疲労回復剤
【課題】疲労回復効果を発揮し得る、新たな安全性の高い薬剤を提供すること。
【解決手段】アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高く、長期間にわたる使用が可能である。
【解決手段】アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高く、長期間にわたる使用が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疲労回復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労および疲労感は、現代社会に生きる多数の人が日常向き合っている現象である。過酷な運動に曝されるアスリートにとって、疲労回復は、健康維持のみならず、より良い記録を出すためにも非常に重要である。一般人にとっても、精神的・肉体的負荷から生じる疲労は、生活の質および労働の質を低下させる原因の１つであり、疾病や死につながる場合もある。また、現在の生活環境は、競争の激化などに伴いますます悪化しており、疲労および疲労感の解消が、大きな関心事になっている。今後、ますます高齢化が進み、老化による病態、脳神経機能、知的能力、あるいは免疫機能の低下により、一層疲労や疲労感が広く蔓延することが予想される。そのため、従来から、疲労症状の改善・回復を目的とし、種々の疲労回復剤が提供されている。例えば、漢方処方に基づく製剤や生薬を主剤とする製剤、総合ビタミン剤、ビタミン類にアミノ酸、生薬、臓器抽出物などを配合した各種の疲労回復用の薬剤・食品が開発されている。しかし、従来の疲労回復剤には、疲労回復効果が十分ではなく、長期間服用した場合の安全性に疑問のあるものも存在していた。あるいは、好ましくない食味を呈するものや、有効量を摂取するためには多量に服用する必要があり、通常の食事に支障をきたすものもある。
【０００３】
カロテノイド（カロチノイド）は、動物、植物、および微生物に広く分布し、その数約６００種におよぶ黄〜橙〜赤色を呈する脂溶性生体色素である。その一種であるアスタキサンチンは、オキアミ、エビ、カニなどの甲殻類、サケ・マスの筋肉・卵（イクラなど）、タイ・コイ・金魚などの体表などに含有されている。アスタキサンチンは、プロビタミンＡとなり得ることや顕著な抗酸化作用を有することだけでなく、抗炎症作用を有することも知られている（例えば、特許文献１および２）。また、アスタキサンチンは、筋肉機能の持続時間を改善し、筋肉障害または横紋筋融解症の治療に用いられ得ることも知られている（特許文献３）。しかし、アスタキサンチン単独による疲労回復効果については全く知られていない。
【特許文献１】特開平７−３００４２１号公報
【特許文献２】特開２００４−３３１５１２号公報
【特許文献３】特表２００１−５１４２１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、疲労回復効果を発揮し得る、新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
抗酸化剤として知られているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンが疲労回復効果を発揮し得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤を提供する。
【０００７】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労予防剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新たな疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、疲労発生の予防、疲労発生後の回復促進などに効果がある。また、本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：
【００１０】
【化１】
【００１１】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。
【００１２】
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。
【００１３】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００１４】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。
【００１５】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、スポーツ前、スポーツ中、スポーツ後、仕事や勉強中、その他、通勤や通学、家事や育児などにおいて、疲労を感じた場合に、あるいは予防的にこれを摂取することによって、疲労を感じなくなったり、それが軽減されたり、疲労によって本来の能力が発揮されなくなることを防いだり、疲労によってもたらされた能力低下の解消を促進したりするという効果を奏するものである。また、日常的にあるいは継続的に使用することによって、疲労および疲労による影響を軽減・予防することもできる。
【実施例】
【００１７】
（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
【００１８】
（実施例１：疲労予防・回復効果の検討）
アスタキサンチンを運動負荷前のマウスに投与し、持久力／筋力の回復について、以下のように検討した。
【００１９】
６週齢のｄｄＹ（ＳＰＦ）マウスを、平均体重が等しくなるように、１群１０匹として試験群および対照群の２群に分けた。試験群には上記調製例１で調製したアスタキサンチンモノエステルを１％含有するオリーブオイルを、対照群にはオリーブオイルを、それぞれ０．０１ｍＬ／ｇ体重となるように、１回強制経口投与した。アスタキサンチンモノエステルの投与量は、１００ｍｇ／ｋｇであった。
【００２０】
投与１時間後に、マウス全例について、強制遊泳検査を次のように行った。マウスの尾部に体重１０％相当のおもりを装着し、プール（水深３０ｃｍ、水温２１〜２３℃）で強制的に泳がせ、水面下に沈んで７秒以内に浮き上がってこなくなるまでの遊泳時間を計測した。結果を、図１に示す。
【００２１】
次いで、マウス全例について、強制遊泳検査終了後３分および３０分の２回、懸垂検査を行った。懸垂検査では、マウスを鉄棒（高さ２０ｃｍのバー）に前肢でつかまらせ、落下するまでの時間を計測した。結果を図２に示す。
【００２２】
遊泳検査では、試験群と対照群との間にほとんど差は見られなかった（図１）。一方、遊泳後の懸垂検査においては、対照群では、遊泳後３分および３０分での懸垂時間はそれぞれ８９．０秒および７２．４秒とやや下降気味であったのに対し、試験群での懸垂時間はそれぞれ１００．１秒および１５４．０秒であり、３０分後の懸垂時間は対照群の約２倍であった（図２）。このように、遊泳検査の運動負荷前における、アスタキサンチンモノエステルの１００ｍｇ／ｋｇ投与によって疲労回復効果が示された。
【００２３】
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
【００２４】
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。
【００２５】
一方、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。
【００２６】
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。
【００２７】
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。
【００２８】
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、新たな疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高く、長期間にわたる使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アスタキサンチンモノエステルを投与した試験群および対照群のマウスの、強制遊泳検査における平均遊泳時間を示すグラフである。
【図２】アスタキサンチンモノエステルを投与した試験群および対照群のマウスの、遊泳後３分および３０分での懸垂検査における平均懸垂時間の推移を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疲労回復剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労および疲労感は、現代社会に生きる多数の人が日常向き合っている現象である。過酷な運動に曝されるアスリートにとって、疲労回復は、健康維持のみならず、より良い記録を出すためにも非常に重要である。一般人にとっても、精神的・肉体的負荷から生じる疲労は、生活の質および労働の質を低下させる原因の１つであり、疾病や死につながる場合もある。また、現在の生活環境は、競争の激化などに伴いますます悪化しており、疲労および疲労感の解消が、大きな関心事になっている。今後、ますます高齢化が進み、老化による病態、脳神経機能、知的能力、あるいは免疫機能の低下により、一層疲労や疲労感が広く蔓延することが予想される。そのため、従来から、疲労症状の改善・回復を目的とし、種々の疲労回復剤が提供されている。例えば、漢方処方に基づく製剤や生薬を主剤とする製剤、総合ビタミン剤、ビタミン類にアミノ酸、生薬、臓器抽出物などを配合した各種の疲労回復用の薬剤・食品が開発されている。しかし、従来の疲労回復剤には、疲労回復効果が十分ではなく、長期間服用した場合の安全性に疑問のあるものも存在していた。あるいは、好ましくない食味を呈するものや、有効量を摂取するためには多量に服用する必要があり、通常の食事に支障をきたすものもある。
【０００３】
カロテノイド（カロチノイド）は、動物、植物、および微生物に広く分布し、その数約６００種におよぶ黄〜橙〜赤色を呈する脂溶性生体色素である。その一種であるアスタキサンチンは、オキアミ、エビ、カニなどの甲殻類、サケ・マスの筋肉・卵（イクラなど）、タイ・コイ・金魚などの体表などに含有されている。アスタキサンチンは、プロビタミンＡとなり得ることや顕著な抗酸化作用を有することだけでなく、抗炎症作用を有することも知られている（例えば、特許文献１および２）。また、アスタキサンチンは、筋肉機能の持続時間を改善し、筋肉障害または横紋筋融解症の治療に用いられ得ることも知られている（特許文献３）。しかし、アスタキサンチン単独による疲労回復効果については全く知られていない。
【特許文献１】特開平７−３００４２１号公報
【特許文献２】特開２００４−３３１５１２号公報
【特許文献３】特表２００１−５１４２１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、疲労回復効果を発揮し得る、新たな安全性の高い薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
抗酸化剤として知られているアスタキサンチンについて種々の検討を行ったところ、アスタキサンチンが疲労回復効果を発揮し得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤を提供する。
【０００７】
本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労予防剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新たな疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、疲労発生の予防、疲労発生後の回復促進などに効果がある。また、本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：
【００１０】
【化１】
【００１１】
（ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。
【００１２】
本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。
【００１３】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
【００１４】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。
【００１５】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、スポーツ前、スポーツ中、スポーツ後、仕事や勉強中、その他、通勤や通学、家事や育児などにおいて、疲労を感じた場合に、あるいは予防的にこれを摂取することによって、疲労を感じなくなったり、それが軽減されたり、疲労によって本来の能力が発揮されなくなることを防いだり、疲労によってもたらされた能力低下の解消を促進したりするという効果を奏するものである。また、日常的にあるいは継続的に使用することによって、疲労および疲労による影響を軽減・予防することもできる。
【実施例】
【００１７】
（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。
【００１８】
（実施例１：疲労予防・回復効果の検討）
アスタキサンチンを運動負荷前のマウスに投与し、持久力／筋力の回復について、以下のように検討した。
【００１９】
６週齢のｄｄＹ（ＳＰＦ）マウスを、平均体重が等しくなるように、１群１０匹として試験群および対照群の２群に分けた。試験群には上記調製例１で調製したアスタキサンチンモノエステルを１％含有するオリーブオイルを、対照群にはオリーブオイルを、それぞれ０．０１ｍＬ／ｇ体重となるように、１回強制経口投与した。アスタキサンチンモノエステルの投与量は、１００ｍｇ／ｋｇであった。
【００２０】
投与１時間後に、マウス全例について、強制遊泳検査を次のように行った。マウスの尾部に体重１０％相当のおもりを装着し、プール（水深３０ｃｍ、水温２１〜２３℃）で強制的に泳がせ、水面下に沈んで７秒以内に浮き上がってこなくなるまでの遊泳時間を計測した。結果を、図１に示す。
【００２１】
次いで、マウス全例について、強制遊泳検査終了後３分および３０分の２回、懸垂検査を行った。懸垂検査では、マウスを鉄棒（高さ２０ｃｍのバー）に前肢でつかまらせ、落下するまでの時間を計測した。結果を図２に示す。
【００２２】
遊泳検査では、試験群と対照群との間にほとんど差は見られなかった（図１）。一方、遊泳後の懸垂検査においては、対照群では、遊泳後３分および３０分での懸垂時間はそれぞれ８９．０秒および７２．４秒とやや下降気味であったのに対し、試験群での懸垂時間はそれぞれ１００．１秒および１５４．０秒であり、３０分後の懸垂時間は対照群の約２倍であった（図２）。このように、遊泳検査の運動負荷前における、アスタキサンチンモノエステルの１００ｍｇ／ｋｇ投与によって疲労回復効果が示された。
【００２３】
（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。
【００２４】
Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。
【００２５】
一方、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。
【００２６】
100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。
【００２７】
インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。
【００２８】
この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、新たな疲労回復剤および疲労予防剤が提供される。本発明の疲労回復剤および疲労予防剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高く、長期間にわたる使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】アスタキサンチンモノエステルを投与した試験群および対照群のマウスの、強制遊泳検査における平均遊泳時間を示すグラフである。
【図２】アスタキサンチンモノエステルを投与した試験群および対照群のマウスの、遊泳後３分および３０分での懸垂検査における平均懸垂時間の推移を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤。
【請求項２】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労予防剤。
【請求項１】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労回復剤。
【請求項２】
アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、疲労予防剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１６４０９（Ｐ２００６−１６４０９Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【公開請求】
【出願番号】特願２００５−３０１１５７（Ｐ２００５−３０１１５７）
【出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【出願人】（００００１００７６）ヤマハ発動機株式会社 (3,045)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０１１５７（Ｐ２００５−３０１１５７）
【出願日】平成１７年１０月１７日（２００５．１０．１７）
【出願人】（００００１００７６）ヤマハ発動機株式会社 (3,045)
【Ｆターム（参考）】
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