見出された（Formanら、1995）。マウスオーソログＲＩＰ１４が酵母２方向ハイブリッドアッセイを餌としてヒトＲＸＲリガンド結合ドメインを使用してクローニングされてファルネソイドによってほとんど活性化されないことが見出された（Seolら、1995）。その代わりに、レチノイン酸および合成レチノイドのＴＴＮＰＢ｛（Ｅ）−４−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフチレニル）−１プロペニル］安息香酸｝が生理的濃度を超えるが、ＦＸＲの有力な活性剤であることが証明された（Zaviackiら、1997）。ファルネソイドおよびレチノイドはＦＸＲの有用な初特性を可能にするが、活性化に高濃度が必要とされるのはこれらの化合物が内因性リガンドの前駆物質であるまたは特定の他の関連生理的リガンドの作用を模倣していることを示す。
【００２４】
ＳＨＰはリガンドが未知の核ホルモン受容体スーパーファミリーの１つである。ＳＨＰタンパクのホモロジーによる分子モデリングはＳＨＰ（白ストランド）がゲイエレチノイン酸とＲＸＲの複合体（赤ストランド）のリガンド結合ドメイン上にモデリングされる下図に示されるように、古典的リガンド結合受容体構造を達成可能であることを示す。ＳＨＰは必要な疎水性アミノ酸およびコアクチベーターまたはコリプレッサーとの電荷で固定された相互作用の形成に必要な負に帯電したアミノ酸を含む古典的なヘリックス１２を含有する。
以下は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）をコードする遺伝子の核酸配列であって、本明細書では配列番号：１と指定される。
【００２５】
【表１】
【００２６】
以下は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）ポリペプチドのアミノ酸配列であって、本明細書では配列番号：２と指定される。
【００２７】
【表２】
【００２８】
以下はＦＸＲをコードする遺伝子の核酸配列である：
【００２９】
【表３】
【００３０】
以下はＦＸＲのアミノ酸配列である。
【００３１】
【表４】
【００３２】
本発明は例えばＳＨＰまたはＦＸＲと結合または競合して、炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲの活性を阻害する薬剤（小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換え受容体、抗体、など）の同定および／または改善に関する。これらの薬剤はコレステロールホメオスタシス経路にて胆汁酸合成におけるＳＨＰまたはＦＸＲの負の効果を阻害してそれによって血清ＬＤＬコレステロール値を有効に低下させるおよび／または炎症遺伝子発現経路におけるＳＨＰまたはＦＸＲの負の効果を阻害することができる。
【００３３】
ＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤の同定法
ＳＨＰまたはＦＸＲのリガンドは未知であるため、それらの活性に影響する分子を同定する結合アッセイは不可能である。本発明は炎症遺伝子発現および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲ活性を阻害する薬剤を同定する新規の方法を対象とする。
本明細書の実施例が証明するように、我々はエストロゲンがＥＲα依存機序を介してＳＨＰの発現を誘導することができることを立証した。このＳＨＰ誘導は肝細胞における胆汁酸合成および胆汁酸値を低下させると予想されるだろう。これはＦＸＲ活性低下および血漿トリグリセリドの上昇を伴うアポＣＩＩ産生低下を引き起こすことができる。さらに、胆汁酸合成の低下は胆汁における胆汁酸のコレステロールに対する比率低下によって胆石形成傾向の増加を引き起こすことができる。興味深いことに、ホルモン補充療法中の女性はこれら２つの効果を示す：トリグリセリド値の増加および胆石罹患率の増加を有する。これはＳＨＰ活性の薬理学的操作が観察可能な生理的変化を引き起こすことを示す。それ故ＳＨＰ活性の阻害はコレステロールの胆汁酸への転換を増加させてトリグリセリド値を上昇させる。これらはアテローム動脈硬化の患者において非常に好ましい効果である。
【００３４】
本発明の具体例に従って、炎症遺伝子発現経路および／またはコレステロール生合成経路におけるＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤を同定する方法はスクリーニングアッセイを含む。スクリーニングアッセイは候補薬剤を得て候補薬剤を（ｉ）ＳＨＰまたは（ｉｉ）ＦＸＲを発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に投与することに関する。ＳＨＰおよび／またはＦＸＲを阻害する候補薬剤は検出物質の増加を引き起こす。それ故、有効な薬剤は各候補物質の投与後に感染細胞にて検出物質の増加をモニターして多数の可能な候補薬剤のいずれかから選択されるだろう。
ある具体例に従って、ＮＦ−κＢプロモーターはチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを含んでＴＫプロモーターの上流に２つのＮＦ−κＢ応答配列の複製がある。
本発明の具体例に従ってＳＨＰ阻害剤を同定する別の方法は、一般にＬＲＨ−１およびＳＨＰクローンの全長を構築し、ＬＲＨ−１受容体を作製して、アデノウイルス構造を発現し、細胞系を選択してスクリーニングパラダイムを確立することに関する。本発明の実施例に従って、その過程は：ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有する、ＳＨＰ、および任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染、トランスフェクトまたは改変して感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出することに関する。
【００３５】
本明細書ではコレステロール生合成経路および／または炎症遺伝子発現経路の両方における阻害剤として有効な特定の薬剤を同定する方法が提供される。本発明の別の実施例に従って、その過程は：ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有するＳＨＰおよび任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染させて感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出する；ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをクローニングする；検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）の前にクローニングしたＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをベクターに挿入してＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを形成する；ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子）レポーターを有する、ＳＨＰ、および任意にＨＮＦ４αを発現する細胞培養を感染させて感染細胞培養を形成する；感染細胞培養に薬剤を投与する；および感染細胞培養において検出物質（例えば、ルシフェラーゼ）の増加を検出することに関する。
ある具体例に従って、ＳＨＰおよび／またはＦＸＲのタンパク値は薬剤がタンパクにまたはおそらくヌクレオチドレベルで作用しているか否かを証明するためにモニターされる。例えば、ＳＨＰを発現する細胞は（例えば、エピトープ標識によってまたは６または７個のアミノ酸のフラグ標識を使用して）標識されても当業者に公知であるような、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたはある適当な技術を使用してレベルモニターされてもよい。
【００３６】
以下の開示は上記の方法を実施するための様々な具体例を記載する。さらに、ＳＨＰ阻害剤としてのいずれの候補化合物を同定するための特別なアッセイの全過程を示す特別な実施例が以下（実施例３および４を参照）に提供される。実施例３は細胞培養のプラスミドでのトランスフェクトを使用して本発明のある実施例に従ってアッセイを行う特別な方法を提供する。実施例４は細胞培養をアデノウイルスで感染させる好ましい特別な方法を提供する。本発明の方法を使用すれば、ＳＨＰおよびＦＸＲ阻害剤が同定されるだろう。本明細書にて提供される開示に基づいて、当業者は本発明の様々な具体例に従って容易に上記の方法を行えるだろう。それ故、当業者は本明細書にて提供される情報に基づいて容易にＳＨＰまたはＦＸＲ阻害剤を同定するアッセイを構築できるだろう。
【００３７】
発現系およびベクター
宿主細胞（および同等物を含む細胞培養）は一般に本発明の発現系、それらの一部、またはポリヌクレオチドを組み込んで設計される。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はDavisら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）およびSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Mannual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、または感染によって、行われる。
適当な宿主の代表例はラット細胞（例えば、ラットヘパトーマ培養細胞）、マウス細胞（例えば、マウスヘパトーマ細胞）、ウサギ細胞、ヒト細胞およびそれらの類似物のような、哺乳類細胞を含む。例えば、適当な細胞はＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ細胞、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせを含む。
組換え産生ポリペプチドは高性能液体クロマトグラフィ、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、リン酸セルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含む、既知の方法によって組換え細胞培養から再生および精製される。
【００３８】
多くの様々な発現系が使用される。このような発現系は特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド、サルモネラのような弱毒化細菌（米国特許番号第４，８３７，１５１号）、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、ワクシニアウイルスおよび他のポックスウイルス、シンドビスウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのような、パポバウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのようなアルファウイルス（米国特許番号第５，６４３，５７６号）、水疱性口内炎ウイルスのような非分節性マイナス鎖ＲＮＡウイルス（米国特許番号第６，１６８，９４３号）のようなウイルス由来のベクター、およびプラスミドおよびコスミドおよびファージミドのような、バクテリオファージ遺伝因子由来のベクターのような、それらの組み合わせ由来のベクター、を含む。発現系はプロモーターおよび（ポリアデニル化シグナルのような）他の調節因子のような、発現を生じさせると共に調節する制御領域を含むべきである。一般に、宿主におけるポリペプチドを産生するポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するのに適したいずれの系またはベクターが使用されてもよい。適当なヌクレオチド配列は例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual（supra）；またZhangら、Journal of Biological Chemistry、276（45）：41690-41699（2001）；Goodwinら、Molecular Cell、6：517-526（2000）；およびSinalら、Cell、102：731-744（2000）を参照、に示されるような、様々な既知および通常の技術のいずれかによって発現系に挿入されてもよく、各々はその全体を明示することによって本明細書の一部とする。
【００３９】
本発明はまた本発明のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター、配列ベクター、クローニングベクター）、一般に本発明のベクターで設計される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生を提供する。無細胞翻訳系はまた本発明のＤＮＡ構造由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパクを産生するのに行うことができる。
好ましいベクターはレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および所望の細胞親和性を有する他の組換えウイルスのような、ウイルスベクターである。それ故、機能的または変異タンパクまたはポリペプチド、またはそれらの断片をコードする遺伝子はウイルスベクターを使用してまたはＤＮＡの直接導入を介してインビトロで導入可能である。標的組織における発現はウイルスベクターまたは受容体リガンドを有するような、トランスジェニックベクターを特異的な細胞にターゲティングして、または組織特異的プロモーターを使用して、またはその両方で実行可能である。標的遺伝子デリバリーはＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２８４９４に記載される。
一般にインビトロ法にて使用されるウイルスベクターはＤＮＡを基本としたベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築および使用する方法は当該分野にて公知である（例えば、MillerおよびRosman、BioTechniques、1992、7：980-990）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損である、すなわち、標的細胞にて自己複製できない。好ましくは、複製欠損ウイルスは最小ウイルスである、すなわち、ウイルス粒子を増殖させるためのゲノム封入に必要なゲノム配列のみを残す。
【００４０】
ＤＮＡウイルスベクターは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプシュタインバールウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびそれらの類似物のような、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを含むが、それらに制限されない。欠損ウイルスが、ウイルスゲノム全体またはほとんど全体を欠損している、好ましい。欠損ウイルスは細胞導入後には感染しない。欠損ウイルスベクターの使用は特異的、局所的領域における細胞への投与を考慮して、ベクターが他の細胞に感染可能であるかは考慮しない。それ故、特異的な組織が特異的に標的可能である。特別なベクターの例は欠損単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.、1991、2：320-330）、糖タンパクＬ遺伝子を欠損した欠損ヘルペスウイルスベクター、または他の欠損ヘルペスウイルス（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２１８０７およびＷＯ９２／０５２６３）；Stratford-Perricaudetら（J.Clin.Invest.、1992、90：626-630；またLa Salleら、Science、1993、259：988-990を参照）によって記載されるベクターのような、弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Samulskiら、J.Virol.、1987、61：3096-3101；Samulskiら、J.Virol.、1989、63：3822-3828；Lebkowskiら、Mol.Cell.Biol.、1988、8：3988-3996）を含むが、それらに制限されない。
アビゲン社（アラメダ、カリフォルニア；ＡＡＶベクター）、セルジェネシス社（フォスターシティ、カリフォルニア；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、クローンテック社（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、ジェノボ社（シャロンヒル、ペンシルベニア；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、ジェンベック社（アデノウイルスベクター）、イントロジェン社（ライデン、オランダ；アデノウイルスベクター）、モレキュラーメディシン社（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、ノージェン社（アデノウイルスベクター）、オックスフォードバイオメディカ社（オックスフォード、イギリス；レンチウイルベクター）、およびトランスジーン社（ストラスブルク、フランス；アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）を含むが、それらに制限されない、様々な会社が市販ウイルスベクターを製造している。
【００４１】
アデノウイルスは本発明のヌクレオチドを様々な型の細胞に有効にデリバリーするのに修飾可能な真核ＤＮＡウイルスである。様々な標準型のアデノウイルスがある。これらの標準型の中で、本発明の範囲内にて、２型または５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２６９１４を参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲内にて使用可能な動物起源のアデノウイルスはイヌ、ウシ、ネズミ（例えば、Ｍａｖ１、Beardら、Virology、1990、75-81）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（例えば、ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを含む。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルスで、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、マンハッタンまたはＡ２６／６１株、例えば、ＡＴＣＣＶＲ−８００）である。様々な複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載された（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本発明に記載の複製欠損組換えアデノウイルスはいずれの当業者に公知の技術によって調製可能である（例えば、Levreroら、Gene、1991、101：195；欧州出願番号ＥＰ１８５５７３；Graham、EMBO J.、1984、3：2917；Grahamら、J.Gen.Virol.、1977、36：59）。組換えアデノウイルスは当業者に公知の、標準の分子生物学的手法を用いて再生および精製される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は安定した部位特異的な方法で、感染する細胞のゲノムに組み込むことができる比較的サイズの小さいＤＮＡウイルスである。それらは細胞の成長、形態、または分化に影響せず広範囲の細胞に感染可能であり、ヒトの病原性に関連が見られない。ＡＡＶゲノムはクローニング、配列決定、および特徴付けられた。インビトロにおける遺伝子輸送に関するＡＡＶ由来のベクターの使用が記載された（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許番号第４，７９７，３６８号および第５，１３９，９４１；欧州出願番号ＥＰ４８８５２８、を参照）。本発明に記載の複製欠損組換えＡＡＶは２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によって興味深く挟まれた核酸配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶ封入遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を、ヒトヘルパー細胞（例えば、アデノウイルス）で感染させた細胞系に輸送するプラスミドをコトランスフェクトして調製可能である。生成したＡＡＶ組換え体は標準的な技術によって精製される。
【００４２】
別の具体例にて、遺伝子は例えば、米国特許番号第５，３９９，３４６号；Mannら、Cell、1983、33：153；米国特許番号第４，６５０，７６４号および第４，９８０２８９号；Markowitzら、J.Virol.、1988、62：1120；米国特許番号第５，１２４，２６３号；欧州出願番号ＥＰ４５３２４２およびＥＰ１７８２２０；Bernsteinら、Genet.Eng.、1985、7：235；McCormick、BioTechnology、1985、3：689；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０７３５８；およびKuoら、Blood、1993、82：845に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入可能である。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは２つのＬＴＲ、１つの封入配列、および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全体的にまたは部分的に、欠失され、重要な異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「ネズミモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「ネズミモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハービー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）、および類似ウイルスのような、異型のレトロウイルスから構築可能である。適当なパッケージング細胞系、特に細胞系ＰＡ３１７（米国特許番号第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／０２８０６）、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１５０）が記載された。加えて、組換えレトロウイルスベクターは一部のｇａｇ遺伝子を含む封入配列の伸長と同様に転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾を含有する（Benderら、J.Virol.、61：1639）。組換えレトロウイルスベクターは当業者に公知の標準の技術によって精製される。
レトロウイルスベクターは感染粒子として機能するまたは１ラウンドのトランスフェクションを行うために構築可能である。前者の場合、ウイルスは癌化能に関与することを除いてその遺伝子全てを維持し、異種遺伝子を発現するように修飾される。非感染ウイルスベクターはウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、異種遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するように設計される共誘導ウイルスをパッケージングするのに必要な構造遺伝子を維持するように増殖する。それ故、産生されるウイルス粒子は別のウイルスを産生することができない。
【００４３】
レトロウイルスベクターはまたＤＮＡウイルスによって誘導可能であって、それは１周期のレトロウイルス複製を可能にしてトランスフェクションの効率を増幅する（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２２６１７、ＷＯ９５／２６４１１、ＷＯ９６／３９０３６およびＷＯ９７／１９１８２を参照）。
別の具体例において、レンチウイルスベクターが直接デリバリーして、脳、網膜、筋、肝、および血液を含む、いくつかの組織型におけるトランス遺伝子の発現を維持する媒介物として使用可能である。ベクターは効果的にこれらの組織にて分裂および非分裂細胞を変換して重要な遺伝子の長期発現を維持することができる。概説として、Naldini、Curr.Opin.Biotechnol.、1998、9：457-63を参照；またZuffereyら、J.Virol.、1998、72：9873-80、を参照。レンチウイルスパッケージング細胞系は入手可能であって一般に当該分野に公知である。それらは遺伝子治療に関する高性能滴定レンチウイルスベクターの産生を容易にする。一例は少なくとも３ないし４日間で１０６ＩＵ／ｍｌ以上の滴定でウイルス粒子を産生可能なテトラサイクリン誘導ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスパッケージング細胞系である（Kafriら、J.Virol.、1999、73：576-584）。誘導可能な細胞系によって産生されるベクターはインビトロにおける非分裂細胞の効果的な変換の必要に応じて濃縮可能である。
陽イオン性オリゴペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク由来ペプチド（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／２５５０８）、または陽イオン性ポリマー（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９５／２１９３１）、またはブピバカイン（米国特許第５，５９３，９７２号）のような、他の分子はまたインビトロにおける核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用である。
本発明の単離したポリペプチドはポリペプチドまたは外来ポリペプチドのような免疫原性断片の発現に必要な遺伝物質を含有する、生きたベクターを使用して、特に生きた組換え細菌、ウイルス、または他の生きた媒介物を使用して哺乳類にデリバリー可能である。特に、サルモネラ属、シゲラ属、エルシニア属、ビブリオ属、エシェリキア属およびＢＣＧのような、消化管にコロニーを形成する細菌はワクチンベクターとして改良されて、これらおよび他の例はKolmgrenら（1992）およびMcGheeら（1992）によって記載される。
【００４４】
以下は一連のベクターの一部として使用されるが、それらに制限されない：
モノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスの分類
パラミクソウイルス科
パラミクソウイルス亜科
パラミクソウイルス属
センダイウイルス（マウスパラインフルエンザウイルス１型）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１型および３型
ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）３型
ルブラウイルス属
シミアンウイルス５（ＳＶ）（イヌパラインフルエンザウイルス２型）
ムンプスウイルス
ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（トリパラミクソウイルス１型）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ−２、４ａおよび４ｂ型）
モルビリウイルス属
麻疹ウイルス（ＭＶ）
イルカモルビリウイルス
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）
小反芻獣疫ウイルス
アザラシジステンパーウイルス
牛疫ウイルス
未分類
ヘンドラウイルス
ニパウイルス
ニューモウイルス亜科
ニューモウイルス属
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
ウシ呼吸器合胞体ウイルス
マウス肺炎ウイルス
メタニューモウイルス属
ヒトメタニューモウイルス
トリニューモウイルス（以前の七面鳥鼻気管炎ウイルス）
ラブドウイルス科
リッサウイルス属
狂犬病ウイルス
ベシクロウイルス属
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
エフェメロウイルス属
ウシ流行熱ウイルス
フィロウイルス科
フィロウイルス属
マールブルグウイルス
【００４５】
ＲＮＡウイルスベクターは基本的に少なくとも１つのモノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする配列を含む単離した核酸分子である。単離した核酸分子はゲノム、アンチゲノム、またはそれらの修飾形態をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ある具体例において、ポリヌクレオチドは結合可能なプロモーター、所望のゲノムまたはアンチゲノム、および転写ターミネータをコードする。
本発明の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドはヌクレオチド挿入、転位、欠失、または置換によって野生型ＲＮＡウイルスから修飾されたゲノムまたはアンチゲノムをコードする。ゲノムまたはアンチゲノム配列はヒトまたは非ヒトウイルス由来であるだろう。ポリヌクレオチド配列はまたゲ２つまたはそれ以上のソースからのゲノムまたはアンチゲノムを組み換えて結合して形成されるキメラゲノムをコードしてもよい。例えば、Ａ群のＲＳＶ由来の１つまたはそれ以上の遺伝子をＢ群のＲＳＶの対応する遺伝子と置換して挿入する；またはウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ）、ＰＩＶ−１またはＰＩＶ−２由来の１つまたはそれ以上の遺伝子をＰＩＶ−３のＲＳＶの対応する遺伝子と置換して挿入する；またはＲＳＶをＰＩＶの遺伝子に置換してもよいなど。さらなる具体例において、ポリヌクレオチドはヒト、ウシ、またはネズミウイルスであるモノネガウイルス目のＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする。本発明の方法によって形成される組換えウイルスは治療または防止目的にて使用されるため、ポリヌクレオチドはまた選択されるＲＮＡウイルスの弱毒化または感染形態をコードしてもよい。多くの具体例において、ポリヌクレオチドはＲＮＡウイルスの弱毒化、感染形態をコードする。特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは刊行された国際特許出願ＷＯ９８／１３５０１、参照として本明細書の一部とする、に記載されるように、３’ゲノムプロモーター領域に少なくとも１つ弱毒変異を有してＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に少なくとも１つ弱毒変異を有するモノネガウイルス目の非分節性、マイナス鎖、１本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする。
【００４６】
ベクターとして、上記のような所望のゲノムおよびアンチゲノムの修飾形態をコードするポリヌクレオチド配列はまた本発明の免疫原性タンパクに関する１つまたはそれ以上の遺伝子またはヌクレオチド配列をコードする。加えて、１つまたはそれ以上の異種遺伝子はまた所望されるような、所望の免疫原性組成物／ベクターを形成する場合含まれてもよい。所望の組換えウイルスの使用によって、異種遺伝子は補因子、（インターロイキンのような）サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバント、または異なる微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）のタンパク、特に免疫応答保護によって誘導可能なタンパクをコードしてもよい。異種遺伝子はまた遺伝子治療に使用される薬剤を提供するのに使用されてもよい。好ましい具体例において、異種遺伝子は組換えウイルスの防止能または治療能を改善するのに選択される、インターロイキン−１２のような、サイトカインをコードする。
好ましくは、ベクターはアデノウイルスである。より好ましくは、アデノウイルスは複製欠損アデノウイルスである。さらにより好ましくは、複製欠損アデノウイルスはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む。さらにより好ましくは、複製欠損アデノウイルスはＳＶ４０プロモーターを含む。
【００４７】
ハイスループットスクリーニング
本発明に記載の生物学的サンプルにおけるＳＨＰ阻害剤を検出および同定する方法はハイスループットスクリーニングの使用を意図する。ハイスループットスクリーニングからの情報量には３つの異なる相：生化学アッセイに関する実験設計、データ完全性の問題およびデータ分析がある。実験設計はスクリーニングを設定する場合最も重要であって瞬時に最適なアッセイ条件を同定して結果データの質を確保するのに使用される。データ完全性の問題は異なる組の化合物に関するアッセイ変動性の計算、系統的な効果の同定およびおそらく修正およびデータがその意図した使用に適当であるという検証に関係する。最終的に、データ分析はＫｉのような結果から未加工データを要約するためにデータ整理することまたはＳＡＲ、ＱＳＡＲまたは神経ネットワーク分析からのデータからパターンおよび情報を抽出することのいずれかの、データ処理に関係する。総合すれば、これらの方法は大量のデータから情報を抽出する仕事に取り組むことである。
実験設計は最適な条件を見出して応答曲面法をモデリングするのに必要とする多くの分野での利用が見出されるがしばしば生物学において十分に利用されていない古典的な統計学的方法である。実験設計の理論的基礎は多くの統計学の教科書、例えば、Cochran、W.G.およびCox、G.M.、Experimental Designs、John Wiley and Sons：New York、1957；Hicks、C.R.、Fundamental Concepts of Design of Experiments、Holt、Rhinehart and Winston、1974；Box、G.E.、Hunter、W.G.およびHunter、S.、Statistics for Experimenters：An Introduction to Design、Data Analysis and Model Building、John Wiley and Sons：New York、1978；Montgomery、D.C.、Design and Analysis of Experiments、John Wiley and Sons：New York、1984、各々はその全体を明示することによって参照として本明細書の一部とする、に詳細に記載される。適用の事例研究は特定の分野に関連の文献に見出すことができる。例はDaniel、C.、Applications of Statistics to Industrial Experimentation、John Willey and sons：New York、1976；Murphy、T.D.、design and analysis of industrial experiments、Chemical Engineering、June 6、1977、168-182に記載されるような工業的プロセス最適化；およびDeming、S.N.およびMorgan、S.L.、Experimental Design：a chemometric approach；Elsevier、1987；Austel、V.、Design of Test Series by Combined Apllication of 2n Factorial Schemes and Pattern Recognition Techniques. Quantitative Approaches to Drug Discovery；Dearden、J.C.、Ed.；Elsevier、1983に記載されるような化学を含む。生物学的および化学的適用に関して実験設計を使用することに関連した問題および方法論はHaaland、Experimental Design in Biotechnology、Marcel Dekker、1989によって記載される。
【００４８】
最も少ない実行において最も多くの情報を抽出するために系統的な方法において最適化する手段への考慮が必要とされる。多くの場合、最適条件の同定は十分である。他の場合、因子および応答の関係は数学的にモデリングされている。相互作用は生物学において例外というよりむしろ標準であって問題の複雑さを大きく助長させるまたは最も悪い場合、データの解釈を不可能にさせるため特に重要である。特定の集団の実験設計は分散低減実験設計である。このような設計では、応答それ自体というよりむしろ応答の分散が最適化される。分散を最小にすることによってアッセイはより信頼できるのでこれらの設計は生物学において重要である。他の適用において、費用は重要な因子であって最適化はタンパクのような希少資源の使用を最小にするために所望される。多くの場合複数の応答が考慮される：例えば、タンパクを節約するために受容体濃度を低く維持しながら分散を最小にするが、それに制限されない。最終的に、モデル、古典的な実験設計の基礎を形成する線形モデルのような単純なものであっても、有する利点は、予測可能であるということである。
古典的な実験設計では、研究者が応答に影響すると考える多数の因子を選択する。因子の数および可能な範囲によって、これらの因子によって定義される余白を抽出するために異型の設計が選択される。後に特定の因子または因子間の相互作用の影響を測定することを可能にする系統的な方法で因子は全て同時に異なる。典型的には因子は処理範囲の際で抽出されて線形または多項式補間機能が設計点間の領域をモデリングするために使用される。
異なる実験設計が特定の対象にて選択される。ロボットアッセイが最初に設定される場合、しばしばアッセイの信頼性に潜在的に影響可能な多くの因子がある。重要な因子を見出すために、低分解能の一部実施要因設計が実行されるだろう。重要な因子が同定された後、因子に最適な設定を見出すために十分な要因設計が設定されるだろう。因子の感度を評価して高度な交互作用を試験するために、応答曲面モデリングが最適な設定領域を探索するのに実行可能である。
【００４９】
最近の科学技術の進歩は薬物発見研究に関する新規のパラダイムを導入した。生物学アッセイにおける化学ライブラリおよびロボット系の有用性は１日に何百または何千もの化合物の合成および試験を可能にする。これはアッセイの自動化およびデータ分析を提供する。組み合わせライブラリは試験する大多数の化合物を提供する。ライブラリが分子標的の配列に対して試験される場合入手可能となる大量のデータは構造−活性関係分析の新規の機会を創りデータの完全性を確保してデータにおける傾向および関係を同定するための有効な統計学的方法の必要を増幅する。
本発明は特定の組織または細胞型にて発現するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤の新規の、大規模スクリーニングを提供する。アプローチはハイスループットin-situ法およびそれに続く分析と薬剤ライブラリを組み合わせる。大多数の化合物がロボット技術を使用して１つの実行において試験されてもよい。例えば、約１，０００ないし４０，０００個の化合物が１日に試験されてもよい。好ましくは、約４０，０００個の化合物１日に試験される。
本発明の具体例に従って、スクリーニングはロボットでウェルプレートにアリコートされる細胞の冷凍バイアルを利用する。ウェルプレートをインキュベートしプレートを除去してレポーターに関してアッセイする。好ましくは、４千万個の細胞が１回に使用されて、１０００個の細胞が１００個の３８４ウェルプレート（３８４個のウェルを有するウェルプレート）の各ウェルにアリコートされる。好ましくは、インキュベーションは約３７℃で約２４ないし約４８時間行われる。
【００５０】
薬剤
本発明の上記の方法は炎症遺伝子経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲを阻害するのに有効な薬剤を同定可能である。本発明の方法によって同定されてもよい薬剤は小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、組換え受容体（例えば、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲ、可溶性組換えＳＨＰ、可溶性組換えＦＸＲ）抗体およびそれらの類似物を含むが、それらに制限されない。
本発明のある具体例に従って、本発明はＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染させた細胞培養に投与される場合ルシフェラーゼの増加を引き起こすように特徴付けられる小分子のような、炎症遺伝子発現経路および／またはコレステロール生合成経路にてＳＨＰおよび／またはＦＸＲ活性を阻害するのに有効な小分子を提供し、上記の細胞培養はＳＨＰまたはＦＸＲを発現する。
本発明のある実施例に従って、小分子はＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染させた細胞培養に投与される場合ルシフェラーゼの増加を引き起こすように特徴付けられて、上記の細胞培養は短鎖へテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）および任意に肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）を発現する。
「小分子」なる語は本発明が関係する分野にて当業者に容易に理解されるような、その通常の意味および一般的な用法で使用される。好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する。より好ましくは、薬剤の分子量は約５０ないし約７５０である。さらにより好ましくは、小分子の分子量は約５０ないし約５００である。分子量は当業者に公知の小分子の分子量を測定するいずれの許容される方法に従っても定量される。
【００５１】
小分子は多種多様の分類の化合物であってもよい。例えば、小分子は天然または合成脂質であってもよいが、それらに制限されない。さらに、小分子は脂溶性ないし水溶性の範囲であってもよい。本発明のある実施例に従って、小分子は脂溶性である。
本発明のある実施例に従って、小分子は天然または合成ステロイドである。ステロイドは天然に存在するおよび合成脂質または多様な生理活性を示す脂溶性化学物質の大群である。確かにステロイドの中には特定のアルコール（ステロール）、胆汁酸、多くの重要なホルモン、いくつかの天然の薬物、およびいくつかのヒキガエルの皮膚に見出される毒がある。ヒトの皮膚に見出される様々なステロールが日光の紫外線に曝される場合ビタミンＤに転換される。実際、コレステロール自体はステロールである。
ステロイドホルモンは、ステロールと同一ではないが類似していて、副腎皮質ヒドロコルチゾン、コルチゾン、アルドステロン、およびプロゲステロン；および女性および男性性ホルモンのエストロゲンおよびテストステロンを含む。大部分の経口避妊薬は排卵を阻害する女性性ホルモンから成る合成ステロイドである。コルチゾンおよび様々なコルチゾン合成誘導体は医学にて広く使用されている。例えば、このようなステロイドは様々な皮膚疾患、関節リウマチ、喘息およびアレルギー、および様々な眼疾患、および副腎機能不全、または副腎皮質機能不全の場合に使用される。本発明の小分子全てがステロイドというわけではなくステロイド全てが本発明の小分子というわけではない。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明の特定の小分子を同定する方法を容易に理解するだろう。
本発明のさらなる実施例に従って、小分子は非ステロイド化合物である。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明のこの実施例に従って特定の小分子を同定する方法を容易に理解するだろう。
【００５２】
本発明のある実施例に従って、小分子は非ステロイド化合物であるのが好ましい。より好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する非ステロイド化合物である。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約７５０を有する非ステロイド化合物である。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約５００を有する非ステロイド化合物である。
本発明のある実施例に従って、小分子は非エストロゲンステロイドホルモンであるのが好ましい。より好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約１５００を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約７５０を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。さらにより好ましくは、小分子は分子量約５０ないし約５００を有する非エストロゲンステロイドホルモンである。
本発明のある実施例に従って、小分子はＳＨＰまたはＦＸＲの成熟または未熟形態または同等物をコードする遺伝子に結合する。さらに、本発明のある実施例は受容体またはリガンドに関してＳＨＰまたはＦＸＲの成熟または未熟形態と競合する小分子を意図し、上記の小分子はアテローム動脈硬化に対して有効量の組成物中にある。加えて、本発明はＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストである小分子を意図する。アンタゴニストは受容体に結合するが通常のリガンドによる通常の効果を誘導せず、それによって通常のリガンドの効果を遮断する構造アナログである。従って、ＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストはリガンドおよび／または受容体結合部位にて競合してＳＨＰまたはＦＸＲが結合するのを防止し、ＳＨＰまたはＦＸＲの活性を阻害するだろう。本明細書にて提供される手引きに基づいて、当業者は本発明の実施例に従って容易にＳＨＰまたはＦＸＲアンタゴニストを同定して同等物を調製することが可能だろう。
【００５３】
治療組成物
また治療組成物が提供される。本発明の組成物は上記のような、広範囲の状態を治療するのに有用である。例えば、本発明の治療組成物はヒト（好ましい）および非ヒト動物のような、哺乳類の血清低比重リポタンパク（ＬＤＬ）コレステロール高値に使用可能である。例えば、動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、およびブタであってもよい。特別な適用はアテローム動脈硬化およびＬＤＬコレステロール高値に関係した他の状態の治療を含むが、それらに制限されない。
本発明の治療組成物は防止（すなわち、感染を防止するまたは感染の発症を低下させるため）または治療（すなわち、疾患または感染後の感染によって引き起こされる副作用を治療するため）のいずれかであってもよい。
組成物は本発明の薬剤を含んでもよい。そうするために、１つまたはそれ以上の薬剤が適当な濃度に調整されていずれの適当な希釈剤、担体、またはそれらのいずれの組み合わせによっても処方可能である。生理上許容される媒体が担体および／または希釈剤として使用されてもよい。これらは水、適当な等張性媒体、グリセロール、エタノールおよび他の従来の溶媒、リン酸緩衝生理食塩水、およびそれらの類似物を含むが、それらに制限されない。
処方されると、本発明の組成物は対象に直接投与され、対象由来の細胞にエクスビボで、またはインビトロでデリバリー可能である。対象に直接デリバリーするために、投与は鼻腔内、非経口、経口、腹腔内、静脈内、皮下、またはエアロゾルスプレーによってのように、鼻腔内、経口、眼、肺、膣、または直腸表面のようないずれの粘膜表面に局所適用されるいずれの従来の形態によってもよい。
【００５４】
いずれの生物学上許容される投与形、およびそれらの組み合わせも、本発明の対象によって意図される。このような投与形の例はチュアブル錠、急速溶解錠、発泡錠、復元散剤、エリキシル、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、カプレット、ロゼンジ、チュアブルロゼンジ、ビーズ、散剤、顆粒、粒子、微粒子、分散顆粒、サケット、圧注剤、坐剤、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、持続性インプラント、内服剤、注射剤、注入剤、ヘルスバー、糖菓剤、家畜飼料、シリアル剤、シリアルコーティング剤、食品、栄養食品、機能性食品またはそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない。上記の投与形の調製は当業者に公知である。本発明の組成物は経口投与形であるのが好ましい。これらの投与形全ては当業者に公知である。
本明細書で使用される、「医薬上許容される」なる語は投与形が十分に高純度で不当な毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答、およびその類似物なく細胞、組織、または膜に接触させて使用するのに適することを意味する。
好ましい具体例において、本発明の治療組成物は生物学的対象に経口投与される。また、本発明の治療組成物はスープ形態で投与される。所望の味に変えるためにいずれのフレーバまたは食品をスープに加えてもよいと考えられる。
【００５５】
様々な添加剤が本発明の組成物に組み込まれてもよい。本発明の任意の添加剤はスターチ、砂糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク、それらの誘導体またはそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない。
また即時放出、拡張放出、パルス放出、可変放出、制御放出、時間放出、持続放出、遅延放出、長時間作用型、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに制限されない、様々な放出形態を組み合わせる投与形において本発明の対象の医薬組成物にて可能である。即時放出、拡張放出、パルス放出、可変放出、制御放出、時間放出、持続放出、遅延放出、長時間作用型特性、およびそれらの組み合わせを得る能力は当業者に入手可能な既知の方法および技術を使用して行われる。放出特性を得るためのこれらの各々の特定の技術または方法は当業者に公知である。本明細書にて使用される、「制御放出形態」なる語は制御放出として処方された成分を少なくとも１つ有するいずれの形態も意味する。本明細書にて使用される、「即時放出形態」なる語は即時放出として処方された医薬活性成分を少なくともいくつか有するいずれの形態も意味する。
以下の方法は本発明の対象の範囲内で行われない処方を調製する許容される方法を表すが、それらに制限されない。
急速溶解錠は例えば、経口投与後通常３０秒以内に、合成錠の溶解または崩壊を促進する、砂糖およびセルロース誘導体のような薬剤と処方を混合して、調製されてもよいが、それらに制限されない。
【００５６】
シリアルコーティング剤は例えば、フィルム状の活性成分、および賦形剤を形成した成分の表面に付着させるための精密なスプレーコーティング装置下でペレット、フレーク、または他の幾何学的形状に形成した後、シリアル形態を通して、調製されてもよいが、それらに制限されない。それ故治療される単位はシリアルコーティング剤を形成するために乾燥させる。
ヘルスバーは、処方および賦形剤（例えば、結合剤、充填剤、フレーバ、着色料、など）を混合してプラスチック硬度の塊に調製されてもよいが、それらに制限されない。塊は「キャンディーバー」形状を形成するように伸長または鋳造されて乾燥または凝固させて最終生成物を形成する。
ソフトゲルまたはソフトゼラチンカプセルは例えば、適当なビヒクル（植物油が一般に使用される）に処方を分散させて高粘度の混合物を形成して、調製されてもよいが、それらに制限されない。この混合物はソフトゲル産業に公知の技術および機械を使用してゼラチンを基礎にしたフィルムでカプセル封入される。それ故形成した産業単位は一定の重量まで乾燥する。
チュワブル錠は例えば、処方を設計した賦形剤と混合して飲み込むというよりむしろ噛むことを意図した比較的柔らかく、味付けされた錠剤投与形を形成することによって調製されてもよいが、それらに制限されない。従来の錠剤化機械および方法は、直接圧縮および圧縮前の、顆粒化、または強打の両方であるが、利用可能である。チュアブル投与形は医薬産業にて非常に一般的な投与形であるので医薬固形投与形製品に関係した人々は使用法および機械に精通している。
フィルムコーティング錠は例えば、錠剤上に隣接するフィルム層を付着させるための回転パンコーティング法またはエアサスペンション法のような技術を使用するコーティング錠剤によって調製されてもよいが、それらに制限されない。この方法はしばしば錠剤の美的外観を改善するのに行われるが、また錠剤の飲み込みを改善する、または不快な臭いまたは味を隠す、または不格好な未コーティング錠の性質を改善するために行われてもよい。
【００５７】
圧縮錠剤は例えば、結合能を崩壊能に加えることを意図した賦形剤と処方を混合して調製されてもよいが、それらに制限されない。混合物は直接圧縮または顆粒化のいずれかが行われて、当産業に公知の方法および機械を使用して圧縮される。生成した圧縮錠剤投与単位は市場の需要に従って、すなわち、単位投与量、ロール、バルク瓶、透明包装、などに包装される。
例えば、動物飼料は当業者に公知の方法によって製造されてもよい。動物飼料は処方を結合成分と混合してプラスチック塊を形成することによって調製されてもよい。塊は高圧下で押し出されて管状（または「スパゲッティ様」）構造を形成しペレットサイズに切断されて乾燥する。
本発明の対象は、経口、バッカル、舌下、直腸、非経口、局所、吸入、注射および経皮、好ましくは経口を含むがそれらに制限されない、いずれの経路によっても投与される処方した医薬組成物を意図する。栄養組成物、それらの処方、および投与経路の物理化学的性質は吸収にて重要である。吸収とは投与部位から体循環への栄養組成物の移動の過程のことをいう。経口投与した栄養組成物は第一に利便性、経済性、安定性、および患者受容性に関して錠剤またはカプセル形態であるだろう。それらは吸収が生じる前に崩壊および溶解しなければならない。本発明の対象の、上記の投与経路または投与形のいずれかでの、使用は当業者に入手可能な公知の方法および技術を使用して行われる。
本発明の対象は広範囲の物質から調製されてもよい生物学上許容される担体の使用を意図する。このような物質は希釈剤、溶媒、結合剤および接着剤、潤沢剤、可塑剤、崩壊剤、着色料、充填物質、フレーバ、甘味料および雑多な組成物を含むが、それらに制限されない。
【００５８】
結合剤は当業者に公知の他の従来の結合剤同様に、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、または他の適当なセルロース誘導体、ポビドン、アクリル乾燥メタクリル酸コポリマー、医薬シロップ、ガム、乳清のような、ミルク誘導体、スターチ、およびそれらの誘導体のような広範囲の物質から選択されてもよい。制限しない毒性のない溶媒の例は水、エタノール、イソプロピルアルコール、塩化メチレンまたはそれらの混合物および組み合わせである。制限しない毒性のない充填物質の例は砂糖、ラクトース、ゼラチン、スターチ、および二酸化ケイ素を含む。
溶解修飾系に使用される可塑剤は前もって有機溶媒に溶解して溶液形態で加えられるのが好ましい。好ましい可塑剤はフタル酸ジエチル、セバシン酸ジエチル、クエン酸トリエチル、クロノチル酸、プロピレングリコール、フタル酸ブチル、セバシン酸ジブチル、ヒマシ油およびそれらの混合物から成るが、それらに制限されない群から選択されてもよい。明確であるように、可塑剤は事実上親水性と同時に疎水性であってもよい。フタル酸ジエチル、セバシン酸ジエチルおよびヒマシ油のような、非水溶性疎水性物質は水溶性物質の放出を遅延させるために使用される。対照的に、親水性可塑剤はカプセル封入フィルムを溶解する、表面にチャネルを作る、組成物を放出するのに有用な非水溶性物質が使用される場合に使用される。
本発明の対象の組成物は２４時間中１回またはそれ以上に分けて、すなわち、分割量にて、２４時間中単回投与、２４時間中２回投与、または２４時間中２回以上の投与で投与されてもよい。分割、２回または他の複数回投与は同時にまたは２４時間中の別の時間に投与されてもよい。
本発明の組成物はヒトおよび他の動物に関する使用を意図する。投与量は体重に従って調整されて体重に基づいて本明細書にて示されてもよい。例えば、処方が５５ｋｇの人に対して約１０−１０００ｍｇの範囲を指定する場合、その範囲は３５ｋｇの人に対して約６．３−６３０ｍｇ（例えば、より低い範囲限界（３５ｋｇ／５５ｋｇ）＊１０ｍｇ＝６．３ｍｇ）に調整されるだろう。小数の量は最も近い整数に四捨五入されてもよい。上記の方法にて本発明の組成物はサイズに関わりなく、いずれの動物も含む、いずれの個人にも適するように調整されるだろう。
【００５９】
ポリペプチド
本発明の方法はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を阻害する薬剤をスクリーニングする。ＳＨＰおよびＦＸＲに加えて、本発明はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を有するいずれの化合物の利用も意図する。例えば、ＳＨＰまたはＦＸＲアゴニストまたは配列において軽度の変異を有するがＳＨＰまたはＦＸＲと同様の効果を有する化合物。このような化合物はＳＨＰまたはＦＸＲ活性の阻害剤としてスクリーニングにて有用性を有するだろう。
例えば、標的化合物は配列番号：２または４の参考配列と同一の、すなわち１００％同一のポリペプチド配列を有しても、また参考配列と比較して％同一性が１００％以下であるようなある整数のアミノ酸変化まで含んでもよい。このような変化は少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的および非保存的な置換を含む、置換、または挿入を含む。変化は参考ポリペプチド配列のアミノ末端部位またはカルボキシ末端部位またはそれらの末端部位間のいずれにも生じて、参考アミノ酸配列内または参考アミノ酸配列内の１つまたはそれ以上の連続する群内のアミノ酸間に各々個々に散在してもよい。
それ故、本発明はまた配列表に含有されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号：２または４）と配列同一性を有する単離したポリペプチドの使用を意図する。特定の配列によって、配列同一性の程度は５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上）であるのが好ましい。これらの同種タンパクは突然変異体および対立遺伝子多型を含む。
【００６０】
当該分野にて公知の、「同一性」は、配列を比較して定量されるような、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の関係である。当該分野にて、「同一性」はまたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の、場合によっては、このような配列の列間の一致によって定量されるような、配列関係性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」はComputational Molecular Biology、Lesk、A.M.、ed.、Oxford University Press、New York、1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.、ed.、Academic Press、New York、1993；Computer Analysis of Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M.およびDevereux、J.、eds.、M Stockton Press、New York、1991；およびCarillo、H.、およびLipman、D.、SIAM J.Applied Math.、48：1073（1988）に記載されるものに含むがそれらに制限されない、既知の方法によって容易に計算可能である。同一性を定量する好ましい方法は試験される配列間に最も多い一致を与えるように設計される。同一性および類似性を定量する方法は公的に入手可能なコンピュータプログラムに含まれる。２つの配列間の同一性および類似性を定量する好ましいコンピュータプログラム法はＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux、J.ら、1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul、S.F.ら、1990）を含むが、それらに制限されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから公的に入手可能である（BLAST Manual、Altschul、S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、Md.20894；Altschul、S.ら、1990）。既知のスミスウォーターマンアルゴリズムはまた同一性を定量するのに使用されてもよい。
【００６１】
例えば、一定の％同一性に関するアミノ酸変化数は複数の配列の１つからのアミノ酸総数を各パーセント同一性の数値パーセント（１００で割った値）と掛けて上記の複数の配列からのアミノ酸総数から上記の積を引くこと、すなわち：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸変化数であって、ｘａは複数の配列のアミノ酸総数であり、いずれのｙも、例えば、７０％で０．７０、８０％で０．８０、８５％で０．８５などであって、ｘａおよびｙの非整数積はそれをｘａから引く前に最も近い整数に四捨五入される
によって定量可能である。
修飾および変化はＳＨＰまたはＦＸＲの構造において生じるが、化合物はＳＨＰまたはＦＸＲ活性を維持するだろう。あるアミノ酸は活性および／または抗原性をそれほど喪失せずに配列内の他のアミノ酸に置換可能である。なぜならポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのはポリペプチドの相互作用能および性質であって、あるアミノ酸配列置換はポリペプチド配列（または、当然、その基礎をなす配列をコードするＤＮＡ）内に作られるためであり、いずれにせよ類似能を有するポリペプチドを得ることができる。
それ故本発明は当業者に公知であるような本明細書に記載の反応性と本質的に同様の活性を提供する生物学的な同等物であるいずれの単離したポリペプチドも意図する。
【００６２】
本発明は配列番号：２または４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体であるポリペプチドを使用することを意図する。本明細書にて使用される、「変異体」なる語は参考ポリペプチドとは異なるポリペプチドを含むが、本質的な性質を維持する。一般に、相違は限定されていてその結果参考ポリペプチドおよび変異体の配列は全体として非常に類似していて、多くの領域にて、同一である（すなわち、生物学的に同等である）。変異体および参考ポリペプチドは１つまたはそれ以上の置換、付加、または欠失によっていずれの組み合わせにおいてもアミノ酸配列にて異なってもよい。置換または挿入アミノ酸残基は遺伝コードにコードされていてもされていなくてもよい。対立遺伝子多型のようなポリペプチドの変異体は自然に生じ、または自然に生じるか未知である変異体であるだろう。ポリペプチドの非自然的に生じる変異体は直接合成してまたは突然変異技術によって作られてもよい。
このような変化をつくる際に、アミノ酸ハイドロパシック指数が考慮されるだろう。ポリペプチドに相互作用する生物学的機能を与えるアミノ酸ハイドロパシック指数の重要性は当該分野にて一般に理解される（Kyte&Doolittle、1982）。あるアミノ酸が類似のハイドロパシック指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換可能であってそれでも類似の生物学的活性を有するポリペプチドであることが知られている。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシック指数を与えられた。それらの指数は以下の各アミノ酸に続く括弧内に記載される：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００６３】
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシック特性は生成したポリペプチドの２次および３次構造を決定し、同様にそれがポリペプチドの酵素、基質、受容体、抗体、抗原、およびそれらの類似物のような、他の分子との相互作用を定義すると考えられる。アミノ酸が類似のハイドロパシック指数を有する別のアミノ酸によって置換可能であって機能的に類似のポリペプチドを得られることが当該分野にて知られている。このような変化において、ハイドロパシック指数が＋／−２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１以内であるのが特に好ましく、＋／−０．５以内であるのがさらにより特に好ましい。
類似のアミノ酸の置換はまた親水性に基づいて行うことができ、特にそれらによって作られる生物学的機能が同等なポリペプチドまたはペプチドが免疫学的具体例における使用を意図される。米国特許番号第４，５５４，１０１号は、参照として本明細書の一部とする、隣接するアミノ酸の親水性に影響されるような、ポリペプチドの最も大きな局所的な平均親水性はその免疫原性および抗原性、すなわち、ポリペプチドの生物学的特性と相関することを記載する。
米国特許番号第４，５５４，１０１号にて詳述されるように、以下の親水性度はアミノ酸残基に与えられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸は類似の親水性度を有する別のものに置換可能であって生物学的に同等の特に、免疫学的に同等のポリペプチドを得られることが理解される。このような変化において、親水性度が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるのが特に好ましく、±０．５以内であるのがさらにより特に好ましい。
【００６４】
上記に概説したように、それ故、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズおよびそれらの類似物に基づく。様々な上記の特性を考慮する模範的な置換基は当業者に公知であって：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。以下の表ＸＩＩＩに示されるように、適当なアミノ酸置換基は以下を含む：
【００６５】
【表５】
【００６６】
ポリペプチドの生物学的または機能的同等物はまた本発明の実施例に従って使用されてもよいような部位特異的突然変異を使用して調製可能である。部位特異的突然変異は第２世代ポリペプチド、または基礎をなすＤＮＡの特異的突然変異誘発を介する、その配列由来の、生物学的または機能的に同等のポリペプチドの調製に有用な技術である。上記に示されるように、このような変化はアミノ酸置換基が所望される場合に所望可能である。さらに技術は例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、１つまたはそれ以上の上記の考慮を入れる、配列変異体を容易に調製および試験する能力を提供する。部位特異的突然変異は十分な数の隣接するヌクレオチド同様に、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用を介して突然変異体を産生し、両側の欠失連結部が妨害される安定した２本鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供することを可能にする。典型的には、長さ約１７ないし２５のヌクレオチドが好ましく、両側の配列連結部の約５ないし１０残基が変化する。
一般に、部位特異的突然変異の技術は当該分野に公知である。理解されるように、技術は典型的には１本鎖および２本鎖形態の両方で存在可能なファージベクターを使用する。典型的には、本明細書に従って部位特異的突然変異誘発法は最初にその配列内に選択されるＳＨＰポリペプチド配列の全てまたは一部をコードするＤＮＡ配列を含む１本鎖ベクターを得ることによって行われる。所望の変異配列を産生するオリゴヌクレオチドプライマーは例えば、既知の技術によって（例えば、合成して）、調製される。このプライマーは変異産生鎖の合成を完了させるために、１本鎖ベクターにアニールされて、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノー断片のような、酵素によって伸長される。それ故、ヘテロ２本鎖は一方の鎖が原型の非変異配列をコードして他方の鎖が所望の変異を産生するように形成される。このヘテロ２本鎖ベクターはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような、適当な細胞を転換するのに使用されて、変異を産生する組換えベクターを含むクローンが選択される。市販のキットが必要な試薬を提供する。
【００６７】
ポリペプチドはさらなる構造または機能分析、または試薬の産生における使用のために断片に有利に分裂されてもよい。これは精製または未精製のポリペプチドをエンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（ボエリンガー社、インディアナポリス、ＩＮ）のようなペプチダーゼで処理して達成可能である。ＣＮＢｒによる処理はペプチド断片が天然のＳＨＰまたはＦＸＲポリペプチドから産生されてもよい別法である。組換え技術はまたＳＨＰまたｈＦＸＲポリペプチドの特異的な断片を産生するのに使用可能である。
ポリペプチドは「成熟」または「未熟」タンパクの形態であっても融合タンパクのような大規模タンパクまたは中間物質の一部であってもよい。ポリペプチドは例えば、分泌またはリーダー配列、前配列、複数のヒスチジン残基のような精製を促進する配列、または組換え産物間の安定性に付加する配列を、含有する付加的なアミノ酸配列を含んでもよい。
ポリペプチド断片はまた本発明によって意図される。断片は全体的にアミノ酸配列の一部同様であるが、全てではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は例えば、少なくとも７個またはそれ以上の（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０個、またはそれ以上）アミノ酸配列の連続するアミノ酸を、を含むことができる。断片は「独立」していてもそれらが領域の一部、最も好ましくは単一の、連続する領域として形成するより大きなポリペプチド内に含まれてもよい。
ＳＨＰ活性の阻害剤を同定する方法にて使用されるポリペプチドはいずれの適当な方法にても調製可能である。このようなポリペプチドは天然に生じるポリペプチド、組換えて製造したポリペプチド、合成して製造したポリペプチド、およびこれらの方法を組み合わせて製造したポリペプチドを含む。このようなポリペプチドの製法は当該分野に十分に理解される。
【００６８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびそれらに密接に関係したポリヌクレオチドを含む単離したポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは例えば、本発明の実施例に従って、細胞系にてＳＨＰまたは受容体遺伝子を発現するのに、使用されてもよい。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは単離したＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターを含むがそれらに制限されない。以下は本発明のある具体例に従って使用される２つのプロモーターである。
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
本発明のある具体例に従って、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターはヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列を含む。ヒトＣＹＰ８Ｂ１−５１４ないし＋３０３（配列番号：７）のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００７２】
【表８】
【００７３】
さらに、ポリヌクレオチドは検出物質（本明細書では検出物質遺伝子という）をコードする遺伝子を含んでもよい。例えば、検出物質は蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせを含んでもよいがそれらに制限されない。好ましくは、検出物質遺伝子は蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である。本発明のある実施例に従って、ＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター（例えば、ヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列を含むＣＹＰ８Ｂ１プロモーター）および検出物質遺伝子を含むヌクレオチド配列はプラスミドまたはアデノウイルスのような、ベクターにクローニングされ、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子受容体のような構築物を形成するが、それらに制限されない。ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子
レポーターは細胞系を感染またはトランスフェクトさせてＣＹＰ８Ｂ１プロモーターが活性化された場合細胞系が検出物質を発現するのに使用されてもよい。
本発明のヌクレオチドはプロモーターまたはＳＨＰおよび／またはＦＸＲをコードする遺伝子を含んでもよい。プロモーターまたは遺伝子はＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含むベクターにクローニングされてもよい。
本発明のある具体例に従って、ＳＨＰプロモーターはベクターにクローニングされる。好ましくは、ＳＨＰプロモーターは以下の核酸配列を有する：
【００７４】
【表９】
【００７５】
本発明は短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）をコードする遺伝子および／または肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）をコードする遺伝子を含んでもよい。ＳＨＰおよび任意にＨＮＦ４αをコードする遺伝子はＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーターおよび検出物質遺伝子を含むベクターにクローニングされてもよい。ヌクレオチドは制限されない、単一のベクターまたは複数のベクターにクローニングされてもよい。
本明細書にて使用される「変異体」なる語は、参考ポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な性質を維持するポリヌクレオチドである。変異体のヌクレオチド配列における変化は参考ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもさせなくてもよい。ヌクレオチドの変化は参考配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合、および切断を生じてもよい。ポリヌクレオチドの変異体は対立遺伝子多型のような天然に生じるものであっても天然に生じるか未知である変異体であってもよい。天然に生じないポリヌクレオチドの変異体は突然変異誘発法または直接合成によって作られてもよい。
本発明はまた本明細書に記載のポリヌクレオチドに低ストリンジェント条件、より好ましくはストリンジェント条件、最も好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドを含む。ストリンジェント条件の例は以下のストリンジェント条件表に示される：高ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ａ−Ｆと同じくらいストリンジェントである；ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ｇ−Ｌと同じくらいストリンジェントである；および低ストリンジェント条件は少なくとも、例えば、条件Ｍ−Ｒと同じくらいストリンジェントである。
【００７６】
【表１０】
【００７７】
【表１１】
【００７８】
ｂｐ１：ハイブッリド長はハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションした領域に対して予想されるものである。あるヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする場合、ハイブリッド長はハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドの長さであると予想される。既知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションされる場合、ハイブリッド長はポリヌクレオチドの配列を調整して最適な配列相補性を有する１つの領域または複数の領域を同定して定量可能である。
緩衝液Ｈ：ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はハイブリダイゼーションにてＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）で置換可能であるおよび洗浄緩衝液；洗浄はハイブリダイゼーションの完了１５分後に行われる。
ＴＢないしＴＲ：長さ５０塩基対以下と予想されるハイブリッドに関するハイブリダイゼーション温度はＴｍが以下の式に従って定量される場合、ハイブリッド融点（Ｔｍ）以下の５−１０ＥＣであるべきである。長さ１８塩基対以下のハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａの＃＋Ｔ塩基）＋（Ｇの＃＋Ｃ塩基）である。長さ１８ないし４９塩基対のハイブッリドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であって、Ｎはハイブッリド内の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣでは［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍである）。
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関するストリンジェント条件の別の例がSambrook、J.、E.F.Fritsch、およびT.Maniatis、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、chapters 9および11、およびCurrent Protocols in Molecular Biology、1995、F.M.Ausubelら、eds.、John Wiley&Sons、Inc.、sections 2.10および6.3-6.4にて提供されて、参照として本明細書の一部とする。
【００７９】
本発明はまたこれらのヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチドを提供してまたアンチセンス配列を提供する。本発明のアンチセンス配列は、またアンチセンスオリゴヌクレオチドというが、本発明のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの発現を遮断する内部で産生される配列および外部から投与した配列の両方を含む。本発明のアンチセンス配列は、例えば、約１５−２０塩基対を含む。アンチセンス配列は、例えば、プロモーターが上流の非翻訳配列に結合するのを防止するまたはリボソームが結合するのを防止して本発明のポリペプチドをコードする転写産物の翻訳を防止することによって転写を阻害するように設計可能である。
本発明のポリヌクレオチドは多くの方法（例えば、ＤＮＡライブラリ、有機体自身から化学合成によって）で調製されて様々な形態（例えば、１本鎖、２本鎖、ベクター、プローブ、プライマー）を成すことができる。「ポリヌクレオチド」なる語はＤＮＡおよびＲＮＡ、およびまた修飾骨格を含有するようなそれらのアナログを含む。
本発明のポリヌクレオチドがポリペプチドの組換え製品用に使用される場合、ポリヌクレオチドは単独で、成熟ポリペプチドまたはその断片のコード配列、リーダー配列または分泌配列をコードするような、他のコード配列と共に読み枠内にある成熟ポリペプチドまたは断片のコード配列、プレ、プロ、またはプレプロタンパク配列、または他の融合タンパク部分を含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列はコード配列に結合可能である。ポリヌクレオチドはまた転写された、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡを安定化する配列のような、非コード５’および３’配列を含有してもよい。
【００８０】
投与法
本発明は対象に上記の組成物を投与する方法を意図する。対象は哺乳類または鳥類が可能である。好ましくは、対象はヒトである。適量の投与量で有効量の組成物が対象に投与されて所望の応答を引き出す。本明細書にて使用される、「有効量」は、哺乳類宿主に単一投与または一連の投与の一部のいずれかで、少なくとも治療される個人の系が所望の応答、例えば、アテローム動脈硬化の場合、血清ＬＤＬコレステロール値を減らす応答を生むようにするのに十分な量を投与することを意味する。保護は免疫原性組成物の単一投与によって与えられても、保護を維持するための後期の追加投与量に加えて、いくつかの投与量の投与を必要としてもよい。
投与量は年齢および体重のような、個人に特異的な条件によって変化可能である。この量は当業者に公知の方法による通常の試験にて定量可能である。
患者に本発明の組成物を投与するための様々な投与形が上記される。当業者によって定量される組成物を投与するためのいずれの適当な投与形も本発明によって意図される。
【００８１】
実施例
以下の実施例は説明であって本発明はそれらに制限されることを意図しない。
【００８２】
実施例１−エチニルエストラジオールはマウス肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害する
心臓血管疾患の発生率は閉経期前の女性に非常に低いが、閉経期以降で劇的に上昇するという観察に基づいてある研究が行われた。多くの研究はホルモン補充療法が閉経後の女性にて心臓血管疾患の発生率を低下させることができることを示した。エストロゲンは脂質プロフィールに有利な効果を有するが、脂質の変化は疾患の発生率の低下を部分的にしか説明できない。炎症はアテローム動脈硬化の過程の重要な成分である。エストロゲンのインビボにおける炎症を阻害する能力を研究するために、卵巣摘除メスＣ５７ＢＬ／６マウスをビヒクルまたはエチニルエストラジオール（ＥＥ）で４日間処理して続いてＩＬ−１βで１時間処理した。肝ＲＮＡの遺伝子チップ分析は約１００個の遺伝子がＩＬ−１βによって誘導されることを証明した。ＥＥによる処理はこれらの遺伝子の約３分の１の誘導を阻害した。ＥＥは発現基礎レベルを変化させないため、この効果は遺伝子活性に特異的であった。ＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害はＥＲαノックアウトマウスでは見られなかった。ＥＥによる処理はまた、その発現がＮＦ−κＢ活性を阻害することで知られる、プロスタグランジンＤシンターゼを含む、肝にて多くの遺伝子発現を阻害した。しかしながら、ゲニステインまたはラロキシフェンによる処理はＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害を維持するがプロスタグランジンＤまたは他の遺伝子発現を刺激しなかった。これらの結果はインビボのＥＲαが古典的なＥＲ介在遺伝子誘導を必要としない機序でＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害できることを示す。
マウス肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現の調節を評価するために実験が行われた。卵巣摘除Ｃ５７ＢＬ／６マウスをコーン油／エタノールビヒクルまたは１００μｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（ＥＥ）のいずれかの皮下投与で５日間前処理した。５日目に、マウスにＰＢＳまたはＰＢＳ中２０μｇ／ｋｇのＩＬ−１βのいずれかの腹腔内注射を行った。１時間後肝を除去してポリＡ化ＲＮＡを調製した。アフィメトリックス社製ネズミ１１Ｋ遺伝子チップを使用する分析によって広範囲の遺伝子発現を定量した。各遺伝子で、ビヒクル前処理およびＰＢＳを受けた動物における発現レベルを１．０と定義し、これに対してビヒクル前処理±ＩＬ−１βまたはＥＥ前処理±ＩＬ−１βを受けたマウスにおける発現レベルを定義した。示された結果は２つの独立した実験からの平均である。７５個の遺伝子がＩＬ−１βによる処理によって２倍以上増殖して誘導された。逆に、５個の遺伝子の発現がＩＬ−１βによって阻害された。
【００８３】
【表１２】
【００８４】
【表１３】
【００８５】
【表１４】
【００８６】
図１を参照して、エチニルエストラジオールがＩＬ−１βによる遺伝子発現の調節を遮断するかどうかを定量する研究結果を提供する。ビヒクル前処理を受けた動物（ｘ軸）対ＥＥによる処理を受けた動物（ｙ軸）で各遺伝子の折りたたみ調節をプロットする。ＥＥ前処理に影響されないＩＬ−１βによる誘導を伴う遺伝子は対角線上に沿って点在するだろう。大部分の遺伝子で、そうである。しかしながら、多くの遺伝子は有意に対角線の下にあり、ＥＥがこれらの遺伝子誘導を阻害したことを示す。例えば、ＩＬ−１βによるｂｃｌ−３、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびＦｎｋの誘導は全てＥＥ前処理によって低下した（また表ＩＩＩを参照）。トランスグルタミナーゼのようないくつかの遺伝子の発現はＥＥ＋ＩＬ−１β処理マウスにて増加して、トランスグルタミナーゼの発現を増加させるＩＬ−１βおよびエストロゲンの両方の既知の能力に一致した。逆に、ＥＥ前処理は有意に対角線の上にあるこれらの点によって示されるように、ＩＬ−１β介在ＳＨＰおよびＨｅｓ−１の抑制を阻害した。
図２を参照して、ＨｅｐＧ２細胞におけるＳＨＰ発現のＩＬ−１βによる阻害を以下のように試験した。ＩＬ−１βは典型的に遺伝子発現の抑制に関連しない。ＩＬ−１β介在ＳＨＰ発現の直接的な抑制を証明するために、ＨｅｐＧ２細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βで処理した。リアルタイムＰＣＲを使用してその後様々な時間で調製した総ＲＮＡをＳＨＰ発現に関して分析した。ＩＬ−１βによる処理３および６時間後でＳＨＰ発現を有意に低下させた（＊ｐ＜０．０５対時間０）。これはＳＨＰｍＲＮＡレベルがＩＬ−１β処理９時間後による基準レベルまで復帰するような細胞の生存を一般に低下させるためではなかった。
図３ａ、３ｂおよび３ｃを参照して、Ｆｎｋ、ＪＡＢ、およびＬＩＸのＥＥによる阻害がＩＬ−１βによる誘導に特異的であることを研究した。２つの可能な機序が遺伝子発現における明らかなＥＥ効果を引き起こすことができた。最初に、ＥＥはＩＬ−１β処理によって誘導される折りたたみ誘導に影響するのではなくて、遺伝子発現の基本レベルを変化させるだろう。別法として、ＥＥは基本的な遺伝子発現には全く影響しないがむしろＩＬ−１β介在遺伝子誘導を特異的に遮断するだろう。
【００８７】
図３ａを参照して、これら２つの機序を判別するために、ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の折りたたみ誘導およびＩＬ−１βによるＳＨＰの折りたたみ抑制をビヒクル（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のＥＥ（灰棒）で前処理した動物にて定量化した。各遺伝子の肝ＲＮＡレベル（平均＋／−標準誤差）を各々個々の動物由来のＲＮＡのリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、およびＬＩＸにおける折りたたみ誘導（ＩＬ−１βを受けた動物における発現のＰＢＳを受けた動物における発現に対する比率として定義される）はＥＥ前処理動物にて低下した。対照的に、ＩＬ−１βによるｂｃｌ−３およびＳＨＰにおける折りたたみ抑制はビヒクルおよびＥＥ処理動物にて同様であった。
図３ｂを参照して、ＥＥはｂｃｌ−３の基本的な発現を抑制してＳＨＰの基本的な発現を増加させた（ＥＥ処理マウスのビヒクル処理マウスに対する比較による）。ＥＥはこれらの遺伝子を調節するためのＩＬ−１βの直接的な能力に影響しなかった：ＩＬ−１によるｂｃｌ−３の誘導はビヒクル処理マウスで６．２倍およびＥＥ処理マウスで５．２倍であり、一方ＩＬ−１はビヒクル処理マウスで８６％およびＥＥ処理マウスで８５％ＳＨＰを抑制した。
図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄおよび４ｅを参照して、ＥＥがエストロゲン受容体（ＥＲ）依存機序によってＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を遮断するかどうかを定量するための実験を行った。エストロゲンは抗酸化機序のようなＥＲ依存経路を含む多くの機序によって遺伝子発現を調節することができる。ＥＲがＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子調節の調節を媒介したことを証明するために、マウスをビヒクル＋ＰＢＳ（灰棒）、ビヒクル＋ＩＬ−１β（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（ＥＥ）、１または１０ｍｇ／ｋｇ／日の１７β−エストラジオール（各々、１個のＥ２および１０個のＥ２）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のゲニステイン、５ｍｇ／ｋｇ／日のラロキシフェン、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０で処理した。Ｆｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、ｂｃｌ−３およびＳＨＰの肝発現レベル（平均＋／−標準誤差）をリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＥＥおよびＥ２はこれらの遺伝子の調節に最も影響した（＊ｐ＜０．０５対ＩＬ−１β単独）。ゲニステインおよびＳＥＲＭラロキシフェンはまた効果はＥＥおよびＥ２で見られたほど大きくないが、同様の調節パターンを示した。最後に、純粋なＥＲアンタゴニストのＩＣＩ１８２７８０はこれらの遺伝子のいずれの発現にも影響しなかった。それ故これらの遺伝子の全ての調節はＥＲが仲介すると考えられる。
【００８８】
図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅを参照して、ＥＲαが肝におけるＥＥによる遺伝子発現の調節に必要されるかどうかを定量するために実験を行った。ＥＲαまたはＥＲβが肝におけるＩＬ−１βによる遺伝子発現に対するＥＥの影響を仲介するかどうかを定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ＥＲαＫＯマウス、または１２９ＥＲβＫＯマウスをビヒクル（黒棒）または１０μｇ／ｋｇ／日のＥＥ（灰棒）で５日間前処理してその後ＩＬ−１βで１時間処理した。Ｆｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、ｂｃｌ−３、およびＳＨＰの肝発現レベル（平均＋／−標準誤差）をビヒクル＋ＰＢＳを受けた動物における発現を１．０と定義して、リアルタイムＰＣＲによって定量した。これらの遺伝子全てのＥＥによるＩＬ−１βによる調節の阻害パターンは野生型動物およびＥＲβ欠損動物にて比較可能であった（ビヒクルおよびＥＥ処理動物間の遺伝子発現の変化の比較に関するｐ＊＜０．０５）。対照的に、ＥＥはＥＲα欠損動物にてＩＬ−１βによるこれらの遺伝子の調節に全く影響しなかった。
表ＩＶを参照して、マウス肝におけるＥＥによる遺伝子発現の誘導を研究した。ＩＬ−１βによる遺伝子誘導のＥＥ調節に関する１つの可能な機序はＳＨＰ、既知の転写リプレッサーの誘導を介してであった。しかしながら、ラロキシフェンはＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸおよびｂｃｌ−３の誘導を阻害できるが、ラロキシフェンはＳＨＰ発現を増加させず、それ故この機序を薬理学的に除外した（図４）。ＥＥによるいずれの他の遺伝子誘導もＩＬ−１βによる誘導の阻害を説明できるかどうかを定量するために、遺伝子チップの結果をＥＥによる遺伝子発現の誘導に関して分析した。イノシトール−１−ホスフェートシンターゼ（ＩＰＳ）、腸管トレフォイル因子、クレアチンキナーゼ、および補体ファミリーの一員を含む、ＥＥ前処理によって誘導される多くの遺伝子がＥＥによって調節されていることがわかった。加えて、プロスタグランジンＤ２シンターゼはＥＥ処理によって強力に誘導された。インビトロにおけるプロスタグランジンＤシンターゼの過剰発現はＩＫＫ活性を遮断してＮＦ−κＢ活性化を阻害し、おそらくＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に関する別の機序を提供する。
【００８９】
【表１５】
【００９０】
図６ａおよび６ｂを参照して、ＥＥによる遺伝子発現の誘導がＥＲαによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害に必要でないことを確認するために実験を行った。ＥＥによるプロスタグランジンＤシンターゼの誘導がＩＬ−１βによる遺伝子誘導のＥＲα介在阻害に必要であるかどうかを定量するために、ビヒクル＋ＰＢＳ（灰棒）、ビヒクル＋ＩＬ−１β（黒棒）または１００μｇ／ｋｇ／日のＥＥ、３０ｍｇ／ｋｇ／日のゲニステイン、５ｍｇ／ｋｇ／日のラロキシフェン、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０で処理したマウスにおけるプロスタグランジンＤシンターゼの肝発現レベルを定量した。ビヒクル＋ＰＢＳ処理マウスにおける発現レベルを１．０と定義した。これらのＲＮＡサンプルは図４にて使用されるものと同様であり、ＥＥ、ゲニステインおよびラロキシフェンのこれらの投与量は全てＩＬ−１βによる誘導を阻害した。しかしながら、これらの化合物のＩＬ−１βによる遺伝子誘導を阻害する能力（ＥＥ＞ゲニステイン＞ラロキシフェン）およびこれらの化合物のプロスタグランジンＤシンターゼの発現を刺激する能力（ＥＥ＞＞ラロキシフェン＞ゲニステイン）の間に相関は全くなかった。ＩＰＳの誘導に関して類似のパターンが見出され、ラロキシフェンによる誘導は非常に弱くゲニステインによる誘導は全くなかった。これはＥＲαによる遺伝子誘導がＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を阻害する能力に必要でないことを示す。
図７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄおよび７ｅを参照して、肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の阻害の有無を試験した。肝のＥＥ活性に関するＥＲαの必要性は肝にＥＲαがほとんど独占的に存在することに一致する（リアルタイムＰＣＲによって定量、パネルＡ）。対照的に、肺は比較的低レベルのＥＲαおよび高レベルのＥＲβを発現する。ＥＲβがまたＩＬ−１βの遺伝子発現を誘導する能力を修飾するかどうかを定量するために、ＥＥのＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の誘導を変化させる能力を肝、脾、および肺にて定量した。上記のように、ＩＬ−１βによるこれらの遺伝子誘導は肝にて有意に遮断された。脾におけるＩＬ−１βによるＦｎｋおよびＪＡＢの誘導もまたＥＥ前処理によって遮断された。脾は、肺に比べてある程度高いが、肝に比べて有意に低いレベルのＥＲαを発現する。対照的に、ＥＥ前処理は肺にてＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、またはｂｃｌ−３の誘導に全く影響しなかった。組織特異因子はこれらの結果に影響するだろうが、肺における調節の欠如はＥＲβがこれらの効果を仲介できず実際ＥＲαのＩＬ−１βによる遺伝子発現の誘導を変化させる能力を阻害するという仮説に一致する。
【００９１】
図８を参照して、ＨｅｐＧ２細胞にてＥＲａおよびＥＲαによるＩＬ−１βによるＮＦκＢ活性誘導の阻害を評価した。肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３発現誘導の阻害の欠如はＥＲβが固有にこの阻害を仲介できないこと、または肝、脾、および肺間の組織特異的な相違のいずれかによるものであるだろう。ＥＲβのＩＬ−１βシグナル伝達を直接阻害する能力を定量するために、ＮＦκＢ誘導ルシフェラーゼレポータープラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照プラスミドと共にヒトＥＲαまたはＥＲβのいずれかを発現するプラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後細胞をビヒクル、１０ｎＭの１７β−エストラジオール、または１０ｎＭの１７β−エストラジオール＋１ｕＭのＩＣＩ１８２７８０で処理した。後日細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間処理してルシフェラーゼ発現をアッセイした。ＥＲαおよびＥＲβは共にルシフェラーゼ活性を有意に抑制したが（＊ｐ＜０．０１）、ＥＲβはＥＲαに比べて常に有効でなかった。それ故肺におけるＥＥによるＩＬ−１βによる遺伝子誘導の調節の欠如はＥＲβが固有にＩＬ−１βシグナル伝達を阻害できないことによるとは考えられない。確かに、肺における調節の欠如はＥＲによるＩＬ−１βシグナル伝達の阻害に必要な補助タンパクにおける組織特異的な発現の相違を反映するだろう。
以下の結論はこれらの実験結果から明らかである：（１）ＩＬ−１βによる１時間処理はマウス肝にて７５個の遺伝子の発現を誘導して５個の遺伝子の発現を阻害する；（２）ＥＥ前処理はＥＲα依存的にこれらのＩＬ−１βによる調節を阻害する；（３）ＥＥは基本的な発現を変化させるまたは遺伝子誘導を特異的に阻害することで遺伝子発現を調節できる；（４）ＥＲαによる遺伝子発現の誘導はＥＲαのＩＬ−１β介在遺伝子調節を遮断する能力に必要でない；および（５）ＩＬ−１βによるＦｎｋ、ＪＡＢ、ＬＩＸ、およびｂｃｌ−３の誘導は肝にて阻害されるが、高レベルのＥＲβを有する、肺ではない。これはＥＲβが固有にＩＬ−１βシグナル伝達を阻害できないことによらないが、おそらくＥＥによるＩＬ−１βシグナル伝達の阻害に必要な補因子における特異的な相違を反映するだろう。
【００９２】
実施例２−ＳＨＰ発現の調節
以下のように、ＳＨＰ発現の調節を調査するためにいくつかの実験を行った。図９を参照して、マウス肝におけるＥＲαによるＳＨＰ発現の調節を研究した。卵巣摘除野生型マウス、ＥＲαＥＲβダブルノックアウトマウス、ＥＲαＫＯマウス、またはＥＲβＫＯマウスをビヒクル、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２＋５ｍｇ／ｋｇ／日のＩＣＩ１８２７８０、５ｍｇ／ｋｇ／日のタモキシフェン、または５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＴの皮下注射で６週間処理した。ＳＨＰの肝発現をリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、モニターした。ＷＴ動物、Ｅ２、タモキシフェン、およびＥＲα選択的アゴニストのＰＰＴは全てＳＨＰｍＲＮＡレベルを誘導した。ＩＣＩ１８２７８０はこの誘導を阻害した。Ｅ２はＥＲαＫＯマウスまたはＥＲαβＫＯマウスの両方でＳＨＰの発現を誘導しなかった。ＥＲβＫＯマウスにおいてＳＨＰの基本的な発現は増加したが、Ｅ２はさらにＳＨＰの発現を誘導した。総合して、これらの結果はマウス肝におけるエストロゲンによるＳＨＰ誘導は主にＥＲαによって媒介されることを示す。
図１０を参照して、エストロゲンがラット肝にてＳＨＰを調節するかどうかを定量するためにある研究を行った。卵巣摘除スプラーグ−ドーリーラットをビヒクル、１０ｕｇ／ｋｇ／日のＥ２、または５ｍｇ／ｋｇ／日のＰＰＴで６週間処理した。ＳＨＰの肝発現をリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、モニターした。Ｅ２およびＰＰＴの両方ともＳＨＰ発現を有意に誘導し、ＥＲａはまたラット肝にてもＳＨＰを誘導することを示す。
図１１ａおよび１１ｂを参照して、ヒト細胞におけるＥＲαによるｈＳＨＰプロモーター活性の調節を試験した。ヒトＨｅｐＧ２または２９３細胞に対照ＳＶ４０誘導β−ガラクトシダーゼプラスミド、１．４ｋｂのヒトＳＨＰプロモーターによって誘導されるルセリフェラーゼプラスミド、およびタンパクもヒトＥＲαもコードしない発現プラスミドをコトランスフェクトした。トランスフェクション後細胞をＤＭＳＯビヒクルまたは１０ｎＭのＥ２で２４時間処理した。β−ガラクトシダーゼ活性を正常化したルシフェラーゼ活性に関して細胞抽出物を分析した。Ｅ２はＥＲαを発現する細胞においてのみＳＨＰプロモーター活性を誘導した。これらの結果はＥ２がヒト肝にてＳＨＰ発現を調節することを示す。
【００９３】
図１２ａ、１２ｂ、および１２ｃを参照して、２９３細胞におけるＥＲαによるｈＳＨＰプロモーター活性の調節を試験した。図１２ａおよび１２ｂを参照して、２９３細胞に対照ＳＶ４０誘導β−ガラクトシダーゼプラスミド、１．４ｋｂのヒトＳＨＰプロモーターまたは合成２ｘＥＲＥ／ＴＫプロモーターによって誘導されるルセリフェラーゼプラスミド、およびヒトＥＲα発現プラスミドをコトランスフェクトした。後日細胞を１ｕＭの示される化合物（ＩＣＩ１８２７８０、４−ヒドロキシタモキシフェン、またはラロキシフェン）およびＤＭＳＯビヒクル（−）または１０ｎＭのＥ２（＋）で２４時間処理した。β−ガラクトシダーゼ活性を正常化したルシフェラーゼ活性に関して細胞抽出物を分析した。マウスで見られたように、Ｅ２およびタモキシフェンはＳＨＰプロモーター活性を刺激した。ＩＣＩおよびラロキシフェンは単独で不活でＥ２活性に拮抗した。ＳＨＰプロモーターはＥＲＥ誘導プロモーターとは有意に異なり、Ｅ２によるＳＨＰプロモーター活性の調節は古典的なエストロゲン応答配列を介して作用しないことを示す。
図１２ｃを参照して、Ｅ２によるＳＨＰの誘導および２ｘＥＲＥプロモーター活性に関する用量応答曲線を提供する。Ｅ２の約１０倍高い濃度がＳＨＰプロモーター活性に比べてＳＨＰプロモーター活性の誘導に必要とされた。ＳＨＰはＥＲ活性のネガティブレギュレーターであるため、ＳＨＰプロモーター活性化に必要とされる高いＥＣ５０はＥ２レベルが多量に達する場合このネガティブフィードバックループを誘導するだけの方法を反映するだろう。
図１３を参照して、２９３細胞においてＥ２応答配列をマッピングするためにある研究が行われた。一連のＳＨＰプロモーター切断レポータープラスミドをＥＲα発現プラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミドと共に２９３細胞にコトランスフェクトした。正常化ルシフェラーゼ活性をビヒクルまたは１０ｎＭのＥ２のいずれかで処理した２４時間後定量した。ビヒクルで処理した細胞における１４６０ｂｐのＳＨＰプロモーターの発現を１．０と定義した。２９３細胞における基本的な発現に影響する配列は−７９５ないし−５４９間に局在し、一方Ｅ２調節は−１４６０ないし−１２６０間に局在した。
【００９４】
図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃを参照して、ＥＲによる誘導によってＳＨＰがＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１を抑制できないかどうかを定量するためにある研究を行った。卵巣摘除マウスに対照食餌（−）またはコール酸塩を含有する食餌（＋）のいずれかを与えてビヒクル（−）または１０ｕｇ／ｋｇ／日のエチニルエストラジオール（＋）の毎日の皮下注射によって５週間または５日間のいずれかで処理した。研究の最後で、ＳＨＰ、ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって、ＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら、定量した。ＥＥは５日間または５週間の処理のいずれかでコール酸塩によって見られた誘導に比べて少し低いレベルまでＳＨＰの発現を誘導した。しかしながら、ＥＥ処理はいずれの期間においてもＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の発現を有意に変化させず、対照的に、コール酸塩は９５％以上までＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の発現を抑制した。これらの結果はＳＨＰ発現の単純な誘導はＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１の強い抑制に適さないことを示す。
図１５を参照して、コール酸塩によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の抑制がＳＨＰ誘導に必要であるかどうかを試験するために実験を行った。卵巣摘除マウスにコール酸塩の濃度を増加させて５日間与えた。ＳＨＰ、ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによってＧＡＰＤＨ発現を正常化しながら定量した。ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１の有意な抑制が食餌中０．０３％のコール酸塩でのみ生じ、一方０．３％のコール酸塩が食餌に加えられるまでＳＨＰｍＲＮＡレベルの有意な増加は生じなかった。ＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１抑制に比べてＳＨＰ誘導に１０倍のレベルのコール酸塩が必要であることはＳＨＰ発現の誘導がコール酸塩によるＣＹＰ７Ａ１およびＣＹＰ８Ｂ１発現の調節に関する唯一の機序ではないことを示す。
【００９５】
実施例３−化合物を同定してコレステロール生合成経路にてＳＨＰを阻害するための一時的トランスフェクション
ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター（転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３の配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってゲノムＤＮＡから単離した。生成したＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ２．１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）にＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を使用してＴＯＰＯクローニングした。正確な配列の確認後、ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターをＥｃｏＲＩ切断によって除去した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して生成したＤＮＡ断端を平滑にした。断片をＳｍａＩ切断ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシンから入手可能）にライゲーションして、ヒトＣＹＰ８Ｂ１プロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼレポーターを有する、ｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬを作製した。ヒトＨＮＦ４およびＳＨＰコード領域をＳＶ４０プロモーター発現ベクターｐＳＩ（プロメガ社）に類似の標準分子法によってクローニングした。
プラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトする。残りのＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、フェノールレッド媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１９９５−０６５）で維持する。トランスフェクションの間に、細胞をフェノールレッド除去ＤＭＥＭ高グルコース媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号３１０５３−０２８）、１０％チャコール処理ＦＢＳ（ハイクローン社、ローガン、ユタ、カタログ番号ＳＨ３００６８．０３）から成るアッセイ媒体に１２ウェルプレートの１ウェル当たり１ｘ１０５細胞でプレートする。後日、トランスフェクション試薬のＴｆｘ−２０（プロメガ社；Ｅ２３９１）を血清除去、フェノールレッド除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１０３９−０２１）中０．５μｇのｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、０．４μｇのｐＳＩ−ＨＮＦ４および１μｇ以下のｐＳＩ−ＳＨＰとＴｆｘ―２０のＤＮＡに対する比率２：１で混合し、室温で１０分間インキュベートする。細胞を血清除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄して媒体を吸引する。Ｔｆｘ−２０／ＤＮＡ混合物を加えて細胞を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション終了後、アッセイ媒体を加えて細胞をさらに２３−４８時間インキュベートする。アッセイ媒体を除去して細胞をＰＢＳで洗浄する。洗浄溶液を除去して２５０μｌの１ｘウミシイタケ溶解緩衝液（プロメガ社；Ｅ２８１０）を加える。プレートを１５分間振動プラットフォームに置く。溶解物を微小遠心チューブに移して３０秒間遠心して除去する。２０μｌのアリコートを微小蛍光プレート（テルモラボシステム社）に移す。１００μｌのウミシイタケアッセイ試薬を１回１ウェルに注入してＤｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計にて３０秒間隔でリーディングを行った。
【００９６】
図１６を参照して、得られたルシフェラーゼ活性をグラフに表す。ＳＨＰ発現プラスミドの付加はＨＮＦ４誘導ＣＹＰ８Ｂ１プロモーター活性を用量依存的に抑制した。
試験化合物がＳＨＰ活性を阻害できるかどうかを定量するために、トランスフェクション後試験化合物をアッセイ媒体に加える。ルシフェラーゼ活性はＳＨＰアンタゴニストの存在下で増加するだろう。
上記方法の別の具体例はネオマイシン、ヒグロマイシン、またはピューロマイシンを含む標準の選択マーカーを使用して細胞にｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、ｐＳＩ−ＨＮＦ４、およびｐＳＩ−ＳＨＰプラスミドを安定してトランスフェクトすることである。
【００９７】
実施例４−化合物を同定してコレステロール生合成経路にてＳＨＰを阻害するためのアデノウイルス感染
ＡＤＥＡＳＹ系（キューバイオジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）に記載されるような標準技術を使用してレポーター遺伝子（例えば、蛍光ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）のヒトＣＹＰ８Ｂ１プロモーター誘導発現領域を含有するレポーターアデノウイルスを構築した。ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターレポーター構築物をまず転送ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅまたはｐＱＢＩ−ＡｄＢＮにクローニングする。生成したプラスミドをＰｍｅＩで直線化してｐＡｄＥａｓｙ−１、ウイルスベクターと共にＥ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３にコトランスフェクトする。組換え体をカナマイシンで選択してＰＣＲまたは制限酵素分析でスクリーニングする。
正確なプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａに形質転換してトランスフェクション性ＤＮＡをキアゲンマキシキットのような典型的な方法によって精製する。組換えアデノウイルス構築物をＰａｃＩで切断してそのＩＴＲ（逆方向末端反復）を暴露しウイルス粒子を産生するためにＱＢＩ−２９３Ａ細胞にトランスフェクトする。生成したプラークは標準法による増幅のために使用される。最終的に増幅させたアデノウイルスの塩化セシウム勾配法のような方法による精製に続いて、２９３細胞を使用して最終のアデノウイルスの残りを滴定する。ＨＮＦ４および／またはＳＨＰを発現するアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのような別の転送ベクターが使用されてもよいことを除いて、同様に調製する。
別の具体例はＨＮＦ４ａに反応することが知られている他のいずれのプロモーターを使用して（Naikiら、JBC 277：14011、2001を参照、このような遺伝子の表に関して、参照として一部とする）レポーター遺伝子の発現を誘導することである。
上記方法のさらに別の具体例はＨＮＦ４およびＳＨＰの両方を発現するために単一のアデノウイルを使用することである。この場合転送ベクターのｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰが使用される。ＳＨＰｃＤＮＡをＣＭＶ５プロモーター下流でクローニングする。ＧＦＰ遺伝子はＨＮＦ４ａ遺伝子に置換される。これらの工程は制限酵素断片組換え法またはより好ましくはオーバーラップＰＣＲ法のような標準技術によって達成される。生成した転送プラスミドはＣＭＶプロモーターさらにＳＨＰｃＤＮＡさらに内部リボソーム進入部分（ＩＲＥＳ）を含有してさらにＨＮＦ４ｃＤＮＡを含有してもよい。転送プラスミドｐＱＢＩ−ＡｄＢＭ５−ＰＡＧにて主要遅延プロモーター（ＭＬＰ）のような他のプロモーターをＣＭＶプロモーターの代わりに使用してもよい。この好ましい方法はＨＮＦ４が発現する全ての細胞にてＳＨＰが発現することを保証する。
【００９８】
さらに別の具体例はレポーター遺伝子の発現を誘導するヒトＣＹＰ７Ａ１プロモーター領域を含有するレポーターアデノウイルスと組み合わせてＣＰＦ（ＬＲＨ−１）を発現するアデノウイルスを使用することである。
アデノウイルスベクターが完成すれば、それらは感染ヒト細胞、最も好ましくはヒトヘパトーマＨｅｐＧ２細胞に使用される。細胞をアデノウイルスに媒体中３７℃で、典型的には５時間暴露する。細胞を洗浄してアデノウイルスと共に新鮮な媒体で栄養補充する。レポータープラスミドおよびＨＮＦ４発現プラスミドに適した感染の多重度（ＭＯＩ）を各ウイルスの様々なＭＯＩの重感染を使用するマトリックス分析によって定量する。同様に、ＳＨＰを発現するアデノウイルスに最適なＭＯＩを定量する。それ故最終アッセイにて、ｘＭＯＩとしてＣＹＰ８Ｂ１レポーターアデノウイルス、ｙＭＯＩとしてＨＮＦ４発現アデノウイルス、およびｚＭＯＩとしてＳＨＰ発現アデノウイルスで細胞を感染させる。感染後、細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。典型的には試験化合物をＤＭＳＯに溶解させて最終濃度約１０μＭで培養媒体に加える。２４ないし４８時間後、レポーター活性の発現を測定する。例えば、ルシフェラーゼ活性はＬＵＣ−ＳＣＲＥＥＮ蛍光ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニアから入手可能）または細胞を溶解させてルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）を使用することを含む多くの方法でモニターされてもよい。ルシフェラーゼ活性を増加させる化合物はＳＨＰ阻害剤として作用するだろう。
試験化合物がＳＨＰ阻害剤として作用していることを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞をｘＭＯＩとしてＣＹＰ８Ｂ１レポーターアデノウイルスおよびｙＭＯＩとしてＨＮＦ４発現アデノウイルスで感染させる。細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。ルシフェラーゼ活性を上記のようにモニターする。ＳＨＰ阻害剤はＳＨＰのないこれらの細胞内ではルシフェラーゼ活性を変化させないだろう。
【００９９】
実施例５−コール酸塩は炎症遺伝子発現を媒介する
卵巣摘除Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１６−２０ｇ）（タコニック社）を８群に分離した。５−７日後、マウスにカゼイン中心の食餌（＃８１１７、テストダイエット社、リッチモンド、ＩＮ）を５日間与えた。カゼイン食餌は粉末でコール酸（ＣＡ；Ｃ−１１２９、シグマ社、セントルイス、ＭＯ）またはウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ；Ｕ−５１２７、シグマ社、セントルイス、ＭＯ）の濃度を増加させて混合補充されていた。実験期間の終了時に、肝をＲＮＡ分析のために収集した。
【０１００】
ＲＮＡ分析
トリゾール試薬（ＢＲＬ）を使用して総肝ＲＮＡを調製して製造元のプロトコールに従ってＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００検出系（アプライドバイオシステムズ社）を使用するリアルタイムＰＣＲによって定量した。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｃｔｏｒ ｖ１．７ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）を使用してデータを分析してアプライドバイオシステムズ社のプライマーキットを使用してＧＡＰＤＨまで正常化した。
【０１０１】
細胞実験
ＨｅｐＧ２細胞を培養基で５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で維持した。細胞を不完全培養基（熱不活化１０％ＦＢＳ、１％グルタマックス、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｉのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充したフェノールレッド除去ＤＭＥＭ（ギブコＢＲＬ））に６ウェルディッシュ（ファルコン社）の１ウェル当たり４−５ｘ１０５で播種した。細胞を血清除去媒体に移して２４時間後化合物をさらに２４時間加えた。細胞をＲＮＡ分析のために採取した。
【０１０２】
結果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコール酸塩含有高脂肪食を与えると３−５週間後マウス肝にて炎症遺伝子発現を誘導することが以前に示された（Liaoら、'93 JCI 91：2572、Evansら、'01 Circ Res 89：823＆Miyakeら、'00 JBC 275：21805）。これらの誘導を媒介する際のコール酸塩の相対的な寄与を定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＡ（０．０１−１．０％）の濃度を増加させて補充した普通の食餌を５日間与えた。図１Ａに示されるように、ＴＮＦα（４倍）、ＶＣＡＭ−１（３倍）およびＲＡＮＴＥＳ（１．７５倍）のｍＲＮＡの肝レベルの用量依存的な誘導が観察された。予想通り、７α−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）の用量依存的な抑制もまた観察された。
これらの結果はより慢性の研究における高脂肪食によって生じる酸化ストレスまたは高レベルの胆汁酸の作用に付随する潜在的な毒性がない場合で胆汁酸への急性暴露が炎症遺伝子発現を促進するのに十分であることを示した。インビボで、ＣＡは腸管にてＦＸＲと選択的に相互作用することが証明されたデオキシコール酸に変換される（Wang、'99 Mol Cell 3：543＆Makishima、'99 Science 284：1362）一方ＵＤＣＡのようなより親水性の胆汁酸はＦＸＲではなくプレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）への結合を介して機能する（Heuman、'89 JLR 30：1161）。ＦＸＲを介するシグナル伝達が炎症遺伝子発現を生じるのに必要であるかどうかを定量するために、ＦＸＲへの結合を介する胆汁酸シグナル伝達は胆汁酸の主要なメカニズムの１つである１％ＵＤＣＡを普通の食餌に補充した。図１Ｂに示されるように、炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されなかったが一方ＵＤＣＡ処理はｃｙｐ７ａ発現を抑制してＰＸＲへの結合を介して機能する能力に一致してｃｙｐ３ａ発現を誘導した。
加えて、ＳＨＰ発現の誘導もまたＣＡのみで観察されてＵＤＣＡでは観察されずＣＡシグナル伝達におけるＦＸＲの必要性を支持した。
【０１０３】
実施例６−ＦＸＲ特異的胆汁酸によるＳＨＰおよびＲＪＰ１４Ｏの誘導
さらにＦＸＲを介する胆汁酸シグナル伝達が炎症遺伝子活性を促進できる可能性を調査するために、肝細胞系、ＨｅｐＧ２にて実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）（１−１００ｕＭ）または選択的合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４（１−１０００ｎＭ）の濃度を増加させて２４時間処理した。ＣＤＣＡはＣＡに比べてＨｅｐＧ２細胞におけるｃｙｐ７ａ発現のより強力な阻害剤であるため（Makishimaら、'99 Science 284：1362）これらの実験でＣＤＣＡを使用した。ＨｅｐＧ２細胞は常時ＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦを含む多くの炎症遺伝子を発現する（Stonansら、'99 Cytokine 11：151）。ＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理は用量依存的にＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦ発現の両方を誘導した。ポジティブコントロールとして、ＳＨＰｍＲＮＡの誘導およびｃｙｐ７ａの抑制を確認した。これらの結果はＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４を介する選択的なＦＸＲの活性化が炎症遺伝子誘導を引き起こすことができることを証明する。
図１９、２０ａおよび２０ｂを参照してＨｅｐＧ２細胞におけるＣＤＣＡおよびＧＷ４０６４の相対的な発現が説明される。
【０１０４】
これらの実験は炎症遺伝子発現を促進するＦＸＲの新規の機能を証明する。胆汁酸含有高脂肪食がマウス肝にて炎症遺伝子誘導を３−５週間後引き起こすことができることは以前に証明された（Liaoら、'93 JCI 91：2572＆Evansら、'01 Circ Res 89：823）。しかしながら、これらの誘導は胆汁酸と組み合わせた高脂肪食によって引き起こされる酸化ストレスを介して生じて肝毒性を反映すると考えられた（Delzenneら、'92 Toxicity Letters 61：291）。これらの起こり得る紛らわしい問題を避けるために、これらの研究を普通の食餌マウスにおける急性の胆汁酸暴露で行った。結果は０．３％ＣＡの補充が炎症遺伝子発現を誘導するのに十分であることを証明した。この濃度のＣＡはまたＦＸＲ介在遺伝子調節の予想した生物学的活性を確認するｃｙｐ７ａ遺伝子を有意に阻害した。より親水性の胆汁酸、ＵＤＣＡが、普通の食餌に補充された場合炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されなかったが、それでもｃｙｐ７ａの抑制は確認された。これはＵＤＣＡのＰＸＲ結合能によると考えられる（Schuetzら、'01 JBC 276：39411）。これに一致するのはよく特徴付けられたＰＸＲ調節遺伝子の、ｃｙｐ３ａ活性の誘導であった。これらの結果はＰＸＲではなくＦＸＲのリガンドが肝にて炎症遺伝子発現を誘導できることを証明する。これらの結論はＩＣＡＭ−１およびＭ−ＣＳＦの炎症遺伝子誘導がまた胆汁酸ＣＤＣＡまたは合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４の存在下で観察されたＨｅｐＧ２細胞実験にて支持された。ＧＷ４０６４は同様にＩＣＡＭ−１誘導で観察されたものと比較して９０ｎＭのＥＣ５０を有するＦＸＲの特異的リガンドであることが以前に特徴付けられた（Goodwinら、'00 Mol Cell 6：5 17）。
ＳＨＰ発現はＦＸＲに結合する胆汁酸またはＧＷ４０６４によって誘導可能であるため（Goodwinら、'00 Mol Cell 6：5 17＆Sinal、'00 Cell 102：73 1）、ＳＨＰｍＲＮＡレベルもまたモニターした。ＦＸＲリガンドのＣＤＣＡおよびＧＷ４０６４のみがＳＨＰ発現を誘導可能であってＰＸＲリガンドのＵＤＣＡでは不可能であることを確認した。近年、ＳＨＰがインビトロでＮＩＰ−ＫＢのコアクチベーターであることが示された（Kim、'01 JBC）。ＮＩＰ−ＫＢは炎症遺伝子発現における主要な転写因子であってＦＸＲリガンドが如何にして炎症遺伝子発現を可能にするかの説明を可能にする。
【０１０５】
実施例７−発現誘導を仲介する際のコール酸塩の相対的寄与率
これらの誘導を仲介する際のコール酸塩の相対的寄与率を定量するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコール酸（ＣＡ；０．０１−１．０％）の濃度を増加させて補充した普通の食餌を５日間与えた。ＴＮＦＯＣ、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの肝レベルでの用量依存的な誘導を観察した。７（ｘ−ヒドロキシラーゼ（ｃｙｐ７ａ）の用量依存的な抑制もまた観察した。インビボにて、ＣＡは腸管でデオキシコール酸に変換されて、選択的にＦＸＲと相互作用し、一方ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）のようなより親水性の胆汁酸はＦＸＲではなくＰＸＲへの結合を介して機能する。ＦＸＲを介するシグナル伝達が炎症遺伝子発現を引き起こすのに必要であるかどうかを定量するために、１％ＵＤＣＡを普通の食餌に補充した。
特に、図２１ａ−ｄを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに示されるような、普通の食餌、アテローム性食餌または高脂肪食（コール酸ナトリウム除去アテローム性食餌）のいずれか与えた。５週間後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。＊ｐ＜０．０１対普通の食餌のマウス。図２２ａ−ｂを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに示されるようなコール酸の濃度を増加させて補充した普通の食餌を与えた。５日後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。図２３ａ−ｂを参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１％デオキシコール酸で補充した普通の食餌を与えた。５日後、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。Ｂ。１％コール酸（ＣＡ）またはＵＤＣＡのいずれかを５日間与えたマウスにおける肝ＳＨＰｍＲＮＡ発現の比較。データを各群の平均±標準誤差として報告した。
炎症遺伝子発現の誘導は全く観察されず一方ＵＤＣＡ処理はｃｙｐ７ａを抑制してそのＰＸＲ結合を介して機能する能力に一致してｃｙｐ３ａ発現を誘導した。加えて、ＳＨＰ発現の誘導もまたＵＤＣＡではなくＣＡ処理で観察されてＣＡシグナル伝達におけるＦＸＲの必要性を支持した。
【０１０６】
ＦＸＲを介する胆汁酸シグナル伝達が炎症遺伝子発現を促進できる可能性をさらに調査するために、肝細胞系、ＨｅｐＧ２細胞にて実験を行った。ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）または選択的合成ＦＸＲリガンド、ＧＷ４０６４の濃度を増加させて２４時間処理した。ＩＣＡＭ−１発現がＣＤＣＡまたはＧＷ４０６４処理によって用量依存的に誘導された。
図２４ａ−ｄを参照して、ＨｅｐＧ２細胞をケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）の濃度を増加させて２４時間処理した。示した遺伝子の内因性ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各Ｂ群の平均±標準誤差として報告した。上記と同様の実験設計は細胞をＧＷ４０６４に対する高濃度のＦＸＲで処理することを除く。データを各群の平均±標準誤差として報告した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス。図２５を参照して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＧＷ４０６４の経口単回投与で（５０ｍｇ／ｋｇ）処理した。投与後の様々な時間で、示した遺伝子の肝ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。データを各群の平均±標準誤差として報告した。
図２６を参照して、ＨｅｐＧ２細胞にヒトＳＨＰの近位プロモーター領域（−３６０ないし＋４０）またはヒトＩＣＡＭ−１プロモーターの配列欠失（−１１０８または−８１０ないし＋１８）を含有するヒトＦＸＲおよびＲＸＲα発現プラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をＧＷ４０６４（１ｕＭ）で２４または４８時間処理した。データは３つの独立したトランスフェクションの平均±標準偏差を表す。
ポジティブコントロールとして、両化合物でＳＨＰｍＲＮＡの誘導およびｃｙｐ７ａの抑制を確認した。ＨｅｐＧ２細胞にて、これはＩＣＡＭ−１プロモーター活性がまたＧＷ４０６４によって刺激されてその活性において近位ＮＦ−κＢ応答配列を必要としたことを証明する。ＳＨＰは炎症遺伝子発現に関連した主要な転写因子である、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットにおいてコアクチベーターとして作用することが証明された。これはＦＸＲシグナル伝達がＳＨＰ発現の誘導を介するＮＦ−κＢ介在炎症遺伝子発現を誘導するという証拠を提供する。
【０１０７】
実施例８−炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する化合物を同定する一過性トランスフェクション
ＮＦ−κＢプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によってゲノムＤＮＡから単離する。ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を使用して生成したＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＲ２．１（インビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）へＴＯＰＯクローニングする。正確な配列の確認後、ＮＦ−κＢプロモーターをＥｃｏＲＩ切断によって除去する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して生成したＤＮＡ断片の末端を平滑化する。断片をＳｍａＩ切断ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシンから入手可能）へライゲーションしてＮＦ−κＢプロモーターによって誘導されるウミシイタケルシフェラーゼレポーターを有する、ｐＮＦ−κＢ−ＲＬを作製する。ヒトＳＨＰまたはＦＸＲコード領域をＳＶ４０プロモーター発現ベクターｐＳＩ（プロメガ社）へ類似の標準分子法でクローニングする。
プラスミドをＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクトする。残りのＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、フェノールレッド媒体（インビトロジェン社、ギブコカタログ番号１１９９５−０６５）で維持する。トランスフェクションの間に、細胞をフェノールレッド除去ＤＭＥＭ高グルコース媒体（インビトロジェン、ギブコカタログ番号３１０５３−０２８）、１０％チャコール処理ＦＢＳ（ハイクローン社、ローガン、ユタ、カタログ番号ＳＨ３００６８．０３）から成るアッセイ媒体に１２ウェルプレートの１ウェル当たり１ｘ１０５細胞でプレートする。後日、トランスフェクション試薬のＴｆｘ−２０（プロメガ社；Ｅ２３９１）を血清除去、フェノールレッド除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン、ギブコカタログ番号１１０３９−０２１）中０．５μｇのｐＣＹＰ８Ｂ１−ＲＬ、０．４μｇのｐＳＩ−ＨＮＦ４または１μｇ以下のｐＳＩ−ＳＨＰとＴｆｘ―２０のＤＮＡに対する比率２：１で混合し、室温で１０分間インキュベートする。細胞を血清除去ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄して媒体を吸引する。Ｔｆｘ−２０／ＤＮＡ混合物を加えて細胞を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション終了後、アッセイ媒体を加えて細胞をさらに２３−４８時間インキュベートする。アッセイ媒体を除去して細胞をＰＢＳで洗浄する。洗浄溶液を除去して２５０μｌの１ｘウミシイタケ溶解緩衝液（プロメガ社；Ｅ２８１０）を加える。プレートを１５分間振動プラットフォームに置く。溶解物を微小遠心チューブに移して３０秒間遠心して除去する。２０μｌのアリコートを微小蛍光プレート（テルモラボシステム社）に移す。１００μｌのウミシイタケアッセイ試薬を１回１ウェルに注入してＤｙｎｅｘ ＭＬＸマイクロタイタープレート照度計にて３０秒間隔でリーディングを行った。
【０１０８】
試験化合物がＳＨＰ活性を阻害できるかどうかを定量するために、試験化合物をトランスフェクション後アッセイ媒体に加える。ルシフェラーゼ活性はＳＨＰアンタゴニスト存在によって増加する。
上記の方法の別の具体例はネオマイシン、ヒグロマイシン、またはピューロマイシンを含む標準の選択マーカーを使用して細胞にｐＮＦ−κＢ−ＲＬおよびｐＳＩ−ＳＨＰプラスミドを安定してトランスフェクトすることである。
【０１０９】
実施例９−炎症遺伝子発現経路にてＦＸＲおよび／またはＳＨＰを阻害する化合物を同定するアデノウイルス感染
ＡＤＥＡＳＹシステム（キューバイオジェン、カールズバッド、カリフォルニアから入手可能）に記載されるような標準的な技術を使用してレポーター遺伝子（例えば蛍光ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）のヒトＮＦ−κＢプロモーター誘導発現領域を含有するレポーターアデノウイルスを構築する。ＮＦ−κＢプロモーターレポーター構築物をまず転送ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅまたはｐＱＢＩ−ＡｄＢＮにクローニングする。生成したプラスミドをＰｍｅＩで直線化してＥ．ｃｏｌｉ株ＢＪ５１８３へｐＡｄＥａｓｙ−１、ウイルスプラスミドと共にコトランスフェクトする。組換え体をカナマイシンで選択してＰＣＲまたは制限酵素分析でスクリーニングする。
正確なプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａへ形質転換してトランスフェクション性ＤＮＡをキアゲンマキシキットのような典型的な方法によって精製する。組換えアデノウイルス構築物をＰａｃＩで切断してそのＩＴＲ（逆方向末端反復）を暴露しウイルス粒子を産生するためにＱＢＩ−２９３Ａ細胞にトランスフェクトする。生成したプラークは標準法による増幅のために使用される。最終的に増幅させたアデノウイルスの塩化セシウム勾配法のような方法による精製に続いて、２９３細胞を使用して最終のアデノウイルスの残りを滴定する。ＦＸＲまたはＳＨＰのいずれかを発現するアデノウイルスを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのような別の転送ベクターが使用されてもよいことを除いて、同様に調製する。
別の具体例はＨＮＦ４ａに反応することが知られている他のいずれのプロモーターを使用して（Naikiら、JBC 277：14011、2001を参照、このような遺伝子の表に関して、参照として一部とする）レポーター遺伝子の発現を誘導することである。
【０１１０】
上記方法のさらに別の具体例はＨＮＦ４およびＳＨＰまたはＦＸＲの両方を発現するために単一のアデノウイルを使用することである。この場合転送ベクターのｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰが使用される。ＳＨＰｃＤＮＡをＣＭＶ５プロモーター下流でクローニングする。ＧＦＰ遺伝子はＨＮＦ４ａ遺伝子に置換される。これらの工程は制限酵素断片組換え法またはより好ましくはオーバーラップＰＣＲ法のような標準技術によって達成される。生成した転送プラスミドはＣＭＶプロモーターさらにＳＨＰｃＤＮＡさらに内部リボソーム進入部分（ＩＲＥＳ）を含有してさらにＨＮＦ４ｃＤＮＡを含有してもよい。転送プラスミドｐＱＢＩ−ＡｄＢＭ５−ＰＡＧにて主要遅延プロモーター（ＭＬＰ）のような他のプロモーターをＣＭＶプロモーターの代わりに使用してもよい。この方法はＨＮＦ４が発現する全ての細胞にてＳＨＰが発現することを保証する。
さらに別の具体例はレポーター遺伝子の発現を誘導するヒトＮＦ−κＢプロモーター領域を含有するレポーターアデノウイルスと組み合わせてＣＰＦ（ＬＲＨ−１）を発現するアデノウイルスを使用することである。
アデノウイルスベクターが完成すれば、それらは感染ヒト細胞、最も好ましくはヒトヘパトーマＨｅｐＧ２細胞に使用される。細胞をアデノウイルスに媒体中３７℃で、典型的には５時間暴露することによって感染を達成する。細胞を洗浄してアデノウイルスと共に新鮮な媒体で栄養補充する。レポータープラスミドおよびＳＨＰ発現プラスミドに適した感染の多重度（ＭＯＩ）を各ウイルスの様々なＭＯＩの重感染を使用するマトリックス分析によって定量する。それ故最終アッセイにて、ｘＭＯＩとしてＮＦ−κＢレポーターアデノウイルスおよびｙＭＯＩとしてＳＨＰ発現アデノウイルスで細胞を感染させる。感染後、細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。典型的には試験化合物をＤＭＳＯに溶解させて最終濃度約１０μＭで培養媒体に加える。２４ないし４８時間後、レポーター活性の発現を測定する。例えば、ルシフェラーゼ活性はＬＵＣ−ＳＣＲＥＥＮ蛍光ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ系（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニアから入手可能）または細胞を溶解させてルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社）を使用することを含む多くの方法でモニターされてもよい。ルシフェラーゼ活性を増加させる化合物はＳＨＰ阻害剤として作用するだろう。
【０１１１】
試験化合物がＳＨＰ阻害剤として作用していることを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞をｘＭＯＩとしてＮＦ−κＢレポーターアデノウイルスで感染させる。細胞をビヒクルまたは試験化合物で処理する。ルシフェラーゼ活性を上記のようにモニターする。ＳＨＰ阻害剤はＳＨＰのないこれらの細胞内ではルシフェラーゼ活性を変化させないだろう。
具体例を参照して上記に説明および記載されるが、本発明は示した詳細に制限されることを意図しない。むしろ、様々な修飾が請求項と同等の範疇および範囲内で本発明の精神から離れず詳細になされてもよい。それ故、本発明はその精神または本質的な特性から離れず他の具体的な形態で具体化されてもよい。本具体例は、それ故、あらゆる点で説明であって制限するものではなく、本発明の範疇は添付の請求書によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
（原文に記載なし）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を阻害するのに有効な薬剤を同定する方法であって：
（ｉ）短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）または（ｉｉ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に薬剤を投与すること；および
細胞培養にて検出物質の増加を引き起こす薬剤を選択すること
を含む方法。
【請求項２】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬剤が約５０ないし約１５００の分子量を有する小分子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞培養が改変細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞培養がトランスフェクション細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞培養が感染細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＳＨＰ、ＦＸＲまたはプロモーター／検出物質遺伝子レポーターがアデノウイルス、プラスミド、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせのいずれかから選択されるベクターによって細胞培養に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ベクターがアデノウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養がＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
さらにＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを調製するのに使用されるＮＦ−κＢプロモーターをクローニングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
加えて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）を発現して第二細胞培養にて検出物質の増加を検出するためのＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む第二細胞培養に薬剤を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
加えてＮＦ−κＢプロモーターをクローニングしてクローニングしたＮＦ−κＢプロモーターを検出物質遺伝子の前にあるベクター中に挿入して細胞培養に感染させる前にＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを形成することを含む方法であって、ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
加えて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）および任意に肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）を発現して第二細胞培養にて検出物質の増加を検出するためのＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む第二細胞培養に候補薬剤を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
加えて
（ａ）第二細胞培養に薬剤を投与し、該細胞培養がＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含んでＳＨＰまたはＦＸＲを発現しないこと；および
（ｂ）第一細胞培養にて検出物質の増加を引き起こし薬剤の投与に続き第二細胞培養にて検出物質の増加を全く引き起こさない薬剤を選択すること：
を含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成に付随する状態を防止または改善する方法であって：
該対象に請求項１−２０のいずれかに記載の方法によって選択される薬剤を投与することを含む方法。
【請求項２２】
請求項１−２０のいずれかに記載の方法によって選択される薬剤を含む組成物。
【請求項２３】
加えて医薬上許容される担体を含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
薬剤が約５０ないし約１５００の分子量を有する小分子である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
核転写因子ＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染、トランスフェクトまたは改変した細胞培養に投与した場合にルシフェラーゼの増加を引き起こすと特徴付けられる薬剤を含む組成物であって、該細胞培養が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現するところの組成物。
【請求項２７】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
小分子が約５０ないし約１５００の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
小分子が約５０ないし約７５０の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
小分子が約５０ないし約５００の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
小分子が非ステロイド化合物である、請求項２７記載の組成物。
【請求項３２】
ベクターがアデノウイルス、プラスミド、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３３】
ベクターがアデノウイルスである、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
細胞培養がＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３８】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤が炎症遺伝子発現経路にて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の活性を阻害する、請求項２６記載の組成物。
【請求項４０】
薬剤が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の成熟または未熟形態またはその物をコードする遺伝子に結合する、請求項２６記載の組成物であって；該薬剤がアテローム動脈硬化に対する有効量にて組成物内にあるところの組成物。
【請求項４１】
薬剤が受容体またはリガンドとして短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の成熟または未熟形態と競合する、請求項２６記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含む、プロモーター／検出物質遺伝子レポーターであって、該ＮＦ−κＢプロモーターが検出物質遺伝子の前に位置する、プロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４４】
ＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターがベクターに導入される、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４５】
ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項４４記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４６】
複製欠損アデノウイルスベクターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項４５記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４７】
複製欠損アデノウイルスベクターがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項４５記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４８】
さらに組成物が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現するポリヌクレオチドを含むベクターを含む、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４９】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項５０】
ベクターが宿主細胞に導入される、請求項４４記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項５１】
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８またはそれらの組み合わせの核酸配列を含むポリヌクレオチド：を含む単離したＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１またはＳＨＰプロモーター。
【請求項５２】
ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターがヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３のＣＹＰ８Ｂ１の断片を含む、請求項５１のプロモーター。
【請求項５３】
プロモーターが検出物質遺伝子に導入されてプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを形成する、請求項５１記載のプロモーター。
【請求項５４】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせである、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５５】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５６】
プロモーター／検出物質遺伝子レポーターがベクターに導入される、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５７】
ベクターがアデノウイルスＳＶ４０である、請求項５６記載のプロモーター。
【請求項５８】
プロモーターが宿主細胞に導入される、請求項５１記載のプロモーター。
【請求項５９】
非天然脱活性型短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の複合体を含む組成物。
【請求項６０】
加えて医薬上許容される担体を含む、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
医薬上許容される担体がチュアブル錠、急速溶解錠、発泡錠、復元散剤、エリキシル、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、カプレット、ロゼンジ、チュアブルロゼンジ、ビーズ、散剤、顆粒、粒子、微粒子、分散顆粒、サケット、圧注剤、坐剤、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、持続性インプラント、内服剤、注射剤、注入剤、ヘルスバー、糖菓剤、家畜飼料、シリアル剤、シリアルコーティング剤、食品、栄養食品、機能性食品またはそれらの組み合わせである、請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
加えて医薬上許容される緩衝剤、希釈剤、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項６０記載の組成物。
【請求項６３】
配列番号：１−４のいずれかに結合する薬剤を含む組成物。
【請求項６４】
薬剤が配列番号：１または配列番号：３のいずれかに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６３記載の組成物。
【請求項６５】
薬剤が配列番号：２または配列番号：４のいずれかに対する抗体である、請求項６３記載の組成物。
【請求項６６】
実質的に本明細書に記載されるような組成物。
【請求項６７】
実質的に本明細書に記載されるような使用。
【請求項１】
短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を阻害するのに有効な薬剤を同定する方法であって：
（ｉ）短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）または（ｉｉ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現してＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む細胞培養に薬剤を投与すること；および
細胞培養にて検出物質の増加を引き起こす薬剤を選択すること
を含む方法。
【請求項２】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬剤が約５０ないし約１５００の分子量を有する小分子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞培養が改変細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
細胞培養がトランスフェクション細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
細胞培養が感染細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＳＨＰ、ＦＸＲまたはプロモーター／検出物質遺伝子レポーターがアデノウイルス、プラスミド、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせのいずれかから選択されるベクターによって細胞培養に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ベクターがアデノウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養がＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
さらにＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを調製するのに使用されるＮＦ−κＢプロモーターをクローニングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
加えて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）を発現して第二細胞培養にて検出物質の増加を検出するためのＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む第二細胞培養に薬剤を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
加えてＮＦ−κＢプロモーターをクローニングしてクローニングしたＮＦ−κＢプロモーターを検出物質遺伝子の前にあるベクター中に挿入して細胞培養に感染させる前にＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを形成することを含む方法であって、ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
加えて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）および任意に肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α）を発現して第二細胞培養にて検出物質の増加を検出するためのＣＹＰ７Ａ１またはＣＹＰ８Ｂ１プロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含む第二細胞培養に候補薬剤を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
加えて
（ａ）第二細胞培養に薬剤を投与し、該細胞培養がＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを含んでＳＨＰまたはＦＸＲを発現しないこと；および
（ｂ）第一細胞培養にて検出物質の増加を引き起こし薬剤の投与に続き第二細胞培養にて検出物質の増加を全く引き起こさない薬剤を選択すること：
を含む請求項１記載の方法。
【請求項２１】
対象における炎症遺伝子活性および／またはコレステロール生合成に付随する状態を防止または改善する方法であって：
該対象に請求項１−２０のいずれかに記載の方法によって選択される薬剤を投与することを含む方法。
【請求項２２】
請求項１−２０のいずれかに記載の方法によって選択される薬剤を含む組成物。
【請求項２３】
加えて医薬上許容される担体を含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
薬剤が約５０ないし約１５００の分子量を有する小分子である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
核転写因子ＮＦ−κＢプロモーター／ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子レポーターを含むベクターで感染、トランスフェクトまたは改変した細胞培養に投与した場合にルシフェラーゼの増加を引き起こすと特徴付けられる薬剤を含む組成物であって、該細胞培養が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現するところの組成物。
【請求項２７】
薬剤が小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、組換えＳＨＰ、組換えＦＸＲまたはそれらの組み合わせである、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
小分子が約５０ないし約１５００の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
小分子が約５０ないし約７５０の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
小分子が約５０ないし約５００の分子量を有する、請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
小分子が非ステロイド化合物である、請求項２７記載の組成物。
【請求項３２】
ベクターがアデノウイルス、プラスミド、レトロウイルスまたはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３３】
ベクターがアデノウイルスである、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
アデノウイルスが複製欠損アデノウイルスである、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
複製欠損アデノウイルスがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
細胞培養がＨＥＬＡ、ヒト肝芽腫細胞系（ＨｅｐＧ２）、ヒト胎生期腎２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）、ラットＦＴＯ−２Ｂ、ラットＭｃＡ−ＲＨ７７７７またはそれらの組み合わせのいずれかである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３８】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項３９】
薬剤が炎症遺伝子発現経路にて短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の活性を阻害する、請求項２６記載の組成物。
【請求項４０】
薬剤が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の成熟または未熟形態またはその物をコードする遺伝子に結合する、請求項２６記載の組成物であって；該薬剤がアテローム動脈硬化に対する有効量にて組成物内にあるところの組成物。
【請求項４１】
薬剤が受容体またはリガンドとして短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の成熟または未熟形態と競合する、請求項２６記載の組成物。
【請求項４２】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項２６記載の組成物。
【請求項４３】
ＮＦ−κＢプロモーターおよび検出物質遺伝子を含む、プロモーター／検出物質遺伝子レポーターであって、該ＮＦ−κＢプロモーターが検出物質遺伝子の前に位置する、プロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４４】
ＮＦ−κＢプロモーター／検出物質遺伝子レポーターがベクターに導入される、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４５】
ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項４４記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４６】
複製欠損アデノウイルスベクターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＬＰプロモーターまたはそれらの組み合わせを含む、請求項４５記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４７】
複製欠損アデノウイルスベクターがＳＶ４０プロモーターを含む、請求項４５記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４８】
さらに組成物が短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）を発現するポリヌクレオチドを含むベクターを含む、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項４９】
ＮＦ−κＢプロモーターが炎症遺伝子の細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）またはマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含む、請求項４３記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項５０】
ベクターが宿主細胞に導入される、請求項４４記載のプロモーター／検出物質遺伝子レポーター。
【請求項５１】
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８またはそれらの組み合わせの核酸配列を含むポリヌクレオチド：を含む単離したＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１またはＳＨＰプロモーター。
【請求項５２】
ＣＹＰ８Ｂ１プロモーターがヒトＣＹＰ８Ｂ１の転写開始部位に対してヌクレオチド−５１４ないし＋３０３のＣＹＰ８Ｂ１の断片を含む、請求項５１のプロモーター。
【請求項５３】
プロモーターが検出物質遺伝子に導入されてプロモーター／検出物質遺伝子レポーターを形成する、請求項５１記載のプロモーター。
【請求項５４】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子またはそれらの組み合わせである、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５５】
検出物質遺伝子が蛍光ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５６】
プロモーター／検出物質遺伝子レポーターがベクターに導入される、請求項５３記載のプロモーター。
【請求項５７】
ベクターがアデノウイルスＳＶ４０である、請求項５６記載のプロモーター。
【請求項５８】
プロモーターが宿主細胞に導入される、請求項５１記載のプロモーター。
【請求項５９】
非天然脱活性型短鎖ヘテロ二量体タンパク（ＳＨＰ）またはファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の複合体を含む組成物。
【請求項６０】
加えて医薬上許容される担体を含む、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
医薬上許容される担体がチュアブル錠、急速溶解錠、発泡錠、復元散剤、エリキシル、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、カプレット、ロゼンジ、チュアブルロゼンジ、ビーズ、散剤、顆粒、粒子、微粒子、分散顆粒、サケット、圧注剤、坐剤、クリーム、局所剤、吸入剤、エアロゾル吸入剤、パッチ、粒子吸入剤、インプラント、持続性インプラント、内服剤、注射剤、注入剤、ヘルスバー、糖菓剤、家畜飼料、シリアル剤、シリアルコーティング剤、食品、栄養食品、機能性食品またはそれらの組み合わせである、請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
加えて医薬上許容される緩衝剤、希釈剤、アジュバントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項６０記載の組成物。
【請求項６３】
配列番号：１−４のいずれかに結合する薬剤を含む組成物。
【請求項６４】
薬剤が配列番号：１または配列番号：３のいずれかに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６３記載の組成物。
【請求項６５】
薬剤が配列番号：２または配列番号：４のいずれかに対する抗体である、請求項６３記載の組成物。
【請求項６６】
実質的に本明細書に記載されるような組成物。
【請求項６７】
実質的に本明細書に記載されるような使用。
【公表番号】特表２００６−５０５２４９（Ｐ２００６−５０５２４９Ａ）
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１３４４５（Ｐ２００４−５１３４４５）
【出願日】平成１５年６月１３日（２００３．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０６６３２
【国際公開日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月１３日（２００３．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０６６３２
【国際公開日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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