生分解性ヒドロゲルの滅菌
本発明は、照射を用いた生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの最終的な滅菌方法に関する。保護溶媒の存在が、ヒドロゲルの三次元特性及び物理化学特性が機能上保全されて無傷のままであることを確実なものにしている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルは、組織再生、創縫合や薬物送達等のさまざまな医療・医薬適用で重要である。安全の理由から、例えばドラッグデリバリーのような一部の応用では、ＰＥＧヒドロゲルに生分解性を付与することが強く望まれている。生分解性は、インビボ水性環境で自然又は酵素加水分解を受けるエステル結合によりヒドロゲルに導入され得る。
【背景技術】
【０００２】
埋め込みあるいは局所適用が意図された医薬組成物又は医療デバイスの滅菌は、対応の市販製品としての認可を受けるためには必須である。さまざまな滅菌の方法、例えば加熱、加圧、濾過、化学薬品あるいは照射が提案されている。残念なこととして、これらの滅菌方法は、それらの方法がヒドロゲルの構造と特性を保持することとは両立できないため、生分解性ＰＥＧヒドロゲルには適用できない。つまり、生分解性ＰＥＧヒドロゲルの医療使用は限られている。
【０００３】
例えば、注射液は、ほとんどの場合、オートクレーブ処理により注射液バイアル中で滅菌されるが、生分解性結合は、高温に曝された場合、劇的に加速された分解を受けるだろう。したがって、生分解性ＰＥＧヒドロゲルのオートクレーブ処理は、治療適用に向いていない前分解された物質をもたらすだろう。
【０００４】
あるいは、微生物汚染物質を除去するために、溶液はポアサイズが０．２μｍのフィルターを用いて濾過により滅菌され、続いてその滅菌溶液が無菌条件下でバイアルの中に充填され得る。しかしながら、不溶性架橋ＰＥＧヒドロゲルの場合、この材料は不溶なので、微小粒子の懸濁液の形態で、あるいは典型的にはサイズが０．２μｍより大きい他の三次元物体（例えば、ディスクあるいはチューブ）として存在し得るので、このような懸濁液又はゲル物体は濾過によっては滅菌され得ないのである。
【０００５】
国際特許出願である（特許文献１）は、滅菌微小粒子の調製ができる閉鎖循環式装置を記載している。フィルター滅菌された各化学薬品成分は粒子形成過程の全体を通して系の無菌環境内に滅菌保持され、結果として滅菌微小粒子がもたらされる。
【０００６】
出発原料の段階で滅菌濾過工程を適用してその処理の間中無菌状態を維持するような無菌処理は、ヒドロゲル合成後滅菌（最後滅菌と呼ばれる）に比較するといくつかの欠点を有している。製造過程で滅菌工程が現れるのが早ければ早いほど、突発的な汚染のリスクは高くなる。無菌処理はまた精巧な専用の装置を必要とし、結果として製造コストが高くなる。したがって、最後滅菌法が好ましい。
【０００７】
高分子のＵＶ光あるいはガンマ線照射での光分解は、ラジカル及び／又はイオンを発生し、これは多くの場合開裂や架橋をもたらす。光への曝露は酸素の不存在下ではめったにないので、酸化も起こり、状況を複雑にしている。一般には、これらのことはヒドロゲルの特性並びに材料の生分解に対する感受性を変える（非特許文献１）。
【０００８】
エチレンオキサイドガスあるいは過酸化水素含有溶液での処理は同じような副反応を引き起こしてヒドロゲルの生分解特性に悪影響を及ぼし、処理済ヒドロゲル材料の未処理ヒドロゲル材料に比較しての分解速度の相当な偏移を引き起こすだろう。加えて、有毒であって望ましくない副作用を引き起こし得る、例えばエチレンオキサイドの有意な量がヒドロゲル中に残っていないことを確実にするための配慮がなされなければならない。
【０００９】
最後滅菌に伴う困難を回避するために、架橋と滅菌の工程が組み合わせられたことがある。（特許文献２）は、ガンマ線照射による架橋ＰＥＧヒドロゲルの作製方法を詳述している。この方法では、線状ＰＥＧ（ＭＷ２００ｋＤａ）が生理食塩水に溶解され、脱気されてＣｏ６０等のガンマ線源で照射された。２．５〜２５Ｍｒａｄ（２５〜２５０ｋＧｙに相当）の線量がラジカル形成並びに鎖間連結によるＰＥＧ鎖の架橋をもたらすのに十分であって、結果として水和された不溶性ヒドロゲルがもたらされた。この照射線量は滅菌にも十分高いという事実から、１工程で、眼の角膜の中に埋め込むのに適している材料が得られた。
【００１０】
同様に、米国特許出願である（特許文献３）は、クロスリンカー及び有機溶媒の存在下にＵＶ及び／又はガンマ線照射によって架橋される、ポリアルキレンオキシド、ポリアリーレンオキシド、又はポリグリシジルエーテルをベースとする、電子デバイスに用いられるための架橋高分子ゲルの形成方法を詳述している。
【００１１】
医薬の送達のような、他の適用では、ＰＥＧヒドロゲルが生分解性であることが望ましい。（特許文献４）は、ガンマ線照射による分解性ＰＥＧヒドロゲルの作製方法を詳述している。この方法では、生分解性エステル連結を介して接続された線状ＰＥＧ鎖が用いられている（ＭＷ１０ｋＤａ）。２５又は３０ｋＧｙでの照射は鎖間架橋並びに不溶性ＰＥＧヒドロゲルを形成した。
【００１２】
また、ＵＶ又はガンマ線照射ＰＥＧヒドロゲル中の架橋の度合いを変化させることによって薬物放出速度を調節することも試みられた（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。とはいっても、この試みでは、照射処理の間中の薬物の存在は薬物の取り込みをもたらすために必要とされているが、高分子鎖への酸化又は加水分解あるいは共役化のような照射が誘発する副反応の可能性が、この方法をほとんどの治療用要素にとって実行不可能なものにしている。
【００１３】
また、照射は、膨潤や粗さのようなＰＥＧベースヒドロゲルの他の特性に影響を及ぼすことも示されている（非特許文献７）。
【００１４】
文献ではさまざまなＰＥＧベースヒドロゲルが記載されている。例えば、（特許文献５）は、プロドラッグの高分子ヒドロゲル複合体を記載しており、このヒドロゲルは生分解性の結合を含んでいるクロスリンカーによって相互接続された非生分解性骨格部分から構成されている。
【００１５】
欧州特許出願である（特許文献６）は、特徴的な後期爆発的分解速度を有するＰＥＧベースヒドロゲルを記載している。
【００１６】
ＰＥＧ部分のみからなるヒドロゲルが欧州特許である（特許文献７）に記載されている。このヒドロゲルには分解を可能にするために加水分解不安定性結合が組み込まれている。この特許はそのようなヒドロゲルの薬物送達系としての使用も特許請求している。
【００１７】
（特許文献８）は、特に、診断用標識物質を、単独又は治療用薬物との組み合わせで含有していて良いＰＥＧベースヒドロゲルを記載している。同様に、（特許文献９）は、インビボ注射され得る生物活性剤を含有している、ＰＥＧ−キトサンヒドロゲルを記載している。ＰＣＴ出願である（特許文献１０）は、薬物送達デバイスとしてあるいは他の生医学利用で用いられるカルバマート架橋を有するポリ（エチレンオキシド）含有ヒドロゲルを開示している。
【００１８】
上記で述べたヒドロゲルは、すべて滅菌を必要とする適用に用いられることを意図しているが、上述の問題はこれらの特許又は特許出願によっては対処されておらず、これが産業へのそれらの適用性を限定している。
【００１９】
ヒドロゲル滅菌における不十分な点の結果として、不溶性架橋生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルはそのままではまだ認可されておらず、投与後ｉｎ ｓｉｔｕでヒドロゲルを形成する前駆体組成物としてのみ認可されている（Ｃｏｒｇｅｌ（商標）ＢｉｏＨｙｄｒｏｇｅｌ、Ｆｏｃａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。したがって、汚染に敏感な応用に際してヒドロゲルを十分利用するためには、コスト効率的且つ保全的な方法でヒドロゲルを最後滅菌するための手段を提供するというニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００３／０３５２４４号
【特許文献２】米国特許第５，６３４，９４３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／００３０１０２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５３７，５６９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／００３０１４号
【特許文献６】欧州特許第０９１６７０２６．５号明細書
【特許文献７】欧州特許第１０１９４４６号明細書
【特許文献８】米国特許５，５１４，３７９号明細書
【特許文献９】米国特許６，６０２，９５２号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００６／３８４６２号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Mark Herman (Ed) Wiley, 2004, p. 263 ff
【非特許文献２】Minkova et al., J. Polym. Sci., Polym. Phys. 27 (1989) 621-642
【非特許文献３】Belcheva et al., Macromol. Symp. 103 (1996) 193
【非特許文献４】Rosiak and Yoshii, Nuclear Instruments and Methods／Physics research B 151 (1999) 56-64
【非特許文献５】Rosiak and Ulansky, Radiation Physics and Chemistry 55 (1999) 139-151
【非特許文献６】Dimitrov et al., Acta Pharmaceutica Turcica 46 (2004) 49-54
【非特許文献７】Kanjickal et al, J Biomed Mater Res A. 2008 Jan 9 - Effects of sterilization on poly(ethylene glycol) hydrogels
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
すなわち、本発明の目的は、欠点を少なくとも一部克服するための、また上記に記載したニーズを満たすための不溶性の生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルの代替滅菌方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、加水分解性結合により相互接続されている骨格部分を含む生分解性ポリ（エチレングリコール）ベース不溶性ヒドロゲルの滅菌方法であって、次の工程
（ａ）ヒドロゲルを準備する工程；
（ｂ）このヒドロゲルを保護溶媒又は２種もしくはそれ以上の保護溶媒の混合物又はそれらの水溶液に溶媒和させる工程；
（ｃ）溶媒和したヒドロゲルにガンマ線照射を行う工程；
を含む方法によって達成される。
【００２４】
この度、意外なこととして、予め形成された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、ガンマ線の照射が、保護溶媒（好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＡ、ＤＭＦ又はＤＭＩ、より好ましくはＮＭＰ）の存在下に行われる場合は、不安定性生分解結合への損傷なしに、したがって安定結合への損傷も全くなしに且つ架橋を引き起こすこともなしにガンマ線照射によって滅菌され得ることを見出した。
【００２５】
特に、本発明によるそのような照射された不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度は、照射されていないＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度に等しいものであった。さらには、そのような照射された不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、なお十分に生分解性であった。もしラジカル生成による鎖間架橋が形成されていたとすると、分解速度は影響を受けていたであろうし、また、不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲル分解過程はもっとゆっくりしたものであろうし、分解曲線はフラットであろうし、分解も完結まで至らなかったであろう。
【００２６】
不溶性生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルが官能性の基を含有している場合、そのような基は、滅菌後もなお官能性である。
【００２７】
本発明において使われている用語は以下の通りの意味を有している。
【００２８】
ヒドロゲルとは、大量の水を取り込むことができる三次元の、親水性もしくは両親媒性高分子網目構造体と定義され得る。この網目構造体は、ホモポリマー又はコポリマーからなり、化学的な共有結合もしくは物理的（イオン、疎水相互作用、絡み合い）架橋が存在することから不溶である。この架橋により網目構造及び物理的一体性がもたらされる。
【００２９】
本明細書において理解される用語「ＰＥＧベースヒドロゲル」（ＰＥＧヒドロゲル）は、ヒドロゲル中のＰＥＧ鎖の質量割合が、ヒドロゲルの全体重量を基準にして、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも２５％であることを意味している。残りの部分は、他の高分子及び他の部分構造から構成され得る。
【００３０】
用語「高分子」は、合成もしくは生物由来又は両者の組み合わせであり得る、線状、環状、分岐状、架橋もしくは樹枝型分岐状又はこれらの組み合わせによる化学結合により接続された繰り返し構造単位からなっている分子を表す。例として、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリラート）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アルキルオキシ）ポリマー、ポリ（アミド）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（アスパルトアミド）、ポリ（酪酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カーボナート）、ポリ（シアノアクリラート）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（エチレン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリラート）、ポリ（ヒドロキシエチルオキサゾリン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリラート）、ポリ（ヒドロキシプロピルオキサゾリン）、ポリ（イミノカーボナート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリラート）、ポリ（メチルオキサゾリン）、ポリ（プロピレンフマラート）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（シロキサン）、ポリ（ウレタン）、ポリ（ビニルアルコホール）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）、シリコーン、リボ核酸、デゾキシ核酸、アルブミン、これらの抗体及び断片、血漿蛋白、コラーゲン、エラスチン、ファシン、フィブリン、ケラチン、ポリアスパルタート、ポリグルタマート、プロラミン、トランスフェリン、シトクロム、フラボプロテイン、グリコプロテイン、ヘモプロテイン、リポプロテイン、メタロプロテイン、フィトクロム、ホスホプロテイン、オプシン、カンテン、アガロース、アルギナート、アラビナン、アラビノガラクタン、カラギーナン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース並びに他の炭水化物ベース高分子、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、キシラン、並びにこれらのコポリマー及び機能性誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
滅菌ヒドロゲルに関しての「無傷」とは、不安定な生分解性結合に損傷がなかったこと及びしたがって安定な結合にも損傷がなかったこと並びに滅菌化の間に検出可能なさらなる架橋も起こらなかったことを意味する。ヒドロゲルの「無傷度」は、本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルのインビトロ分解速度により測定することができ、滅菌されていない生分解性ＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度にそれが同じである度合いである。さらには、照射されたそのような生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、なお十分に生分解性である。もしラジカル生成による鎖間架橋が形成されていたとすると、分解速度は影響を受けていたであろうし、したがってＰＥＧヒドロゲル分解過程はもっとゆっくりしたものであろうし、分解曲線はフラットであろうし、分解も完結まで至らなかったであろう。もし鎖の切断が起こると、ＰＥＧヒドロゲル分解過程は加速されるだろう。２つの分解速度に関しての用語「等しい」は、Ｘ％の分解を得るのに必要とされる時間が２つの分解速度間で２０％以上、好ましくは１５％以上変わらないことを意味する（ここで、Ｘは５〜９０の範囲内にあるものとする）。
【００３２】
生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルが官能基を含有している場合、それらの官能基は保全される。例えば、官能基がアミン基である場合、ＰＥＧベースヒドロゲルのアミン含有量は滅菌前と滅菌処理後で同じである。好ましくは、この文脈での用語「同じ」は、本発明に従って滅菌されたヒドロゲル中の官能基の数が滅菌前のヒドロゲル中の官能基の数から３０％未満、好ましくは２０％未満だけ変わることを意味する。
【００３３】
分解速度を測定するためには、不溶性生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルから可溶骨格分解生成物のアリコートを分離して、そのヒドロゲルから脱離された他の可溶分解生成物からの干渉なしに定量することができる。沈殿又は遠心によりヒドロゲル物体は生理浸透圧の緩衝液の過剰水と分離され得る。遠心は、上澄み液が膨潤ヒドロゲルの体積の少なくとも１０％を占めるようなやり方で行われ得る。そのような沈殿又は遠心工程の後は可溶ヒドロゲル分解生成物は水性上澄み液中に残り、１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる水可溶分解生成物はそのような上澄み液のアリコートを適する分離及び／又は分析方法に付することによって検出できる。
【００３４】
別法として、水可溶分解生成物は０．４５μｍフィルターを通す濾過により水不溶性分解生成物から分離することができ、この後、その水可溶分解生成物は通過流中に見出され得る。水可溶分解生成物は遠心と濾過処理の組み合わせによっても水不溶性分解生成物から分離され得る。
【００３５】
例として、骨格部分は、他の分解生成物がＵＶ吸収を呈さない波長でＵＶ吸収を呈する基を有し得る。そのような選択的ＵＶ吸収基は、アミド結合等の骨格部分の構造成分であり得るし、あるいはインドリル基等の芳香族環系を用いてその反応性官能基に結合させることによって骨格に導入されたものであり得る。
【００３６】
薬物のインビボ物理化学又は薬理速度特性を向上させるためには、そのような薬物は、担体（例えば、ヒドロゲル）と複合体化され得る。薬物が担体及び／又はリンカーに一時的に結合されている場合、そのようなシステムは一般に担体連結プロドラッグとして分類される。ＩＵＰＡＣによって提供されている定義（http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchemに掲載、２００９年７月２２日にアクセス）によれば、担体連結プロドラッグとは、改善された物理化学又は薬理速度特性をもたらし且つ一般には加水分解開裂によって容易にインビボ除去され得る一時的担体基と所与の活性物質との仮の連結を含有しているプロドラッグである。
【００３７】
用語「薬物」、「生物活性分子」、「生物活性部分」、「生物活性剤」、「活性剤」等は、限定するものではないがウイルス、細菌、菌類、植物、動物、及びヒトを含めた、生物有機体の任意の物理又は生化学特性に影響を及ぼすことができるあらゆる物質を意味する。特に、本明細書で使われる場合、生物活性分子には、ヒト又は他の動物における病気を診断、治療、軽減、処置、又は予防することが意図された、あるいはそうでなければヒト又は動物の身体又は精神の健康状態を高めることが意図されたあらゆる物質が包含される。生物活性分子の例としては、限定するものではないが、ペプチド、蛋白、酵素、小分子ドラッグ（例えば、非ペプチドドラッグ）、染料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが挙げられる。本発明で用いるのに適している生物活性剤の類としては、限定するものではないが、催眠薬及び鎮静薬、精神高揚薬、精神安定薬、呼吸器ドラッグ、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン作用薬（ドーパミン拮抗薬）、鎮痛薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、抗不安薬（不安緩解剤）、食欲抑制剤、肥満防止薬、抗片頭痛薬、筋肉収縮剤、抗感染症薬（抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、抗菌薬、ワクチン）、抗炎症薬、抗関節炎薬、抗マラリア薬、制吐剤、抗癲癇薬、抗糖尿病薬、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗がん剤、抗凝固剤、抗高血圧薬、心血管薬、血管拡張薬、血管収縮薬、抗不整脈薬、抗酸化薬、反喘息薬、中枢神経系活性剤、避妊薬を含めたホルモン剤、免疫調節剤、交感神経興奮薬、利尿薬、脂質調節薬、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫薬、抗凝固薬、新生物、抗新生物薬、低血糖薬、ステロイド薬、栄養剤及び補助食品、成長補助食品、抗腸炎剤、ワクチン、抗体、診断薬、対照用剤等が挙げられる。
【００３８】
「小分子生物活性部分」とは、分子量が３０００Ｄａｌｔｏｎ以下の上記に記載した生物活性部分のことをいう。
【００３９】
本発明による方法に合ったヒドロゲルの生分解性は、加水分解性結合の導入によって達成される。
【００４０】
本発明の文脈内での用語「生分解性」とは、生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下で１時間〜３ヶ月の半減期で非酵素的に加水分解で分解される連結を指し、これには、限定するものではないが、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバマート、これらの組み合わせ他が挙げられる。好ましい生分解性連結は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。インビトロ研究には、例えば、ｐＨ９、３７℃、水性緩衝液のような加速条件が実用的な目的のために用いられ得ることは理解されるところである。
【００４１】
つまり、加水分解性結合は、例えば、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバマート、これらの組み合わせ等である。好ましい加水分解性結合は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。
【００４２】
用語「中断された」は、尿素、アミド、又はカルバマート基もしくはエーテルが炭素鎖の２つの炭素間に挟み込まれていることを意味する。
【００４３】
「非生分解性」（安定）とは、非開裂性の永久結合である連結のことをいい、それぞれの接続部分が生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下で少なくとも６ヶ月の半減期を有していることを意味する。
【００４４】
「徐放送達システム」とは、長期間に亘って患者の身体に薬物を放出する組成物のことをいう。
【００４５】
「外科用密閉剤」又は「医用密閉剤」とは、ヒドロゲルベースの接着剤並びに切り口、破傷、穿刺、擦過傷、挫傷や剥離のような、創傷を密閉するためのその他の手段のことをいう。
【００４６】
「止血剤」とは、創傷からの出血を停止させるのに使われる作用剤のことをいう。
【００４７】
「手術用スポンジ」とは、手術部位からの液体を吸収するのに使われるスポンジを意味する。
【００４８】
ガンマ線照射は、その照射源に関係なく、２００ｋｅＶより大きい量子エネルギーでの電磁照射と定義されている。好ましくは、照射源は、コバルト６０である。
【００４９】
「滅菌」とは、あらゆる成長段階並びに形態にある、細菌、酵母、真菌、ウイルス、胞子を含めた、検出可能な伝染性外的病原因子が存在しないことを意味する。
【００５０】
「滅菌処理」とは、例えば照射（例えばＵＶあるいはガンマ線での照射）により材料を滅菌にするための処理のことをいう。好ましくは、ガンマ線での照射が用いられる。
【００５１】
「保護溶媒」は、三次元構造及び物理化学特性を保全するために、つまりヒドロゲルが無傷であることを保全するために滅菌前に乾燥ヒドロゲルを溶媒和させるのに用いられる化学薬品化合物を表している。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１ａ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ａの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｂ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｂの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｃ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｃの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｄ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｄの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｅ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｅの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｆ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｆの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｇ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｇの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｈ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｈの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｉ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｉの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｊ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｊの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｋ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｋの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図２】ｐＨ９．０、３７℃における６の滅菌後インビトロ分解速度を、５（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５４】
本発明は、ヒドロゲルを無傷に保持する保護溶媒の存在下に照射によって生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌する方法に関する。本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、同じ分解速度を有しており且つ十分に分解性であるが、このことは不安定な生分解性結合に損傷がないこと、したがって安定結合への損傷も起こっていないこと、さらには望ましくない架橋も起こっていないこと、つまりヒドロゲルが無傷であることが保全されることを意味している。本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが反応性の官能基を含有している場合、そのような基の官能性も保全される、すなわち基はそのまま保全される。そのような反応性官能基は、アフィニティーリガンド、キレート基、ドラッグ、プロドラッグ、担体連結プロドラッグ他を直接又は間接的に連結するための結合ポイントとして役立ち得る。そのような反応性官能基の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール、スルホン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアナート、イソチオシアナート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイル及び他のα−β不飽和マイケル受容体、アリールフルオリドのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、エポキシド、オキシラン、及びアジリジン；好ましくはカルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、チオール、スルホン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアナート、イソチオシアナート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アリールフルオリドのようなアクリロイルアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、オキシラン、及びアジリジンが挙げられる。好ましい反応性官能基としては、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、アルデヒド、及びハロアセチルが挙げられ、より好ましくはチオール、アミノ、カルボン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、アルデヒド、及びハロアセチルが挙げられる。好ましくは、反応性官能基は、一級アミノ基又はカルボン酸、最も好ましくは一級アミノ基である。
【００５５】
一実施形態では、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの反応性官能基は保護基で保護されているが、これは滅菌後に脱離される。
【００５６】
本発明に従って滅菌されたＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、例えば、再生医療、皮膚再生、眼内デバイス、医用埋め込み剤、外科用密閉剤及びスポンジ、止血剤、徐放送達システム、医用画像化剤及びプロドラッグ担体のような、滅菌が有益であるあるいは必要とされているあらゆる適用で用いられ得る。好ましい使用は、徐放送達システム及びプロドラッグ担体としてであり、最も好ましいのはプロドラッグ担体としてである。予め形成された三次元ヒドロゲルは保護溶媒の存在下に又は２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはこれらの水性溶液中で照射により滅菌され、滅菌ヒドロゲルは続いて場合により、例えば、例えばペプチド、プロテイン又は小分子のような生物活性部分を持ち得る。そのような生物活性部分はヒドロゲルには安定なスペーサー部分を介して又は分解性リンカー部分を介して連結され得る。
【００５７】
代替の実施形態では、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、最初に小分子生物活性部分が搭載され、その後保護溶媒の存在下に又は２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはそれらの水性溶液中で照射により滅菌される。
【００５８】
本発明による滅菌に適しているＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルはさまざまな形状のものであり得るが、そのようなものとしては、限定するものではないが、無定形、球形、水晶形、フラット形（例えばフィルムでの）又は管形のヒドロゲルが挙げられる。好ましい実施形態では、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、粒子直径が１〜１０００ミクロン、好ましくは１０〜１００ミクロンの球形微小粒子からなっている。
【００５９】
本発明による滅菌に適しているＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、分解性結合で相互接続された骨格部分からできている。場合によっては、この骨格部分は、骨格とは分解性結合を介して繋ぎ合わされていて、さらに分解性結合をもち得る、オリゴマー、高分子又は低分子量架橋部分を通して架橋されているものであり得る。場合により、骨格部分は、以下（リガンド、キレート基、スペーサー分子、ブロック基）のうちの１つ又はそれ以上への永久連結をもち得る。
【００６０】
本発明の一実施形態ではヒドロゲルは以下の組成を有している。
【００６１】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、加水分解性結合により相互接続された骨格部分からできている。好ましくは、その骨格部分は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲内にある分子量を有している。
【００６２】
好ましくは、この生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルにおいては、骨格部分は、相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基からなる、多くある官能性基を特徴としている。好ましくは、相互接続された生分解性基と反応性官能基の和は１６以上、好ましくは１６〜１２８（２０〜１００好ましい、２０〜４０も好ましい、２４〜８０より好ましい、２８〜３２もより好ましい、３０〜６０さらにより好ましい）であり；最も好ましいのは３０〜３２である。この相互接続された官能基及び反応性官能基に加えて保護基も存在し得ることは理解されるところである。
【００６３】
この官能基は、線状鎖に結合されたものであり得る。この場合、官能基は、鎖に沿って規則的に又は不規則的に間隔を置いて配置されたものであり得るし、あるいは別形態としては、この鎖は、官能基の全体をもたらしている、２つの樹枝状部分で終端されたものであり得る。
【００６４】
優先的に、骨格部分は、少なくとも３つのＰＥＧベース高分子鎖を延ばしている、分岐コアを有していることを特徴としている。そのような分岐コアは、結合形態で、ポリ−又はオリゴ−アルコール、好ましくはペンタエリトリトール、トリペンタエリトリトール、ヘキサグリセリン、スクロース、ソルビトール、フルクトース、マンニトール、グルコース、セルロース、アミロース、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコホール、デキストラン、ヒアルロナンを含んだものであり得るし、あるいは分岐コアは、結合形態で、オルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンのようなポリ−又はオリゴ−アミンを含んだものであり得る。好ましくは、分岐コアは、結合形態で、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンのようなポリ−又はオリゴ−アミンを含んだものであり得る。
【００６５】
好ましくは、この分岐コアは、３〜１６のＰＥＧベース高分子鎖を延ばしている（より好ましくは４〜８）。
【００６６】
骨格部分の相互接続された官能基と反応性官能基の和は、この分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数だけ等しく分けられている。分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数が均等な分布を可能としない場合は、ＰＥＧベース高分子鎖１本当たりの相互接続された官能基と反応性官能基の和の平均数からの逸脱が最小に保たれることが好ましい。
【００６７】
より好ましくは、骨格部分の相互接続された官能基と反応性官能基の和は、分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数だけ均等に分けられている。例として、３２個の相互接続された官能基と反応性官能基がある場合、８個の基が、そのコアから延びている４ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベース高分子鎖の終端に結合された樹枝状部分によってもたらされ得る。別形態としては、４個の基がコアから延びている８ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによってあるいは２個の基が１６ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによってもたらされ得る。
【００６８】
骨格部分に好適な分岐コアから延びている対応するＰＥＧベース高分子鎖の好ましい構造は、例としてであるが、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡのプロダクトリスト（２００９年７月２８日にwww.jenkemusa.comからダウンロードによりアクセス）に詳述されている、４ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（ペンタエリトリトールコア）、８ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（ヘキサグリセリンコア）及び８ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（トリペンタエリトリトールコア）のようなｍｕｌｔｉ−ａｒｍ（多腕）ＰＥＧ誘導体である。最も好ましいのは、４ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（ペンタエリトリトールコア）及び４ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ペンタエリトリトールコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（ヘキサグリセリンコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ヘキサグリセリンコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（トリペンタエリトリトールコア）、及び８ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（トリペンタエリトリトールコア）である。骨格部分中のそのような多腕ＰＥＧ誘導体の好ましい分子量は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは２．５ｋＤａ〜１５ｋＤａ、なおより好ましくは５ｋＤａ〜１０ｋＤａである。このような試薬はヒドロゲル中には結合形態で存在していることは理解されるところである。
【００６９】
そのようなさらなる官能性の基は樹枝状部分によってもたらされ得る。好ましくは、それぞれの樹枝状部分は、０．４ｋＤａ〜４ｋＤａ、より好ましくは０．４ｋＤａ〜２ｋＤａの範囲内の分子量を有している。好ましくは、それぞれの樹枝状部分は、少なくとも３分岐及び少なくとも４反応性官能基、且つ多くて６３分岐及び６４反応性官能基を有しており、少なくとも７分岐及び少なくとも８反応性官能基且つ多くて３１分岐及び３２反応性官能基が好ましい。
【００７０】
そのような樹枝状部分の例は、結合形態のトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン、ヘキサデカリシン、ヘプタデカリシン、オクタデカリシン、ノナデカリシンである。好ましいそのような樹枝状部分の例には、結合形態のトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシンが含まれる（最も好ましいのはトリリシン、ペンタリシン又はヘプタリシン）。
【００７１】
最も好ましくは、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、その骨格部分が式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４で表される四級炭素を有していることを特徴としていることであって、この式においてはそれぞれのＡは独立にその四級炭素に永久共有結合で終端結合されたポリ（エチレングリコール）ベース高分子鎖であり、このＰＥＧベース高分子鎖の遠位終端は樹枝状部分Ｈｙｐに共有結合されており、それぞれの樹枝状部分Ｈｙｐは相互接続された生分解性官能基と反応性官能基を代表する少なくとも４個の官能性の基並びに永久結合を有している。それぞれの骨格部分は、少なくとも１６個の相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基並びに永久結合、好ましくは２０〜６４、より好ましくは２８〜６４個の相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基並びに永久結合を含有している。
【００７２】
好ましくは、それぞれのＡは、式−（ＣＨ２）ｎ１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＸ−［式中、ｎ１は１又は２であり；ｎは５〜５０の範囲内の整数であり；ＸはＡとＨｙｐを共有連結している官能基である］から独立に選択される。
【００７３】
好ましくは、ＡとＨｙｐとは、アミド官能基により共有連結されている。
【００７４】
好ましくは、樹枝状部分Ｈｙｐは、超分岐ポリペプチドである。好ましくは、この超分岐ポリペプチドは、結合形態のリシンからなっていて、最も好ましくはＨｙｐはウンデカリシニル又はヘプタリシニルである。好ましくは、それぞれの樹枝状部分Ｈｙｐは、０．４ｋＤａ〜４ｋＤａの範囲内の分子量を有している。骨格部分Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４は同じ又は異なる樹枝状部分Ｈｙｐからなっていること及びそれぞれのＨｙｐは独立に選択され得ることは理解されるところである。それぞれの部分Ｈｙｐは５〜２１リシン、好ましくは少なくとも７リシンからなっている、すなわちそれぞれの部分Ｈｙｐは結合形態の５〜３２リシン、好ましくは結合形態の少なくとも７リシンからなっている。
【００７５】
好ましくは、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、なおより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有している。
【００７６】
本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解性結合の導入により達成される。
【００７７】
好ましくは、骨格部分はクロスリンカー部分を通して一緒に連結されていて良く、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合で終端されている。この終端分解性結合に加えて、クロスリンカー部分は、さらなる生分解性結合を含有していて良い。つまり、骨格部分に連結されたクロスリンカー部分のそれぞれの終端には加水分解性結合が含まれ、クロスリンカー部分にはさらなる生分解性結合が場合により存在していて良い。
【００７８】
つまり、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルには、加水分解性結合で相互接続された骨格部分が含まれており、ここにおける骨格部分は好ましくはクロスリンカー部分を通して一緒に連結されており、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合で終端されている。
【００７９】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは１種又はそれ以上の異なるタイプのクロスリンカー部分を含有し得る（好ましくは１種）。クロスリンカー部分は線状もしくは分岐分子であり得、好ましくは線状分子である。本発明の好ましい実施形態では、クロスリンカー部分は、骨格部分に少なくとも２つの生分解性結合で接続されている。
【００８０】
用語の生分解性結合とは、生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下において１時間〜３ヶ月の半減期で非酵素的に加水分解で分解される連結を表しており、そのようなものとしては、限定するものではないが、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カーボナート、これらの組み合わせ他が挙げられる。好ましい生分解性連結は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸カルボン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。
【００８１】
好ましくは、クロスリンカー部分は、６０Ｄａ〜５ｋＤａ（より好ましくは、６０Ｄａ〜４ｋＤａ、なおより好ましくは６０Ｄａ〜３ｋＤａ）、さらにより好ましくは０．５〜４ｋＤａ、なおより好ましくは１ｋＤａ〜４ｋＤａ、最も好ましくは１ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲内の分子量を有している。一実施形態では、クロスリンカー部分は、高分子からなっている。
【００８２】
オリゴマー又は高分子架橋部分に加えて、特にこの生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを形成するのに親水性高分子量骨格部分が用いられる場合は、低分子量架橋部分が用いられ得る。
【００８３】
好ましくは、このポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、場合によりさらなる官能基を含んでいる、エチレングリコール単位を含む炭化水素鎖であり、ここにおける各ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分には、それぞれ、少なくともｍエチレングリコール単位が含まれ、ここにおけるｍは、３〜１００、好ましくは１〜７０、最も好ましくは１０〜７０の範囲内の整数である。より好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、６０Ｄａ〜５ｋＤａ、より好ましくは０．５ｋＤａ〜５ｋＤａの範囲内の分子量を有している。
【００８４】
好ましくは、クロスリンカー部分は、好ましくは唯一のＰＥＧベース分子鎖によって表される、ＰＥＧベースである。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、場合によりさらなる化学官能基を含んでいる、１個又はそれ以上のエチレングリコール単位を含む炭化水素鎖であり、ここにおけるポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分には、それぞれ、少なくともｍエチレングリコール単位が含まれ、ここにおけるｍは、１〜１００（好ましくは３〜１００）、好ましくは１〜７０、さらにより好ましくは１０〜７０の範囲内の整数である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカーは、６０Ｄａ〜５ｋＤａ、好ましくは０．５ｋＤａ〜５ｋＤａの分子量を有している。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態においてはこのクロスリンカー部分は、超分岐樹枝状部分に永久アミド結合を通して接続されている骨格部分によってもたらされる２つのα−、ω−脂肪族ジカルボン酸スペーサーにエステル結合を通して対称的に接続されている、ＰＥＧ鎖からなっている。
【００８６】
骨格部分に接続されたスペーサー部分及びそのもう一方の側が架橋部分に接続されたスペーサー部分のジカルボン酸は、３〜１２炭素原子（最も好ましくは５〜８炭素原子）からなっていて、１つ又はそれ以上の炭素原子において置換されていて良い。好ましい置換基は、アルキル基、ヒドロキシ基又はアミド基あるいは置換されたアミノ基である。この脂肪族ジカルボン酸のメチレン基の１つ又はそれ以上は、Ｏ又はＮＨあるいはアルキル置換Ｎで場合により置換されていて良い。好ましいアルキルは、１〜６炭素原子を有する線状又は分岐アルキルである。
【００８７】
骨格部分とクロスリンカー部分との間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して接続された原子の数及びタイプによって影響を受け、もしくは決定される。例として、ＰＥＧエステルを形成するのにコハク酸、アジピン酸又はグルタル酸から選択することにより、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの分解半減期を変えることができる。
【００８８】
代替の実施形態では、反応性官能基の数を増やす（これは、例えば、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルのドラッグ搭載量を増大させることを可能にする）ために重合ヒドロゲルの反応性官能基には多官能部分がカップリングされる。そのような多官能部分は、適切に置換された結合形態のリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、又はオリゴリシンの誘導体、低分子量ＰＥＩによってもたらされ得る。好ましくは、この多官能部分は、結合形態のリシンからできている。場合によっては、そのような多官能部分は、保護基で保護されていて良い。
【００８９】
さらに、本発明によるそのようなヒドロゲルは、同じ官能基をもっているスペーサーで官能化されていて良く、例として、ヒドロゲルには、適切に活性化されたＣＯＯＨ−ＰＥＧ６−ＮＨ−Ｆｍｏｃのような、ヘテロ二官能スペーサーをカップリングして、そのＦｍｏｃ保護基を除去することでアミノ基が導入され得る。
【００９０】
１つの好ましいクロスリンカー部分を以下に示す（点線は、骨格部分への相互接続生分解性連結を示している）：
【化１】
【００９１】
［式中、ｑは５〜５０の整数である］。
【００９２】
好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、加水分解性結合により相互接続された骨格部分からできている。
【００９３】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化２】
【００９４】
［式中、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される分岐コアを含んでいる。
【００９５】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化３】
【００９６】
［式中、ｎは５〜５０の整数であり、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される構造を含んでいる。
【００９７】
より好ましくは、骨格部分は、超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる。
【００９８】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化４】
【００９９】
［式中、点線は、分子の残部への結合を示しており、＊でマークされた炭素原子は好ましい実施形態においてＳ配置を示している］
で表される超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる。ところで、上記に示されている超分岐部分ＨｙｐはＲ配置にあっても良いしあるいはラセミ体であっても良いことは理解されるところである。
【０１００】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化５】
【０１０１】
［式中、各点線の一方は超分岐部分Ｈｙｐへの結合を示しており、もう一方の点線は分子の残部への結合を示している；またｍは２〜４の整数である］
で表される少なくとも１つのスペーサーに結合されている。
【０１０２】
より好ましくは、骨格部分は、以下の構造：
【化６】
【０１０３】
［式中、ｑは３〜１００の整数である］
を有しているクロスリンカー部分によって一緒に連結されている。
【０１０４】
より好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分は、以下の式：
【化７】
【０１０５】
［式中、各点線は、それぞれ、骨格部分への結合を示しており、またｎは４５である］
で表される部分によって一緒に連結されている。
【０１０６】
また、より好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分は以下の式：
【化８】
【０１０７】
［式中、各点線は、それぞれ、骨格部分への結合を示しており、またｎは２２である］
で表される部分によって一緒に連結されている。
【０１０８】
本発明は、保護溶媒の存在下での照射による生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの滅菌を記載するものである。この滅菌処理に用いられる生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは照射の前に保護溶媒で溶媒和され、その保護溶媒は照射の間中そのままで存在している。好ましくは、保護溶媒は、酢酸（水溶液、０．０１〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、４−アセチルモルホリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、ホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アルキルアルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルアセトアミド、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、ピリドキシン（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、１，２−プロピレンカーボナート、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、スルホラン、水、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０９】
より好ましくは、保護溶媒は、酢酸（水溶液、０．０１〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アルキルアルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、スルホラン、水、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１０】
最も好ましくは、保護溶媒は、４−アセチルモルホリン、ＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ、ＤＭＰＵ、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、ＤＭＳＯ又はＮＭＰから選択される。なおより好ましくは保護溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ又はＮＭＰから；なおより好ましくはＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ又はＮＭＰから；さらになおより好ましくはＤＭＳＯ又はＮＭＰ、なおより好ましくはＮＭＰから選択される。
【０１１１】
場合によっては、保護溶媒は脱気されて、他の、その保護溶媒に溶ける、塩等の、１種又はそれ以上の保護剤を場合により含有していて良い。好ましくは、保護剤は、０．０１〜１０％の濃度で含まれている。保護溶媒はまた、２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはそれらの水性希釈液であり得ることは理解されるところである。
【０１１２】
保護剤は、置換されていて良い線状、分岐、又は環状Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミン、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルカルボン酸、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホン酸、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオール、又は炭水化物からなる群から選択され得る。保護剤は、ヒドロキシル基で置換されていて良いしあるいは尿素、アミド、又はカルバマート基で置換又は中断されていて良いしあるいはエーテルで中断されていても良い。２種又はそれ以上の保護剤の混合物が保護溶媒に加えられ得る。
【０１１３】
好ましい保護剤は、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、セリノール、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、酢酸、ギ酸、アスコルビン酸、グリシネアミド、ピバル酸、プロパン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、チオグリセリン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、還元グルタチオンから選択される。
【０１１４】
滅菌するためには、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは適する容器に入れられるが、これは滅菌処理後の滅菌性を確実なものにする。つまり、ヒドロゲルは保護溶媒で溶媒和され、そして適する容器は密閉されて滅菌処理に付される。適する容器は、容器密閉後の滅菌性を確実なものにしてその滅菌処理が行われるものが選択される。別形態としては、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、最初に保護溶媒で溶媒和され、その後適する容器の中に移され、そしてこの中で滅菌されて、その適する容器がこの後密閉される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの滅菌は、線量が５〜１００ｋＧｙ、好ましくは８〜５０ｋＧｙ、より好ましくは２０〜４０ｋＧｙ（例えば３２〜４０ｋＧｙ等）、より好ましくは２０〜３０ｋＧｙの照射（好ましくはガンマ線の照射）により行われる。本発明による生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの照射は室温（２５℃）〜−８０℃の温度で行われ得る。好ましくは、照射は、室温にて行われる。室温より低い温度を得るためには、滅菌されるべき生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが含まれている適する容器は冷却可能な環境内に格納され得るしあるいは氷やドライアイス等の冷却材で囲まれ得る。
【０１１５】
そのような滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、例えば埋め込み物として、直接用いられ得るし、あるいは、例えばその滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングすることでさらに改変され得る。後者の場合は、さらなる処理が、滅菌済み化学薬品及び生物活性部分を用いて、滅菌条件下で行われる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、小分子生物活性部分が生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの官能基にカップリングされて、いわゆる小分子生物活性部分保持生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルがもたらされ、これがこの後保護溶媒の存在下に照射により滅菌される。ガンマ線照射の間中その化学構造を維持するような小分子生物活性部分のみが適していることは当業者には明らかである。
【０１１７】
つまり、本発明の好ましい態様は、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが小分子生物活性部分を持っている、本発明による方法である。
【０１１８】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが小分子生物活性部分を持ち、本発明の方法による照射により滅菌される場合は、その小分子生物活性部分は保全されているはずである。この文脈での用語「保全されている」とは、質量分光分析、超高速液体クロマトグラフィーあるいは薬理活性試験のような、当業者に知られている方法で測定できるが、そのような滅菌ヒドロゲルから放出される小分子生物活性部分の少なくとも９０％は変化していないことを好ましくは意味する。
【０１１９】
本発明の好ましい実施形態では、乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが５〜１０ｍｌ ＮＭＰ／ｇ乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルで溶媒和され、滅菌後汚染を回避するために密閉容器を用いて、線量が２５ｋＧｙのガンマ線で照射される。滅菌ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングするような、さらなる処理をするためには、ＮＭＰは、フィルター装着シリンジあるいは適するカラムを用いて所望溶媒に交換される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌した後のすべての工程は、滅菌溶液を用いて、無菌状態下で行われることは当業者には明らかである。
【０１２０】
本発明のなおより好ましい実施形態では、１ｇの乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲル当たり、０．１％〜２％（ｖ／ｖ）アミノエタノール又はプロピルアミンを含んでいる５〜１０ｍｌ ＮＭＰが生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを溶媒和させるのに用いられ、そのような溶媒和された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、滅菌後汚染を回避するために密閉容器を用いて、線量が３２ｋＧｙのガンマ線で続いて照射される。滅菌ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングするような、さらなる処理をするためには、０．１％〜２％（ｖ／ｖ）アミノエタノール又はプロピルアミンを含んでいるＮＭＰは、フィルター装着シリンジあるいは適するカラムを用いて所望の溶媒に交換される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌した後のすべての工程は、滅菌溶液を用いて、無菌状態下で行われることは当業者には明らかである。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、本発明のいずれの方法によっても得ることができる、特に小分子生物活性部分を持つ、滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルである。
【実施例】
【０１２２】
（材料及び方法）
材料
Ａｍｉｎｏ ４−ａｒｍ ＰＥＧ５０００は、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）から入手した。
【０１２３】
他の化学薬品はすべてＳｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１２４】
ヒドロゲルビーズに対しては、反応容器としてはあるいは洗浄工程にはポリプロピレンフリットが装着されたシリンジを用いた。
【０１２５】
分析：
エレクトロスプレーイオン質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍが装着されたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ機器で行った。
【０１２６】
ＰＥＧ出発材料が多分散であるためＰＥＧ生成物のＭＳスペクトルは一続きの（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を示した。理解をより容易にするため実施例には１つだけの単一代表的ｍ／ｚシグナルが記載されている。
【０１２７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、特に断らない限り、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が装着されたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＥＫＴＡｂａｓｉｃ装置を用いて行った。４／１（ｖ／ｖ）水性緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ＴＷＥＥＮ ２０、ｐＨ７．４）／アセトニトリル混合物を移動相として用いた。吸収は２１５ｎｍで検出した。
【０１２８】
（実施例１）
骨格試薬１ｇの合成
【化９】
【０１２９】
骨格試薬１ｇをＡｍｉｎｏ ４−ａｒｍ ＰＥＧ５０００（１ａ）から以下のスキーム：
【化１０】
【０１３０】
に従って合成した。
【０１３１】
化合物１ｂの合成には、４−Ａｒｍ−ＰＥＧ５０００テトラアミン１ａ（ＭＷ約５２００ｇ／ｍｏｌ、５．２０ｇ、１．００ｍｍｏｌ、ＨＣｌ塩）を２０ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．１７ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）／５ｍＬのＤＭＳＯ（無水）、ＥＤＣ ＨＣｌ（１．１５ｇ、６．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（０．９６ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）、及びコリジン（５．２０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて３０分間撹拌した。
【０１３２】
この反応混合物を１２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、６００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を５００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、６．３ｇの粗製生成物１ｂを無色の油状物として得た。化合物１ｂをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量３．８５ｇ（５９％）無色ガラス状生成物１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ１２９４．４＝［Ｍ＋５Ｈ］５＋（計算＝１２９４．６）
【０１３３】
３．４０ｇの化合物１ｂ（０．５２１ｍｍｏｌ）／５ｍＬのメタノールと９ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて１５分間撹拌することにより化合物１ｃを得た。揮発分を真空で除去した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ１１５１．９＝［Ｍ＋５Ｈ］５＋（計算＝１１５２．０）
【０１３４】
化合物１ｄの合成には、３．２６ｇの化合物１ｃ（０．５４ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。２．９９ｇ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（８．６４ｍｍｏｌ）／１５ｍＬ ＤＭＳＯ（無水）、１．５５ｇ ＥＤＣ ＨＣｌ（８．１ｍｍｏｌ）、１．２４ｇ ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（８．１ｍｍｏｌ）、及び５．６２ｍＬのコリジン（４３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて３０分間撹拌した。
【０１３５】
反応混合物を８００ｍＬ ＤＣＭで希釈し、４００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を８００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ガラス状粗製生成物を得た。
【０１３６】
生成物をＤＣＭに溶解させて冷却（−１８℃）ジエチルエーテルで沈殿させた。この処理を２回繰り返し、その沈殿物を真空で乾燥させた。
収量：４．０１ｇ（８９％）無色ガラス状生成物１ｄ（これをさらに精製することなく次の工程で用いた）
ＭＳ：ｍ／ｚ１４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝１４０５．４）
【０１３７】
溶液の化合物１ｄ（３．９６ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）／７ｍＬのメタノールと２０ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて１５分間撹拌することにより化合物１ｅを得た。揮発分を真空で除去した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ９６９．６＝［Ｍ＋７Ｈ］７＋（計算＝９６９．７）
【０１３８】
化合物１ｆの合成には、化合物１ｅ（３．５５ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５．３２ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）／１８．８ｍＬのＤＭＳＯ（無水）、ＥＤＣ ＨＣｌ（２．７６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．２０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、及び１０．０ｍＬのコリジン（７６．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて６０分間撹拌した。
【０１３９】
この反応混合物を８００ｍＬのＤＣＭで希釈し、４００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を８００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製生成物１ｆを無色の油状物として得た。
【０１４０】
生成物をＤＣＭに溶解させて冷却（−１８℃）ジエチルエーテルで沈殿させた。この工程を２回繰り返し、その沈殿物を真空で乾燥させた。
収量４．７２ｇ（８２％）無色ガラス状生成物１ｆ（これをさらに精製することなく次の工程で用いた）
ＭＳ：ｍ／ｚ１５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１５０５．４）
【０１４１】
溶液の化合物１ｆ（ＭＷ約１２０３５ｇ／ｍｏｌ、４．７２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）／２０ｍＬのメタノールと４０ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて３０分間撹拌することにより骨格試薬１ｇを得た。揮発分を真空で除去した。
収量３．９１ｇ（１００％）、ガラス状生成物骨格試薬１ｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ９７７．２＝［Ｍ＋９Ｈ］９＋（計算＝９７７．４）
【０１４２】
（１ｇの代替の合成経路）
化合物１ｂの合成には、４−Ａｒｍ−ＰＥＧ５０００テトラアミン（１ａ）（５０．０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）／２５０ｍＬのｉＰｒＯＨ（無水）の４５℃懸濁液に、ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（２６．６ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０．９ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を３０分間撹拌した。
【０１４３】
続いて、ｎ−プロピルアミン（２．４８ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を１０００ｍＬのＭＴＢＥで希釈し、一晩−２０℃で撹拌なしで保存した。上澄み液のおよそ５００ｍＬをデカント分離して捨てた。３００ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、１分震盪の後その生成物をガラスフィルターを通す濾過により回収し、５００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。この生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：６５．６ｇ（７４％）１ｂ（白色の塊状固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９３７．４＝［Ｍ＋７Ｈ］７＋（計算＝９３７．６）
【０１４４】
前の工程からの化合物１ｂ（４８．８ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）／１５６ｍＬの２−プロパノールを４０℃で撹拌することにより化合物１ｃを得た。１９６ｍＬの２−プロパノールと７８．３ｍＬの塩化アセチルの混合物を撹拌下で１〜２分以内に加えた。この溶液を４０℃で３０分間撹拌し、撹拌なしで一晩−３０℃に冷却させた。１００ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、この懸濁液を１分間震盪し、−３０℃で１時間冷却させた。生成物をガラスフィルターを通す濾過により回収し、２００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
【０１４５】
収量：３８．９ｇ（８６％）１ｃ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９６０．１［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝９６０．２）。
【０１４６】
化合物１ｄの合成には、前の工程からの１ｃ（１９．０ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）／８０ｍＬ２−プロパノールの４５℃懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１６．７ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１３．１ｍＬ、７５．４ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を４５℃で３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．５６ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を６００ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、遠心した（３０００分−１、１分）。この沈殿物を真空で１時間乾燥させ、４００ｍＬ ＴＨＦに溶解させた。２００ｍＬのジエチルエーテルを加え、その生成物を撹拌なしで１６時間、−３０℃に冷却した。この懸濁液をガラスフィルターで濾過し、３００ｍＬ冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：２１．０ｇ（８０％）１ｄ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ１４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝１４０５．４）
【０１４７】
前の工程からの化合物１ｄ（１５．６ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を３Ｎ ＨＣｌ／メタノール（８１ｍＬ、２４３ｍｍｏｌ）に溶解させて４０℃で９０分間撹拌することにより化合物１ｅを得た。２００ｍＬのＭｅＯＨ及び７００ｍＬのｉＰｒＯＨを加え、この混合物を−３０℃で２時間保存した。結晶化が完結するよう、１００ｍＬのＭＴＢＥを加え、この懸濁液を一晩−３０℃で保存した。２５０ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、その懸濁液を１分間震盪し、ガラスフィルターで濾過し、１００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で乾燥させた。
収量：１３．２ｇ（９６％）１ｅ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝６７９．１＝［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋（計算＝６７９．１）
【０１４８】
化合物１ｆの合成には、前の工程からの１ｅ（８．２２ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の１６５ｍＬ２−プロパノール中４５℃懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１１．９ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．３４ｍＬ、５３．６ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．４７ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を２時間、−１８℃に冷却させ、その後１６５ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、その懸濁液を１分間震盪し、ガラスフィルターで濾過した。続いて、そのフィルターケーキを４×２００ｍＬの冷ＭＴＢＥ／ｉＰｒＯＨ４：１及び１×２００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：１２．８ｇ、ＭＷ（９０％）１ｆ（淡黄色の塊状固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ１５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１５０５．４）
【０１４９】
４ＡｒｍＰＥＧ５ｋＤａ（−ＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４（ｂｏｃ）８）４（１ｆ）（１５．５ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＭｅＯＨに溶解させて０℃に冷却することにより骨格試薬１ｇを得た。４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（１２０ｍＬ、４８０ｍｍｏｌ、０℃に冷却）を３分以内に加え、氷浴を取り除いた。２０分後、３Ｎ ＨＣｌ／メタノール（２００ｍＬ、６００ｍｍｏｌ、０℃に冷却）を１５分以内に加え、この溶液を室温にて１０分間撹拌した。この生成物溶液を４８０ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。この沈殿物を真空で１時間乾燥させ、９０ｍＬのＭｅＯＨに再溶解させ、２４０ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、この懸濁液をもう一度３０００ｒｐｍで１分間遠心した。生成物を真空で乾燥させた。
収量：１１．５ｇ（８９％）（淡黄色フレーク）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１０４．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１１０４．９）
【０１５０】
（実施例２）
クロスリンカー試薬２ｄの合成
以下のスキーム：
【化１１】
【０１５１】
に従ってアジピン酸モノベンジルエステル（English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347）とＰＥＧ２０００からクロスリンカー試薬２ｄを調製した。
【０１５２】
ＰＥＧ２０００（２ａ）（１１．０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）＋ベンジルアジパート半エステル（４．８ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）／ジクロロメタン（９０．０ｍＬ）の溶液を０℃に冷却させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．４７ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）、その後触媒量のＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加え、この溶液を撹拌し、一晩（１２時間）室温まで到達させた。このフラスコを５時間＋４℃で保存した。その固形物を濾過し、溶媒を真空での蒸留により完全に除去した。残留物を１０００ｍＬ１／１（ｖ／ｖ）エーテル／酢酸エチルに溶解させ、２時間ＲＴにて保存したがこの間フレーク状固形物が形成された。この固形物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通す濾過により除去した。この溶液をしっかり栓をしたフラスコ中冷凍庫の−３０℃に１２時間結晶化が完結するまで保存した。この結晶生成物をガラスフリットで濾過し、冷却エーテル（−３０℃）で洗浄した。この濾過ケーキを真空で乾燥させた。収量：１１．６ｇ（８６％）２ｂ（無色の固形物）。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ８１３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝８１３．３）
【０１５３】
５００ｍＬガラスオートクレーブ中でＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸−ビス−ベンジルエステル２ｂ（１３．３ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１８０ｍＬ）に溶解させ、１０％パラジウム／炭（０．４ｇ）を加えた。この溶液を６ｂａｒ、４０℃で水素の消費が止まるまで（５〜１２時間）水素化した。触媒をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通す濾過により除去し、溶媒を真空で除去した。収量：１２．３ｇ（定量）２ｃ（黄色っぽい油状物）。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ７５３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝７５３．２）
【０１５４】
ＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸半エステル２ｃ（９．４３ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．９２ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３．４４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）／７５ｍＬのＤＣＭ（無水）の溶液を室温にて一晩撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却させ、沈殿物を濾過で除去した。ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＴＨＦから再結晶させた。
収量：８．７３ｇ（８５％）クロスリンカー試薬２ｄ（無色固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ８１７．８＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝８１７．９）
【０１５５】
（実施例３）
遊離アミノ基３ａ含有低密度ヒドロゲルビーズの調製
３００ｍｇ １ｇ＋９００ｍｇ ２ｄ／１０．８０ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を１００ｍｇＡｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／８０ｍＬヘプタンの溶液に加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて７００ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。１．１ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。１．６ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１５６】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を７５、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３ａを白色の粉末として得た。
【０１５７】
遊離アミノ基３ｂ含有中密度ヒドロゲルビーズの調製
１２００ｍｇ １ｇ＋３８４０ｍｇ ２ｄ／２８．６ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を４２５ｍｇ Ａｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／１００ｍＬヘプタンに加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて６５０ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。４．３ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。６．６ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１５８】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を６３、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３ｂを白色の粉末として得た。
【０１５９】
遊離アミノ基３ｃ含有高密度ヒドロゲルビーズの調製
２４００ｍｇ １ｇ＋３６００ｍｇ ２ｄ／２４．０ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を４２５ｍｇ Ａｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／１１０ｍＬヘプタンに加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて８５０ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。８．６ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。１３．２ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１６０】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を６３、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３．００ｇの３ｃを白色の粉末として得た。
【０１６１】
（実施例４）
ヒドロゲルビーズ（４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ）の調製とそれに続くガンマ線照射
フィルター装着シリンジ中の乾燥ヒドロゲル３ａの２０ｍｇ部分を以下の保護溶媒（ＮＭＰ（４ａ）、ジエチレングリコールジエチルエーテル（ＤＧＤＥ）（４ｂ）、ＤＭＳＯ（４ｃ）、又は０．１％酢酸／水（４ｄ））で５回洗浄した。
【０１６２】
同様にフィルター装着シリンジ中の乾燥ヒドロゲル３ｂの２０ｍｇ部分を以下の保護溶媒（ＤＭＩ（４ｆ）、ＤＭＡ（４ｇ）、ＮＭＰ＋０．５ｖｏｌ％１−プロピルアミン（４ｈ）、ＮＭＰ＋０．５ｖｏｌ％２−アミノエタノール（エタノールアミン）（４ｉ）、ＮＭＰ＋０．１ｖｏｌ％酢酸（４ｊ）、又は０．２Ｍ ＡｃＯＨ及び０．１Ｍプロピルアミン含有ＮＭＰ（４ｋ））で５回洗浄した。
【０１６３】
最後の洗浄の後、シリンジを密閉し、ヒドロゲルビーズを少し過剰の保護溶媒で膨潤状態にしておいた。
【０１６４】
加えてヒドロゲル３ａの乾燥サンプルをその乾燥状態で照射して４ｅを得た。
【０１６５】
サンプルを室温にて４０ｋＧｙ（４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ）又は３２ｋＧｙ（４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ）の線量でガンマ線照射した（照射源：Ｃｏ６０）。続いて、このサンプルをエタノールで５回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させた。
【０１６６】
（実施例５）
アミノ含有量の決定
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（４９ｍｇ、１１６μｍｏｌ）を０．９ｍＬアセトニトリルに溶解させて、０．５ｍＬ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。この溶液をシリンジ反応器中の２０ｍｇヒドロゲル３ａ及び４ａに加え、周囲温度で３０分間震盪した。
【０１６７】
続いて、このヒドロゲルをアセトニトリル／水２：１（ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡで１０×さらにＤＭＦで１０×洗浄した。
【０１６８】
ＤＭＦ／ＤＢＵ９８／２（ｖ／ｖ）で３×１０分震盪し、ＤＭＦ／ＤＢＵ９８／２（ｖ／ｖ）で１０×洗浄することによりＦｍｏｃ−基を開裂させた。これらのフラクションすべてを貯留し、ＤＭＦで希釈し、９−メチレンフルオレンの量を２９５ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより決定した。９１４１Ｌ ｍｏｌ−１ｃｍ−１の減衰係数を使った。
３ａのアミノ量：０．１３ｍｍｏｌ／ｇ
４ａのガンマ線照射後アミノ量：０．１２ｍｍｏｌ／ｇ
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕの代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＳｕの代替使用は同じアミノ量をもたらした。
【０１６９】
（実施例６）
ヒドロゲルビーズの加速インビトロ分解解析
加速条件下での滅菌後ヒドロゲルビーズ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ及び４ｋ並びに３ａ及び３ｂ（参考材料、滅菌なし）のインビトロ分解速度を各サンプルの５ｍｇを３７℃にある０．５ｍＬ０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）中でインキュベートすることにより測定した（３ａ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ及び４ｅ）。別形態としては加速インビトロ分解には３７℃状態にある０．５ｍＬ０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０を用いた（３ｂ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ及び４ｋ）。アリコートを一定時間間隔で採取し、ＳＥＣで分析した。ヒドロゲルの放出水可溶分解生成物（１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる）に対応するＵＶシグナルを積分し、インキュベーション時間に対してプロットした（図１）。
【表１】
【０１７０】
（実施例７）
ガンマ線照射パリペリドン搭載ヒドロゲル６の調製
国際特許出願であるＰＣ／ＥＰ２０１０／０６４８７４に説明されているようにしてヒドロゲル３ｃをリシンで変性し、続いてパリペリドン−グルタリルエステルをカップリングさせることによりパリペリドン搭載ヒドロゲル５を調製した。フィルター装着シリンジ中にある乾燥ヒドロゲルビーズ５の２０ｍｇ部分を製剤緩衝液（８５ｇ／ｌトレハロース二水和物、５０ｍＭスクシナート／トリス緩衝液ｐＨ５．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で５回洗浄した。最後の洗浄工程の後、シリンジを密閉し、ヒドロゲルビーズを少し過剰の保護溶媒で膨潤形態のままにしておいた。このサンプルをドライアイスのベッド中で４０ｋＧｙ（照射源：Ｃｏ６０）の線量でガンマ線照射した。続いて、製剤緩衝液でヒドロゲル６を５回、水で５回、エタノールで５回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させた。
【０１７１】
（実施例８）
照射された６のｐＨ９・３７℃におけるインビトロ分解
ヒドロゲル６（滅菌後）及び参考５（滅菌なし）の加速条件下でのインビトロ分解速度をそれぞれのサンプルの２ｍｇを３７℃にある１．０ｍＬ０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０中でインキュベートすることにより測定した。アリコートを一定時間間隔で採取し、ＳＥＣで分析した。ヒドロゲルの放出水可溶分解生成物（１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる）に対応するＵＶシグナル（２１５ｎｍ）を積分し、インキュベーション時間に対してプロットした。分解挙動におけるほんの少しの逸脱が観察された（図２）。
【０１７２】
（実施例９）
照射されたヒドロゲル６から放出されたパリペリドンの品質
１ｍｇ照射パリペリドン−リンカー−ヒドロゲル６を３７℃にある１．５ｍＬｐＨ７．４リン酸緩衝液（６０ｍＭ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でインキュベートした。４日後、上澄み液中に放出されたパリペリドンの品質をＨＰＬＣにより検証した。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いたがこれにはＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．、１．７μｍ粒子サイズ）が装着されていた（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ／水、溶媒Ｂ：０．０４％ＴＦＡ／アセトニトリル）。４分で０→５０％Ｂの線形勾配を採用した。パリペリドン純度は９５％であることが判明した（２１５ｎｍ）。
【０１７３】
略記号：
ＡｃＯＥｔ 酢酸エチル
ＡｃＯＨ 酢酸
Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｂｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＧＤＥ ジエチレングリコールジエチルエーテル
ＤＭＡ Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ ジメチルアミノ−ピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＩ １，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＳＩ エロクトロスプレーイオン化
ｅｑ 化学量論当量
ＥｔＯＨ エタノール
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｉＰｒＯＨ イソプロパノール
ｋＧｙ キログレイ
ＬＣＭＳ 質量分光分析直結液体クロマトグラフィー
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＳ 質量スペクトル
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＭＷ 分子量
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチルオキシ
ＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−
ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ 室温
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン
ＵＶ 紫外
ＶＩＳ 可視
【技術分野】
【０００１】
生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルは、組織再生、創縫合や薬物送達等のさまざまな医療・医薬適用で重要である。安全の理由から、例えばドラッグデリバリーのような一部の応用では、ＰＥＧヒドロゲルに生分解性を付与することが強く望まれている。生分解性は、インビボ水性環境で自然又は酵素加水分解を受けるエステル結合によりヒドロゲルに導入され得る。
【背景技術】
【０００２】
埋め込みあるいは局所適用が意図された医薬組成物又は医療デバイスの滅菌は、対応の市販製品としての認可を受けるためには必須である。さまざまな滅菌の方法、例えば加熱、加圧、濾過、化学薬品あるいは照射が提案されている。残念なこととして、これらの滅菌方法は、それらの方法がヒドロゲルの構造と特性を保持することとは両立できないため、生分解性ＰＥＧヒドロゲルには適用できない。つまり、生分解性ＰＥＧヒドロゲルの医療使用は限られている。
【０００３】
例えば、注射液は、ほとんどの場合、オートクレーブ処理により注射液バイアル中で滅菌されるが、生分解性結合は、高温に曝された場合、劇的に加速された分解を受けるだろう。したがって、生分解性ＰＥＧヒドロゲルのオートクレーブ処理は、治療適用に向いていない前分解された物質をもたらすだろう。
【０００４】
あるいは、微生物汚染物質を除去するために、溶液はポアサイズが０．２μｍのフィルターを用いて濾過により滅菌され、続いてその滅菌溶液が無菌条件下でバイアルの中に充填され得る。しかしながら、不溶性架橋ＰＥＧヒドロゲルの場合、この材料は不溶なので、微小粒子の懸濁液の形態で、あるいは典型的にはサイズが０．２μｍより大きい他の三次元物体（例えば、ディスクあるいはチューブ）として存在し得るので、このような懸濁液又はゲル物体は濾過によっては滅菌され得ないのである。
【０００５】
国際特許出願である（特許文献１）は、滅菌微小粒子の調製ができる閉鎖循環式装置を記載している。フィルター滅菌された各化学薬品成分は粒子形成過程の全体を通して系の無菌環境内に滅菌保持され、結果として滅菌微小粒子がもたらされる。
【０００６】
出発原料の段階で滅菌濾過工程を適用してその処理の間中無菌状態を維持するような無菌処理は、ヒドロゲル合成後滅菌（最後滅菌と呼ばれる）に比較するといくつかの欠点を有している。製造過程で滅菌工程が現れるのが早ければ早いほど、突発的な汚染のリスクは高くなる。無菌処理はまた精巧な専用の装置を必要とし、結果として製造コストが高くなる。したがって、最後滅菌法が好ましい。
【０００７】
高分子のＵＶ光あるいはガンマ線照射での光分解は、ラジカル及び／又はイオンを発生し、これは多くの場合開裂や架橋をもたらす。光への曝露は酸素の不存在下ではめったにないので、酸化も起こり、状況を複雑にしている。一般には、これらのことはヒドロゲルの特性並びに材料の生分解に対する感受性を変える（非特許文献１）。
【０００８】
エチレンオキサイドガスあるいは過酸化水素含有溶液での処理は同じような副反応を引き起こしてヒドロゲルの生分解特性に悪影響を及ぼし、処理済ヒドロゲル材料の未処理ヒドロゲル材料に比較しての分解速度の相当な偏移を引き起こすだろう。加えて、有毒であって望ましくない副作用を引き起こし得る、例えばエチレンオキサイドの有意な量がヒドロゲル中に残っていないことを確実にするための配慮がなされなければならない。
【０００９】
最後滅菌に伴う困難を回避するために、架橋と滅菌の工程が組み合わせられたことがある。（特許文献２）は、ガンマ線照射による架橋ＰＥＧヒドロゲルの作製方法を詳述している。この方法では、線状ＰＥＧ（ＭＷ２００ｋＤａ）が生理食塩水に溶解され、脱気されてＣｏ６０等のガンマ線源で照射された。２．５〜２５Ｍｒａｄ（２５〜２５０ｋＧｙに相当）の線量がラジカル形成並びに鎖間連結によるＰＥＧ鎖の架橋をもたらすのに十分であって、結果として水和された不溶性ヒドロゲルがもたらされた。この照射線量は滅菌にも十分高いという事実から、１工程で、眼の角膜の中に埋め込むのに適している材料が得られた。
【００１０】
同様に、米国特許出願である（特許文献３）は、クロスリンカー及び有機溶媒の存在下にＵＶ及び／又はガンマ線照射によって架橋される、ポリアルキレンオキシド、ポリアリーレンオキシド、又はポリグリシジルエーテルをベースとする、電子デバイスに用いられるための架橋高分子ゲルの形成方法を詳述している。
【００１１】
医薬の送達のような、他の適用では、ＰＥＧヒドロゲルが生分解性であることが望ましい。（特許文献４）は、ガンマ線照射による分解性ＰＥＧヒドロゲルの作製方法を詳述している。この方法では、生分解性エステル連結を介して接続された線状ＰＥＧ鎖が用いられている（ＭＷ１０ｋＤａ）。２５又は３０ｋＧｙでの照射は鎖間架橋並びに不溶性ＰＥＧヒドロゲルを形成した。
【００１２】
また、ＵＶ又はガンマ線照射ＰＥＧヒドロゲル中の架橋の度合いを変化させることによって薬物放出速度を調節することも試みられた（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。とはいっても、この試みでは、照射処理の間中の薬物の存在は薬物の取り込みをもたらすために必要とされているが、高分子鎖への酸化又は加水分解あるいは共役化のような照射が誘発する副反応の可能性が、この方法をほとんどの治療用要素にとって実行不可能なものにしている。
【００１３】
また、照射は、膨潤や粗さのようなＰＥＧベースヒドロゲルの他の特性に影響を及ぼすことも示されている（非特許文献７）。
【００１４】
文献ではさまざまなＰＥＧベースヒドロゲルが記載されている。例えば、（特許文献５）は、プロドラッグの高分子ヒドロゲル複合体を記載しており、このヒドロゲルは生分解性の結合を含んでいるクロスリンカーによって相互接続された非生分解性骨格部分から構成されている。
【００１５】
欧州特許出願である（特許文献６）は、特徴的な後期爆発的分解速度を有するＰＥＧベースヒドロゲルを記載している。
【００１６】
ＰＥＧ部分のみからなるヒドロゲルが欧州特許である（特許文献７）に記載されている。このヒドロゲルには分解を可能にするために加水分解不安定性結合が組み込まれている。この特許はそのようなヒドロゲルの薬物送達系としての使用も特許請求している。
【００１７】
（特許文献８）は、特に、診断用標識物質を、単独又は治療用薬物との組み合わせで含有していて良いＰＥＧベースヒドロゲルを記載している。同様に、（特許文献９）は、インビボ注射され得る生物活性剤を含有している、ＰＥＧ−キトサンヒドロゲルを記載している。ＰＣＴ出願である（特許文献１０）は、薬物送達デバイスとしてあるいは他の生医学利用で用いられるカルバマート架橋を有するポリ（エチレンオキシド）含有ヒドロゲルを開示している。
【００１８】
上記で述べたヒドロゲルは、すべて滅菌を必要とする適用に用いられることを意図しているが、上述の問題はこれらの特許又は特許出願によっては対処されておらず、これが産業へのそれらの適用性を限定している。
【００１９】
ヒドロゲル滅菌における不十分な点の結果として、不溶性架橋生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルはそのままではまだ認可されておらず、投与後ｉｎ ｓｉｔｕでヒドロゲルを形成する前駆体組成物としてのみ認可されている（Ｃｏｒｇｅｌ（商標）ＢｉｏＨｙｄｒｏｇｅｌ、Ｆｏｃａｌ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。したがって、汚染に敏感な応用に際してヒドロゲルを十分利用するためには、コスト効率的且つ保全的な方法でヒドロゲルを最後滅菌するための手段を提供するというニーズがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２００３／０３５２４４号
【特許文献２】米国特許第５，６３４，９４３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／００３０１０２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５３７，５６９号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／００３０１４号
【特許文献６】欧州特許第０９１６７０２６．５号明細書
【特許文献７】欧州特許第１０１９４４６号明細書
【特許文献８】米国特許５，５１４，３７９号明細書
【特許文献９】米国特許６，６０２，９５２号明細書
【特許文献１０】国際公開第２００６／３８４６２号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Mark Herman (Ed) Wiley, 2004, p. 263 ff
【非特許文献２】Minkova et al., J. Polym. Sci., Polym. Phys. 27 (1989) 621-642
【非特許文献３】Belcheva et al., Macromol. Symp. 103 (1996) 193
【非特許文献４】Rosiak and Yoshii, Nuclear Instruments and Methods／Physics research B 151 (1999) 56-64
【非特許文献５】Rosiak and Ulansky, Radiation Physics and Chemistry 55 (1999) 139-151
【非特許文献６】Dimitrov et al., Acta Pharmaceutica Turcica 46 (2004) 49-54
【非特許文献７】Kanjickal et al, J Biomed Mater Res A. 2008 Jan 9 - Effects of sterilization on poly(ethylene glycol) hydrogels
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
すなわち、本発明の目的は、欠点を少なくとも一部克服するための、また上記に記載したニーズを満たすための不溶性の生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルの代替滅菌方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
この目的は、加水分解性結合により相互接続されている骨格部分を含む生分解性ポリ（エチレングリコール）ベース不溶性ヒドロゲルの滅菌方法であって、次の工程
（ａ）ヒドロゲルを準備する工程；
（ｂ）このヒドロゲルを保護溶媒又は２種もしくはそれ以上の保護溶媒の混合物又はそれらの水溶液に溶媒和させる工程；
（ｃ）溶媒和したヒドロゲルにガンマ線照射を行う工程；
を含む方法によって達成される。
【００２４】
この度、意外なこととして、予め形成された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、ガンマ線の照射が、保護溶媒（好ましくはＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＡ、ＤＭＦ又はＤＭＩ、より好ましくはＮＭＰ）の存在下に行われる場合は、不安定性生分解結合への損傷なしに、したがって安定結合への損傷も全くなしに且つ架橋を引き起こすこともなしにガンマ線照射によって滅菌され得ることを見出した。
【００２５】
特に、本発明によるそのような照射された不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度は、照射されていないＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度に等しいものであった。さらには、そのような照射された不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、なお十分に生分解性であった。もしラジカル生成による鎖間架橋が形成されていたとすると、分解速度は影響を受けていたであろうし、また、不溶性生分解性ＰＥＧヒドロゲル分解過程はもっとゆっくりしたものであろうし、分解曲線はフラットであろうし、分解も完結まで至らなかったであろう。
【００２６】
不溶性生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルが官能性の基を含有している場合、そのような基は、滅菌後もなお官能性である。
【００２７】
本発明において使われている用語は以下の通りの意味を有している。
【００２８】
ヒドロゲルとは、大量の水を取り込むことができる三次元の、親水性もしくは両親媒性高分子網目構造体と定義され得る。この網目構造体は、ホモポリマー又はコポリマーからなり、化学的な共有結合もしくは物理的（イオン、疎水相互作用、絡み合い）架橋が存在することから不溶である。この架橋により網目構造及び物理的一体性がもたらされる。
【００２９】
本明細書において理解される用語「ＰＥＧベースヒドロゲル」（ＰＥＧヒドロゲル）は、ヒドロゲル中のＰＥＧ鎖の質量割合が、ヒドロゲルの全体重量を基準にして、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも２５％であることを意味している。残りの部分は、他の高分子及び他の部分構造から構成され得る。
【００３０】
用語「高分子」は、合成もしくは生物由来又は両者の組み合わせであり得る、線状、環状、分岐状、架橋もしくは樹枝型分岐状又はこれらの組み合わせによる化学結合により接続された繰り返し構造単位からなっている分子を表す。例として、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリラート）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アルキルオキシ）ポリマー、ポリ（アミド）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（アスパルトアミド）、ポリ（酪酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カーボナート）、ポリ（シアノアクリラート）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポリ（エステル）、ポリ（エチレン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ヒドロキシエチルアクリラート）、ポリ（ヒドロキシエチルオキサゾリン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリラート）、ポリ（ヒドロキシプロピルオキサゾリン）、ポリ（イミノカーボナート）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリラート）、ポリ（メチルオキサゾリン）、ポリ（プロピレンフマラート）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（シロキサン）、ポリ（ウレタン）、ポリ（ビニルアルコホール）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）、シリコーン、リボ核酸、デゾキシ核酸、アルブミン、これらの抗体及び断片、血漿蛋白、コラーゲン、エラスチン、ファシン、フィブリン、ケラチン、ポリアスパルタート、ポリグルタマート、プロラミン、トランスフェリン、シトクロム、フラボプロテイン、グリコプロテイン、ヘモプロテイン、リポプロテイン、メタロプロテイン、フィトクロム、ホスホプロテイン、オプシン、カンテン、アガロース、アルギナート、アラビナン、アラビノガラクタン、カラギーナン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース並びに他の炭水化物ベース高分子、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、キシラン、並びにこれらのコポリマー及び機能性誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
滅菌ヒドロゲルに関しての「無傷」とは、不安定な生分解性結合に損傷がなかったこと及びしたがって安定な結合にも損傷がなかったこと並びに滅菌化の間に検出可能なさらなる架橋も起こらなかったことを意味する。ヒドロゲルの「無傷度」は、本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルのインビトロ分解速度により測定することができ、滅菌されていない生分解性ＰＥＧヒドロゲルのインビトロ分解速度にそれが同じである度合いである。さらには、照射されたそのような生分解性ＰＥＧヒドロゲルは、なお十分に生分解性である。もしラジカル生成による鎖間架橋が形成されていたとすると、分解速度は影響を受けていたであろうし、したがってＰＥＧヒドロゲル分解過程はもっとゆっくりしたものであろうし、分解曲線はフラットであろうし、分解も完結まで至らなかったであろう。もし鎖の切断が起こると、ＰＥＧヒドロゲル分解過程は加速されるだろう。２つの分解速度に関しての用語「等しい」は、Ｘ％の分解を得るのに必要とされる時間が２つの分解速度間で２０％以上、好ましくは１５％以上変わらないことを意味する（ここで、Ｘは５〜９０の範囲内にあるものとする）。
【００３２】
生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルが官能基を含有している場合、それらの官能基は保全される。例えば、官能基がアミン基である場合、ＰＥＧベースヒドロゲルのアミン含有量は滅菌前と滅菌処理後で同じである。好ましくは、この文脈での用語「同じ」は、本発明に従って滅菌されたヒドロゲル中の官能基の数が滅菌前のヒドロゲル中の官能基の数から３０％未満、好ましくは２０％未満だけ変わることを意味する。
【００３３】
分解速度を測定するためには、不溶性生分解性ＰＥＧベースヒドロゲルから可溶骨格分解生成物のアリコートを分離して、そのヒドロゲルから脱離された他の可溶分解生成物からの干渉なしに定量することができる。沈殿又は遠心によりヒドロゲル物体は生理浸透圧の緩衝液の過剰水と分離され得る。遠心は、上澄み液が膨潤ヒドロゲルの体積の少なくとも１０％を占めるようなやり方で行われ得る。そのような沈殿又は遠心工程の後は可溶ヒドロゲル分解生成物は水性上澄み液中に残り、１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる水可溶分解生成物はそのような上澄み液のアリコートを適する分離及び／又は分析方法に付することによって検出できる。
【００３４】
別法として、水可溶分解生成物は０．４５μｍフィルターを通す濾過により水不溶性分解生成物から分離することができ、この後、その水可溶分解生成物は通過流中に見出され得る。水可溶分解生成物は遠心と濾過処理の組み合わせによっても水不溶性分解生成物から分離され得る。
【００３５】
例として、骨格部分は、他の分解生成物がＵＶ吸収を呈さない波長でＵＶ吸収を呈する基を有し得る。そのような選択的ＵＶ吸収基は、アミド結合等の骨格部分の構造成分であり得るし、あるいはインドリル基等の芳香族環系を用いてその反応性官能基に結合させることによって骨格に導入されたものであり得る。
【００３６】
薬物のインビボ物理化学又は薬理速度特性を向上させるためには、そのような薬物は、担体（例えば、ヒドロゲル）と複合体化され得る。薬物が担体及び／又はリンカーに一時的に結合されている場合、そのようなシステムは一般に担体連結プロドラッグとして分類される。ＩＵＰＡＣによって提供されている定義（http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchemに掲載、２００９年７月２２日にアクセス）によれば、担体連結プロドラッグとは、改善された物理化学又は薬理速度特性をもたらし且つ一般には加水分解開裂によって容易にインビボ除去され得る一時的担体基と所与の活性物質との仮の連結を含有しているプロドラッグである。
【００３７】
用語「薬物」、「生物活性分子」、「生物活性部分」、「生物活性剤」、「活性剤」等は、限定するものではないがウイルス、細菌、菌類、植物、動物、及びヒトを含めた、生物有機体の任意の物理又は生化学特性に影響を及ぼすことができるあらゆる物質を意味する。特に、本明細書で使われる場合、生物活性分子には、ヒト又は他の動物における病気を診断、治療、軽減、処置、又は予防することが意図された、あるいはそうでなければヒト又は動物の身体又は精神の健康状態を高めることが意図されたあらゆる物質が包含される。生物活性分子の例としては、限定するものではないが、ペプチド、蛋白、酵素、小分子ドラッグ（例えば、非ペプチドドラッグ）、染料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが挙げられる。本発明で用いるのに適している生物活性剤の類としては、限定するものではないが、催眠薬及び鎮静薬、精神高揚薬、精神安定薬、呼吸器ドラッグ、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン作用薬（ドーパミン拮抗薬）、鎮痛薬、抗炎症薬、抗アレルギー薬、抗不安薬（不安緩解剤）、食欲抑制剤、肥満防止薬、抗片頭痛薬、筋肉収縮剤、抗感染症薬（抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、抗菌薬、ワクチン）、抗炎症薬、抗関節炎薬、抗マラリア薬、制吐剤、抗癲癇薬、抗糖尿病薬、気管支拡張薬、サイトカイン、成長因子、抗がん剤、抗凝固剤、抗高血圧薬、心血管薬、血管拡張薬、血管収縮薬、抗不整脈薬、抗酸化薬、反喘息薬、中枢神経系活性剤、避妊薬を含めたホルモン剤、免疫調節剤、交感神経興奮薬、利尿薬、脂質調節薬、抗アンドロゲン剤、抗寄生虫薬、抗凝固薬、新生物、抗新生物薬、低血糖薬、ステロイド薬、栄養剤及び補助食品、成長補助食品、抗腸炎剤、ワクチン、抗体、診断薬、対照用剤等が挙げられる。
【００３８】
「小分子生物活性部分」とは、分子量が３０００Ｄａｌｔｏｎ以下の上記に記載した生物活性部分のことをいう。
【００３９】
本発明による方法に合ったヒドロゲルの生分解性は、加水分解性結合の導入によって達成される。
【００４０】
本発明の文脈内での用語「生分解性」とは、生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下で１時間〜３ヶ月の半減期で非酵素的に加水分解で分解される連結を指し、これには、限定するものではないが、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバマート、これらの組み合わせ他が挙げられる。好ましい生分解性連結は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。インビトロ研究には、例えば、ｐＨ９、３７℃、水性緩衝液のような加速条件が実用的な目的のために用いられ得ることは理解されるところである。
【００４１】
つまり、加水分解性結合は、例えば、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバマート、これらの組み合わせ等である。好ましい加水分解性結合は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。
【００４２】
用語「中断された」は、尿素、アミド、又はカルバマート基もしくはエーテルが炭素鎖の２つの炭素間に挟み込まれていることを意味する。
【００４３】
「非生分解性」（安定）とは、非開裂性の永久結合である連結のことをいい、それぞれの接続部分が生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下で少なくとも６ヶ月の半減期を有していることを意味する。
【００４４】
「徐放送達システム」とは、長期間に亘って患者の身体に薬物を放出する組成物のことをいう。
【００４５】
「外科用密閉剤」又は「医用密閉剤」とは、ヒドロゲルベースの接着剤並びに切り口、破傷、穿刺、擦過傷、挫傷や剥離のような、創傷を密閉するためのその他の手段のことをいう。
【００４６】
「止血剤」とは、創傷からの出血を停止させるのに使われる作用剤のことをいう。
【００４７】
「手術用スポンジ」とは、手術部位からの液体を吸収するのに使われるスポンジを意味する。
【００４８】
ガンマ線照射は、その照射源に関係なく、２００ｋｅＶより大きい量子エネルギーでの電磁照射と定義されている。好ましくは、照射源は、コバルト６０である。
【００４９】
「滅菌」とは、あらゆる成長段階並びに形態にある、細菌、酵母、真菌、ウイルス、胞子を含めた、検出可能な伝染性外的病原因子が存在しないことを意味する。
【００５０】
「滅菌処理」とは、例えば照射（例えばＵＶあるいはガンマ線での照射）により材料を滅菌にするための処理のことをいう。好ましくは、ガンマ線での照射が用いられる。
【００５１】
「保護溶媒」は、三次元構造及び物理化学特性を保全するために、つまりヒドロゲルが無傷であることを保全するために滅菌前に乾燥ヒドロゲルを溶媒和させるのに用いられる化学薬品化合物を表している。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１ａ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ａの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｂ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｂの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｃ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｃの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｄ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｄの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｅ】ｐＨ１０．３、３７℃における４ｅの滅菌後インビトロ分解速度を、３ａ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｆ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｆの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｇ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｇの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｈ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｈの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｉ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｉの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｊ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｊの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図１ｋ】ｐＨ９．０、３７℃における４ｋの滅菌後インビトロ分解速度を、３ｂ（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【図２】ｐＨ９．０、３７℃における６の滅菌後インビトロ分解速度を、５（滅菌していないヒドロゲル；参考）と一緒にして示している。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５４】
本発明は、ヒドロゲルを無傷に保持する保護溶媒の存在下に照射によって生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌する方法に関する。本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、同じ分解速度を有しており且つ十分に分解性であるが、このことは不安定な生分解性結合に損傷がないこと、したがって安定結合への損傷も起こっていないこと、さらには望ましくない架橋も起こっていないこと、つまりヒドロゲルが無傷であることが保全されることを意味している。本発明に従って滅菌された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが反応性の官能基を含有している場合、そのような基の官能性も保全される、すなわち基はそのまま保全される。そのような反応性官能基は、アフィニティーリガンド、キレート基、ドラッグ、プロドラッグ、担体連結プロドラッグ他を直接又は間接的に連結するための結合ポイントとして役立ち得る。そのような反応性官能基の非限定的な例としては、限定するものではないが、カルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール、スルホン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアナート、イソチオシアナート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイル及び他のα−β不飽和マイケル受容体、アリールフルオリドのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、エポキシド、オキシラン、及びアジリジン；好ましくはカルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、チオール、スルホン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアナート、イソチオシアナート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アリールフルオリドのようなアクリロイルアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、オキシラン、及びアジリジンが挙げられる。好ましい反応性官能基としては、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、アルデヒド、及びハロアセチルが挙げられ、より好ましくはチオール、アミノ、カルボン酸及び誘導体、カーボナート及び誘導体、カルバマート及び誘導体、アルデヒド、及びハロアセチルが挙げられる。好ましくは、反応性官能基は、一級アミノ基又はカルボン酸、最も好ましくは一級アミノ基である。
【００５５】
一実施形態では、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの反応性官能基は保護基で保護されているが、これは滅菌後に脱離される。
【００５６】
本発明に従って滅菌されたＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、例えば、再生医療、皮膚再生、眼内デバイス、医用埋め込み剤、外科用密閉剤及びスポンジ、止血剤、徐放送達システム、医用画像化剤及びプロドラッグ担体のような、滅菌が有益であるあるいは必要とされているあらゆる適用で用いられ得る。好ましい使用は、徐放送達システム及びプロドラッグ担体としてであり、最も好ましいのはプロドラッグ担体としてである。予め形成された三次元ヒドロゲルは保護溶媒の存在下に又は２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはこれらの水性溶液中で照射により滅菌され、滅菌ヒドロゲルは続いて場合により、例えば、例えばペプチド、プロテイン又は小分子のような生物活性部分を持ち得る。そのような生物活性部分はヒドロゲルには安定なスペーサー部分を介して又は分解性リンカー部分を介して連結され得る。
【００５７】
代替の実施形態では、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、最初に小分子生物活性部分が搭載され、その後保護溶媒の存在下に又は２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはそれらの水性溶液中で照射により滅菌される。
【００５８】
本発明による滅菌に適しているＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルはさまざまな形状のものであり得るが、そのようなものとしては、限定するものではないが、無定形、球形、水晶形、フラット形（例えばフィルムでの）又は管形のヒドロゲルが挙げられる。好ましい実施形態では、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、粒子直径が１〜１０００ミクロン、好ましくは１０〜１００ミクロンの球形微小粒子からなっている。
【００５９】
本発明による滅菌に適しているＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、分解性結合で相互接続された骨格部分からできている。場合によっては、この骨格部分は、骨格とは分解性結合を介して繋ぎ合わされていて、さらに分解性結合をもち得る、オリゴマー、高分子又は低分子量架橋部分を通して架橋されているものであり得る。場合により、骨格部分は、以下（リガンド、キレート基、スペーサー分子、ブロック基）のうちの１つ又はそれ以上への永久連結をもち得る。
【００６０】
本発明の一実施形態ではヒドロゲルは以下の組成を有している。
【００６１】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、加水分解性結合により相互接続された骨格部分からできている。好ましくは、その骨格部分は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａの範囲内にある分子量を有している。
【００６２】
好ましくは、この生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルにおいては、骨格部分は、相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基からなる、多くある官能性基を特徴としている。好ましくは、相互接続された生分解性基と反応性官能基の和は１６以上、好ましくは１６〜１２８（２０〜１００好ましい、２０〜４０も好ましい、２４〜８０より好ましい、２８〜３２もより好ましい、３０〜６０さらにより好ましい）であり；最も好ましいのは３０〜３２である。この相互接続された官能基及び反応性官能基に加えて保護基も存在し得ることは理解されるところである。
【００６３】
この官能基は、線状鎖に結合されたものであり得る。この場合、官能基は、鎖に沿って規則的に又は不規則的に間隔を置いて配置されたものであり得るし、あるいは別形態としては、この鎖は、官能基の全体をもたらしている、２つの樹枝状部分で終端されたものであり得る。
【００６４】
優先的に、骨格部分は、少なくとも３つのＰＥＧベース高分子鎖を延ばしている、分岐コアを有していることを特徴としている。そのような分岐コアは、結合形態で、ポリ−又はオリゴ−アルコール、好ましくはペンタエリトリトール、トリペンタエリトリトール、ヘキサグリセリン、スクロース、ソルビトール、フルクトース、マンニトール、グルコース、セルロース、アミロース、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコホール、デキストラン、ヒアルロナンを含んだものであり得るし、あるいは分岐コアは、結合形態で、オルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンのようなポリ−又はオリゴ−アミンを含んだものであり得る。好ましくは、分岐コアは、結合形態で、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンのようなポリ−又はオリゴ−アミンを含んだものであり得る。
【００６５】
好ましくは、この分岐コアは、３〜１６のＰＥＧベース高分子鎖を延ばしている（より好ましくは４〜８）。
【００６６】
骨格部分の相互接続された官能基と反応性官能基の和は、この分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数だけ等しく分けられている。分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数が均等な分布を可能としない場合は、ＰＥＧベース高分子鎖１本当たりの相互接続された官能基と反応性官能基の和の平均数からの逸脱が最小に保たれることが好ましい。
【００６７】
より好ましくは、骨格部分の相互接続された官能基と反応性官能基の和は、分岐コアから延びているＰＥＧベース高分子鎖の数だけ均等に分けられている。例として、３２個の相互接続された官能基と反応性官能基がある場合、８個の基が、そのコアから延びている４ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベース高分子鎖の終端に結合された樹枝状部分によってもたらされ得る。別形態としては、４個の基がコアから延びている８ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによってあるいは２個の基が１６ＰＥＧベース高分子鎖のそれぞれによってもたらされ得る。
【００６８】
骨格部分に好適な分岐コアから延びている対応するＰＥＧベース高分子鎖の好ましい構造は、例としてであるが、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡのプロダクトリスト（２００９年７月２８日にwww.jenkemusa.comからダウンロードによりアクセス）に詳述されている、４ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（ペンタエリトリトールコア）、８ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（ヘキサグリセリンコア）及び８ＡＲＭ−ＰＥＧ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（トリペンタエリトリトールコア）のようなｍｕｌｔｉ−ａｒｍ（多腕）ＰＥＧ誘導体である。最も好ましいのは、４ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（ペンタエリトリトールコア）及び４ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ペンタエリトリトールコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（ヘキサグリセリンコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（ヘキサグリセリンコア）、８ａｒｍ ＰＥＧ Ａｍｉｎｅ（トリペンタエリトリトールコア）、及び８ａｒｍ ＰＥＧ Ｃａｒｂｏｘｙｌ（トリペンタエリトリトールコア）である。骨格部分中のそのような多腕ＰＥＧ誘導体の好ましい分子量は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは２．５ｋＤａ〜１５ｋＤａ、なおより好ましくは５ｋＤａ〜１０ｋＤａである。このような試薬はヒドロゲル中には結合形態で存在していることは理解されるところである。
【００６９】
そのようなさらなる官能性の基は樹枝状部分によってもたらされ得る。好ましくは、それぞれの樹枝状部分は、０．４ｋＤａ〜４ｋＤａ、より好ましくは０．４ｋＤａ〜２ｋＤａの範囲内の分子量を有している。好ましくは、それぞれの樹枝状部分は、少なくとも３分岐及び少なくとも４反応性官能基、且つ多くて６３分岐及び６４反応性官能基を有しており、少なくとも７分岐及び少なくとも８反応性官能基且つ多くて３１分岐及び３２反応性官能基が好ましい。
【００７０】
そのような樹枝状部分の例は、結合形態のトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン、ヘキサデカリシン、ヘプタデカリシン、オクタデカリシン、ノナデカリシンである。好ましいそのような樹枝状部分の例には、結合形態のトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシンが含まれる（最も好ましいのはトリリシン、ペンタリシン又はヘプタリシン）。
【００７１】
最も好ましくは、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、その骨格部分が式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４で表される四級炭素を有していることを特徴としていることであって、この式においてはそれぞれのＡは独立にその四級炭素に永久共有結合で終端結合されたポリ（エチレングリコール）ベース高分子鎖であり、このＰＥＧベース高分子鎖の遠位終端は樹枝状部分Ｈｙｐに共有結合されており、それぞれの樹枝状部分Ｈｙｐは相互接続された生分解性官能基と反応性官能基を代表する少なくとも４個の官能性の基並びに永久結合を有している。それぞれの骨格部分は、少なくとも１６個の相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基並びに永久結合、好ましくは２０〜６４、より好ましくは２８〜６４個の相互接続された生分解性官能基及び反応性官能基並びに永久結合を含有している。
【００７２】
好ましくは、それぞれのＡは、式−（ＣＨ２）ｎ１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＸ−［式中、ｎ１は１又は２であり；ｎは５〜５０の範囲内の整数であり；ＸはＡとＨｙｐを共有連結している官能基である］から独立に選択される。
【００７３】
好ましくは、ＡとＨｙｐとは、アミド官能基により共有連結されている。
【００７４】
好ましくは、樹枝状部分Ｈｙｐは、超分岐ポリペプチドである。好ましくは、この超分岐ポリペプチドは、結合形態のリシンからなっていて、最も好ましくはＨｙｐはウンデカリシニル又はヘプタリシニルである。好ましくは、それぞれの樹枝状部分Ｈｙｐは、０．４ｋＤａ〜４ｋＤａの範囲内の分子量を有している。骨格部分Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４は同じ又は異なる樹枝状部分Ｈｙｐからなっていること及びそれぞれのＨｙｐは独立に選択され得ることは理解されるところである。それぞれの部分Ｈｙｐは５〜２１リシン、好ましくは少なくとも７リシンからなっている、すなわちそれぞれの部分Ｈｙｐは結合形態の５〜３２リシン、好ましくは結合形態の少なくとも７リシンからなっている。
【００７５】
好ましくは、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）４は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、なおより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有している。
【００７６】
本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解性結合の導入により達成される。
【００７７】
好ましくは、骨格部分はクロスリンカー部分を通して一緒に連結されていて良く、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合で終端されている。この終端分解性結合に加えて、クロスリンカー部分は、さらなる生分解性結合を含有していて良い。つまり、骨格部分に連結されたクロスリンカー部分のそれぞれの終端には加水分解性結合が含まれ、クロスリンカー部分にはさらなる生分解性結合が場合により存在していて良い。
【００７８】
つまり、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルには、加水分解性結合で相互接続された骨格部分が含まれており、ここにおける骨格部分は好ましくはクロスリンカー部分を通して一緒に連結されており、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合で終端されている。
【００７９】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは１種又はそれ以上の異なるタイプのクロスリンカー部分を含有し得る（好ましくは１種）。クロスリンカー部分は線状もしくは分岐分子であり得、好ましくは線状分子である。本発明の好ましい実施形態では、クロスリンカー部分は、骨格部分に少なくとも２つの生分解性結合で接続されている。
【００８０】
用語の生分解性結合とは、生理条件（ｐＨ７．４、３７℃にある水性緩衝液）下において１時間〜３ヶ月の半減期で非酵素的に加水分解で分解される連結を表しており、そのようなものとしては、限定するものではないが、アコニチル、アセタール、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスホアミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カーボナート、これらの組み合わせ他が挙げられる。好ましい生分解性連結は、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル及びスルホン酸カルボン酸エステルであり、最も好ましいのはカルボン酸エステル又はカーボナートである。
【００８１】
好ましくは、クロスリンカー部分は、６０Ｄａ〜５ｋＤａ（より好ましくは、６０Ｄａ〜４ｋＤａ、なおより好ましくは６０Ｄａ〜３ｋＤａ）、さらにより好ましくは０．５〜４ｋＤａ、なおより好ましくは１ｋＤａ〜４ｋＤａ、最も好ましくは１ｋＤａ〜３ｋＤａの範囲内の分子量を有している。一実施形態では、クロスリンカー部分は、高分子からなっている。
【００８２】
オリゴマー又は高分子架橋部分に加えて、特にこの生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを形成するのに親水性高分子量骨格部分が用いられる場合は、低分子量架橋部分が用いられ得る。
【００８３】
好ましくは、このポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、場合によりさらなる官能基を含んでいる、エチレングリコール単位を含む炭化水素鎖であり、ここにおける各ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分には、それぞれ、少なくともｍエチレングリコール単位が含まれ、ここにおけるｍは、３〜１００、好ましくは１〜７０、最も好ましくは１０〜７０の範囲内の整数である。より好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、６０Ｄａ〜５ｋＤａ、より好ましくは０．５ｋＤａ〜５ｋＤａの範囲内の分子量を有している。
【００８４】
好ましくは、クロスリンカー部分は、好ましくは唯一のＰＥＧベース分子鎖によって表される、ＰＥＧベースである。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分は、場合によりさらなる化学官能基を含んでいる、１個又はそれ以上のエチレングリコール単位を含む炭化水素鎖であり、ここにおけるポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカー部分には、それぞれ、少なくともｍエチレングリコール単位が含まれ、ここにおけるｍは、１〜１００（好ましくは３〜１００）、好ましくは１〜７０、さらにより好ましくは１０〜７０の範囲内の整数である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースクロスリンカーは、６０Ｄａ〜５ｋＤａ、好ましくは０．５ｋＤａ〜５ｋＤａの分子量を有している。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態においてはこのクロスリンカー部分は、超分岐樹枝状部分に永久アミド結合を通して接続されている骨格部分によってもたらされる２つのα−、ω−脂肪族ジカルボン酸スペーサーにエステル結合を通して対称的に接続されている、ＰＥＧ鎖からなっている。
【００８６】
骨格部分に接続されたスペーサー部分及びそのもう一方の側が架橋部分に接続されたスペーサー部分のジカルボン酸は、３〜１２炭素原子（最も好ましくは５〜８炭素原子）からなっていて、１つ又はそれ以上の炭素原子において置換されていて良い。好ましい置換基は、アルキル基、ヒドロキシ基又はアミド基あるいは置換されたアミノ基である。この脂肪族ジカルボン酸のメチレン基の１つ又はそれ以上は、Ｏ又はＮＨあるいはアルキル置換Ｎで場合により置換されていて良い。好ましいアルキルは、１〜６炭素原子を有する線状又は分岐アルキルである。
【００８７】
骨格部分とクロスリンカー部分との間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して接続された原子の数及びタイプによって影響を受け、もしくは決定される。例として、ＰＥＧエステルを形成するのにコハク酸、アジピン酸又はグルタル酸から選択することにより、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの分解半減期を変えることができる。
【００８８】
代替の実施形態では、反応性官能基の数を増やす（これは、例えば、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルのドラッグ搭載量を増大させることを可能にする）ために重合ヒドロゲルの反応性官能基には多官能部分がカップリングされる。そのような多官能部分は、適切に置換された結合形態のリシン、ジリシン、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、又はオリゴリシンの誘導体、低分子量ＰＥＩによってもたらされ得る。好ましくは、この多官能部分は、結合形態のリシンからできている。場合によっては、そのような多官能部分は、保護基で保護されていて良い。
【００８９】
さらに、本発明によるそのようなヒドロゲルは、同じ官能基をもっているスペーサーで官能化されていて良く、例として、ヒドロゲルには、適切に活性化されたＣＯＯＨ−ＰＥＧ６−ＮＨ−Ｆｍｏｃのような、ヘテロ二官能スペーサーをカップリングして、そのＦｍｏｃ保護基を除去することでアミノ基が導入され得る。
【００９０】
１つの好ましいクロスリンカー部分を以下に示す（点線は、骨格部分への相互接続生分解性連結を示している）：
【化１】
【００９１】
［式中、ｑは５〜５０の整数である］。
【００９２】
好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、加水分解性結合により相互接続された骨格部分からできている。
【００９３】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化２】
【００９４】
［式中、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される分岐コアを含んでいる。
【００９５】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化３】
【００９６】
［式中、ｎは５〜５０の整数であり、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される構造を含んでいる。
【００９７】
より好ましくは、骨格部分は、超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる。
【００９８】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化４】
【００９９】
［式中、点線は、分子の残部への結合を示しており、＊でマークされた炭素原子は好ましい実施形態においてＳ配置を示している］
で表される超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる。ところで、上記に示されている超分岐部分ＨｙｐはＲ配置にあっても良いしあるいはラセミ体であっても良いことは理解されるところである。
【０１００】
より好ましくは、骨格部分は、以下の式：
【化５】
【０１０１】
［式中、各点線の一方は超分岐部分Ｈｙｐへの結合を示しており、もう一方の点線は分子の残部への結合を示している；またｍは２〜４の整数である］
で表される少なくとも１つのスペーサーに結合されている。
【０１０２】
より好ましくは、骨格部分は、以下の構造：
【化６】
【０１０３】
［式中、ｑは３〜１００の整数である］
を有しているクロスリンカー部分によって一緒に連結されている。
【０１０４】
より好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分は、以下の式：
【化７】
【０１０５】
［式中、各点線は、それぞれ、骨格部分への結合を示しており、またｎは４５である］
で表される部分によって一緒に連結されている。
【０１０６】
また、より好ましくは、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分は以下の式：
【化８】
【０１０７】
［式中、各点線は、それぞれ、骨格部分への結合を示しており、またｎは２２である］
で表される部分によって一緒に連結されている。
【０１０８】
本発明は、保護溶媒の存在下での照射による生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの滅菌を記載するものである。この滅菌処理に用いられる生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは照射の前に保護溶媒で溶媒和され、その保護溶媒は照射の間中そのままで存在している。好ましくは、保護溶媒は、酢酸（水溶液、０．０１〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、４−アセチルモルホリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、ホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アルキルアルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、Ｎ−メチルアセトアミド、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、ピリドキシン（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、１，２−プロピレンカーボナート、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、スルホラン、水、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０９】
より好ましくは、保護溶媒は、酢酸（水溶液、０．０１〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アルキルアルコール（例えばメタノール、エタノール、プロパノール）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、スルホラン、水、又はこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１０】
最も好ましくは、保護溶媒は、４−アセチルモルホリン、ＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ、ＤＭＰＵ、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、ＤＭＳＯ又はＮＭＰから選択される。なおより好ましくは保護溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ又はＮＭＰから；なおより好ましくはＤＭＡ、ＤＭＦ、ＤＭＩ又はＮＭＰから；さらになおより好ましくはＤＭＳＯ又はＮＭＰ、なおより好ましくはＮＭＰから選択される。
【０１１１】
場合によっては、保護溶媒は脱気されて、他の、その保護溶媒に溶ける、塩等の、１種又はそれ以上の保護剤を場合により含有していて良い。好ましくは、保護剤は、０．０１〜１０％の濃度で含まれている。保護溶媒はまた、２種又はそれ以上の保護溶媒の混合物もしくはそれらの水性希釈液であり得ることは理解されるところである。
【０１１２】
保護剤は、置換されていて良い線状、分岐、又は環状Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミン、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルカルボン酸、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホン酸、置換されていて良い線状又は分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオール、又は炭水化物からなる群から選択され得る。保護剤は、ヒドロキシル基で置換されていて良いしあるいは尿素、アミド、又はカルバマート基で置換又は中断されていて良いしあるいはエーテルで中断されていても良い。２種又はそれ以上の保護剤の混合物が保護溶媒に加えられ得る。
【０１１３】
好ましい保護剤は、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、セリノール、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、酢酸、ギ酸、アスコルビン酸、グリシネアミド、ピバル酸、プロパン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、チオグリセリン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、還元グルタチオンから選択される。
【０１１４】
滅菌するためには、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは適する容器に入れられるが、これは滅菌処理後の滅菌性を確実なものにする。つまり、ヒドロゲルは保護溶媒で溶媒和され、そして適する容器は密閉されて滅菌処理に付される。適する容器は、容器密閉後の滅菌性を確実なものにしてその滅菌処理が行われるものが選択される。別形態としては、ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、最初に保護溶媒で溶媒和され、その後適する容器の中に移され、そしてこの中で滅菌されて、その適する容器がこの後密閉される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの滅菌は、線量が５〜１００ｋＧｙ、好ましくは８〜５０ｋＧｙ、より好ましくは２０〜４０ｋＧｙ（例えば３２〜４０ｋＧｙ等）、より好ましくは２０〜３０ｋＧｙの照射（好ましくはガンマ線の照射）により行われる。本発明による生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの照射は室温（２５℃）〜−８０℃の温度で行われ得る。好ましくは、照射は、室温にて行われる。室温より低い温度を得るためには、滅菌されるべき生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが含まれている適する容器は冷却可能な環境内に格納され得るしあるいは氷やドライアイス等の冷却材で囲まれ得る。
【０１１５】
そのような滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、例えば埋め込み物として、直接用いられ得るし、あるいは、例えばその滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングすることでさらに改変され得る。後者の場合は、さらなる処理が、滅菌済み化学薬品及び生物活性部分を用いて、滅菌条件下で行われる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、小分子生物活性部分が生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの官能基にカップリングされて、いわゆる小分子生物活性部分保持生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルがもたらされ、これがこの後保護溶媒の存在下に照射により滅菌される。ガンマ線照射の間中その化学構造を維持するような小分子生物活性部分のみが適していることは当業者には明らかである。
【０１１７】
つまり、本発明の好ましい態様は、生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが小分子生物活性部分を持っている、本発明による方法である。
【０１１８】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが小分子生物活性部分を持ち、本発明の方法による照射により滅菌される場合は、その小分子生物活性部分は保全されているはずである。この文脈での用語「保全されている」とは、質量分光分析、超高速液体クロマトグラフィーあるいは薬理活性試験のような、当業者に知られている方法で測定できるが、そのような滅菌ヒドロゲルから放出される小分子生物活性部分の少なくとも９０％は変化していないことを好ましくは意味する。
【０１１９】
本発明の好ましい実施形態では、乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルが５〜１０ｍｌ ＮＭＰ／ｇ乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルで溶媒和され、滅菌後汚染を回避するために密閉容器を用いて、線量が２５ｋＧｙのガンマ線で照射される。滅菌ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングするような、さらなる処理をするためには、ＮＭＰは、フィルター装着シリンジあるいは適するカラムを用いて所望溶媒に交換される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌した後のすべての工程は、滅菌溶液を用いて、無菌状態下で行われることは当業者には明らかである。
【０１２０】
本発明のなおより好ましい実施形態では、１ｇの乾燥生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲル当たり、０．１％〜２％（ｖ／ｖ）アミノエタノール又はプロピルアミンを含んでいる５〜１０ｍｌ ＮＭＰが生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを溶媒和させるのに用いられ、そのような溶媒和された生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルは、滅菌後汚染を回避するために密閉容器を用いて、線量が３２ｋＧｙのガンマ線で続いて照射される。滅菌ヒドロゲルに生物活性部分をカップリングするような、さらなる処理をするためには、０．１％〜２％（ｖ／ｖ）アミノエタノール又はプロピルアミンを含んでいるＮＭＰは、フィルター装着シリンジあるいは適するカラムを用いて所望の溶媒に交換される。生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルを滅菌した後のすべての工程は、滅菌溶液を用いて、無菌状態下で行われることは当業者には明らかである。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、本発明のいずれの方法によっても得ることができる、特に小分子生物活性部分を持つ、滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルである。
【実施例】
【０１２２】
（材料及び方法）
材料
Ａｍｉｎｏ ４−ａｒｍ ＰＥＧ５０００は、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）から入手した。
【０１２３】
他の化学薬品はすべてＳｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０１２４】
ヒドロゲルビーズに対しては、反応容器としてはあるいは洗浄工程にはポリプロピレンフリットが装着されたシリンジを用いた。
【０１２５】
分析：
エレクトロスプレーイオン質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍが装着されたＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ機器で行った。
【０１２６】
ＰＥＧ出発材料が多分散であるためＰＥＧ生成物のＭＳスペクトルは一続きの（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ部分を示した。理解をより容易にするため実施例には１つだけの単一代表的ｍ／ｚシグナルが記載されている。
【０１２７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、特に断らない限り、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ５／１５０ ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が装着されたＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡＥＫＴＡｂａｓｉｃ装置を用いて行った。４／１（ｖ／ｖ）水性緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ＴＷＥＥＮ ２０、ｐＨ７．４）／アセトニトリル混合物を移動相として用いた。吸収は２１５ｎｍで検出した。
【０１２８】
（実施例１）
骨格試薬１ｇの合成
【化９】
【０１２９】
骨格試薬１ｇをＡｍｉｎｏ ４−ａｒｍ ＰＥＧ５０００（１ａ）から以下のスキーム：
【化１０】
【０１３０】
に従って合成した。
【０１３１】
化合物１ｂの合成には、４−Ａｒｍ−ＰＥＧ５０００テトラアミン１ａ（ＭＷ約５２００ｇ／ｍｏｌ、５．２０ｇ、１．００ｍｍｏｌ、ＨＣｌ塩）を２０ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．１７ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）／５ｍＬのＤＭＳＯ（無水）、ＥＤＣ ＨＣｌ（１．１５ｇ、６．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（０．９６ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）、及びコリジン（５．２０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて３０分間撹拌した。
【０１３２】
この反応混合物を１２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、６００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を５００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、６．３ｇの粗製生成物１ｂを無色の油状物として得た。化合物１ｂをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量３．８５ｇ（５９％）無色ガラス状生成物１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ１２９４．４＝［Ｍ＋５Ｈ］５＋（計算＝１２９４．６）
【０１３３】
３．４０ｇの化合物１ｂ（０．５２１ｍｍｏｌ）／５ｍＬのメタノールと９ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて１５分間撹拌することにより化合物１ｃを得た。揮発分を真空で除去した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ１１５１．９＝［Ｍ＋５Ｈ］５＋（計算＝１１５２．０）
【０１３４】
化合物１ｄの合成には、３．２６ｇの化合物１ｃ（０．５４ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。２．９９ｇ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（８．６４ｍｍｏｌ）／１５ｍＬ ＤＭＳＯ（無水）、１．５５ｇ ＥＤＣ ＨＣｌ（８．１ｍｍｏｌ）、１．２４ｇ ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（８．１ｍｍｏｌ）、及び５．６２ｍＬのコリジン（４３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて３０分間撹拌した。
【０１３５】
反応混合物を８００ｍＬ ＤＣＭで希釈し、４００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を８００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ガラス状粗製生成物を得た。
【０１３６】
生成物をＤＣＭに溶解させて冷却（−１８℃）ジエチルエーテルで沈殿させた。この処理を２回繰り返し、その沈殿物を真空で乾燥させた。
収量：４．０１ｇ（８９％）無色ガラス状生成物１ｄ（これをさらに精製することなく次の工程で用いた）
ＭＳ：ｍ／ｚ１４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝１４０５．４）
【０１３７】
溶液の化合物１ｄ（３．９６ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）／７ｍＬのメタノールと２０ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて１５分間撹拌することにより化合物１ｅを得た。揮発分を真空で除去した。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ９６９．６＝［Ｍ＋７Ｈ］７＋（計算＝９６９．７）
【０１３８】
化合物１ｆの合成には、化合物１ｅ（３．５５ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＭＳＯ（無水）に溶解させた。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５．３２ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）／１８．８ｍＬのＤＭＳＯ（無水）、ＥＤＣ ＨＣｌ（２．７６ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２．２０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）、及び１０．０ｍＬのコリジン（７６．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物をＲＴにて６０分間撹拌した。
【０１３９】
この反応混合物を８００ｍＬのＤＣＭで希釈し、４００ｍＬの０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及び１／１（ｖ／ｖ）ブライン／水（４×）で洗浄した。水層を８００ｍＬのＤＣＭで再抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗製生成物１ｆを無色の油状物として得た。
【０１４０】
生成物をＤＣＭに溶解させて冷却（−１８℃）ジエチルエーテルで沈殿させた。この工程を２回繰り返し、その沈殿物を真空で乾燥させた。
収量４．７２ｇ（８２％）無色ガラス状生成物１ｆ（これをさらに精製することなく次の工程で用いた）
ＭＳ：ｍ／ｚ１５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１５０５．４）
【０１４１】
溶液の化合物１ｆ（ＭＷ約１２０３５ｇ／ｍｏｌ、４．７２ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）／２０ｍＬのメタノールと４０ｍＬの４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサンをＲＴにて３０分間撹拌することにより骨格試薬１ｇを得た。揮発分を真空で除去した。
収量３．９１ｇ（１００％）、ガラス状生成物骨格試薬１ｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ９７７．２＝［Ｍ＋９Ｈ］９＋（計算＝９７７．４）
【０１４２】
（１ｇの代替の合成経路）
化合物１ｂの合成には、４−Ａｒｍ−ＰＥＧ５０００テトラアミン（１ａ）（５０．０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）／２５０ｍＬのｉＰｒＯＨ（無水）の４５℃懸濁液に、ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（２６．６ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０．９ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を３０分間撹拌した。
【０１４３】
続いて、ｎ−プロピルアミン（２．４８ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を１０００ｍＬのＭＴＢＥで希釈し、一晩−２０℃で撹拌なしで保存した。上澄み液のおよそ５００ｍＬをデカント分離して捨てた。３００ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、１分震盪の後その生成物をガラスフィルターを通す濾過により回収し、５００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。この生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：６５．６ｇ（７４％）１ｂ（白色の塊状固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９３７．４＝［Ｍ＋７Ｈ］７＋（計算＝９３７．６）
【０１４４】
前の工程からの化合物１ｂ（４８．８ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）／１５６ｍＬの２−プロパノールを４０℃で撹拌することにより化合物１ｃを得た。１９６ｍＬの２−プロパノールと７８．３ｍＬの塩化アセチルの混合物を撹拌下で１〜２分以内に加えた。この溶液を４０℃で３０分間撹拌し、撹拌なしで一晩−３０℃に冷却させた。１００ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、この懸濁液を１分間震盪し、−３０℃で１時間冷却させた。生成物をガラスフィルターを通す濾過により回収し、２００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
【０１４５】
収量：３８．９ｇ（８６％）１ｃ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９６０．１［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝９６０．２）。
【０１４６】
化合物１ｄの合成には、前の工程からの１ｃ（１９．０ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）／８０ｍＬ２−プロパノールの４５℃懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１６．７ｇ、３７．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１３．１ｍＬ、７５．４ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を４５℃で３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．５６ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を６００ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、遠心した（３０００分−１、１分）。この沈殿物を真空で１時間乾燥させ、４００ｍＬ ＴＨＦに溶解させた。２００ｍＬのジエチルエーテルを加え、その生成物を撹拌なしで１６時間、−３０℃に冷却した。この懸濁液をガラスフィルターで濾過し、３００ｍＬ冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：２１．０ｇ（８０％）１ｄ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ１４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］６＋（計算＝１４０５．４）
【０１４７】
前の工程からの化合物１ｄ（１５．６ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を３Ｎ ＨＣｌ／メタノール（８１ｍＬ、２４３ｍｍｏｌ）に溶解させて４０℃で９０分間撹拌することにより化合物１ｅを得た。２００ｍＬのＭｅＯＨ及び７００ｍＬのｉＰｒＯＨを加え、この混合物を−３０℃で２時間保存した。結晶化が完結するよう、１００ｍＬのＭＴＢＥを加え、この懸濁液を一晩−３０℃で保存した。２５０ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、その懸濁液を１分間震盪し、ガラスフィルターで濾過し、１００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で乾燥させた。
収量：１３．２ｇ（９６％）１ｅ（白色の粉末）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝６７９．１＝［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋（計算＝６７９．１）
【０１４８】
化合物１ｆの合成には、前の工程からの１ｅ（８．２２ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の１６５ｍＬ２−プロパノール中４５℃懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１１．９ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．３４ｍＬ、５３．６ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．４７ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後この溶液を２時間、−１８℃に冷却させ、その後１６５ｍＬの冷ＭＴＢＥを加え、その懸濁液を１分間震盪し、ガラスフィルターで濾過した。続いて、そのフィルターケーキを４×２００ｍＬの冷ＭＴＢＥ／ｉＰｒＯＨ４：１及び１×２００ｍＬの冷ＭＴＢＥで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥させた。
収量：１２．８ｇ、ＭＷ（９０％）１ｆ（淡黄色の塊状固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ１５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１５０５．４）
【０１４９】
４ＡｒｍＰＥＧ５ｋＤａ（−ＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４（ｂｏｃ）８）４（１ｆ）（１５．５ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を３０ｍＬのＭｅＯＨに溶解させて０℃に冷却することにより骨格試薬１ｇを得た。４Ｎ ＨＣｌ／ジオキサン（１２０ｍＬ、４８０ｍｍｏｌ、０℃に冷却）を３分以内に加え、氷浴を取り除いた。２０分後、３Ｎ ＨＣｌ／メタノール（２００ｍＬ、６００ｍｍｏｌ、０℃に冷却）を１５分以内に加え、この溶液を室温にて１０分間撹拌した。この生成物溶液を４８０ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、３０００ｒｐｍで１分間遠心した。この沈殿物を真空で１時間乾燥させ、９０ｍＬのＭｅＯＨに再溶解させ、２４０ｍＬの冷ＭＴＢＥで沈殿させ、この懸濁液をもう一度３０００ｒｐｍで１分間遠心した。生成物を真空で乾燥させた。
収量：１１．５ｇ（８９％）（淡黄色フレーク）
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１０４．９［Ｍ＋８Ｈ］８＋（計算＝１１０４．９）
【０１５０】
（実施例２）
クロスリンカー試薬２ｄの合成
以下のスキーム：
【化１１】
【０１５１】
に従ってアジピン酸モノベンジルエステル（English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347）とＰＥＧ２０００からクロスリンカー試薬２ｄを調製した。
【０１５２】
ＰＥＧ２０００（２ａ）（１１．０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）＋ベンジルアジパート半エステル（４．８ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）／ジクロロメタン（９０．０ｍＬ）の溶液を０℃に冷却させた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．４７ｇ、２１．７ｍｍｏｌ）、その後触媒量のＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加え、この溶液を撹拌し、一晩（１２時間）室温まで到達させた。このフラスコを５時間＋４℃で保存した。その固形物を濾過し、溶媒を真空での蒸留により完全に除去した。残留物を１０００ｍＬ１／１（ｖ／ｖ）エーテル／酢酸エチルに溶解させ、２時間ＲＴにて保存したがこの間フレーク状固形物が形成された。この固形物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通す濾過により除去した。この溶液をしっかり栓をしたフラスコ中冷凍庫の−３０℃に１２時間結晶化が完結するまで保存した。この結晶生成物をガラスフリットで濾過し、冷却エーテル（−３０℃）で洗浄した。この濾過ケーキを真空で乾燥させた。収量：１１．６ｇ（８６％）２ｂ（無色の固形物）。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ８１３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝８１３．３）
【０１５３】
５００ｍＬガラスオートクレーブ中でＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸−ビス−ベンジルエステル２ｂ（１３．３ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１８０ｍＬ）に溶解させ、１０％パラジウム／炭（０．４ｇ）を加えた。この溶液を６ｂａｒ、４０℃で水素の消費が止まるまで（５〜１２時間）水素化した。触媒をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）のパッドを通す濾過により除去し、溶媒を真空で除去した。収量：１２．３ｇ（定量）２ｃ（黄色っぽい油状物）。この生成物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ７５３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝７５３．２）
【０１５４】
ＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸半エステル２ｃ（９．４３ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．９２ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３．４４ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）／７５ｍＬのＤＣＭ（無水）の溶液を室温にて一晩撹拌した。この反応混合物を０℃に冷却させ、沈殿物を濾過で除去した。ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＴＨＦから再結晶させた。
収量：８．７３ｇ（８５％）クロスリンカー試薬２ｄ（無色固形物）
ＭＳ：ｍ／ｚ８１７．８＝［Ｍ＋３Ｈ］３＋（計算＝８１７．９）
【０１５５】
（実施例３）
遊離アミノ基３ａ含有低密度ヒドロゲルビーズの調製
３００ｍｇ １ｇ＋９００ｍｇ ２ｄ／１０．８０ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を１００ｍｇＡｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／８０ｍＬヘプタンの溶液に加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて７００ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。１．１ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。１．６ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１５６】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を７５、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３ａを白色の粉末として得た。
【０１５７】
遊離アミノ基３ｂ含有中密度ヒドロゲルビーズの調製
１２００ｍｇ １ｇ＋３８４０ｍｇ ２ｄ／２８．６ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を４２５ｍｇ Ａｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／１００ｍＬヘプタンに加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて６５０ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。４．３ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。６．６ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１５８】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を６３、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３ｂを白色の粉末として得た。
【０１５９】
遊離アミノ基３ｃ含有高密度ヒドロゲルビーズの調製
２４００ｍｇ １ｇ＋３６００ｍｇ ２ｄ／２４．０ｍＬ ＤＭＳＯの溶液を４２５ｍｇ Ａｒｌａｃｅｌ Ｐ１３５（Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌｃ）／１１０ｍＬヘプタンに加えた。この混合物をＲＴにて１０分間自家製金属スターラーを用いて８５０ｒｐｍで撹拌して懸濁液を形成させた。８．６ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を加えて重合を起こさせた。２時間後、スターラースピードを４００ｒｐｍに下げ、混合物をさらに１６時間撹拌した。１３．２ｍＬの酢酸を加え、その１０分後５０ｍＬの水を加えた。５分後、スターラーを停止させ、水相を流出させた。
【０１６０】
ビーズサイズ分別には、この水−ヒドロゲル懸濁液を６３、５０、４０、３２及び２０μｍ鋼製シーブで湿式シーブ分別した。その３２、４０、及び５０μｍシーブに保持されたビーズフラクションを貯留し、水で３回、エタノールで１０回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させて、３．００ｇの３ｃを白色の粉末として得た。
【０１６１】
（実施例４）
ヒドロゲルビーズ（４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ）の調製とそれに続くガンマ線照射
フィルター装着シリンジ中の乾燥ヒドロゲル３ａの２０ｍｇ部分を以下の保護溶媒（ＮＭＰ（４ａ）、ジエチレングリコールジエチルエーテル（ＤＧＤＥ）（４ｂ）、ＤＭＳＯ（４ｃ）、又は０．１％酢酸／水（４ｄ））で５回洗浄した。
【０１６２】
同様にフィルター装着シリンジ中の乾燥ヒドロゲル３ｂの２０ｍｇ部分を以下の保護溶媒（ＤＭＩ（４ｆ）、ＤＭＡ（４ｇ）、ＮＭＰ＋０．５ｖｏｌ％１−プロピルアミン（４ｈ）、ＮＭＰ＋０．５ｖｏｌ％２−アミノエタノール（エタノールアミン）（４ｉ）、ＮＭＰ＋０．１ｖｏｌ％酢酸（４ｊ）、又は０．２Ｍ ＡｃＯＨ及び０．１Ｍプロピルアミン含有ＮＭＰ（４ｋ））で５回洗浄した。
【０１６３】
最後の洗浄の後、シリンジを密閉し、ヒドロゲルビーズを少し過剰の保護溶媒で膨潤状態にしておいた。
【０１６４】
加えてヒドロゲル３ａの乾燥サンプルをその乾燥状態で照射して４ｅを得た。
【０１６５】
サンプルを室温にて４０ｋＧｙ（４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ）又は３２ｋＧｙ（４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ）の線量でガンマ線照射した（照射源：Ｃｏ６０）。続いて、このサンプルをエタノールで５回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させた。
【０１６６】
（実施例５）
アミノ含有量の決定
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（４９ｍｇ、１１６μｍｏｌ）を０．９ｍＬアセトニトリルに溶解させて、０．５ｍＬ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。この溶液をシリンジ反応器中の２０ｍｇヒドロゲル３ａ及び４ａに加え、周囲温度で３０分間震盪した。
【０１６７】
続いて、このヒドロゲルをアセトニトリル／水２：１（ｖ／ｖ）＋０．１％ＴＦＡで１０×さらにＤＭＦで１０×洗浄した。
【０１６８】
ＤＭＦ／ＤＢＵ９８／２（ｖ／ｖ）で３×１０分震盪し、ＤＭＦ／ＤＢＵ９８／２（ｖ／ｖ）で１０×洗浄することによりＦｍｏｃ−基を開裂させた。これらのフラクションすべてを貯留し、ＤＭＦで希釈し、９−メチレンフルオレンの量を２９５ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより決定した。９１４１Ｌ ｍｏｌ−１ｃｍ−１の減衰係数を使った。
３ａのアミノ量：０．１３ｍｍｏｌ／ｇ
４ａのガンマ線照射後アミノ量：０．１２ｍｍｏｌ／ｇ
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕの代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＳｕの代替使用は同じアミノ量をもたらした。
【０１６９】
（実施例６）
ヒドロゲルビーズの加速インビトロ分解解析
加速条件下での滅菌後ヒドロゲルビーズ４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ及び４ｋ並びに３ａ及び３ｂ（参考材料、滅菌なし）のインビトロ分解速度を各サンプルの５ｍｇを３７℃にある０．５ｍＬ０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．３）中でインキュベートすることにより測定した（３ａ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ及び４ｅ）。別形態としては加速インビトロ分解には３７℃状態にある０．５ｍＬ０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０を用いた（３ｂ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ及び４ｋ）。アリコートを一定時間間隔で採取し、ＳＥＣで分析した。ヒドロゲルの放出水可溶分解生成物（１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる）に対応するＵＶシグナルを積分し、インキュベーション時間に対してプロットした（図１）。
【表１】
【０１７０】
（実施例７）
ガンマ線照射パリペリドン搭載ヒドロゲル６の調製
国際特許出願であるＰＣ／ＥＰ２０１０／０６４８７４に説明されているようにしてヒドロゲル３ｃをリシンで変性し、続いてパリペリドン−グルタリルエステルをカップリングさせることによりパリペリドン搭載ヒドロゲル５を調製した。フィルター装着シリンジ中にある乾燥ヒドロゲルビーズ５の２０ｍｇ部分を製剤緩衝液（８５ｇ／ｌトレハロース二水和物、５０ｍＭスクシナート／トリス緩衝液ｐＨ５．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で５回洗浄した。最後の洗浄工程の後、シリンジを密閉し、ヒドロゲルビーズを少し過剰の保護溶媒で膨潤形態のままにしておいた。このサンプルをドライアイスのベッド中で４０ｋＧｙ（照射源：Ｃｏ６０）の線量でガンマ線照射した。続いて、製剤緩衝液でヒドロゲル６を５回、水で５回、エタノールで５回洗浄し、０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥させた。
【０１７１】
（実施例８）
照射された６のｐＨ９・３７℃におけるインビトロ分解
ヒドロゲル６（滅菌後）及び参考５（滅菌なし）の加速条件下でのインビトロ分解速度をそれぞれのサンプルの２ｍｇを３７℃にある１．０ｍＬ０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０中でインキュベートすることにより測定した。アリコートを一定時間間隔で採取し、ＳＥＣで分析した。ヒドロゲルの放出水可溶分解生成物（１種又はそれ以上の骨格部分を含んでいる）に対応するＵＶシグナル（２１５ｎｍ）を積分し、インキュベーション時間に対してプロットした。分解挙動におけるほんの少しの逸脱が観察された（図２）。
【０１７２】
（実施例９）
照射されたヒドロゲル６から放出されたパリペリドンの品質
１ｍｇ照射パリペリドン−リンカー−ヒドロゲル６を３７℃にある１．５ｍＬｐＨ７．４リン酸緩衝液（６０ｍＭ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でインキュベートした。４日後、上澄み液中に放出されたパリペリドンの品質をＨＰＬＣにより検証した。Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣを用いたがこれにはＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．、１．７μｍ粒子サイズ）が装着されていた（溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ／水、溶媒Ｂ：０．０４％ＴＦＡ／アセトニトリル）。４分で０→５０％Ｂの線形勾配を採用した。パリペリドン純度は９５％であることが判明した（２１５ｎｍ）。
【０１７３】
略記号：
ＡｃＯＥｔ 酢酸エチル
ＡｃＯＨ 酢酸
Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｂｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＣ ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＧＤＥ ジエチレングリコールジエチルエーテル
ＤＭＡ Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＡＰ ジメチルアミノ−ピリジン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＩ １，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＳＩ エロクトロスプレーイオン化
ｅｑ 化学量論当量
ＥｔＯＨ エタノール
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｉＰｒＯＨ イソプロパノール
ｋＧｙ キログレイ
ＬＣＭＳ 質量分光分析直結液体クロマトグラフィー
ＭｅＯＨ メタノール
ＭＳ 質量スペクトル
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＭＷ 分子量
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＯｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチルオキシ
ＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−
ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ 室温
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン
ＵＶ 紫外
ＶＩＳ 可視
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解性結合により相互接続されている骨格部分を含む生分解性ポリ（エチレングリコール）ベース不溶性ヒドロゲルの滅菌方法であって、次の工程
（ａ）ヒドロゲルを準備する工程；
（ｂ）ヒドロゲルを保護溶媒又は２種もしくはそれ以上の保護溶媒の混合物又はそれらの水溶液に溶媒和させる工程；
（ｃ）溶媒和したヒドロゲルにガンマ線照射を行う工程；
を含む、上記方法。
【請求項２】
保護溶媒が、酢酸（水溶液、０．０５〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、４−アセチルモルホリン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン、アルキルアルコール、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、ピリドキシン（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、１，２−プロピレンカーボナート、テトラヒドロフラン、スルホラン、水、又はこれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護溶媒が、ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＤＭＦ又はＤＭＩである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
滅菌が、線量が５〜１００ｋＧｙのガンマ線照射により得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
滅菌が、線量が８〜５０ｋＧｙのガンマ線照射により得られる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒドロゲルが、小分子生物活性部分を持っている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒドロゲルの骨格部分が、それぞれ、１ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲内の分子量を有している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヒドロゲルの骨格部分が、加水分解性結合により相互接続されていて、骨格部分はクロスリンカー部分を介して一緒に連結されており、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合により終端されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
加水分解性結合が、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル又はスルホン酸エステルである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
クロスリンカー部分が、６０Ｄａ〜５ｋＤａの範囲内の分子量を有している、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化１】
［式中、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される分岐コアを含んでいる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化２】
［式中、ｎは５〜５０の整数であり、点線は、分子の残部への結合を示している］
で表される構造を含んでいる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化３】
［式中、点線は、分子の残部への結合を示しており、＊でマークされた炭素原子はＳ配置を示している］
で表される超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
骨格部分が、以下の式：
【化４】
［式中、点線のうちの一方は超分岐部分Ｈｙｐへの結合を示しており、もう一方の点線は分子の残部への結合を示しており、ｍは２〜４の整数である］
で表される少なくとも１個のスペーサーに結合している、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
骨格部分が、以下の構造
【化５】
［式中、ｑは３〜１００の整数である］
を含むクロスリンカー部分を介して一緒に連結されている、請求項１〜１５のいずれかに記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
保護溶媒が、１種又はそれ以上の保護剤を含有している、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
保護剤が、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、セリノール、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、酢酸、ギ酸、アスコルビン酸、グリシンアミド、ピバル酸、プロパン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、チオグリセリン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、還元グルタチオンから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８にいずれかに記載の方法により取得可能な滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲル。
【請求項１】
加水分解性結合により相互接続されている骨格部分を含む生分解性ポリ（エチレングリコール）ベース不溶性ヒドロゲルの滅菌方法であって、次の工程
（ａ）ヒドロゲルを準備する工程；
（ｂ）ヒドロゲルを保護溶媒又は２種もしくはそれ以上の保護溶媒の混合物又はそれらの水溶液に溶媒和させる工程；
（ｃ）溶媒和したヒドロゲルにガンマ線照射を行う工程；
を含む、上記方法。
【請求項２】
保護溶媒が、酢酸（水溶液、０．０５〜１％（ｖ／ｖ））、アセトニトリル、４−アセチルモルホリン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルカーボナート、ジメチルホルムアミド、１−エチル−２−ピロリドン、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ−エチルホルムアミド、４−ホルミルモルホリン、１−ホルミルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン、アルキルアルコール、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホルアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ニコチンアミド（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、ピリドキシン（水溶液、０．１〜５％（ｗ／ｗ））、Ｎ−メチルホルムアミド、ＮＭＰ、１，２−プロピレンカーボナート、テトラヒドロフラン、スルホラン、水、又はこれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護溶媒が、ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＤＭＦ又はＤＭＩである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
滅菌が、線量が５〜１００ｋＧｙのガンマ線照射により得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
滅菌が、線量が８〜５０ｋＧｙのガンマ線照射により得られる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒドロゲルが、小分子生物活性部分を持っている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ヒドロゲルの骨格部分が、それぞれ、１ｋＤａ〜２０ｋＤａの範囲内の分子量を有している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ヒドロゲルの骨格部分が、加水分解性結合により相互接続されていて、骨格部分はクロスリンカー部分を介して一緒に連結されており、それぞれのクロスリンカー部分は少なくとも２つの加水分解性結合により終端されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
加水分解性結合が、カルボン酸エステル、カーボナート、ホスホエステル又はスルホン酸エステルである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
クロスリンカー部分が、６０Ｄａ〜５ｋＤａの範囲内の分子量を有している、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化１】
［式中、点線は、骨格部分の残りの部分への結合を示している］
で表される分岐コアを含んでいる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化２】
［式中、ｎは５〜５０の整数であり、点線は、分子の残部への結合を示している］
で表される構造を含んでいる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲルの骨格部分が、以下の式：
【化３】
［式中、点線は、分子の残部への結合を示しており、＊でマークされた炭素原子はＳ配置を示している］
で表される超分岐部分Ｈｙｐを含んでいる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
骨格部分が、以下の式：
【化４】
［式中、点線のうちの一方は超分岐部分Ｈｙｐへの結合を示しており、もう一方の点線は分子の残部への結合を示しており、ｍは２〜４の整数である］
で表される少なくとも１個のスペーサーに結合している、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
骨格部分が、以下の構造
【化５】
［式中、ｑは３〜１００の整数である］
を含むクロスリンカー部分を介して一緒に連結されている、請求項１〜１５のいずれかに記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
保護溶媒が、１種又はそれ以上の保護剤を含有している、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
保護剤が、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、セリノール、トリスヒドロキシメチル−アミノメタン、酢酸、ギ酸、アスコルビン酸、グリシンアミド、ピバル酸、プロパン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、チオグリセリン、ジチオトレイトール、メルカプトエタノール、還元グルタチオンから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８にいずれかに記載の方法により取得可能な滅菌生分解性ＰＥＧベース不溶性ヒドロゲル。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図２】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０９２１６（Ｐ２０１３−５０９２１６Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３５８３５（Ｐ２０１２−５３５８３５）
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６４０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１４０６
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５１０２０９１３３）アセンディス ファーマ エー／エス (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６６４０４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５１４０６
【国際公開日】平成２３年５月５日（２０１１．５．５）
【出願人】（５１０２０９１３３）アセンディス ファーマ エー／エス (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]