生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグ、プローブおよび検出方法
本発明は、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグ、プローブおよび検出方法を提供する。本発明におけるユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはＬＮＡのフラグメントであり、長さが３−２０ｍｅｒである。本発明のプローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列およびユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列を含むか、または、前記プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列およびターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子のための検出技術の分野に関し、特に、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグ、プローブおよび検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト・ゲノム計画（ＨＧＰ）の実現により、動物、植物および微生物の多数のゲノム配列が特定され、遺伝子データは先例のない速度で増加している。遺伝子の数が莫大であることを考えると、どのようにして遺伝子の生物学的情報を大規模に調査し、同時にそれらの生命過程の間における機能を分析するかは、科学者および研究者にとって熱いテーマである。上述の背景の下で、遺伝子チップ技術に基づくバイオチップが開発され、それは１９９０年代の中頃以後、技術の最も著しい発達の１つと見做されている（参考文献１〜４）。ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイまたはオリゴヌクレオチド配列とも呼ばれる遺伝子チップは、固相担体の表面上に何百何千ものＤＮＡプローブを固着するためにｉｎ ｓｉｔｕ合成またはマイクロスポッティングの技術を用いてつくり出される２次元ＤＮＡプローブ・マイクロアレイに関連する。そして、ＤＮＡプローブ・マイクロアレイは核酸ハイブリダイゼーションの原理に従ってラベリングされたサンプルとハイブリッド形成され、それにより、ハイブリダイゼーション信号を検出することによって、生物学的標本の検出および分析が急速に並行して効率的に達成される。これまで、遺伝子チップ技術は、分子生物学、医学研究その他において広く使われ、例えば、遺伝子発現、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ゲノム研究、疾患診断および薬剤スクリーニング等の分野において応用の十分な可能性を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
遺伝子チップがサンプル分子の複数の迅速で並行した検出において顕著な優位性を示したが、遺伝子チップの実質的応用および普及を制限しているいくつかの障壁要因がある。重要な要因はテストされるサンプルがハイブリダイゼーションの前にラベリングされる必要があるということであり、そして、サンプルをラベリングするステップは退屈で、専門家によって操作されることを必要とする。ラベリングプロセスの間、逆転写酵素、ポリメラーゼ等が使われなければならない。ラベリング効率は比較的低く、プロセスは検出サイトで行われることができない。これらの要因の全ては、検出コストおよびオペレーションステップを増加させて、チップ技術の普及および実質的応用に不利である。本発明の目的は、現在のラベリング方法の一つ以上の欠点を克服して、生体分子のためのマルチターゲット・ユニバーサルタグの使い易くて迅速な検出方法を見つけることである。
【０００４】
核酸二重らせんを安定させるための２つの主な要因があることはよく知られている。要因のうちの１つは、相補的塩基対との間に形成される水素結合であり、それは主に核酸二重らせんの横安定を維持する。もう一方は同じ核酸鎖にある隣接する塩基間の塩基スタッキングの効果であり、それは核酸二重らせんの縦安定を維持するための大きな要因である。２つの要因は、核酸二重らせんの安定を維持するために相乗的に機能し、水素結合の形成は塩基スタッキングに役立ち、その一方で、塩基スタッキングは水素結合の形成に役立つ。ロシアの国立科学院のアカデミー会員であるミルザベコフ（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ）（故人）に率いられる研究チームは、系統的に研究して、塩基スタッキングハイブリダイゼーション（ＢＳＨ）の理論を説明した（参考文献５〜９）。塩基スタッキングハイブリダイゼーションは、近接スタッキングハイブリダイゼーション（ＣＳＨ）とも呼ばれ、短いオリゴヌクレオチド一本鎖が相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ長鎖とハイブリッド形成するときに、形成された二本鎖構造は通常不安定であることに言及する。しかしながら、短いオリゴヌクレオチド一本鎖の近傍にある他のオリゴヌクレオチド一本鎖もまた相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ長鎖とハイブリッド形成する場合、このような二本鎖構造の安定性は非常に増加する（図１）。上記の研究結果に基づいて、本発明は、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルラベリング方法を提供する。
【０００５】
本発明の説明
本発明の目的は、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグを提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブを提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子のマルチターゲット検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）ＬＮＡ（ロックド核酸）等のフラグメントであってもよい。ユニバーサルタグの長さは、３−２０ｍｅｒの範囲で変化する。設計する際に、ユニバーサルタグの塩基配列は、できるだけテストされるサンプルとの相同性を有することを回避するためにテストされるサンプルのそれと比較されなければならない。
【０００７】
本発明による生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブが、３´末端から５´末端まで順番に、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的なヌクレオチド配列、およびユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列、および固相担体の界面効果を減らすために３´末端上に任意に加えられるｐｏｌｙ（Ｔ）またはｐｏｌｙ（Ａ）のフラグメントを含む。あるいは、プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的なヌクレオチド配列、および固相担体の界面効果を減らすために５´末端上に任意に加えられるｐｏｌｙ（Ｔ）またはｐｏｌｙ（Ａ）のフラグメントを含む。
【０００８】
本発明によるプローブにおいて、末端基は、アミノ、チオール、カルボキシルまたはビオチン等である。
本発明による生体分子のマルチターゲット検出方法は次のステップを含む。
１）ユニバーサルタグを準備するステップであって、ユニバーサルタグは蛍光染料、量子ドット、金ナノ粒子、同位元素およびビオチン等のインジケータでラベリングされ、その結果、それらは蛍光顕微鏡、アレイスキャナ、銀染色着色方法、酵素反応着色方法などによって検出するのに適しているものである；
２）上述のプローブを準備するステップであって、第１に、プローブは検出されるターゲットに応じて設計され、プローブはターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列のフラグメントに加えて、上述のユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列のフラグメントを含み、プローブの末端は、固相担体と結び付けるために改質されるものである、
３）プローブを改質固相担体に結合させるステップ；
４）ユニバーサルタグおよび処理されたテストされるサンプルをハイブリダイゼーション溶液に溶解し、ユニバーサルタグおよびサンプルをプローブ配列とハイブリッド形成させるステップ、あるいは、プロセスは、２つのステップ、すなわち、テストされるサンプルをプローブとハイブリッド形成させ、サンプルを洗浄し、それからユニバーサルタグをプローブ配列とハイブリッド形成させるステップで実行することができる；
４）余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグを除去するために洗浄するステップ；
５）ハイブリダイゼーション信号を検出して、分析するステップ。
【０００９】
本発明による方法において、検出される対象は、ＤＮＡおよびＲＮＡだけでなく、タンパク質、サッカリド分子等を含む。
本発明による方法において、固相担体は、スライドガラス、プラスチック基板、シリコンウエハ、ミクロビーズまたは高分子膜等とすることができる。
本発明による方法において、固相担体は、ポリ−Ｌ−リジン、アルデヒド基、カルボキシルまたはチオール等によって改質されることができる。
【００１０】
検出が本発明のユニバーサルタグおよびプローブを用いて実行されるときに、検出は、サンプルが得られた後ラベリングなしで直接実行されることができ、大幅にコストを減らして、その場で検出するのに有益である。実験手順は単純化され、操作が容易であるために、専門家でなくても操作することができるので、技術の普及に便利である。さらにまた、生体分子のマルチターゲット検出は、本発明のタグおよびプローブを用いて達成されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、塩基スタッキングハイブリダイゼーションを示す図解図である。
【図２】図２は、さまざまな臨床病原体の検出に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図３】図３は、ｍｉＲＮＡプロフィールの分析に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図４】図４は、タンパク質ターゲットのマルチ検出に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図５】図５は、ｍｉＲＮＡプロフィールの分析に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施例１
さまざまな臨床病原体の検出における本発明による方法の応用
肺炎の呼吸経路から得られる５つの病原体は、実施例１を示す（図２に示される）実施例として見なされる：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ。使用されるプローブおよびユニバーサルタグは、表１に示される。
【００１３】
【表１】
【００１４】
１．５つの病原体の１６ＳＲＮＡは検出のターゲットとして選ばれ、５つのプローブがそれぞれ合成され、そこにおいて、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ｔ）１２であり、プローブの中央の配列のフラグメントはターゲット分子の一部と相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成されて、その５´末端上でフルオレセインによって改質される；
３．スライドガラスは、アルデヒド基質を準備するために、従来の化学的改良方法を用いて処理される；
４．プローブは、スポッティング緩衝液に溶解され、オリゴヌクレオチド配列はスポッティングによって準備される；
５．患者の呼吸経路からの分泌物は溶解するために加熱され、または、分泌物が細菌培養されたあと、細菌培養懸濁液は溶解するために加熱される。それから、溶解した物質はユニバーサルタグと共にハイブリダイゼーション溶液に溶かされて、プローブ配列とハイブリッド形成される；
６．余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグは、洗浄することによって除去される；
７．検出は蛍光顕微鏡またはアレイスキャナを用いて実行され、分析が実行される。
【００１５】
塩基スタッキングハイブリダイゼーションの効果のため、完全に相補的なターゲット分子がプローブに結合した場合にだけ、ユニバーサルタグは確実にプローブに結合されることができる。ミスマッチターゲット分子がプローブに結合しとき、ユニバーサルタグとプローブとの間の結合は安定することができない。５つのプローブは、それぞれ、５つの病原体の１６ＳＲＮＡとハイブリッド形成される。このように、感染した病原体のタイプおよび内容は、臨床治療の薬剤を導くために特定されることができる。
【００１６】
実施例２
ｍｉＲＮＡプロフィールの分析における本発明による方法の応用
肝臓の組織から得られる４つのｍｉＲＮＡは、（図３に示される）実施例２を示す実施例と見なされる：ｈｓａ−ｍｉｒ−１９４、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４８およびｈｓａ−ｍｉｒ−１９２。使用されるプローブおよびユニバーサルタグは、表２に示される。
【００１７】
【表２】
【００１８】
１．上述の４つのｍｉＲＮＡに対応するプローブは、ｍｉＲＮＡライブラリに従って準備され、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ａ）１０であり、プローブの中央の配列のフラグメントはｍｉＲＮＡと相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成され、その５´末端上において金ナノ粒子によって改質される；
３．スライドガラスは、アルデヒド基質を準備するために、従来の化学的改良方法を用いて処理される；
４．プローブはスポッティング緩衝液に溶解され、オリゴヌクレオチド配列がスポッティングによって準備される；
５．サンプルが溶解されるかまたは全ＲＮＡが抽出され小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）が分離されて濃縮されたあと、サンプルは、ユニバーサルタグとともに、ハイブリダイゼーション溶液に溶かされて、プローブとハイブリッド形成される；
６．余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグは、洗浄によって除去される；
７．銀共力剤が信号を強化するために加えられる；
８．信号は、ｍｉＲＮＡの発現プロフィールを特定するために、平板スキャナを用いて検出され分析される。
【００１９】
実施例３
タンパク質ターゲットに関する多重検出における本発明による方法の応用
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）およびヒト血清から得られる全前立腺特異抗原（ＴＰＳＡ）は、実施例３を示す（図４に示される）実施例として見なされる。使用されるプローブ、バイオ・バーコードおよびユニバーサルタグは、表３に示される。
【００２０】
【表３】
【００２１】
１．検出される３つの抗原に対応する抗体は電磁ビーズに結合され、抗体に結合された電磁ビーズは試料溶液と反応し、抗原抗体複合体を形成する；
２．余分なサンプルは、磁気分離によって除去され、抗体およびバイオ・バーコード（検出される３つの抗原は、３つの異なるバーコード・ヌクレオチド配列に対応する）によって改質される金ナノ粒子は抗原抗体複合体と反応し、電磁ビーズ−抗原−金ナノ粒子の複合体を形成する；
３．余分な金ナノ粒子は磁気分離によって除去され、バイオ・バーコードはＤＴＴ溶液を用いて金ナノ粒子から切り離される；
４．切り離されたバイオ・バーコードおよびＦＡＭでラベリングされたユニバーサルタグは、ハイブリダイゼーション溶液に溶解され、プローブ配列とハイブリッド形成される（プローブの３´末端はユニバーサルタグと相補的であり、プローブの中央の部分は対応するバイオ・バーコードと相補的であり、５´末端はｐｏｌｙ（Ｔ）１０であって、５´末端がアルデヒド・スライドガラスに固定されるようにアミノ基によって改質される）；
５．余分なユニバーサルタグは、洗浄によって除去される；
６．検出および分析は、血清サンプルの３つの抗原のタイプおよび内容を特定するために、蛍光顕微鏡またはアレイスキャナを用いて実行される。
【００２２】
実施例４
高い特異性を有するｍｉＲＮＡの分析における本発明による方法の応用
ｍｉＲＮＡ（図５に示される）のｈｓａ−ｌｅｔ−７ファミリーの４つのメンバーｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄは、実施例４を示す実施例と見なされ、使用されるプローブ、ユニバーサルタグおよびターゲットは、表４に示される。
【００２３】
【表４】
【００２４】
１．ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄに対応する４つのプローブは、それぞれ、ｍｉＲＮＡライブラリに従って合成され、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ａ）１０であり、プローブの中央の配列のフラグメントは関連のあるｍｉＲＮＡと相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成され、５´末端はルシフェリンＣｙ３によって改質される；
３．ターゲットＴ−ｌｅｔ−７ｂが合成される；
４．アルデヒド・スライドガラスは、化学的改良法を用いて準備される；
５．プローブはスポッティング緩衝液に溶解され、４つのプローブのオリゴヌクレオチド配列は、スポッティング・プロセスによって準備される；
６．ターゲットＴ−ｌｅｔ−７ｂおよびユニバーサルタグはハイブリダイゼーション溶液に溶解され、配列とハイブリッド形成される；
７．配列のスライドガラスは洗浄される；
８．スライドガラスは、スキャナで走査される；
９．本発明の方法が高い特異性を有して、２つ、３つまたは４つのミスマッチ塩基だけを有するターゲットを確認することが可能であることを示す結果となった。
【００２５】
参照文献
［１］Ｆｏｄｏｒ ＳＰ、Ｒｅａｄ ＪＬ、Ｐｉｒｒｕｎｇ ＭＣ、Ｓｔｒｙｅｒ Ｌ、Ｌｕ ＡＴ、Ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ， ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１ Ｆｅｂ １５； ２５１（４９９５）： ７６７−７７３
［２］Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｒ． Ｔｈｅ ｒｕｎｎｅｒｓ−ｕｐ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９８ Ｄｅｃ １８； ２８２（５３９７）： ２１５７−２１６１
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［６］Ｐａｒｉｎｏｖ Ｓ、Ｂａｒｓｋｙ Ｖ、Ｙｅｒｓｈｏｖ Ｇ、Ｋｉｒｉｌｌｏｖ Ｅ、Ｔｉｍｏｆｅｅｖ Ｅ、Ｂｅｌｇｏｖｓｋｉｙ Ａ、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ａ． ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｏｃｔａ−ａｎｄ ｄｅｃａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂｙ ｓｔａｃｋｅｄ ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９６ Ａｕｇ １； ２４（１５）： ２９９８−３００４
［７］Ｄｕｂｉｌｅｙ Ｓ、Ｋｉｒｉｌｌｏｖ Ｅ、Ｌｙｓｏｖ Ｙ、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ａ．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ ｔｏｅｎｈａｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｎ １５；２５（１２）： ２２５９−２２６５
［８］Ｐａｒａｌｌｅｌ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｎ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ． Ｆｏｔｉｎ ＡＶ、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖ ＡＬ、Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ ＤＹ、Ｐｅｒｏｖ ＡＮ、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ ＡＤ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８ Ｍａｒ１５； ２６（６）： １５１５−１５２１．
［９］Ｖａｓｉｌｉｓｋｏｖ ＶＡ、Ｐｒｏｋｏｐｅｎｋｏ ＤＶ、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ ＡＤ． Ｐａｒａｌｌｅｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｘｉａｌ ｂａｓｅ ｓｔａｃｋｉｎｇ ｉｎ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００１ Ｊｕｎ １； ２９（１１）： ２３０３−２３１３．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子のための検出技術の分野に関し、特に、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグ、プローブおよび検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト・ゲノム計画（ＨＧＰ）の実現により、動物、植物および微生物の多数のゲノム配列が特定され、遺伝子データは先例のない速度で増加している。遺伝子の数が莫大であることを考えると、どのようにして遺伝子の生物学的情報を大規模に調査し、同時にそれらの生命過程の間における機能を分析するかは、科学者および研究者にとって熱いテーマである。上述の背景の下で、遺伝子チップ技術に基づくバイオチップが開発され、それは１９９０年代の中頃以後、技術の最も著しい発達の１つと見做されている（参考文献１〜４）。ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイまたはオリゴヌクレオチド配列とも呼ばれる遺伝子チップは、固相担体の表面上に何百何千ものＤＮＡプローブを固着するためにｉｎ ｓｉｔｕ合成またはマイクロスポッティングの技術を用いてつくり出される２次元ＤＮＡプローブ・マイクロアレイに関連する。そして、ＤＮＡプローブ・マイクロアレイは核酸ハイブリダイゼーションの原理に従ってラベリングされたサンプルとハイブリッド形成され、それにより、ハイブリダイゼーション信号を検出することによって、生物学的標本の検出および分析が急速に並行して効率的に達成される。これまで、遺伝子チップ技術は、分子生物学、医学研究その他において広く使われ、例えば、遺伝子発現、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ゲノム研究、疾患診断および薬剤スクリーニング等の分野において応用の十分な可能性を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
遺伝子チップがサンプル分子の複数の迅速で並行した検出において顕著な優位性を示したが、遺伝子チップの実質的応用および普及を制限しているいくつかの障壁要因がある。重要な要因はテストされるサンプルがハイブリダイゼーションの前にラベリングされる必要があるということであり、そして、サンプルをラベリングするステップは退屈で、専門家によって操作されることを必要とする。ラベリングプロセスの間、逆転写酵素、ポリメラーゼ等が使われなければならない。ラベリング効率は比較的低く、プロセスは検出サイトで行われることができない。これらの要因の全ては、検出コストおよびオペレーションステップを増加させて、チップ技術の普及および実質的応用に不利である。本発明の目的は、現在のラベリング方法の一つ以上の欠点を克服して、生体分子のためのマルチターゲット・ユニバーサルタグの使い易くて迅速な検出方法を見つけることである。
【０００４】
核酸二重らせんを安定させるための２つの主な要因があることはよく知られている。要因のうちの１つは、相補的塩基対との間に形成される水素結合であり、それは主に核酸二重らせんの横安定を維持する。もう一方は同じ核酸鎖にある隣接する塩基間の塩基スタッキングの効果であり、それは核酸二重らせんの縦安定を維持するための大きな要因である。２つの要因は、核酸二重らせんの安定を維持するために相乗的に機能し、水素結合の形成は塩基スタッキングに役立ち、その一方で、塩基スタッキングは水素結合の形成に役立つ。ロシアの国立科学院のアカデミー会員であるミルザベコフ（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ）（故人）に率いられる研究チームは、系統的に研究して、塩基スタッキングハイブリダイゼーション（ＢＳＨ）の理論を説明した（参考文献５〜９）。塩基スタッキングハイブリダイゼーションは、近接スタッキングハイブリダイゼーション（ＣＳＨ）とも呼ばれ、短いオリゴヌクレオチド一本鎖が相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ長鎖とハイブリッド形成するときに、形成された二本鎖構造は通常不安定であることに言及する。しかしながら、短いオリゴヌクレオチド一本鎖の近傍にある他のオリゴヌクレオチド一本鎖もまた相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ長鎖とハイブリッド形成する場合、このような二本鎖構造の安定性は非常に増加する（図１）。上記の研究結果に基づいて、本発明は、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルラベリング方法を提供する。
【０００５】
本発明の説明
本発明の目的は、生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグを提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブを提供することである。
本発明の他の目的は、生体分子のマルチターゲット検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）ＬＮＡ（ロックド核酸）等のフラグメントであってもよい。ユニバーサルタグの長さは、３−２０ｍｅｒの範囲で変化する。設計する際に、ユニバーサルタグの塩基配列は、できるだけテストされるサンプルとの相同性を有することを回避するためにテストされるサンプルのそれと比較されなければならない。
【０００７】
本発明による生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブが、３´末端から５´末端まで順番に、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的なヌクレオチド配列、およびユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列、および固相担体の界面効果を減らすために３´末端上に任意に加えられるｐｏｌｙ（Ｔ）またはｐｏｌｙ（Ａ）のフラグメントを含む。あるいは、プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的なヌクレオチド配列、および固相担体の界面効果を減らすために５´末端上に任意に加えられるｐｏｌｙ（Ｔ）またはｐｏｌｙ（Ａ）のフラグメントを含む。
【０００８】
本発明によるプローブにおいて、末端基は、アミノ、チオール、カルボキシルまたはビオチン等である。
本発明による生体分子のマルチターゲット検出方法は次のステップを含む。
１）ユニバーサルタグを準備するステップであって、ユニバーサルタグは蛍光染料、量子ドット、金ナノ粒子、同位元素およびビオチン等のインジケータでラベリングされ、その結果、それらは蛍光顕微鏡、アレイスキャナ、銀染色着色方法、酵素反応着色方法などによって検出するのに適しているものである；
２）上述のプローブを準備するステップであって、第１に、プローブは検出されるターゲットに応じて設計され、プローブはターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列のフラグメントに加えて、上述のユニバーサルタグと逆相補的なヌクレオチド配列のフラグメントを含み、プローブの末端は、固相担体と結び付けるために改質されるものである、
３）プローブを改質固相担体に結合させるステップ；
４）ユニバーサルタグおよび処理されたテストされるサンプルをハイブリダイゼーション溶液に溶解し、ユニバーサルタグおよびサンプルをプローブ配列とハイブリッド形成させるステップ、あるいは、プロセスは、２つのステップ、すなわち、テストされるサンプルをプローブとハイブリッド形成させ、サンプルを洗浄し、それからユニバーサルタグをプローブ配列とハイブリッド形成させるステップで実行することができる；
４）余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグを除去するために洗浄するステップ；
５）ハイブリダイゼーション信号を検出して、分析するステップ。
【０００９】
本発明による方法において、検出される対象は、ＤＮＡおよびＲＮＡだけでなく、タンパク質、サッカリド分子等を含む。
本発明による方法において、固相担体は、スライドガラス、プラスチック基板、シリコンウエハ、ミクロビーズまたは高分子膜等とすることができる。
本発明による方法において、固相担体は、ポリ−Ｌ−リジン、アルデヒド基、カルボキシルまたはチオール等によって改質されることができる。
【００１０】
検出が本発明のユニバーサルタグおよびプローブを用いて実行されるときに、検出は、サンプルが得られた後ラベリングなしで直接実行されることができ、大幅にコストを減らして、その場で検出するのに有益である。実験手順は単純化され、操作が容易であるために、専門家でなくても操作することができるので、技術の普及に便利である。さらにまた、生体分子のマルチターゲット検出は、本発明のタグおよびプローブを用いて達成されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、塩基スタッキングハイブリダイゼーションを示す図解図である。
【図２】図２は、さまざまな臨床病原体の検出に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図３】図３は、ｍｉＲＮＡプロフィールの分析に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図４】図４は、タンパク質ターゲットのマルチ検出に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【図５】図５は、ｍｉＲＮＡプロフィールの分析に使用するユニバーサルラベリング方法を示す図解図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施例１
さまざまな臨床病原体の検出における本発明による方法の応用
肺炎の呼吸経路から得られる５つの病原体は、実施例１を示す（図２に示される）実施例として見なされる：Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ。使用されるプローブおよびユニバーサルタグは、表１に示される。
【００１３】
【表１】
【００１４】
１．５つの病原体の１６ＳＲＮＡは検出のターゲットとして選ばれ、５つのプローブがそれぞれ合成され、そこにおいて、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ｔ）１２であり、プローブの中央の配列のフラグメントはターゲット分子の一部と相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成されて、その５´末端上でフルオレセインによって改質される；
３．スライドガラスは、アルデヒド基質を準備するために、従来の化学的改良方法を用いて処理される；
４．プローブは、スポッティング緩衝液に溶解され、オリゴヌクレオチド配列はスポッティングによって準備される；
５．患者の呼吸経路からの分泌物は溶解するために加熱され、または、分泌物が細菌培養されたあと、細菌培養懸濁液は溶解するために加熱される。それから、溶解した物質はユニバーサルタグと共にハイブリダイゼーション溶液に溶かされて、プローブ配列とハイブリッド形成される；
６．余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグは、洗浄することによって除去される；
７．検出は蛍光顕微鏡またはアレイスキャナを用いて実行され、分析が実行される。
【００１５】
塩基スタッキングハイブリダイゼーションの効果のため、完全に相補的なターゲット分子がプローブに結合した場合にだけ、ユニバーサルタグは確実にプローブに結合されることができる。ミスマッチターゲット分子がプローブに結合しとき、ユニバーサルタグとプローブとの間の結合は安定することができない。５つのプローブは、それぞれ、５つの病原体の１６ＳＲＮＡとハイブリッド形成される。このように、感染した病原体のタイプおよび内容は、臨床治療の薬剤を導くために特定されることができる。
【００１６】
実施例２
ｍｉＲＮＡプロフィールの分析における本発明による方法の応用
肝臓の組織から得られる４つのｍｉＲＮＡは、（図３に示される）実施例２を示す実施例と見なされる：ｈｓａ−ｍｉｒ−１９４、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４８およびｈｓａ−ｍｉｒ−１９２。使用されるプローブおよびユニバーサルタグは、表２に示される。
【００１７】
【表２】
【００１８】
１．上述の４つのｍｉＲＮＡに対応するプローブは、ｍｉＲＮＡライブラリに従って準備され、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ａ）１０であり、プローブの中央の配列のフラグメントはｍｉＲＮＡと相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成され、その５´末端上において金ナノ粒子によって改質される；
３．スライドガラスは、アルデヒド基質を準備するために、従来の化学的改良方法を用いて処理される；
４．プローブはスポッティング緩衝液に溶解され、オリゴヌクレオチド配列がスポッティングによって準備される；
５．サンプルが溶解されるかまたは全ＲＮＡが抽出され小さいＲＮＡ（ｓＲＮＡ）が分離されて濃縮されたあと、サンプルは、ユニバーサルタグとともに、ハイブリダイゼーション溶液に溶かされて、プローブとハイブリッド形成される；
６．余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグは、洗浄によって除去される；
７．銀共力剤が信号を強化するために加えられる；
８．信号は、ｍｉＲＮＡの発現プロフィールを特定するために、平板スキャナを用いて検出され分析される。
【００１９】
実施例３
タンパク質ターゲットに関する多重検出における本発明による方法の応用
アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胚抗原（ＣＥＡ）およびヒト血清から得られる全前立腺特異抗原（ＴＰＳＡ）は、実施例３を示す（図４に示される）実施例として見なされる。使用されるプローブ、バイオ・バーコードおよびユニバーサルタグは、表３に示される。
【００２０】
【表３】
【００２１】
１．検出される３つの抗原に対応する抗体は電磁ビーズに結合され、抗体に結合された電磁ビーズは試料溶液と反応し、抗原抗体複合体を形成する；
２．余分なサンプルは、磁気分離によって除去され、抗体およびバイオ・バーコード（検出される３つの抗原は、３つの異なるバーコード・ヌクレオチド配列に対応する）によって改質される金ナノ粒子は抗原抗体複合体と反応し、電磁ビーズ−抗原−金ナノ粒子の複合体を形成する；
３．余分な金ナノ粒子は磁気分離によって除去され、バイオ・バーコードはＤＴＴ溶液を用いて金ナノ粒子から切り離される；
４．切り離されたバイオ・バーコードおよびＦＡＭでラベリングされたユニバーサルタグは、ハイブリダイゼーション溶液に溶解され、プローブ配列とハイブリッド形成される（プローブの３´末端はユニバーサルタグと相補的であり、プローブの中央の部分は対応するバイオ・バーコードと相補的であり、５´末端はｐｏｌｙ（Ｔ）１０であって、５´末端がアルデヒド・スライドガラスに固定されるようにアミノ基によって改質される）；
５．余分なユニバーサルタグは、洗浄によって除去される；
６．検出および分析は、血清サンプルの３つの抗原のタイプおよび内容を特定するために、蛍光顕微鏡またはアレイスキャナを用いて実行される。
【００２２】
実施例４
高い特異性を有するｍｉＲＮＡの分析における本発明による方法の応用
ｍｉＲＮＡ（図５に示される）のｈｓａ−ｌｅｔ−７ファミリーの４つのメンバーｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄは、実施例４を示す実施例と見なされ、使用されるプローブ、ユニバーサルタグおよびターゲットは、表４に示される。
【００２３】
【表４】
【００２４】
１．ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆおよびｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄに対応する４つのプローブは、それぞれ、ｍｉＲＮＡライブラリに従って合成され、プローブの５´末端はｐｏｌｙ（Ａ）１０であり、プローブの中央の配列のフラグメントは関連のあるｍｉＲＮＡと相補的であり、３´末端上の配列のフラグメントはユニバーサルタグと相補的であり、プローブの５´末端はアミノ基によって改質される；
２．ユニバーサルタグは合成され、５´末端はルシフェリンＣｙ３によって改質される；
３．ターゲットＴ−ｌｅｔ−７ｂが合成される；
４．アルデヒド・スライドガラスは、化学的改良法を用いて準備される；
５．プローブはスポッティング緩衝液に溶解され、４つのプローブのオリゴヌクレオチド配列は、スポッティング・プロセスによって準備される；
６．ターゲットＴ−ｌｅｔ−７ｂおよびユニバーサルタグはハイブリダイゼーション溶液に溶解され、配列とハイブリッド形成される；
７．配列のスライドガラスは洗浄される；
８．スライドガラスは、スキャナで走査される；
９．本発明の方法が高い特異性を有して、２つ、３つまたは４つのミスマッチ塩基だけを有するターゲットを確認することが可能であることを示す結果となった。
【００２５】
参照文献
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグであって、
ユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはＬＮＡのフラグメントであり、
ユニバーサルタグは、長さが３−２０ｍｅｒであることを特徴とする、ユニバーサルタグ。
【請求項２】
ユニバーサルタグは、蛍光染料、量子ドット、金ナノ粒子、同位元素および／またはビオチンを含むインジケータでラベリングされることを特徴とする、請求項１に記載のユニバーサルタグ。
【請求項３】
生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブであって、
プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列、およびユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列を含むか、または、
プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記ユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはＬＮＡのフラグメントであって、長さが３−２０ｍｅｒであることを特徴とする、プローブ。
【請求項４】
末端基は、アミノ、チオール、カルボキシルまたはビオチンであることを特徴とする、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
生体分子のマルチターゲット検出方法であって、
１）請求項１にしたがってユニバーサルタグを準備するステップ；
２）請求項２にしたがってプローブを準備するステップ；
３）前記プローブを改質固相担体に結合させるステップ；
４）プローブ配列とハイブリッド形成するためにハイブリダイゼーション溶液に前記ユニバーサルタグおよびテストされるサンプルを溶解するか、または、最初に、テストされるサンプルを前記プローブとハイブリッド形成させ、次に、洗浄した後に前記ユニバーサルタグを前記プローブ配列とハイブリッド形成させるステップ；
５）余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグを除去するために洗浄するステップ；
６）ハイブリダイゼーション信号を検出して分析するステップ、
を含むことを特徴とする、生体分子のマルチターゲット検出方法。
【請求項６】
固相担体は、スライドガラス、プラスチック基板、シリコンのスライス、ミクロビーズまたは高分子膜であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
固相担体がエポキシ基、アミノ、ポリ−Ｌ−リジン、アルデヒド基、カルボキシル、またはチオールによって改質されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
検出方法で検出される対象が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および／またはサッカリドの分子であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１】
生体分子のマルチターゲット検出のためのユニバーサルタグであって、
ユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはＬＮＡのフラグメントであり、
ユニバーサルタグは、長さが３−２０ｍｅｒであることを特徴とする、ユニバーサルタグ。
【請求項２】
ユニバーサルタグは、蛍光染料、量子ドット、金ナノ粒子、同位元素および／またはビオチンを含むインジケータでラベリングされることを特徴とする、請求項１に記載のユニバーサルタグ。
【請求項３】
生体分子のマルチターゲット検出のためのプローブであって、
プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列、およびユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列を含むか、または、
プローブは、３´末端から５´末端まで順番に、ユニバーサルタグと逆相補的であるヌクレオチド配列、ターゲット分子またはターゲット分子の一部と逆相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記ユニバーサルタグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはＬＮＡのフラグメントであって、長さが３−２０ｍｅｒであることを特徴とする、プローブ。
【請求項４】
末端基は、アミノ、チオール、カルボキシルまたはビオチンであることを特徴とする、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
生体分子のマルチターゲット検出方法であって、
１）請求項１にしたがってユニバーサルタグを準備するステップ；
２）請求項２にしたがってプローブを準備するステップ；
３）前記プローブを改質固相担体に結合させるステップ；
４）プローブ配列とハイブリッド形成するためにハイブリダイゼーション溶液に前記ユニバーサルタグおよびテストされるサンプルを溶解するか、または、最初に、テストされるサンプルを前記プローブとハイブリッド形成させ、次に、洗浄した後に前記ユニバーサルタグを前記プローブ配列とハイブリッド形成させるステップ；
５）余分なサンプルおよび余分なユニバーサルタグを除去するために洗浄するステップ；
６）ハイブリダイゼーション信号を検出して分析するステップ、
を含むことを特徴とする、生体分子のマルチターゲット検出方法。
【請求項６】
固相担体は、スライドガラス、プラスチック基板、シリコンのスライス、ミクロビーズまたは高分子膜であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
固相担体がエポキシ基、アミノ、ポリ−Ｌ−リジン、アルデヒド基、カルボキシル、またはチオールによって改質されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
検出方法で検出される対象が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および／またはサッカリドの分子であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５２４５２６（Ｐ２０１２−５２４５２６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６３１１（Ｐ２０１２−５０６３１１）
【出願日】平成２２年４月２０日（２０１０．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０００５４１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７５５０
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５１１２５７１９３）中国科学院蘇州ナノテク・ナノバイオニクス研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２０日（２０１０．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０００５４１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７５５０
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５１１２５７１９３）中国科学院蘇州ナノテク・ナノバイオニクス研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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