生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法
【課題】反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度の高い生体物質検出カートリッジを得る。
【解決手段】ターゲットとプローブをハイブリダイゼーションさせるための複数のチャンバー２１２と、チャンバー２１２間に設けられた流路２１３とを備え、チャンバー２１２の上には、多孔質膜２０５と気液分離膜２０４が重層されている。気液分離膜２０４の上には気泡排出部２０６が設けられており、ハイブリダイゼーション反応中に気泡排出部２０６内を負圧に保つことにより、チャンバー２１２内の気泡が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６へ排出される。
【解決手段】ターゲットとプローブをハイブリダイゼーションさせるための複数のチャンバー２１２と、チャンバー２１２間に設けられた流路２１３とを備え、チャンバー２１２の上には、多孔質膜２０５と気液分離膜２０４が重層されている。気液分離膜２０４の上には気泡排出部２０６が設けられており、ハイブリダイゼーション反応中に気泡排出部２０６内を負圧に保つことにより、チャンバー２１２内の気泡が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６へ排出される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸分子などの生体物質を検出するための、生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体中に、疾患に由来する特定の遺伝子が存在するか否かを検査する手法の一つにＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ遺伝子と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。従来、検体中に含まれる特定の遺伝子の検出精度をあげるため、検体中の特定の遺伝子とプローブ遺伝子との反応効率を高くする工夫がなされている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、プローブが固定された基板と板状部材との間に試料溶液を満たし、基板と板状部材との間の相対運動をおこすことによって、試料溶液を攪拌し、反応効率を高める方法が開示されている。
また、特許文献２には、試料溶液中に微粒子を分散させて攪拌することにより、反応効率を高める方法が開示されている。
【０００４】
また、特許文献１や特許文献２に開示された方法では、ＤＮＡマイクロアレイを回転させたりすることにより試料溶液を攪拌しているが、マイクロアレイを動かす機構を用いずに反応効率を高める方法の例として、特許文献３には、核酸検出用のプローブと試料を反応させるためのチャンバー内の流体の流れが制御されるように、流路断面積を減少させる流体抵抗部を備えた生化学反応カセットが開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特許第３７４６７５６号公報
【特許文献２】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献３】特開２００７−４０９６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜３に開示された従来技術のように、試料溶液を攪拌したり、チャンバー内で流れを起こすように制御すると、試料溶液内に気泡が発生しやすくなる。気泡が発生すると、プローブ遺伝子と検体中の遺伝子との接触が妨げられ、反応が不均一、非効率になるという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度の高い生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体物質検出カートリッジは、試料溶液に含まれる特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための反応容器と、前記反応容器内に面した多孔質膜と、前記多孔質膜に重層された気液分離膜と、前記気液分離膜の前記多孔質膜と接する面とは反対の面上に設けられ、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、内部を負圧に保つことが可能な気泡排出部と、を備えたものである。
【０００９】
本発明によれば、反応中に反応容器内で気泡が発生しても、気液分離膜を通して気泡を排出することができるので、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。また、気液分離膜と反応容器の間に多孔質膜を設けたことによって、反応容器の内壁だけでなく、多孔質膜側にもプローブを固定することができる。
【００１０】
また、前記反応容器は、前記プローブを固定する領域を各々有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための複数のチャンバーと、前記複数のチャンバー間に設けられた流路と、を備え、前記流路は、前記試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積が前記チャンバーの断面積よりも小さいことが望ましい。
【００１１】
これにより、流路で繋がれた各々のチャンバーに、それぞれ異なる１種類のプローブを固定することにより、１度に複数種類のターゲットの検出を行うことができる。また、１つのチャンバー内では１種類のプローブのみを用いれば、反応結果の検出を、発光物質が溶液中に浮遊する化学発光物質を用いて行っても、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
【００１２】
さらに、流路の試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積がチャンバーの断面積よりも小さく形成されているため、断面積の小さな流路から大きなチャンバーへ試料溶液が流入することによって、液体の流れが変化し、チャンバー内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー内の試料溶液が攪拌されることによって、プローブに短い時間でより多くのターゲットとなる生体物質が接することになるので、反応効率がより向上する。
【００１３】
前記プローブを固定する領域は、前記反応容器の内壁に設けられていてもよいし、前記多孔質膜上に設けられていてもよい。また、内壁と多孔質膜の両方に設けられていても良い。
プローブを固定する領域を内壁と多孔質膜の両方に設けることにより、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積が広くなり、反応効率、検出感度が向上する。また、多孔質膜は三次元構造を有するため、反応容器の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。
【００１４】
また、前記反応容器と前記多孔質膜の間に、前記プローブを固定する領域に対応した貫通孔を有する基板を備えるようにしてもよい。
これにより、前記多孔質膜上のプローブ固定領域とプローブ固定領域の間を分離することができ、隣り合う固定領域に異なるプローブを固定した場合、プローブが混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
【００１５】
また、前記反応容器は、透明基板で形成されていることが望ましい。
これにより、反応容器の外側から内部の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができ、装置の小型化および処理の効率化を図ることができる。
【００１６】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、前記気泡排出部を負圧に保つための第１のポンプを備えている。
これにより、簡易な方法で、反応中に反応容器内で発生した気泡を、気液分離膜を通して排出することができる。
【００１７】
また、前記反応容器内で前記試料溶液を往復移動させるための第２のポンプを備えていることが望ましい。
これにより、より多くのターゲットとなる生体物質がプローブに接するようになるので、反応効率が向上する。
【００１８】
本発明に係る生体物質検出方法は、上記の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、前記反応容器内に試料溶液を供給し、前記試料溶液に含まれる特定の生体物質と、前記反応容器内に固定され、前記生体物質を検出するためのプローブとを反応させる反応工程と、前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、前記反応工程では、前記気泡排出部を負圧に保つことにより、前記気液分離膜を通して前記反応容器内の気泡を外部へ排出することを特徴とする。
【００１９】
本発明によれば、反応中に反応容器内で気泡が発生しても、気液分離膜を通して気泡を排出することができるので、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。
【００２０】
また、前記検出工程では、化学発光物質を用いた方法により、前記プローブと反応した前記生体物質の検出を行うことが望ましい。
一般に、化学発光物質を用いた方法では、発光物質の産出量を加える基質の量を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による核酸検出装置（生体物質検出装置）１０の概略構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置１０は、検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）２０を設置するステージ１０１、検出用窓１０２、ポンプ１０３、ポンプ１０４、試料容器１０５、ＣＣＤカメラ１０６を備えている。
【００２２】
ステージ１０１は、検出カートリッジ２０を固定するためのステージである。ステージ１０１には検出用窓１０２が設けられており、ハイブリダイゼーション反応の検出処理の際、ＣＣＤカメラ１０６を用いて、検出カートリッジ２０内で産出された化学発光物質の発光強度を測定することができる。
【００２３】
ポンプ１０３，１０４は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。ポンプ１０３は、検出カートリッジ２０内で試料溶液の往復送液を行うために用いられ、ポンプ１０４は、検出カートリッジ２０内の気泡を排出するために用いられる。ポンプ１０３，１０４は、フッ素樹脂、ポリエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、シリコーン樹脂等からなるキャピラリーチューブを介して検出カートリッジ２０と接続されている。
【００２４】
試料容器１０５は、検体試料溶液を収容するための容器である。試料容器１０５は、フッ素樹脂、ポリエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、シリコーン樹脂等からなるキャピラリーチューブを介して検出カートリッジ２０と接続されており、検出カートリッジ２０内へは、この試料容器１０５から、試料溶液が供給される。また、ポンプ１０３を用いて試料溶液の往復送液を行う際、検出カートリッジ２０内から溢れた試料溶液が、試料容器１０５に一旦流入し、また、検出カートリッジ２０内へ戻っていく。
【００２５】
図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジ２０の分解斜視図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。図に示すように、検出カートリッジ２０は、基板２０１、気液分離膜２０４、多孔質膜２０５、基板２０２、及び基板２０３を貼り合わせて構成される。
【００２６】
基板２０１には、気泡排出部２０６が形成されている。気泡排出部２０６には、排出口２０７が設けられており、排出口２０７とポンプ１０４はキャピラリーチューブを介して繋がれる。また、基板２０１には、基板２０３に形成された流路２１３の両端に対応する位置に、液体導入口２０８，２０９が設けられており、液体導入口２０８，２０９は、それぞれポンプ１０３、試料容器１０５とキャピラリーチューブを介して繋がれる。
【００２７】
気液分離膜２０４、多孔質膜２０５は、基板２０１と基板２０２の間に挟まれている。気液分離膜２０４は、４フッ化エチレン樹脂等で形成された膜であり、気体は透過させるが、液体の透過は遮断する性質を持つ。多孔質膜２０５は、ニトロセルロースやナイロン、ポリカーボネート等で形成された膜である。
【００２８】
基板２０２には、基板２０３に形成されたチャンバー２１２に対応する位置に、貫通孔２１０が設けられている。また、多孔質膜２０５及び気液分離膜２０４を配置するための膜配置用凹部２１１が形成されている。また、基板２０１と同様に、基板２０３に形成された流路２１３の両端に対応する位置に、液体導入口２０８，２０９が設けられている。
【００２９】
基板２０３には、複数のチャンバー２１２と、チャンバー２１２間を繋ぐように設けられた流路２１３が形成されている。流路２１３の両端部は、それぞれ液体導入口２０８，２０９を介してポンプ１０３、試料容器１０５と接続される。基板２０３は、ガラス基板などの透明基板であることが望ましい。これにより、チャンバー２１２の外側から内部の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができる。
【００３０】
図３（Ａ）に示すように、基板２０３、基板２０２、及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われ、各々が流路２１３を介して繋がった複数のチャンバー２１２が形成される。さらに、その上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、チャンバー２１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、チャンバー２１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００３１】
チャンバー２１２は、例えば、送液方向の長さを２００μｍ、送液方向に垂直な断面の幅を２００μｍ、深さを１５０〜２００μｍ、とすることができる。また、チャンバー２１２とチャンバー２１２を繋ぐ流路２１３は、送液方向の長さを２００μｍ、送液方向に垂直な断面の幅を１００μｍ、深さを５０〜１００μｍとすることができる。流路２１３の送液方向に垂直な断面の面積は、チャンバー２１２の送液方向に垂直な断面よりも小さく形成されている。チャンバー２１２の形状は、円形の他、例えば楕円形や、四角形の角を丸めた形状など、チャンバー２１２内に気泡がたまりにくい形状が望ましい。
【００３２】
各々のチャンバー２１２は、内壁上にプローブ固定領域２１４を有している。プローブ固定領域２１４は、プローブを塗布するための領域である。プローブ固定領域２１４は、図３（Ａ）に示すように、チャンバー２１２の内壁の表面に設けられていてもよいし、図３（Ｂ）に示すように、チャンバー２１２の内壁と多孔質膜２０５の表面に設けられていても良い。図３（Ｂ）に示す構成の場合には、チャンバー２１２内のプローブの量が増え、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積も広くなるので、反応効率、検出感度が向上する。また、図３（Ｃ）に示すように、多孔質膜２０５の表面にのみプローブ固定領域２１４が設けられている構成とすることもできる。多孔質膜２０５は三次元構造を有するため、チャンバー２１２の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。
【００３３】
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。
【００３４】
なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
【００３５】
プローブ固定領域２１４へのプローブの塗布は、非接触あるいは接触式スポッター等を用いて行うことができる。なお、多孔質膜２０５への塗布は非接触スポッターを用いることが望ましい。本実施形態では、各々のチャンバー２１２には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。
【００３６】
なお、プローブ固定領域２１４には、必要に応じて、表面処理が施されていてもよい。表面処理としては、例えば、プローブをプローブ固定領域２１４の表面に確実に固定するための処理（固相化処理）等が挙げられる。
【００３７】
次に、本実施形態による核酸検出装置１０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理（反応工程）およびハイブリダイゼーションの検出処理（検出工程）について説明する。
【００３８】
まず、プローブ固定領域２１４にプローブが固定された検出カートリッジ２０内（チャンバー２１２と流路２１３で形成される空間）に、ポンプ１０３を用いてブロッキング液を充填する。
【００３９】
ここで、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内部を負圧にしてから、ポンプ１０３を用いて充填したブロッキング液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、プローブが固定化されていない領域をブロッキングする。ブロッキングは約１０分行う。
【００４０】
次に、ポンプ１０３を用いてブロッキング液を排出した後、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４１】
次に、検出カートリッジ２０内に、ビオチン標識した試料溶液を充填する。具体的には、ポンプ１０３を駆動することにより、試料容器１０５に収容された試料溶液が検出カートリッジ２０内に供給される。
【００４２】
ビオチン標識した試料溶液の調整方法について説明する。
試料溶液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
具体的には、まず、試料中に第１及び第２のプライマーを加え、温度サイクルをかける。第１のプライマーはターゲットとなる核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマーはターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸を含む二本鎖核酸と第１及び第２のプライマーが結合すると伸長反応によってターゲット核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。十分に標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅された後に、試料中に第３のプライマーを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマーは、伸長反応時にビオチンの取込みが可能であり、ターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸に相補的な核酸と、第３のプライマーが結合すると伸長反応によってビオチンで標識されたターゲット核酸が増幅される。結果として、試料中にターゲット核酸が含まれている場合は標識されたターゲット核酸が生成され、試料中にターゲット核酸が含まれない場合は標識されたターゲット核酸は生成されない。なお、ここでは、標識物質はビオチンとしたが、他の酵素や、蛍光物質、等でも良い。
【００４３】
次に、充填したビオチン標識した試料溶液を検出カートリッジ２０内で往復送液し、プローブ固定領域２１４に固定されているプローブと反応（ハイブリダイセーション）させる。ハイブリダイセーションは１〜３時間行うのが望ましい。
【００４４】
なお、ハイブリダイセーションを行っている間も、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておく。
本実施形態に係る検出カートリッジ２０は、流路２１３の試料溶液が流れる方向に垂直な断面の面積がチャンバー２１２の断面積よりも小さく形成されている。断面積の小さな流路２１３から大きなチャンバー２１２へ試料溶液が流入することによって、液体の流れが変化し、チャンバー２１２内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー２１２内の試料溶液が攪拌されることによって、プローブ固定領域２１４のプローブに短い時間でより多くのターゲット核酸が接することになるので、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。一方、液体が乱流によって攪拌されやすいため、チャンバー２１２内には気泡が溜まりやすく、不均一なハイブリダイゼーション反応を誘引させる可能性がある。しかし、本実施形態によれば、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておくことにより、気液分離膜２０４を通ってチャンバー２１２内の気泡が気泡排出部２０６へ排出されるため、反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。
【００４５】
次に、ポンプ１０３を用いてビオチン標識した試料溶液を排出した後、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４６】
次に、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内にストレプトアビジン標識した化学発光用酵素（ＨＲＰ）液を充填し、検出カートリッジ２０内で約５分間往復送液する。
次に、ＨＲＰ液を排出した後、検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４７】
次に、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液を充填する。充填したら、気泡排出部２０６内を大気圧に戻し、ポンプ１０３による往復送液操作は行わずに約１０〜３０秒静止させ、化学発光物質の産出を待つ。
【００４８】
化学発光物質が産出されたら、ＣＣＤカメラ１０６を用いて発光強度を測定し、ハイブリダイゼーション反応の有無を確認する。
【００４９】
図４（Ａ）は、化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図である。図４（Ａ）に示すように、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合したビオチンとストレプトアビジン標識済みの化学発光用酵素（ＨＲＰ）が結合し、そこへ化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加えることにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出することにより発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００５０】
図４（Ｂ）は、蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。蛍光標識剤を用いた方法では、ターゲット核酸に結合した蛍光標識剤が、励起光を照射することにより発光する。発光強度は、ターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するため、化学発光物質を用いた検出方法に比べると、検出感度を高めることが難しい。
【００５１】
このため、検出感度を向上させるためには、化学発光物質による方法を用いた方がよい。なお、蛍光標識剤を用いた方法では、発光体である蛍光標識剤が、ターゲット核酸に結合した状態であるため、発光体の位置が動かない。このため、１つのチャンバー内で複数のプローブを用いたハーブリダイゼーションを行う場合でも、どのプローブとの反応結果なのかの区別がつきやすい。一方、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が１つのチャンバー内で混ざり合ってしまうため、１つのチャンバー内で複数のプローブを用いた場合には、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。しかし、本実施形態による核酸検出装置１０では、各々のチャンバー２１２にはそれぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、化学発光物質を用いた検出方法でも、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がなく、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。
【００５２】
以上のように、実施の形態１によれば、流路２１３で繋がれた各々のチャンバー２１２に、それぞれ異なる１種類のプローブを固定することにより、１度に複数種類のターゲットの検出を行うことができる。また、１つのチャンバー内では１種類のプローブのみを用いるようにすれば、ハイブリダーゼーション結果の検出を化学発光物質による方法で行っても、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなるという問題がない。
【００５３】
さらに、本実施形態では、流路２１３の、試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積がチャンバー２１２の断面積よりも小さく形成されているため、流路２１３とチャンバー２１２の境界で流れの変化が発生し、チャンバー２１２内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー２１２内の試料溶液が攪拌されることによって、短い時間でより多くのターゲットとプローブが接することになるので、反応効率が向上する。
【００５４】
また、本実施形態によれば、ポンプ１０３を用いてチャンバー２１２および流路２１３内で試料溶液を往復移動させるようにしたので、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。
【００５５】
一方、本実施形態では、流路２１３とチャンバー２１２の境界で乱流が発生し、チャンバー２１２内に気泡が溜まりやすくなるが、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておくことにより、気液分離膜２０４を通ってチャンバー２１２内の気泡が気泡排出部２０６へ排出されるため、反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。なお、気液分離膜２０４とチャンバー２１２の間に多孔質膜２０５を設けたことによって、多孔質膜２０５側にもプローブ固定領域２１４を設けることができる。
【００５６】
実施の形態２．
図５（Ａ）は、本発明の実施の形態２による検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）３０の分解斜視図、図５（Ｂ）は図５（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
図に示すように、実施の形態２では、基板２０３には、複数のチャンバー２１２の代わりに１つの反応容器３１２が形成されている。また、基板２０２がなく、気液分離膜２０４と多孔質膜２０５は基板２０１と基板２０３の間に挟まれている。
【００５７】
図５（Ｂ）に示すように、基板２０３及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われた反応容器３１２が形成される。さらに、その上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、反応容器３１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、反応容器３１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００５８】
反応容器３１２は、プローブを塗布するためのプローブ固定領域２１４を有している。プローブ固定領域２１４は、図５（Ｂ）に示すように多孔質膜２０５の表面に設けられていてもよい。多孔質膜２０５は三次元構造を有するため、反応容器３１２の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。また、図６（Ａ）に示すように、多孔質膜２０５の表面と反応容器３１２の内壁の対向する領域に設けられていてもよい。この場合、対向する領域には、同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。図６（Ａ）に示す構成の場合には、反応容器３１２内のプローブの量が増え、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積も広くなるので、反応効率、検出感度が向上する。また、図６（Ｂ）に示すように、反応容器３１２の内壁にのみプローブ固定領域２１４が設けられている構成とすることもできる。
【００５９】
また、図７（Ａ）は、本発明の実施の形態２の他の例による検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）４０の分解斜視図、図７（Ｂ）は図７（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
図に示すように、基板２０３には、検出カートリッジ３０と同様に１つの反応容器３１２が形成されている。また、検出カートリッジ４０は基板２０２を備えており、気液分離膜２０４と多孔質膜２０５は基板２０１と基板２０２の間に挟まれている。
【００６０】
図７（Ｂ）に示すように、基板２０３、基板２０２、及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われた反応容器３１２が形成される。また、多孔質膜２０５と基板２０３の間に基板２０２を挟むことにより、基板２０２に設けられた貫通孔２１０に対応する領域の多孔質膜２０５のみが反応容器３１２内に露出されるので、この領域にプローブ固定領域２１４を形成することができる。さらに、多孔質膜２０５の上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、反応容器３１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、反応容器３１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００６１】
なお、反応容器３１２のプローブ固定領域２１４は、図７（Ｂ）に示すように多孔質膜２０５の表面のみに設けられていてもよいし、図８に示すように、多孔質膜２０５の表面と反応容器３１２の内壁の対向する領域に設けられていてもよい。この場合、対向する領域には、同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態１による核酸検出装置の概略構成を示す斜視図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジの分解斜視図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図３】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【図４】図４（Ａ）は化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図、図４（Ｂ）は蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の実施の形態２による検出カートリッジの分解斜視図、図５（Ｂ）は図５（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図６】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【図７】図７（Ａ）は、本発明の実施の形態２の他の例による検出カートリッジの分解斜視図、図７（Ｂ）は図７（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図８】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【符号の説明】
【００６３】
１０ 核酸検出装置、１０１ ステージ、１０２ 検出用窓、１０３ ポンプ、１０４ ポンプ、１０５ 試料容器、１０６ ＣＣＤカメラ、２０，３０，４０ 検出カートリッジ、２０１，２０２，２０３ 基板、２０４ 気液分離膜、２０５ 多孔質膜、２０６ 気泡排出部、２０７ 排出口、２０８，２０９ 液体導入口、２１０ 貫通孔、２１１ 膜配置用凹部、２１２ チャンバー、２１３ 流路、２１４ プローブ固定領域、３１２ 反応容器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有する核酸分子などの生体物質を検出するための、生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液や組織細胞などの検体中に、疾患に由来する特定の遺伝子が存在するか否かを検査する手法の一つにＤＮＡマイクロアレイがある。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ遺伝子と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。従来、検体中に含まれる特定の遺伝子の検出精度をあげるため、検体中の特定の遺伝子とプローブ遺伝子との反応効率を高くする工夫がなされている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、プローブが固定された基板と板状部材との間に試料溶液を満たし、基板と板状部材との間の相対運動をおこすことによって、試料溶液を攪拌し、反応効率を高める方法が開示されている。
また、特許文献２には、試料溶液中に微粒子を分散させて攪拌することにより、反応効率を高める方法が開示されている。
【０００４】
また、特許文献１や特許文献２に開示された方法では、ＤＮＡマイクロアレイを回転させたりすることにより試料溶液を攪拌しているが、マイクロアレイを動かす機構を用いずに反応効率を高める方法の例として、特許文献３には、核酸検出用のプローブと試料を反応させるためのチャンバー内の流体の流れが制御されるように、流路断面積を減少させる流体抵抗部を備えた生化学反応カセットが開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特許第３７４６７５６号公報
【特許文献２】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献３】特開２００７−４０９６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１〜３に開示された従来技術のように、試料溶液を攪拌したり、チャンバー内で流れを起こすように制御すると、試料溶液内に気泡が発生しやすくなる。気泡が発生すると、プローブ遺伝子と検体中の遺伝子との接触が妨げられ、反応が不均一、非効率になるという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度の高い生体物質検出カートリッジ、生体物質検出装置、および生体物質検出方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る生体物質検出カートリッジは、試料溶液に含まれる特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための反応容器と、前記反応容器内に面した多孔質膜と、前記多孔質膜に重層された気液分離膜と、前記気液分離膜の前記多孔質膜と接する面とは反対の面上に設けられ、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、内部を負圧に保つことが可能な気泡排出部と、を備えたものである。
【０００９】
本発明によれば、反応中に反応容器内で気泡が発生しても、気液分離膜を通して気泡を排出することができるので、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。また、気液分離膜と反応容器の間に多孔質膜を設けたことによって、反応容器の内壁だけでなく、多孔質膜側にもプローブを固定することができる。
【００１０】
また、前記反応容器は、前記プローブを固定する領域を各々有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための複数のチャンバーと、前記複数のチャンバー間に設けられた流路と、を備え、前記流路は、前記試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積が前記チャンバーの断面積よりも小さいことが望ましい。
【００１１】
これにより、流路で繋がれた各々のチャンバーに、それぞれ異なる１種類のプローブを固定することにより、１度に複数種類のターゲットの検出を行うことができる。また、１つのチャンバー内では１種類のプローブのみを用いれば、反応結果の検出を、発光物質が溶液中に浮遊する化学発光物質を用いて行っても、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
【００１２】
さらに、流路の試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積がチャンバーの断面積よりも小さく形成されているため、断面積の小さな流路から大きなチャンバーへ試料溶液が流入することによって、液体の流れが変化し、チャンバー内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー内の試料溶液が攪拌されることによって、プローブに短い時間でより多くのターゲットとなる生体物質が接することになるので、反応効率がより向上する。
【００１３】
前記プローブを固定する領域は、前記反応容器の内壁に設けられていてもよいし、前記多孔質膜上に設けられていてもよい。また、内壁と多孔質膜の両方に設けられていても良い。
プローブを固定する領域を内壁と多孔質膜の両方に設けることにより、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積が広くなり、反応効率、検出感度が向上する。また、多孔質膜は三次元構造を有するため、反応容器の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。
【００１４】
また、前記反応容器と前記多孔質膜の間に、前記プローブを固定する領域に対応した貫通孔を有する基板を備えるようにしてもよい。
これにより、前記多孔質膜上のプローブ固定領域とプローブ固定領域の間を分離することができ、隣り合う固定領域に異なるプローブを固定した場合、プローブが混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がない。
【００１５】
また、前記反応容器は、透明基板で形成されていることが望ましい。
これにより、反応容器の外側から内部の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができ、装置の小型化および処理の効率化を図ることができる。
【００１６】
本発明に係る生体物質検出装置は、上記の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、前記気泡排出部を負圧に保つための第１のポンプを備えている。
これにより、簡易な方法で、反応中に反応容器内で発生した気泡を、気液分離膜を通して排出することができる。
【００１７】
また、前記反応容器内で前記試料溶液を往復移動させるための第２のポンプを備えていることが望ましい。
これにより、より多くのターゲットとなる生体物質がプローブに接するようになるので、反応効率が向上する。
【００１８】
本発明に係る生体物質検出方法は、上記の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、前記反応容器内に試料溶液を供給し、前記試料溶液に含まれる特定の生体物質と、前記反応容器内に固定され、前記生体物質を検出するためのプローブとを反応させる反応工程と、前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、前記反応工程では、前記気泡排出部を負圧に保つことにより、前記気液分離膜を通して前記反応容器内の気泡を外部へ排出することを特徴とする。
【００１９】
本発明によれば、反応中に反応容器内で気泡が発生しても、気液分離膜を通して気泡を排出することができるので、反応容器内での反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。
【００２０】
また、前記検出工程では、化学発光物質を用いた方法により、前記プローブと反応した前記生体物質の検出を行うことが望ましい。
一般に、化学発光物質を用いた方法では、発光物質の産出量を加える基質の量を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による核酸検出装置（生体物質検出装置）１０の概略構成を示す斜視図である。図に示すように、核酸検出装置１０は、検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）２０を設置するステージ１０１、検出用窓１０２、ポンプ１０３、ポンプ１０４、試料容器１０５、ＣＣＤカメラ１０６を備えている。
【００２２】
ステージ１０１は、検出カートリッジ２０を固定するためのステージである。ステージ１０１には検出用窓１０２が設けられており、ハイブリダイゼーション反応の検出処理の際、ＣＣＤカメラ１０６を用いて、検出カートリッジ２０内で産出された化学発光物質の発光強度を測定することができる。
【００２３】
ポンプ１０３，１０４は、例えばシリンジポンプやマイクロポンプを用いることができる。ポンプ１０３は、検出カートリッジ２０内で試料溶液の往復送液を行うために用いられ、ポンプ１０４は、検出カートリッジ２０内の気泡を排出するために用いられる。ポンプ１０３，１０４は、フッ素樹脂、ポリエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、シリコーン樹脂等からなるキャピラリーチューブを介して検出カートリッジ２０と接続されている。
【００２４】
試料容器１０５は、検体試料溶液を収容するための容器である。試料容器１０５は、フッ素樹脂、ポリエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂、シリコーン樹脂等からなるキャピラリーチューブを介して検出カートリッジ２０と接続されており、検出カートリッジ２０内へは、この試料容器１０５から、試料溶液が供給される。また、ポンプ１０３を用いて試料溶液の往復送液を行う際、検出カートリッジ２０内から溢れた試料溶液が、試料容器１０５に一旦流入し、また、検出カートリッジ２０内へ戻っていく。
【００２５】
図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジ２０の分解斜視図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。図に示すように、検出カートリッジ２０は、基板２０１、気液分離膜２０４、多孔質膜２０５、基板２０２、及び基板２０３を貼り合わせて構成される。
【００２６】
基板２０１には、気泡排出部２０６が形成されている。気泡排出部２０６には、排出口２０７が設けられており、排出口２０７とポンプ１０４はキャピラリーチューブを介して繋がれる。また、基板２０１には、基板２０３に形成された流路２１３の両端に対応する位置に、液体導入口２０８，２０９が設けられており、液体導入口２０８，２０９は、それぞれポンプ１０３、試料容器１０５とキャピラリーチューブを介して繋がれる。
【００２７】
気液分離膜２０４、多孔質膜２０５は、基板２０１と基板２０２の間に挟まれている。気液分離膜２０４は、４フッ化エチレン樹脂等で形成された膜であり、気体は透過させるが、液体の透過は遮断する性質を持つ。多孔質膜２０５は、ニトロセルロースやナイロン、ポリカーボネート等で形成された膜である。
【００２８】
基板２０２には、基板２０３に形成されたチャンバー２１２に対応する位置に、貫通孔２１０が設けられている。また、多孔質膜２０５及び気液分離膜２０４を配置するための膜配置用凹部２１１が形成されている。また、基板２０１と同様に、基板２０３に形成された流路２１３の両端に対応する位置に、液体導入口２０８，２０９が設けられている。
【００２９】
基板２０３には、複数のチャンバー２１２と、チャンバー２１２間を繋ぐように設けられた流路２１３が形成されている。流路２１３の両端部は、それぞれ液体導入口２０８，２０９を介してポンプ１０３、試料容器１０５と接続される。基板２０３は、ガラス基板などの透明基板であることが望ましい。これにより、チャンバー２１２の外側から内部の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができる。
【００３０】
図３（Ａ）に示すように、基板２０３、基板２０２、及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われ、各々が流路２１３を介して繋がった複数のチャンバー２１２が形成される。さらに、その上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、チャンバー２１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、チャンバー２１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００３１】
チャンバー２１２は、例えば、送液方向の長さを２００μｍ、送液方向に垂直な断面の幅を２００μｍ、深さを１５０〜２００μｍ、とすることができる。また、チャンバー２１２とチャンバー２１２を繋ぐ流路２１３は、送液方向の長さを２００μｍ、送液方向に垂直な断面の幅を１００μｍ、深さを５０〜１００μｍとすることができる。流路２１３の送液方向に垂直な断面の面積は、チャンバー２１２の送液方向に垂直な断面よりも小さく形成されている。チャンバー２１２の形状は、円形の他、例えば楕円形や、四角形の角を丸めた形状など、チャンバー２１２内に気泡がたまりにくい形状が望ましい。
【００３２】
各々のチャンバー２１２は、内壁上にプローブ固定領域２１４を有している。プローブ固定領域２１４は、プローブを塗布するための領域である。プローブ固定領域２１４は、図３（Ａ）に示すように、チャンバー２１２の内壁の表面に設けられていてもよいし、図３（Ｂ）に示すように、チャンバー２１２の内壁と多孔質膜２０５の表面に設けられていても良い。図３（Ｂ）に示す構成の場合には、チャンバー２１２内のプローブの量が増え、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積も広くなるので、反応効率、検出感度が向上する。また、図３（Ｃ）に示すように、多孔質膜２０５の表面にのみプローブ固定領域２１４が設けられている構成とすることもできる。多孔質膜２０５は三次元構造を有するため、チャンバー２１２の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。
【００３３】
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。
【００３４】
なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
【００３５】
プローブ固定領域２１４へのプローブの塗布は、非接触あるいは接触式スポッター等を用いて行うことができる。なお、多孔質膜２０５への塗布は非接触スポッターを用いることが望ましい。本実施形態では、各々のチャンバー２１２には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。
【００３６】
なお、プローブ固定領域２１４には、必要に応じて、表面処理が施されていてもよい。表面処理としては、例えば、プローブをプローブ固定領域２１４の表面に確実に固定するための処理（固相化処理）等が挙げられる。
【００３７】
次に、本実施形態による核酸検出装置１０を用いた、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理（反応工程）およびハイブリダイゼーションの検出処理（検出工程）について説明する。
【００３８】
まず、プローブ固定領域２１４にプローブが固定された検出カートリッジ２０内（チャンバー２１２と流路２１３で形成される空間）に、ポンプ１０３を用いてブロッキング液を充填する。
【００３９】
ここで、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内部を負圧にしてから、ポンプ１０３を用いて充填したブロッキング液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、プローブが固定化されていない領域をブロッキングする。ブロッキングは約１０分行う。
【００４０】
次に、ポンプ１０３を用いてブロッキング液を排出した後、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４１】
次に、検出カートリッジ２０内に、ビオチン標識した試料溶液を充填する。具体的には、ポンプ１０３を駆動することにより、試料容器１０５に収容された試料溶液が検出カートリッジ２０内に供給される。
【００４２】
ビオチン標識した試料溶液の調整方法について説明する。
試料溶液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
具体的には、まず、試料中に第１及び第２のプライマーを加え、温度サイクルをかける。第１のプライマーはターゲットとなる核酸の一部と特異的に結合し、第２のプライマーはターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸を含む二本鎖核酸と第１及び第２のプライマーが結合すると伸長反応によってターゲット核酸を含む二本鎖核酸が増幅される。十分に標的核酸を含む二本鎖核酸が増幅された後に、試料中に第３のプライマーを加えて温度サイクルをかける。第３のプライマーは、伸長反応時にビオチンの取込みが可能であり、ターゲット核酸と相補的な核酸の一部と特異的に結合する。ターゲット核酸に相補的な核酸と、第３のプライマーが結合すると伸長反応によってビオチンで標識されたターゲット核酸が増幅される。結果として、試料中にターゲット核酸が含まれている場合は標識されたターゲット核酸が生成され、試料中にターゲット核酸が含まれない場合は標識されたターゲット核酸は生成されない。なお、ここでは、標識物質はビオチンとしたが、他の酵素や、蛍光物質、等でも良い。
【００４３】
次に、充填したビオチン標識した試料溶液を検出カートリッジ２０内で往復送液し、プローブ固定領域２１４に固定されているプローブと反応（ハイブリダイセーション）させる。ハイブリダイセーションは１〜３時間行うのが望ましい。
【００４４】
なお、ハイブリダイセーションを行っている間も、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておく。
本実施形態に係る検出カートリッジ２０は、流路２１３の試料溶液が流れる方向に垂直な断面の面積がチャンバー２１２の断面積よりも小さく形成されている。断面積の小さな流路２１３から大きなチャンバー２１２へ試料溶液が流入することによって、液体の流れが変化し、チャンバー２１２内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー２１２内の試料溶液が攪拌されることによって、プローブ固定領域２１４のプローブに短い時間でより多くのターゲット核酸が接することになるので、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。一方、液体が乱流によって攪拌されやすいため、チャンバー２１２内には気泡が溜まりやすく、不均一なハイブリダイゼーション反応を誘引させる可能性がある。しかし、本実施形態によれば、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておくことにより、気液分離膜２０４を通ってチャンバー２１２内の気泡が気泡排出部２０６へ排出されるため、反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。
【００４５】
次に、ポンプ１０３を用いてビオチン標識した試料溶液を排出した後、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４６】
次に、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内にストレプトアビジン標識した化学発光用酵素（ＨＲＰ）液を充填し、検出カートリッジ２０内で約５分間往復送液する。
次に、ＨＲＰ液を排出した後、検出カートリッジ２０内に洗浄液を充填し、充填した洗浄液を検出カートリッジ２０内で往復送液することにより、チャンバー２１２および流路２１３内部を十分に洗浄する。
【００４７】
次に、ポンプ１０３を用いて検出カートリッジ２０内に化学発光基質（ルミノール）と過酸化水素を含む溶液を充填する。充填したら、気泡排出部２０６内を大気圧に戻し、ポンプ１０３による往復送液操作は行わずに約１０〜３０秒静止させ、化学発光物質の産出を待つ。
【００４８】
化学発光物質が産出されたら、ＣＣＤカメラ１０６を用いて発光強度を測定し、ハイブリダイゼーション反応の有無を確認する。
【００４９】
図４（Ａ）は、化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図である。図４（Ａ）に示すように、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合したビオチンとストレプトアビジン標識済みの化学発光用酵素（ＨＲＰ）が結合し、そこへ化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加えることにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出することにより発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。
【００５０】
図４（Ｂ）は、蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。蛍光標識剤を用いた方法では、ターゲット核酸に結合した蛍光標識剤が、励起光を照射することにより発光する。発光強度は、ターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するため、化学発光物質を用いた検出方法に比べると、検出感度を高めることが難しい。
【００５１】
このため、検出感度を向上させるためには、化学発光物質による方法を用いた方がよい。なお、蛍光標識剤を用いた方法では、発光体である蛍光標識剤が、ターゲット核酸に結合した状態であるため、発光体の位置が動かない。このため、１つのチャンバー内で複数のプローブを用いたハーブリダイゼーションを行う場合でも、どのプローブとの反応結果なのかの区別がつきやすい。一方、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が１つのチャンバー内で混ざり合ってしまうため、１つのチャンバー内で複数のプローブを用いた場合には、どのプローブによって検出されたものなのか区別がつかなくなってしまう。しかし、本実施形態による核酸検出装置１０では、各々のチャンバー２１２にはそれぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、化学発光物質を用いた検出方法でも、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなる問題がなく、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。
【００５２】
以上のように、実施の形態１によれば、流路２１３で繋がれた各々のチャンバー２１２に、それぞれ異なる１種類のプローブを固定することにより、１度に複数種類のターゲットの検出を行うことができる。また、１つのチャンバー内では１種類のプローブのみを用いるようにすれば、ハイブリダーゼーション結果の検出を化学発光物質による方法で行っても、発光物質が混ざり合ってどのプローブとの反応結果なのか区別がつかなくなるという問題がない。
【００５３】
さらに、本実施形態では、流路２１３の、試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積がチャンバー２１２の断面積よりも小さく形成されているため、流路２１３とチャンバー２１２の境界で流れの変化が発生し、チャンバー２１２内の試料溶液を攪拌する効果がある。チャンバー２１２内の試料溶液が攪拌されることによって、短い時間でより多くのターゲットとプローブが接することになるので、反応効率が向上する。
【００５４】
また、本実施形態によれば、ポンプ１０３を用いてチャンバー２１２および流路２１３内で試料溶液を往復移動させるようにしたので、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。
【００５５】
一方、本実施形態では、流路２１３とチャンバー２１２の境界で乱流が発生し、チャンバー２１２内に気泡が溜まりやすくなるが、ポンプ１０４を用いて気泡排出部２０６内を負圧に保っておくことにより、気液分離膜２０４を通ってチャンバー２１２内の気泡が気泡排出部２０６へ排出されるため、反応が不均一になることを防止し、反応効率及び検出感度を高めることができる。なお、気液分離膜２０４とチャンバー２１２の間に多孔質膜２０５を設けたことによって、多孔質膜２０５側にもプローブ固定領域２１４を設けることができる。
【００５６】
実施の形態２．
図５（Ａ）は、本発明の実施の形態２による検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）３０の分解斜視図、図５（Ｂ）は図５（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
図に示すように、実施の形態２では、基板２０３には、複数のチャンバー２１２の代わりに１つの反応容器３１２が形成されている。また、基板２０２がなく、気液分離膜２０４と多孔質膜２０５は基板２０１と基板２０３の間に挟まれている。
【００５７】
図５（Ｂ）に示すように、基板２０３及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われた反応容器３１２が形成される。さらに、その上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、反応容器３１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、反応容器３１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００５８】
反応容器３１２は、プローブを塗布するためのプローブ固定領域２１４を有している。プローブ固定領域２１４は、図５（Ｂ）に示すように多孔質膜２０５の表面に設けられていてもよい。多孔質膜２０５は三次元構造を有するため、反応容器３１２の内壁に比べてより多くのプローブを固定することができるので、反応効率、検出感度を向上させることができる。また、図６（Ａ）に示すように、多孔質膜２０５の表面と反応容器３１２の内壁の対向する領域に設けられていてもよい。この場合、対向する領域には、同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。図６（Ａ）に示す構成の場合には、反応容器３１２内のプローブの量が増え、プローブとターゲットとなる生体物質が接する面積も広くなるので、反応効率、検出感度が向上する。また、図６（Ｂ）に示すように、反応容器３１２の内壁にのみプローブ固定領域２１４が設けられている構成とすることもできる。
【００５９】
また、図７（Ａ）は、本発明の実施の形態２の他の例による検出カートリッジ（生体物質検出カートリッジ）４０の分解斜視図、図７（Ｂ）は図７（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
図に示すように、基板２０３には、検出カートリッジ３０と同様に１つの反応容器３１２が形成されている。また、検出カートリッジ４０は基板２０２を備えており、気液分離膜２０４と多孔質膜２０５は基板２０１と基板２０２の間に挟まれている。
【００６０】
図７（Ｂ）に示すように、基板２０３、基板２０２、及び多孔質膜２０５を重ねて配置することによって、上面が多孔質膜２０５で覆われた反応容器３１２が形成される。また、多孔質膜２０５と基板２０３の間に基板２０２を挟むことにより、基板２０２に設けられた貫通孔２１０に対応する領域の多孔質膜２０５のみが反応容器３１２内に露出されるので、この領域にプローブ固定領域２１４を形成することができる。さらに、多孔質膜２０５の上に気液分離膜２０４、基板２０１を重ねることによって、反応容器３１２内の空気が気液分離膜２０４を通って気泡排出部２０６に排出されるように構成することができる。気泡排出部２０６を負圧に保つことにより、反応容器３１２内で発生した気泡を除去することができる。
【００６１】
なお、反応容器３１２のプローブ固定領域２１４は、図７（Ｂ）に示すように多孔質膜２０５の表面のみに設けられていてもよいし、図８に示すように、多孔質膜２０５の表面と反応容器３１２の内壁の対向する領域に設けられていてもよい。この場合、対向する領域には、同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態１による核酸検出装置の概略構成を示す斜視図である。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による検出カートリッジの分解斜視図、図２（Ｂ）は図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図３】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【図４】図４（Ａ）は化学発光物質を用いた検出方法の原理を説明する図、図４（Ｂ）は蛍光標識剤を用いた検出方法の原理を説明する図である。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の実施の形態２による検出カートリッジの分解斜視図、図５（Ｂ）は図５（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図６】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【図７】図７（Ａ）は、本発明の実施の形態２の他の例による検出カートリッジの分解斜視図、図７（Ｂ）は図７（Ａ）のＣ−Ｃ断面を示す図である。
【図８】チャンバー内のプローブ固定領域の形成パターンを示す図である。
【符号の説明】
【００６３】
１０ 核酸検出装置、１０１ ステージ、１０２ 検出用窓、１０３ ポンプ、１０４ ポンプ、１０５ 試料容器、１０６ ＣＣＤカメラ、２０，３０，４０ 検出カートリッジ、２０１，２０２，２０３ 基板、２０４ 気液分離膜、２０５ 多孔質膜、２０６ 気泡排出部、２０７ 排出口、２０８，２０９ 液体導入口、２１０ 貫通孔、２１１ 膜配置用凹部、２１２ チャンバー、２１３ 流路、２１４ プローブ固定領域、３１２ 反応容器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料溶液に含まれる特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための反応容器と、
前記反応容器内に面した多孔質膜と、
前記多孔質膜に重層された気液分離膜と、
前記気液分離膜の前記多孔質膜と接する面とは反対の面上に設けられ、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、内部を負圧に保つことが可能な気泡排出部と、を備えた生体物質検出カートリッジ。
【請求項２】
前記反応容器は、
前記プローブを固定する領域を各々有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための複数のチャンバーと、
前記複数のチャンバー間に設けられた流路と、を備え、
前記流路は、前記試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積が前記チャンバーの断面積よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項３】
前記プローブを固定する領域が、前記反応容器の内壁に設けられていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項４】
前記プローブを固定する領域が、前記多孔質膜上に設けられていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項５】
前記反応容器と前記多孔質膜の間に、前記プローブを固定する領域に対応した貫通孔を有する基板を備えていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項６】
前記反応容器は、透明基板で形成されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記生体物質と前記プローブとの反応中に、前記気泡排出部を負圧に保つための第１のポンプを備えている生体物質検出装置。
【請求項８】
前記反応容器内で前記試料溶液を往復移動させるための第２のポンプを備えていることを特徴とする請求項７に記載の生体物質検出装置。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、
前記反応容器内に試料溶液を供給し、前記試料溶液に含まれる特定の生体物質と、前記反応容器内に固定され、前記生体物質を検出するためのプローブとを反応させる反応工程と、
前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、
前記反応工程では、前記気泡排出部を負圧に保つことにより、前記気液分離膜を通して前記反応容器内の気泡を外部へ排出することを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項１０】
前記検出工程では、化学発光物質を用いた方法により、前記プローブと反応した前記生体物質の検出を行うことを特徴とする請求項９に記載の生体物質検出方法。
【請求項１】
試料溶液に含まれる特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための反応容器と、
前記反応容器内に面した多孔質膜と、
前記多孔質膜に重層された気液分離膜と、
前記気液分離膜の前記多孔質膜と接する面とは反対の面上に設けられ、前記生体物質と前記プローブとの反応中に、内部を負圧に保つことが可能な気泡排出部と、を備えた生体物質検出カートリッジ。
【請求項２】
前記反応容器は、
前記プローブを固定する領域を各々有し、前記生体物質と前記プローブを反応させるための複数のチャンバーと、
前記複数のチャンバー間に設けられた流路と、を備え、
前記流路は、前記試料溶液が移動する方向に垂直な断面の面積が前記チャンバーの断面積よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項３】
前記プローブを固定する領域が、前記反応容器の内壁に設けられていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項４】
前記プローブを固定する領域が、前記多孔質膜上に設けられていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項５】
前記反応容器と前記多孔質膜の間に、前記プローブを固定する領域に対応した貫通孔を有する基板を備えていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項６】
前記反応容器は、透明基板で形成されていることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジ。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体物質検出カートリッジを用いて生体物質検出を行う生体物質検出装置であって、
前記生体物質と前記プローブとの反応中に、前記気泡排出部を負圧に保つための第１のポンプを備えている生体物質検出装置。
【請求項８】
前記反応容器内で前記試料溶液を往復移動させるための第２のポンプを備えていることを特徴とする請求項７に記載の生体物質検出装置。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、
前記反応容器内に試料溶液を供給し、前記試料溶液に含まれる特定の生体物質と、前記反応容器内に固定され、前記生体物質を検出するためのプローブとを反応させる反応工程と、
前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、
前記反応工程では、前記気泡排出部を負圧に保つことにより、前記気液分離膜を通して前記反応容器内の気泡を外部へ排出することを特徴とする生体物質検出方法。
【請求項１０】
前記検出工程では、化学発光物質を用いた方法により、前記プローブと反応した前記生体物質の検出を行うことを特徴とする請求項９に記載の生体物質検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１５０７５６（Ｐ２００９−１５０７５６Ａ）
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２８４３４（Ｐ２００７−３２８４３４）
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
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