特殊化オリゴヌクレオチドならびに核酸の増幅および検出でのその使用
核酸増幅反応での使用に有用な標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドが本明細書に記載される。これらのプローブおよびオリゴヌクレオチドは、その対応する非修飾の対応物に比べて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ活性に対するそれらの感度を変化させるように修飾される。これらの標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドを用いる非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および検出方法もまた記載される。標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドを含む、核酸増幅反応用のキットもまた記載される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００６年７月１７日に出願した米国仮出願第６０／８３１２２３号に対する優先権およびその利益を主張するものである。
【０００２】
本出願は、具体的には、ＰＣＲとして一般に知られているポリメラーゼ連鎖反応を利用する増幅を含む、核酸増幅反応および増幅産物の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅の技術およびアッセイはよく知られている。ＤＮＡを増幅するためのいくつかの反応は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）等の等温のものである。他は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の熱性のサイクルを用いる。ＰＣＲを利用する増幅および増幅を用いるアッセイは、たとえば米国特許第４６８３２０２号、第４６８３１９５号、および第４９６５１８８号ならびに一般的に、ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＮＩＳら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（ＵＳＡ）１９９０）に記載され、これらのそれぞれはこれによってその全体が参照によって組み込まれる。ＰＣＲ増幅は、対称となるよう、すなわち、等モルまたは約等モルの濃度の１対のマッチするプライマー、すなわち、等しい融解温度（Ｔｍ）を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することによって、二本鎖産物（または「アンプリコン」）を作製するよう一般的に設計される。直接ＰＣＲ増幅反応で一本鎖アンプリコンを主として作製するための、用途が限られている技術は、ＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎおよびＥｒｌｉｃｈ，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ−ＤＱＡ Ｌｏｃｕｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：７６５２〜７６５６（１９８８）；および米国特許第５０６６５８４号に記載される「非対称ＰＣＲ」である。非対称ＰＣＲは、一方のプライマーが、他方のプライマーの濃度の１〜２０パーセントの限られた量で存在するように５倍〜１００倍に希釈される点で対称ＰＣＲと異なる非対称のＰＣＲ増幅方法である。結果として、増幅は、一方のプライマーのみが残存して一本鎖アンプリコンを産出する線形増幅が後に続く、両方のプライマーが伸長して二本鎖アンプリコンを産出する対数期からなる。
【０００４】
より最近の非対称のＰＣＲ増幅方法は、「Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ＰＣＲ」（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）であり、これは異なる濃度のプライマーを利用するが、プライマーは、対称ＰＣＲおよび非対称ＰＣＲでのように「マッチしない」。Ｓａｎｃｈｅｚら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０１：１９３３〜１９３８、公開国際特許出願第０３／０５４２３３号（２００３年７月３日）、およびＰｉｅｒｃｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０２；８６０９〜８６１４、これらのすべてはそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＤＮＡ増幅方法は、逆転写を最初に行って、ｃＤＮＡを生成し、次いで、ｃＤＮＡを、たとえば先のＰＣＲ法のうちの１つによって増幅することによってＲＮＡ標的に使用することができる。
【０００５】
核酸増幅産物の検出および分析は様々な形で行うことができる。二本鎖アンプリコンは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ等の、二本鎖ＤＮＡ中にインターカレートするまたはその他の形でそれと相互作用する際に蛍光を発する色素で監視することができる。たとえば、米国特許第５９９４０５６号を参照されたい。アンプリコンは、シークエンシング反応、たとえば従来のジデオキシシークエンシング法、パイロシークエンシング法、リアルタイムの合成によるシークエンシング法にかけることができる。ハイブリダイゼーションプローブは一般に検出に使用される。プローブは標識されてもよくまたは非標識であってもよい。ハイブリダイズしたプローブの検出は、サイズ等の物理的特徴によるもの、続いて起こるイベント、たとえば発色反応への関与によるもの、または放射性標識もしくは蛍光標識等の、プローブに適用された標識の検出によるものであってもよい。標識プローブの例は、プライマー伸長の間に切断される５’ヌクレアーゼプローブ（米国特許第５２１００１５号、第５４８７９７２号、および第５５３８８４８号）、分子ビーコンプローブ（米国特許第５９２５５１７号、第６１０３４７６号、および第６３６５７２９号）、Ｙｉｎ−Ｙａｎｇ二本鎖プローブ（Ｌｉ， Ｑ．ら（２００２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ５）、ならびにＦＲＥＴプローブ対である。
【０００６】
増幅の上記のＰＣＲベースの方法はすべて、細菌源から回収された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用に依存する。それらの天然の形態では、これらの酵素は、いくつかのドメインおよびいくつかの活性：３’から５’へのポリメラーゼ、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ、および３’から５’への編集機能（商業的に使用される酵素から除去される）を含む、を有する単一のポリペプチドである。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（サーマス アクアティカス由来）は、ホットスタート形態を含めて最も広く使用されているが、Ｔｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品＃３０３４２−０１１）は別のそのような酵素である。これらの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、ＤＮＡ鎖の重合およびある５’末端のエキソヌクレアーゼ切断と共にＤＮＡへのＲＮＡの逆転写もまた実行するいくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。これらの酵素は、ＺＯ５ポリメラーゼおよびサーマス サーモフィラス（ＴＴＨ）ポリメラーゼを含む。
【０００７】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで見つかった５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性はＴａｑポリメラーゼを使用して非常に研究されてきた。たとえば、このエキソヌクレアーゼ活性は、対称ＰＣＲに関連して使用されるいわゆる５’ヌクレアーゼアッセイのベースとなる。５’ヌクレアーゼアッセイは２つのプライマーおよび１つのプローブを利用する。プローブは、一方の末端ヌクレオチドに共有結合された蛍光体および他方の末端ヌクレオチドに共有結合された非蛍光消光剤を有する直鎖またはランダムコイルのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プローブは、２つのプライマーのうちの一方が結合する、２つの標的鎖のうちの一方とハイブリダイズする。５’ヌクレアーゼプローブの融解温度はその上流プライマーの融解温度よりも高く、したがって、プローブは、伸長プライマーの下流に配置される。酵素の３’から５’へのポリメラーゼドメインがプライマーの３’末端を伸長するとき、５’から３’へのＴａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性はプローブの５’末端に遭遇し、これを切断する。プローブがその５’末端に蛍光成分を有する場合、その成分およびそれが共有結合されたヌクレオチドは切断によってオリゴマーの残りから分離される。オリゴヌクレオチドの残部が標的配列にまだ結合している場合、それは、前進しているポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼによってさらに切断される。これはプローブのプライマー依存的切断である。
【０００８】
プローブのプライマー依存的切断は次の特徴を有する：１）プライマーの３’末端は非ブロック（または非キャップ）３’−ＯＨ基を有していなければならない。したがって、３’−ＯＨに対する−ＰＯ4もしくは他の化学成分の追加および／または３’ＯＨの除去は切断を予防する。２）プライマーは、プローブの５’末端まで前進またはプローブの５’末端「の下に侵入」しなければならない。したがって、プライマーがプローブの５’末端まで前進することができないという条件において、下記に示されることを除いて、プライマー依存的反応からの１つまたは複数のヌクレオチド三リン酸の除外は切断を予防するであろう。このルールに対する例外は、さらなる伸長を伴わない、プローブの５’末端の下に既に侵入している、３’ＯＨを有するプライマーが設計され得るということである。３）プライマーの３’末端がプローブの５’末端の下に既に侵入している場合、その３’末端は標的配列に相補的でなければならない。したがって、３’−ＯＨが非キャップでも、プライマーの３’末端での２つ以上のヌクレオチドの非相補的３’伸長（アーム）は、プローブのプライマー依存的切断を予防する。Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのドメインを除去すると、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片として知られている酵素が産出される。Ｓｔｏｆｆｅｌ断片を利用するＰＣＲ増幅は５’ヌクレアーゼ（ＴＡＱＭＡＮ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社の商標）プローブを使用することができない。それらの全長にわたって２’ｏ−メチルヌクレオチド等のある種の修飾されたヌクレオチドを使用する、分子ビーコンプローブ等の構築はプローブプライマー依存的切断を予防する。
【０００９】
Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：９５２３〜９５３２）は、プローブのプライマー依存的切断に特有の３つのオリゴヌクレオチドの構造的特色に基づいた侵入型シグナル増幅反応（invasive signal amplification reaction）を記載した。彼らは、「上昇した温度で反応を実施することによって、下流オリゴヌクレオチドは標的に循環的に結合および解離して、温度サイクルを伴うことなく標的分子当たりに多数の切断イベントをもたらす」ことを報告した。
【００１０】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性はまたプローブ−標的ハイブリッドのプライマー非依存的切断を実行することでも知られている。この反応は、１６塩基対のステム、４つのヌクレオチドのループ、およびＰ32−ＰＯ4で標識された５’末端を有するヘアピン型標的分子を使用して研究された。ヘアピンの２つのアームは長さが等しい（つまり、それは平滑断端にされている）または３’アームは５’末端を超えて伸長しているまたは５’末端は３’末端を超えて伸長している。このデザインの分子を使用して、Ｔａｑポリメラーゼのプライマー非依存的５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は次の特徴を有することが示された：１）Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０，７７８〜７８３（１９９３））は、プライマーの非存在下で、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼは、基質鎖および標的鎖の最後の２つの塩基対の間でヘアピン基質の陥凹５’末端を切断したことを報告した。２）Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６１４３〜６１４８（１９９９））は、完全なＴａｑポリメラーゼ（ＴａｑＮＰ）の５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、３’末端が６つのヌクレオチドだけ陥凹したヘアピン構造の５’末端を効率的に切断しないことを実証した。これらの著者らは、「効率の低い切断は、おそらく、鋳型−プライマー複合体に類似する二重鎖の端への、この酵素のポリメラーゼドメインの結合に起因する」と結論づけた。彼らは、標的とハイブリダイズしたプライマーではなく標的とハイブリダイズしたプローブに類似している基質を試験しなかった。
【００１１】
ある種の増幅目的およびある種の検出目的については、当技術分野で知られている増幅方法および検出方法は適さないまたは制限を有する。たとえば、多重ＰＣＲアッセイは、異なる色の蛍光プローブによって５つまたは６つの標的を区別することができるにすぎない。また、大量の対立遺伝子を含むサンプル中でまれな対立遺伝子を検出するのは非常に難しい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態では、その対応する非修飾の対応物に比べて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ活性に感受性にするように修飾された低温直鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを使用するシグナル増幅を含む非対称のＰＣＲ法が提供される。
【００１３】
他の実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性にするように修飾された低温直鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーションの検出を含む非対称のＰＣＲ法が提供される。
【００１４】
さらなる他の実施形態では、ある標的または対立遺伝子の増幅が選択的にブロックされるＰＣＲ法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】異なる種類のプローブを示す図である。
【図２】図１に示されるプローブに対する切断の多種多様のメカニズムを示す図である。
【図３】プライマーおよび標的に対する低温プローブについての最適なＴｍ関係を示す図である。
【図４】多種多様のプローブ構造を切断するＺＯ５の性能を示す図である。
【図５】図５Ａ：ＺＯ５ポリメラーゼ、ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ５およびＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ３の１０，０００コピーの増幅を示す図である。 図５Ｂ：図５Ａについての融解曲線を示す図である。 図５Ｃ：プラチナＴａｑポリメラーゼ、ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ５およびＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ３の１０，０００コピーの増幅を示す図である。 図５Ｄ：図５Ｂについての融解曲線を示す図である。
【図６】実施例３および図７で利用されるＥＸＯ−Ｒプローブおよび多種多様のプライマー対の関係を示す図である。
【図７】図７Ａ：高Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｂ：高Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｃ：高Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。 図７Ｄ：中間Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｅ：中間Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｆ：中間Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。 図７Ｇ：低Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｈ：低Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｉ：低Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。
【図８】５’末端上にＦＡＭを使用するＥＸＯ−Ｓプローブを示す図である。
【図９】５’末端上にＢＨＱ１を使用するＥＸＯ−Ｒプローブを示す図である。
【図１０】ニューカッスルＤＮＡアンプリコンの７５００コピーを検出するためのＥＸＯ−Ｒ ＲＯＸプローブを示す図である。
【図１１】等温条件対変動条件下でのＥＸＯ−Ｓプローブの切断の速度を示す図である。
【図１２】その相補的標的の３’末端に対するＥＸＯ−Ｓプローブの距離は切断の速度に影響を与えることを示す図である。
【図１３】４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対する、プローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル生成の異なる速度を示す図である（ケース１）。
【図１４】４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対する、プローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル増幅の異なる速度を示す図である（ケース２）。
【図１５】３０分間の等温条件（５０℃）下でのシグナル増幅の速度を示す図である。
【図１６】変動条件（４５℃〜７０℃）下でのシグナル増幅の速度を示す図である。
【図１７】プローブの５’アームの長さを増加させると、プローブはＥＸＯ−ＳプローブまたはＥＸＯ−Ｒプローブとなることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ａ．定義
本明細書に使用されるように、「サンプル」は、たとえば生物学的サンプルまたは環境サンプル等の試験されることとなる任意の物質とすることができる。生物学的サンプルは任意の生物から得ることができる。一実施形態では、サンプルは、ヒト、コンパニオンアニマル、または家畜等の哺乳動物から得ることができる。サンプルはまた、たとえばトリ等の他の動物から得ることができる。一実施形態では、動物からのサンプルは、鼻咽頭吸引液、血液、唾液、糞便、尿、または任意の他の体液を含む。他の実施形態では、環境サンプルは、たとえば土壌、水、人工建造物の環境および表面等の任意の環境から得ることができる。
【００１７】
本明細書に使用されるように、「増幅標的配列」、「標的配列」、および「核酸標的配列」は、増幅反応、たとえばＰＣＲ増幅技術によるコピーのための鋳型を提供するＤＮＡ配列を区別なく意味する。増幅標的配列は一本鎖とすることができるまたは二本鎖とすることができる。出発物質がＲＮＡ、たとえばメッセンジャーＲＮＡである場合、ＤＮＡ増幅標的配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するための、ＲＮＡの逆転写によって生成され、増幅標的配列はｃＤＮＡ分子となる。したがって、ＲＮＡについてのＰＣＲアッセイでは、ハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ増幅標的配列のコピーとハイブリダイズし、それによってそれを反映し、逆転写によって、増幅標的配列を含むｃＤＮＡ分子を産生したＲＮＡの存在を間接的に表す。増幅標的配列は、その増幅に使用される１対のプライマーによって、典型的に挟まれる。伸長産物または「アンプリコン」は、二本鎖または一本鎖かにかかわらず、プライマー対によって境界を定められる。増幅標的配列は単一の核酸配列とすることができる。ある場合では、しかしながら、増幅標的配列は対立遺伝子の変異または突然変異を含んでよく、したがって、単一の配列ではなくてよい。
【００１８】
本明細書に使用されるように、「Ｔｍ」は、対象の核酸物質の半分が二本鎖形態で存在し、残部が単鎖である温度を指す。歴史的に、プライマー、プローブ、またはアンプリコンのＴｍは、標準的なプライマーの状態および塩濃度での、両方ともよく知られている「％ＧＣ」法（Ｗｅｔｍａｒ，Ｊ．Ｇ．（１９９１）「ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７〜２５９）または「２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）」法を使用する算出値であった。ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、しかしながら、「最近傍」法を使用して（Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１４６０〜１４６５）、式Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒ ｌｎ（Ｃ／２））＋１２．５ ｌｏｇ［Ｍ］−２７３．１５を使用して、Ｔｍを算出することによって（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ，Ｎ．（２００１），「ＭＥＬＴＩＮＧ，Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｕｐｌｅｘ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：１２２６〜７）Ｔｍを決定する際に実際のプライマーおよびプローブの開始濃度を考慮に入れる（Ｓａｎｃｈｅｚら（２００４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１０１：１９３３〜１９３８，およびＰｉｅｒｃｅら（２００５）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１０２：８６０９〜８６１４）。ΔＨはエンタルピーであり、ΔＳはエントロピーであり（ΔＨおよびΔＳの算出の両方は、Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．およびＳａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１０５８１〜１０５９４に基づく）、Ｃはオリゴヌクレオチドの濃度であり、Ｒは一般気体定数であり、［Ｍ］は一価カチオンのモル濃度である（実施例では０．０７）。この式によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基組成（用語ΔＨおよびΔＳに含有される）、一価塩濃度、ならびにオリゴヌクレオチドの濃度（用語Ｃに含有される）はＴｍに影響を及ぼす。しかしながら、ＰＣＲバッファー中に使用されるマグネシウムまたは他の二価カチオンの濃度はこの式に含まれておらず、二価カチオンはＴｍを増加させることで知られている。本発明者らは典型的に３ｍＭマグネシウムを使用する。これはプローブＴｍを約５℃上げる。したがって、所望されるＴｍが５０℃であり、３ｍＭマグネシウムが使用されることになる場合、マグネシウムなしでのＴｍについての上記の最近傍式は、Ｔｍを４５度とするべきであり、次いで、必要に応じ、プローブの長さまたは組成に対する微量の調整と共に経験的に確認することができる。本発明者は、ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（アナーバー、ＭＩ）の許諾ソフトウェア、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（バージョン６．１．９）ソフトウェアが最近傍式に対するそのような調整を含み、本発明者が経験的に決定したものに近い結果が得られることを見出した。プライマーまたはプローブのＴｍに対する本明細書の言及は、他に述べられない限り、マグネシウム濃度を考慮に入れる値を意味する。
【００１９】
本明細書に使用されるように、「対立遺伝子識別力のある」および「配列特異的」の両方は、完全に相補的な標的配列と選択的にハイブリダイズするおよび１つまたは少数のミスマッチの塩基を有する、密接に関連する配列を強く拒絶する、プローブ（ある場合ではプライマー）の能力を指す。本明細書に使用されるように、「ミスマッチ認容性」は、完全に相補的な配列および１つまたは複数のミスマッチの塩基を有する部分的に相補的な配列の両方とハイブリダイズするプローブ（ある場合ではプライマー）の能力を指す。
【００２０】
本明細書に使用されるように、「単一管」は、試験管、反応ウェル、マイクロフルイディクスデバイス中のチャンバー、スライドガラス、または反応混合物を保持することができる他の装置等のある容器から別の容器にサンプルを移動させずに行うことができる一連の少なくとも２つの操作、たとえばサンプルの調製、増幅、またはシークエンシングを含む方法を指す。
【００２１】
本明細書に使用されるように、「エキソヌクレアーゼ活性」は、ＰＣＲ増幅に使用される、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む耐熱性ポリメラーゼの酵素特性のうちの１つを指す。エキソヌクレアーゼ活性は、３’から５’への消化と別個の５’から３’への消化を指し、これは酵素の校正機能と見なされる。エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ糖リン酸主鎖の切断の正確なモードまたは場所、特に、切断が、５’末端に付けられた成分および末端５’ヌクレオチドの間にまたは末端ヌクレオチドおよび最後から２番目の５’ヌクレオチドもしくは３’末端の下流の１つまたは複数のヌクレオチドの間にあるかどうかを明示することを意味しない。他に述べられない限り、その使用が本明細書に記載されるポリメラーゼはすべて、エキソヌクレアーゼドメインを単独でまたは上流プライマーの３’末端に対する塩基対追加を実行するポリメラーゼドメインと共に含むことが理解される。
【００２２】
本明細書に使用されるように、「プライマー依存的」切断は、ポリメラーゼがプライマーのその伸長の間に出会った、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの切断を指す。伸長鎖上の３’末端−ＯＨ基の存在がプライマー依存的切断に必要とされることが知られている。本明細書に使用されるように、「プライマー依存的」切断はまた、上流のオリゴヌクレオチドの３’ＯＨが、ｄＮＴＰの非存在下でさえ、下流のオリゴヌクレオチド、たとえばハイブリダイズしたプローブの５’末端に取って代わる場合に生じる切断を含む。たとえばリン酸基の化学的追加（キャッピング）および末端２’３’ジデオキシヌクレオチドの存在は、下流のオリゴヌクレオチド中のある種の非天然ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチド間連結のように、プライマー依存的切断を予防することで知られている方法である。
【００２３】
本明細書に使用されるように、「プライマー非依存的」切断は、プライマー依存的切断ではない、ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性による、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの５’から３’への切断を指す。この場合では、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドに直接結合し、結合したオリゴヌクレオチドの５’末端を切断する。プライマーもプライマー伸長も含まれない。
【００２４】
本明細書に使用されるように、「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」は、蛍光検出可能な二本鎖アンプリコンを産生するために、およそ十分なＰＣＲサイクルで消耗されて、それ自体は２００ｎＭまでの低濃度で利用される他方のプライマー（「制限プライマー」）と比較して少なくとも５倍過剰の、あるオリゴヌクレオチドプライマー（「過剰プライマー」）を利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを用いる非対称のＤＮＡ増幅を意味し、増幅の開始時の制限プライマーの濃度調整した融解温度、Ｔｍ[0]Lは、増幅の開始時の過剰プライマーの濃度調整した融解温度、Ｔｍ[0]Xよりも５℃を超えて下回ることはなく、好ましくは少なくとも同じくらい高く、より好ましくは３〜１０℃高く、熱性のサイクルは制限プライマーの消耗の後に複数回のサイクルの間、継続されて、一本鎖産物、すなわち、「過剰プライマー鎖」と時に称される、過剰プライマーの伸長産物を産生する。
【００２５】
本明細書に使用されるように、用語「低Ｔｍプローブ」は、その標的に対するハイブリダイゼーション後にシグナルを出す標識ハイブリダイゼーションプローブを意味し、これは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは過剰プライマーの伸長によって産出される過剰プライマー鎖であり、ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは制限プライマーである、過剰プライマー鎖とハイブリダイズし、それに沿って伸長する、プライマーのＴｍ[0]よりも少なくとも５℃、より好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍ[0]Pを有する。本明細書に使用されるように、低Ｔｍプローブは直鎖プローブである。
【００２６】
Ｂ．詳細な説明
ＤＮＡ増幅反応での特定の目的のために修飾される標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドならびに増幅の間にまたは増幅後検出の間に特定の効果を達成するためのそれらの使用が記載される。ＤＮＡ増幅反応、たとえばＰＣＲ増幅はＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む。本明細書に記載されるように、プローブ−標的構造は、ハイブリダイズしたプローブが５’方向にあるよりも３’方向に長い鋳型鎖を含む。したがって、プローブは、可変数のヌクレオチドだけ標的鎖の一本鎖３’末端から陥凹しており、プローブは、標的鎖に完全にマッチし得るまたは可変長の伸長５’アームを有する５’末端を有する。これらの構造的特色を有する単分子ヘアピン分子は、本明細書に記載されるように、構築されたこれらのものをまねるために使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、標的非依存的プローブ切断を呈しないまたは組成物が耐熱性ポリメラーゼに標的非依存的プローブ切断を呈するようにさせる反応混合物中で使用される耐熱性ポリメラーゼでなければならない。「標的非依存的プローブ切断を呈する」とは、オリゴヌクレオチドが、３〜５ヌクレオチド長のループおよび２〜５ヌクレオチド長のステムを有する末端ヘアピンを含有する場合に、また１０分間、酵素の最適な伸長温度を２０℃以下下回る温度で上述の酵素とインキュベートされた場合に、標的配列の非存在下で上述のオリゴヌクレオチドを切断する酵素の能力を意味する。Ｍｎ++を有するビシンバッファー中のＺＯ５ポリメラーゼは標的非依存的プローブ切断を呈する酵素の例である。対照的に、Ｍｇ++を含有し、ナトリウムＴｒｉｓで緩衝した反応混合物中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、標的非依存的プローブ切断を呈しない酵素の例である。本明細書に記載される方法は、標的非依存的プローブ切断を呈しないポリメラーゼの使用を含むことを理解されたい。酵素が標的非依存的プローブ切断を呈するかどうかは、プローブの５’末端に５’ヌクレオチドが伸長したプローブの使用により確立することができ、上述の伸長により、７０℃よりも高い温度での自己アニーリングによって２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成する。標的非依存的プローブ切断を呈しない酵素は、リアルタイムＰＣＲまたは終末点等温条件もしくは終末点変動温度条件でこれらのヘアピンプローブを切断することができない。
【００２８】
本明細書に記載されるプローブは、標的アンプリコン鎖とハイブリダイズし、プライマーの中間に位置し、プローブが含まれる増幅反応の平均プライマーアニーリング温度を少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍ[0]を有する低温プローブである、構造上修飾された直鎖またはランダムコイルのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブである。増幅反応がたとえば３段階温度ＰＣＲ反応である場合、増幅の後の最後にまたはＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の線形期の間等のいくつかの増幅サイクルの間に低温ステップが加えられなければ、プローブはハイブリダイズしない。切断されていないプローブは、好ましくはＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤等の非蛍光消光剤またはＱＳＹ ７もしくは９等の別の消光剤によって、プローブが溶液中で遊離している場合に消光される蛍光体を有する２重標識蛍光プローブである。Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ノバート、ＣＡ（米国）の知的所有権付き消光剤である。ＱＳＹ消光剤はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ（米国）から入手可能である。切断されているプローブもまた２重標識蛍光プローブであってもよいが、その必要はない。切断されたプローブについては、必要とされることは、いずれにせよ、断片上の標識または断片のいくつかの特性、たとえば重量もしくはサイズまたはたとえば色の形成を引き起こす等の検出可能な働きを行うための能力を用いて、切断されたプローブ断片を検出することである。この最後の場合では、切断の検出は間接的である。
【００２９】
本明細書に記載されるブロッキングオリゴヌクレオチドは、プライマーに対して下流（３’）にハイブリダイズし、非標識である修飾された直鎖オリゴヌクレオチドである。
【００３０】
ある種類の修飾されたハイブリダイゼーションプローブは、増幅に先立ってＰＣＲ反応混合物に添加した場合に、等温プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断を増強するように構造が修飾されたプローブである。そのようなプローブを「エキソ感受性」、または略してＥＸＯ−Ｓプローブと称する。それは、プローブが使用される増幅反応で平均プライマーアニーリング温度を少なくとも５、好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍを有する直鎖またはランダムコイルのＤＮＡプローブである。等温プライマー非依存的切断条件にかけられた場合、それは、対応する非修飾のプローブの少なくとも２倍速く、好ましくは５倍速く、より好ましくは少なくとも１０倍速く切断される。
【００３１】
一実施形態では、プローブをエキソ感受性にする修飾は、少なくとも３つの連続した、好ましくは３つを超える、最も好ましくは６つの連続したメチレン（ＣＨ2）基からなる鎖による、少なくとも１つの標識成分、たとえばプローブの５’末端に対する蛍光体または非蛍光消光剤の共有結合を含む。前記メチレン鎖の前に、５’ヌクレオチドに連結された端で、カルボキシル基、アミン、アミド、または別のかさ高い化学基を置くことはできないが、連続したメチレン基の前記鎖の前に、エーテル基（−Ｏ−）を置く（５’ヌクレオチドに連結された端で）ことができることが予想される。他の実施形態では、プローブの５’末端での修飾は、ハイブリダイズしたプローブのすぐ「上流」（３’）の標的のヌクレオチドに対して相補的ではない追加のヌクレオチドからなる。この修飾はまたプローブの５’末端での１塩基「アーム」として記載することもできる。ＥＸＯ−Ｓプローブは、５’アームを有していなくてもよい、すなわち、標的に対して相補的ではないヌクレオチドはないまたは多くても、５ヌクレオチド未満、好ましくは１ヌクレオチドだけの短いアームを有していてもよい。ＥＸＯ−Ｓプローブは、その標的鎖の３’末端から６ヌクレオチド、好ましくは３’末端から１０〜３０ヌクレオチドを超えて配置されるハイブリッドを形成するように設計されるべきである。端から４０ヌクレオチドを超えるハイブリッドは、プローブの標的非依存的等温切断を遅くするので、それほど好ましくない。当業者は十分に理解するであろうが、その特異的標的の３’末端に対して特定のＥＸＯ−Ｓプローブを位置づけるための最適な場所は、プローブが用いられる増幅反応の正確な条件および組成物に依存する。最も重要な因子は、ＥＸＯ−Ｓプローブの上流の制限プライマーの長さおよびプローブされることとなる標的配列の塩基組成である。すべての場合で、しかしながら、ＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端は、制限プライマーが消耗される前に制限プライマーの３’末端がハイブリダイズする標的鎖上の場所と重複するべきでない。言い換えれば、制限プライマーの３’末端に相補的な標的鎖上の塩基は、プローブの５’末端またはＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端上のアームの５’末端の少なくとも２塩基上流とするべきである。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、エキソ感受性プローブの存在下で少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅することを含み、増幅プロセスは、伸長によりプローブに相補的なアンプリコン鎖を産出するプライマーが消耗されるまで、プローブがハイブリダイズするであろう低温ステップを含まない、すなわち、プローブのＴｍを下回る温度でのインキュベーションを含まない。ＰＣＲ増幅で使用される場合、ＥＸＯ−Ｓプローブは、低温検出ステップを有しないサイクルの間にアンプリコンとハイブリダイズしない。制限プライマーの消耗の後の増幅サイクル中に、すなわち、プローブが相補的な一本鎖過剰プライマーアンプリコン鎖を産出するサイクル中に低温検出ステップを含む非対称のＰＣＲ法により、プローブはハイブリダイズし、プライマー非依存的様式で切断され、それによって、プローブによって産出されたシグナルを増幅する。増幅後低温検出ステップのみが含まる場合、蛍光体および消光剤、好ましくは非蛍光消光剤を含有する２重蛍光標識プローブからのシグナルはまた、３０分以上生じ続けることがあり、繰り返しのハイブリダイゼーションおよび切断が、リアルタイム検出と同様にそのような終末点検出で起こることを示唆する。このため、終末点での読み取りは、所定の時間、好ましくは少なくとも１分後に、より好ましくは少なくとも２分後になされるべきである。たとえば、プローブが蛍光体および消光剤で標識される場合、繰り返しのハイブリダイゼーションおよび切断は、非消光断片の産生の増加および蛍光発光シグナルの増幅をもたらす。そのような方法は、プローブ切断の均一な検出を含む。
【００３３】
本明細書に記載される別の種類のプローブは、増幅に先立ってＰＣＲ反応物に添加された場合に、プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断に抵抗するように構造が修飾されたプローブである。そのようなプローブを「エキソ抵抗性」プローブまたは略してＥＸＯ−Ｒプローブと称する。エキソ抵抗性プローブは低温プローブである。エキソ抵抗性プローブはプライマー依存的エキソヌクレアーゼ切断に抵抗性である必要はない。しかしながら、ある実施形態は、プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断およびプライマー依存的５’エキソヌクレアーゼ切断の両方に抵抗性である。エキソ抵抗性プローブは、蛍光体および消光剤で標識され、相補的な標的鎖とハイブリダイズされ、等温プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断条件にかけられた場合に、蛍光発光での測定可能な発生はなく、２５分間の期間にわたって１０％以下であるといった程度までプライマー非依存的切断に抵抗する。いくつかの実施形態は、下記に記載されるように、プローブ−標的Ｔｍのあたりの急速な熱変動にかけられた場合でも抵抗性のままであるが、他の実施形態は、そのような変動によって切断されて、増幅されたシグナルを産出することができる。エキソ抵抗性プローブは、その非修飾構造が標識されたまたは非標識であるＤＮＡオリゴヌクレオチドである、直鎖またはランダムコイルのハイブリダイゼーションプローブである。プローブをエキソ抵抗性にするための１つの修飾は、標識成分、たとえば蛍光体または非蛍光消光剤を５’末端ヌクレオチドにメチレン鎖以外のものによって連結することである。プローブをエキソ抵抗性にするための別の修飾は、プローブの標的とハイブリダイズしない２〜７つのヌクレオチドを含む５’末端アームを追加することである。プローブをエキソ抵抗性にするための別の修飾は、プローブの５’末端にヌクレオチド伸長を追加することであり、上述の伸長により、７０℃よりも高い温度での自己アニーリングによって２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成する。これらの５’ヘアピンもまた変動温度誘発性の切断に抵抗する。
【００３４】
本明細書に記載される方法は、非対称のＰＣＲ増幅方法、好ましくはエキソ抵抗性プローブの存在下でのＬＡＴＥ−ＰＣＲ法によって少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅することを含み、増幅プロセスは、プローブがハイブリダイズする低温ステップを制限プライマーの消耗の後まで含まない。ＰＣＲ増幅で使用される場合、ＥＸＯ−Ｒプローブは、低温検出ステップを有しないサイクルの間にアンプリコンとハイブリダイズしない。増幅の後にまたは非対称の方法については制限プライマーの消耗の後に低温検出ステップを含むＰＣＲ法により、プローブはハイブリダイズする。検出が等温である、すなわち、プローブのＴｍのあたりの急速な温度変動がない場合では、プローブは切断されないであろう、また、そのシグナルはハイブリダイゼーションのみから起きる。そのような実施形態では、プローブは、ハイブリダイゼーション後に検出可能なものを発しなければならない。検出が終末点であり、プローブのＴｍのあたりの急速な熱性の変動、たとえば、Ｔｍの５℃上〜５℃下または好ましくは１０℃上〜１０℃下を含み、各変動サイクルは３０秒間以下である場合、ある実施形態は、上記に述べられるようにプライマー非依存的様式で切断されるが、他の実施形態は切断されない。プライマー非依存的様式での急速な変動による切断は、プローブシグナルが産出される速度を増加させる。これらの実施形態では、エキソ感受性プローブについて上記に記載されるように、切断はシグナルを直接または間接的に産出する。任意の所与の時点でのシグナルの大きさは、切断の速度および反応中のプローブの全体量に依存する。たとえば、プローブが蛍光体および消光剤で標識される場合、繰り返しの変動は、すべての利用可能なプローブが切断されるまで、非消光蛍光体含有断片の産生の増加および蛍光発光シグナルの増幅をもたらす。そのような方法は、プローブハイブリダイゼーションまたはプローブ切断の均一な検出を含む。
【００３５】
相補鎖とハイブリダイズし、プライマー依存的５’ヌクレアーゼ切断およびプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断の両方に抵抗性のハイブリッドを形成する、構造上修飾されたオリゴヌクレオチドもまた本明細書に記載される。時に、そのようなオリゴヌクレオチドをＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドと称する。ＥＸＯ−Ｎは、ＥＸＯ−Ｎが使用されるＰＣＲ増幅反応、対称ＰＣＲ増幅または非対称のＰＣＲ増幅のいずれかのプライマー伸長ステップの間に、プライマーのうちの一方から下流の標的鎖とハイブリダイズするのに十分に高いＴｍを有する直鎖オリゴヌクレオチドである。ＥＸＯ−Ｎはプライマー伸長の間にポリメラーゼによって切断されないので、ＥＸＯ−Ｎは、ハイブリダイズした鎖の伸長を阻害し、それによってその鎖の増幅を非効率にする。オリゴヌクレオチドをＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドにする直鎖オリゴヌクレオチドの１つの修飾は、オリゴヌクレオチドの標的に相補的ではない直鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にオリゴヌクレオチド伸長を追加することであり、そのような伸長は、２〜５ヌクレオチド長のステムを有し、少なくとも７０℃のＴｍを有するヘアピン構造を形成する。
【００３６】
本明細書に記載される方法は、本来なら使用されるプライマー対によって増幅されるはずである、考えられる１つの標的対立遺伝子に特異的なＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドの存在下で対称または非対称のＰＣＲ増幅反応を行い、それによって、ＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドがプライマー伸長の間にハイブリダイズしない１つまたは複数の代替の対立遺伝子の変異体配列の増幅を促進するステップを含む。本明細書に記載される方法はまた、所望される時点で、すなわち２回以上の熱サイクル後に、一方の鎖、プラス鎖またはマイナス鎖の増幅を非効率にし、それによって、続いて起こるサイクルで他方の鎖の増幅を促進するために、対称ＰＣＲ増幅反応にＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドを挿入するステップを含む。
【００３７】
一方のプライマー、過剰プライマーは、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１で、他方のプライマー、制限プライマーと比較して実質的に過剰に存在する、ＤＮＡ増幅標的配列（ｃＤＮＡ配列を含む）についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるＤＮＡ増幅、特に、非対称ＰＣＲおよびＬＡＴＥ−ＰＣＲ等の非対称のＰＣＲ法が記載される。好ましい増幅方法は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲであるが、他の方法を使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、その方法は、修飾された低温ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを利用する。ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、それらの標的に相補的な非伸長性のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、標的は、この場合では、ＰＣＲ増幅反応によって産生されたアンプリコンである、過剰プライマーの伸長産物（過剰プライマー鎖）中のＤＮＡ配列である。非修飾のプローブは、プローブの標的相補的配列であるＤＮＡのストレッチであるまたはそれを含有する。プローブの標的相補的配列は、反応中で産生され得る過剰プライマー鎖に完全に相補的であってもよく、反応中で産生され得る少なくとも１つの過剰プライマー鎖に不完全に相補的であってもよく、またはその両方であってもよい。プローブは、完全に相補的な標的に対して、不完全に相補的な標的に対するよりも高いＴｍ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲの場合、Ｔｍ[0]）を有する。たとえば、プローブが５５℃の、完全に相補的な標的に対してＴｍを有するように設計される場合、１つまたは複数のミスマッチ塩基、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入を含有する標的に対するそのＴｍは、時に１０℃以上低くなる。これは、プローブが、形成された１つまたは複数のハイブリッドのＴｍによって標的を区別することを可能にする。すべての実施形態で、プローブは低温プローブである。
【００３９】
プローブを利用する非対称のＰＣＲ法は、開始増幅反応混合物中にプローブを含み、プライマー、ｄＮＴＰ、バッファー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸出発物質がＲＮＡである場合、逆転写酵素もまた含む。増幅の間にまたはその最後に切断されないあらゆるプローブは、ハイブリダイゼーション後に検出可能な蛍光シグナルを発する２重蛍光標識プローブであろう。適した標識手法が当技術分野で知られている。好ましい標識は、一方の末端に共有結合された蛍光体および他方の末端に共有結合された非蛍光消光剤であるが、他の標識法を使用することができる。入手可能なＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＭＩ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤、ＱＳＹ消光剤、Ｄｅｅｐ Ｄａｒｋ消光剤、および他を含む多数の消光剤が当技術分野で知られている。検出の一部として切断されることとなるあらゆるプローブもまた同様に標識されてもよいが、その必要はない。そのようなプローブに必要とされることは、切断が検出可能であるということであり、したがって、プローブは、検出可能な標識で別々に標識することができるまたはプローブは非標識とすることができる。
【００４０】
使用されるプローブは、ＰＣＲ増幅の間に、すなわちリアルタイム検出でまたは増幅の後に、すなわち終末点検出で標的とハイブリダイズした場合のそれらのプライマー非依存的等温５’ヌクレアーゼ切断を増強するまたは実質的に排除するように修飾される直鎖またはランダムコイルのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとすることができる。示されるように、増強された切断性を有するプローブをエキソ感受性またはＥＸＯ−Ｓプローブと称し、また、切断に抵抗性のプローブをエキソ抵抗性またはＥＸＯ−Ｒプローブと称する。ＥＸＯ−Ｒプローブは、２５分間の等温プライマー非依存的切断条件にかけられた場合、実質的に未切断のままである。いくつかのＥＸＯ−Ｒプローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍのあたりの急速な温度変動によって切断することができるが、他のものはそのような変動にさえ抵抗する。検出が制限プライマーの消耗後に起こり、したがって、起こるあらゆる切断はプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ酵素活性によるものである。ＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブは低温プローブである。
【００４１】
ランダムコイルＤＮＡプローブをＥＸＯ−Ｓプローブにするためのそのプローブに対する修飾は、プローブの標的に相補的ではない５’ヌクレオチドを追加することおよびプローブの５’ヌクレオチドに標識成分を、好ましくは蛍光成分を少なくとも３つの、好ましくは６つのメチレン基のメチレン鎖によって連結することである。
【００４２】
ランダムコイルＤＮＡプローブをＥＸＯ−Ｒプローブにするためのそのプローブに対する修飾は、それらの５’末端の構造的修飾に基づいた３つのクラスがあると考えることができる：
クラス（１）５’末端が完全に相補的な標的配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対するある非核酸化学成分の追加；
クラス（２）プローブの５’末端が標的配列に相補的ではなく、したがって、１つまたは複数の塩基について伸長された一本鎖「アーム」を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対する１つまたは複数の非相補的ヌクレオチドの追加；
クラス（３）５’末端の一本鎖「アーム」が、３〜５つのヌクレオチドのステムおよび＞７０℃の自己アニーリングＴｍを有する、ヘアピン構造を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対する複数の非相補的ヌクレオチドの追加。
【００４３】
図１は、比較のための例示的な５’ヌクレアーゼプローブと共に各クラスのＥＸＯ−Ｒプローブの例を示す。図２は、クラス（１）〜（３）のプローブについての例示的な切断メカニズムを示す。
【００４４】
Ｔａｑシステムでは、たとえば、いくつかのクラス（１）およびクラス（２）のＥＸＯ−Ｒプローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍが伸長プライマーの通り道でのプローブ結合を回避するのに十分に低くなかった場合、プライマー依存的切断によって切断され得る。対照的に、クラス（３）プローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍが伸長プライマーの通り道でのプローブ結合を回避するのに十分に低くなかった場合、伸長プライマーによって切断されず、またプライマー伸長を非効率にする。
【００４５】
特定の修飾されたランダムコイルプローブがＥＸＯ−ＳかＥＸＯ−Ｒプローブかどうか決定するために、その切断性を、等温プライマー非依存的切断条件が後続するＰＣＲ増幅反応条件にかけられた場合の、対応する非修飾のプローブのものと比較することができる。ＥＸＯ−ＲプローブがそのＴｍのあたりの急速な温度変動によって切断可能かどうか決定するために、その切断を、温度サイクルの時間または数の関数としてプロットすることができる。
【００４６】
述べられたように、ＥＸＯ−Ｓプローブ法およびＥＸＯ−Ｒプローブ法は、非対称のＰＣＲ増幅およびハイブリダイズされたプローブの検出または切断されたプローブ断片の検出である。プローブが、ハイブリダイズされたことによりまたは切断されたことにより、検出可能なシグナル、たとえば蛍光シグナルを発する場合、検出は、変動を含んでいてもよくまたは含んでいなくてもよい低温検出ステップの手段を用いて増幅反応の間に（リアルタイム）または反応の完了後に（終末点）行うことができる。そのようなプローブでの検出はまた、プローブ−標的ハイブリッドについての融解曲線の生成を含んでいてもよい。
【００４７】
以下の説明は、同じまたは異なる標識を有するいくつかのＥＸＯ−ＳプローブまたはいくつかのＥＸＯ−Ｒプローブを、そのような反応物が産出する情報量を増加させるために、多重ＰＣＲ反応物にどのように添加することができるかを示す。同様の結果は、同じ反応中でＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブを組み合わせることにより達成することができる。
【００４８】
多重非対称のＰＣＲ反応は、それぞれ異なる標的配列に対するいくつかの対のプライマーを使用するように構築することができる。結果として生じる一本鎖アンプリコンのそれぞれは、一本鎖標的アンプリコン中のその相補的配列との１つまたは複数のＥＸＯ−Ｓプローブのハイブリダイゼーションを達成するために反応の間にまたは反応の最後に温度を低下させることにより検出することができる。ＥＸＯ−Ｓプローブのそれぞれが、異なった色の蛍光体でまたは固有の分子量もしくは電気的なサインを有する異なる成分で標識される場合、それぞれのプローブ−アンプリコンハイブリッドはその固有のシグナルを産出する。しかしながら、２つのＥＸＯ−Ｓプローブはまた、それらが異なる温度でプローブ−アンプリコンハイブリッドを形成することを条件として、同じシグナル基で標識することができる。同様に、ＥＸＯ−Ｓプローブは、同じ色だが区別可能に異なるＴｍのＥＸＯ−Ｒプローブと共に使用することができ、この場合には、プローブのうちの一方のみがプローブおよびアンプリコンの等温インキュベーションの間に切断され、第２のプローブは続いて起こるまたは先の温度の変動の間に切断されるので、ＥＸＯ−Ｒプローブが温度変動によって切断可能である場合、区別を高めることができる。
【００４９】
ＥＸＯ−Ｓプローブを用いて別個のシグナルを産出する可能な標的のレパートリーは、Ｋｒａｍｅｒ（米国特許第６１５００９７号）によって記載される「Ｃｏｌｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｔ Ｃｏｄｉｎｇ」の原理を利用することによりさらに高めることができる。この場合では、各アンプリコン、ユニーク配列または対立遺伝子変異体のいずれかは、２つまたは３つの異なる５’標識で標識されたそれ自体のＥＸＯ−Ｓプローブで標的にされる。したがって、プローブ−アンプリコンハイブリッドが形成され、切断された場合、２つまたは３つの標識は切断を介して放出される。Ｋｒａｍｅｒによって記載されるように、２つまたは３つのグループで複数の標識を組み合わせるための複数の方法がある。
【００５０】
同様に、多重非対称ＰＣＲ反応は、温度が反応の間にまたはその最後に低下する場合に、複数のＥＸＯ−Ｒプローブで検出される複数の一本鎖アンプリコンを産出するためにいくつかの対のプライマーを使用して構築することができる。この場合では、各ＥＸＯ−Ｒプローブは異なる色の蛍光体で標識することができる。加えて、各ＥＸＯ−Ｒプローブは、その長さに依存して、配列特異的、つまり対立遺伝子識別力があるまたはミスマッチ認容性とすることができる。この場合では、プローブ−アンプリコンハイブリダイゼーションを区別するための最良の方法は、反応の温度が、あらかじめ設定された低温から徐々に低くなるまたは徐々に増加する融解曲線分析を行うことである。これらの状況下で、各ＥＸＯ−Ｒプローブはその固有の融解プロフィルを表し、同じ色の２つのＥＸＯ−Ｒプローブの組合せは複合融解曲線をもたらす。加えて、温度変動は、プローブのうちの一方のみのシグナルを変化させるので、温度変動に抵抗性のＥＸＯ−Ｒプローブおよび温度変動に感受性のＥＸＯ−Ｒプローブは多重化することができる。
【００５１】
ＥＸＯ−Ｒプローブを用いて別個のシグナルを産出する可能な標的のレパートリーは、Ｋｒａｍｅｒ（米国特許第６１５００９７号）によって記載される「Ｃｏｌｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｔ Ｃｏｄｉｎｇ」の原理を利用することによりさらに高めることができる。この場合では、各アンプリコン、ユニーク配列または対立遺伝子変異体のいずれかは、２つまたは３つの異なる５’標識で標識されたそれ自体のＥＸＯ−Ｒプローブで標的にされる。したがって、プローブ−アンプリコンハイブリッドが形成され、融解される場合、そのハイブリッドは２つまたは３つの色で同じ融解曲線を産出する。Ｋｒａｍｅｒによって記載されるように、２つまたは３つのグループで複数の標識を組み合わせるための複数の方法がある。
【００５２】
ＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブを使用する別の手段は、シングル多重非対称ＰＣＲ反応中でそれらを組み合わせることを含む。この場合では、異なるプローブは、融解曲線分析または切断分析のいずれかによって異なる一本鎖アンプリコンを検出することができる。たとえば、反応の温度を低下させるので、ミスマッチ認容性ＥＸＯ−Ｒプローブは、固有の融解曲線を産出する有色の蛍光体で標識することができる。その標的へのＥＸＯ−Ｒプローブの最大の結合が低温で達すると、反応温度は、その標的に対して同じ色であってもよく、その標的に対するＥＸＯ−ＲプローブのＴｍよりも低いＴｍを有するＥＸＯ−Ｓプローブのハイブリダイゼーションおよび等温または変動温度依存性の切断を達成するためにさらに低下させることができる。ＥＸＯ−Ｓプローブ切断産物の検出は低温で実行することができるが、好ましくはより上の温度、たとえば、ＥＸＯ−ＳプローブもＥＸＯ−Ｒプローブもその標的とハイブリダイズしない７０℃で実行される。これらの各直鎖プローブ上に消光剤が存在するので、ＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端から切断された蛍光体のみが、そのより上の温度でバックグラウンドを上回るシグナルを産出する。
【実施例】
【００５３】
実施例１（図４）
本実施例は、ここで使用される条件下で、ポリメラーゼＺＯ５がプライマー非依存的抵抗性を呈しないことを実証する。
【００５４】
増幅反応は、１×ＲＴ−ＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）、５０ｍＭビシン／ＫＯＨ、ｐＨ８．２（２５℃）、１１５ｍＭ Ｋ−酢酸、８％グリセロール（ｖ／ｖ）、および３ｍＭ酢酸マンガン（Ｍｎ ＯＡｃ2）をそれぞれ含有する。ＺＯ５ポリメラーゼ濃度は反応当たり２００ユニットとし、プローブは０．５μＭとし、相補的標的は１．５μＭとする。反応は等温とし、５２℃で実施する。蛍光発光データは２０秒間隔で１５分間収集する。反応はＡＢＩ社製７７００サーモサイクラーを使用して実施する。
【００５５】
以下のプローブおよびそれらの相補的標的を使用した：
プローブ名 配列（５’−３’）
直鎖FT(アームなし) Fam-CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1
直鎖FT BHQ5' BHQ1-CCATGATACAAGCTTCC-Fam
直鎖FT(5'3'アーム) Fam-TTTTTTCCATGATACAAGCTTCCTTTTTT-BHQ1
0-4-0 MW-BG Fam-CGGTGAAACCGCGCCTGCAATATACAGC-BHQ1
標的名
FT標的 ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAAC
BG標的 AAAAAAGCTGTATATTGCAGGCGAAAAAA
【００５６】
以下のプローブ−標的の組合せを試験した（各２通り）。カットが最も速い速度の２つ（４１）の線は、ＦＴ標的＋６つの非相補的ヌクレオチド（すべてＴ）の５’３’アームを有する直鎖ＦＴプローブである。カットが２番目に速い速度の２つ（４２）の線（赤線）は、ＦＴ標的＋５’３’アームなしの直鎖ＦＴプローブである。２つ（４３）の線は、ＢＧ標的＋４ｂｐステムおよび３塩基ループを有する５’ヘアピンを含有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブである。上記のプローブの３つはすべて５’ＦＡＭ蛍光体を有する。
【００５７】
２つ（４４）の線は、ＦＴ標的＋５’３’アームなしの直鎖ＦＴプローブであるが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤１が５’末端上にある。
【００５８】
２つ（４５）の点線は、５’ヘアピンを有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブであるが、ＢＧ標的を反応物に添加しなかった。
【００５９】
図４に示される結果は、これらの条件下で、ポリメラーゼＺＯ５が、ＢＧ標的の非存在下でさえ、５’ヘアピンを有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブを切断することを実証する。すべての他のプローブは、それらの標的配列の非存在下で切断されなかった（結果は示さず）。したがって、これらの結果は、これらの条件下のポリメラーゼＺＯ５が標的非依存的プローブ切断を呈することを実証する。この結論は、これらの条件下で、ポリメラーゼＺＯ５はまた、６つの非相補的ヌクレオチド（すべてのＴ）の５’３’アームを有する直鎖ＦＴプローブがそのＦＴ標的に結合した場合に、このＥＸＯ−ＲプローブはＴａｑポリメラーゼによって切断されないが、その直鎖ＦＴプローブを切断した事実によって支持される。
【００６０】
実施例２（図５（Ａ〜Ｄ））
本実施例では、標的非依存的プローブ切断を呈する酵素ＺＯ５ポリメラーゼ（実施例１）は、ＥＸＯ−Ｒプローブを切断するが、標的非依存的プローブ切断を呈しないプラチナＴａｑポリメラーゼは、ＥＸＯ−Ｒプローブを切断しないことを示す。図５は、唯一の変更を重合反応中で使用される酵素とする同じ反応条件下での、各実行を１０，０００コピーで始めた、Ｈ５およびＨ３のインフルエンザ遺伝子の検出についての４回の実験の結果を示す。Ｈ５遺伝子は５’ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブ（実線）によって検出し、Ｈ３遺伝子は５’ＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブ（破線）によって検出する。ＮＴＣ値は点線で示す。
【００６１】
図５Ａは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅についてＺＯ５酵素を用いた結果を示し、ＴＥＴプローブおよびＦＡＭプローブの両方を用いた（５１）はＴＥＴプローブ蛍光発光の、（５２）はＦＡＭプローブ蛍光発光の、および（５３）はＮＴＣの結果である。
【００６２】
図５Ｂは、プローブの融解を示し、ＦＡＭおよびＴＥＴのプローブの両方について、（５４）はＴＥＴプローブ蛍光発光の、（５５）はＦＡＭプローブ蛍光発光の、および（５６）はＮＴＣの結果である。
【００６３】
図５Ｃは酵素としてプラチナＴａｑポリメラーゼを使用したＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の結果を示し、ＴＥＴおよびＦＡＭのプローブの蛍光発光で、（５７）はＴＥＴプローブ蛍光発光、（５８）はＦＡＭプローブ蛍光発光、および（５９）はＮＴＣである。
【００６４】
図５Ｄは、プローブの融解を示し、ＴＥＴおよびＦＡＭのプローブの蛍光発光で、（５１０）はＴＥＴプローブ蛍光発光、（５１１）はＦＡＭプローブ蛍光発光、および（５１２）はＮＴＣである。
【００６５】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲはＺＯ５の実施例（図５Ａ）でより効率的に見え、Ｃｔ値は両遺伝子について２９であり、一方、プラチナＴａｑ（図５Ｃ）については、Ｃｔ値は３０（Ｈ５）および３３（Ｈ３）である。しかしながら、２つの融解曲線によって示されるようにこれは事実ではない。ＺＯ５反応中でのＴＥＴプローブ（５４）は完全にカットされていき、反応中に遊離ＴＥＴを放出するが、ＺＯ５を用いたＦＡＭプローブ（５５）は部分的にカットされる。これは図６Ｂに見ることができ、ＺＯ５反応プローブ融解曲線で、プローブがもはや標的に結合しなくなると、プローブ蛍光発光（５４、５５）はＮＴＣ蛍光発光値（５６）に達する。これもまた増幅でのＣｔ値をより低くする。結果は、プラチナＴａｑ反応で全く異なり（図５Ｄ）、プローブがもはや標的に結合しなくなると、プローブ融解曲線は遊離ＴＥＴ（５１０）またはＦＡＭ（５１１）を示さない。したがって、遊離ＦＡＭまたはＴＥＴが検出されないので、Ｃｔ値（図５Ｃ）はより後になる。
【００６６】
ＥＸＯ−Ｒプローブ：
5' TET-CACTAGGGAACTCGCTG-BHQ1 3', Tm=52.7 (H5)
5' FAM-CGTTTCTCGAGGTCCTGCG-BHQ1 3', Tm=54.5 (H3)
制限プライマー：
5' AAGGATAGACCAGCTACCATGATTGCC 3', Tm=66.8 (H5)
5' CGTTGTATGACCAGAGATCTATTTTAGTGTCCT 3', Tm=67.9 (H3)
過剰プライマー：
5' ATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGG 3', Tm=63.6 (H5)
5' CCATCAGATTGAAAAAGAATTCT 3', Tm=62.7 (H3)
【００６７】
反応条件（ミリモル（ｍＭ）またはマイクロモル（μＭ）での濃度、マイクロリットル（μＬ）での容量）：
１０×ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ制限プライマー ２× ０．１２５μＬ
１００μＭ過剰プライマー ２× ０．２５０μＬ
１０μＭプローブ ５００ｎＭ ２× １．２５μＬ
１０μＭ Ｃ３ Ｐｒｉｍｅｓａｆｅ ５００ｎＭ １．５０μＬ
混合合計： ９．３７５μＬ
ＺＯ−５(5ユニット),プラチナＴＡＱ(1.25ｕ)： 1.0/0.25最終ユニット
水： 12.625μＬまたは13.375μＬ
ＤＮＡアンプリコン（10,000コピー／μＬで２） ２．０
合計容量： ２５．０μＬ
【００６８】
熱性条件：（アニーリングＺＯ−５＝５８℃、Ｔａｑ＝６２℃）
段階１：９５℃／３：００分間
段階２：（９５℃／１０秒間：５８℃または６２℃、１５秒間：７２℃、３０秒間）２０回繰り返す
段階３：（９５℃／１０秒間−５８℃または６２℃／１５秒間−７２℃／３０秒間−４５℃／２０秒間）３０回繰り返す
段階４：融解３５℃〜９４℃
【００６９】
実施例３（図７Ａ〜Ｉ）
プライマー依存的およびプライマー非依存的ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応でのＥＸＯ−Ｎプローブ
本実施例では、５’ヘアピンＥＸＯ−ＲプローブはＬＡＴＥ−ＰＣＲサイクルの最初のサイクルの間にプライマー依存的様式でＴＡＱポリメラーゼによって切断されず、制限プライマーが消耗された場合にプライマー非依存的様式で切断されないことを示す。さらに、使用されるＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーの対のＴｍに依存して、ＥＸＯ−ＲプローブはＢＧ標的の増幅を非効率にする。結果を図７Ａ〜Ｉに示す。
【００７０】
図７Ａ〜Ｃは、高Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ａ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｂ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｃ 終末点融解曲線分析（（７３）標的ありのプローブ、（７４）プローブのみ）。図７Ｄ〜Ｆは、中間Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ｄ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｅ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｆ 終末点融解曲線分析（（７７）標的ありのプローブ、（７８）プローブのみ）。図７Ｇ〜Ｉは、低Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ｇ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｈ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｉ 終末点融解曲線分析（（７１１）標的ありのプローブ、（７１２）プローブのみ）。
【００７１】
図７Ａ、７Ｄ、７Ｇは、プローブのシグナルが、あらゆるプライマー対を用いても５０サイクルにわたって９５℃で変化しないことを示す。この結果は、ＥＸＯ−Ｒプローブがプライマー依存的メカニズムによってカットされなかったことを示し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲの間にＥＸＯ−Ｒプローブがプライマー非依存的切断によってカットされなかったことをさらに示す。図７Ｂ、７Ｅ、７Ｈは、３つのプライマー対についての７２℃での伸長ステップの後の４５℃でのプローブ蛍光発光のリアルタイムの結果を示す。高Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｂ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは結合せず、増幅をブロックしない。中間Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｅ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは、Ｃｔの遅延およびシグナル強度の減少に見られるように増幅をブロックし始める。低Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｈ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは、Ｃｔの大幅な遅延およびシグナル強度の大幅な減少に見られるように増幅を著しく阻害する。図７Ｃ、７Ｆ、７Ｉは、プライマー実施例のそれぞれについてのＥＸＯ−Ｒ ＦＡＭプローブ３５℃〜９４℃の融解曲線を示す。７Ｃでは、最大量のＰＣＲ産物が示されるが、７Ｆは、ＥＸＯ−Ｒプローブのブロッキング能力によりより少量が示され、（７Ｉ）では、産生されるＰＣＲ産物はほとんどない。融解曲線はＬＡＴＥ−ＰＣＲ後に描くので、遊離ＦＡＭは検出されず、プローブがプライマー依存的または非依存的様式でカットされなかったことを示す。黒色の実線は、１０，０００コピーのＢＧ開始コピーを用いた反応を示し、一方、黒色の点線はＮＴＣを示す。
配列：
制限プライマー：
TGCGTTCTGACTGAACAGTGATCGAG, Tm=72℃ (高Tmプライマー対)
TTCTGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=64℃ (中間Tmプライマー対)
TGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=61℃ (低Tmプライマー対)
過剰プライマー：
CCCTCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=66℃ (高Tmプライマー対)
TCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=61℃ (中間Tmプライマー対)
TTGAAATTCCCGAATGG, Tm=58℃ (低Tmプライマー対)
ＥＸＯ−Ｒプローブ０４０１７：
5' FAM-CGCTGAAAGCGCGCCTGCAATTTACAGC-BHQ1, 3' Tm=60C
【００７２】
反応条件：マイクロリットル（μＬ）
１０× ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ 制限プライマー ５０ｎＭ ０．１２５μＬ
１００μＭ 過剰プライマー １０００ｎＭ ０．２５０μＬ
１０μＭ EXO-Nプローブ １００ｎＭ ０．２５０μＬ
１０μＭ Primesafe9-3DD ５００ｎＭ １．２５０μＬ
１．２５Ｕ プラチナＴＡＱ ０．２５０μＬ
水 １７．２５μＬ
ＢＧ標的 104コピー／μＬ １．０μＬ
合計 ２５μＬ
熱性条件：
段階１：５分間９５℃
段階２：繰り返し５０サイクル、１０秒間９５℃、１５秒間６１℃／５８℃、２０秒間７２℃、および２０秒間４５℃。
段階３：融解３５℃〜９４℃
【００７３】
実施例４（図８）
５’末端にＦＡＭを使用するＥＸＯ−Ｓプローブ
実施例４についての図８は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応の完了の後の１５分間の変動によるＥＸＯ−Ｓプローブシグナル増幅を示す。反応条件は、９５℃で１０秒、６４℃で１０秒、および７２℃で２０秒の４５ラウンドとした。最終の試薬濃度は、２５マイクロリットル（μＬ）の容量中、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼ、２００ｎＭのｄＮＴＰ、５０ナノモル（ｎＭ）ＦＴ＃２制限プライマー、１０００ｎＭ ＦＴ＃２過剰プライマー、および０．６×ＰｒｉｍｅＳａｆｅ（商標）＃０２２（ＰｒｉｍｅＳａｆｅは、Ｓｍｉｔｈｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ社から入手可能な試薬である、ならびに３００ｎＭ ＦＴ ＭＢｓｅｑ４とした。
【００７４】
ＦＴ＃２制限プライマーの配列は、
5' GGAAGTGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGA 3'
とした。
【００７５】
ＦＴ＃２過剰プライマーの配列は、
5' GTTGCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA 3'
とした。
【００７６】
ＦＴ ＭＢｓｅｑ４ ＥＸＯ−Ｓプローブは、
5' FAM-CATGATACAAGCTTC-BHQ1 3'
とした。
【００７７】
ＰＣＲの完了後に；４５℃（１０秒間）および６５℃（２０秒間）の間の４５ラウンドの変動。蛍光発光を６５℃で収集した。線（８１）は、ＦＴ ＭＢｓｅｑ４プローブおよび増幅されたＦＴ産物の両方を含有する複製物であり、一方、線（８２）は鋳型なしコントロールサンプルである。
【００７８】
実施例５（図９）
５’末端にＢＨＱ１を使用するＥＸＯ−Ｒプローブ
本実施例では、（１）Ｅｘｏ−Ｓプローブの５’蛍光体を５’ＢＨＱ−１消光剤に交換することにより、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによってプライマー非依存的様式でもはや切断されないＥｘｏ−ＲプローブにＥｘｏ−Ｓプローブを変換すること、および（２）ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合されたＥｘｏ−Ｒプローブは、プライマー非依存的様式でＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによって切断されないことを示す。図ｘｘは、本実施例の結果を示す。パネルＡは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの非存在（線９１）または存在（線９２）下でのＥｘｏ−Ｓプローブ／標的ハイブリッドの融解プロファイルを示す。この特定のＥｘｏ−Ｓプローブは５’ＨＥＸ蛍光体および３’ＢＨＱ−１消光剤からなる。線９３は、鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。反応は、２５μＬ容量中で実行し、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｎＭ合成標的（下記参照）、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｓプローブ（下記参照）、およびＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサンプルの場合には、１．２５ユニット ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）からなるものとした。鋳型なしコントロールサンプルについては、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを含み、標的配列は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ８．３と交換した。サンプルは１０秒間９５℃で、次いで２０分間２０℃でインキュベートし、Ｅｘｏ−Ｓプローブ／標的ハイブリッドの形成を可能にした。次いで、サンプル温度を、それぞれ９０秒間の長さの１℃の間隔で２０℃から９５℃まで上げると共に、蛍光発光シグナルを収集した。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼなしのサンプル（線９１）については、プローブ蛍光発光シグナルは、６５℃の上で、プローブが標的から完全に融解される温度範囲で鋳型なしコントロールからのプローブ蛍光発光シグナルにマッチする。対照的に、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサンプルについては、６５℃の上のプローブ蛍光発光シグナルは、鋳型なしコントロールからの蛍光発光シグナルよりも高く、ＢＨＱ−１消光剤からのＨＥＸ蛍光体のプローブ切断および分離を示す。この結果は、合成標的に結合されたＥｘｏ−Ｓプローブがプライマー非依存的様式でＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に感受性であることを実証する。
配列
Exo-Sプローブ: 5' HEX AGCATACGGTTCAGTT 3' BHQ1
合成標的：
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
【００７９】
上記の同じプローブ配列を５’ＢＨＱ−１消光剤および３’ＨＥＸ蛍光体を有するように修飾した。５’ＢＨＱ−１成分の存在は、プライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であるＥｘｏ−Ｒプローブにそのプローブを変える。パネルＢは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのそのようなＥｘｏ−Ｒプローブ−標的ハイブリッドの融解プロファイルを示す（線９４）。線９５は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。反応条件は、２５μｌの最終容量中、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｎＭ合成標的、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｒプローブ（下記参照）、および１．２５ユニットＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）から成った。鋳型なしコントロールサンプルについては、標的配列は１０ｎＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ Ｐｈ ８．３と交換した。サンプルは２０分間２０℃でインキュベートし、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／標的ハイブリッドの形成を可能にし、次いで、サンプル温度を、それぞれ９０秒間の長さの１℃の間隔で２０℃から９５℃まで上げると共に、蛍光発光シグナルを収集した。Ｅｘｏ−Ｒプローブ／標的ハイブリッドを用いたサンプル（線９４）については、蛍光発光シグナルは、６５℃の上で、プローブが標的から完全に融解される温度範囲で鋳型なしコントロールからの蛍光発光シグナル（線９５）にマッチする。この結果は、（１）合成標的に結合したＥｘｏ−Ｒプローブは、プライマー非依存的様式のＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であること、および（２）５’ＨＥＸ蛍光体を５’ＢＨＱ−１消光剤に交換することによりＥｘｏ−ＳプローブをＥｘｏ−Ｒプローブに変えることを実証する。
配列
Exo-Rプローブ: 5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
【００８０】
合成標的：（上記のものと同じ）
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
【００８１】
パネルＣは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合した場合、上記に記載されるＥｘｏ−ＲプローブはまたＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを示す。上記に記載されるＥｘｏ−Ｒプローブについての標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡ産物は、Ｅｘｏ−Ｒプローブの存在下でＬＡＴＥ−ＰＣＲを介して産出された。増幅の最後に、温度を２０℃に低下させ、２０分間インキュベートして、Ｅｘｏ−Ｒ／一本鎖アンプリコンハイブリッドの形成を可能にした。この図は、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／一本鎖アンプリコンハイブリッドのＰＣＲ後の融解曲線分析を示す（線９６）。線９７は、プローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。合成標的とハイブリダイズしたＥｘｏ−Ｒプローブと同様に（パネルＢ）、６５℃の上でのＥｘｏ−Ｒプローブ−アンプリコンハイブリッドの完全融解は、鋳型なしコントロールサンプルに等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、ＰＣＲによって産出された標的に結合されたＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅についての反応条件は、２５ｕｌの最終容量中、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５０ｎＭ ｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、２５ｎＭ ９−２２ＤＤ ＰｒｉｍｅＳａｆｅ、５００ｎＭ ９−Ｃ３ ＰｒｉｍｅＳａｆｅ、１．２５ユニットＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、５０ｎＭ制限プライマー、１ｕＭ過剰プライマー、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｒプローブ、ヒトＤＮＡの１０００ゲノム等価物（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ社、キャムデン、ＮＪ、カタログ番号；ＮＡ０７３４８）とした。熱サイクルプロファイルは、３分間９５℃、１０秒間９５℃、１０秒間６４℃、および２０秒間７２℃の７０サイクル、次いで２０分間２０℃、ならびに１℃で各９０秒間の長さの間隔での２０℃から９５℃までの蛍光発光取得を伴う融解ステップとした。
配列：
制限プライマー:
5' CCATTTCTTCCTCCTCCTCATAAGCATGGTACCTAT 3'
過剰プライマー:
5' CCCGCTGGTTCAATAATGTCTTTAA 3'
Exo-Rプローブ(上記と同じ)
5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
【００８２】
パネルＡ−合成標的上で試験したＥｘｏ−Ｓプローブの実施例：このパネルは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの非存在（線９１）または存在（線９２）下でのＥｘｏ−Ｓプローブ−標的ハイブリッドの融解曲線分析を示す。線９３は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼなしのサンプル（線９１）については、６５℃の上でのプローブ−標的ハイブリッドの完全融解は、鋳型なしコントロールに等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（線９１）ありのサンプルについては、６５℃の上でのプローブ−標的ハイブリッドの完全な融解は、プローブ切断およびＢＨＱ−Ｉ消光剤からのＨＥＸ蛍光体の分離により、非結合プローブよりも高い蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、合成物質に結合されたＥｘｏ−Ｓプローブがプライマー非依存的様式のＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に感受性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８３】
パネルＢ：合成標的上で試験したＥｘｏ−Ｒプローブの実施例：このパネルは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＥｘｏ−Ｒプローブ−標的ハイブリッドの融解曲線分析を示す（線９４）。線９５は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼが存在するにもかかわらず、プローブ−標的ハイブリッドの融解は、非結合プローブと等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、合成標的に結合したＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８４】
パネルＣ：ＰＣＲ産物上で試験したＥｘｏ−Ｒプローブの実施例：ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合した場合、上記に記載されるＥｘｏ−ＲプローブはＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性である。上記に記載されるＥｘｏ−Ｒプローブについての標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡ産物は、Ｅｘｏ−Ｒプローブの存在下でＬＡＴＥ−ＰＣＲを介して産出された。増幅の最後に、温度を２０℃に低下させ、２０分間インキュベートして、Ｅｘｏ−Ｒ／アンプリコンハイブリッドの形成を可能にした。この図は、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／アンプリコンハイブリッドのＰＣＲ後の融解曲線分析を示す（線９５）。線９６は、プローブのみ／標的なしサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。合成標的とハイブリダイズしたＥｘｏ−Ｒプローブと同様に、Ｅｘｏ−Ｒプローブ−アンプリコンハイブリッドの融解は、鋳型なしコントロールと等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、ＰＣＲによって産出された標的に結合されたＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８５】
実施例６（図１０）
本実施例では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の間にＲＯＸ ＥＸＯ−Ｒプローブの分解が観察されない、ニューカッスルＤＮＡアンプリコンの７５００コピーを検出するためにＥＸＯ−Ｒ ＲＯＸプローブを使用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応を示す。
【００８６】
図１０Ａは、７５００コピーのニューカッスルウイルスアンプリコン（線１０１）のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅およびＲＯＸ ＥＸＯ−Ｒプローブ融解曲線（実線）対ＮＴＣ（線１０２）の両方を示す。プローブが高温で非結合である場合、すべてのプローブ蛍光発光（線１０３）およびＮＴＣ蛍光発光（線１０４）が重なり合うので、プローブ分解は融解曲線の図１０Ｂで観察されず、遊離ＲＯＸ蛍光発光がないことを示す。
配列：
制限プライマー:
5' GCATCAAATTCCCCACTGAGCCTC 3', Tm: 67.9℃
過剰プライマー:
5' CCTGGTATTTATTCCTGTTTGAG 3', Tm: 63.2℃
プローブ配列:
5' ROX-ATTTTGCGATATGATACCC-BHQ2 3', Tm: 56℃
【００８７】
ストック濃度： 最終濃度 25μＬアッセイ中の容量（μＬ）
１０×ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ制限プライマー ０．１２５μＬ
１００μＭ過剰プライマー ０．２５０μＬ
１０μＭプローブ 500nM ２× １．２５μＬ
１０μＭ C3-12B Primesafe 300nM ．７５０μＬ
混合合計： ８．２５μＬ
Ｐｔ ＴＡＱ(１．２５ユニット)：
水： １４．５μＬ
ＤＮＡアンプリコン
（750、7,500コピー／μＬで２） ２．０μＬ
合計容量： ２５．０μＬ
熱サイクル条件：
段階１：９５℃／３：００分間
段階２：（９５℃／０：１０秒間−５８°／６２℃／０：１５秒間−７２℃／０：３０秒間）２０回繰り返す
段階３：（９５℃／０：１０秒間−５８°／６２℃／０：１５秒間−７２℃／０：３０秒間−４５℃／０：２０秒間−２５℃／０：２０秒間）２０回繰り返す
段階４：２５℃／２：００分間保持
段階５：融解２５℃〜９４℃
【００８８】
実施例７（図１１）
等温対変動条件下でのＥＸＯ−Ｓプローブの切断の速度
５分間の等温条件５０℃または５０℃から７０℃の温度の間での変動下でのシグナル増幅の速度の比較。プローブおよび相補標的の濃度の両方は０．５μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１１１）は変動条件下での複製物であり、一方、線（１１２）は等温条件下での複製物である。
Ｅ９Ｌプローブ：
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
１２塩基対の３’および５’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
【００８９】
実施例８（図１２）
その相補的標的の３’末端に対するＥＸＯ−Ｓプローブの距離は切断の速度に影響を与える。
【００９０】
Ｅ９Ｌプローブは０．２ｕＭで使用し、一方、両標的は０．０５ｕＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１２１）は、プローブ−標的ハイブリッド複合体の端に対して１２塩基対の５’および３’突出を有する複製物である。一方、線（１２２）は、プローブ−標的ハイブリッド複合体の５’末端に対して４４塩基対の３’突出を有する複製物である。
Ｅ９Ｌプローブ：
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
１２塩基対の３’および５’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
４４塩基対の３’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3 'ACCTACACGTTGAGAATCGGCTTCCCATACTCATATCTCGT
GATAAAGATTTAGGGTAGTCTGG 5'
【００９１】
実施例９（図１３）
４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル発生についての異なる速度（ケース１）。
【００９２】
プローブの濃度は０．２μＭ ｒｓ４９８とし、０．０５μＭの標的とする；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。７０℃でデータ収集した。線（１３１）は、Ａに対するミスマッチＡを含有する複製物であり、線（１３２）は、Ｔに対してＡにマッチした複製物である。線（１３３）はプローブのみでの複製物である。
rs498プローブ: FAM 5' AGACATGTTCCCTACT 3' BHQ1.
末端塩基がミスマッチの標的、（ボールド）
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC
完全にマッチした標的
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC
【００９３】
実施例１０（図１４）
４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル増幅についての異なる速度（ケース２）。
【００９４】
プローブの濃度は０．２μＭ ｒｓ４９８とし、０．０５μＭの標的とし、試薬は上記と同じとし、７０℃でデータ収集した。線（１４１）は、Ａに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４２）は、Ｔに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４３）は、Ｃに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４４）は、Ｇ塩基対に対してマッチしたＣを含有する複製物である。線（１４５）はプローブのみでの複製物である。ｒｓ４９８プローブ配列は３’ＦＡＭ ＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＡＣＴ ＢＨＱ１５’とする。プローブ配列の端での５’Ｔは、標的鎖内で、その相補的配列（下線）の３’末端に対してミスマッチ（ボールド）とした：
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCCGCCATAGGTTTC 3',
または標的鎖内でその相補的配列（下線）の３’末端にマッチした（ボールドなし）。
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCGGCCATAGGTTTC 3'.
【００９５】
実施例１１（図１５）
３０分間の等温条件（５０℃）下でのシグナル増幅の速度。ＦＴプローブは０．５μＭとし、その相補標的は１．０μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１５１）はＦＴプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線（１５２）はＦＴプローブのみである。ＦＴプローブに対する配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし、相補的配列は５’ＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴ３’とする
【００９６】
実施例１２（図１６）
変動条件（４５℃〜７０℃）下でのシグナル増幅の速度。ＦＴプローブは０．５μＭとし、その相補標的は０．５μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１６１）はＦＴプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線（１６２）はＦＴプローブのみである。ＦＴプローブに対する配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし、相補配列は、５’ＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴ３’とする
【００９７】
実施例１３（図１７）
プローブの５’アームの長さを増加させると、プローブはＥＸＯ−ＳまたはＥＸＯ−Ｒプローブとなる。図１７Ａ〜Ｃは、Ｔａｑポリメラーゼの存在下または非存在下での５０℃でのプローブおよびその相補的標的の３０分間の等温インキュベーション後に行った融解分析を示す。Ｔａｑを含有し、Ｔａｑを含有していないものと同じ蛍光発光値に達するサンプルは、ＥＸＯ−Ｒプローブを示す。蛍光発光値はすべて７０℃に標準化する。図１７Ａについては、線（１７１）は、ＴａｑポリメラーゼなしのＦＴプローブ（修飾なし）標的複合体の複製サンプルである。線（１７２）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴプローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７３）はＦＴプローブのみである。図１７Ｂについては、線（１７４）は、Ｔａｑポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの５’末端で標的に対する単一の非相補的塩基を有するＦＴ（１ｂｐ）プローブの複製サンプルである。線（１７５）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴ（１ｂｐ）プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７６）はＦＴ（１ｂｐ）プローブのみである。図１７Ｃについては、線（１７７）は、Ｔａｑポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの５’末端で標的に対する５つの非相補塩基を有するＦＴ（５ｂｐ）プローブの複製サンプルである。線（１７８）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴ（５ｂｐ）プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７９）はＦＴ（５ｂｐ）プローブのみである。
【００９８】
ＦＴプローブ配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし；ＦＴ（１ｂｐ）プローブ配列は５’ＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし；ＦＴ（５ｂｐ）プローブは５’ＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とした。ＦＴ標的は３’ＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＣＡ５’とした。
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００６年７月１７日に出願した米国仮出願第６０／８３１２２３号に対する優先権およびその利益を主張するものである。
【０００２】
本出願は、具体的には、ＰＣＲとして一般に知られているポリメラーゼ連鎖反応を利用する増幅を含む、核酸増幅反応および増幅産物の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸増幅の技術およびアッセイはよく知られている。ＤＮＡを増幅するためのいくつかの反応は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）等の等温のものである。他は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の熱性のサイクルを用いる。ＰＣＲを利用する増幅および増幅を用いるアッセイは、たとえば米国特許第４６８３２０２号、第４６８３１９５号、および第４９６５１８８号ならびに一般的に、ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩＮＮＩＳら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（ＵＳＡ）１９９０）に記載され、これらのそれぞれはこれによってその全体が参照によって組み込まれる。ＰＣＲ増幅は、対称となるよう、すなわち、等モルまたは約等モルの濃度の１対のマッチするプライマー、すなわち、等しい融解温度（Ｔｍ）を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することによって、二本鎖産物（または「アンプリコン」）を作製するよう一般的に設計される。直接ＰＣＲ増幅反応で一本鎖アンプリコンを主として作製するための、用途が限られている技術は、ＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎおよびＥｒｌｉｃｈ，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ−ＤＱＡ Ｌｏｃｕｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：７６５２〜７６５６（１９８８）；および米国特許第５０６６５８４号に記載される「非対称ＰＣＲ」である。非対称ＰＣＲは、一方のプライマーが、他方のプライマーの濃度の１〜２０パーセントの限られた量で存在するように５倍〜１００倍に希釈される点で対称ＰＣＲと異なる非対称のＰＣＲ増幅方法である。結果として、増幅は、一方のプライマーのみが残存して一本鎖アンプリコンを産出する線形増幅が後に続く、両方のプライマーが伸長して二本鎖アンプリコンを産出する対数期からなる。
【０００４】
より最近の非対称のＰＣＲ増幅方法は、「Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ＰＣＲ」（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）であり、これは異なる濃度のプライマーを利用するが、プライマーは、対称ＰＣＲおよび非対称ＰＣＲでのように「マッチしない」。Ｓａｎｃｈｅｚら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０１：１９３３〜１９３８、公開国際特許出願第０３／０５４２３３号（２００３年７月３日）、およびＰｉｅｒｃｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０２；８６０９〜８６１４、これらのすべてはそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＤＮＡ増幅方法は、逆転写を最初に行って、ｃＤＮＡを生成し、次いで、ｃＤＮＡを、たとえば先のＰＣＲ法のうちの１つによって増幅することによってＲＮＡ標的に使用することができる。
【０００５】
核酸増幅産物の検出および分析は様々な形で行うことができる。二本鎖アンプリコンは、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ等の、二本鎖ＤＮＡ中にインターカレートするまたはその他の形でそれと相互作用する際に蛍光を発する色素で監視することができる。たとえば、米国特許第５９９４０５６号を参照されたい。アンプリコンは、シークエンシング反応、たとえば従来のジデオキシシークエンシング法、パイロシークエンシング法、リアルタイムの合成によるシークエンシング法にかけることができる。ハイブリダイゼーションプローブは一般に検出に使用される。プローブは標識されてもよくまたは非標識であってもよい。ハイブリダイズしたプローブの検出は、サイズ等の物理的特徴によるもの、続いて起こるイベント、たとえば発色反応への関与によるもの、または放射性標識もしくは蛍光標識等の、プローブに適用された標識の検出によるものであってもよい。標識プローブの例は、プライマー伸長の間に切断される５’ヌクレアーゼプローブ（米国特許第５２１００１５号、第５４８７９７２号、および第５５３８８４８号）、分子ビーコンプローブ（米国特許第５９２５５１７号、第６１０３４７６号、および第６３６５７２９号）、Ｙｉｎ−Ｙａｎｇ二本鎖プローブ（Ｌｉ， Ｑ．ら（２００２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ５）、ならびにＦＲＥＴプローブ対である。
【０００６】
増幅の上記のＰＣＲベースの方法はすべて、細菌源から回収された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作用に依存する。それらの天然の形態では、これらの酵素は、いくつかのドメインおよびいくつかの活性：３’から５’へのポリメラーゼ、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ、および３’から５’への編集機能（商業的に使用される酵素から除去される）を含む、を有する単一のポリペプチドである。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（サーマス アクアティカス由来）は、ホットスタート形態を含めて最も広く使用されているが、Ｔｆｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、製品＃３０３４２−０１１）は別のそのような酵素である。これらの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに加えて、ＤＮＡ鎖の重合およびある５’末端のエキソヌクレアーゼ切断と共にＤＮＡへのＲＮＡの逆転写もまた実行するいくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがある。これらの酵素は、ＺＯ５ポリメラーゼおよびサーマス サーモフィラス（ＴＴＨ）ポリメラーゼを含む。
【０００７】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで見つかった５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性はＴａｑポリメラーゼを使用して非常に研究されてきた。たとえば、このエキソヌクレアーゼ活性は、対称ＰＣＲに関連して使用されるいわゆる５’ヌクレアーゼアッセイのベースとなる。５’ヌクレアーゼアッセイは２つのプライマーおよび１つのプローブを利用する。プローブは、一方の末端ヌクレオチドに共有結合された蛍光体および他方の末端ヌクレオチドに共有結合された非蛍光消光剤を有する直鎖またはランダムコイルのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。プローブは、２つのプライマーのうちの一方が結合する、２つの標的鎖のうちの一方とハイブリダイズする。５’ヌクレアーゼプローブの融解温度はその上流プライマーの融解温度よりも高く、したがって、プローブは、伸長プライマーの下流に配置される。酵素の３’から５’へのポリメラーゼドメインがプライマーの３’末端を伸長するとき、５’から３’へのＴａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性はプローブの５’末端に遭遇し、これを切断する。プローブがその５’末端に蛍光成分を有する場合、その成分およびそれが共有結合されたヌクレオチドは切断によってオリゴマーの残りから分離される。オリゴヌクレオチドの残部が標的配列にまだ結合している場合、それは、前進しているポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼによってさらに切断される。これはプローブのプライマー依存的切断である。
【０００８】
プローブのプライマー依存的切断は次の特徴を有する：１）プライマーの３’末端は非ブロック（または非キャップ）３’−ＯＨ基を有していなければならない。したがって、３’−ＯＨに対する−ＰＯ4もしくは他の化学成分の追加および／または３’ＯＨの除去は切断を予防する。２）プライマーは、プローブの５’末端まで前進またはプローブの５’末端「の下に侵入」しなければならない。したがって、プライマーがプローブの５’末端まで前進することができないという条件において、下記に示されることを除いて、プライマー依存的反応からの１つまたは複数のヌクレオチド三リン酸の除外は切断を予防するであろう。このルールに対する例外は、さらなる伸長を伴わない、プローブの５’末端の下に既に侵入している、３’ＯＨを有するプライマーが設計され得るということである。３）プライマーの３’末端がプローブの５’末端の下に既に侵入している場合、その３’末端は標的配列に相補的でなければならない。したがって、３’−ＯＨが非キャップでも、プライマーの３’末端での２つ以上のヌクレオチドの非相補的３’伸長（アーム）は、プローブのプライマー依存的切断を予防する。Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのドメインを除去すると、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片として知られている酵素が産出される。Ｓｔｏｆｆｅｌ断片を利用するＰＣＲ増幅は５’ヌクレアーゼ（ＴＡＱＭＡＮ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社の商標）プローブを使用することができない。それらの全長にわたって２’ｏ−メチルヌクレオチド等のある種の修飾されたヌクレオチドを使用する、分子ビーコンプローブ等の構築はプローブプライマー依存的切断を予防する。
【０００９】
Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：９５２３〜９５３２）は、プローブのプライマー依存的切断に特有の３つのオリゴヌクレオチドの構造的特色に基づいた侵入型シグナル増幅反応（invasive signal amplification reaction）を記載した。彼らは、「上昇した温度で反応を実施することによって、下流オリゴヌクレオチドは標的に循環的に結合および解離して、温度サイクルを伴うことなく標的分子当たりに多数の切断イベントをもたらす」ことを報告した。
【００１０】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性はまたプローブ−標的ハイブリッドのプライマー非依存的切断を実行することでも知られている。この反応は、１６塩基対のステム、４つのヌクレオチドのループ、およびＰ32−ＰＯ4で標識された５’末端を有するヘアピン型標的分子を使用して研究された。ヘアピンの２つのアームは長さが等しい（つまり、それは平滑断端にされている）または３’アームは５’末端を超えて伸長しているまたは５’末端は３’末端を超えて伸長している。このデザインの分子を使用して、Ｔａｑポリメラーゼのプライマー非依存的５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は次の特徴を有することが示された：１）Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０，７７８〜７８３（１９９３））は、プライマーの非存在下で、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼは、基質鎖および標的鎖の最後の２つの塩基対の間でヘアピン基質の陥凹５’末端を切断したことを報告した。２）Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：６１４３〜６１４８（１９９９））は、完全なＴａｑポリメラーゼ（ＴａｑＮＰ）の５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性は、３’末端が６つのヌクレオチドだけ陥凹したヘアピン構造の５’末端を効率的に切断しないことを実証した。これらの著者らは、「効率の低い切断は、おそらく、鋳型−プライマー複合体に類似する二重鎖の端への、この酵素のポリメラーゼドメインの結合に起因する」と結論づけた。彼らは、標的とハイブリダイズしたプライマーではなく標的とハイブリダイズしたプローブに類似している基質を試験しなかった。
【００１１】
ある種の増幅目的およびある種の検出目的については、当技術分野で知られている増幅方法および検出方法は適さないまたは制限を有する。たとえば、多重ＰＣＲアッセイは、異なる色の蛍光プローブによって５つまたは６つの標的を区別することができるにすぎない。また、大量の対立遺伝子を含むサンプル中でまれな対立遺伝子を検出するのは非常に難しい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態では、その対応する非修飾の対応物に比べて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ活性に感受性にするように修飾された低温直鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを使用するシグナル増幅を含む非対称のＰＣＲ法が提供される。
【００１３】
他の実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ活性に抵抗性にするように修飾された低温直鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーションの検出を含む非対称のＰＣＲ法が提供される。
【００１４】
さらなる他の実施形態では、ある標的または対立遺伝子の増幅が選択的にブロックされるＰＣＲ法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】異なる種類のプローブを示す図である。
【図２】図１に示されるプローブに対する切断の多種多様のメカニズムを示す図である。
【図３】プライマーおよび標的に対する低温プローブについての最適なＴｍ関係を示す図である。
【図４】多種多様のプローブ構造を切断するＺＯ５の性能を示す図である。
【図５】図５Ａ：ＺＯ５ポリメラーゼ、ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ５およびＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ３の１０，０００コピーの増幅を示す図である。 図５Ｂ：図５Ａについての融解曲線を示す図である。 図５Ｃ：プラチナＴａｑポリメラーゼ、ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ５およびＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブで検出されたＨ３の１０，０００コピーの増幅を示す図である。 図５Ｄ：図５Ｂについての融解曲線を示す図である。
【図６】実施例３および図７で利用されるＥＸＯ−Ｒプローブおよび多種多様のプライマー対の関係を示す図である。
【図７】図７Ａ：高Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｂ：高Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｃ：高Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。 図７Ｄ：中間Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｅ：中間Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｆ：中間Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。 図７Ｇ：低Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの９５℃分析を示す図である。 図７Ｈ：低Ｔｍプライマー対を用いたリアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイでのＥＸＯ−Ｒオリゴヌクレオチドの下流のＢＧプローブの４５℃分析を示す図である。 図７Ｉ：低Ｔｍプライマー対を用いたＥＸＯ−ＲオリゴヌクレオチドＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの下流のＢＧプローブの終末点融解曲線分析を示す図である。
【図８】５’末端上にＦＡＭを使用するＥＸＯ−Ｓプローブを示す図である。
【図９】５’末端上にＢＨＱ１を使用するＥＸＯ−Ｒプローブを示す図である。
【図１０】ニューカッスルＤＮＡアンプリコンの７５００コピーを検出するためのＥＸＯ−Ｒ ＲＯＸプローブを示す図である。
【図１１】等温条件対変動条件下でのＥＸＯ−Ｓプローブの切断の速度を示す図である。
【図１２】その相補的標的の３’末端に対するＥＸＯ−Ｓプローブの距離は切断の速度に影響を与えることを示す図である。
【図１３】４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対する、プローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル生成の異なる速度を示す図である（ケース１）。
【図１４】４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対する、プローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル増幅の異なる速度を示す図である（ケース２）。
【図１５】３０分間の等温条件（５０℃）下でのシグナル増幅の速度を示す図である。
【図１６】変動条件（４５℃〜７０℃）下でのシグナル増幅の速度を示す図である。
【図１７】プローブの５’アームの長さを増加させると、プローブはＥＸＯ−ＳプローブまたはＥＸＯ−Ｒプローブとなることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ａ．定義
本明細書に使用されるように、「サンプル」は、たとえば生物学的サンプルまたは環境サンプル等の試験されることとなる任意の物質とすることができる。生物学的サンプルは任意の生物から得ることができる。一実施形態では、サンプルは、ヒト、コンパニオンアニマル、または家畜等の哺乳動物から得ることができる。サンプルはまた、たとえばトリ等の他の動物から得ることができる。一実施形態では、動物からのサンプルは、鼻咽頭吸引液、血液、唾液、糞便、尿、または任意の他の体液を含む。他の実施形態では、環境サンプルは、たとえば土壌、水、人工建造物の環境および表面等の任意の環境から得ることができる。
【００１７】
本明細書に使用されるように、「増幅標的配列」、「標的配列」、および「核酸標的配列」は、増幅反応、たとえばＰＣＲ増幅技術によるコピーのための鋳型を提供するＤＮＡ配列を区別なく意味する。増幅標的配列は一本鎖とすることができるまたは二本鎖とすることができる。出発物質がＲＮＡ、たとえばメッセンジャーＲＮＡである場合、ＤＮＡ増幅標的配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するための、ＲＮＡの逆転写によって生成され、増幅標的配列はｃＤＮＡ分子となる。したがって、ＲＮＡについてのＰＣＲアッセイでは、ハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ増幅標的配列のコピーとハイブリダイズし、それによってそれを反映し、逆転写によって、増幅標的配列を含むｃＤＮＡ分子を産生したＲＮＡの存在を間接的に表す。増幅標的配列は、その増幅に使用される１対のプライマーによって、典型的に挟まれる。伸長産物または「アンプリコン」は、二本鎖または一本鎖かにかかわらず、プライマー対によって境界を定められる。増幅標的配列は単一の核酸配列とすることができる。ある場合では、しかしながら、増幅標的配列は対立遺伝子の変異または突然変異を含んでよく、したがって、単一の配列ではなくてよい。
【００１８】
本明細書に使用されるように、「Ｔｍ」は、対象の核酸物質の半分が二本鎖形態で存在し、残部が単鎖である温度を指す。歴史的に、プライマー、プローブ、またはアンプリコンのＴｍは、標準的なプライマーの状態および塩濃度での、両方ともよく知られている「％ＧＣ」法（Ｗｅｔｍａｒ，Ｊ．Ｇ．（１９９１）「ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７〜２５９）または「２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）」法を使用する算出値であった。ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、しかしながら、「最近傍」法を使用して（Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１４６０〜１４６５）、式Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒ ｌｎ（Ｃ／２））＋１２．５ ｌｏｇ［Ｍ］−２７３．１５を使用して、Ｔｍを算出することによって（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ，Ｎ．（２００１），「ＭＥＬＴＩＮＧ，Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｕｐｌｅｘ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：１２２６〜７）Ｔｍを決定する際に実際のプライマーおよびプローブの開始濃度を考慮に入れる（Ｓａｎｃｈｅｚら（２００４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１０１：１９３３〜１９３８，およびＰｉｅｒｃｅら（２００５）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１０２：８６０９〜８６１４）。ΔＨはエンタルピーであり、ΔＳはエントロピーであり（ΔＨおよびΔＳの算出の両方は、Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．およびＳａｎｔａ Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１０５８１〜１０５９４に基づく）、Ｃはオリゴヌクレオチドの濃度であり、Ｒは一般気体定数であり、［Ｍ］は一価カチオンのモル濃度である（実施例では０．０７）。この式によれば、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基組成（用語ΔＨおよびΔＳに含有される）、一価塩濃度、ならびにオリゴヌクレオチドの濃度（用語Ｃに含有される）はＴｍに影響を及ぼす。しかしながら、ＰＣＲバッファー中に使用されるマグネシウムまたは他の二価カチオンの濃度はこの式に含まれておらず、二価カチオンはＴｍを増加させることで知られている。本発明者らは典型的に３ｍＭマグネシウムを使用する。これはプローブＴｍを約５℃上げる。したがって、所望されるＴｍが５０℃であり、３ｍＭマグネシウムが使用されることになる場合、マグネシウムなしでのＴｍについての上記の最近傍式は、Ｔｍを４５度とするべきであり、次いで、必要に応じ、プローブの長さまたは組成に対する微量の調整と共に経験的に確認することができる。本発明者は、ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（アナーバー、ＭＩ）の許諾ソフトウェア、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（バージョン６．１．９）ソフトウェアが最近傍式に対するそのような調整を含み、本発明者が経験的に決定したものに近い結果が得られることを見出した。プライマーまたはプローブのＴｍに対する本明細書の言及は、他に述べられない限り、マグネシウム濃度を考慮に入れる値を意味する。
【００１９】
本明細書に使用されるように、「対立遺伝子識別力のある」および「配列特異的」の両方は、完全に相補的な標的配列と選択的にハイブリダイズするおよび１つまたは少数のミスマッチの塩基を有する、密接に関連する配列を強く拒絶する、プローブ（ある場合ではプライマー）の能力を指す。本明細書に使用されるように、「ミスマッチ認容性」は、完全に相補的な配列および１つまたは複数のミスマッチの塩基を有する部分的に相補的な配列の両方とハイブリダイズするプローブ（ある場合ではプライマー）の能力を指す。
【００２０】
本明細書に使用されるように、「単一管」は、試験管、反応ウェル、マイクロフルイディクスデバイス中のチャンバー、スライドガラス、または反応混合物を保持することができる他の装置等のある容器から別の容器にサンプルを移動させずに行うことができる一連の少なくとも２つの操作、たとえばサンプルの調製、増幅、またはシークエンシングを含む方法を指す。
【００２１】
本明細書に使用されるように、「エキソヌクレアーゼ活性」は、ＰＣＲ増幅に使用される、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む耐熱性ポリメラーゼの酵素特性のうちの１つを指す。エキソヌクレアーゼ活性は、３’から５’への消化と別個の５’から３’への消化を指し、これは酵素の校正機能と見なされる。エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ糖リン酸主鎖の切断の正確なモードまたは場所、特に、切断が、５’末端に付けられた成分および末端５’ヌクレオチドの間にまたは末端ヌクレオチドおよび最後から２番目の５’ヌクレオチドもしくは３’末端の下流の１つまたは複数のヌクレオチドの間にあるかどうかを明示することを意味しない。他に述べられない限り、その使用が本明細書に記載されるポリメラーゼはすべて、エキソヌクレアーゼドメインを単独でまたは上流プライマーの３’末端に対する塩基対追加を実行するポリメラーゼドメインと共に含むことが理解される。
【００２２】
本明細書に使用されるように、「プライマー依存的」切断は、ポリメラーゼがプライマーのその伸長の間に出会った、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの切断を指す。伸長鎖上の３’末端−ＯＨ基の存在がプライマー依存的切断に必要とされることが知られている。本明細書に使用されるように、「プライマー依存的」切断はまた、上流のオリゴヌクレオチドの３’ＯＨが、ｄＮＴＰの非存在下でさえ、下流のオリゴヌクレオチド、たとえばハイブリダイズしたプローブの５’末端に取って代わる場合に生じる切断を含む。たとえばリン酸基の化学的追加（キャッピング）および末端２’３’ジデオキシヌクレオチドの存在は、下流のオリゴヌクレオチド中のある種の非天然ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチド間連結のように、プライマー依存的切断を予防することで知られている方法である。
【００２３】
本明細書に使用されるように、「プライマー非依存的」切断は、プライマー依存的切断ではない、ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性による、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの５’から３’への切断を指す。この場合では、ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッドに直接結合し、結合したオリゴヌクレオチドの５’末端を切断する。プライマーもプライマー伸長も含まれない。
【００２４】
本明細書に使用されるように、「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」は、蛍光検出可能な二本鎖アンプリコンを産生するために、およそ十分なＰＣＲサイクルで消耗されて、それ自体は２００ｎＭまでの低濃度で利用される他方のプライマー（「制限プライマー」）と比較して少なくとも５倍過剰の、あるオリゴヌクレオチドプライマー（「過剰プライマー」）を利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを用いる非対称のＤＮＡ増幅を意味し、増幅の開始時の制限プライマーの濃度調整した融解温度、Ｔｍ[0]Lは、増幅の開始時の過剰プライマーの濃度調整した融解温度、Ｔｍ[0]Xよりも５℃を超えて下回ることはなく、好ましくは少なくとも同じくらい高く、より好ましくは３〜１０℃高く、熱性のサイクルは制限プライマーの消耗の後に複数回のサイクルの間、継続されて、一本鎖産物、すなわち、「過剰プライマー鎖」と時に称される、過剰プライマーの伸長産物を産生する。
【００２５】
本明細書に使用されるように、用語「低Ｔｍプローブ」は、その標的に対するハイブリダイゼーション後にシグナルを出す標識ハイブリダイゼーションプローブを意味し、これは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは過剰プライマーの伸長によって産出される過剰プライマー鎖であり、ＬＡＴＥ−ＰＣＲでは制限プライマーである、過剰プライマー鎖とハイブリダイズし、それに沿って伸長する、プライマーのＴｍ[0]よりも少なくとも５℃、より好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍ[0]Pを有する。本明細書に使用されるように、低Ｔｍプローブは直鎖プローブである。
【００２６】
Ｂ．詳細な説明
ＤＮＡ増幅反応での特定の目的のために修飾される標識プローブおよび非標識オリゴヌクレオチドならびに増幅の間にまたは増幅後検出の間に特定の効果を達成するためのそれらの使用が記載される。ＤＮＡ増幅反応、たとえばＰＣＲ増幅はＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む。本明細書に記載されるように、プローブ−標的構造は、ハイブリダイズしたプローブが５’方向にあるよりも３’方向に長い鋳型鎖を含む。したがって、プローブは、可変数のヌクレオチドだけ標的鎖の一本鎖３’末端から陥凹しており、プローブは、標的鎖に完全にマッチし得るまたは可変長の伸長５’アームを有する５’末端を有する。これらの構造的特色を有する単分子ヘアピン分子は、本明細書に記載されるように、構築されたこれらのものをまねるために使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、標的非依存的プローブ切断を呈しないまたは組成物が耐熱性ポリメラーゼに標的非依存的プローブ切断を呈するようにさせる反応混合物中で使用される耐熱性ポリメラーゼでなければならない。「標的非依存的プローブ切断を呈する」とは、オリゴヌクレオチドが、３〜５ヌクレオチド長のループおよび２〜５ヌクレオチド長のステムを有する末端ヘアピンを含有する場合に、また１０分間、酵素の最適な伸長温度を２０℃以下下回る温度で上述の酵素とインキュベートされた場合に、標的配列の非存在下で上述のオリゴヌクレオチドを切断する酵素の能力を意味する。Ｍｎ++を有するビシンバッファー中のＺＯ５ポリメラーゼは標的非依存的プローブ切断を呈する酵素の例である。対照的に、Ｍｇ++を含有し、ナトリウムＴｒｉｓで緩衝した反応混合物中のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、標的非依存的プローブ切断を呈しない酵素の例である。本明細書に記載される方法は、標的非依存的プローブ切断を呈しないポリメラーゼの使用を含むことを理解されたい。酵素が標的非依存的プローブ切断を呈するかどうかは、プローブの５’末端に５’ヌクレオチドが伸長したプローブの使用により確立することができ、上述の伸長により、７０℃よりも高い温度での自己アニーリングによって２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成する。標的非依存的プローブ切断を呈しない酵素は、リアルタイムＰＣＲまたは終末点等温条件もしくは終末点変動温度条件でこれらのヘアピンプローブを切断することができない。
【００２８】
本明細書に記載されるプローブは、標的アンプリコン鎖とハイブリダイズし、プライマーの中間に位置し、プローブが含まれる増幅反応の平均プライマーアニーリング温度を少なくとも５℃、好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍ[0]を有する低温プローブである、構造上修飾された直鎖またはランダムコイルのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブである。増幅反応がたとえば３段階温度ＰＣＲ反応である場合、増幅の後の最後にまたはＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の線形期の間等のいくつかの増幅サイクルの間に低温ステップが加えられなければ、プローブはハイブリダイズしない。切断されていないプローブは、好ましくはＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤等の非蛍光消光剤またはＱＳＹ ７もしくは９等の別の消光剤によって、プローブが溶液中で遊離している場合に消光される蛍光体を有する２重標識蛍光プローブである。Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ノバート、ＣＡ（米国）の知的所有権付き消光剤である。ＱＳＹ消光剤はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ（米国）から入手可能である。切断されているプローブもまた２重標識蛍光プローブであってもよいが、その必要はない。切断されたプローブについては、必要とされることは、いずれにせよ、断片上の標識または断片のいくつかの特性、たとえば重量もしくはサイズまたはたとえば色の形成を引き起こす等の検出可能な働きを行うための能力を用いて、切断されたプローブ断片を検出することである。この最後の場合では、切断の検出は間接的である。
【００２９】
本明細書に記載されるブロッキングオリゴヌクレオチドは、プライマーに対して下流（３’）にハイブリダイズし、非標識である修飾された直鎖オリゴヌクレオチドである。
【００３０】
ある種類の修飾されたハイブリダイゼーションプローブは、増幅に先立ってＰＣＲ反応混合物に添加した場合に、等温プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断を増強するように構造が修飾されたプローブである。そのようなプローブを「エキソ感受性」、または略してＥＸＯ−Ｓプローブと称する。それは、プローブが使用される増幅反応で平均プライマーアニーリング温度を少なくとも５、好ましくは少なくとも１０℃下回るＴｍを有する直鎖またはランダムコイルのＤＮＡプローブである。等温プライマー非依存的切断条件にかけられた場合、それは、対応する非修飾のプローブの少なくとも２倍速く、好ましくは５倍速く、より好ましくは少なくとも１０倍速く切断される。
【００３１】
一実施形態では、プローブをエキソ感受性にする修飾は、少なくとも３つの連続した、好ましくは３つを超える、最も好ましくは６つの連続したメチレン（ＣＨ2）基からなる鎖による、少なくとも１つの標識成分、たとえばプローブの５’末端に対する蛍光体または非蛍光消光剤の共有結合を含む。前記メチレン鎖の前に、５’ヌクレオチドに連結された端で、カルボキシル基、アミン、アミド、または別のかさ高い化学基を置くことはできないが、連続したメチレン基の前記鎖の前に、エーテル基（−Ｏ−）を置く（５’ヌクレオチドに連結された端で）ことができることが予想される。他の実施形態では、プローブの５’末端での修飾は、ハイブリダイズしたプローブのすぐ「上流」（３’）の標的のヌクレオチドに対して相補的ではない追加のヌクレオチドからなる。この修飾はまたプローブの５’末端での１塩基「アーム」として記載することもできる。ＥＸＯ−Ｓプローブは、５’アームを有していなくてもよい、すなわち、標的に対して相補的ではないヌクレオチドはないまたは多くても、５ヌクレオチド未満、好ましくは１ヌクレオチドだけの短いアームを有していてもよい。ＥＸＯ−Ｓプローブは、その標的鎖の３’末端から６ヌクレオチド、好ましくは３’末端から１０〜３０ヌクレオチドを超えて配置されるハイブリッドを形成するように設計されるべきである。端から４０ヌクレオチドを超えるハイブリッドは、プローブの標的非依存的等温切断を遅くするので、それほど好ましくない。当業者は十分に理解するであろうが、その特異的標的の３’末端に対して特定のＥＸＯ−Ｓプローブを位置づけるための最適な場所は、プローブが用いられる増幅反応の正確な条件および組成物に依存する。最も重要な因子は、ＥＸＯ−Ｓプローブの上流の制限プライマーの長さおよびプローブされることとなる標的配列の塩基組成である。すべての場合で、しかしながら、ＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端は、制限プライマーが消耗される前に制限プライマーの３’末端がハイブリダイズする標的鎖上の場所と重複するべきでない。言い換えれば、制限プライマーの３’末端に相補的な標的鎖上の塩基は、プローブの５’末端またはＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端上のアームの５’末端の少なくとも２塩基上流とするべきである。
【００３２】
本明細書に記載される方法は、エキソ感受性プローブの存在下で少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅することを含み、増幅プロセスは、伸長によりプローブに相補的なアンプリコン鎖を産出するプライマーが消耗されるまで、プローブがハイブリダイズするであろう低温ステップを含まない、すなわち、プローブのＴｍを下回る温度でのインキュベーションを含まない。ＰＣＲ増幅で使用される場合、ＥＸＯ−Ｓプローブは、低温検出ステップを有しないサイクルの間にアンプリコンとハイブリダイズしない。制限プライマーの消耗の後の増幅サイクル中に、すなわち、プローブが相補的な一本鎖過剰プライマーアンプリコン鎖を産出するサイクル中に低温検出ステップを含む非対称のＰＣＲ法により、プローブはハイブリダイズし、プライマー非依存的様式で切断され、それによって、プローブによって産出されたシグナルを増幅する。増幅後低温検出ステップのみが含まる場合、蛍光体および消光剤、好ましくは非蛍光消光剤を含有する２重蛍光標識プローブからのシグナルはまた、３０分以上生じ続けることがあり、繰り返しのハイブリダイゼーションおよび切断が、リアルタイム検出と同様にそのような終末点検出で起こることを示唆する。このため、終末点での読み取りは、所定の時間、好ましくは少なくとも１分後に、より好ましくは少なくとも２分後になされるべきである。たとえば、プローブが蛍光体および消光剤で標識される場合、繰り返しのハイブリダイゼーションおよび切断は、非消光断片の産生の増加および蛍光発光シグナルの増幅をもたらす。そのような方法は、プローブ切断の均一な検出を含む。
【００３３】
本明細書に記載される別の種類のプローブは、増幅に先立ってＰＣＲ反応物に添加された場合に、プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断に抵抗するように構造が修飾されたプローブである。そのようなプローブを「エキソ抵抗性」プローブまたは略してＥＸＯ−Ｒプローブと称する。エキソ抵抗性プローブは低温プローブである。エキソ抵抗性プローブはプライマー依存的エキソヌクレアーゼ切断に抵抗性である必要はない。しかしながら、ある実施形態は、プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断およびプライマー依存的５’エキソヌクレアーゼ切断の両方に抵抗性である。エキソ抵抗性プローブは、蛍光体および消光剤で標識され、相補的な標的鎖とハイブリダイズされ、等温プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断条件にかけられた場合に、蛍光発光での測定可能な発生はなく、２５分間の期間にわたって１０％以下であるといった程度までプライマー非依存的切断に抵抗する。いくつかの実施形態は、下記に記載されるように、プローブ−標的Ｔｍのあたりの急速な熱変動にかけられた場合でも抵抗性のままであるが、他の実施形態は、そのような変動によって切断されて、増幅されたシグナルを産出することができる。エキソ抵抗性プローブは、その非修飾構造が標識されたまたは非標識であるＤＮＡオリゴヌクレオチドである、直鎖またはランダムコイルのハイブリダイゼーションプローブである。プローブをエキソ抵抗性にするための１つの修飾は、標識成分、たとえば蛍光体または非蛍光消光剤を５’末端ヌクレオチドにメチレン鎖以外のものによって連結することである。プローブをエキソ抵抗性にするための別の修飾は、プローブの標的とハイブリダイズしない２〜７つのヌクレオチドを含む５’末端アームを追加することである。プローブをエキソ抵抗性にするための別の修飾は、プローブの５’末端にヌクレオチド伸長を追加することであり、上述の伸長により、７０℃よりも高い温度での自己アニーリングによって２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成する。これらの５’ヘアピンもまた変動温度誘発性の切断に抵抗する。
【００３４】
本明細書に記載される方法は、非対称のＰＣＲ増幅方法、好ましくはエキソ抵抗性プローブの存在下でのＬＡＴＥ−ＰＣＲ法によって少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅することを含み、増幅プロセスは、プローブがハイブリダイズする低温ステップを制限プライマーの消耗の後まで含まない。ＰＣＲ増幅で使用される場合、ＥＸＯ−Ｒプローブは、低温検出ステップを有しないサイクルの間にアンプリコンとハイブリダイズしない。増幅の後にまたは非対称の方法については制限プライマーの消耗の後に低温検出ステップを含むＰＣＲ法により、プローブはハイブリダイズする。検出が等温である、すなわち、プローブのＴｍのあたりの急速な温度変動がない場合では、プローブは切断されないであろう、また、そのシグナルはハイブリダイゼーションのみから起きる。そのような実施形態では、プローブは、ハイブリダイゼーション後に検出可能なものを発しなければならない。検出が終末点であり、プローブのＴｍのあたりの急速な熱性の変動、たとえば、Ｔｍの５℃上〜５℃下または好ましくは１０℃上〜１０℃下を含み、各変動サイクルは３０秒間以下である場合、ある実施形態は、上記に述べられるようにプライマー非依存的様式で切断されるが、他の実施形態は切断されない。プライマー非依存的様式での急速な変動による切断は、プローブシグナルが産出される速度を増加させる。これらの実施形態では、エキソ感受性プローブについて上記に記載されるように、切断はシグナルを直接または間接的に産出する。任意の所与の時点でのシグナルの大きさは、切断の速度および反応中のプローブの全体量に依存する。たとえば、プローブが蛍光体および消光剤で標識される場合、繰り返しの変動は、すべての利用可能なプローブが切断されるまで、非消光蛍光体含有断片の産生の増加および蛍光発光シグナルの増幅をもたらす。そのような方法は、プローブハイブリダイゼーションまたはプローブ切断の均一な検出を含む。
【００３５】
相補鎖とハイブリダイズし、プライマー依存的５’ヌクレアーゼ切断およびプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断の両方に抵抗性のハイブリッドを形成する、構造上修飾されたオリゴヌクレオチドもまた本明細書に記載される。時に、そのようなオリゴヌクレオチドをＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドと称する。ＥＸＯ−Ｎは、ＥＸＯ−Ｎが使用されるＰＣＲ増幅反応、対称ＰＣＲ増幅または非対称のＰＣＲ増幅のいずれかのプライマー伸長ステップの間に、プライマーのうちの一方から下流の標的鎖とハイブリダイズするのに十分に高いＴｍを有する直鎖オリゴヌクレオチドである。ＥＸＯ−Ｎはプライマー伸長の間にポリメラーゼによって切断されないので、ＥＸＯ−Ｎは、ハイブリダイズした鎖の伸長を阻害し、それによってその鎖の増幅を非効率にする。オリゴヌクレオチドをＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドにする直鎖オリゴヌクレオチドの１つの修飾は、オリゴヌクレオチドの標的に相補的ではない直鎖オリゴヌクレオチドの５’末端にオリゴヌクレオチド伸長を追加することであり、そのような伸長は、２〜５ヌクレオチド長のステムを有し、少なくとも７０℃のＴｍを有するヘアピン構造を形成する。
【００３６】
本明細書に記載される方法は、本来なら使用されるプライマー対によって増幅されるはずである、考えられる１つの標的対立遺伝子に特異的なＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドの存在下で対称または非対称のＰＣＲ増幅反応を行い、それによって、ＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドがプライマー伸長の間にハイブリダイズしない１つまたは複数の代替の対立遺伝子の変異体配列の増幅を促進するステップを含む。本明細書に記載される方法はまた、所望される時点で、すなわち２回以上の熱サイクル後に、一方の鎖、プラス鎖またはマイナス鎖の増幅を非効率にし、それによって、続いて起こるサイクルで他方の鎖の増幅を促進するために、対称ＰＣＲ増幅反応にＥＸＯ−Ｎオリゴヌクレオチドを挿入するステップを含む。
【００３７】
一方のプライマー、過剰プライマーは、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１で、他方のプライマー、制限プライマーと比較して実質的に過剰に存在する、ＤＮＡ増幅標的配列（ｃＤＮＡ配列を含む）についてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるＤＮＡ増幅、特に、非対称ＰＣＲおよびＬＡＴＥ−ＰＣＲ等の非対称のＰＣＲ法が記載される。好ましい増幅方法は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲであるが、他の方法を使用することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、その方法は、修飾された低温ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを利用する。ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、それらの標的に相補的な非伸長性のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、標的は、この場合では、ＰＣＲ増幅反応によって産生されたアンプリコンである、過剰プライマーの伸長産物（過剰プライマー鎖）中のＤＮＡ配列である。非修飾のプローブは、プローブの標的相補的配列であるＤＮＡのストレッチであるまたはそれを含有する。プローブの標的相補的配列は、反応中で産生され得る過剰プライマー鎖に完全に相補的であってもよく、反応中で産生され得る少なくとも１つの過剰プライマー鎖に不完全に相補的であってもよく、またはその両方であってもよい。プローブは、完全に相補的な標的に対して、不完全に相補的な標的に対するよりも高いＴｍ（ＬＡＴＥ−ＰＣＲの場合、Ｔｍ[0]）を有する。たとえば、プローブが５５℃の、完全に相補的な標的に対してＴｍを有するように設計される場合、１つまたは複数のミスマッチ塩基、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド挿入を含有する標的に対するそのＴｍは、時に１０℃以上低くなる。これは、プローブが、形成された１つまたは複数のハイブリッドのＴｍによって標的を区別することを可能にする。すべての実施形態で、プローブは低温プローブである。
【００３９】
プローブを利用する非対称のＰＣＲ法は、開始増幅反応混合物中にプローブを含み、プライマー、ｄＮＴＰ、バッファー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸出発物質がＲＮＡである場合、逆転写酵素もまた含む。増幅の間にまたはその最後に切断されないあらゆるプローブは、ハイブリダイゼーション後に検出可能な蛍光シグナルを発する２重蛍光標識プローブであろう。適した標識手法が当技術分野で知られている。好ましい標識は、一方の末端に共有結合された蛍光体および他方の末端に共有結合された非蛍光消光剤であるが、他の標識法を使用することができる。入手可能なＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＭＩ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤、ＱＳＹ消光剤、Ｄｅｅｐ Ｄａｒｋ消光剤、および他を含む多数の消光剤が当技術分野で知られている。検出の一部として切断されることとなるあらゆるプローブもまた同様に標識されてもよいが、その必要はない。そのようなプローブに必要とされることは、切断が検出可能であるということであり、したがって、プローブは、検出可能な標識で別々に標識することができるまたはプローブは非標識とすることができる。
【００４０】
使用されるプローブは、ＰＣＲ増幅の間に、すなわちリアルタイム検出でまたは増幅の後に、すなわち終末点検出で標的とハイブリダイズした場合のそれらのプライマー非依存的等温５’ヌクレアーゼ切断を増強するまたは実質的に排除するように修飾される直鎖またはランダムコイルのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとすることができる。示されるように、増強された切断性を有するプローブをエキソ感受性またはＥＸＯ−Ｓプローブと称し、また、切断に抵抗性のプローブをエキソ抵抗性またはＥＸＯ−Ｒプローブと称する。ＥＸＯ−Ｒプローブは、２５分間の等温プライマー非依存的切断条件にかけられた場合、実質的に未切断のままである。いくつかのＥＸＯ−Ｒプローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍのあたりの急速な温度変動によって切断することができるが、他のものはそのような変動にさえ抵抗する。検出が制限プライマーの消耗後に起こり、したがって、起こるあらゆる切断はプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ酵素活性によるものである。ＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブは低温プローブである。
【００４１】
ランダムコイルＤＮＡプローブをＥＸＯ−Ｓプローブにするためのそのプローブに対する修飾は、プローブの標的に相補的ではない５’ヌクレオチドを追加することおよびプローブの５’ヌクレオチドに標識成分を、好ましくは蛍光成分を少なくとも３つの、好ましくは６つのメチレン基のメチレン鎖によって連結することである。
【００４２】
ランダムコイルＤＮＡプローブをＥＸＯ−Ｒプローブにするためのそのプローブに対する修飾は、それらの５’末端の構造的修飾に基づいた３つのクラスがあると考えることができる：
クラス（１）５’末端が完全に相補的な標的配列とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対するある非核酸化学成分の追加；
クラス（２）プローブの５’末端が標的配列に相補的ではなく、したがって、１つまたは複数の塩基について伸長された一本鎖「アーム」を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対する１つまたは複数の非相補的ヌクレオチドの追加；
クラス（３）５’末端の一本鎖「アーム」が、３〜５つのヌクレオチドのステムおよび＞７０℃の自己アニーリングＴｍを有する、ヘアピン構造を形成するような、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に対する複数の非相補的ヌクレオチドの追加。
【００４３】
図１は、比較のための例示的な５’ヌクレアーゼプローブと共に各クラスのＥＸＯ−Ｒプローブの例を示す。図２は、クラス（１）〜（３）のプローブについての例示的な切断メカニズムを示す。
【００４４】
Ｔａｑシステムでは、たとえば、いくつかのクラス（１）およびクラス（２）のＥＸＯ−Ｒプローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍが伸長プライマーの通り道でのプローブ結合を回避するのに十分に低くなかった場合、プライマー依存的切断によって切断され得る。対照的に、クラス（３）プローブは、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍが伸長プライマーの通り道でのプローブ結合を回避するのに十分に低くなかった場合、伸長プライマーによって切断されず、またプライマー伸長を非効率にする。
【００４５】
特定の修飾されたランダムコイルプローブがＥＸＯ−ＳかＥＸＯ−Ｒプローブかどうか決定するために、その切断性を、等温プライマー非依存的切断条件が後続するＰＣＲ増幅反応条件にかけられた場合の、対応する非修飾のプローブのものと比較することができる。ＥＸＯ−ＲプローブがそのＴｍのあたりの急速な温度変動によって切断可能かどうか決定するために、その切断を、温度サイクルの時間または数の関数としてプロットすることができる。
【００４６】
述べられたように、ＥＸＯ−Ｓプローブ法およびＥＸＯ−Ｒプローブ法は、非対称のＰＣＲ増幅およびハイブリダイズされたプローブの検出または切断されたプローブ断片の検出である。プローブが、ハイブリダイズされたことによりまたは切断されたことにより、検出可能なシグナル、たとえば蛍光シグナルを発する場合、検出は、変動を含んでいてもよくまたは含んでいなくてもよい低温検出ステップの手段を用いて増幅反応の間に（リアルタイム）または反応の完了後に（終末点）行うことができる。そのようなプローブでの検出はまた、プローブ−標的ハイブリッドについての融解曲線の生成を含んでいてもよい。
【００４７】
以下の説明は、同じまたは異なる標識を有するいくつかのＥＸＯ−ＳプローブまたはいくつかのＥＸＯ−Ｒプローブを、そのような反応物が産出する情報量を増加させるために、多重ＰＣＲ反応物にどのように添加することができるかを示す。同様の結果は、同じ反応中でＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブを組み合わせることにより達成することができる。
【００４８】
多重非対称のＰＣＲ反応は、それぞれ異なる標的配列に対するいくつかの対のプライマーを使用するように構築することができる。結果として生じる一本鎖アンプリコンのそれぞれは、一本鎖標的アンプリコン中のその相補的配列との１つまたは複数のＥＸＯ−Ｓプローブのハイブリダイゼーションを達成するために反応の間にまたは反応の最後に温度を低下させることにより検出することができる。ＥＸＯ−Ｓプローブのそれぞれが、異なった色の蛍光体でまたは固有の分子量もしくは電気的なサインを有する異なる成分で標識される場合、それぞれのプローブ−アンプリコンハイブリッドはその固有のシグナルを産出する。しかしながら、２つのＥＸＯ−Ｓプローブはまた、それらが異なる温度でプローブ−アンプリコンハイブリッドを形成することを条件として、同じシグナル基で標識することができる。同様に、ＥＸＯ−Ｓプローブは、同じ色だが区別可能に異なるＴｍのＥＸＯ−Ｒプローブと共に使用することができ、この場合には、プローブのうちの一方のみがプローブおよびアンプリコンの等温インキュベーションの間に切断され、第２のプローブは続いて起こるまたは先の温度の変動の間に切断されるので、ＥＸＯ−Ｒプローブが温度変動によって切断可能である場合、区別を高めることができる。
【００４９】
ＥＸＯ−Ｓプローブを用いて別個のシグナルを産出する可能な標的のレパートリーは、Ｋｒａｍｅｒ（米国特許第６１５００９７号）によって記載される「Ｃｏｌｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｔ Ｃｏｄｉｎｇ」の原理を利用することによりさらに高めることができる。この場合では、各アンプリコン、ユニーク配列または対立遺伝子変異体のいずれかは、２つまたは３つの異なる５’標識で標識されたそれ自体のＥＸＯ−Ｓプローブで標的にされる。したがって、プローブ−アンプリコンハイブリッドが形成され、切断された場合、２つまたは３つの標識は切断を介して放出される。Ｋｒａｍｅｒによって記載されるように、２つまたは３つのグループで複数の標識を組み合わせるための複数の方法がある。
【００５０】
同様に、多重非対称ＰＣＲ反応は、温度が反応の間にまたはその最後に低下する場合に、複数のＥＸＯ−Ｒプローブで検出される複数の一本鎖アンプリコンを産出するためにいくつかの対のプライマーを使用して構築することができる。この場合では、各ＥＸＯ−Ｒプローブは異なる色の蛍光体で標識することができる。加えて、各ＥＸＯ−Ｒプローブは、その長さに依存して、配列特異的、つまり対立遺伝子識別力があるまたはミスマッチ認容性とすることができる。この場合では、プローブ−アンプリコンハイブリダイゼーションを区別するための最良の方法は、反応の温度が、あらかじめ設定された低温から徐々に低くなるまたは徐々に増加する融解曲線分析を行うことである。これらの状況下で、各ＥＸＯ−Ｒプローブはその固有の融解プロフィルを表し、同じ色の２つのＥＸＯ−Ｒプローブの組合せは複合融解曲線をもたらす。加えて、温度変動は、プローブのうちの一方のみのシグナルを変化させるので、温度変動に抵抗性のＥＸＯ−Ｒプローブおよび温度変動に感受性のＥＸＯ−Ｒプローブは多重化することができる。
【００５１】
ＥＸＯ−Ｒプローブを用いて別個のシグナルを産出する可能な標的のレパートリーは、Ｋｒａｍｅｒ（米国特許第６１５００９７号）によって記載される「Ｃｏｌｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｔ Ｃｏｄｉｎｇ」の原理を利用することによりさらに高めることができる。この場合では、各アンプリコン、ユニーク配列または対立遺伝子変異体のいずれかは、２つまたは３つの異なる５’標識で標識されたそれ自体のＥＸＯ−Ｒプローブで標的にされる。したがって、プローブ−アンプリコンハイブリッドが形成され、融解される場合、そのハイブリッドは２つまたは３つの色で同じ融解曲線を産出する。Ｋｒａｍｅｒによって記載されるように、２つまたは３つのグループで複数の標識を組み合わせるための複数の方法がある。
【００５２】
ＥＸＯ−ＳプローブおよびＥＸＯ−Ｒプローブを使用する別の手段は、シングル多重非対称ＰＣＲ反応中でそれらを組み合わせることを含む。この場合では、異なるプローブは、融解曲線分析または切断分析のいずれかによって異なる一本鎖アンプリコンを検出することができる。たとえば、反応の温度を低下させるので、ミスマッチ認容性ＥＸＯ−Ｒプローブは、固有の融解曲線を産出する有色の蛍光体で標識することができる。その標的へのＥＸＯ−Ｒプローブの最大の結合が低温で達すると、反応温度は、その標的に対して同じ色であってもよく、その標的に対するＥＸＯ−ＲプローブのＴｍよりも低いＴｍを有するＥＸＯ−Ｓプローブのハイブリダイゼーションおよび等温または変動温度依存性の切断を達成するためにさらに低下させることができる。ＥＸＯ−Ｓプローブ切断産物の検出は低温で実行することができるが、好ましくはより上の温度、たとえば、ＥＸＯ−ＳプローブもＥＸＯ−Ｒプローブもその標的とハイブリダイズしない７０℃で実行される。これらの各直鎖プローブ上に消光剤が存在するので、ＥＸＯ−Ｓプローブの５’末端から切断された蛍光体のみが、そのより上の温度でバックグラウンドを上回るシグナルを産出する。
【実施例】
【００５３】
実施例１（図４）
本実施例は、ここで使用される条件下で、ポリメラーゼＺＯ５がプライマー非依存的抵抗性を呈しないことを実証する。
【００５４】
増幅反応は、１×ＲＴ−ＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）、５０ｍＭビシン／ＫＯＨ、ｐＨ８．２（２５℃）、１１５ｍＭ Ｋ−酢酸、８％グリセロール（ｖ／ｖ）、および３ｍＭ酢酸マンガン（Ｍｎ ＯＡｃ2）をそれぞれ含有する。ＺＯ５ポリメラーゼ濃度は反応当たり２００ユニットとし、プローブは０．５μＭとし、相補的標的は１．５μＭとする。反応は等温とし、５２℃で実施する。蛍光発光データは２０秒間隔で１５分間収集する。反応はＡＢＩ社製７７００サーモサイクラーを使用して実施する。
【００５５】
以下のプローブおよびそれらの相補的標的を使用した：
プローブ名 配列（５’−３’）
直鎖FT(アームなし) Fam-CCATGATACAAGCTTCC-BHQ1
直鎖FT BHQ5' BHQ1-CCATGATACAAGCTTCC-Fam
直鎖FT(5'3'アーム) Fam-TTTTTTCCATGATACAAGCTTCCTTTTTT-BHQ1
0-4-0 MW-BG Fam-CGGTGAAACCGCGCCTGCAATATACAGC-BHQ1
標的名
FT標的 ACTTAGTAATTGGGAAGCTTGTATCATGGCACTTAGAAC
BG標的 AAAAAAGCTGTATATTGCAGGCGAAAAAA
【００５６】
以下のプローブ−標的の組合せを試験した（各２通り）。カットが最も速い速度の２つ（４１）の線は、ＦＴ標的＋６つの非相補的ヌクレオチド（すべてＴ）の５’３’アームを有する直鎖ＦＴプローブである。カットが２番目に速い速度の２つ（４２）の線（赤線）は、ＦＴ標的＋５’３’アームなしの直鎖ＦＴプローブである。２つ（４３）の線は、ＢＧ標的＋４ｂｐステムおよび３塩基ループを有する５’ヘアピンを含有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブである。上記のプローブの３つはすべて５’ＦＡＭ蛍光体を有する。
【００５７】
２つ（４４）の線は、ＦＴ標的＋５’３’アームなしの直鎖ＦＴプローブであるが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ消光剤１が５’末端上にある。
【００５８】
２つ（４５）の点線は、５’ヘアピンを有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブであるが、ＢＧ標的を反応物に添加しなかった。
【００５９】
図４に示される結果は、これらの条件下で、ポリメラーゼＺＯ５が、ＢＧ標的の非存在下でさえ、５’ヘアピンを有する０−４−０ ＭＷ−ＢＧプローブを切断することを実証する。すべての他のプローブは、それらの標的配列の非存在下で切断されなかった（結果は示さず）。したがって、これらの結果は、これらの条件下のポリメラーゼＺＯ５が標的非依存的プローブ切断を呈することを実証する。この結論は、これらの条件下で、ポリメラーゼＺＯ５はまた、６つの非相補的ヌクレオチド（すべてのＴ）の５’３’アームを有する直鎖ＦＴプローブがそのＦＴ標的に結合した場合に、このＥＸＯ−ＲプローブはＴａｑポリメラーゼによって切断されないが、その直鎖ＦＴプローブを切断した事実によって支持される。
【００６０】
実施例２（図５（Ａ〜Ｄ））
本実施例では、標的非依存的プローブ切断を呈する酵素ＺＯ５ポリメラーゼ（実施例１）は、ＥＸＯ−Ｒプローブを切断するが、標的非依存的プローブ切断を呈しないプラチナＴａｑポリメラーゼは、ＥＸＯ−Ｒプローブを切断しないことを示す。図５は、唯一の変更を重合反応中で使用される酵素とする同じ反応条件下での、各実行を１０，０００コピーで始めた、Ｈ５およびＨ３のインフルエンザ遺伝子の検出についての４回の実験の結果を示す。Ｈ５遺伝子は５’ＴＥＴ ＥＸＯ−Ｒプローブ（実線）によって検出し、Ｈ３遺伝子は５’ＦＡＭ ＥＸＯ−Ｒプローブ（破線）によって検出する。ＮＴＣ値は点線で示す。
【００６１】
図５Ａは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅についてＺＯ５酵素を用いた結果を示し、ＴＥＴプローブおよびＦＡＭプローブの両方を用いた（５１）はＴＥＴプローブ蛍光発光の、（５２）はＦＡＭプローブ蛍光発光の、および（５３）はＮＴＣの結果である。
【００６２】
図５Ｂは、プローブの融解を示し、ＦＡＭおよびＴＥＴのプローブの両方について、（５４）はＴＥＴプローブ蛍光発光の、（５５）はＦＡＭプローブ蛍光発光の、および（５６）はＮＴＣの結果である。
【００６３】
図５Ｃは酵素としてプラチナＴａｑポリメラーゼを使用したＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の結果を示し、ＴＥＴおよびＦＡＭのプローブの蛍光発光で、（５７）はＴＥＴプローブ蛍光発光、（５８）はＦＡＭプローブ蛍光発光、および（５９）はＮＴＣである。
【００６４】
図５Ｄは、プローブの融解を示し、ＴＥＴおよびＦＡＭのプローブの蛍光発光で、（５１０）はＴＥＴプローブ蛍光発光、（５１１）はＦＡＭプローブ蛍光発光、および（５１２）はＮＴＣである。
【００６５】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲはＺＯ５の実施例（図５Ａ）でより効率的に見え、Ｃｔ値は両遺伝子について２９であり、一方、プラチナＴａｑ（図５Ｃ）については、Ｃｔ値は３０（Ｈ５）および３３（Ｈ３）である。しかしながら、２つの融解曲線によって示されるようにこれは事実ではない。ＺＯ５反応中でのＴＥＴプローブ（５４）は完全にカットされていき、反応中に遊離ＴＥＴを放出するが、ＺＯ５を用いたＦＡＭプローブ（５５）は部分的にカットされる。これは図６Ｂに見ることができ、ＺＯ５反応プローブ融解曲線で、プローブがもはや標的に結合しなくなると、プローブ蛍光発光（５４、５５）はＮＴＣ蛍光発光値（５６）に達する。これもまた増幅でのＣｔ値をより低くする。結果は、プラチナＴａｑ反応で全く異なり（図５Ｄ）、プローブがもはや標的に結合しなくなると、プローブ融解曲線は遊離ＴＥＴ（５１０）またはＦＡＭ（５１１）を示さない。したがって、遊離ＦＡＭまたはＴＥＴが検出されないので、Ｃｔ値（図５Ｃ）はより後になる。
【００６６】
ＥＸＯ−Ｒプローブ：
5' TET-CACTAGGGAACTCGCTG-BHQ1 3', Tm=52.7 (H5)
5' FAM-CGTTTCTCGAGGTCCTGCG-BHQ1 3', Tm=54.5 (H3)
制限プライマー：
5' AAGGATAGACCAGCTACCATGATTGCC 3', Tm=66.8 (H5)
5' CGTTGTATGACCAGAGATCTATTTTAGTGTCCT 3', Tm=67.9 (H3)
過剰プライマー：
5' ATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGG 3', Tm=63.6 (H5)
5' CCATCAGATTGAAAAAGAATTCT 3', Tm=62.7 (H3)
【００６７】
反応条件（ミリモル（ｍＭ）またはマイクロモル（μＭ）での濃度、マイクロリットル（μＬ）での容量）：
１０×ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ制限プライマー ２× ０．１２５μＬ
１００μＭ過剰プライマー ２× ０．２５０μＬ
１０μＭプローブ ５００ｎＭ ２× １．２５μＬ
１０μＭ Ｃ３ Ｐｒｉｍｅｓａｆｅ ５００ｎＭ １．５０μＬ
混合合計： ９．３７５μＬ
ＺＯ−５(5ユニット),プラチナＴＡＱ(1.25ｕ)： 1.0/0.25最終ユニット
水： 12.625μＬまたは13.375μＬ
ＤＮＡアンプリコン（10,000コピー／μＬで２） ２．０
合計容量： ２５．０μＬ
【００６８】
熱性条件：（アニーリングＺＯ−５＝５８℃、Ｔａｑ＝６２℃）
段階１：９５℃／３：００分間
段階２：（９５℃／１０秒間：５８℃または６２℃、１５秒間：７２℃、３０秒間）２０回繰り返す
段階３：（９５℃／１０秒間−５８℃または６２℃／１５秒間−７２℃／３０秒間−４５℃／２０秒間）３０回繰り返す
段階４：融解３５℃〜９４℃
【００６９】
実施例３（図７Ａ〜Ｉ）
プライマー依存的およびプライマー非依存的ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応でのＥＸＯ−Ｎプローブ
本実施例では、５’ヘアピンＥＸＯ−ＲプローブはＬＡＴＥ−ＰＣＲサイクルの最初のサイクルの間にプライマー依存的様式でＴＡＱポリメラーゼによって切断されず、制限プライマーが消耗された場合にプライマー非依存的様式で切断されないことを示す。さらに、使用されるＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーの対のＴｍに依存して、ＥＸＯ−ＲプローブはＢＧ標的の増幅を非効率にする。結果を図７Ａ〜Ｉに示す。
【００７０】
図７Ａ〜Ｃは、高Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ａ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｂ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｃ 終末点融解曲線分析（（７３）標的ありのプローブ、（７４）プローブのみ）。図７Ｄ〜Ｆは、中間Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ｄ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｅ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｆ 終末点融解曲線分析（（７７）標的ありのプローブ、（７８）プローブのみ）。図７Ｇ〜Ｉは、低Ｔｍプライマー対についての結果を示す：図７Ｇ ９５℃でのリアルタイム分析、図７Ｈ ４５℃でのリアルタイム分析、図７Ｉ 終末点融解曲線分析（（７１１）標的ありのプローブ、（７１２）プローブのみ）。
【００７１】
図７Ａ、７Ｄ、７Ｇは、プローブのシグナルが、あらゆるプライマー対を用いても５０サイクルにわたって９５℃で変化しないことを示す。この結果は、ＥＸＯ−Ｒプローブがプライマー依存的メカニズムによってカットされなかったことを示し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲの間にＥＸＯ−Ｒプローブがプライマー非依存的切断によってカットされなかったことをさらに示す。図７Ｂ、７Ｅ、７Ｈは、３つのプライマー対についての７２℃での伸長ステップの後の４５℃でのプローブ蛍光発光のリアルタイムの結果を示す。高Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｂ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは結合せず、増幅をブロックしない。中間Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｅ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは、Ｃｔの遅延およびシグナル強度の減少に見られるように増幅をブロックし始める。低Ｔｍプライマー対の場合には（図７Ｈ）、ＥＸＯ−Ｒプローブは、Ｃｔの大幅な遅延およびシグナル強度の大幅な減少に見られるように増幅を著しく阻害する。図７Ｃ、７Ｆ、７Ｉは、プライマー実施例のそれぞれについてのＥＸＯ−Ｒ ＦＡＭプローブ３５℃〜９４℃の融解曲線を示す。７Ｃでは、最大量のＰＣＲ産物が示されるが、７Ｆは、ＥＸＯ−Ｒプローブのブロッキング能力によりより少量が示され、（７Ｉ）では、産生されるＰＣＲ産物はほとんどない。融解曲線はＬＡＴＥ−ＰＣＲ後に描くので、遊離ＦＡＭは検出されず、プローブがプライマー依存的または非依存的様式でカットされなかったことを示す。黒色の実線は、１０，０００コピーのＢＧ開始コピーを用いた反応を示し、一方、黒色の点線はＮＴＣを示す。
配列：
制限プライマー：
TGCGTTCTGACTGAACAGTGATCGAG, Tm=72℃ (高Tmプライマー対)
TTCTGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=64℃ (中間Tmプライマー対)
TGACTGAACAGCTGATCGAG, Tm=61℃ (低Tmプライマー対)
過剰プライマー：
CCCTCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=66℃ (高Tmプライマー対)
TCTTGAAATTCCCGAATGG, Tm=61℃ (中間Tmプライマー対)
TTGAAATTCCCGAATGG, Tm=58℃ (低Tmプライマー対)
ＥＸＯ−Ｒプローブ０４０１７：
5' FAM-CGCTGAAAGCGCGCCTGCAATTTACAGC-BHQ1, 3' Tm=60C
【００７２】
反応条件：マイクロリットル（μＬ）
１０× ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ 制限プライマー ５０ｎＭ ０．１２５μＬ
１００μＭ 過剰プライマー １０００ｎＭ ０．２５０μＬ
１０μＭ EXO-Nプローブ １００ｎＭ ０．２５０μＬ
１０μＭ Primesafe9-3DD ５００ｎＭ １．２５０μＬ
１．２５Ｕ プラチナＴＡＱ ０．２５０μＬ
水 １７．２５μＬ
ＢＧ標的 104コピー／μＬ １．０μＬ
合計 ２５μＬ
熱性条件：
段階１：５分間９５℃
段階２：繰り返し５０サイクル、１０秒間９５℃、１５秒間６１℃／５８℃、２０秒間７２℃、および２０秒間４５℃。
段階３：融解３５℃〜９４℃
【００７３】
実施例４（図８）
５’末端にＦＡＭを使用するＥＸＯ−Ｓプローブ
実施例４についての図８は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応の完了の後の１５分間の変動によるＥＸＯ−Ｓプローブシグナル増幅を示す。反応条件は、９５℃で１０秒、６４℃で１０秒、および７２℃で２０秒の４５ラウンドとした。最終の試薬濃度は、２５マイクロリットル（μＬ）の容量中、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼ、２００ｎＭのｄＮＴＰ、５０ナノモル（ｎＭ）ＦＴ＃２制限プライマー、１０００ｎＭ ＦＴ＃２過剰プライマー、および０．６×ＰｒｉｍｅＳａｆｅ（商標）＃０２２（ＰｒｉｍｅＳａｆｅは、Ｓｍｉｔｈｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ社から入手可能な試薬である、ならびに３００ｎＭ ＦＴ ＭＢｓｅｑ４とした。
【００７４】
ＦＴ＃２制限プライマーの配列は、
5' GGAAGTGTAAGATTACAATGGCAGGCTCCAGA 3'
とした。
【００７５】
ＦＴ＃２過剰プライマーの配列は、
5' GTTGCCCAAGTTTTATCGTTCTTCTCA 3'
とした。
【００７６】
ＦＴ ＭＢｓｅｑ４ ＥＸＯ−Ｓプローブは、
5' FAM-CATGATACAAGCTTC-BHQ1 3'
とした。
【００７７】
ＰＣＲの完了後に；４５℃（１０秒間）および６５℃（２０秒間）の間の４５ラウンドの変動。蛍光発光を６５℃で収集した。線（８１）は、ＦＴ ＭＢｓｅｑ４プローブおよび増幅されたＦＴ産物の両方を含有する複製物であり、一方、線（８２）は鋳型なしコントロールサンプルである。
【００７８】
実施例５（図９）
５’末端にＢＨＱ１を使用するＥＸＯ−Ｒプローブ
本実施例では、（１）Ｅｘｏ−Ｓプローブの５’蛍光体を５’ＢＨＱ−１消光剤に交換することにより、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによってプライマー非依存的様式でもはや切断されないＥｘｏ−ＲプローブにＥｘｏ−Ｓプローブを変換すること、および（２）ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合されたＥｘｏ−Ｒプローブは、プライマー非依存的様式でＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによって切断されないことを示す。図ｘｘは、本実施例の結果を示す。パネルＡは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの非存在（線９１）または存在（線９２）下でのＥｘｏ−Ｓプローブ／標的ハイブリッドの融解プロファイルを示す。この特定のＥｘｏ−Ｓプローブは５’ＨＥＸ蛍光体および３’ＢＨＱ−１消光剤からなる。線９３は、鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。反応は、２５μＬ容量中で実行し、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｎＭ合成標的（下記参照）、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｓプローブ（下記参照）、およびＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサンプルの場合には、１．２５ユニット ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）からなるものとした。鋳型なしコントロールサンプルについては、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを含み、標的配列は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ８．３と交換した。サンプルは１０秒間９５℃で、次いで２０分間２０℃でインキュベートし、Ｅｘｏ−Ｓプローブ／標的ハイブリッドの形成を可能にした。次いで、サンプル温度を、それぞれ９０秒間の長さの１℃の間隔で２０℃から９５℃まで上げると共に、蛍光発光シグナルを収集した。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼなしのサンプル（線９１）については、プローブ蛍光発光シグナルは、６５℃の上で、プローブが標的から完全に融解される温度範囲で鋳型なしコントロールからのプローブ蛍光発光シグナルにマッチする。対照的に、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼを用いたサンプルについては、６５℃の上のプローブ蛍光発光シグナルは、鋳型なしコントロールからの蛍光発光シグナルよりも高く、ＢＨＱ−１消光剤からのＨＥＸ蛍光体のプローブ切断および分離を示す。この結果は、合成標的に結合されたＥｘｏ−Ｓプローブがプライマー非依存的様式でＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に感受性であることを実証する。
配列
Exo-Sプローブ: 5' HEX AGCATACGGTTCAGTT 3' BHQ1
合成標的：
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
【００７９】
上記の同じプローブ配列を５’ＢＨＱ−１消光剤および３’ＨＥＸ蛍光体を有するように修飾した。５’ＢＨＱ−１成分の存在は、プライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であるＥｘｏ−Ｒプローブにそのプローブを変える。パネルＢは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのそのようなＥｘｏ−Ｒプローブ−標的ハイブリッドの融解プロファイルを示す（線９４）。線９５は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。反応条件は、２５μｌの最終容量中、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｎＭ合成標的、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｒプローブ（下記参照）、および１．２５ユニットＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）から成った。鋳型なしコントロールサンプルについては、標的配列は１０ｎＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ Ｐｈ ８．３と交換した。サンプルは２０分間２０℃でインキュベートし、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／標的ハイブリッドの形成を可能にし、次いで、サンプル温度を、それぞれ９０秒間の長さの１℃の間隔で２０℃から９５℃まで上げると共に、蛍光発光シグナルを収集した。Ｅｘｏ−Ｒプローブ／標的ハイブリッドを用いたサンプル（線９４）については、蛍光発光シグナルは、６５℃の上で、プローブが標的から完全に融解される温度範囲で鋳型なしコントロールからの蛍光発光シグナル（線９５）にマッチする。この結果は、（１）合成標的に結合したＥｘｏ−Ｒプローブは、プライマー非依存的様式のＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であること、および（２）５’ＨＥＸ蛍光体を５’ＢＨＱ−１消光剤に交換することによりＥｘｏ−ＳプローブをＥｘｏ−Ｒプローブに変えることを実証する。
配列
Exo-Rプローブ: 5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
【００８０】
合成標的：（上記のものと同じ）
5' AAGATCCTGAATAACTGAACCGTATGCTTGGCTAAAGTTC 3'
下線を引いた配列はプローブ標的部位に相当する。
【００８１】
パネルＣは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合した場合、上記に記載されるＥｘｏ−ＲプローブはまたＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを示す。上記に記載されるＥｘｏ−Ｒプローブについての標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡ産物は、Ｅｘｏ−Ｒプローブの存在下でＬＡＴＥ−ＰＣＲを介して産出された。増幅の最後に、温度を２０℃に低下させ、２０分間インキュベートして、Ｅｘｏ−Ｒ／一本鎖アンプリコンハイブリッドの形成を可能にした。この図は、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／一本鎖アンプリコンハイブリッドのＰＣＲ後の融解曲線分析を示す（線９６）。線９７は、プローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。合成標的とハイブリダイズしたＥｘｏ−Ｒプローブと同様に（パネルＢ）、６５℃の上でのＥｘｏ−Ｒプローブ−アンプリコンハイブリッドの完全融解は、鋳型なしコントロールサンプルに等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、ＰＣＲによって産出された標的に結合されたＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅についての反応条件は、２５ｕｌの最終容量中、１×ＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５０ｎＭ ｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、２５ｎＭ ９−２２ＤＤ ＰｒｉｍｅＳａｆｅ、５００ｎＭ ９−Ｃ３ ＰｒｉｍｅＳａｆｅ、１．２５ユニットＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバード、ＣＡ）、５０ｎＭ制限プライマー、１ｕＭ過剰プライマー、５００ｎＭ Ｅｘｏ−Ｒプローブ、ヒトＤＮＡの１０００ゲノム等価物（Ｃｏｒｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ社、キャムデン、ＮＪ、カタログ番号；ＮＡ０７３４８）とした。熱サイクルプロファイルは、３分間９５℃、１０秒間９５℃、１０秒間６４℃、および２０秒間７２℃の７０サイクル、次いで２０分間２０℃、ならびに１℃で各９０秒間の長さの間隔での２０℃から９５℃までの蛍光発光取得を伴う融解ステップとした。
配列：
制限プライマー:
5' CCATTTCTTCCTCCTCCTCATAAGCATGGTACCTAT 3'
過剰プライマー:
5' CCCGCTGGTTCAATAATGTCTTTAA 3'
Exo-Rプローブ(上記と同じ)
5' BHQ-1 AGCATACGGTTCAGTT 3' HEX
【００８２】
パネルＡ−合成標的上で試験したＥｘｏ−Ｓプローブの実施例：このパネルは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの非存在（線９１）または存在（線９２）下でのＥｘｏ−Ｓプローブ−標的ハイブリッドの融解曲線分析を示す。線９３は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼなしのサンプル（線９１）については、６５℃の上でのプローブ−標的ハイブリッドの完全融解は、鋳型なしコントロールに等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（線９１）ありのサンプルについては、６５℃の上でのプローブ−標的ハイブリッドの完全な融解は、プローブ切断およびＢＨＱ−Ｉ消光剤からのＨＥＸ蛍光体の分離により、非結合プローブよりも高い蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、合成物質に結合されたＥｘｏ−Ｓプローブがプライマー非依存的様式のＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に感受性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８３】
パネルＢ：合成標的上で試験したＥｘｏ−Ｒプローブの実施例：このパネルは、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＥｘｏ−Ｒプローブ−標的ハイブリッドの融解曲線分析を示す（線９４）。線９５は、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ存在下でのプローブのみ／鋳型なしコントロールサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼが存在するにもかかわらず、プローブ−標的ハイブリッドの融解は、非結合プローブと等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、合成標的に結合したＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８４】
パネルＣ：ＰＣＲ産物上で試験したＥｘｏ−Ｒプローブの実施例：ＬＡＴＥ−ＰＣＲによって産出された一本鎖ＤＮＡに結合した場合、上記に記載されるＥｘｏ−ＲプローブはＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性である。上記に記載されるＥｘｏ−Ｒプローブについての標的配列を含有する一本鎖ＤＮＡ産物は、Ｅｘｏ−Ｒプローブの存在下でＬＡＴＥ−ＰＣＲを介して産出された。増幅の最後に、温度を２０℃に低下させ、２０分間インキュベートして、Ｅｘｏ−Ｒ／アンプリコンハイブリッドの形成を可能にした。この図は、Ｅｘｏ−Ｒプローブ／アンプリコンハイブリッドのＰＣＲ後の融解曲線分析を示す（線９５）。線９６は、プローブのみ／標的なしサンプルのバックグラウンド蛍光発光シグナルに相当する。合成標的とハイブリダイズしたＥｘｏ−Ｒプローブと同様に、Ｅｘｏ−Ｒプローブ−アンプリコンハイブリッドの融解は、鋳型なしコントロールと等しいバックグラウンド蛍光発光シグナルをもたらす。この結果は、ＰＣＲによって産出された標的に結合されたＥｘｏ−Ｒプローブがプライマー非依存的様式でのＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼによる切断に対して抵抗性であることを実証する。蛍光発光シグナルは複製サンプルの比較を容易にするために９５℃で標準化した。
【００８５】
実施例６（図１０）
本実施例では、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の間にＲＯＸ ＥＸＯ−Ｒプローブの分解が観察されない、ニューカッスルＤＮＡアンプリコンの７５００コピーを検出するためにＥＸＯ−Ｒ ＲＯＸプローブを使用するＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応を示す。
【００８６】
図１０Ａは、７５００コピーのニューカッスルウイルスアンプリコン（線１０１）のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅およびＲＯＸ ＥＸＯ−Ｒプローブ融解曲線（実線）対ＮＴＣ（線１０２）の両方を示す。プローブが高温で非結合である場合、すべてのプローブ蛍光発光（線１０３）およびＮＴＣ蛍光発光（線１０４）が重なり合うので、プローブ分解は融解曲線の図１０Ｂで観察されず、遊離ＲＯＸ蛍光発光がないことを示す。
配列：
制限プライマー:
5' GCATCAAATTCCCCACTGAGCCTC 3', Tm: 67.9℃
過剰プライマー:
5' CCTGGTATTTATTCCTGTTTGAG 3', Tm: 63.2℃
プローブ配列:
5' ROX-ATTTTGCGATATGATACCC-BHQ2 3', Tm: 56℃
【００８７】
ストック濃度： 最終濃度 25μＬアッセイ中の容量（μＬ）
１０×ＰＣＲバッファー １× ２．５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ２５０μＭ ０．６２５μＬ
５０ｍＭ Ｍｇ++ ３ｍＭ １．５μＬ
１０μＭ制限プライマー ０．１２５μＬ
１００μＭ過剰プライマー ０．２５０μＬ
１０μＭプローブ 500nM ２× １．２５μＬ
１０μＭ C3-12B Primesafe 300nM ．７５０μＬ
混合合計： ８．２５μＬ
Ｐｔ ＴＡＱ(１．２５ユニット)：
水： １４．５μＬ
ＤＮＡアンプリコン
（750、7,500コピー／μＬで２） ２．０μＬ
合計容量： ２５．０μＬ
熱サイクル条件：
段階１：９５℃／３：００分間
段階２：（９５℃／０：１０秒間−５８°／６２℃／０：１５秒間−７２℃／０：３０秒間）２０回繰り返す
段階３：（９５℃／０：１０秒間−５８°／６２℃／０：１５秒間−７２℃／０：３０秒間−４５℃／０：２０秒間−２５℃／０：２０秒間）２０回繰り返す
段階４：２５℃／２：００分間保持
段階５：融解２５℃〜９４℃
【００８８】
実施例７（図１１）
等温対変動条件下でのＥＸＯ−Ｓプローブの切断の速度
５分間の等温条件５０℃または５０℃から７０℃の温度の間での変動下でのシグナル増幅の速度の比較。プローブおよび相補標的の濃度の両方は０．５μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１１１）は変動条件下での複製物であり、一方、線（１１２）は等温条件下での複製物である。
Ｅ９Ｌプローブ：
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
１２塩基対の３’および５’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
【００８９】
実施例８（図１２）
その相補的標的の３’末端に対するＥＸＯ−Ｓプローブの距離は切断の速度に影響を与える。
【００９０】
Ｅ９Ｌプローブは０．２ｕＭで使用し、一方、両標的は０．０５ｕＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１２１）は、プローブ−標的ハイブリッド複合体の端に対して１２塩基対の５’および３’突出を有する複製物である。一方、線（１２２）は、プローブ−標的ハイブリッド複合体の５’末端に対して４４塩基対の３’突出を有する複製物である。
Ｅ９Ｌプローブ：
FAM 5' TTTCTAAATCCCATCAGACC 3' BHQ1
１２塩基対の３’および５’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3' ATATCTCGTGATAAAGATTTAGGGTAGTCTGGTATATGACTCA 5'
４４塩基対の３’突出を有するＥ９Ｌ標的：
3 'ACCTACACGTTGAGAATCGGCTTCCCATACTCATATCTCGT
GATAAAGATTTAGGGTAGTCTGG 5'
【００９１】
実施例９（図１３）
４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル発生についての異なる速度（ケース１）。
【００９２】
プローブの濃度は０．２μＭ ｒｓ４９８とし、０．０５μＭの標的とする；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。７０℃でデータ収集した。線（１３１）は、Ａに対するミスマッチＡを含有する複製物であり、線（１３２）は、Ｔに対してＡにマッチした複製物である。線（１３３）はプローブのみでの複製物である。
rs498プローブ: FAM 5' AGACATGTTCCCTACT 3' BHQ1.
末端塩基がミスマッチの標的、（ボールド）
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC
完全にマッチした標的
CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC
【００９３】
実施例１０（図１４）
４５℃および７０℃の間の変動の間の、標的に対するプローブの５’末端での単一塩基対ミスマッチでのシグナル増幅についての異なる速度（ケース２）。
【００９４】
プローブの濃度は０．２μＭ ｒｓ４９８とし、０．０５μＭの標的とし、試薬は上記と同じとし、７０℃でデータ収集した。線（１４１）は、Ａに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４２）は、Ｔに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４３）は、Ｃに対するミスマッチＣを含有する複製物であり、線（１４４）は、Ｇ塩基対に対してマッチしたＣを含有する複製物である。線（１４５）はプローブのみでの複製物である。ｒｓ４９８プローブ配列は３’ＦＡＭ ＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＴＡＣＴ ＢＨＱ１５’とする。プローブ配列の端での５’Ｔは、標的鎖内で、その相補的配列（下線）の３’末端に対してミスマッチ（ボールド）とした：
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCAGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCTGCCATAGGTTTC 3',
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCCGCCATAGGTTTC 3',
または標的鎖内でその相補的配列（下線）の３’末端にマッチした（ボールドなし）。
5' CTTGAGTGGGAGGGTAGGGAACATGTCGGCCATAGGTTTC 3'.
【００９５】
実施例１１（図１５）
３０分間の等温条件（５０℃）下でのシグナル増幅の速度。ＦＴプローブは０．５μＭとし、その相補標的は１．０μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ＋＋、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１５１）はＦＴプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線（１５２）はＦＴプローブのみである。ＦＴプローブに対する配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし、相補的配列は５’ＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴ３’とする
【００９６】
実施例１２（図１６）
変動条件（４５℃〜７０℃）下でのシグナル増幅の速度。ＦＴプローブは０．５μＭとし、その相補標的は０．５μＭとした；最終試薬濃度は、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰＣＲバッファー、３ｍＭ Ｍｇ++、および１．２５ユニットのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｔａｑポリメラーゼとした。線（１６１）はＦＴプローブおよびその相補標的の複製物であり、一方、線（１６２）はＦＴプローブのみである。ＦＴプローブに対する配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし、相補配列は、５’ＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴ３’とする
【００９７】
実施例１３（図１７）
プローブの５’アームの長さを増加させると、プローブはＥＸＯ−ＳまたはＥＸＯ−Ｒプローブとなる。図１７Ａ〜Ｃは、Ｔａｑポリメラーゼの存在下または非存在下での５０℃でのプローブおよびその相補的標的の３０分間の等温インキュベーション後に行った融解分析を示す。Ｔａｑを含有し、Ｔａｑを含有していないものと同じ蛍光発光値に達するサンプルは、ＥＸＯ−Ｒプローブを示す。蛍光発光値はすべて７０℃に標準化する。図１７Ａについては、線（１７１）は、ＴａｑポリメラーゼなしのＦＴプローブ（修飾なし）標的複合体の複製サンプルである。線（１７２）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴプローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７３）はＦＴプローブのみである。図１７Ｂについては、線（１７４）は、Ｔａｑポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの５’末端で標的に対する単一の非相補的塩基を有するＦＴ（１ｂｐ）プローブの複製サンプルである。線（１７５）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴ（１ｂｐ）プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７６）はＦＴ（１ｂｐ）プローブのみである。図１７Ｃについては、線（１７７）は、Ｔａｑポリメラーゼなしの標的の存在下でプローブの５’末端で標的に対する５つの非相補塩基を有するＦＴ（５ｂｐ）プローブの複製サンプルである。線（１７８）は、ＴａｑポリメラーゼありのＦＴ（５ｂｐ）プローブおよび標的を含有する複製サンプルである。一方、線（１７９）はＦＴ（５ｂｐ）プローブのみである。
【００９８】
ＦＴプローブ配列は５’ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし；ＦＴ（１ｂｐ）プローブ配列は５’ＡＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とし；ＦＴ（５ｂｐ）プローブは５’ＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ３’とした。ＦＴ標的は３’ＴＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＣＡ５’とした。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および検出方法であって、
（ａ）プライマーアニーリング温度を含む繰り返しの熱サイクルを通して反応混合物を熱的に循環させるステップであって、前記反応混合物が、第１のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅標的配列、第１の過剰プライマーおよび第１の制限プライマー、ｄＮＴＰ、標的非依存的プローブ切断を呈しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに第１の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも５℃下回る濃度調整した融解温度を有し、プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断に対する感受性がオリゴヌクレオチドの構造的修飾によって変化した直鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである低温の第１のハイブリダイゼーションプローブを含有するステップと、
（ｂ）制限プライマーの消耗後に第１の温度で過剰プライマーの伸長産物である第１のアンプリコン鎖に前記プローブをハイブリダイズするステップと、
（ｃ）前記プローブのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記プローブの構造的修飾がプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断を増強し、検出するステップはプローブが切断されたかどうかを検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造的修飾が、前記アンプリコン鎖の対応するヌクレオチドに対して相補的ではない５’ヌクレオチドおよび少なくとも３つの連続したメチレン基からなる鎖によって連結された標識成分を有する５’ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記鎖が３つを超える連続したメチレン基からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鎖が６つの連続したメチレン基からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物が、第２のＤＮＡ増幅標的配列、前記第２のＤＮＡ増幅標的配列に対する第２の過剰プライマーおよび第２の制限プライマー、ならびに第２の過剰プライマーの伸長によって形成された第２のアンプリコン鎖に対する第２のハイブリダイゼーションプローブを含有し、検出するステップが、前記第２のプローブが第２の温度でハイブリダイズしたかどうかを検出するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のプローブが同じ蛍光体で標識された２重標識蛍光プローブである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のプローブが、第１の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも５℃下回り、かつ前記第１の温度と少なくとも５℃異なる、濃度調整した融解温度を有する低温プローブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の温度が前記第１の温度を少なくとも１０℃下回る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２のプローブがその融解温度のあたりで反応温度を急速に変動させることにより切断される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の温度が前記第１の温度を少なくとも１０℃上回る、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブの構造的修飾が等温プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断を予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
構造的修飾は、第１のアンプリコン鎖とハイブリダイズしない２〜７つのヌクレオチドから構成される５’末端アーム、３つ以上の連続したメチレン基の鎖以外によって連結された標識成分を有する５’末端ヌクレオチド、および７０℃を上回る温度での自己アニーリングにより２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成するプローブの５’末端における非相補的ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プローブが、プローブのＴｍのあたりの温度での熱変動によって誘発された切断に対して抵抗性ではなく、検出が、プローブ切断をもたらす、その融解温度のあたりでのプローブ−アンプリコンハイブリッドの急速な熱変動を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅でＤＮＡ標的鎖の伸長を予防するための方法であって、混合物中で前記鎖とハイブリダイズするプライマーおよび標的非依存的プローブ切断を呈しないＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物に、前記プライマーから下流（５’）の前記標的鎖とハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を予防するオリゴヌクレオチドを添加するステップを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的鎖とハイブリダイズせず、少なくとも７０℃の融解温度を有する２〜５つのヌクレオチドのステムを有する５’末端オリゴヌクレオチドヘアピンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、本来ならすべて増幅されるはずである少なくとも２つの考えられる対立遺伝子のうちの一方とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲ反応混合物は、前記プライマーが１対の釣り合いのとれたプライマーのうちの一方である対称ＰＣＲ反応混合物であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記プライマーの伸長を予防するために、２回以上の熱サイクル後に反応混合物に添加される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および検出方法であって、
（ａ）プライマーアニーリング温度を含む繰り返しの熱サイクルを通して反応混合物を熱的に循環させるステップであって、前記反応混合物が、第１のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅標的配列、第１の過剰プライマーおよび第１の制限プライマー、ｄＮＴＰ、標的非依存的プローブ切断を呈しない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに第１の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも５℃下回る濃度調整した融解温度を有し、プライマー非依存的５’エキソヌクレアーゼ切断に対する感受性がオリゴヌクレオチドの構造的修飾によって変化した直鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである低温の第１のハイブリダイゼーションプローブを含有するステップと、
（ｂ）制限プライマーの消耗後に第１の温度で過剰プライマーの伸長産物である第１のアンプリコン鎖に前記プローブをハイブリダイズするステップと、
（ｃ）前記プローブのハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記プローブの構造的修飾がプライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断を増強し、検出するステップはプローブが切断されたかどうかを検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造的修飾が、前記アンプリコン鎖の対応するヌクレオチドに対して相補的ではない５’ヌクレオチドおよび少なくとも３つの連続したメチレン基からなる鎖によって連結された標識成分を有する５’ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記鎖が３つを超える連続したメチレン基からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記鎖が６つの連続したメチレン基からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物が、第２のＤＮＡ増幅標的配列、前記第２のＤＮＡ増幅標的配列に対する第２の過剰プライマーおよび第２の制限プライマー、ならびに第２の過剰プライマーの伸長によって形成された第２のアンプリコン鎖に対する第２のハイブリダイゼーションプローブを含有し、検出するステップが、前記第２のプローブが第２の温度でハイブリダイズしたかどうかを検出するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のプローブが同じ蛍光体で標識された２重標識蛍光プローブである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のプローブが、第１の制限プライマーの濃度調整した融解温度を少なくとも５℃下回り、かつ前記第１の温度と少なくとも５℃異なる、濃度調整した融解温度を有する低温プローブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の温度が前記第１の温度を少なくとも１０℃下回る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第２のプローブがその融解温度のあたりで反応温度を急速に変動させることにより切断される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の温度が前記第１の温度を少なくとも１０℃上回る、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブの構造的修飾が等温プライマー非依存的５’ヌクレアーゼ切断を予防する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
構造的修飾は、第１のアンプリコン鎖とハイブリダイズしない２〜７つのヌクレオチドから構成される５’末端アーム、３つ以上の連続したメチレン基の鎖以外によって連結された標識成分を有する５’末端ヌクレオチド、および７０℃を上回る温度での自己アニーリングにより２〜５ヌクレオチド長のステムを有するヘアピン構造を形成するプローブの５’末端における非相補的ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プローブが、プローブのＴｍのあたりの温度での熱変動によって誘発された切断に対して抵抗性ではなく、検出が、プローブ切断をもたらす、その融解温度のあたりでのプローブ−アンプリコンハイブリッドの急速な熱変動を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅でＤＮＡ標的鎖の伸長を予防するための方法であって、混合物中で前記鎖とハイブリダイズするプライマーおよび標的非依存的プローブ切断を呈しないＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物に、前記プライマーから下流（５’）の前記標的鎖とハイブリダイズし、前記ＤＮＡポリメラーゼによる前記プライマーの伸長を予防するオリゴヌクレオチドを添加するステップを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、前記標的鎖とハイブリダイズせず、少なくとも７０℃の融解温度を有する２〜５つのヌクレオチドのステムを有する５’末端オリゴヌクレオチドヘアピンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、本来ならすべて増幅されるはずである少なくとも２つの考えられる対立遺伝子のうちの一方とハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＲ反応混合物は、前記プライマーが１対の釣り合いのとれたプライマーのうちの一方である対称ＰＣＲ反応混合物であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記プライマーの伸長を予防するために、２回以上の熱サイクル後に反応混合物に添加される、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
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【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００９−５４３５７８（Ｐ２００９−５４３５７８Ａ）
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２０８００（Ｐ２００９−５２０８００）
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６１５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１００４
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０１４４２３４５）ブランディーズ・ユニバーシティ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１７日（２００７．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６１５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１００４
【国際公開日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【出願人】（５０１４４２３４５）ブランディーズ・ユニバーシティ (4)
【Ｆターム（参考）】
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