生物発光分析およびそれに有用な細胞
本発明は、新規の生物発光分析、および、それに有用な細胞およびキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の生物発光分析、および、それに有用な細胞およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、化学物質の突然変異誘発性の可能性は、物質の発癌性の可能性にほぼ比例することが認められている。Ｇｒｏｓｓｂｌａｔｔ，Ｎ.(１９８３年)。ある種の物質が突然変異誘発性の危険を示すかどうかを早期に決定することは、化学、化粧品、食品添加剤および製薬産業に関する製品開発にとって重要である。
【０００３】
突然変異誘発物質は、突然変異（すなわち生物の遺伝物質における検出可能で遺伝性の構造変化）の割合の増加を引き起こす物質である。このような変化としては、染色体全体の付加または欠失、染色体の構造変化（例えばトランスロケーション）、および、ゲノム配列の一部の構造変化（例えば、点突然変異、複数の連続するヌクレオチドの突然変異、および、ゲノム配列の部分的な欠失）が挙げられる。突然変異誘発性の変化は、遺伝子の作用にダメージを与えるか、または別の方法で妨害することができるので、突然変異誘発物質は、遺伝毒性物質、すなわち遺伝子にとって毒性の物質とみなされている。
【０００４】
突然変異誘発物質を検出するための広く知られているインビトロ試験は、エイムス（Ａｍｅｓ）分析である。この試験は、ヒスチジン依存性のサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）試験菌株における突然変異の逆戻り、それによる、それらの自身のヒスチジンを生産する細胞の能力を復元させる物質の能力を測定するものである（Ａｍｅｓ等，１９７３ａ，１９７３ｂおよび１９７５；また、Ａｍｅｓ，Ｂ.Ｎ.，１９７１年も参照）。エイムス分析に類似した、サルモネラ株（Ｌｅｅ，Ｃ−Ｃ，等，１９９４年、および、Ｈｏｕｒ，Ｔ−Ｃ．等，１９９５年）、および、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ，Ｄ.等，１９８７年；および、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ.Ｌ.等，１９８７年）におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子の逆突然変異によるアンピシリン耐性の回復を測定する方法が開発されている。このような試験はいずれも、１個のヌクレオチドのその他のヌクレオチドでの置換、または、配列のフレームシフトを引き起こすヌクレオチド挿入または欠失のいずれかによって、単一のヌクレオチド逆突然変異による突然変異誘発物質を検出する菌株を用いる。
【０００５】
エイムス型の分析の改変法が報告されており、例えば、Ｙａｈａｇｉ，Ｔ.等(１９７５年)；Ｐｒｉｖａｌ，Ｍ.Ｊ.およびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｖ.Ｄ.(１９８２年)；Ｈａｗｏｒｔｈ，Ｓ.等(１９８３年)；Ｋａｄｏ，Ｎ.Ｙ.，等(１９８３年)；および、Ｒｅｉｄ，Ｔ.Ｍ.等(１９８４年)；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.）(２０００年)，第３章．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｄｄｕｃｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，第３章 Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ユニット３.１ Ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ａｍｅｓ）Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ １：Ｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ２：Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｌｉｑｕｉｄｓ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ３：Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｇａｓｅｓ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
４：Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｓｓａｙ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ５：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｋａｄｏ）Ｍｉｃｒｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
Ａｓｓａｙで報告されている。これらの改変法は、一般的に、用いられる試験物質の量
を最小化すること、および、分析の速度と作業効率を高めることを目的としている。
【０００６】
共に譲渡された米国特許出願番号１０／０２９,７４１は、新規のエイムス型の分析を開示しており、この分析は、特に、細菌細胞と、試験物質および外因性の代謝活性化系とを接触させることを含み、ここにおいて、この細菌細胞は、発現可能な異種ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（またはオペロン）を含み、さらに、突然変異していない形態で細胞が選択的培地中で代謝的に活性になることにおいて機能化されることが重要なポリペプチドをコードする遺伝子における可逆的な点変異を含む。
【０００７】
突然変異誘発物質を同定するためのさらなる方法が説明されており、例えば、点突然変異のための、マウスリンパ腫系（Ａｍａｃｈｅｒ等(１９７９年)）；染色体異常および姉妹染色分体の変換のための、チャイニーズハムスター卵巣系（Ｅｖａｎｓ(１９８３年)およびＷｏｌｆｆ(１９８３年)）；小核分析（ＦｅｎｅｃｈおよびＭｏｒｌｅｙ(１９８５年)）；および、ショウジョウバエ変異誘発分析（Ｒａｓｍｕｓｏｎ等(１９７８年)）が挙げられる。
【０００８】
Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）は、酵母、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における染色体内組換えに関する正の選択系を報告しており、これは、一方の３’末端と他方の５’末端において末端が欠失している遺伝子の２つのコピーを生産するＨＩＳ３遺伝子座におけるＨＩＳ３遺伝子の内部フラグメントを含むプラスミドの組み込みによる。
Ｓｏｍｍｅｒｓ等（１９９５年）は、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）によって説明された染色体内組換え系のための自動化方法を報告しており、これは、マルチウェルプレートを利用し、マイクロウェル波動方法を用いて逆突然変異の頻度を測定する。
Ｃｏｔｅ等（１９９５年）は、サルモネラ・チフィムリウムの生物発光株を用いたエイムス突然変異誘発分析を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のところ利用可能な試験物質の突然変異誘発性の可能性を評価する方法、特にエイムス試験は、有用かつ重要な機能を提供してきたが、それにもかかわらず、可能性のある突然変異誘発性の信頼性のある的確な評価を、比較的速く経済的な手段で提供する新しい方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一形態において、物質を試験する方法に関し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を試験物質で処理すること、および、適切な選択培地の存在下で、細胞からの生物発光のレベルを測定することを含む。
【００１１】
本発明のその他の形態は、物質を試験する方法を提供し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、前記真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること；および、真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定することを含む。
【００１２】
本発明のさらなる形態は、物質を試験する方法を提供し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、前記真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること；適切な選択培地の存在下で、処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、適切な選択培地の存在下で真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、並びに以下から選択されるカテゴリー、すなわち、前記選択培地の存在下における前記未処理部分と比較して、前記処理部分の生物発光を
示す細胞の数を増加させる物質；および、前記選択培地の存在下における前記未処理部分と比較して、前記処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させない物質から選択されたカテゴリーに従って、試験物質を特徴付けることを含む。
【００１３】
本発明の追加の形態は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を提供する。
本発明の方法の形態の好ましい実施態様において、前記生物発光の増加は、前記未処理部分と比較して統計学的に有意である。
本発明の方法の形態のさらなる好ましい実施態様において、前記生物発光を示す細胞の増加は、前記未処理部分と比較して少なくとも２倍である。
本発明の方法の形態のその他の好ましい実施態様において、前記真核細胞は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導され、好ましくはサッカロミセス・セレビジエの細胞から誘導される。
【００１４】
本発明の細胞の形態の好ましい実施態様において、前記真核細胞は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導され、好ましくはサッカロミセス・セレビジエの細胞から誘導され、より好ましくはサッカロミセス・セレビジエＲＳ１１２−ｌｕｃ株の細胞から誘導される。
【００１５】
〔図面の簡単な説明〕
本発明のさらなる理解、同様に、それらのその他の目的とさらなる特徴のために、以下のそれらの様々な好ましい実施態様の詳細な説明について添付の図面と合わせて説明する：
図１は、ＤＥＬ組換えのメカニズムを示す。ＤＥＬ組換えは、ＤＮＡ二本鎖の破断によって開始され、これは、一本鎖のアニーリングによって修復される。これにより、介在配列（Ｌｅｕ）を用いた複製された対立遺伝子の欠失と、野生型Ｈｉｓ３マーカーの復元が起こる。
【００１６】
図２は、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドのマップであり、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌｕｃ＋、構成的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターを示し、ｐＹＥＳ６／ＣＴ主鎖のベクター、細菌および酵母の複製起点（それぞれｐＵＣｏｒｉおよび２μ）、および、ブラスチシジンおよびアンピシリン耐性遺伝子由来である。
【００１７】
図３は、ＤＥＬ組換えを受ける細胞の生物発光検出の原理を示す。細胞は、ＤＥＬマーカーの組換えによって選択培地で生存できるようになる。生存する細胞のみが代謝的に活性であり、生物発光の表現型を維持するのに十分なＡＴＰを生産する。
【００１８】
図４は、ＤＥＬ組換え頻度（Ａ部）および生存（Ｂ部）に関するＲＳ１１２ｌｕｃ細胞のメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）処理の作用のグラフ表示である。
【００１９】
〔発明の詳細な説明〕
本明細書で用いられる用語は、それらの当業界において一般的な意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするためと、便宜上、本明細書（実施例や添付の請求項を含む）で用いられている所定の用語および成句の意味は、以下に示す通りである。
【００２０】
「生物発光」は、生きている細胞における光の放出を意味しており、ここにおいて光の放出は、代謝活性に依存しており、それに対応するものである（例えば図３を参照）。
「生物発光マーカー」は、細胞に取り込ませて発現させる場合、細胞の代謝活性の際に生物発光を引き起こすヌクレオチド配列を意味する。
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味し、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）と、後の調節配列（３’非コード配列）を含む。用語「遺伝子」は、ゲノム中の天然の位置に存在する内因性遺伝子、または、宿主生物中に通常は見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される外来遺伝子を含む。
【００２１】
「突然変異誘発物質」は、突然変異の割合の増加を引き起こす物質である。突然変異誘発物質は、遺伝子の作用にダメージを与えるか、または別の方法で妨害することによって遺伝毒性作用を有する可能性がある。
「突然変異」は、生物の遺伝物質における検出可能で遺伝性の構造変化であり、例えば、染色体全体の付加または欠失、染色体の構造変化（例えばトランスロケーション）、および、ゲノム配列の一部の構造変化（例えば、点突然変異、複数の連続するヌクレオチドの突然変異、および、ゲノム配列の部分的な欠失）が挙げられる。
【００２２】
「ＤＥＬ選択マーカー」は、破壊された遺伝子配列を意味し、ここにおいて：（１）上記破壊は、遺伝子配列内へのヌクレオチド配列の挿入を含み；（２）前記ヌクレオチド配列は、遺伝子配列の一部の１つの複製を含み；（３）前記ヌクレオチド配列の複製された部分の頭から尾（すなわち、５’末端から３’末端）の方向は、遺伝子配列の方向と同じであり；および（４）遺伝子配列は、適切な選択培地で成長させた場合、細胞表現型の選択に有用である。ＤＥＬ選択マーカーの様々な実施態様を、以下で説明する。
【００２３】
「選択培地」は、細胞の表現型の選択に用いることができる組成物を意味する。例えば、ヒスチジンを生産することができる酵母細胞を選択的にスクリーニングするためには、ヒスチジンが欠損した栄養組成物を用いることができる。ｎｅｏ耐性遺伝子を有する細胞を選択的にスクリーニングするためには、抗生物質Ｇ−４１８を含む栄養組成物を用いることができる。
「適切な選択培地」は、ＤＥＬ選択マーカーに関して用いられる場合、ＤＥＬ選択マーカーの遺伝子配列に基づく細胞の表現型の選択に用いることができる組成物を含む選択培地を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる略語は、それらの当業界において一般的な意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするためと、便宜上、所定の略語の意味は、以下に示す通りである：
「℃」は、セ氏温度を意味し；「μＬ」は、マイクロリットルを意味し；「ＡＴＣＣ」は、バージニア州マナサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を意味する（ウェブサイト：www.atcc.org）；「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミンテトラ酢酸を意味し；「ｇ」は、グラムを意味し；「ｋｇ」は、キログラムを意味し；「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し；「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し；「ｍＭ」は、ミリモルを意味し；ＭＭＳは、メタンスルホン酸メチルを意味し；「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味し；「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し；および「ＲＰＭ」は、毎分回転数を意味する。
【００２５】
環境要因は、ガンの原因に関連する。実際に、環境要因の役割は、遺伝よりも緊密なガンとの因果関係を有する可能性もある（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ等(２０００年)）。結果として、発ガン性物質であることがわかっているか、またはその疑いがある天然化学物質および人工の化学物質を同定し、それらとヒトとの接触を少なくする努力がなされてきた。
【００２６】
上述したように、化学物質の発癌性の可能性は、一般的に、その突然変異誘発性によって少なくとも部分的に予想可能であるとみなされている。Ｇｒｏｓｓｂｌａｔｔ，Ｎ.(１９８３年)。そのために、化学、化粧品、食品添加剤および製薬産業のような産業で、それらの製品の発癌性の危険を、それらの突然変異誘発性の特性を最小化することによって緩和することが可能となってきた。
【００２７】
ＤＥＬ分析はまた、染色体内組換え分析としても知られており、最初に、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）によってサッカロミセス・セレビジエを用いて説明されており、ここにおいて、標的とする遺伝子配列において誘導されたゲノム配列の一部の欠失を突然変異誘発物質によって測定する。従って、この分析は、試験化合物の突然変異誘発性の可能性に関する評価が可能である。
【００２８】
ＤＥＬ分析で用いられる標的遺伝子配列は、外因性ＤＮＡフラグメントの組み込みによって機能が破壊されている遺伝子である。例えば、Ｓｃｈｉｅｓｔｌｅ等（１９８８年）は、ＨＩＳ３遺伝子が外因性ＤＮＡフラグメントの組み込みによって破壊されている「ＲＳＹ６」と命名されたＳ．セレビジエ株（ＡＴＣＣより入手可能，寄託番号２０１６８２）の使用を説明している。得られたｈｉｓ−酵母株は、その増殖培地において成長するためにヒスチジンを必要とする。ヒスチジン非含有培地において、自発的にｈｉｓ＋に復帰する細胞は極めて少数であると予想される。しかしながら、細胞が突然変異誘発物質で処理されると、逆突然変異速度は、通常のバックグラウンドレベルを超えて増加する。
【００２９】
図１で、ＤＥＬ分析の機能について提唱されているメカニズムが説明されている（ＧａｌｌｉおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（１９９８年））。図１に示されるように、突然変異誘発物質は、二本鎖ＤＮＡの破断の形成を引き起こす。このような破断が破壊された遺伝子で起こった場合、細胞自身の修復メカニズムにより、外因性ＤＮＡの除去、および、一本鎖アニーリングを介した配列の修復を起こし、それによって遺伝子がその野生型に逆突然変異する可能性がある。
【００３０】
ＤＥＬ分析は、その他の突然変異誘発性分析よりも確かな利点を有する。例えば、ＤＥＬ分析は、より一般的に使用されるサルモネラ逆突然変異エイムス分析よりも優れた発癌性の予測精度を有することが報告されている。エイムス分析を用いると陰性の結果が得られる発癌性化合物の多くが、ＤＥＬ法では陽性である。（ＢｉｓｈｏｐおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ(２０００年)）。
【００３１】
しかしながら、現在のところ利用可能なＤＥＬ分析の一つの不利点は、可能性のある突然変異誘発物質の大規模で自動化されたスクリーニング（すなわち、ハイスループットスクリーニング）における非実際性である。例えば、現状の分析では、試験化合物が可能性のある発癌性物質であるかどうかを決定するために、目視できるコロニーまで成長できるような十分な時間を細胞に与えることが必要である。その上、成長するコロニーを可視化する必要があるために、現状の分析では、例えば必要な試験物質の量を減少させることが可能なマルチウェルプレートシステムに小型化することができない。
【００３２】
本発明は、一形態において、ＤＥＬ組換え現象のような突然変異誘発性の正の指標として生物発光を使用するＤＥＬタイプの方法の発見に基づいている。本発明によれば、これまで利用不可能であった様式で、未知の発癌性を有する可能性のある物質を、ＤＥＬ組換えに関して迅速かつ経済的に試験することが可能である。
【００３３】
本発明は、一成分として、生物発光マーカーを含み、同様に、破壊されたＤＥＬタイプの選択マーカーを含む細胞の使用に関与する。生物発光マーカーは、ＤＥＬ組換えの結果として野生型の表現型に復帰した細胞の極めて初期の検出を可能にする。選択培地で成長
させた復帰突然変異細胞における生物発光は、非復帰突然変異体と比較すれば、それらの代謝活性の結果として発生する（図３を参照）。十分に高感度の検出手段が利用可能な場合、本発明の方法は、試験物質で処理した後極めて迅速に、個々の細胞の復帰突然変異体またはこれらの細胞微小コロニーの検出を可能にする。これは、検出を可能にするために細胞を大きなコロニーに成長させる必要性を不要にすると予想される。
【００３４】
現在のところ利用可能なＤＥＬ分析に比べると、本発明の復帰突然変異細胞の生物発光の検出に基づく方法および細胞は、小型化された物質試験システム（例えばマルチウェルプレートを使用するシステム）の使用が可能である。本発明の方法および細胞は、突然変異誘発性の試験に必要な試験物質の量を顕著に減少させることが可能である。これは、試験物質がほんの少量しか利用できない場合に顕著な利点となり得る。加えて、生物発光の使用は、生物発光シグナルの迅速かつ正確な検出のための、高感度の装置（例えばＣＣＤチップベースのフォトンカウンティングカメラ）の使用を可能にする。
【００３５】
当業者であれば本発明の開示に基づき明白であるが、本発明の実施においてあらゆる適切な真核細胞が使用可能である。例えば、上記細胞は、脊椎動物（例えば哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類および両生類）由来、同様に、無脊椎動物（例えば、昆虫、線虫）由来、および、単細胞真核生物由来のものが挙げられる。多細胞真核生物については、上記細胞は、血液、内皮、胸腺、脾臓、骨髄、肝臓、腎臓、心臓、精巣、卵巣、心臓および骨格筋などのあらゆる臓器または組織から誘導されたものでもよいし、一次細胞でも、または、不死化細胞系から誘導された細胞でもよい。好ましい細胞としては、ヒトのリンパ芽球様細胞系、例えばＧＭ６８０４（例えば、Ｍｏｎｎａｔ，Ｒ.Ｊ.等(１９９２年)、および、Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ.等(１９９５年)を参照）、および、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ属の酵母細胞が挙げられる。
【００３６】
本発明の方法に使用するための細胞および細胞系は、例えば、ＡＴＣＣ（マナサス，バージニア州２０１１０−２２０９）から得てもよい。
【００３７】
上記で定義したように、ＤＥＬ選択マーカーは、破壊された遺伝子配列を意味し、ここにおいて：（１）上記破壊は、遺伝子配列内のヌクレオチド配列の挿入を含み；（２）前記ヌクレオチド配列は、遺伝子配列の一部の１つの複製を含み；（３）前記ヌクレオチド配列の複製された部分の頭から尾（すなわち、５’末端から３’末端）の方向は、遺伝子配列の方向と同じであり；および、（４）遺伝子配列は、細胞の表現型の選択に有用である。
【００３８】
例えば、遺伝子配列に要素Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇが含まれる場合、このような遺伝子配列に基づく適切なＤＥＬ選択マーカーは、配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ、および、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ（ここにおいて、Ｘは、それ自身が、破壊の取り込みが成功した形質転換細胞を選択するために用いることができる選択マーカーである）を包含していてもよい。
【００３９】
当業者であれば当然であるが、本発明の開示に基づき、本発明の実施において、ＤＥＬ選択マーカーに適切なあらゆる表現型の選択マーカーが使用可能である。さらに当然ながら、用いられる選択マーカーのタイプは、一形態において、本発明の実施で用いられる細胞のタイプに応じて様々であり得る。
【００４０】
本発明の一実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーは、破壊の結果として細胞が生存、代謝活性または成長を維持するために特定の栄養素が必要になるように栄養マーカー遺伝子の機能の破壊を含む。この実施態様において、栄養マーカーの非破壊型への逆突然変異を引き起こすことによって、細胞がそれに対応する栄養素が欠失した培地で増殖すること
を可能にする能力に関して物質を試験してもよい。典型的な栄養マーカーとしては、酵母細胞の場合、細胞のヒスチジン要求性を改変するｈｉｓ３が挙げられる。その他の栄養マーカーは、本発明の開示に基づき当業者には明白であると予想される。
【００４１】
その他の実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーは、細胞にとって毒性でしかない（すなわち、生存、代謝活性または成長を妨害する）と予想される特定の物理的な物質または化学物質に対する耐性を運搬する遺伝子である。このような「耐性マーカー」は、抗生物質、代謝拮抗物質または除草剤などの化学物質に対する耐性を細胞に与えるものである。耐性マーカー遺伝子の機能の破壊は、毒性物質に晒された場合に細胞に毒性を引き起こす。そのようなものとして、この実施態様は、遺伝子の非破壊型への逆突然変異を引き起こすことによって、細胞が毒性物質を含む培地で増殖することを可能にする能力に関して物質を試験することを含む。典型的な耐性マーカーとしては、以下が挙げられる：ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、これはメトトレキセート耐性を付与する；ｎｅｏ、これは、アミノグルコシド系、ネオマイシン、および、Ｇ−４１８耐性を付与する；および、ａｌｓおよびｐａｔ、これは、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ.等(１９８０年)；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ.等(１９８１年)を参照）。その他の耐性マーカーは当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。
【００４２】
この開示に基づき当業者には明白と予想されるが、本発明の範囲内で、ＤＥＬ選択マーカーはまた、二次的な遺伝学的要素で制御可能な非破壊型の栄養マーカーまたは耐性マーカーを包含していてもよく、ここにおいて、上記二次的な遺伝学的要素の機能は、破壊されている。このような二次的な遺伝学的要素としては、活性化ドメインに結合することによって、栄養マーカーまたは耐性マーカーの転写を開始させるか、またはその速度を促進する転写活性化タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。従って、この実施態様によれば、二次的な遺伝学的要素のその機能的な形態への逆突然変異を引き起こすことによって、栄養マーカーまたは耐性マーカー遺伝子の発現を可能にする能力に関して、物質を試験してもよい。典型的な転写活性化因子および活性化ドメイン配列の組み合わせとしては、ＢＤ(R)Ｔｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現系（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）の一部であるＴｅｔ調節性転写活性化因子が挙げられる。その他の転写活性化因子および活性化ドメイン配列は当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。
【００４３】
当業者には本発明の開示に基づきさらに当然と予想されるが、ＤＥＬ選択マーカーはまた、転写抑制因子の遺伝学的要素によって制御可能な非破壊型の負の選択マーカー遺伝子を包含していてもよく、ここにおいて、転写抑制因子の機能が破壊されている。負の選択マーカーは、活性な場合、細胞にとって毒性である。従って、このような実施態様によれば、転写抑制因子のその機能的な形態への逆突然変異を引き起こすことによって、負の選択マーカー遺伝子の発現を可能にする能力に関して、物質を試験してもよい。典型的な負の選択マーカーは、単純疱疹ウイルス遺伝子、チミジンキナーゼであり、これは、薬物、ガンシクロビルの存在下で細胞毒性を引き起こす（Ｍｏｏｌｔｏｎ(１９８６年)）。その他の負の選択マーカーとしては、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニン、または、６−チオキサンチンの存在下で細胞毒性）、および、ジフテリア毒素、リシン毒素、および、シトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシンの存在下で細胞毒性）が挙げられる。
【００４４】
転写抑制因子の遺伝学的要素は、発現された場合、負の選択マーカーの発現を抑制すると予想される。典型的な転写抑制因子は、例えばＦｉｒｅ等（１９９８年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ等（２００２年）で説明されている方法を用いて、および、当業者既知のその他の方法で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を介する。
【００４５】
当業者には本発明の開示に基づき明白と予想されるが、本発明の方法および細胞で用いられるＤＥＬ選択マーカーを構成する破壊された遺伝子または遺伝学的要素は、内因性の遺伝子または遺伝学的要素であってもよいし、または、本発明の開示に基づき当業者周知の組換え方法によって前駆細胞に導入された外因性の遺伝子または遺伝学的要素であってもよい。その上、本発明で用いられる細胞は、一倍体（各タイプの染色体の１つのコピーを有する）、または、二倍体（各タイプの染色体の２つのコピーを有する）のいずれでもよい。従って、本発明の方法および細胞で二倍体細胞が用いられ、ＤＥＬ選択マーカーを構成する破壊された遺伝子または遺伝学的要素が、内因性遺伝子または遺伝学的要素である場合、または、それ以外に内因的に存在する遺伝子または遺伝学的要素の２以上のコピーが存在する場合、本発明の方法の実施および細胞の使用のために前記遺伝子または遺伝学的要素の全てのコピーを崩壊させることが好ましい。
【００４６】
好ましい実施態様において、サッカロミセス・セレビジエ酵母細胞で使用するためのＤＥＬ選択マーカーは、ＨＩＳ３遺伝子を含み、これは、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）で説明されているようにプラスミドｐＲＳ６の挿入によって破壊されており、さらに、米国特許第４,９９７,７５７号で説明されているように、Ｓ.セレビジエＲＳＹ６株およびＲＳ１１２株に含まれている。
【００４７】
当業者であれば当然であるが、本発明の開示に基づき、本発明の実施においてあらゆる適切な生物発光マーカーが使用可能である。さらに当然ながら、用いられる生物発光マーカーのタイプは、一形態において、本発明の実施で用いられる細胞のタイプに応じて様々であってよい。酵母細胞に使用するための典型的な生物発光マーカーは、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子であり（ＧｅｎｅＢａｎｋ(R)登録番号ＡＡＡ８９０８４）、これは、構成的なグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターによって作動する。Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ.等（１９９５年）。ｌｕｃ遺伝子によって触媒された生物発光は、基質（ルシフェリン）と、内因性ＡＴＰの形態のエネルギーとを必要とする。細胞が成長している培地に補助物質としてルシフェリンが含まれる限り、酵母細胞の生物発光はもっぱら細胞内ＡＴＰの利用可能性に依存する。細胞内ＡＴＰ濃度はエネルギー代謝に依存するため、生物発光の生産高は、酵母細胞の代謝活性のレベルを示す。本発明の方法において、欠失組換え現象を引き起こしてＤＥＬ選択マーカーの機能を回復させる試験化合物によって、細胞は、該当する栄養素の非存在下で、または、細胞毒性を有する可能性のある物質の存在下で代謝活性を維持し増殖することが可能である（図３を参照）。
【００４８】
本発明の方法および細胞で使用可能なその他の生物発光マーカーは当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。例えば、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等（１９９４年）は、本発明で使用可能な生物発光マーカーを説明している。
【００４９】
本発明の方法および細胞で用いられる生物発光マーカーおよびＤＥＬ選択マーカーは、このようなマーカーをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することによって細胞に取り込ませることもできる。このようなベクターは、細胞の染色体ＤＮＡに安定して取り込まれるように設計してもよいし、または、染色体へ組み込まなくても適用できるマーカーが発現されるように設計してもよい。
【００５０】
細胞に挿入されたコード配列の転写および翻訳制御に必要な要素を含む発現ベクターを用いて、試験物質での処理後に、逆突然変異の際に生物学的に活性になると予想される生物学的に活性な生物発光マーカーまたはＤＥＬ選択マーカーを細胞に取り込ませてもよい。転写および翻訳調節要素としては、調節配列、例えばエンハンサー、構成的および誘導性プロモーター、ならびに、適用可能なマーカーをコードするベクターやポリヌクレオチド配列中の５’および３’非翻訳領域が挙げられる。このような要素は、それらの強度や特異性の点で様々なものが可能である。また、上記マーカーをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグナルを用いてもよい。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン、および、隣接する配列、例えばコザック配列が挙げられる。マーカーおよびその開始コドンならびに上流調節配列をコードする配列が適切な発現ベクターに挿入されている場合、追加の転写または翻訳制御シグナルが必要ないこともある。しかしながら、コード配列またはそれらのフラグメントしか挿入されていない場合、インフレームのＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳制御シグナルがベクターによって提供されるべきである。外因性翻訳要素および開始コドンは、様々な由来のものが可能であり、天然でも合成でもよい。発現効率は、用いられる特定の宿主細胞系に適したエンハンサーを含ませることによって強化することもできる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ.等(１９９４年)を参照）。
【００５１】
本発明の開示に基づき当業者周知の方法を用いて、生物発光マーカーおよびＤＥＬ選択マーカー、ならびに、適切な転写および翻訳調節要素をコードする配列を含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、および、インビボでの遺伝子組換えが挙げられる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.等(１９８９年)，第４，８および１６〜１７章；Ａｕｓｕｂｅｌ等(２００３年)，９，１３および１６を参照）。
【００５２】
本発明のＤＥＬ選択マーカーが内因性遺伝子の破壊に関与する実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーを組み込む好ましい方法は、相同組換えによるものである。操作された遺伝子コンストラクトを細胞の染色体ＤＮＡに組み込むための相同組換え方法は当業者周知であり、および／または、当業者には本発明の開示に基づきさらに明白であると予想される。
【００５３】
ＤＥＬ選択マーカーを含む細胞の製造において、ＤＥＬ選択マーカー標的化ベクターは、非破壊型の標的遺伝子を有する細胞に導入される。導入されたベクターは、標的遺伝子に相同なベクター中のヌクレオチド配列を用いて上記遺伝子を標的とする。この相同配列が、ベクターと標的遺伝子の配列とのハイブリダイゼーションを容易にする。ハイブリダイゼーションは、交差現象を介してベクター配列の標的遺伝子への組み込みを起こし、標的遺伝子の破壊を発生させる。
【００５４】
標的化に用いられるベクターの構築に関する一般的な原理は、Ｂｒａｄｌｅｙ等（１９９２年）に総論されている。本発明の説明に基づき相同組換えに有効な配列の選択および使用に関する指針は、文献で説明されている（例えば、ＤｅｎｇおよびＣａｐｅｃｃｈｉ(１９９２年)；Ｂｏｌｌａｇ等(１９８９年)；ならびに、ＷａｌｄｍａｎおよびＬｉｓｋａｙ(１９８８年)を参照）。
【００５５】
当業者であれば本発明に基づき理解できると思われるが、多種多様のクローニングベクターが、本発明のＤＥＬ選択マーカー標的化ベクターの構築において、ベクター主鎖として使用可能であり、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋１１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢＫファージミド、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、および、ｐＲＩＴ５ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、および、ｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２、および、ｐＢＲ３２２ベースのベクター、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージＣｈａｒｏｎ２８、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫ１９関連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、および、ｐＧＥＭシリーズのプラスミドである。これらのベクターは、多種多様な商業的な供給源より入手可能である（例えば、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），インディアナポリス，インディアナ州；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ），バレンシア，カリフォルニア州；ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州；および、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），ビバリー，マサチューセッツ州）。しかしながら、望ましい宿主中で複製可能で生存可能でさえあれば、その他のあらゆるベクター、例えばプラスミド、ウイルス、またはそれらの部分も使用可能である。また、このようなベクターは、ゲノムを改変する予定の宿主細胞中でそれらの複製を可能にする配列を含んでいてもよい。このようなベクターの使用によって、組換えが起こっている最中の相互作用期間を延長させることができ、そのため、標的化効率を高めることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ等(２００３年)，ユニット９.１６，図９.１６.１を参照）。
【００５６】
本発明の標的化ベクターを増殖させるために用いられた具体的な宿主細胞は、重要ではない。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒ等(１９７７年)）、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２ＨＢ１０１(ＡＴＣＣ番号３３６９４)、Ｅ.ｃｏｌｉ ＭＭ２１（ＡＴＣＣ番号３３６７８０）、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ番号３３８４９）、Ｅ.ｃｏｌｉ
ＤＨ５α株、および、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＴＢＬ２が挙げられる。あるいは、Ｃ.セレビジエ（Ｃ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または、Ｂ.ズブチリス（Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような宿主細胞を用いてもよい。上述の典型的な宿主、同様に、その他の適切な宿主は、市販されている（例えば、ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州；および、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ロックビル，メリーランド州）。
【００５７】
好ましくは、標的遺伝子を破壊するための標的化コンストラクトとしては、耐性マーカータンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列も挙げられる。様々な可能性のあるＤＥＬ選択マーカーのタイプに関して上述したように、耐性マーカーは、細胞にとって毒性でしかないと予想される特定の物理的な物質または化学物質に対する耐性を運搬する。耐性マーカー遺伝子は、交差現象に続いて耐性マーカー遺伝子が標的遺伝子に統合するように、耐性マーカー遺伝子が組み込みの後に発現できるような位置に置かれるような様式で、２つの端にある相同性領域間に位置する。選択可能な条件を与えることによって、ベクター配列の統合がうまくいかなかったその他の細胞から、耐性マーカーをコードするベクター配列を安定して発現する細胞を生存に基づいて単離することが可能である。
【００５８】
上述の耐性マーカーを使用すると、標的化された相同組換えによってベクターが標的遺伝子の遺伝子座に統合された細胞と、染色体のあらゆる位置へのランダムな非相同的なベクター配列の組み込みによる細胞とが区別されない。それゆえに、本発明の細胞を作製するための相同組換え用の置換ベクターを用いた場合、負の選択マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことも好ましい。ＤＥＬ選択マーカーの様々な可能性のあるタイプに関して上述したように、負の選択マーカーは、発現されると細胞にとって毒性のタンパク質である。負の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、置換ベクターの２つの相同領域の外側に位置する。この位置付けであれば、組み込みがランダムな非相同組換えによって発生した場合、細胞は、負の選択マーカーだけを統合し安定してそれを発現すると予想される；すなわち、標的化コンストラクトにおける標的遺伝子と２つの相同領域との相同組換えは、負の選択マーカーをコードする配列を組み込みから排除する。従って、負の条件を与えることによって、ランダムな非相同組換えによって標的化ベクターを統合した細胞は、生存能力を失う。
【００５９】
上記生物発光マーカーおよび／またはＤＥＬ選択マーカー（またはそれらの標的配列）を含むベクターは、当業者周知の標準的な方法、または、本発明の開示に基づき当業者に
は明白と予想される方法に従って細胞に導入されていてもよい。当業者には明白と予想されるが、選択される形質転換プロトコールは、例えば対象の遺伝子の細胞型や性質に依存すると予想され、慣例的な実験に基づき選択することができる。数種の形質転換プロトコールが、Ｋａｕｆｍａｎ（１９８８年）に総論されている。方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、遺伝子銃、リポソームトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、または、トランスファーインフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が挙げられる（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ等（１９８２年）；Ｐｏｔｔｅｒ等（１９８４年）；Ｃｈｕ等（１９８７年）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８７年）；Ｂａｕｍ等（１９９４年）；Ｂｉｅｗｅｎｇａ等（１９９７年）；Ｚｈａｎｇ等（１９９３年）；ＲａｙおよびＧａｇｅ（１９９２年）；Ｌｏ（１９８３年）；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ等（１９９８年）；Ｌｉｎｎｅｙ等（１９９９年）；ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ，（１９８９年）；および、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等（１９８６年）を参照）。本発明の実施において外来ＤＮＡを酵母細胞に導入するための好ましい方法は、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年）で説明されているように、酢酸リチウム／ＰＥＧの使用を含む。
【００６０】
本発明の方法の実施で用いることができる細胞は、本発明の開示に基づき、当業者周知の方法に従って、保存および培養してもよい。例えば、哺乳動物細胞は、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ等（２００３年），第１章で説明されている方法に従って培養してもよい。酵母細胞は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００３年），第１３章で説明されている一般的な方法に従って培養してもよい。
【００６１】
本発明の実施方法において、細胞の試験物質での処理は、本発明の開示に基づき、当業者既知の方法に従って用いることもできる。用いられる方法は、用いられる細胞のタイプ、ＤＥＬ選択マーカーおよび生物発光マーカーの特徴、ならびに、用いられる試験物質の特徴などの多くの変数に応じて様々であると予想される。
【００６２】
一実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーとしてｈｉｓ遺伝子の破壊を有する酵母細胞（サッカロミセス・セレビジエ）を、９６ウェルプレート中で約１７時間、約３０℃で、試験物質で処理する。処理の後、この細胞を洗浄し（例えばＰＢＳで）、超音波破砕して、単一の細胞の懸濁液への細胞の分離を確実にする。次に、この細胞を、適切な希釈で、ヒスチジン欠失培地、同様に、ヒスチジンを含む標準培地で平板培養する（以下を参照）。ヒスチジン欠失培地は、組換え頻度を決定するのに用いられる。標準培地（ヒスチジンを含む培地）は、試験物質の総体的な毒性を決定するのに用いられる。
【００６３】
平板培養に最適な細胞希釈を決定するために、細胞計数装置を用いて（例えば、コールター・パーティクル・カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ），コールター社（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ.，マイアミ，フロリダ州）を用いて）、細胞を計数してもよい。次に、１０倍の連続希釈液を製造する（Ｄ0〜Ｄ5、ここにおいてＤ0は、最初の細胞培養物である）。最適な細胞の希釈は、（ａ）試験物質の毒性；（ｂ）細胞の基準となる組換え頻度（処理なし）；および、（ｃ）処理後のＤＥＬ組換えのレベルを測定できる十分な細胞が存在するような濃度である。例えば、Ｓ.セレビジエ細胞を用いる場合の好ましい希釈は、１×１０5〜１×１０7細胞／ｍＬである。
【００６４】
ハイスループット検出のためには、細胞は、マルチウェルプレート（例えば、１２、２４または４８ウェル）で平板培養してもよい。次に、この細胞を、復帰突然変異体のコロニーの成長を可能にする十分な時間（Ｓ.セレビジエ細胞の場合、好ましくは約３０℃で約４８時間）インキュベートする。
【００６５】
当業者には明白と予想されるが、本発明の開示に基づき、生物発光を示す復帰突然変異
体コロニーは、あらゆる光検出装置を用いて可視化することもでき、このような装置としては、例えば、マルチウェルプレートでコロニーを同定するのに用いられるルミ−イメージャー(Ｌｕｍｉ−ｌｍａｇｅｒ)(R)Ｆ１フォトンカウンティング装置（ロシュ・ダイアグノースティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），インディアナポリス，インディアナ州）が挙げられる。使用可能なその他の光検出装置としては、ナイトアウル（ＮｉｇｈｔＯｗｌ，ベルトールド(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ)，ドイツ）、および、コダック(Ｋｏｄａｋ)ＩＳ１０００（コダック(Ｋｏｄａｋ)，ロチェスター，ＭＹ）が挙げられる。その上、細胞の生物発光コロニーのデジタル画像は、画像解析ソフトウェア（例えば、イメージ・プラス・プロ（Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏ)(R)，バージョン４.１（メディア・サイバネティックス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ.），カールスバッド，カリフォルニア州）を用いた自動データ評価に適している。
【００６６】
逆突然変異頻度は、試験物質での処理から生き残った細胞総数に対する復帰突然変異細胞の数で示すこともできる。例えば、ｈｉｓ−ＤＥＬ選択マーカーを有するＳ．セレビジエの場合、以下の式を用いて、逆突然変異頻度を計算してもよい。
【００６７】
ＦＲ＝（Ｒ×Ｄ）／（Ｓ×Ｄ′）
式中：
ＦＲ＝逆突然変異頻度、
Ｒ＝ヒスチジン欠失培地上の復帰突然変異体コロニーの数、
Ｓ＝標準培地上のコロニーの数（を含む、
Ｄ＝ヒスチジン欠失培地で平板培養した細胞の希釈係数、
Ｄ′＝標準培地で平板培養した細胞の希釈係数。
【００６８】
逆突然変異頻度が、コントロールと比較して少しでも統計学的に有意に増加していれば、遺伝毒性および／または発癌性の特性を有する可能性のある試験物質であることを示すと予想される。統計的有意性の測定は当業者周知であるか、または、本発明の開示に基づき明白と予想される。その結果は、好ましくは０.０５以下、より好ましくは０.０１以下のｐ値が得られると予想される（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ(１９６０年)）。あるいは、逆突然変異頻度の増加は、少なくともコントロールの約２倍である。
【００６９】
当業者には本発明の開示に基づき明白と予想されるが、コントロールと比較した細胞群の逆突然変異頻度の生物発光による測定は、試験物質の二次的な作用の補正を必要とする。例えば、逆突然変異頻度の増加を引き起こす所定の試験物質はまた、成長および／または細胞分裂の速度を減少させることもある。結果として、未処理コントロール細胞における復帰突然変異細胞の数は、処理された細胞群よりも速く成長し、コントロールの生物発光する総個体数が処理された細胞の生物発光する総個体数を超える可能性がある。このような二次的な作用は、細胞の生物発光がひとまとめに測定される場合（例えば、細胞を液状媒体に入れて全ての生物発光を測定することによって）、特に顕著になると予想される。
【００７０】
このような二次的な作用を補正する好ましい方法は、例えば細胞が個別のコロニーを形成するような選択培地（固体または半固体の）を用いて、処理された細胞とコントロール細胞それぞれの個体群を固定することによる方法である。次いで、生物発光によって検出可能なコロニーまたは微小コロニーの数に基づき逆突然変異頻度が決定され得る。
【００７１】
上述の分析方法は、単に説明のために示されたものである。本発明の開示に基づき当業者には明白と予想されるが、本発明の実施において多種多様な分析様式が利用可能である。用いられる細胞のタイプ、ＤＥＬ選択マーカー、生物発光マーカーおよび試験物質、処理方法および細胞培養方法、ならびに、復帰突然変異体の検出方法に基づいて、改変をなすことができる。
【００７２】
本発明の方法および細胞の好ましい使用は、化学的突然変異誘発性／遺伝毒性の物質の検出に関するが、本発明はまた、突然変異誘発性／遺伝毒性を引き起こす可能性のあるその他の物質、例えば電離放射線のような環境物質にも適用可能である。
【００７３】
本明細書で引用された全ての特許、出願、公報、および、小冊子や技術報告などの文献の開示は、それらの全体が参照により開示に含まれる。当業者であれば、実施例、図面および添付の請求項を含む本発明の説明に基づき、本発明を最大限に利用することが可能であると考えられる。
【００７４】
以下の実施例は、本発明の実施の単なる説明と解釈されるべきであり、あらゆる方式における開示されていない部分を何であれ限定するものではない。
【実施例】
【００７５】
〔実施例１〕
酵母ＲＳ１１２−ｌｕｃ試験株の製造
ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドの製造
プラスミドのｐＧＬ３−コントロール（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）５μｇを、ＨｉｎｄIII（１００ユニット）、および、ＸｂａＩ（１００ユニット）（ニューイングランドバイオラボ，ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて、製造元が供給した緩衝液（総反応体積２０μｌ）の存在下で、３７℃で１時間消化した。次に、このサンプルを０.８％アガロースゲルにローディングし、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス酢酸塩；２ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ）中で、５０ｍＶで、１時間泳動した。エチジウムブロマイド（５ｎｇ／ｍｌ，３０分間）を用いてバンドを染色し、トランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｔｏｒ）で２５００μＷ／ｃｍ2で可視化した。２つのバンドが観察され、１つは、ルシフェラーゼ遺伝子の１.７ｋｂのバンドであり、もう１つは、プラスミド主鎖を含む３.５ｋｂのバンドであった。１.７ｋｂのルシフェラーゼＤＮＡを含むバンドを寒天ゲル断片として切り出し、この断片から、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）キット（キアゲン，バレンシア，カリフォルニア州）を用いてＤＮＡを精製した。
【００７６】
発現ベクターのｐＹＥＳ６／ＣＴ（インビトロジェン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)，カールスバッド，カリフォルニア州）５μｇを、上述のようにＨｉｎｄIIIとＸｂａＩ（いずれも、ニューイングランドバイオラボ製）で消化し、得られた消化物を、上述のようにアガロースゲル電気泳動で分離した。得られた単一の検出可能な５.８ｋｂフラグメントのバンドを、上述のように切り出して精製した。
【００７７】
得られたルシフェラーゼと直線状にしたｐＹＥＳ６／ＣＴフラグメントを、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），インディアナポリス，インディアナ州）を製造元のプロトコールに従って用いてライゲートし、プラスミドのｐＹＥＳ−ＧＬ３を作製した。
【００７８】
このｐＹＥＳ−ＧＬ３を含むライゲーション混合物を用いて、Ｅ.ｃｏｌｉ細胞（ＵｌｔｒａＭａｘ(R)ＤＨ５α−ＦＴ(R)コンピテント細胞，ライフテクノロジーズ，ロックビル，メリーランド州）を製造元の推奨プロトコールに従って形質転換させた。形質転換された細胞をアンピシリン培地で平板培養し、ｐＹＥＳ−ＧＬ３を含むコロニーを選択した。
【００７９】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）のための強い構成的プロ
モーター（Ｍｕｍｂｅｒｇ等（１９９５年）を参照）を、ｐ４１６ＧＰＤ（ＡＴＣＣ寄託番号８７３６１，Ｍ.Ｆｕｎｋによって寄託された）をＳａｃＩとＨｉｎｄIIIで消化し０.７ｋｂのＤＮＡフラグメントを作製することによって製造した。
【００８０】
ｐＹＥＳ−ＧＬ３中のＳｗａＩクローニング部位を、上述のようにｐＹＥＳ−ＧＬ３をＳｗａＩで消化し、ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ）で３７℃で２時間処理して５’リン酸基を除去することによって、ＳａｃＩに改変した。得られたＤＮＡをキアクイックキット（キアゲン）を用いて精製し、滅菌水１０μｌに再懸濁し、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いてＳａｃＩリンカー（ニューイングランドバイオラボ）にライゲートし、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃプラスミドを作製し、これを、形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ細胞（ＵｌｔｒａＭａｘ(R)ＤＨ５α−ＦＴ(R)コンピテント細胞，ライフテクノロジーズ）から単離した。単離されたｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃを、ＳａｃＩとＨｉｎｄIIIで消化し、Ｐｇａｌ１プロモーターを除去し、０.９７ｋｂのフラグメント（Ｐｇａｌ１プロモーターをコードする）、および、６.５ｋｂのフラグメント（プラスミドをコードする）を得た。
【００８１】
ＳａｃＩ／ＨｉｎｄIIIが両端にあるＧＰＤプロモーターフラグメントを、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いてｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃフラグメントにライゲートし、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドを作製した（図２を参照）。
【００８２】
ＲＳＹ１１２−ｌｕｃ株の製造
２０〜５０マイクロリットルの酵母ＲＳ１１２株の接種材料（米国特許第４,９９７,７５７号の段落３４，４６〜６４行で説明されている）を、ＹＰＤプレートから（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）回収し、滅菌水１ｍｌに再懸濁した。この細胞をマイクロ遠心分離機を用いて１５秒間沈降させ、水を除去した。得られた細胞のペレットを、５０％ＰＥＧ（２４０μｌ）、１Ｍ酢酸リチウム（３６μｌ）、２ｍｇ／ｍｌ一本鎖ＤＮＡ（２５μｌ）、ｐＹＥＳ−ＧＬ２−ＧＰＤプラスミド（５μｌ）１μｇ、および、滅菌水（４５μｌ）からなる形質転換混合物に再懸濁し、４２℃で６０〜１８０分間インキュベートした。形質転換の後、この細胞懸濁液をマイクロ遠心分離機で１５秒間沈降させ、上清を捨てた。得られたペレットを滅菌水２００〜４００μｌに穏やかに再懸濁し、この細胞を、５０μｇ／ｍｌブラスチシジン（インビトロジェン）を含む寒天プレートで平板培養した。３０℃で３日後に、形質転換されたブラスチシジン耐性酵母細胞のコロニーを可視化した。液状媒体中、０.４ｍＭルシフェリン（プロメガ）の存在下で、１つの発光コロニーを選択し、ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞を作製した。
実施例１は、本発明の方法で使用可能な、本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の製造を説明する。
【００８３】
〔実施例２〕
ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞を用いて遺伝毒性物質を同定するための分析
水６００ｍｌに溶解させた酵母窒素原礎培地（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）４ｇ、−Ｌｅｕアミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ，ヒスチジンＨＣｌ１.２ｇ，ウラシル１.２ｇ，これら全て、シグマ−アルドリッチ社製（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ.，セントルイス，ミズーリ州））０.４ｇ、および、デキストロース１２ｇからなるロイシン欠損最小培地（−ＬＥＵ培地）５０ｍＬ中で、ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の接種材料を３０℃で一晩（１７〜２２時間）成長させた。植菌の前に、−ＬＥＵ培地をオートクレーブ処理で滅菌し、ろ過滅菌したアデニンヘミ硫酸塩（２.５ｍｇ／ｍＬ）溶液４ｍＬを添加して、オートクレーブ処理によって失われたアデニンを補給した。得られたＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の培養物を３２０００ＲＰＭで回転沈降させ、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、この細胞を、−ＬＥＵ培地に２×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁し、氷上に置いた。この細胞を、９６ウェルプレート中で、遺伝毒性メチル化物質、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ，シグマ−アルドリッチ社）で、３０℃で１７時間処理した。各ウェルには、細胞懸濁液２００μｌと適切な濃度の試験化合物または媒体とを入れた。処理後に、このプレートを、３２００ＲＰＭで１０分間回転させ、上清を除去した。次に、この細胞を、ＰＢＳ２００μｌで２回洗浄し、超音波発生装置（ブランソン・ウルトラソニック社（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｃｏｒｐ.），ダンベリー，コネチカット州）を用いて５分間再懸濁した。細胞濃度を、コールター・パーティクル・カウンター（コールター社，マイアミ，フロリダ州）を用いて測定し、平板培養に最も適した希釈を決定した。希釈していない培養物についてはＤ0、および、１０倍の連続希釈についてはＤ1〜Ｄ5と指定された細胞懸濁液の希釈液を製造した。細胞懸濁液５０μｌを２組のマルチウェルプレート（例えば、１２、２４または４８ウェルプレート）で平板培養した。復帰突然変異体を検出するための第一の組には、水１０ｍｌに溶解させた酵母窒素原礎培地（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）０.６ｇ、−ｈｉｓアミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ、ロイシン１.８ｇ、ウラシル１.２ｇ，全てシグマ−アルドリッチ社製）０.７ｇ、デキストロース（フィッシャー・サイエンティフィック，フェアーローン，ニュージャージー州）２ｇ、および、寒天（バクトアガー（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ），ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），スパークス，メリーランド州）１.７ｇからなるヒスチジン欠失寒天培地を入れた。細胞生存率を検出するための第二の組には、酵母窒素原礎培地０.６ｇ、＋４アミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ、ヒスチジンＨＣｌ１.２ｇ、ロイシン１.８ｇ、ウラシル１.２ｇ，全てシグマ−アルドリッチ社製）０.４ｇ、デキストロース（フィッシャー・サイエンティフィック）２ｇ、および、寒天（バクトアガー、ベクトン・ディッキンソン）１.７ｇからなる基礎プラス４培地を入れた。平板培養の後、この細胞に、２.４％寒天水溶液５ｍｌ、ＰＢＳ５ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌブラスチシジン１０μｌ、および、０.１Ｍ甲虫ルシフェリン（ｂｅｅｔｌｅ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）４０μｌからなるルシフェリンを含む軟寒天１５０μｌを上塗りした。次に、このプレートを３０℃で約４８時間インキュベートした。生物発光を示す復帰突然変異体または生存する細胞のコロニーを、フォトンカウンティング装置ルミイメージャー（Ｌｕｍｉｍａｇｅｒ Ｆ１，ロシュ・ダイアグノスティックス，インディアナポリス，インディアナ州）を用いて可視化した。
実施例２は、それらの生物発光のレベルに基づく復帰突然変異細胞の数に基づき試験物質の遺伝毒性を決定するために、本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞が試験される本発明の方法を説明する。
【００８４】
ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の寄託
本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞は、２００４年２月１７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、米国バージニア州マナサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に特許寄託番号ＰＴＡ−５８２２として寄託された。
【００８５】
文献
Amacher, D.E. et al.,“Point mutations at the thymidine kinase locus in L5178Y
mouse lymphoma cells. Application to genetic toxicological testing,”Mut. Res. 64:391-406 (1979)；
Ames, B.N.“The detection of chemical mutagens with enteric bacteria,”In Chemical Mutagens：Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, ed., Plenum, New York, 1: 267-282 (1971)；
Ames, B.N.,“Carcinogens are mutagens: their detection and classification,”Environ. Health Perspect. 6: 115-118 (1973);
Ames, B.N. et al.,“Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2281-2285 (1973a)(co-incubation of a carcinogen, a rat or human liver homogenate, and the bacterial tester strain on a petri plate)；
Ames, B.N. et al.,“An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70：782-786 (1973b);
Ames, B.N. et al.,“Methods for detecting carcinogens and mutagens with Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test,”Mutation Res. 31: 347-364 (1975);
Aubrecht, J. et al.,“Carcinogens induce intrachromosomal recombination in human cells,”Carcinogenesis 16(11): 2841-6 (1995);
Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY (2003);
Baum, C. et al.,“An optimized electroporation protocol applicable to a wide range of cell lines,”Biotechniques 17:1058-62 (1994);
Biewenga, J.E. et al.,“Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique,”J. Neuroscience Methods 71:67-75 (1997);
Bishop, A.J.R. and Schiestl, R.H.,“Homologous recombination as a mechanism for genome rearrangement: environmental and genetic effects,”Human Molecular Genetics 9(16): 2427-2434 (2000);
Bollag, R.J, et al.,“Homologous recombination in mammalian cells,”Annu. Rev.
Genet. 23:199-225 (1989).
Bonifacino, J.S., et al., Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, New York NY (2003);
Bosworth, D. et al.,“A forward mutation assay using ampicillin-resistance in Escherichia coli designed for investigating the mutagenicity of biological samples,”Mutagenesis 2 (6): 455-468 (1987);
Bronstein, I. et al.,“REVIEW: Chemilumiescent and Bioluminescent Reporter Gene Assays,”Anal. Biochem. 219:169-181 (1994);
Brooks, T.M.,“The use of a streamlined bacterial mutagenicity assay, the MINISCREEN,”Mutagenesis 10(5): 447-448 (1995);
Brownlee, K.A., Statistical Theory and Methodology, Wiley, New York (1960);
Brummelkamp, T.R. et al.,“A system for stable expression of short interfering
RNAs in mammalian cells,”Science 296: 550-553.
Chu et al.,“Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells
with DNA,”Nucleic Acids Res. 15:1311-26 (1987);
Colbere-Garapin, F., Horodniceanu, F., Kourilsky, P. and Garapin, A.C.,“A new
dominant hybrid selective marker for higher eukaryotic cells,”J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981);
Cote et al (1995),“A miniaturized Ames mutagenicity assay employing bioluminescent strains of Salmonella typhimurium”, Mutation Research, 345, 137-146;
Deng, C. and Capecchi, M.R.,“Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus,”Mol. Cell. Biol. 12:3365-3371 (1992);
【００８６】
Evans, H.J.,“Cytogenetic methods for detecting effects of chemical mutagens,”Ann. N.Y. Acad. Sci., 407:131-41 (1983);
Falck, K., et al.,“Mutascreen(R), an automated bacterial mutagenicity assay,”Mutation Res. 150: 119-125 (1985);
Fenech, M. and Morley, A.A.,“Measurement of micronuclei in human lympocytes,”Mutat. Res., 148: 29-36 (1985);
Fire, A. et al.,“Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans,”Nature 391: 806-811.
Foster, P.L. et al.,“Creation of a test Plasmid for Detecting G.C-to-T.A Transversions by Changing Serine to Arginine in the Active Site of β-Lactamase,”J. Bacteriol. 169(6): 2476-2481 (1987);
Frackman, S. et al.,“Cloning, organization, and expression of the bioluminescence genes of Xenorhabdus luminescens,”J. Bacteriol. 172(10): 5767-5773 (1990);
Galli and Schiestl (1998),“Effects of DNA double-strand and single-strand breaks on intrachromosomal recombination events in cell-cycle-arrested yeast cells,”Genetics, 149, 1235-50;
Gatehouse, D.G. & Delow, G.F.,“The development of a‘Microtitre' fluctuation test for the detection of indirect mutagens, and its use in the evaluation of mixed enzyme induction of the liver,”Mutation Res. 60: 239-252 (1979);
Gee, P. et al.,“Detection and classification of mutagens: A base set of base-specific Salmonella tester strains,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11606-11610 (1994);
Gietz, R.D. and Woods, R.A.,“Transformation of yeast by the LiAc/ss carrier dna/PEG method,”Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002);
Grossblatt, N., Ed.,“Quantitative Relationship Between Mutagenic and Carcinogenic Potencies: A Feasibility Study," Report of the Committee on Chemical Environmental Mutagens, National Academy Press, Washington, DC, 17-26 (1983);
Haworth, S., et al.,“Salmonella mutagenicity results for 250 chemicals,”Environ. Mutagen. 5(Suppl.1): 3-142 (1983);
Hartman, S.C., Mulligan, R.C.,“Two dominant-acting selectable markers for gene transfer studies in mammalian cells,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-8051 (1988);
Hour, T-C. et al.,“A new mutagenicity assay method for frameshift mutagens based on deleting or inserting a guanosine nucleotide in the β-lactamase gene,”Mutagenesis 10 (5): 433-438 (1995);
【００８７】
Jassim, S.A.A. et al.,“In vivo Bioluminescence: A Cellular Reporter for Research and Industry,”J. Biolumin. Chemilumin. 5:115-122 (1990);
Kado, N.Y. et al.,“A simple modification of the Salmonella liquid incubation assay: Increased sensitivity for detecting mutagens in human urine,”Mutat. Res.
112:25-32 (1983);
Kato, H. et al.,“Automation of the Ames test,”in JEMS Abstract 31, published
in Mutation Res. 334: 399 (1995);
Kaufman, R. J., Meth. Enzymology 185:537 (1988)
Lee, C-C. et al.,“A reverse mutagenicity assay for alkylating agents based on
a point mutation in the β-lactamase gene at the active site serine codon,” Mutagenesis 9 (5): 401-405 (1994);
Lichtenstein, P., Holm, N.V., Verkasalo, P.K., Iliadou, A., Kaprio, J., Koskenvuo, M., Pukkala, E., Skytthe, A. and Hemminki, K.,“Environmental and Heritable Factors in the Causation of Cancer,”N. Engl. J. Med., 343:78-85 (2000);
Linney et al., Dev. Biol. (Orlando) 213:207-16 (1999);
Lo, C.W.,“Transformation by iontophoretic microinjection of DNA: multiple integrations without tandem insertions,”Mol. Cell. Biol. 3:1803-14 (1983).
Lowy, I., Pellicer, A., Jackson, J.F., Sim, G.K., Silverstein, S., Axel, R.,“Isolation of transforming DNA：cloning the hamster aprt gene,”Cell. 22: 817-23 (1980);
Maron, D.M. and Ames, B.N.,“Revised methods for the Salmonella mutagenicity test,”Mutation Res. 113: 173-215 (1983);
McCann, J. et al.,“Detection of carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor plasmids,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(3): 979-983 (1975);
McPherson, M.F. and Nestmann, E.R.,“The SIMULTEST approach for testing mutagens in the Salmonella microtitre fluctuation assay,”Environ. Mol. Mutagen. 16: 21-25 (1990);
Monnat, R. J. et al.“Molecular structure and genetic stability of human hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene duplications,”Genomics 13: 788-796 (1992):
Moolton, F.,“Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes thymidine kinase genes: paradigm for a prospective cancer control strategy,”Cancer Res. 46: 5276-5281 (1986);
Mumberg, D. et al.,“Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds,”Gene 156(1): 119-22 (1995);
Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982);
Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:7161-65 (1984);
Prival, M.J. and Mitchell, V.D,“Analysis of method for testing azo dyes for mutagenic activity in Salmonella typhimurium in the presence of flavin mononucleotide and hamster liver S-9,”Mutat. Res. 97:103-116 (1982);
Ray and Gage,“Gene transfer into established and primary fibroblast cell lines：comparison of transfection methods and promoters,”Biotechniques 13:598-603 (1992);
Rasmuson, B., Svahlin H., Rasmuson A., Montell I. and Olofsson H.,“The use of
a mutationally unstable X-chromosome in Drosophila melanogaster for mutagenicity testing,”Mutat. Res. 54(1):33-38 (1978);
Reid, T.M., Morton, K.C., Wang, C.Y., and King, C.M.,“Mutagenesis of azo dyes
following metabolism by different reductive/oxidative systems,”Environ. Mutagen. 6:247-259 (1984);
Robertson et al., Nature 323:445-48 (1986).
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989);
Schiestl, R.H., Igarashi, S. and Hastings, P.J.,“Analysis of the Mechanism for Reversion of a Disrupted Gene,”Genetics 119:237-247 (1988);
Schiestl, R.H.,“Nonmutagenic carcinogens induce intrachromosomal recombination in yeast,”Nature 337(6204): 285-288 (1989);
Scharf, D. et al. Results Probl. Cell Differ. 20:125 162 (1994).
Sommers, C.H., Mackay, W.J., Nalezny, J., Gee, P., Benjamin, M. and Farr, S.B.,“Induction of DEL recombination in the yeast Saccharomyces cerevisiae using a microtiter plate format,”In Vitro and Molecular Toxicology, 11: 37-47 (1995);
Thomas, K.R. and Capecchi, M.R.,“Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells,”Cell 51:503-12 (1987);
Van der Sand, S.T. et al.,“Optimization of a lux gene expression in Saccharomyces cerevisiae as a tool to study gene regulation and plasmid segregation,”J. Bioluminescence and Chemiluminescence 7: 220 (1992);
Waldman, A.S. and Liskay, R.M.,“Dependence of intrachromosomal recombination in mammalian cells on uninterrupted homology,”Mol. Cell. Biol. 8:5350-5357 (1988).
Waleh, N.S., et al.,“Development of a toxicity test to be coupled to the Ames
Salmonella assay and the method of construction of the required strains,”Mutat. Res. 97:247-256 (1982);
Walker, G.C.,“Plasmid (pKM101)-mediated enhancement of repair and mutagenesis: dependence on chromsomal genes in Escherichia coli K-12,”Mol. Gen. Genet. 152(1): 93-103 (1977);
Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.S., Pellicer, A., Cheng, Y. and Axel, R.,“Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells,”Cell. 11: 223-32 (1977);
Wigler, M., Perucho, M., Kurtz, D., Dana, S., Pellicer, A., Axel, R. and Silverstein, S.,“Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-70 (1980);
Wilcox, P. et al.,“Comparison of Salmonella typhimurium TA102 with Escherichia coli WP2 tester strains,”Mutagenesis 5: 285-291 (1990);
Winson, M.K., et al.,“Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs,”FEMS Microbiol. Lett. 163(2): 193-202 (1998);
Wolff S.,“Sister chromatid exchange as a test for mutagenic carcinogens,”Ann. N.Y. Acad. Sci., 407:142-153 (1983);
Xi, L. et al.,“Cloning and nucleotide sequences of lux genes and characterization of luciferase of Xenorhabdus luminescens from a human wound,”J. Bacteriol. 173: 1399-1405 (1991);
Yahagi, T. et al.,“Mutagenicity of carcinogenic azo dyes and their derivatives,”Cancer Lett. 1:91-97 (1975);
Zeiger, E.,“The Salmonella mutagenicity assay for identification of presumptive carcinogens,”in the Handbook of Carcinogen Testing (H.A. Milman and E.K. Weisburger, eds., Noyes Publishers, Park Ridge, N.J.): 83-99 (1985);
Zhang et al.,“Efficient production of single-stranded DNA as long as 2 kb for
sequencing of PCR-amplified DNA,”Biotechniques 15:868-72 (1993);
Zimmer and Gruss, “Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination,”Nature 338:150-153 (1989).
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＤＥＬ組換えのメカニズムを示す。
【図２】ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドのマップである。
【図３】ＤＥＬ組換えを受ける細胞の生物発光検出の原理を示す。
【図４】ＤＥＬ組換え頻度（Ａ部）および生存（Ｂ部）に関するＲＳ１１２ｌｕｃ細胞のメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）処理の作用のグラフ表示である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の生物発光分析、および、それに有用な細胞およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、化学物質の突然変異誘発性の可能性は、物質の発癌性の可能性にほぼ比例することが認められている。Ｇｒｏｓｓｂｌａｔｔ，Ｎ.(１９８３年)。ある種の物質が突然変異誘発性の危険を示すかどうかを早期に決定することは、化学、化粧品、食品添加剤および製薬産業に関する製品開発にとって重要である。
【０００３】
突然変異誘発物質は、突然変異（すなわち生物の遺伝物質における検出可能で遺伝性の構造変化）の割合の増加を引き起こす物質である。このような変化としては、染色体全体の付加または欠失、染色体の構造変化（例えばトランスロケーション）、および、ゲノム配列の一部の構造変化（例えば、点突然変異、複数の連続するヌクレオチドの突然変異、および、ゲノム配列の部分的な欠失）が挙げられる。突然変異誘発性の変化は、遺伝子の作用にダメージを与えるか、または別の方法で妨害することができるので、突然変異誘発物質は、遺伝毒性物質、すなわち遺伝子にとって毒性の物質とみなされている。
【０００４】
突然変異誘発物質を検出するための広く知られているインビトロ試験は、エイムス（Ａｍｅｓ）分析である。この試験は、ヒスチジン依存性のサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）試験菌株における突然変異の逆戻り、それによる、それらの自身のヒスチジンを生産する細胞の能力を復元させる物質の能力を測定するものである（Ａｍｅｓ等，１９７３ａ，１９７３ｂおよび１９７５；また、Ａｍｅｓ，Ｂ.Ｎ.，１９７１年も参照）。エイムス分析に類似した、サルモネラ株（Ｌｅｅ，Ｃ−Ｃ，等，１９９４年、および、Ｈｏｕｒ，Ｔ−Ｃ．等，１９９５年）、および、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ，Ｄ.等，１９８７年；および、Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ.Ｌ.等，１９８７年）におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子の逆突然変異によるアンピシリン耐性の回復を測定する方法が開発されている。このような試験はいずれも、１個のヌクレオチドのその他のヌクレオチドでの置換、または、配列のフレームシフトを引き起こすヌクレオチド挿入または欠失のいずれかによって、単一のヌクレオチド逆突然変異による突然変異誘発物質を検出する菌株を用いる。
【０００５】
エイムス型の分析の改変法が報告されており、例えば、Ｙａｈａｇｉ，Ｔ.等(１９７５年)；Ｐｒｉｖａｌ，Ｍ.Ｊ.およびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｖ.Ｄ.(１９８２年)；Ｈａｗｏｒｔｈ，Ｓ.等(１９８３年)；Ｋａｄｏ，Ｎ.Ｙ.，等(１９８３年)；および、Ｒｅｉｄ，Ｔ.Ｍ.等(１９８４年)；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.）(２０００年)，第３章．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｄｄｕｃｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，第３章 Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ユニット３.１ Ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ａｍｅｓ）Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ １：Ｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｗｉｔｈ Ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ２：Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｖｏｌａｔｉｌｅ Ｌｉｑｕｉｄｓ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ３：Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｇａｓｅｓ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
４：Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｓｓａｙ；Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ５：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｋａｄｏ）Ｍｉｃｒｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
Ａｓｓａｙで報告されている。これらの改変法は、一般的に、用いられる試験物質の量
を最小化すること、および、分析の速度と作業効率を高めることを目的としている。
【０００６】
共に譲渡された米国特許出願番号１０／０２９,７４１は、新規のエイムス型の分析を開示しており、この分析は、特に、細菌細胞と、試験物質および外因性の代謝活性化系とを接触させることを含み、ここにおいて、この細菌細胞は、発現可能な異種ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（またはオペロン）を含み、さらに、突然変異していない形態で細胞が選択的培地中で代謝的に活性になることにおいて機能化されることが重要なポリペプチドをコードする遺伝子における可逆的な点変異を含む。
【０００７】
突然変異誘発物質を同定するためのさらなる方法が説明されており、例えば、点突然変異のための、マウスリンパ腫系（Ａｍａｃｈｅｒ等(１９７９年)）；染色体異常および姉妹染色分体の変換のための、チャイニーズハムスター卵巣系（Ｅｖａｎｓ(１９８３年)およびＷｏｌｆｆ(１９８３年)）；小核分析（ＦｅｎｅｃｈおよびＭｏｒｌｅｙ(１９８５年)）；および、ショウジョウバエ変異誘発分析（Ｒａｓｍｕｓｏｎ等(１９７８年)）が挙げられる。
【０００８】
Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）は、酵母、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における染色体内組換えに関する正の選択系を報告しており、これは、一方の３’末端と他方の５’末端において末端が欠失している遺伝子の２つのコピーを生産するＨＩＳ３遺伝子座におけるＨＩＳ３遺伝子の内部フラグメントを含むプラスミドの組み込みによる。
Ｓｏｍｍｅｒｓ等（１９９５年）は、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）によって説明された染色体内組換え系のための自動化方法を報告しており、これは、マルチウェルプレートを利用し、マイクロウェル波動方法を用いて逆突然変異の頻度を測定する。
Ｃｏｔｅ等（１９９５年）は、サルモネラ・チフィムリウムの生物発光株を用いたエイムス突然変異誘発分析を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在のところ利用可能な試験物質の突然変異誘発性の可能性を評価する方法、特にエイムス試験は、有用かつ重要な機能を提供してきたが、それにもかかわらず、可能性のある突然変異誘発性の信頼性のある的確な評価を、比較的速く経済的な手段で提供する新しい方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一形態において、物質を試験する方法に関し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を試験物質で処理すること、および、適切な選択培地の存在下で、細胞からの生物発光のレベルを測定することを含む。
【００１１】
本発明のその他の形態は、物質を試験する方法を提供し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、前記真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること；および、真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定することを含む。
【００１２】
本発明のさらなる形態は、物質を試験する方法を提供し、本方法は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、前記真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること；適切な選択培地の存在下で、処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、適切な選択培地の存在下で真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、並びに以下から選択されるカテゴリー、すなわち、前記選択培地の存在下における前記未処理部分と比較して、前記処理部分の生物発光を
示す細胞の数を増加させる物質；および、前記選択培地の存在下における前記未処理部分と比較して、前記処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させない物質から選択されたカテゴリーに従って、試験物質を特徴付けることを含む。
【００１３】
本発明の追加の形態は、ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を提供する。
本発明の方法の形態の好ましい実施態様において、前記生物発光の増加は、前記未処理部分と比較して統計学的に有意である。
本発明の方法の形態のさらなる好ましい実施態様において、前記生物発光を示す細胞の増加は、前記未処理部分と比較して少なくとも２倍である。
本発明の方法の形態のその他の好ましい実施態様において、前記真核細胞は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導され、好ましくはサッカロミセス・セレビジエの細胞から誘導される。
【００１４】
本発明の細胞の形態の好ましい実施態様において、前記真核細胞は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導され、好ましくはサッカロミセス・セレビジエの細胞から誘導され、より好ましくはサッカロミセス・セレビジエＲＳ１１２−ｌｕｃ株の細胞から誘導される。
【００１５】
〔図面の簡単な説明〕
本発明のさらなる理解、同様に、それらのその他の目的とさらなる特徴のために、以下のそれらの様々な好ましい実施態様の詳細な説明について添付の図面と合わせて説明する：
図１は、ＤＥＬ組換えのメカニズムを示す。ＤＥＬ組換えは、ＤＮＡ二本鎖の破断によって開始され、これは、一本鎖のアニーリングによって修復される。これにより、介在配列（Ｌｅｕ）を用いた複製された対立遺伝子の欠失と、野生型Ｈｉｓ３マーカーの復元が起こる。
【００１６】
図２は、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドのマップであり、ルシフェラーゼ遺伝子、ｌｕｃ＋、構成的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターを示し、ｐＹＥＳ６／ＣＴ主鎖のベクター、細菌および酵母の複製起点（それぞれｐＵＣｏｒｉおよび２μ）、および、ブラスチシジンおよびアンピシリン耐性遺伝子由来である。
【００１７】
図３は、ＤＥＬ組換えを受ける細胞の生物発光検出の原理を示す。細胞は、ＤＥＬマーカーの組換えによって選択培地で生存できるようになる。生存する細胞のみが代謝的に活性であり、生物発光の表現型を維持するのに十分なＡＴＰを生産する。
【００１８】
図４は、ＤＥＬ組換え頻度（Ａ部）および生存（Ｂ部）に関するＲＳ１１２ｌｕｃ細胞のメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）処理の作用のグラフ表示である。
【００１９】
〔発明の詳細な説明〕
本明細書で用いられる用語は、それらの当業界において一般的な意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするためと、便宜上、本明細書（実施例や添付の請求項を含む）で用いられている所定の用語および成句の意味は、以下に示す通りである。
【００２０】
「生物発光」は、生きている細胞における光の放出を意味しており、ここにおいて光の放出は、代謝活性に依存しており、それに対応するものである（例えば図３を参照）。
「生物発光マーカー」は、細胞に取り込ませて発現させる場合、細胞の代謝活性の際に生物発光を引き起こすヌクレオチド配列を意味する。
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味し、コード配列の前の調節配列（５’非コード配列）と、後の調節配列（３’非コード配列）を含む。用語「遺伝子」は、ゲノム中の天然の位置に存在する内因性遺伝子、または、宿主生物中に通常は見出されないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される外来遺伝子を含む。
【００２１】
「突然変異誘発物質」は、突然変異の割合の増加を引き起こす物質である。突然変異誘発物質は、遺伝子の作用にダメージを与えるか、または別の方法で妨害することによって遺伝毒性作用を有する可能性がある。
「突然変異」は、生物の遺伝物質における検出可能で遺伝性の構造変化であり、例えば、染色体全体の付加または欠失、染色体の構造変化（例えばトランスロケーション）、および、ゲノム配列の一部の構造変化（例えば、点突然変異、複数の連続するヌクレオチドの突然変異、および、ゲノム配列の部分的な欠失）が挙げられる。
【００２２】
「ＤＥＬ選択マーカー」は、破壊された遺伝子配列を意味し、ここにおいて：（１）上記破壊は、遺伝子配列内へのヌクレオチド配列の挿入を含み；（２）前記ヌクレオチド配列は、遺伝子配列の一部の１つの複製を含み；（３）前記ヌクレオチド配列の複製された部分の頭から尾（すなわち、５’末端から３’末端）の方向は、遺伝子配列の方向と同じであり；および（４）遺伝子配列は、適切な選択培地で成長させた場合、細胞表現型の選択に有用である。ＤＥＬ選択マーカーの様々な実施態様を、以下で説明する。
【００２３】
「選択培地」は、細胞の表現型の選択に用いることができる組成物を意味する。例えば、ヒスチジンを生産することができる酵母細胞を選択的にスクリーニングするためには、ヒスチジンが欠損した栄養組成物を用いることができる。ｎｅｏ耐性遺伝子を有する細胞を選択的にスクリーニングするためには、抗生物質Ｇ−４１８を含む栄養組成物を用いることができる。
「適切な選択培地」は、ＤＥＬ選択マーカーに関して用いられる場合、ＤＥＬ選択マーカーの遺伝子配列に基づく細胞の表現型の選択に用いることができる組成物を含む選択培地を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる略語は、それらの当業界において一般的な意味を有する。しかしながら、本発明をさらに明確にするためと、便宜上、所定の略語の意味は、以下に示す通りである：
「℃」は、セ氏温度を意味し；「μＬ」は、マイクロリットルを意味し；「ＡＴＣＣ」は、バージニア州マナサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を意味する（ウェブサイト：www.atcc.org）；「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味し；「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミンテトラ酢酸を意味し；「ｇ」は、グラムを意味し；「ｋｇ」は、キログラムを意味し；「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し；「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し；「ｍＭ」は、ミリモルを意味し；ＭＭＳは、メタンスルホン酸メチルを意味し；「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し；「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を意味し；「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味し；および「ＲＰＭ」は、毎分回転数を意味する。
【００２５】
環境要因は、ガンの原因に関連する。実際に、環境要因の役割は、遺伝よりも緊密なガンとの因果関係を有する可能性もある（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ等(２０００年)）。結果として、発ガン性物質であることがわかっているか、またはその疑いがある天然化学物質および人工の化学物質を同定し、それらとヒトとの接触を少なくする努力がなされてきた。
【００２６】
上述したように、化学物質の発癌性の可能性は、一般的に、その突然変異誘発性によって少なくとも部分的に予想可能であるとみなされている。Ｇｒｏｓｓｂｌａｔｔ，Ｎ.(１９８３年)。そのために、化学、化粧品、食品添加剤および製薬産業のような産業で、それらの製品の発癌性の危険を、それらの突然変異誘発性の特性を最小化することによって緩和することが可能となってきた。
【００２７】
ＤＥＬ分析はまた、染色体内組換え分析としても知られており、最初に、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）によってサッカロミセス・セレビジエを用いて説明されており、ここにおいて、標的とする遺伝子配列において誘導されたゲノム配列の一部の欠失を突然変異誘発物質によって測定する。従って、この分析は、試験化合物の突然変異誘発性の可能性に関する評価が可能である。
【００２８】
ＤＥＬ分析で用いられる標的遺伝子配列は、外因性ＤＮＡフラグメントの組み込みによって機能が破壊されている遺伝子である。例えば、Ｓｃｈｉｅｓｔｌｅ等（１９８８年）は、ＨＩＳ３遺伝子が外因性ＤＮＡフラグメントの組み込みによって破壊されている「ＲＳＹ６」と命名されたＳ．セレビジエ株（ＡＴＣＣより入手可能，寄託番号２０１６８２）の使用を説明している。得られたｈｉｓ−酵母株は、その増殖培地において成長するためにヒスチジンを必要とする。ヒスチジン非含有培地において、自発的にｈｉｓ＋に復帰する細胞は極めて少数であると予想される。しかしながら、細胞が突然変異誘発物質で処理されると、逆突然変異速度は、通常のバックグラウンドレベルを超えて増加する。
【００２９】
図１で、ＤＥＬ分析の機能について提唱されているメカニズムが説明されている（ＧａｌｌｉおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ（１９９８年））。図１に示されるように、突然変異誘発物質は、二本鎖ＤＮＡの破断の形成を引き起こす。このような破断が破壊された遺伝子で起こった場合、細胞自身の修復メカニズムにより、外因性ＤＮＡの除去、および、一本鎖アニーリングを介した配列の修復を起こし、それによって遺伝子がその野生型に逆突然変異する可能性がある。
【００３０】
ＤＥＬ分析は、その他の突然変異誘発性分析よりも確かな利点を有する。例えば、ＤＥＬ分析は、より一般的に使用されるサルモネラ逆突然変異エイムス分析よりも優れた発癌性の予測精度を有することが報告されている。エイムス分析を用いると陰性の結果が得られる発癌性化合物の多くが、ＤＥＬ法では陽性である。（ＢｉｓｈｏｐおよびＳｃｈｉｅｓｔｌ(２０００年)）。
【００３１】
しかしながら、現在のところ利用可能なＤＥＬ分析の一つの不利点は、可能性のある突然変異誘発物質の大規模で自動化されたスクリーニング（すなわち、ハイスループットスクリーニング）における非実際性である。例えば、現状の分析では、試験化合物が可能性のある発癌性物質であるかどうかを決定するために、目視できるコロニーまで成長できるような十分な時間を細胞に与えることが必要である。その上、成長するコロニーを可視化する必要があるために、現状の分析では、例えば必要な試験物質の量を減少させることが可能なマルチウェルプレートシステムに小型化することができない。
【００３２】
本発明は、一形態において、ＤＥＬ組換え現象のような突然変異誘発性の正の指標として生物発光を使用するＤＥＬタイプの方法の発見に基づいている。本発明によれば、これまで利用不可能であった様式で、未知の発癌性を有する可能性のある物質を、ＤＥＬ組換えに関して迅速かつ経済的に試験することが可能である。
【００３３】
本発明は、一成分として、生物発光マーカーを含み、同様に、破壊されたＤＥＬタイプの選択マーカーを含む細胞の使用に関与する。生物発光マーカーは、ＤＥＬ組換えの結果として野生型の表現型に復帰した細胞の極めて初期の検出を可能にする。選択培地で成長
させた復帰突然変異細胞における生物発光は、非復帰突然変異体と比較すれば、それらの代謝活性の結果として発生する（図３を参照）。十分に高感度の検出手段が利用可能な場合、本発明の方法は、試験物質で処理した後極めて迅速に、個々の細胞の復帰突然変異体またはこれらの細胞微小コロニーの検出を可能にする。これは、検出を可能にするために細胞を大きなコロニーに成長させる必要性を不要にすると予想される。
【００３４】
現在のところ利用可能なＤＥＬ分析に比べると、本発明の復帰突然変異細胞の生物発光の検出に基づく方法および細胞は、小型化された物質試験システム（例えばマルチウェルプレートを使用するシステム）の使用が可能である。本発明の方法および細胞は、突然変異誘発性の試験に必要な試験物質の量を顕著に減少させることが可能である。これは、試験物質がほんの少量しか利用できない場合に顕著な利点となり得る。加えて、生物発光の使用は、生物発光シグナルの迅速かつ正確な検出のための、高感度の装置（例えばＣＣＤチップベースのフォトンカウンティングカメラ）の使用を可能にする。
【００３５】
当業者であれば本発明の開示に基づき明白であるが、本発明の実施においてあらゆる適切な真核細胞が使用可能である。例えば、上記細胞は、脊椎動物（例えば哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類および両生類）由来、同様に、無脊椎動物（例えば、昆虫、線虫）由来、および、単細胞真核生物由来のものが挙げられる。多細胞真核生物については、上記細胞は、血液、内皮、胸腺、脾臓、骨髄、肝臓、腎臓、心臓、精巣、卵巣、心臓および骨格筋などのあらゆる臓器または組織から誘導されたものでもよいし、一次細胞でも、または、不死化細胞系から誘導された細胞でもよい。好ましい細胞としては、ヒトのリンパ芽球様細胞系、例えばＧＭ６８０４（例えば、Ｍｏｎｎａｔ，Ｒ.Ｊ.等(１９９２年)、および、Ａｕｂｒｅｃｈｔ，Ｊ.等(１９９５年)を参照）、および、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビジエ属の酵母細胞が挙げられる。
【００３６】
本発明の方法に使用するための細胞および細胞系は、例えば、ＡＴＣＣ（マナサス，バージニア州２０１１０−２２０９）から得てもよい。
【００３７】
上記で定義したように、ＤＥＬ選択マーカーは、破壊された遺伝子配列を意味し、ここにおいて：（１）上記破壊は、遺伝子配列内のヌクレオチド配列の挿入を含み；（２）前記ヌクレオチド配列は、遺伝子配列の一部の１つの複製を含み；（３）前記ヌクレオチド配列の複製された部分の頭から尾（すなわち、５’末端から３’末端）の方向は、遺伝子配列の方向と同じであり；および、（４）遺伝子配列は、細胞の表現型の選択に有用である。
【００３８】
例えば、遺伝子配列に要素Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇが含まれる場合、このような遺伝子配列に基づく適切なＤＥＬ選択マーカーは、配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ、および、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ｘ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ（ここにおいて、Ｘは、それ自身が、破壊の取り込みが成功した形質転換細胞を選択するために用いることができる選択マーカーである）を包含していてもよい。
【００３９】
当業者であれば当然であるが、本発明の開示に基づき、本発明の実施において、ＤＥＬ選択マーカーに適切なあらゆる表現型の選択マーカーが使用可能である。さらに当然ながら、用いられる選択マーカーのタイプは、一形態において、本発明の実施で用いられる細胞のタイプに応じて様々であり得る。
【００４０】
本発明の一実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーは、破壊の結果として細胞が生存、代謝活性または成長を維持するために特定の栄養素が必要になるように栄養マーカー遺伝子の機能の破壊を含む。この実施態様において、栄養マーカーの非破壊型への逆突然変異を引き起こすことによって、細胞がそれに対応する栄養素が欠失した培地で増殖すること
を可能にする能力に関して物質を試験してもよい。典型的な栄養マーカーとしては、酵母細胞の場合、細胞のヒスチジン要求性を改変するｈｉｓ３が挙げられる。その他の栄養マーカーは、本発明の開示に基づき当業者には明白であると予想される。
【００４１】
その他の実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーは、細胞にとって毒性でしかない（すなわち、生存、代謝活性または成長を妨害する）と予想される特定の物理的な物質または化学物質に対する耐性を運搬する遺伝子である。このような「耐性マーカー」は、抗生物質、代謝拮抗物質または除草剤などの化学物質に対する耐性を細胞に与えるものである。耐性マーカー遺伝子の機能の破壊は、毒性物質に晒された場合に細胞に毒性を引き起こす。そのようなものとして、この実施態様は、遺伝子の非破壊型への逆突然変異を引き起こすことによって、細胞が毒性物質を含む培地で増殖することを可能にする能力に関して物質を試験することを含む。典型的な耐性マーカーとしては、以下が挙げられる：ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、これはメトトレキセート耐性を付与する；ｎｅｏ、これは、アミノグルコシド系、ネオマイシン、および、Ｇ−４１８耐性を付与する；および、ａｌｓおよびｐａｔ、これは、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ.等(１９８０年)；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ.等(１９８１年)を参照）。その他の耐性マーカーは当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。
【００４２】
この開示に基づき当業者には明白と予想されるが、本発明の範囲内で、ＤＥＬ選択マーカーはまた、二次的な遺伝学的要素で制御可能な非破壊型の栄養マーカーまたは耐性マーカーを包含していてもよく、ここにおいて、上記二次的な遺伝学的要素の機能は、破壊されている。このような二次的な遺伝学的要素としては、活性化ドメインに結合することによって、栄養マーカーまたは耐性マーカーの転写を開始させるか、またはその速度を促進する転写活性化タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。従って、この実施態様によれば、二次的な遺伝学的要素のその機能的な形態への逆突然変異を引き起こすことによって、栄養マーカーまたは耐性マーカー遺伝子の発現を可能にする能力に関して、物質を試験してもよい。典型的な転写活性化因子および活性化ドメイン配列の組み合わせとしては、ＢＤ(R)Ｔｅｔ−Ｏｆｆ遺伝子発現系（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），パロアルト，カリフォルニア州）の一部であるＴｅｔ調節性転写活性化因子が挙げられる。その他の転写活性化因子および活性化ドメイン配列は当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。
【００４３】
当業者には本発明の開示に基づきさらに当然と予想されるが、ＤＥＬ選択マーカーはまた、転写抑制因子の遺伝学的要素によって制御可能な非破壊型の負の選択マーカー遺伝子を包含していてもよく、ここにおいて、転写抑制因子の機能が破壊されている。負の選択マーカーは、活性な場合、細胞にとって毒性である。従って、このような実施態様によれば、転写抑制因子のその機能的な形態への逆突然変異を引き起こすことによって、負の選択マーカー遺伝子の発現を可能にする能力に関して、物質を試験してもよい。典型的な負の選択マーカーは、単純疱疹ウイルス遺伝子、チミジンキナーゼであり、これは、薬物、ガンシクロビルの存在下で細胞毒性を引き起こす（Ｍｏｏｌｔｏｎ(１９８６年)）。その他の負の選択マーカーとしては、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニン、または、６−チオキサンチンの存在下で細胞毒性）、および、ジフテリア毒素、リシン毒素、および、シトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシンの存在下で細胞毒性）が挙げられる。
【００４４】
転写抑制因子の遺伝学的要素は、発現された場合、負の選択マーカーの発現を抑制すると予想される。典型的な転写抑制因子は、例えばＦｉｒｅ等（１９９８年）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ等（２００２年）で説明されている方法を用いて、および、当業者既知のその他の方法で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を介する。
【００４５】
当業者には本発明の開示に基づき明白と予想されるが、本発明の方法および細胞で用いられるＤＥＬ選択マーカーを構成する破壊された遺伝子または遺伝学的要素は、内因性の遺伝子または遺伝学的要素であってもよいし、または、本発明の開示に基づき当業者周知の組換え方法によって前駆細胞に導入された外因性の遺伝子または遺伝学的要素であってもよい。その上、本発明で用いられる細胞は、一倍体（各タイプの染色体の１つのコピーを有する）、または、二倍体（各タイプの染色体の２つのコピーを有する）のいずれでもよい。従って、本発明の方法および細胞で二倍体細胞が用いられ、ＤＥＬ選択マーカーを構成する破壊された遺伝子または遺伝学的要素が、内因性遺伝子または遺伝学的要素である場合、または、それ以外に内因的に存在する遺伝子または遺伝学的要素の２以上のコピーが存在する場合、本発明の方法の実施および細胞の使用のために前記遺伝子または遺伝学的要素の全てのコピーを崩壊させることが好ましい。
【００４６】
好ましい実施態様において、サッカロミセス・セレビジエ酵母細胞で使用するためのＤＥＬ選択マーカーは、ＨＩＳ３遺伝子を含み、これは、Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等（１９８８年）で説明されているようにプラスミドｐＲＳ６の挿入によって破壊されており、さらに、米国特許第４,９９７,７５７号で説明されているように、Ｓ.セレビジエＲＳＹ６株およびＲＳ１１２株に含まれている。
【００４７】
当業者であれば当然であるが、本発明の開示に基づき、本発明の実施においてあらゆる適切な生物発光マーカーが使用可能である。さらに当然ながら、用いられる生物発光マーカーのタイプは、一形態において、本発明の実施で用いられる細胞のタイプに応じて様々であってよい。酵母細胞に使用するための典型的な生物発光マーカーは、ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子であり（ＧｅｎｅＢａｎｋ(R)登録番号ＡＡＡ８９０８４）、これは、構成的なグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーターによって作動する。Ｍｕｍｂｅｒｇ，Ｄ.等（１９９５年）。ｌｕｃ遺伝子によって触媒された生物発光は、基質（ルシフェリン）と、内因性ＡＴＰの形態のエネルギーとを必要とする。細胞が成長している培地に補助物質としてルシフェリンが含まれる限り、酵母細胞の生物発光はもっぱら細胞内ＡＴＰの利用可能性に依存する。細胞内ＡＴＰ濃度はエネルギー代謝に依存するため、生物発光の生産高は、酵母細胞の代謝活性のレベルを示す。本発明の方法において、欠失組換え現象を引き起こしてＤＥＬ選択マーカーの機能を回復させる試験化合物によって、細胞は、該当する栄養素の非存在下で、または、細胞毒性を有する可能性のある物質の存在下で代謝活性を維持し増殖することが可能である（図３を参照）。
【００４８】
本発明の方法および細胞で使用可能なその他の生物発光マーカーは当業者既知であるか、または、本発明の開示に基づき当業者には明白と予想される。例えば、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ等（１９９４年）は、本発明で使用可能な生物発光マーカーを説明している。
【００４９】
本発明の方法および細胞で用いられる生物発光マーカーおよびＤＥＬ選択マーカーは、このようなマーカーをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することによって細胞に取り込ませることもできる。このようなベクターは、細胞の染色体ＤＮＡに安定して取り込まれるように設計してもよいし、または、染色体へ組み込まなくても適用できるマーカーが発現されるように設計してもよい。
【００５０】
細胞に挿入されたコード配列の転写および翻訳制御に必要な要素を含む発現ベクターを用いて、試験物質での処理後に、逆突然変異の際に生物学的に活性になると予想される生物学的に活性な生物発光マーカーまたはＤＥＬ選択マーカーを細胞に取り込ませてもよい。転写および翻訳調節要素としては、調節配列、例えばエンハンサー、構成的および誘導性プロモーター、ならびに、適用可能なマーカーをコードするベクターやポリヌクレオチド配列中の５’および３’非翻訳領域が挙げられる。このような要素は、それらの強度や特異性の点で様々なものが可能である。また、上記マーカーをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグナルを用いてもよい。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン、および、隣接する配列、例えばコザック配列が挙げられる。マーカーおよびその開始コドンならびに上流調節配列をコードする配列が適切な発現ベクターに挿入されている場合、追加の転写または翻訳制御シグナルが必要ないこともある。しかしながら、コード配列またはそれらのフラグメントしか挿入されていない場合、インフレームのＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳制御シグナルがベクターによって提供されるべきである。外因性翻訳要素および開始コドンは、様々な由来のものが可能であり、天然でも合成でもよい。発現効率は、用いられる特定の宿主細胞系に適したエンハンサーを含ませることによって強化することもできる（例えば、Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ.等(１９９４年)を参照）。
【００５１】
本発明の開示に基づき当業者周知の方法を用いて、生物発光マーカーおよびＤＥＬ選択マーカー、ならびに、適切な転写および翻訳調節要素をコードする配列を含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、および、インビボでの遺伝子組換えが挙げられる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.等(１９８９年)，第４，８および１６〜１７章；Ａｕｓｕｂｅｌ等(２００３年)，９，１３および１６を参照）。
【００５２】
本発明のＤＥＬ選択マーカーが内因性遺伝子の破壊に関与する実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーを組み込む好ましい方法は、相同組換えによるものである。操作された遺伝子コンストラクトを細胞の染色体ＤＮＡに組み込むための相同組換え方法は当業者周知であり、および／または、当業者には本発明の開示に基づきさらに明白であると予想される。
【００５３】
ＤＥＬ選択マーカーを含む細胞の製造において、ＤＥＬ選択マーカー標的化ベクターは、非破壊型の標的遺伝子を有する細胞に導入される。導入されたベクターは、標的遺伝子に相同なベクター中のヌクレオチド配列を用いて上記遺伝子を標的とする。この相同配列が、ベクターと標的遺伝子の配列とのハイブリダイゼーションを容易にする。ハイブリダイゼーションは、交差現象を介してベクター配列の標的遺伝子への組み込みを起こし、標的遺伝子の破壊を発生させる。
【００５４】
標的化に用いられるベクターの構築に関する一般的な原理は、Ｂｒａｄｌｅｙ等（１９９２年）に総論されている。本発明の説明に基づき相同組換えに有効な配列の選択および使用に関する指針は、文献で説明されている（例えば、ＤｅｎｇおよびＣａｐｅｃｃｈｉ(１９９２年)；Ｂｏｌｌａｇ等(１９８９年)；ならびに、ＷａｌｄｍａｎおよびＬｉｓｋａｙ(１９８８年)を参照）。
【００５５】
当業者であれば本発明に基づき理解できると思われるが、多種多様のクローニングベクターが、本発明のＤＥＬ選択マーカー標的化ベクターの構築において、ベクター主鎖として使用可能であり、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋１１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢＫファージミド、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、および、ｐＲＩＴ５ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、および、ｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２、および、ｐＢＲ３２２ベースのベクター、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージＣｈａｒｏｎ２８、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫ１９関連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、および、ｐＧＥＭシリーズのプラスミドである。これらのベクターは、多種多様な商業的な供給源より入手可能である（例えば、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），インディアナポリス，インディアナ州；キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ），バレンシア，カリフォルニア州；ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州；および、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ），ビバリー，マサチューセッツ州）。しかしながら、望ましい宿主中で複製可能で生存可能でさえあれば、その他のあらゆるベクター、例えばプラスミド、ウイルス、またはそれらの部分も使用可能である。また、このようなベクターは、ゲノムを改変する予定の宿主細胞中でそれらの複製を可能にする配列を含んでいてもよい。このようなベクターの使用によって、組換えが起こっている最中の相互作用期間を延長させることができ、そのため、標的化効率を高めることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ等(２００３年)，ユニット９.１６，図９.１６.１を参照）。
【００５６】
本発明の標的化ベクターを増殖させるために用いられた具体的な宿主細胞は、重要ではない。例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖａｒ等(１９７７年)）、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２ＨＢ１０１(ＡＴＣＣ番号３３６９４)、Ｅ.ｃｏｌｉ ＭＭ２１（ＡＴＣＣ番号３３６７８０）、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ１（ＡＴＣＣ番号３３８４９）、Ｅ.ｃｏｌｉ
ＤＨ５α株、および、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＴＢＬ２が挙げられる。あるいは、Ｃ.セレビジエ（Ｃ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または、Ｂ.ズブチリス（Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような宿主細胞を用いてもよい。上述の典型的な宿主、同様に、その他の適切な宿主は、市販されている（例えば、ストラタジーン，ラホヤ，カリフォルニア州；および、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ロックビル，メリーランド州）。
【００５７】
好ましくは、標的遺伝子を破壊するための標的化コンストラクトとしては、耐性マーカータンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列も挙げられる。様々な可能性のあるＤＥＬ選択マーカーのタイプに関して上述したように、耐性マーカーは、細胞にとって毒性でしかないと予想される特定の物理的な物質または化学物質に対する耐性を運搬する。耐性マーカー遺伝子は、交差現象に続いて耐性マーカー遺伝子が標的遺伝子に統合するように、耐性マーカー遺伝子が組み込みの後に発現できるような位置に置かれるような様式で、２つの端にある相同性領域間に位置する。選択可能な条件を与えることによって、ベクター配列の統合がうまくいかなかったその他の細胞から、耐性マーカーをコードするベクター配列を安定して発現する細胞を生存に基づいて単離することが可能である。
【００５８】
上述の耐性マーカーを使用すると、標的化された相同組換えによってベクターが標的遺伝子の遺伝子座に統合された細胞と、染色体のあらゆる位置へのランダムな非相同的なベクター配列の組み込みによる細胞とが区別されない。それゆえに、本発明の細胞を作製するための相同組換え用の置換ベクターを用いた場合、負の選択マーカータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことも好ましい。ＤＥＬ選択マーカーの様々な可能性のあるタイプに関して上述したように、負の選択マーカーは、発現されると細胞にとって毒性のタンパク質である。負の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、置換ベクターの２つの相同領域の外側に位置する。この位置付けであれば、組み込みがランダムな非相同組換えによって発生した場合、細胞は、負の選択マーカーだけを統合し安定してそれを発現すると予想される；すなわち、標的化コンストラクトにおける標的遺伝子と２つの相同領域との相同組換えは、負の選択マーカーをコードする配列を組み込みから排除する。従って、負の条件を与えることによって、ランダムな非相同組換えによって標的化ベクターを統合した細胞は、生存能力を失う。
【００５９】
上記生物発光マーカーおよび／またはＤＥＬ選択マーカー（またはそれらの標的配列）を含むベクターは、当業者周知の標準的な方法、または、本発明の開示に基づき当業者に
は明白と予想される方法に従って細胞に導入されていてもよい。当業者には明白と予想されるが、選択される形質転換プロトコールは、例えば対象の遺伝子の細胞型や性質に依存すると予想され、慣例的な実験に基づき選択することができる。数種の形質転換プロトコールが、Ｋａｕｆｍａｎ（１９８８年）に総論されている。方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、遺伝子銃、リポソームトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、または、トランスファーインフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が挙げられる（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ等（１９８２年）；Ｐｏｔｔｅｒ等（１９８４年）；Ｃｈｕ等（１９８７年）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８７年）；Ｂａｕｍ等（１９９４年）；Ｂｉｅｗｅｎｇａ等（１９９７年）；Ｚｈａｎｇ等（１９９３年）；ＲａｙおよびＧａｇｅ（１９９２年）；Ｌｏ（１９８３年）；Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ等（１９９８年）；Ｌｉｎｎｅｙ等（１９９９年）；ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ，（１９８９年）；および、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等（１９８６年）を参照）。本発明の実施において外来ＤＮＡを酵母細胞に導入するための好ましい方法は、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年）で説明されているように、酢酸リチウム／ＰＥＧの使用を含む。
【００６０】
本発明の方法の実施で用いることができる細胞は、本発明の開示に基づき、当業者周知の方法に従って、保存および培養してもよい。例えば、哺乳動物細胞は、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ等（２００３年），第１章で説明されている方法に従って培養してもよい。酵母細胞は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００３年），第１３章で説明されている一般的な方法に従って培養してもよい。
【００６１】
本発明の実施方法において、細胞の試験物質での処理は、本発明の開示に基づき、当業者既知の方法に従って用いることもできる。用いられる方法は、用いられる細胞のタイプ、ＤＥＬ選択マーカーおよび生物発光マーカーの特徴、ならびに、用いられる試験物質の特徴などの多くの変数に応じて様々であると予想される。
【００６２】
一実施態様において、ＤＥＬ選択マーカーとしてｈｉｓ遺伝子の破壊を有する酵母細胞（サッカロミセス・セレビジエ）を、９６ウェルプレート中で約１７時間、約３０℃で、試験物質で処理する。処理の後、この細胞を洗浄し（例えばＰＢＳで）、超音波破砕して、単一の細胞の懸濁液への細胞の分離を確実にする。次に、この細胞を、適切な希釈で、ヒスチジン欠失培地、同様に、ヒスチジンを含む標準培地で平板培養する（以下を参照）。ヒスチジン欠失培地は、組換え頻度を決定するのに用いられる。標準培地（ヒスチジンを含む培地）は、試験物質の総体的な毒性を決定するのに用いられる。
【００６３】
平板培養に最適な細胞希釈を決定するために、細胞計数装置を用いて（例えば、コールター・パーティクル・カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ），コールター社（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ.，マイアミ，フロリダ州）を用いて）、細胞を計数してもよい。次に、１０倍の連続希釈液を製造する（Ｄ0〜Ｄ5、ここにおいてＤ0は、最初の細胞培養物である）。最適な細胞の希釈は、（ａ）試験物質の毒性；（ｂ）細胞の基準となる組換え頻度（処理なし）；および、（ｃ）処理後のＤＥＬ組換えのレベルを測定できる十分な細胞が存在するような濃度である。例えば、Ｓ.セレビジエ細胞を用いる場合の好ましい希釈は、１×１０5〜１×１０7細胞／ｍＬである。
【００６４】
ハイスループット検出のためには、細胞は、マルチウェルプレート（例えば、１２、２４または４８ウェル）で平板培養してもよい。次に、この細胞を、復帰突然変異体のコロニーの成長を可能にする十分な時間（Ｓ.セレビジエ細胞の場合、好ましくは約３０℃で約４８時間）インキュベートする。
【００６５】
当業者には明白と予想されるが、本発明の開示に基づき、生物発光を示す復帰突然変異
体コロニーは、あらゆる光検出装置を用いて可視化することもでき、このような装置としては、例えば、マルチウェルプレートでコロニーを同定するのに用いられるルミ−イメージャー(Ｌｕｍｉ−ｌｍａｇｅｒ)(R)Ｆ１フォトンカウンティング装置（ロシュ・ダイアグノースティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ），インディアナポリス，インディアナ州）が挙げられる。使用可能なその他の光検出装置としては、ナイトアウル（ＮｉｇｈｔＯｗｌ，ベルトールド(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ)，ドイツ）、および、コダック(Ｋｏｄａｋ)ＩＳ１０００（コダック(Ｋｏｄａｋ)，ロチェスター，ＭＹ）が挙げられる。その上、細胞の生物発光コロニーのデジタル画像は、画像解析ソフトウェア（例えば、イメージ・プラス・プロ（Ｉｍａｇｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏ)(R)，バージョン４.１（メディア・サイバネティックス社（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ.），カールスバッド，カリフォルニア州）を用いた自動データ評価に適している。
【００６６】
逆突然変異頻度は、試験物質での処理から生き残った細胞総数に対する復帰突然変異細胞の数で示すこともできる。例えば、ｈｉｓ−ＤＥＬ選択マーカーを有するＳ．セレビジエの場合、以下の式を用いて、逆突然変異頻度を計算してもよい。
【００６７】
ＦＲ＝（Ｒ×Ｄ）／（Ｓ×Ｄ′）
式中：
ＦＲ＝逆突然変異頻度、
Ｒ＝ヒスチジン欠失培地上の復帰突然変異体コロニーの数、
Ｓ＝標準培地上のコロニーの数（を含む、
Ｄ＝ヒスチジン欠失培地で平板培養した細胞の希釈係数、
Ｄ′＝標準培地で平板培養した細胞の希釈係数。
【００６８】
逆突然変異頻度が、コントロールと比較して少しでも統計学的に有意に増加していれば、遺伝毒性および／または発癌性の特性を有する可能性のある試験物質であることを示すと予想される。統計的有意性の測定は当業者周知であるか、または、本発明の開示に基づき明白と予想される。その結果は、好ましくは０.０５以下、より好ましくは０.０１以下のｐ値が得られると予想される（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ(１９６０年)）。あるいは、逆突然変異頻度の増加は、少なくともコントロールの約２倍である。
【００６９】
当業者には本発明の開示に基づき明白と予想されるが、コントロールと比較した細胞群の逆突然変異頻度の生物発光による測定は、試験物質の二次的な作用の補正を必要とする。例えば、逆突然変異頻度の増加を引き起こす所定の試験物質はまた、成長および／または細胞分裂の速度を減少させることもある。結果として、未処理コントロール細胞における復帰突然変異細胞の数は、処理された細胞群よりも速く成長し、コントロールの生物発光する総個体数が処理された細胞の生物発光する総個体数を超える可能性がある。このような二次的な作用は、細胞の生物発光がひとまとめに測定される場合（例えば、細胞を液状媒体に入れて全ての生物発光を測定することによって）、特に顕著になると予想される。
【００７０】
このような二次的な作用を補正する好ましい方法は、例えば細胞が個別のコロニーを形成するような選択培地（固体または半固体の）を用いて、処理された細胞とコントロール細胞それぞれの個体群を固定することによる方法である。次いで、生物発光によって検出可能なコロニーまたは微小コロニーの数に基づき逆突然変異頻度が決定され得る。
【００７１】
上述の分析方法は、単に説明のために示されたものである。本発明の開示に基づき当業者には明白と予想されるが、本発明の実施において多種多様な分析様式が利用可能である。用いられる細胞のタイプ、ＤＥＬ選択マーカー、生物発光マーカーおよび試験物質、処理方法および細胞培養方法、ならびに、復帰突然変異体の検出方法に基づいて、改変をなすことができる。
【００７２】
本発明の方法および細胞の好ましい使用は、化学的突然変異誘発性／遺伝毒性の物質の検出に関するが、本発明はまた、突然変異誘発性／遺伝毒性を引き起こす可能性のあるその他の物質、例えば電離放射線のような環境物質にも適用可能である。
【００７３】
本明細書で引用された全ての特許、出願、公報、および、小冊子や技術報告などの文献の開示は、それらの全体が参照により開示に含まれる。当業者であれば、実施例、図面および添付の請求項を含む本発明の説明に基づき、本発明を最大限に利用することが可能であると考えられる。
【００７４】
以下の実施例は、本発明の実施の単なる説明と解釈されるべきであり、あらゆる方式における開示されていない部分を何であれ限定するものではない。
【実施例】
【００７５】
〔実施例１〕
酵母ＲＳ１１２−ｌｕｃ試験株の製造
ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドの製造
プラスミドのｐＧＬ３−コントロール（プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）５μｇを、ＨｉｎｄIII（１００ユニット）、および、ＸｂａＩ（１００ユニット）（ニューイングランドバイオラボ，ビバリー，マサチューセッツ州）を用いて、製造元が供給した緩衝液（総反応体積２０μｌ）の存在下で、３７℃で１時間消化した。次に、このサンプルを０.８％アガロースゲルにローディングし、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス酢酸塩；２ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏ）中で、５０ｍＶで、１時間泳動した。エチジウムブロマイド（５ｎｇ／ｍｌ，３０分間）を用いてバンドを染色し、トランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｔｏｒ）で２５００μＷ／ｃｍ2で可視化した。２つのバンドが観察され、１つは、ルシフェラーゼ遺伝子の１.７ｋｂのバンドであり、もう１つは、プラスミド主鎖を含む３.５ｋｂのバンドであった。１.７ｋｂのルシフェラーゼＤＮＡを含むバンドを寒天ゲル断片として切り出し、この断片から、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）キット（キアゲン，バレンシア，カリフォルニア州）を用いてＤＮＡを精製した。
【００７６】
発現ベクターのｐＹＥＳ６／ＣＴ（インビトロジェン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)，カールスバッド，カリフォルニア州）５μｇを、上述のようにＨｉｎｄIIIとＸｂａＩ（いずれも、ニューイングランドバイオラボ製）で消化し、得られた消化物を、上述のようにアガロースゲル電気泳動で分離した。得られた単一の検出可能な５.８ｋｂフラグメントのバンドを、上述のように切り出して精製した。
【００７７】
得られたルシフェラーゼと直線状にしたｐＹＥＳ６／ＣＴフラグメントを、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），インディアナポリス，インディアナ州）を製造元のプロトコールに従って用いてライゲートし、プラスミドのｐＹＥＳ−ＧＬ３を作製した。
【００７８】
このｐＹＥＳ−ＧＬ３を含むライゲーション混合物を用いて、Ｅ.ｃｏｌｉ細胞（ＵｌｔｒａＭａｘ(R)ＤＨ５α−ＦＴ(R)コンピテント細胞，ライフテクノロジーズ，ロックビル，メリーランド州）を製造元の推奨プロトコールに従って形質転換させた。形質転換された細胞をアンピシリン培地で平板培養し、ｐＹＥＳ−ＧＬ３を含むコロニーを選択した。
【００７９】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）のための強い構成的プロ
モーター（Ｍｕｍｂｅｒｇ等（１９９５年）を参照）を、ｐ４１６ＧＰＤ（ＡＴＣＣ寄託番号８７３６１，Ｍ.Ｆｕｎｋによって寄託された）をＳａｃＩとＨｉｎｄIIIで消化し０.７ｋｂのＤＮＡフラグメントを作製することによって製造した。
【００８０】
ｐＹＥＳ−ＧＬ３中のＳｗａＩクローニング部位を、上述のようにｐＹＥＳ−ＧＬ３をＳｗａＩで消化し、ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ）で３７℃で２時間処理して５’リン酸基を除去することによって、ＳａｃＩに改変した。得られたＤＮＡをキアクイックキット（キアゲン）を用いて精製し、滅菌水１０μｌに再懸濁し、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いてＳａｃＩリンカー（ニューイングランドバイオラボ）にライゲートし、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃプラスミドを作製し、これを、形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ細胞（ＵｌｔｒａＭａｘ(R)ＤＨ５α−ＦＴ(R)コンピテント細胞，ライフテクノロジーズ）から単離した。単離されたｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃを、ＳａｃＩとＨｉｎｄIIIで消化し、Ｐｇａｌ１プロモーターを除去し、０.９７ｋｂのフラグメント（Ｐｇａｌ１プロモーターをコードする）、および、６.５ｋｂのフラグメント（プラスミドをコードする）を得た。
【００８１】
ＳａｃＩ／ＨｉｎｄIIIが両端にあるＧＰＤプロモーターフラグメントを、ラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いてｐＹＥＳ−ＧＬ３−Ｓａｃフラグメントにライゲートし、ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドを作製した（図２を参照）。
【００８２】
ＲＳＹ１１２−ｌｕｃ株の製造
２０〜５０マイクロリットルの酵母ＲＳ１１２株の接種材料（米国特許第４,９９７,７５７号の段落３４，４６〜６４行で説明されている）を、ＹＰＤプレートから（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）回収し、滅菌水１ｍｌに再懸濁した。この細胞をマイクロ遠心分離機を用いて１５秒間沈降させ、水を除去した。得られた細胞のペレットを、５０％ＰＥＧ（２４０μｌ）、１Ｍ酢酸リチウム（３６μｌ）、２ｍｇ／ｍｌ一本鎖ＤＮＡ（２５μｌ）、ｐＹＥＳ−ＧＬ２−ＧＰＤプラスミド（５μｌ）１μｇ、および、滅菌水（４５μｌ）からなる形質転換混合物に再懸濁し、４２℃で６０〜１８０分間インキュベートした。形質転換の後、この細胞懸濁液をマイクロ遠心分離機で１５秒間沈降させ、上清を捨てた。得られたペレットを滅菌水２００〜４００μｌに穏やかに再懸濁し、この細胞を、５０μｇ／ｍｌブラスチシジン（インビトロジェン）を含む寒天プレートで平板培養した。３０℃で３日後に、形質転換されたブラスチシジン耐性酵母細胞のコロニーを可視化した。液状媒体中、０.４ｍＭルシフェリン（プロメガ）の存在下で、１つの発光コロニーを選択し、ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞を作製した。
実施例１は、本発明の方法で使用可能な、本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の製造を説明する。
【００８３】
〔実施例２〕
ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞を用いて遺伝毒性物質を同定するための分析
水６００ｍｌに溶解させた酵母窒素原礎培地（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）４ｇ、−Ｌｅｕアミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ，ヒスチジンＨＣｌ１.２ｇ，ウラシル１.２ｇ，これら全て、シグマ−アルドリッチ社製（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ.，セントルイス，ミズーリ州））０.４ｇ、および、デキストロース１２ｇからなるロイシン欠損最小培地（−ＬＥＵ培地）５０ｍＬ中で、ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の接種材料を３０℃で一晩（１７〜２２時間）成長させた。植菌の前に、−ＬＥＵ培地をオートクレーブ処理で滅菌し、ろ過滅菌したアデニンヘミ硫酸塩（２.５ｍｇ／ｍＬ）溶液４ｍＬを添加して、オートクレーブ処理によって失われたアデニンを補給した。得られたＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の培養物を３２０００ＲＰＭで回転沈降させ、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、この細胞を、−ＬＥＵ培地に２×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁し、氷上に置いた。この細胞を、９６ウェルプレート中で、遺伝毒性メチル化物質、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ，シグマ−アルドリッチ社）で、３０℃で１７時間処理した。各ウェルには、細胞懸濁液２００μｌと適切な濃度の試験化合物または媒体とを入れた。処理後に、このプレートを、３２００ＲＰＭで１０分間回転させ、上清を除去した。次に、この細胞を、ＰＢＳ２００μｌで２回洗浄し、超音波発生装置（ブランソン・ウルトラソニック社（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｃｏｒｐ.），ダンベリー，コネチカット州）を用いて５分間再懸濁した。細胞濃度を、コールター・パーティクル・カウンター（コールター社，マイアミ，フロリダ州）を用いて測定し、平板培養に最も適した希釈を決定した。希釈していない培養物についてはＤ0、および、１０倍の連続希釈についてはＤ1〜Ｄ5と指定された細胞懸濁液の希釈液を製造した。細胞懸濁液５０μｌを２組のマルチウェルプレート（例えば、１２、２４または４８ウェルプレート）で平板培養した。復帰突然変異体を検出するための第一の組には、水１０ｍｌに溶解させた酵母窒素原礎培地（Ｂｉｏ１０１，カールスバッド，カリフォルニア州）０.６ｇ、−ｈｉｓアミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ、ロイシン１.８ｇ、ウラシル１.２ｇ，全てシグマ−アルドリッチ社製）０.７ｇ、デキストロース（フィッシャー・サイエンティフィック，フェアーローン，ニュージャージー州）２ｇ、および、寒天（バクトアガー（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ），ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），スパークス，メリーランド州）１.７ｇからなるヒスチジン欠失寒天培地を入れた。細胞生存率を検出するための第二の組には、酵母窒素原礎培地０.６ｇ、＋４アミノ酸混合物（アデニンヘミ硫酸塩１.８ｇ、ヒスチジンＨＣｌ１.２ｇ、ロイシン１.８ｇ、ウラシル１.２ｇ，全てシグマ−アルドリッチ社製）０.４ｇ、デキストロース（フィッシャー・サイエンティフィック）２ｇ、および、寒天（バクトアガー、ベクトン・ディッキンソン）１.７ｇからなる基礎プラス４培地を入れた。平板培養の後、この細胞に、２.４％寒天水溶液５ｍｌ、ＰＢＳ５ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌブラスチシジン１０μｌ、および、０.１Ｍ甲虫ルシフェリン（ｂｅｅｔｌｅ ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，プロメガ，マディソン，ウィスコンシン州）４０μｌからなるルシフェリンを含む軟寒天１５０μｌを上塗りした。次に、このプレートを３０℃で約４８時間インキュベートした。生物発光を示す復帰突然変異体または生存する細胞のコロニーを、フォトンカウンティング装置ルミイメージャー（Ｌｕｍｉｍａｇｅｒ Ｆ１，ロシュ・ダイアグノスティックス，インディアナポリス，インディアナ州）を用いて可視化した。
実施例２は、それらの生物発光のレベルに基づく復帰突然変異細胞の数に基づき試験物質の遺伝毒性を決定するために、本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞が試験される本発明の方法を説明する。
【００８４】
ＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞の寄託
本発明のＲＳ１１２−ｌｕｃ細胞は、２００４年２月１７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、米国バージニア州マナサスにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に特許寄託番号ＰＴＡ−５８２２として寄託された。
【００８５】
文献
Amacher, D.E. et al.,“Point mutations at the thymidine kinase locus in L5178Y
mouse lymphoma cells. Application to genetic toxicological testing,”Mut. Res. 64:391-406 (1979)；
Ames, B.N.“The detection of chemical mutagens with enteric bacteria,”In Chemical Mutagens：Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, ed., Plenum, New York, 1: 267-282 (1971)；
Ames, B.N.,“Carcinogens are mutagens: their detection and classification,”Environ. Health Perspect. 6: 115-118 (1973);
Ames, B.N. et al.,“Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2281-2285 (1973a)(co-incubation of a carcinogen, a rat or human liver homogenate, and the bacterial tester strain on a petri plate)；
Ames, B.N. et al.,“An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70：782-786 (1973b);
Ames, B.N. et al.,“Methods for detecting carcinogens and mutagens with Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test,”Mutation Res. 31: 347-364 (1975);
Aubrecht, J. et al.,“Carcinogens induce intrachromosomal recombination in human cells,”Carcinogenesis 16(11): 2841-6 (1995);
Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY (2003);
Baum, C. et al.,“An optimized electroporation protocol applicable to a wide range of cell lines,”Biotechniques 17:1058-62 (1994);
Biewenga, J.E. et al.,“Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique,”J. Neuroscience Methods 71:67-75 (1997);
Bishop, A.J.R. and Schiestl, R.H.,“Homologous recombination as a mechanism for genome rearrangement: environmental and genetic effects,”Human Molecular Genetics 9(16): 2427-2434 (2000);
Bollag, R.J, et al.,“Homologous recombination in mammalian cells,”Annu. Rev.
Genet. 23:199-225 (1989).
Bonifacino, J.S., et al., Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, New York NY (2003);
Bosworth, D. et al.,“A forward mutation assay using ampicillin-resistance in Escherichia coli designed for investigating the mutagenicity of biological samples,”Mutagenesis 2 (6): 455-468 (1987);
Bronstein, I. et al.,“REVIEW: Chemilumiescent and Bioluminescent Reporter Gene Assays,”Anal. Biochem. 219:169-181 (1994);
Brooks, T.M.,“The use of a streamlined bacterial mutagenicity assay, the MINISCREEN,”Mutagenesis 10(5): 447-448 (1995);
Brownlee, K.A., Statistical Theory and Methodology, Wiley, New York (1960);
Brummelkamp, T.R. et al.,“A system for stable expression of short interfering
RNAs in mammalian cells,”Science 296: 550-553.
Chu et al.,“Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells
with DNA,”Nucleic Acids Res. 15:1311-26 (1987);
Colbere-Garapin, F., Horodniceanu, F., Kourilsky, P. and Garapin, A.C.,“A new
dominant hybrid selective marker for higher eukaryotic cells,”J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981);
Cote et al (1995),“A miniaturized Ames mutagenicity assay employing bioluminescent strains of Salmonella typhimurium”, Mutation Research, 345, 137-146;
Deng, C. and Capecchi, M.R.,“Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus,”Mol. Cell. Biol. 12:3365-3371 (1992);
【００８６】
Evans, H.J.,“Cytogenetic methods for detecting effects of chemical mutagens,”Ann. N.Y. Acad. Sci., 407:131-41 (1983);
Falck, K., et al.,“Mutascreen(R), an automated bacterial mutagenicity assay,”Mutation Res. 150: 119-125 (1985);
Fenech, M. and Morley, A.A.,“Measurement of micronuclei in human lympocytes,”Mutat. Res., 148: 29-36 (1985);
Fire, A. et al.,“Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans,”Nature 391: 806-811.
Foster, P.L. et al.,“Creation of a test Plasmid for Detecting G.C-to-T.A Transversions by Changing Serine to Arginine in the Active Site of β-Lactamase,”J. Bacteriol. 169(6): 2476-2481 (1987);
Frackman, S. et al.,“Cloning, organization, and expression of the bioluminescence genes of Xenorhabdus luminescens,”J. Bacteriol. 172(10): 5767-5773 (1990);
Galli and Schiestl (1998),“Effects of DNA double-strand and single-strand breaks on intrachromosomal recombination events in cell-cycle-arrested yeast cells,”Genetics, 149, 1235-50;
Gatehouse, D.G. & Delow, G.F.,“The development of a‘Microtitre' fluctuation test for the detection of indirect mutagens, and its use in the evaluation of mixed enzyme induction of the liver,”Mutation Res. 60: 239-252 (1979);
Gee, P. et al.,“Detection and classification of mutagens: A base set of base-specific Salmonella tester strains,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11606-11610 (1994);
Gietz, R.D. and Woods, R.A.,“Transformation of yeast by the LiAc/ss carrier dna/PEG method,”Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002);
Grossblatt, N., Ed.,“Quantitative Relationship Between Mutagenic and Carcinogenic Potencies: A Feasibility Study," Report of the Committee on Chemical Environmental Mutagens, National Academy Press, Washington, DC, 17-26 (1983);
Haworth, S., et al.,“Salmonella mutagenicity results for 250 chemicals,”Environ. Mutagen. 5(Suppl.1): 3-142 (1983);
Hartman, S.C., Mulligan, R.C.,“Two dominant-acting selectable markers for gene transfer studies in mammalian cells,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-8051 (1988);
Hour, T-C. et al.,“A new mutagenicity assay method for frameshift mutagens based on deleting or inserting a guanosine nucleotide in the β-lactamase gene,”Mutagenesis 10 (5): 433-438 (1995);
【００８７】
Jassim, S.A.A. et al.,“In vivo Bioluminescence: A Cellular Reporter for Research and Industry,”J. Biolumin. Chemilumin. 5:115-122 (1990);
Kado, N.Y. et al.,“A simple modification of the Salmonella liquid incubation assay: Increased sensitivity for detecting mutagens in human urine,”Mutat. Res.
112:25-32 (1983);
Kato, H. et al.,“Automation of the Ames test,”in JEMS Abstract 31, published
in Mutation Res. 334: 399 (1995);
Kaufman, R. J., Meth. Enzymology 185:537 (1988)
Lee, C-C. et al.,“A reverse mutagenicity assay for alkylating agents based on
a point mutation in the β-lactamase gene at the active site serine codon,” Mutagenesis 9 (5): 401-405 (1994);
Lichtenstein, P., Holm, N.V., Verkasalo, P.K., Iliadou, A., Kaprio, J., Koskenvuo, M., Pukkala, E., Skytthe, A. and Hemminki, K.,“Environmental and Heritable Factors in the Causation of Cancer,”N. Engl. J. Med., 343:78-85 (2000);
Linney et al., Dev. Biol. (Orlando) 213:207-16 (1999);
Lo, C.W.,“Transformation by iontophoretic microinjection of DNA: multiple integrations without tandem insertions,”Mol. Cell. Biol. 3:1803-14 (1983).
Lowy, I., Pellicer, A., Jackson, J.F., Sim, G.K., Silverstein, S., Axel, R.,“Isolation of transforming DNA：cloning the hamster aprt gene,”Cell. 22: 817-23 (1980);
Maron, D.M. and Ames, B.N.,“Revised methods for the Salmonella mutagenicity test,”Mutation Res. 113: 173-215 (1983);
McCann, J. et al.,“Detection of carcinogens as mutagens: bacterial tester strains with R factor plasmids,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72(3): 979-983 (1975);
McPherson, M.F. and Nestmann, E.R.,“The SIMULTEST approach for testing mutagens in the Salmonella microtitre fluctuation assay,”Environ. Mol. Mutagen. 16: 21-25 (1990);
Monnat, R. J. et al.“Molecular structure and genetic stability of human hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene duplications,”Genomics 13: 788-796 (1992):
Moolton, F.,“Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes thymidine kinase genes: paradigm for a prospective cancer control strategy,”Cancer Res. 46: 5276-5281 (1986);
Mumberg, D. et al.,“Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds,”Gene 156(1): 119-22 (1995);
Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982);
Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:7161-65 (1984);
Prival, M.J. and Mitchell, V.D,“Analysis of method for testing azo dyes for mutagenic activity in Salmonella typhimurium in the presence of flavin mononucleotide and hamster liver S-9,”Mutat. Res. 97:103-116 (1982);
Ray and Gage,“Gene transfer into established and primary fibroblast cell lines：comparison of transfection methods and promoters,”Biotechniques 13:598-603 (1992);
Rasmuson, B., Svahlin H., Rasmuson A., Montell I. and Olofsson H.,“The use of
a mutationally unstable X-chromosome in Drosophila melanogaster for mutagenicity testing,”Mutat. Res. 54(1):33-38 (1978);
Reid, T.M., Morton, K.C., Wang, C.Y., and King, C.M.,“Mutagenesis of azo dyes
following metabolism by different reductive/oxidative systems,”Environ. Mutagen. 6:247-259 (1984);
Robertson et al., Nature 323:445-48 (1986).
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989);
Schiestl, R.H., Igarashi, S. and Hastings, P.J.,“Analysis of the Mechanism for Reversion of a Disrupted Gene,”Genetics 119:237-247 (1988);
Schiestl, R.H.,“Nonmutagenic carcinogens induce intrachromosomal recombination in yeast,”Nature 337(6204): 285-288 (1989);
Scharf, D. et al. Results Probl. Cell Differ. 20:125 162 (1994).
Sommers, C.H., Mackay, W.J., Nalezny, J., Gee, P., Benjamin, M. and Farr, S.B.,“Induction of DEL recombination in the yeast Saccharomyces cerevisiae using a microtiter plate format,”In Vitro and Molecular Toxicology, 11: 37-47 (1995);
Thomas, K.R. and Capecchi, M.R.,“Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells,”Cell 51:503-12 (1987);
Van der Sand, S.T. et al.,“Optimization of a lux gene expression in Saccharomyces cerevisiae as a tool to study gene regulation and plasmid segregation,”J. Bioluminescence and Chemiluminescence 7: 220 (1992);
Waldman, A.S. and Liskay, R.M.,“Dependence of intrachromosomal recombination in mammalian cells on uninterrupted homology,”Mol. Cell. Biol. 8:5350-5357 (1988).
Waleh, N.S., et al.,“Development of a toxicity test to be coupled to the Ames
Salmonella assay and the method of construction of the required strains,”Mutat. Res. 97:247-256 (1982);
Walker, G.C.,“Plasmid (pKM101)-mediated enhancement of repair and mutagenesis: dependence on chromsomal genes in Escherichia coli K-12,”Mol. Gen. Genet. 152(1): 93-103 (1977);
Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.S., Pellicer, A., Cheng, Y. and Axel, R.,“Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells,”Cell. 11: 223-32 (1977);
Wigler, M., Perucho, M., Kurtz, D., Dana, S., Pellicer, A., Axel, R. and Silverstein, S.,“Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-70 (1980);
Wilcox, P. et al.,“Comparison of Salmonella typhimurium TA102 with Escherichia coli WP2 tester strains,”Mutagenesis 5: 285-291 (1990);
Winson, M.K., et al.,“Engineering the luxCDABE genes from Photorhabdus luminescens to provide a bioluminescent reporter for constitutive and promoter probe plasmids and mini-Tn5 constructs,”FEMS Microbiol. Lett. 163(2): 193-202 (1998);
Wolff S.,“Sister chromatid exchange as a test for mutagenic carcinogens,”Ann. N.Y. Acad. Sci., 407:142-153 (1983);
Xi, L. et al.,“Cloning and nucleotide sequences of lux genes and characterization of luciferase of Xenorhabdus luminescens from a human wound,”J. Bacteriol. 173: 1399-1405 (1991);
Yahagi, T. et al.,“Mutagenicity of carcinogenic azo dyes and their derivatives,”Cancer Lett. 1:91-97 (1975);
Zeiger, E.,“The Salmonella mutagenicity assay for identification of presumptive carcinogens,”in the Handbook of Carcinogen Testing (H.A. Milman and E.K. Weisburger, eds., Noyes Publishers, Park Ridge, N.J.): 83-99 (1985);
Zhang et al.,“Efficient production of single-stranded DNA as long as 2 kb for
sequencing of PCR-amplified DNA,”Biotechniques 15:868-72 (1993);
Zimmer and Gruss, “Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination,”Nature 338:150-153 (1989).
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＤＥＬ組換えのメカニズムを示す。
【図２】ｐＹＥＳ−ＧＬ３−ＧＰＤプラスミドのマップである。
【図３】ＤＥＬ組換えを受ける細胞の生物発光検出の原理を示す。
【図４】ＤＥＬ組換え頻度（Ａ部）および生存（Ｂ部）に関するＲＳ１１２ｌｕｃ細胞のメタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）処理の作用のグラフ表示である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を試験物質で処理すること、および、適切な選択培地の存在下で、該細胞からの生物発光のレベルを測定することを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項２】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、該真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、適切な選択培地の存在下で、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、および、該選択培地の存在下で、該真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定することを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項３】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、該真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、適切な選択培地の存在下で、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、該選択培地の存在下で、該真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、および、該試験物質を、選択されたカテゴリー（該選択培地の存在下における該未処理部分と比較して、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させる物質；および、該選択培地の存在下における該未処理部分と比較して、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させない物質）に従って特徴付けることを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項４】
生物発光を示す細胞の増加は、未処理部分と比較して統計学的に有意である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物発光を示す細胞の増加は、未処理部分と比較して少なくとも２倍である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
真核細胞または細胞培養物は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞から選択される細胞から誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
真核細胞または細胞培養物は、サッカロミセス・セレビジエから誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞。
【請求項９】
哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導された、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ＲＳ１１２−ｌｕｃ株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８２２）である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の細胞および容器を含むキット。
【請求項１３】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む酵母細胞の胞子を含むキット。
【請求項１４】
酵母細胞は、サッカロミセス・セレビジエである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
酵母細胞は、ＲＳ１１２−ｌｕｃ株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８２２）から誘導される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞を試験物質で処理すること、および、適切な選択培地の存在下で、該細胞からの生物発光のレベルを測定することを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項２】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、該真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、適切な選択培地の存在下で、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、および、該選択培地の存在下で、該真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定することを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項３】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞培養物を提供すること、該真核細胞培養物の処理部分を試験物質で処理すること、適切な選択培地の存在下で、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、該選択培地の存在下で、該真核細胞培養物の未処理部分の生物発光を示す細胞の数を測定すること、および、該試験物質を、選択されたカテゴリー（該選択培地の存在下における該未処理部分と比較して、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させる物質；および、該選択培地の存在下における該未処理部分と比較して、該処理部分の生物発光を示す細胞の数を増加させない物質）に従って特徴付けることを含む、試験物質を特徴付ける方法。
【請求項４】
生物発光を示す細胞の増加は、未処理部分と比較して統計学的に有意である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物発光を示す細胞の増加は、未処理部分と比較して少なくとも２倍である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
真核細胞または細胞培養物は、哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞から選択される細胞から誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
真核細胞または細胞培養物は、サッカロミセス・セレビジエから誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む真核細胞。
【請求項９】
哺乳動物のリンパ系細胞；ヒトのリンパ芽球様細胞；酵母細胞；および、サッカロミセス・セレビジエの細胞から選択される細胞から誘導された、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ＲＳ１１２−ｌｕｃ株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８２２）である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の細胞および容器を含むキット。
【請求項１３】
ＤＥＬ選択マーカーと生物発光マーカーとを含む酵母細胞の胞子を含むキット。
【請求項１４】
酵母細胞は、サッカロミセス・セレビジエである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
酵母細胞は、ＲＳ１１２−ｌｕｃ株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５８２２）から誘導される、請求項１３に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５１６７１６（Ｐ２００７−５１６７１６Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６３５９（Ｐ２００６−５４６３５９）
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４１２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６６２８
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４１２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６６２８
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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