生体分子修飾のためのポリイオンデンドリマー
【課題】
本発明は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作で生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤を提供する。
【解決手段】
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー、並びにそれを用いたラベル化剤、及びラベル化方法に関する。
本発明は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作で生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤を提供する。
【解決手段】
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー、並びにそれを用いたラベル化剤、及びラベル化方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー、並びにそれを用いた生体分子のラベル化剤、及びラベル化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質をはじめとする生体分子の標識化には、化学結合の生成を伴う手法が用いられてきた。しかしながら、そのよう手法では、標識化に伴い生体分子の活性が変化することもあり、多くの場合、遺伝子工学的手法により変異体を調製する必要があった。
生体分子の改変法は、遺伝子工学的手法により発現過程で変異を導入する手法か、後処理行程において化学修飾を利用する手法により行われている。後者は、共有結合を介して分子の修飾を行う手法であるが、あらかじめ修飾位置に適切な変異を加えた変異体を調製する必要があった。また、多くの場合、修飾剤に合わせてあらかじめ生体分子を改変する必要がある。このため、生体分子をそのまま修飾できる汎用性の高い標識手法の開発が待たれていた(非特許文献１)。
【０００３】
デンドリマーは、ギリシャ語の「dendri-」(樹木状)と「meros」(一部)を組み合わせて名づけられた、中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、構造が正確にコントロールされた樹木状のポリマーである。過去１０年間に５０００以上の論文が発表されてきているが、他の高分子と比べて合成が極めて困難であるため、実用化は難しとされている。現在最もよく用いられているポリアミドアミン構造を持つＰＡＭＡＭデンドリマーなどは、既に市販されてきている。
デンドリマーは、コア (core) と呼ばれる中心分子と、デンドロン (dendron) と呼ばれる樹状の分岐構造部分、及び表面（surface）と呼ばれる末端基部分から構成され、デンドロン部分の分岐回数を世代 (generation) と言っている。一般に高分子はある程度の分子量分布を持つが、高世代のデンドリマーは、分子量数万に達するもののほとんど単一分子量であるという、際立った特徴を持っている。
コア（core）はデンドリマー全体のサイズ・形・方向性・多様性を決定する部位であるとされており、デンドロン (dendron) は、枝状のセルが規則的に増えていく部分で、このセルが空間のタイプと大きさを決定し、枝状のセルの多重度は世代(generation)に対して指数関数的に増加する。表面（surface）は反応性・非反応性の末端基で構成され、末端基のタイプにより様々な機能を発現することができると共に、外部のゲスト分子の出入りをコントロールするゲートの役割もになっている。
【０００４】
デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば、リジン単位の層に基くデンドリマーの製造法（特許文献１参照）、ポリアミドアミンを含む他の単位に基くデンドリマーやＰＡＭＡＭデンドリマーの製造法（特許文献２参照）などが報告されている。これらのデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤または油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、及び塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適するとされているが、医薬製造用の基剤として使用（特許文献３参照）や、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合させるためのもの（特許文献４参照）なども既に報告されてきている。
また、表面の末端基としてグアニジン基のようなカチオン性の基を有するデンドリマー（樹状高分子化合物）も知られており、例えば、ポリアミドアミンデンドリマーやポリリジンデンドリマーやポリ(プロピレンイミン)デンドリマーなどの表面に４級アミノ含有部分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分などのイオン性基を設けたデンドリマーを毒性物質による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献５参照）や、同じデンドリマーを細菌などの微生物又は寄生虫による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献６参照）、また、このようなイオン性末端基を有するデンドリマーをゲル形成剤として農薬や衛生用品の担体として使用するもの（特許文献７参照）などが報告されている。さらに、カチオン性の基を有するポリエチレンイミンデンドリマーなどのカチオン性物質をアニオン性の酵素活性蛍光基質と複合させて蛍光基質の膜輸送系を形成させる方法も報告されている（特許文献８参照）。
しかしながら、コア部に蛍光プローブを共有結合させたものは知られていない。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献４】国際特許公開 ＷＯ ９５／２４２２１号公報
【特許文献５】特表２００２−５２４５２３号公報
【特許文献６】特表２００２−５２４５２４号公報
【特許文献７】特表２００２−５３８１８６号公報
【特許文献８】特表２００６−５１７３８２号公報
【非特許文献１】Timothy L Foley and Michael D Burkart, advances and applications Current Opinion in Chemical Biology, 2007, 11:12-19
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明で解決しようとする課題は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作で生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤を提供することにある。また、このような修飾剤の基本骨格となる分子の設計指針と合成手法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にグアニジン基あるいはチオウレニウム基を多数擁するポリグアニジンデンドリマーの分子設計とその合成法を確立することによる、生体分子の修飾の可能性の開拓に挑戦してきた。これらの化合物は、複数のイオン性官能基を表面に持つため、タンパク質、核酸など複数のアニオン性官能基を持つ生体分子と強く結合し、これらの生体分子をラベル化することが可能となることを見出した。例えば、表面に複数のグアニジン基あるいはチオウロニウム基を有するデンドリマー（樹状高分子）は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と強く相互作用し、ラベル化できることを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。より詳細には、本発明は、下記の一般式［１］
【０００９】
【化４】
【００１０】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表し、ｍは世代を示し１〜５の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。さらに詳細には、本発明は、下記の一般式［２］、
【００１１】
【化５】
【００１２】
又は、下記の一般式［３］
【００１３】
【化６】
【００１４】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
また、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤、又はラベル化用組成物に関する。
さらに、本発明は、標的とする生体分子が存在する試料中に、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法に関する。
【００１５】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
（２）蛍光性の基がピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、又はローダミンのいずれかである前記（１）のポリイオンデンドリマー。
（３）分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４−ジヒドロキシ安息香酸アミド、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである前記（１）又は（２）に記載のポリイオンデンドリマー。
（４）分岐鎖が、繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（５）世代が、１〜５世代である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（６）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［１］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（７）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［２］、又は、前記した一般式［３］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（８）蛍光性の基が、ピレンである前記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤。
（１０）生体分子が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である前記（９）に記載のラベル化剤。
（１１）標的とする生体分子が存在する試料中に、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、共有結合を介さず、分子間相互作用によりそのまま生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤として有用な新規なデンドリマーを提供する。すなわち、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にグアニジン基を多数擁するポリグアニジン型デンドリマー（樹状高分子）により、生体分子の修飾を行うことにより、共有結合を介することなく、生体分子をラベル化することができる。
本発明の方法により、生体分子を共有結合でラベル化することによる生体分子の化学的な変性をすることなく、生体分子を生体分子のままの状態でラベル化することが可能となり、より自然な状態で生体分子の挙動を測定することが可能となるだけでなく、より簡便な方法で生体分子の存在を検出することが可能となる。
具体的には、表面部としてグアニジン基、分岐鎖として親水性の高いポリエチレングリコール基、コア部として、様々な官能基を導入可能なカルボキシル基を有する樹状高分子を分子設計し、その合成法を確立した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第一にデンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有することである。このようなカチオン性の基としては、次の式［４］、［５］、及び［６］、
【００１８】
【化７】
【００１９】
が挙げられる。これらの基の水素原子部分は炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基などで置換されていてもよい。
このようなカチオン性の基はデンドリマー表面部に１個以上あればよいが、好ましくは表面部の末端の全てがこれらのカチオン性の基を有するものが挙げられる。
最近、グアニジン基を有するアミノ酸であるアルギニンの作用に注目が集まっている。特に、アルギニンを導入した化合物の細胞膜透過性が増すことが報告されており、この理由がグアニジン基にあるとされている。本発明のデンドリマー（樹状高分子）においても、本発明のデンドリマーが優れた細胞膜透過を有する一因が、グアニジン基のようなカチオン性の基を多数有していることと考えられる。なお、前記式［５］及び［６］で示されるチオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基もプロトンの付加により、グアニジウム基と同様にカチオン性とすることができる。
【００２０】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第二に分岐鎖として親水性の高いポリアルキレンオキシ基を有していることである。本発明におけるアルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。好ましいアルキレンオキシ基としては、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基などが挙げられるが、入手のしやすさや親水性などの点からエチレンオキシ基が好ましい。また、これらのアルキレンオキシ基は、水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基などの親水性の基で置換されていてもよい。
分岐鎖におけるアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは２〜４が挙げられる。また、デンドリマーの各世代において、これらの繰り返し数は同じであっても異なっていてもよい。これらの繰り返し数により、デンドリマーの内部のセル空間の広さが確保されることから、コア部に大きな蛍光性の基を導入しようとする場合には、比較的大きな繰り返し数が必要となるし、蛍光性の基が小さいものであれば、繰り返し数は比較的少なくてもよい。
【００２１】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第三にコア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることである。当該カルボキシ基は、遊離のカルボキシル基として存在することができるのであれば、分岐鎖を形成することができる基を有している限りにおいて、どのような化合物から誘導されるものであってもよいが、好ましくは本発明のデンドリマーにおける分岐部分を形成する分子と同じ化合物から誘導されるものが挙げられる。例えば、ポリヒドロキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、トリカルボン酸や、テトラカルボン酸などが挙げられる。好ましい具体例としては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドなどが挙げられる。
また、当該カルボキシ基に結合する蛍光性の基としては、測定可能な蛍光を発する基であって、カルボキシ基に共有結合することができる官能基、例えば、水酸基やアミノ基などの官能基を有する化合物であれば特に制限はない。好ましい蛍光性の基としては、例えば、ピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基が挙げられる。これらの基にカルボキシ基に共有結合させるための官能基を導入して、カルボキシ基に共有結合させることができる。例えば、ピレンにアミノメチル基を導入し、アミノメチルピレンとし、次の式［７］
【００２２】
【化８】
【００２３】
で示されるように、コア部のカルボキシ基とアミド結合させることができる。
カルボキシル基と蛍光性の基との結合は、共有結合が可能であればどのような形態であってもよい。好ましい結合としては、アミド結合、エステル結合などが挙げられる。
【００２４】
本発明のポリイオンデンドリマーの分岐部分を形成する化合物としては、分岐可能なものであれば特に制限はないが、好ましくはコア部の化合物と同種の化合物の使用が挙げられる。例えば、コア部におけるカルボキシ基を有する化合物として、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸を用いた場合には、分岐部分においてもこれを用いることが製造の容易さの点からも好ましい。
分岐部分の化合物と、分岐鎖の結合も任意に選択することができる。例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、イミノ（−Ｎ−）結合などの任意の結合を選択することができる。
【００２５】
本発明のポリイオンデンドリマーの製造方法としては、デンドリマーの公知の製造方法に準じた製造方法を適用することができる。例えば、コア部を形成して第一世代を製造する方法、又は第一世代を形成した状態でコア部を形成させる方法により、コア部と第一世代を製造し、次いで、必要に応じて第二世代、第三世代と成長させる方法が挙げられる。そして、表面の末端部を形成させることにより製造することができる。
より具体的には、後記する実施例を参照されたい。
【００２６】
前記してきた一般式［１］で表される本発明のポリイオンデンドリマーは、分岐鎖がエチレンオキシ基であり、分岐部分が３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸で前の世代の分岐鎖とアミド結合で結合され、次の世代とエーテル結合で結合され、分岐鎖の繰り返し数がｎで世代がｍのものを表している。
また、前記した一般式［２］は、２世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表しており、前記した一般式［３］は１世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表している。
これらはいずれも本発明の好ましいポリイオンデンドリマーの例であり、より具体的には、本発明の好ましいポリイオンデンドリマーとして、次のＧ０−Ｇ、Ｇ１−Ｇ、及びＧ０−Ｔが挙げられる。
【００２７】
【化９】
【００２８】
【化１０】
【００２９】
【化１１】
【００３０】
本発明のポリイオンデンドリマーは、細胞膜透過性を有するだけでなく生体分子と会合して、当該生体分子をラベル化することができる。本発明のポリイオンデンドリマーは生体分子と会合するだけであり、共有結合で結合されている訳ではないことから生体分子の構造は何等変化することなくラベル化することができる。したがって、生体分子を生体内に存在しているままの構造で測定することができることになる。
本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤を提供する。本発明のラベル化剤は、本発明のポリイオンデンドリマー、及び測定用の担体とを含有してなるラベル化用組成物として提供することもできる。本発明のラベル化剤又はラベル化用組成物は、本発明のポリイオンデンドリマーに結合されている蛍光性の基による蛍光を測定することもできるし、また生体分子との会合による蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として測定することもできる。
また、本発明は、標的とする生体分子が存在する試料中に、本発明のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法を提供する。このようにして、本発明のポリイオンデンドリマーを用いて生体分子をラベル化することができ、当該ラベル化による蛍光を測定することにより、生体分子を検出し、その挙動を生体内に存在しているままの状態で測定することができる。
蛍光や蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定方法としては、公知の測定方法を使用することができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
Ｇ０−Ｇの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ０−Ｇを製造した。
【００３３】
【化１２】
【００３４】
（１）化合物２の製造
既知のトリアジドデンドロン（１）４３ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ）と１−ピレンメチルアミン塩酸塩３６ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で脱水ジクロロメタン１．０ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン８５μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１８ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２５ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で７時間撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。２回のカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→１／０）、（シリカゲル、酢酸エチル）で精製し、黄色油状の液体として得た（５３ｍｇ；収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
3.24 (t,4H;ＯＣＨ２Ｎ３ outer), 3.33 (t, 2H;ＯＣＨ２Ｎ３ inner),
3.52-3.80 (m, 24H;ＯＣＨ２), 4.16 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２),
5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ), 7.03 (s, 2H;Ar-H),
7.98-8.21 (m, 8H;Pyrene), 8.32 (d, 1H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８５４．３７，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８７８．４０，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８９３．３９．
【００３５】
（２）化合物３の製造
前記（１）で製造した化合物（２）５０ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム−炭素２０ｍｇを混合し、エタノール４．０ｍＬに溶解させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで薄黄色油状の液体として得た（３６ｍｇ；収率９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.92 (br, 6H, ＮＨ２), 2.67 (t, 4H;ＯＣＨ２ＮＨ２ outer),
2.76 (t, 2H;ＯＣＨ２ＮＨ２ inner), 3.43-3.78 (m, 24H;ＯＣＨ２),
4.15 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.31 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ),
7.16 (s, 2H;Ar-H), 7.99-8.16 (m, 8H;Pyrene), 8.19 (d, 1H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ７７６．４０
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ ７７７．５１，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ７９９．４９，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８１７．５４．
【００３６】
（３）化合物４の製造
前記（２）で製造した化合物（３）２０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ”−トリフリルグアニジン３６ｍｇ（０．０９２ｍｍｏｌ）を混合し、ジクロロメタン１ｍＬに溶解させた。トリエチルアミン４０μＬを添加した後、室温で終夜撹拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、２Ｍ硫酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１→１／０）で精製することで黄色油状の液体として得た（１４ｍｇ；収率３６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.52 (s, 54H;Ｃ（ＣＨ３）３), 3.47-3.83 (m, 30H;ＯＣＨ２),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.36 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
7.24 (s, 2H;Ar-H), 8.03-8.18 (m, 8H;Pyrene),
8.23 (br, 3H;NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.44 (br, 3H;NHBoc).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １５０２．７８，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ １５０４．４５，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １４０３．７２，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ２＋Ｈ＋］ １３０３．６６，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ３＋Ｈ＋］ １２０３．６０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ４＋Ｈ＋］ １１０３．５７．
【００３７】
（４）デンドリマーＧ０−Ｇの製造
前記（３）で製造した化合物（４）１８ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）をメタノール５００μＬ中に溶解させ、１２Ｍ塩酸３００μＬを添加した。室温で２日間撹拌した後、減圧下で乾燥させることで黄色固体として得た（１２ｍｇ；収率＞９９％）
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.29 (t, 6H;ＣＨ２-Guanidine), 3.51 (t, 6H;ＯＣＨ２),
3.56-3.62 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.70 (t, 2H;ＯＣＨ２ inner),
3.76 (t, 4H;ＯＣＨ２ outer), 4.08 (t, 2H;ＰｈＯＣＨ２ inner),
4.18 (t, 4H;ＰｈＯＣＨ２ outer), 5.23 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ),
7.17 (br, 12H; ＮＨ２), 7.34 (s, 2H;Ar-H),
7.63 (br, 3H;ＮＨ（ＮＨ２）２), 8.01-8.19 (m, 4H;Pyrene),
8.22-8.30 (m, 4H;Pyrene), 8.54 (d, 1H;Pyrene), 9.18 (s, 1H;CONH).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０１０．４０，
実測値：［Ｍ−Ｃｌ−］（Ｉ） ９７５．２６，
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４５２．１６．
【実施例２】
【００３８】
Ｇ１−Ｇの合成
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−Ｇを製造した。
【００３９】
【化１３】
【００４０】
（１）化合物５の製造
化合物（１）９３１ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム−炭素４００ｍｇをエタノール３０ｍＬに溶解させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで薄黄色油状の粘性液体として得た（７８１ｍｇ；収率９６％）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ５６３．３１，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ ５６４．３４，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ６０４．３７．
【００４１】
（２）化合物６の製造
前記（１）で製造した化合物（５）３４４ｍｇ（０／６１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／ＴＨＦ（ｖ／ｖ；１／１）混合溶液に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン１ｍＬ、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラアゾール−１−カルボキサミド６２５ｍｇ（２．０１ｍｍｏｌ）を順次添加した。室温で終夜撹拌した後、減圧下で溶媒を除去した。酢酸エチルに溶解させ、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをリサイクルＧＰＣで精製し、薄黄色の油状液体として得た（４６７ｍｇ；収率５９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.42 (s, 36H;Ｃ（ＣＨ３）３ outer), 1.42 (s, 18H;Ｃ（ＣＨ３）３ inner),
3.50-3.64 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.73-3.79 (m, 12H;ＯＣＨ２),
4.17 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 7.34 (s, 2H;Ar-H),
8.52 (br, 3H; NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.40 (br, 3H, NHBoc).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １２８９．６９，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ １３１２．６９，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １１９０．６６，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ２＋Ｈ＋］ １０９０．５０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ３＋Ｈ＋］ ９９０．５５，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ４＋Ｈ＋］ ８９０．５０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ６＋Ｈ＋］ ６９０．４３．
【００４２】
（３）化合物７の製造
前記（１）で製造した化合物（５）３．３ｍｇ（４．２５μｍｏｌ）と（６）２０ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）をアルゴン下、脱水ジクロロメタン１ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン１００μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール２．１ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３．０ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）を順次添加し、室温で終夜撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。リサイクルＧＰＣで精製し、黄色油状の液体として得た（６．４ｍｇ；収率３３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.41 (m, 162H;Ｃ（ＣＨ３）３), 3.49-3.69 (m, 120H;ＯＣＨ２),
4.07 (br, 24H;ＰｈＯＣＨ２), 5.27 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
6.96 (s, 2H;Py-Ar-H), 7.18 (br, 6H;Ar-H),
7.97-8.13 (m, 9H;Pyrene),
8.53 (br, 9H; NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.38 (br, 9H, NHBoc).
【００４３】
（４）デンドリマーＧ１−Ｇの製造
前記（３）で製造した化合物（７）１４ｍｇ（３．０μｍｏｌ）をメタノール２５０μＬに溶解させ、１２Ｍ塩酸１５０μＬを添加した。室温で２日間撹拌した後、減圧下で乾燥させることで薄黄色固体として得た（９．６ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.30 (m, 18H;ＣＨ２-Guanidine outer),
3.40 (m, 6H;ＣＨ２-Guanidine inner), 3.51-3.62 (m, 72H;ＯＣＨ２),
3.68 (m, 6H;ＯＣＨ２ inner), 3.76 (m, 18H;ＯＣＨ２ outer),
4.07 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２ inner), 4.15 (m, 18H;ＰｈＯＣＨ２ outer),
5.22 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ), 7.17 (br, 36H; ＮＨ２),
7.23 (s, 6H;Ａｒ−Ｈ peripheral), 7.33 (s, 2H;Ａｒ−Ｈ core),
7.64 (br, 9H;ＮＨ（ＮＨ２）２), 8.01-8.26 (m, 8H;Pyrene),
8.45 (br, 3H;ＣＯＮＨ peripheral), 8.54 (d, 1H;Pyrene),
9.18 (s, 1H;ＣＯＮＨ core).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０１０．４０，
実測値：［Ｍ−Ｃｌ−］（Ｉ） ９７５．２６，
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４５２．１６．
【実施例３】
【００４４】
Ｇ０−Ｔの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ０−Ｔを製造した。
【００４５】
【化１４】
【００４６】
（１）化合物９の製造
没食子酸メチル１．５６ｇ（８．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４５ｍＬに溶解させ、そこに炭酸カリウム１１．７ｇ（８４．７ｍｍｏｌ）を添加した。既知のトリエチレングリコール誘導体（８）７．０７ｇ（２８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４０ｍＬに溶かした溶液を添加し、８０℃で１８時間撹拌した。室温に戻した後、６０℃減圧下でＤＭＦを除去し、ジクロロメタンに再度溶解させ、ろ過により固体成分を除去した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル→酢酸エチル／アセトン＝９／１）で精製し、橙色の油状液体として得た（１．５１ｇ；収率２１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２（THP）),
3.4-3.9 (m, 39H;ＯＣＨ２(THP,TEG)，ＯＣＨ３),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (t, 3H;OCHO), 7.27 (s, 2H;Ar-H).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８３２．４５，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８５５．５６，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８７１．５３．
【００４７】
（２）化合物１０の製造
前記（１）で製造した化合物（９）１．５１ｇ（１．８１ｍｍｏｌ）を９５％エタノール８０ｍＬに溶解させ、１Ｍ 水酸化カリウム６．４ｍＬを添加した。これを終夜、加熱還流しながら撹拌した後、室温に戻した。溶液をアンバーライトＩＲ１２０（陽イオン交換樹脂）に通して中和した。減圧下で溶媒を除去することで薄黄色の油状液体として得た（１．３５ｇ；収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２(THP)),
3.4-4.0 (m, 36H;ＯＣＨ２(THP,TEG)),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (m, 3H;OCHO), 7.27 (s, 2H;Ar-H).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８１８．４３，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８５７．４４，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８４１．４７，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｋ＋］ ７７３．３８，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｎａ＋］ ７５７．４２，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｋ＋］ ６８９．３２，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｎａ＋］ ６７３．３６，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｋ＋］ ６０５．２６，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｎａ＋］ ５８９．２９．
【００４８】
（３）化合物１１の製造
前記（２）で製造した化合物（１０）４４３ｍｇ（０．５４１ｍｍｏｌ）と１−ピレンメチルアミン塩酸塩２７９ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）を混合し、アルゴン下で脱水ジクロロメタン８ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン７００μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１４１ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２００ｍｇ（１．０４２ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で終夜撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（アルミナ、酢酸エチル／ヘキサン＝４／１→１／０→メタノール）で精製し、黄色油状液体として得た（５０８ｍｇ；収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２(THP)),
3.4-4.0 (m, 36H;ＯＣＨ２(THP,TEG)),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (m, 3H;OCHO),
5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ), 7.12 (s, 2H;Ar-H).
8.0-8.3 (m, 9H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０３１．５２，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ １０５４．５９，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｋ＋］ ９８６．５０，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｎａ＋］ ９７０．５３，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｋ＋］ ９０２．４４，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｎａ＋］ ８８６．４７，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｋ＋］ ８１８．３８，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｎａ＋］ ８０２．４１．
【００４９】
（４）化合物１２の製造
前記（３）で製造した化合物（１１）５０７ｍｇ（０．４９１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸１２ｍｇ（０．０６３ｍｍｏｌ）を混合し、メタノール１０ｍＬに溶解させた。室温で終夜撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、減圧下メタノールを除去した。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。得られた油状液体とｐ−トルエンスルホン酸５０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）を混合し、メタノール１０ｍＬに溶解させ５０℃で撹拌した。反応溶液にピリジニウムｐ−トルエンスルホナート４０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、５５℃で終夜撹拌した。減圧下、溶媒を除去して得られた固体１９３ｍｇ（全体の３０％を使用）に四臭化炭素１０１ｍｇ（０．３０５ｍｍｏｌ）を混合した。これをアルゴン下、脱水ジクロロメタン２ｍＬに溶解させ、トリフェニルホスフィン８０ｍｇ（０．３０５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で終夜撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、ジクロロメタンに再び溶解したものをろ過することで固体成分を除去した。２回のカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→１／０）（シリカゲル、クロロホルム→酢酸エチル）で簡易精製した後、分取用ＴＬＣで精製することで黄色油状液体として得た（２９ｍｇ；収率１２％(calcd.)）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
3.33-3.36 (t, 4H;ＯＣＨ２Ｂｒ outer),
3.40-3.42 (t, 2H;ＯＣＨ２Ｂｒ inner), 3.60-3.78 (m, 24H;ＯＣＨ２),
4.16 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
7.05 (s, 2H;Ar-H). 8.0-8.3 (m, 9H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ９６５．１０，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ １００８．１２，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ９９０．１４，
実測値：［Ｍ＋］ ９６８．４７．
【００５０】
（５）デンドリマーＧ０−Ｔの製造
前記（４）で製造した化合物（１２）２４ｍｇ（２４．８μｍｏｌ）とチオ尿素５．９ｍｇ（７８μｍｏｌ）を混合し、ジクロロメタン５００μＬと９６％エタノール５００μＬの混合溶液に溶解させた。これを終夜、加熱還流した後、室温に戻したものをメタノールに溶解させた。これを多量のヘキサンに滴下して生じた固体成分をろ過により除去し、溶媒を除去して得られる黄色油状液体を再びチオ尿素１５ｍｇ（０．１９７ｍｍｏｌ）と混合し、エタノール１ｍＬに溶解させ、２日間加熱還流した。減圧下で溶媒を除去し、メタノールに再度溶解させ、固体成分をろ過して除去した。真空下で乾燥させ、黄色固体として得た（３０ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.38 (m, 6H;ＯＣＨ２Ｓ), 3.64 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.72 (m, 8H;ＯＣＨ２),
3.81 (m, 4H;ＯＣＨ２), 4.14 (t, 2H;ＰｈＯＣＨ２ inner),
4.32 (t, 4H;ＰｈＯＣＨ２ outer), 5.28 (s, 2H, ＣＨ２−Ｐｙ),
6.93 (br, 12H;ＳＣ（ＮＨ２）２), 7.36 (s, 2H;Ar-H),
8.10-8.36 (m, 8H;Pyrene), 8.57 (d, 1H;Pyrene), 8.96 (br,1H;CONH).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １１９３．１３
実測値：［Ｍ−Ｂｒ−］（Ｉ） １１１５．９９
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−２Ｃｌ−］（Ｉ） １０３６．０６
実測値：［Ｍ＋２Ｈ＋−３Ｃｌ−］（Ｉ） ９５４．１５
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７７．５７
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ−３Ｃｌ−］（ＩＩＩ） ３１８．７１
【実施例４】
【００５１】
溶媒としてトリス・ＨＣｌ２０ｍＭ（ｐＨ７）中にＢＳＡ水溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）の３ｍＬを添加した溶液中に、実施例１〜３で製造した各種デンドリマー（（ａ）Ｇ０−Ｇ（ｂ）Ｇ１−Ｇ（ｃ）Ｇ０−Ｔ）の１ｍＭ溶液を、０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトル変化を測定した。測定温度は２５℃で、励起波長は２７７ｎｍである。結果を図１（ａ）、図２（ｂ）、及び図３（ｃ）にそれぞれ示す。図１〜３の縦軸は強度（ａ．ｕ．）であり、横軸は波長（ｎｍ）を示す。黒色実線（原図では青色）はデンドリマーを添加していない場合を示し、３４０ｎｍ付近における当該黒実線の下から順に０．６７当量の場合（原図では赤色）、１．３４当量の場合（原図では緑色）、２．０１当量の場合（原図では橙色）、２．６８当量の場合（原図では赤色）、３．３当量の場合（原図では薄青色）をそれぞれ示す。
３４０ｎｍの発光はＢＳＡに対応し、デンドリマーの添加に伴い消光していく様子が観察される。一方、３８０ｎｍ、３９５ｎｍの発光はデンドリマー中のピレンの発光に対応し、添加に伴って強度が増加している。このことから、ＢＳＡ→ピレンに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じ、両者が非常に近傍に存在する、すなわちデンドリマーによるＢＳＡの修飾が成功したことを示す。また、Ｇ０−Ｔでは４５０−５００ｎｍの発光が増加しているが、これはピレンのエキシマー発光に対応するものである。
【実施例５】
【００５２】
実施例４と同様にして、ＣＤスペクトル変化を測定した。結果を、図４（ａ）、図５（ｂ）、及び図６（ｃ）にそれぞれ示す。図４〜６の縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）であり、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
２００−２５０ｎｍ領域のＣＤスペクトルはＢＳＡの二次構造を反映している。いずれの場合もＣＤスペクトルの変化がほとんど観察されないことと、前述の蛍光スペクトル変化の結果を考慮すると、本デンドリマーによる修飾ではタンパク質の構造を乱さないソフトな修飾が可能であることがわかる。
【００５３】
このように、本発明のデンドリマーは、分子間力を利用して生体分子の修飾を直接行えるものであり、修飾のための変異体作製が必要ないという点で、その実用的な利用価値は極めて高い。実施例４及び５では、蛍光プローブとしてピレンを導入しているが、コア部の分子設計は自由に変えることができるため、多様な機能性官能基をタンパク質表面に導入できるものと期待される。さらに潜在的な応用可能性として、機能性物質の生体膜透過に利用できる可能性があるため、特に医薬産業分野での応用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、生体分子と共有結合すること無しに生体分子をレベル化することができるデンドリマーを提供するものであり、機能性物質の生体膜透過に利用できるだけでなく、検査試薬、生体分子の機能解析用の試薬などの各種の試薬や医薬産業分野での応用が可能であり、産業上有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明のデンドリマー（ａ）Ｇ０−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図２】図２は、本発明のデンドリマー（ｂ）Ｇ１−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図３】図３は、本発明のデンドリマー（ｃ）Ｇ０−Ｔを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図４】図４は、本発明のデンドリマー（ａ）Ｇ０−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【図５】図５は、本発明のデンドリマー（ｂ）Ｇ１−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【図６】図６は、本発明のデンドリマー（ｃ）Ｇ０−Ｔを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー、並びにそれを用いた生体分子のラベル化剤、及びラベル化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質をはじめとする生体分子の標識化には、化学結合の生成を伴う手法が用いられてきた。しかしながら、そのよう手法では、標識化に伴い生体分子の活性が変化することもあり、多くの場合、遺伝子工学的手法により変異体を調製する必要があった。
生体分子の改変法は、遺伝子工学的手法により発現過程で変異を導入する手法か、後処理行程において化学修飾を利用する手法により行われている。後者は、共有結合を介して分子の修飾を行う手法であるが、あらかじめ修飾位置に適切な変異を加えた変異体を調製する必要があった。また、多くの場合、修飾剤に合わせてあらかじめ生体分子を改変する必要がある。このため、生体分子をそのまま修飾できる汎用性の高い標識手法の開発が待たれていた(非特許文献１)。
【０００３】
デンドリマーは、ギリシャ語の「dendri-」(樹木状)と「meros」(一部)を組み合わせて名づけられた、中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、構造が正確にコントロールされた樹木状のポリマーである。過去１０年間に５０００以上の論文が発表されてきているが、他の高分子と比べて合成が極めて困難であるため、実用化は難しとされている。現在最もよく用いられているポリアミドアミン構造を持つＰＡＭＡＭデンドリマーなどは、既に市販されてきている。
デンドリマーは、コア (core) と呼ばれる中心分子と、デンドロン (dendron) と呼ばれる樹状の分岐構造部分、及び表面（surface）と呼ばれる末端基部分から構成され、デンドロン部分の分岐回数を世代 (generation) と言っている。一般に高分子はある程度の分子量分布を持つが、高世代のデンドリマーは、分子量数万に達するもののほとんど単一分子量であるという、際立った特徴を持っている。
コア（core）はデンドリマー全体のサイズ・形・方向性・多様性を決定する部位であるとされており、デンドロン (dendron) は、枝状のセルが規則的に増えていく部分で、このセルが空間のタイプと大きさを決定し、枝状のセルの多重度は世代(generation)に対して指数関数的に増加する。表面（surface）は反応性・非反応性の末端基で構成され、末端基のタイプにより様々な機能を発現することができると共に、外部のゲスト分子の出入りをコントロールするゲートの役割もになっている。
【０００４】
デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば、リジン単位の層に基くデンドリマーの製造法（特許文献１参照）、ポリアミドアミンを含む他の単位に基くデンドリマーやＰＡＭＡＭデンドリマーの製造法（特許文献２参照）などが報告されている。これらのデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤または油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、及び塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適するとされているが、医薬製造用の基剤として使用（特許文献３参照）や、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合させるためのもの（特許文献４参照）なども既に報告されてきている。
また、表面の末端基としてグアニジン基のようなカチオン性の基を有するデンドリマー（樹状高分子化合物）も知られており、例えば、ポリアミドアミンデンドリマーやポリリジンデンドリマーやポリ(プロピレンイミン)デンドリマーなどの表面に４級アミノ含有部分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分などのイオン性基を設けたデンドリマーを毒性物質による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献５参照）や、同じデンドリマーを細菌などの微生物又は寄生虫による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献６参照）、また、このようなイオン性末端基を有するデンドリマーをゲル形成剤として農薬や衛生用品の担体として使用するもの（特許文献７参照）などが報告されている。さらに、カチオン性の基を有するポリエチレンイミンデンドリマーなどのカチオン性物質をアニオン性の酵素活性蛍光基質と複合させて蛍光基質の膜輸送系を形成させる方法も報告されている（特許文献８参照）。
しかしながら、コア部に蛍光プローブを共有結合させたものは知られていない。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献３】米国特許第４，２８９，８７２号明細書
【特許文献４】国際特許公開 ＷＯ ９５／２４２２１号公報
【特許文献５】特表２００２−５２４５２３号公報
【特許文献６】特表２００２−５２４５２４号公報
【特許文献７】特表２００２−５３８１８６号公報
【特許文献８】特表２００６−５１７３８２号公報
【非特許文献１】Timothy L Foley and Michael D Burkart, advances and applications Current Opinion in Chemical Biology, 2007, 11:12-19
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明で解決しようとする課題は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作で生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤を提供することにある。また、このような修飾剤の基本骨格となる分子の設計指針と合成手法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にグアニジン基あるいはチオウレニウム基を多数擁するポリグアニジンデンドリマーの分子設計とその合成法を確立することによる、生体分子の修飾の可能性の開拓に挑戦してきた。これらの化合物は、複数のイオン性官能基を表面に持つため、タンパク質、核酸など複数のアニオン性官能基を持つ生体分子と強く結合し、これらの生体分子をラベル化することが可能となることを見出した。例えば、表面に複数のグアニジン基あるいはチオウロニウム基を有するデンドリマー（樹状高分子）は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と強く相互作用し、ラベル化できることを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。より詳細には、本発明は、下記の一般式［１］
【０００９】
【化４】
【００１０】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表し、ｍは世代を示し１〜５の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。さらに詳細には、本発明は、下記の一般式［２］、
【００１１】
【化５】
【００１２】
又は、下記の一般式［３］
【００１３】
【化６】
【００１４】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
また、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤、又はラベル化用組成物に関する。
さらに、本発明は、標的とする生体分子が存在する試料中に、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法に関する。
【００１５】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
（２）蛍光性の基がピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、又はローダミンのいずれかである前記（１）のポリイオンデンドリマー。
（３）分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４−ジヒドロキシ安息香酸アミド、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである前記（１）又は（２）に記載のポリイオンデンドリマー。
（４）分岐鎖が、繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（５）世代が、１〜５世代である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（６）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［１］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（７）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［２］、又は、前記した一般式［３］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（８）蛍光性の基が、ピレンである前記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤。
（１０）生体分子が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である前記（９）に記載のラベル化剤。
（１１）標的とする生体分子が存在する試料中に、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、共有結合を介さず、分子間相互作用によりそのまま生体分子を修飾できる、汎用性の高い修飾化剤として有用な新規なデンドリマーを提供する。すなわち、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にグアニジン基を多数擁するポリグアニジン型デンドリマー（樹状高分子）により、生体分子の修飾を行うことにより、共有結合を介することなく、生体分子をラベル化することができる。
本発明の方法により、生体分子を共有結合でラベル化することによる生体分子の化学的な変性をすることなく、生体分子を生体分子のままの状態でラベル化することが可能となり、より自然な状態で生体分子の挙動を測定することが可能となるだけでなく、より簡便な方法で生体分子の存在を検出することが可能となる。
具体的には、表面部としてグアニジン基、分岐鎖として親水性の高いポリエチレングリコール基、コア部として、様々な官能基を導入可能なカルボキシル基を有する樹状高分子を分子設計し、その合成法を確立した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第一にデンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有することである。このようなカチオン性の基としては、次の式［４］、［５］、及び［６］、
【００１８】
【化７】
【００１９】
が挙げられる。これらの基の水素原子部分は炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基などで置換されていてもよい。
このようなカチオン性の基はデンドリマー表面部に１個以上あればよいが、好ましくは表面部の末端の全てがこれらのカチオン性の基を有するものが挙げられる。
最近、グアニジン基を有するアミノ酸であるアルギニンの作用に注目が集まっている。特に、アルギニンを導入した化合物の細胞膜透過性が増すことが報告されており、この理由がグアニジン基にあるとされている。本発明のデンドリマー（樹状高分子）においても、本発明のデンドリマーが優れた細胞膜透過を有する一因が、グアニジン基のようなカチオン性の基を多数有していることと考えられる。なお、前記式［５］及び［６］で示されるチオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基もプロトンの付加により、グアニジウム基と同様にカチオン性とすることができる。
【００２０】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第二に分岐鎖として親水性の高いポリアルキレンオキシ基を有していることである。本発明におけるアルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。好ましいアルキレンオキシ基としては、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基などが挙げられるが、入手のしやすさや親水性などの点からエチレンオキシ基が好ましい。また、これらのアルキレンオキシ基は、水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基などの親水性の基で置換されていてもよい。
分岐鎖におけるアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは２〜４が挙げられる。また、デンドリマーの各世代において、これらの繰り返し数は同じであっても異なっていてもよい。これらの繰り返し数により、デンドリマーの内部のセル空間の広さが確保されることから、コア部に大きな蛍光性の基を導入しようとする場合には、比較的大きな繰り返し数が必要となるし、蛍光性の基が小さいものであれば、繰り返し数は比較的少なくてもよい。
【００２１】
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第三にコア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることである。当該カルボキシ基は、遊離のカルボキシル基として存在することができるのであれば、分岐鎖を形成することができる基を有している限りにおいて、どのような化合物から誘導されるものであってもよいが、好ましくは本発明のデンドリマーにおける分岐部分を形成する分子と同じ化合物から誘導されるものが挙げられる。例えば、ポリヒドロキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、トリカルボン酸や、テトラカルボン酸などが挙げられる。好ましい具体例としては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドなどが挙げられる。
また、当該カルボキシ基に結合する蛍光性の基としては、測定可能な蛍光を発する基であって、カルボキシ基に共有結合することができる官能基、例えば、水酸基やアミノ基などの官能基を有する化合物であれば特に制限はない。好ましい蛍光性の基としては、例えば、ピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基が挙げられる。これらの基にカルボキシ基に共有結合させるための官能基を導入して、カルボキシ基に共有結合させることができる。例えば、ピレンにアミノメチル基を導入し、アミノメチルピレンとし、次の式［７］
【００２２】
【化８】
【００２３】
で示されるように、コア部のカルボキシ基とアミド結合させることができる。
カルボキシル基と蛍光性の基との結合は、共有結合が可能であればどのような形態であってもよい。好ましい結合としては、アミド結合、エステル結合などが挙げられる。
【００２４】
本発明のポリイオンデンドリマーの分岐部分を形成する化合物としては、分岐可能なものであれば特に制限はないが、好ましくはコア部の化合物と同種の化合物の使用が挙げられる。例えば、コア部におけるカルボキシ基を有する化合物として、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸を用いた場合には、分岐部分においてもこれを用いることが製造の容易さの点からも好ましい。
分岐部分の化合物と、分岐鎖の結合も任意に選択することができる。例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、イミノ（−Ｎ−）結合などの任意の結合を選択することができる。
【００２５】
本発明のポリイオンデンドリマーの製造方法としては、デンドリマーの公知の製造方法に準じた製造方法を適用することができる。例えば、コア部を形成して第一世代を製造する方法、又は第一世代を形成した状態でコア部を形成させる方法により、コア部と第一世代を製造し、次いで、必要に応じて第二世代、第三世代と成長させる方法が挙げられる。そして、表面の末端部を形成させることにより製造することができる。
より具体的には、後記する実施例を参照されたい。
【００２６】
前記してきた一般式［１］で表される本発明のポリイオンデンドリマーは、分岐鎖がエチレンオキシ基であり、分岐部分が３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸で前の世代の分岐鎖とアミド結合で結合され、次の世代とエーテル結合で結合され、分岐鎖の繰り返し数がｎで世代がｍのものを表している。
また、前記した一般式［２］は、２世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表しており、前記した一般式［３］は１世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表している。
これらはいずれも本発明の好ましいポリイオンデンドリマーの例であり、より具体的には、本発明の好ましいポリイオンデンドリマーとして、次のＧ０−Ｇ、Ｇ１−Ｇ、及びＧ０−Ｔが挙げられる。
【００２７】
【化９】
【００２８】
【化１０】
【００２９】
【化１１】
【００３０】
本発明のポリイオンデンドリマーは、細胞膜透過性を有するだけでなく生体分子と会合して、当該生体分子をラベル化することができる。本発明のポリイオンデンドリマーは生体分子と会合するだけであり、共有結合で結合されている訳ではないことから生体分子の構造は何等変化することなくラベル化することができる。したがって、生体分子を生体内に存在しているままの構造で測定することができることになる。
本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤を提供する。本発明のラベル化剤は、本発明のポリイオンデンドリマー、及び測定用の担体とを含有してなるラベル化用組成物として提供することもできる。本発明のラベル化剤又はラベル化用組成物は、本発明のポリイオンデンドリマーに結合されている蛍光性の基による蛍光を測定することもできるし、また生体分子との会合による蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）として測定することもできる。
また、本発明は、標的とする生体分子が存在する試料中に、本発明のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法を提供する。このようにして、本発明のポリイオンデンドリマーを用いて生体分子をラベル化することができ、当該ラベル化による蛍光を測定することにより、生体分子を検出し、その挙動を生体内に存在しているままの状態で測定することができる。
蛍光や蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の測定方法としては、公知の測定方法を使用することができる。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
Ｇ０−Ｇの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ０−Ｇを製造した。
【００３３】
【化１２】
【００３４】
（１）化合物２の製造
既知のトリアジドデンドロン（１）４３ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ）と１−ピレンメチルアミン塩酸塩３６ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で脱水ジクロロメタン１．０ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン８５μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１８ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２５ｍｇ（０．１３３ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で７時間撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。２回のカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→１／０）、（シリカゲル、酢酸エチル）で精製し、黄色油状の液体として得た（５３ｍｇ；収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
3.24 (t,4H;ＯＣＨ２Ｎ３ outer), 3.33 (t, 2H;ＯＣＨ２Ｎ３ inner),
3.52-3.80 (m, 24H;ＯＣＨ２), 4.16 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２),
5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ), 7.03 (s, 2H;Ar-H),
7.98-8.21 (m, 8H;Pyrene), 8.32 (d, 1H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８５４．３７，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８７８．４０，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８９３．３９．
【００３５】
（２）化合物３の製造
前記（１）で製造した化合物（２）５０ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム−炭素２０ｍｇを混合し、エタノール４．０ｍＬに溶解させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで薄黄色油状の液体として得た（３６ｍｇ；収率９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.92 (br, 6H, ＮＨ２), 2.67 (t, 4H;ＯＣＨ２ＮＨ２ outer),
2.76 (t, 2H;ＯＣＨ２ＮＨ２ inner), 3.43-3.78 (m, 24H;ＯＣＨ２),
4.15 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.31 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ),
7.16 (s, 2H;Ar-H), 7.99-8.16 (m, 8H;Pyrene), 8.19 (d, 1H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ７７６．４０
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ ７７７．５１，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ７９９．４９，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８１７．５４．
【００３６】
（３）化合物４の製造
前記（２）で製造した化合物（３）２０ｍｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ”−トリフリルグアニジン３６ｍｇ（０．０９２ｍｍｏｌ）を混合し、ジクロロメタン１ｍＬに溶解させた。トリエチルアミン４０μＬを添加した後、室温で終夜撹拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、２Ｍ硫酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝１／１→１／０）で精製することで黄色油状の液体として得た（１４ｍｇ；収率３６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.52 (s, 54H;Ｃ（ＣＨ３）３), 3.47-3.83 (m, 30H;ＯＣＨ２),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.36 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
7.24 (s, 2H;Ar-H), 8.03-8.18 (m, 8H;Pyrene),
8.23 (br, 3H;NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.44 (br, 3H;NHBoc).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １５０２．７８，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ １５０４．４５，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １４０３．７２，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ２＋Ｈ＋］ １３０３．６６，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ３＋Ｈ＋］ １２０３．６０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ４＋Ｈ＋］ １１０３．５７．
【００３７】
（４）デンドリマーＧ０−Ｇの製造
前記（３）で製造した化合物（４）１８ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）をメタノール５００μＬ中に溶解させ、１２Ｍ塩酸３００μＬを添加した。室温で２日間撹拌した後、減圧下で乾燥させることで黄色固体として得た（１２ｍｇ；収率＞９９％）
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.29 (t, 6H;ＣＨ２-Guanidine), 3.51 (t, 6H;ＯＣＨ２),
3.56-3.62 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.70 (t, 2H;ＯＣＨ２ inner),
3.76 (t, 4H;ＯＣＨ２ outer), 4.08 (t, 2H;ＰｈＯＣＨ２ inner),
4.18 (t, 4H;ＰｈＯＣＨ２ outer), 5.23 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ),
7.17 (br, 12H; ＮＨ２), 7.34 (s, 2H;Ar-H),
7.63 (br, 3H;ＮＨ（ＮＨ２）２), 8.01-8.19 (m, 4H;Pyrene),
8.22-8.30 (m, 4H;Pyrene), 8.54 (d, 1H;Pyrene), 9.18 (s, 1H;CONH).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０１０．４０，
実測値：［Ｍ−Ｃｌ−］（Ｉ） ９７５．２６，
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４５２．１６．
【実施例２】
【００３８】
Ｇ１−Ｇの合成
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−Ｇを製造した。
【００３９】
【化１３】
【００４０】
（１）化合物５の製造
化合物（１）９３１ｍｇ（１．４５ｍｍｏｌ）と１０％パラジウム−炭素４００ｍｇをエタノール３０ｍＬに溶解させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで薄黄色油状の粘性液体として得た（７８１ｍｇ；収率９６％）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ５６３．３１，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋］ ５６４．３４，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ６０４．３７．
【００４１】
（２）化合物６の製造
前記（１）で製造した化合物（５）３４４ｍｇ（０／６１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル／ＴＨＦ（ｖ／ｖ；１／１）混合溶液に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン１ｍＬ、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラアゾール−１−カルボキサミド６２５ｍｇ（２．０１ｍｍｏｌ）を順次添加した。室温で終夜撹拌した後、減圧下で溶媒を除去した。酢酸エチルに溶解させ、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをリサイクルＧＰＣで精製し、薄黄色の油状液体として得た（４６７ｍｇ；収率５９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.42 (s, 36H;Ｃ（ＣＨ３）３ outer), 1.42 (s, 18H;Ｃ（ＣＨ３）３ inner),
3.50-3.64 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.73-3.79 (m, 12H;ＯＣＨ２),
4.17 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 7.34 (s, 2H;Ar-H),
8.52 (br, 3H; NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.40 (br, 3H, NHBoc).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １２８９．６９，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ １３１２．６９，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １１９０．６６，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ２＋Ｈ＋］ １０９０．５０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ３＋Ｈ＋］ ９９０．５５，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ４＋Ｈ＋］ ８９０．５０，
実測値：［Ｍ−Ｂｏｃｘ６＋Ｈ＋］ ６９０．４３．
【００４２】
（３）化合物７の製造
前記（１）で製造した化合物（５）３．３ｍｇ（４．２５μｍｏｌ）と（６）２０ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）をアルゴン下、脱水ジクロロメタン１ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン１００μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール２．１ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３．０ｍｇ（１５．５μｍｏｌ）を順次添加し、室温で終夜撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。リサイクルＧＰＣで精製し、黄色油状の液体として得た（６．４ｍｇ；収率３３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.41 (m, 162H;Ｃ（ＣＨ３）３), 3.49-3.69 (m, 120H;ＯＣＨ２),
4.07 (br, 24H;ＰｈＯＣＨ２), 5.27 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
6.96 (s, 2H;Py-Ar-H), 7.18 (br, 6H;Ar-H),
7.97-8.13 (m, 9H;Pyrene),
8.53 (br, 9H; NHC(NBoc)(NHBoc)),
11.38 (br, 9H, NHBoc).
【００４３】
（４）デンドリマーＧ１−Ｇの製造
前記（３）で製造した化合物（７）１４ｍｇ（３．０μｍｏｌ）をメタノール２５０μＬに溶解させ、１２Ｍ塩酸１５０μＬを添加した。室温で２日間撹拌した後、減圧下で乾燥させることで薄黄色固体として得た（９．６ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.30 (m, 18H;ＣＨ２-Guanidine outer),
3.40 (m, 6H;ＣＨ２-Guanidine inner), 3.51-3.62 (m, 72H;ＯＣＨ２),
3.68 (m, 6H;ＯＣＨ２ inner), 3.76 (m, 18H;ＯＣＨ２ outer),
4.07 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２ inner), 4.15 (m, 18H;ＰｈＯＣＨ２ outer),
5.22 (s, 2H; ＣＨ２−Ｐｙ), 7.17 (br, 36H; ＮＨ２),
7.23 (s, 6H;Ａｒ−Ｈ peripheral), 7.33 (s, 2H;Ａｒ−Ｈ core),
7.64 (br, 9H;ＮＨ（ＮＨ２）２), 8.01-8.26 (m, 8H;Pyrene),
8.45 (br, 3H;ＣＯＮＨ peripheral), 8.54 (d, 1H;Pyrene),
9.18 (s, 1H;ＣＯＮＨ core).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０１０．４０，
実測値：［Ｍ−Ｃｌ−］（Ｉ） ９７５．２６，
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４５２．１６．
【実施例３】
【００４４】
Ｇ０−Ｔの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ０−Ｔを製造した。
【００４５】
【化１４】
【００４６】
（１）化合物９の製造
没食子酸メチル１．５６ｇ（８．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４５ｍＬに溶解させ、そこに炭酸カリウム１１．７ｇ（８４．７ｍｍｏｌ）を添加した。既知のトリエチレングリコール誘導体（８）７．０７ｇ（２８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４０ｍＬに溶かした溶液を添加し、８０℃で１８時間撹拌した。室温に戻した後、６０℃減圧下でＤＭＦを除去し、ジクロロメタンに再度溶解させ、ろ過により固体成分を除去した。飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル→酢酸エチル／アセトン＝９／１）で精製し、橙色の油状液体として得た（１．５１ｇ；収率２１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２（THP）),
3.4-3.9 (m, 39H;ＯＣＨ２(THP,TEG)，ＯＣＨ３),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (t, 3H;OCHO), 7.27 (s, 2H;Ar-H).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８３２．４５，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８５５．５６，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８７１．５３．
【００４７】
（２）化合物１０の製造
前記（１）で製造した化合物（９）１．５１ｇ（１．８１ｍｍｏｌ）を９５％エタノール８０ｍＬに溶解させ、１Ｍ 水酸化カリウム６．４ｍＬを添加した。これを終夜、加熱還流しながら撹拌した後、室温に戻した。溶液をアンバーライトＩＲ１２０（陽イオン交換樹脂）に通して中和した。減圧下で溶媒を除去することで薄黄色の油状液体として得た（１．３５ｇ；収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２(THP)),
3.4-4.0 (m, 36H;ＯＣＨ２(THP,TEG)),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (m, 3H;OCHO), 7.27 (s, 2H;Ar-H).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８１８．４３，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ ８５７．４４，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８４１．４７，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｋ＋］ ７７３．３８，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｎａ＋］ ７５７．４２，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｋ＋］ ６８９．３２，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｎａ＋］ ６７３．３６，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｋ＋］ ６０５．２６，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｎａ＋］ ５８９．２９．
【００４８】
（３）化合物１１の製造
前記（２）で製造した化合物（１０）４４３ｍｇ（０．５４１ｍｍｏｌ）と１−ピレンメチルアミン塩酸塩２７９ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）を混合し、アルゴン下で脱水ジクロロメタン８ｍＬに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン７００μＬ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１４１ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２００ｍｇ（１．０４２ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で終夜撹拌した。ジクロロメタンで希釈した後、飽和塩化アンモニウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（アルミナ、酢酸エチル／ヘキサン＝４／１→１／０→メタノール）で精製し、黄色油状液体として得た（５０８ｍｇ；収率９１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
1.4-1.9 (m, 18H;ＣＨ２(THP)),
3.4-4.0 (m, 36H;ＯＣＨ２(THP,TEG)),
4.18 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 4.60 (m, 3H;OCHO),
5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ), 7.12 (s, 2H;Ar-H).
8.0-8.3 (m, 9H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １０３１．５２，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ １０５４．５９，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｋ＋］ ９８６．５０，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰ＋Ｎａ＋］ ９７０．５３，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｋ＋］ ９０２．４４，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ２＋Ｎａ＋］ ８８６．４７，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｋ＋］ ８１８．３８，
実測値：［Ｍ−ＴＨＰｘ３＋Ｎａ＋］ ８０２．４１．
【００４９】
（４）化合物１２の製造
前記（３）で製造した化合物（１１）５０７ｍｇ（０．４９１ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸１２ｍｇ（０．０６３ｍｍｏｌ）を混合し、メタノール１０ｍＬに溶解させた。室温で終夜撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和し、減圧下メタノールを除去した。ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。得られた油状液体とｐ−トルエンスルホン酸５０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）を混合し、メタノール１０ｍＬに溶解させ５０℃で撹拌した。反応溶液にピリジニウムｐ−トルエンスルホナート４０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、５５℃で終夜撹拌した。減圧下、溶媒を除去して得られた固体１９３ｍｇ（全体の３０％を使用）に四臭化炭素１０１ｍｇ（０．３０５ｍｍｏｌ）を混合した。これをアルゴン下、脱水ジクロロメタン２ｍＬに溶解させ、トリフェニルホスフィン８０ｍｇ（０．３０５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で終夜撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、ジクロロメタンに再び溶解したものをろ過することで固体成分を除去した。２回のカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→１／０）（シリカゲル、クロロホルム→酢酸エチル）で簡易精製した後、分取用ＴＬＣで精製することで黄色油状液体として得た（２９ｍｇ；収率１２％(calcd.)）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
3.33-3.36 (t, 4H;ＯＣＨ２Ｂｒ outer),
3.40-3.42 (t, 2H;ＯＣＨ２Ｂｒ inner), 3.60-3.78 (m, 24H;ＯＣＨ２),
4.16 (m, 6H;ＰｈＯＣＨ２), 5.32 (s, 2H;ＣＨ２−Ｐｙ),
7.05 (s, 2H;Ar-H). 8.0-8.3 (m, 9H;Pyrene).
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ９６５．１０，
実測値：［Ｍ＋Ｋ＋］ １００８．１２，
実測値：［Ｍ＋Ｎａ＋］ ９９０．１４，
実測値：［Ｍ＋］ ９６８．４７．
【００５０】
（５）デンドリマーＧ０−Ｔの製造
前記（４）で製造した化合物（１２）２４ｍｇ（２４．８μｍｏｌ）とチオ尿素５．９ｍｇ（７８μｍｏｌ）を混合し、ジクロロメタン５００μＬと９６％エタノール５００μＬの混合溶液に溶解させた。これを終夜、加熱還流した後、室温に戻したものをメタノールに溶解させた。これを多量のヘキサンに滴下して生じた固体成分をろ過により除去し、溶媒を除去して得られる黄色油状液体を再びチオ尿素１５ｍｇ（０．１９７ｍｍｏｌ）と混合し、エタノール１ｍＬに溶解させ、２日間加熱還流した。減圧下で溶媒を除去し、メタノールに再度溶解させ、固体成分をろ過して除去した。真空下で乾燥させ、黄色固体として得た（３０ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ （ｄ６−ＤＭＳＯ，７０℃）： δ （ｐｐｍ）
3.38 (m, 6H;ＯＣＨ２Ｓ), 3.64 (m, 12H;ＯＣＨ２), 3.72 (m, 8H;ＯＣＨ２),
3.81 (m, 4H;ＯＣＨ２), 4.14 (t, 2H;ＰｈＯＣＨ２ inner),
4.32 (t, 4H;ＰｈＯＣＨ２ outer), 5.28 (s, 2H, ＣＨ２−Ｐｙ),
6.93 (br, 12H;ＳＣ（ＮＨ２）２), 7.36 (s, 2H;Ar-H),
8.10-8.36 (m, 8H;Pyrene), 8.57 (d, 1H;Pyrene), 8.96 (br,1H;CONH).
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １１９３．１３
実測値：［Ｍ−Ｂｒ−］（Ｉ） １１１５．９９
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−２Ｃｌ−］（Ｉ） １０３６．０６
実測値：［Ｍ＋２Ｈ＋−３Ｃｌ−］（Ｉ） ９５４．１５
実測値：［Ｍ＋Ｈ＋−３Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７７．５７
実測値：［Ｍ−２Ｃｌ−］（ＩＩ） ４７０．１４，
実測値：［Ｍ−３Ｃｌ−］（ＩＩＩ） ３１８．７１
【実施例４】
【００５１】
溶媒としてトリス・ＨＣｌ２０ｍＭ（ｐＨ７）中にＢＳＡ水溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）の３ｍＬを添加した溶液中に、実施例１〜３で製造した各種デンドリマー（（ａ）Ｇ０−Ｇ（ｂ）Ｇ１−Ｇ（ｃ）Ｇ０−Ｔ）の１ｍＭ溶液を、０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトル変化を測定した。測定温度は２５℃で、励起波長は２７７ｎｍである。結果を図１（ａ）、図２（ｂ）、及び図３（ｃ）にそれぞれ示す。図１〜３の縦軸は強度（ａ．ｕ．）であり、横軸は波長（ｎｍ）を示す。黒色実線（原図では青色）はデンドリマーを添加していない場合を示し、３４０ｎｍ付近における当該黒実線の下から順に０．６７当量の場合（原図では赤色）、１．３４当量の場合（原図では緑色）、２．０１当量の場合（原図では橙色）、２．６８当量の場合（原図では赤色）、３．３当量の場合（原図では薄青色）をそれぞれ示す。
３４０ｎｍの発光はＢＳＡに対応し、デンドリマーの添加に伴い消光していく様子が観察される。一方、３８０ｎｍ、３９５ｎｍの発光はデンドリマー中のピレンの発光に対応し、添加に伴って強度が増加している。このことから、ＢＳＡ→ピレンに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が生じ、両者が非常に近傍に存在する、すなわちデンドリマーによるＢＳＡの修飾が成功したことを示す。また、Ｇ０−Ｔでは４５０−５００ｎｍの発光が増加しているが、これはピレンのエキシマー発光に対応するものである。
【実施例５】
【００５２】
実施例４と同様にして、ＣＤスペクトル変化を測定した。結果を、図４（ａ）、図５（ｂ）、及び図６（ｃ）にそれぞれ示す。図４〜６の縦軸はＣＤ（ｍｄｅｇ）であり、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
２００−２５０ｎｍ領域のＣＤスペクトルはＢＳＡの二次構造を反映している。いずれの場合もＣＤスペクトルの変化がほとんど観察されないことと、前述の蛍光スペクトル変化の結果を考慮すると、本デンドリマーによる修飾ではタンパク質の構造を乱さないソフトな修飾が可能であることがわかる。
【００５３】
このように、本発明のデンドリマーは、分子間力を利用して生体分子の修飾を直接行えるものであり、修飾のための変異体作製が必要ないという点で、その実用的な利用価値は極めて高い。実施例４及び５では、蛍光プローブとしてピレンを導入しているが、コア部の分子設計は自由に変えることができるため、多様な機能性官能基をタンパク質表面に導入できるものと期待される。さらに潜在的な応用可能性として、機能性物質の生体膜透過に利用できる可能性があるため、特に医薬産業分野での応用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、生体分子と共有結合すること無しに生体分子をレベル化することができるデンドリマーを提供するものであり、機能性物質の生体膜透過に利用できるだけでなく、検査試薬、生体分子の機能解析用の試薬などの各種の試薬や医薬産業分野での応用が可能であり、産業上有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明のデンドリマー（ａ）Ｇ０−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図２】図２は、本発明のデンドリマー（ｂ）Ｇ１−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図３】図３は、本発明のデンドリマー（ｃ）Ｇ０−Ｔを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時の蛍光スペクトルを測定した結果示すものである。
【図４】図４は、本発明のデンドリマー（ａ）Ｇ０−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【図５】図５は、本発明のデンドリマー（ｂ）Ｇ１−Ｇを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【図６】図６は、本発明のデンドリマー（ｃ）Ｇ０−Ｔを、ＢＳＡ水溶液に０．６７当量づつ３．３当量まで、それぞれ順次添加した時のＣＤスペクトルを測定した結果示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
【請求項２】
蛍光性の基がピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、又はローダミンのいずれかである請求項１のポリイオンデンドリマー。
【請求項３】
分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４−ジヒドロキシ安息香酸アミド、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである請求項１又は２に記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項４】
分岐鎖が、繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項５】
世代が、１〜５世代である請求項１〜４のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項６】
ポリイオンデンドリマーが、下記の一般式［１］
【化１】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表し、ｍは世代を示し１〜５の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜５のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項７】
ポリイオンデンドリマーが、下記の一般式［２］、
【化２】
又は、下記の一般式［３］
【化３】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜６のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項８】
蛍光性の基が、ピレンである請求項１〜７のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤。
【請求項１０】
生体分子が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である請求項９に記載のラベル化剤。
【請求項１１】
標的とする生体分子が存在する試料中に、請求項１〜８のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法。
【請求項１】
表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてカルボキシル基を有し、当該カルボキシル基に蛍光性の基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
【請求項２】
蛍光性の基がピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、又はローダミンのいずれかである請求項１のポリイオンデンドリマー。
【請求項３】
分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４−ジヒドロキシ安息香酸アミド、又は３，４−ジヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである請求項１又は２に記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項４】
分岐鎖が、繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項５】
世代が、１〜５世代である請求項１〜４のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項６】
ポリイオンデンドリマーが、下記の一般式［１］
【化１】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表し、ｍは世代を示し１〜５の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜５のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項７】
ポリイオンデンドリマーが、下記の一般式［２］、
【化２】
又は、下記の一般式［３］
【化３】
［式中、Ｘはピレン、アゾベンゼン、ポルフィリン、及びローダミンからなる群から選ばれる蛍光性の基を示し、Ｙはグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｎは分岐鎖の繰り返し回数を示し１〜６の整数を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜６のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項８】
蛍光性の基が、ピレンである請求項１〜７のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなる生体分子のラベル化剤。
【請求項１０】
生体分子が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）である請求項９に記載のラベル化剤。
【請求項１１】
標的とする生体分子が存在する試料中に、請求項１〜８のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを添加し、生体分子とポリイオンデンドリマーとを会合させることからなる生体分子をラベル化する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１２０６２６（Ｐ２００９−１２０６２６Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９２６０６（Ｐ２００７−２９２６０６）
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年５月１０日 社団法人高分子学会発行の「高分子学会予稿集 ５６巻１号［２００７］」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月９日（２００７．１１．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年５月１０日 社団法人高分子学会発行の「高分子学会予稿集 ５６巻１号［２００７］」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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