疾患を検出するための、ＤＮＡユークロマチンを同定し評価する方法
本発明は、生物学的細胞中のＤＮＡユークロマチンを同定し評価する方法である。ＤＮＡユークロマチンの量及び／又は分布状態は、ＲＮＡ／タンパク質合成と一般に関係があり、疾患、且つ／或いは環境及び／又は化学物質に対する細胞応答などの、いくつかの条件において変化する可能性がある。本発明は、表面上は正常な細胞中のＤＮＡユークロマチンを評価することによって、疾患の潜在的な存在を検出し、治療応答性をモニターし評価するための手段を同様に提供する。本発明を使用して、環境、放射、化学物質、薬剤、薬草、ビタミンなどの、影響を加える（或いは除去する）ことがどのように相互作用して、細胞に影響を与えるかを評価し、健康状態の調査及び薬理学的スクリーニングの際の使用を確立させることもできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
生物学的細胞は、それらがそのプログラム化された義務を果たす際に、栄養、化学物質及び細胞因子の海に浸っている複雑な経路を介して生存し連絡している。疾患及び感染のいくつかの場合、多数の細胞が、身体の防御機構に関与する、或いは他の場合はそれを支援することを要求される。生物学的活性を有する様々な分子が、細胞核に浸透し、二本鎖状態又は一本鎖状態のＤＮＡと結合し、これによってＤＮＡらせんの開裂又は閉鎖に関与し、それ故のＲＮＡ／タンパク質合成の上方又は下方制御に関与する。疾患に直面すると、細胞は劇的な様式で応答し、現在の義務を放棄して新しい役割を採り入れ、時折分化して抗体産生細胞又はスカベンジャー細胞になる可能性がある。しかしながら、細胞修復などの通常の有益な機能調整任務を果たす他の細胞は破壊されて、癌組織の増殖又は血管新生を助長する因子が生成する可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
時折、罹患組織と隣接しているか或いはそこから離れている細胞が、系中を循環する細胞因子によって疾患の存在に変わる可能性がある。しかしながら、明確な様式で応答する代わりに、様々な細胞がＤＮＡのわずかな再編成を受ける可能性があり、この再編成は、凝縮クロマチン（ヘテロクロマチン）と、ＲＮＡ／タンパク質合成において一般的に活性がある可能性がある、さらに緩くパッケージされたＤＮＡ（ユークロマチン）の両方において、観察することができる。典型的には、これらの方法によってＤＮＡを観察するためには、ＤＮＡを視覚的に増大させることが必要であり、これは染色を伴う。しかしながら、ＤＮＡの量及び／又はＤＮＡの分布状態を測定するためには、ＤＮＡを化学両論的に、即ち特異的且つ割合的に染色することが必要である。
【０００３】
（細胞の有糸分裂と関係がない）全ＤＮＡ含量の変化は診断上使用されてきており、さらに近年は、ＤＮＡの空間的分布の立体配置の変化に基づいて、癌などの疾患を検出するための改善された法が導入されてきている。１つのこのような方法は、悪性腫瘍関連変化（「ＭＡＣ」）と呼ばれるものを使用するものであり、これらの変化は、癌などの疾患の存在下において時々観察され、細胞因子に対する一般に非特異的な応答の一例を提供する。
【０００４】
悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は、表面上は正常な細胞中のＤＮＡの分布状態において主に観察される、わずかな変化であると考えられる。ＭＡＣに基づくアッセイは、総ＤＮＡに基づく測定、又は特定のＤＮＡ変化を検出する遺伝的試験とは著しく異なる。何故ならＭＡＣとは異なり、これらのアッセイは、異常な細胞を利用するものだからである。したがって、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は、遺伝的試験ほど特異的ではない可能性はあるが、それらは、表面上は正常な細胞中の、疾患の存在又はＤＮＡ分布状態の変化を検出するための手段を提供する。ＭＡＣの利点には、関連又は非関連組織由来の細胞を利用して、癌などの疾患を検出できることが挙げられる。
【０００５】
関連組織は、試験する組織由来のみかけが正常な細胞を含むと妥当に予想することができる、サンプルであると思われる。例えば、喀痰サンプルを、肺癌をスクリーニングするために使用する場合、それは（剥離した肺細胞を含む）関連組織であると考えられ、乳癌を検出するための乳頭吸引液も同様であろう。乳頭吸引の考察は、Ｐｅｔｒａｋｉｓ、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｏｆ Ｎｉｐｐｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｅ Ｆｌｕｉｄ」中で見ることができ、他の考察はＬｅｉｆによる「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｎｉｐｐｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」中に与えられている。或いは、さらに利用しやすいか或いは好都合な細胞源（化学的メッセージによって疾患の存在に変えられている可能性がある）が、試験中の組織由来の多数の細胞を含む可能性がない場合、これは非関連組織であると考えられるであろう。したがって、例えば、口腔（頬粘膜）由来の細胞を、肺癌を検出するためのアッセイ用に使用する場合、頬粘膜は非関連組織であると考えられるであろう。
【０００６】
ＭＡＣのパラダイムの１つの考えられる制約は、本発明によって企図されるように、それが細胞核中のほぼすべてのＤＮＡを染色することに基づくものであり、ＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある細胞活性を不明瞭にする可能性があることである。
【０００７】
したがって、疾患の存在に対する高い感受性を与え、みかけが正常な細胞に基づく疾患検出法を与えることは有利であると思われる。本発明はこのような方法であり、ＤＮＡユークロマチンの量及び／又はＤＮＡユークロマチンの分布状態で測定される変化に基づいて、疾患を検出しモニターするための手段を提供し、したがってＲＮＡ／タンパク質合成に関する細胞の現在の可能性を評価する間接的な方法を提供する。
【０００８】
本明細書で使用する、「細胞応答因子」（ＣＲＦ）とは、生物学的細胞中のＤＮＡユークロマチンの量及び／又はＤＮＡユークロマチンの分布状態で測定又は観察することができる、タンパク質、化学物質、ストレス（例えば熱、磁気又は電磁気エネルギー、圧力、又は他の形のエネルギー）、薬剤、ビタミン、薬草、化粧品、又は環境条件などの外部の影響に対する、任意の細胞応答を意味する。濃度、及び細胞が遭遇するストレスの程度は、ｉｎ ｖｉｖｏでは限られる可能性があるが、本発明の方法は単独で使用することができ、或いは、他のアッセイ又はバイオマーカーと組み合わせて、植物細胞、培養細胞、幹細胞、細菌、又は、生きているか若しくは死んでいる、生物学的細胞の任意の他の源中において使用することができる。
【０００９】
一般にＤＮＡユークロマチンは、正確、安全且つ柔軟に細胞核内の壮大な細胞プログラムを進行させる、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のユニークな組合せである。本明細書で使用する、「ユークロマチン」又は「ＤＮＡユークロマチン」とは、転写により活性状態になると思われる、生物学的細胞中のＤＮＡの部分を意味する。この定義は、緩くコイル状であるＤＮＡ部分を含む。約１０パーセントのＤＮＡユークロマチンが、１０ｎｍの繊維として細胞中に存在する可能性があり、何本かの開いた鎖は直径約４ｎｍである。ＤＮＡユークロマチンの残りは、典型的には２０〜３０ｎｍの繊維として出現する。逆に、ヘテロクロマチンはユークロマチンよりも凝縮されており、転写により活性状態になることはなく、さらにコイル状になって、直径３００ｎｍの範囲の繊維を形成する可能性がある。
【００１０】
生物学界では、ＤＮＡ、及び癌などの疾患とＤＮＡとの関係の発見以来、生物学的細胞中のＤＮＡ含量を定量化するための方法を開発するために、相当な尽力がなされてきている。さらに近年、細胞学者はイメージサイトメーター、濃度計、フローサイトメーター、及びレーザースキャン式サイトメーターなどのツールを与えて、大きさ、形状、ＤＮＡ含量及びＤＮＡ分布状態などの細胞の特徴を測定してきている。イメージサイトメーターによって細胞全体のＤＮＡを測定するためには、ＤＮＡを最初に化学両論的に、即ちＤＮＡの量に比例して染色することが必要である。フォイルゲン法は、１つのこのようなＤＮＡ染色法であり、その対照物質はパラロサニリン又はチアジン誘導体であることが多い。フォイルゲン手順で使用される、最も一般的な染色物質には、パラロサニリン、アズールＡ、チオニン、及びアクリフラビン（吸光度及び蛍光染色手順において使用することができる）がある。有用なＤＮＡ染色物質に関する他の詳細は、「Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｉｍａｇｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」という表題のＭｉｋｅｌの刊行物中で見ることができる。
【００１１】
フォイルゲン法を使用してＤＮＡを染色するために、典型的には塩酸を使用して、ＤＮＡを最初に加水分解し、これによってプリン塩基を特異的且つ定量的に除去し、ＤＮＡのピリマジン−糖結合を完全な状態に保つ。裸にされたデオキシリボース糖は、ＤＮＡの骨格に沿ったアルデヒド基を暴露し、これらの基が後にシッフの試薬と結合して染色強度を生み出し、これは細胞中のＤＮＡの量と正比例することが理想的である。
【００１２】
フォイルゲン染色法は数十年で進化し、この進展中に、ＤＮＡ染色に影響を与えるいくつかの変数が同定された。これらの変数には、細胞固定、反応温度、加水分解時間、酸濃度、組織型及びクロマチンの凝縮性がある。２つの一般的なＤＮＡ用のフォイルゲン染色法が認められるようになっており、ＤＮＡ加水分解に関する条件が主に異なる。第１の方法は、比較的高い酸濃度（５ＮのＨＣＬ）での室温（２５℃）におけるＤＮＡ加水分解を支持するものである。第２の方法は、１ＮのＨＣＬを使用する６０℃の反応温度を採用するものである。
【００１３】
簡潔には、顕微鏡スライド上に置いた細胞を、前に記載した加水分解条件下で、典型的には２０分から６５分の間浸す。この時間中に、すべてのプリン塩基（アデニン及びグアニン）が、ＤＮＡから除去されることが理想的である。この還元状態は、ある程度の時間の間は比較的安定していることがあり、その後、連続的な酸加水分解によって、光学濃度の低下により示すことができるような、ＤＮＡの分解が引き起こされる。
【００１４】
ＤＮＡ加水分解を研究しながら、何人かの研究者達は、ＤＮＡの分画はすぐに染色されるらしいことを観察した。彼らは、ＤＮＡのこの部分を酸不安定と呼び、酸加水分解の動態をさらに詳しく研究し始め、酸不安定の特性を使用して、正常細胞と疾患細胞を区別することを期待した。さらなる考察は、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ｓｅｍｉ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｇｒａｄｅ ２ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｎｕｃｌｅｉ」、Ｓｏａｍｅｓ、「Ｆｅｕｌｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ ｉｎ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｆｉｎｃｈ、「Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ Ｉｎ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｍｅａｒｓ」、Ｋｌａｗｅ、「Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）Ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｏｆ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｍｅａｒｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｂｙ Ｍｅａｎｓ Ｏｆ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｐａｒｔｉｎｇｔｏｎ、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ− Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｉｄ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」、Ｏｇｄｅｎ、「Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｄｉｓｔａｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ｕｐｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ Ｏｒａｌ Ｍｕｃｏｓａ」、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ａ Ｓｅｍｉ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｆｏｒ Ａｉｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ＤＮＡ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｍｍａｒｙ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、及びＳｉｎｃｏｃｋ、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｂｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ」に見ることができる。
【００１５】
残念ながら、これらの研究からは、酸不安定ＤＮＡの全量に基づく、広く受け入れられるアッセイは発展しなかった。制約としては、厳しい条件下で多数のスライドを調製する必要性があることが含まれ、したがって、時間、コスト及びこれらの可能性のある方法の複雑性が増大する。加えて、さらに論じるように、これらの適用例は、ＭＡＣアッセイと同様に、ＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある細胞変化に対して低い感受性を有する可能性がある。
【００１６】
興味を引いたＤＮＡの他の側面は、細胞核中でのその空間的分布であった。１９５０年代後半に、Ｎｉｅｂｕｒｇｓはわずかな細胞の変化を同定し、これを疾患と関連付けた。最初に記載されたとき、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は珍奇なものであった。Ｎｉｅｂｕｒｇｓ；「Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）」、ＡＣＴＡ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ、１９６８、Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．６。様々な研究者達が、Ｎｅｉｂｕｒｇｓの研究を再現しようと試みた。ごく最近、ＭＡＣのパラダイムが再浮上し、自動式測定法が示唆された。依然として議論の余地はあるが、ＭＡＣは、みかけは正常な細胞核のＤＮＡの分布状態で測定される、わずかな変化として説明され、腫瘍又は他の細胞因子に対する非特異的且つ潜在的に全身性の応答と関係がある。したがって本発明では、好都合な術語として、一般的用語「細胞応答因子」即ち「ＣＲＦ」を採用する。
【００１７】
ＭＡＣ法は米国特許第５８８９８８１号中に記載され、さらに米国特許第６０２６１７４号中に記載されている。さらに、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ」という表題の２００２年８月２９日前後に出願された、ＭａｃＡｕｌａｙ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ他の同時係属米国特許出願第１０／２３２，６９８号は、細胞の特徴を計算する前にデジタル画像の正規化に基づきＭＡＣの評価を改善し、それによってこれらの細胞の特徴を識別する能力を保つための方法をさらに記載している。本発明は、ＣＲＦ又はＤＮＡユークロマチンの他の記述子を測定する際に使用するための、画像の正規化を支持する実施形態を含む。
【００１８】
ＤＮＡユークロマチンは、優先的に染色し評価することができる。いくつかの場合、例えば顕微鏡スライドなどの受容表面に細胞を置く場合、同じ細胞をさらに加水分解し、残りのＤＮＡを染色することができる。これによって、ＤＮＡユークロマチンの量及び分布状態と、細胞全体のＤＮＡ及びその分布状態を、細胞毎の単位で比較するための手段が提供される。この方法で測定されるＤＮＡ合成の量及び所在部位によって、さらなる診断情報を提供することができる。他の顕微鏡法が広い容認を得ているので、これらの能力は高い重要性を有する可能性がある。例えば、共焦点顕微鏡によって、三次元の再構築用の複数の細胞の画像片を集める能力が提供される（例えば米国特許第６３８８８０９号）。本明細書において企図されるように、受容表面に関するこの但し書きは、フローサイトメーターなどの他の測定ツールが、ＤＮＡ及び関連する細胞の特徴を測定する能力を与えることができることを、思い出させるものとして働く。これらのシステムは、流体環境中に細胞を維持し、典型的には細胞を、レーザーを含むことが多いセンサーへと誘導する。フローサイトメトリーによる分析の後、細胞選別などの特別な努力を利用しない限りは、アッセイで使用する生物学的細胞は、典型的には失われる。
【００１９】
数十年の努力が、ほぼすべてのＤＮＡを染色するためのフォイルゲン法の最適化に費やされているが、フォイルゲン法は典型的には、ＤＮＡユークロマチンの優先的な染色を提供するわけではなく、本発明に利点を与えるために活用することができる方法における１ステップを与える。このステップはＤＮＡ加水分解に関するものであり、それにより酸を使用して、ＤＮＡ骨格からプリン塩基を選択的且つ特異的に取り除く。典型的には、パラロサニリン又はチオニンなどのチアジン誘導体などのＤＮＡ吸収性染色物質が、対照物質として使用される。他のＤＮＡ染色物質には、ヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（３３３４２及び３３２５８）、ＳＹＴＯＸ（青色、緑色又はオレンジ色）などの、アデニン−チアミン選択的染色物質、並びにクロモマイシンＡ３及びミトラマイシンなどのシトシン−グアニン染色物質がある。しかしながら、典型的にはこれらの染色物質が、濃縮クロマチンとユークロマチンを区別することはない。しかしながら、将来的に、いくつかのＤＮＡ部位を阻害して、その後１つ又は複数のこれらのＤＮＡ蛍光染色物質を本発明用に活用することができる可能性がある。核酸を素早く染色するための新しい方法（例えばＵＳ６２７１０３５）が導入されており、マイクロ波も染色を容易にするために使用されてきている。
【００２０】
ＤＮＡ及びＤＮＡユークロマチンを評価するための他の方法は、ＤＮＡのメチル化状態に基づく。これらの技法は比較的複雑で、ＤＮＡを細胞から除去し、ＰＣＲ又は他の技法を使用してさらに操作することを典型的には必要とする。ここでも、メチル化状態に基づくＤＮＡ法は、入手又は接近することが困難である可能性があり、ときにはバイオプシー手順を必要とする異常な細胞に対して最適に機能する。
【００２１】
したがって、容易に接近可能な、みかけは正常な細胞に適用することができると思われる、疾患を検出し調べる簡潔な方法を提供することが有利であると思われる。バイオプシーから得た組織は、本発明、危険集団のスクリーニングなどの、多量体積の用途に使用することができるが、接近可能な体腔（例えば頚部）、体液（例えば血液又は尿）、吸引液（例えば乳液又は穿刺吸引液）、洗浄物（例えば気管支洗浄又は前立腺洗浄）、又は典型的には剥離細胞が豊富なサンプル（例えば、肺喀痰又は口腔由来の細胞）からの細胞のスクレーピングを使用することが好ましい可能性がある。本発明の方法は、特異的マーカー又は疾患機構がまだ完全には理解されていない疾患、例えば自己免疫疾患、ストレス障害、慢性疲労症候群、アレルギー、加齢性障害、感染、又はアルツハイマー病などの他の変性疾患を検出しモニターするのに有用となる可能性もある。同様に、ビタミン、薬草、食品栄養剤、薬剤の複雑な相互作用、及び日光から細胞音までの様々な形のエネルギーへの暴露によっても、ＤＮＡユークロマチンにおいて観察可能な細胞の変化を引き起こす可能性がある。これらは例えば、治療に対する疾患応答性のモニタリング、健康状態の評価、生物活性の評価、又は薬理学的物質のスクリーニングに利用することができる。一般的に言うと、細胞中のＲＮＡ／タンパク質合成の変化を引き起こすか、或いはそうした変化と関係があるものは何でも、これらの変化が微生物、植物又はヒト中で起ころうと、潜在的に関心が持たれる。さらに、ＤＮＡユークロマチンの評価を使用して、細胞死（アポトーシス）又は他の生物学的プロセスを、或いは例えば死滅した細胞又は死滅しつつある細胞をサンプル採取することによる「死期」の決定などの、新しいアッセイの基盤として、さらに特徴付けることが有用である可能性がある。
【００２２】
１９６０年代半ばに、Ｄｅｃｏｓｓｅ及びＡｉｅｌｌｏは、ＤＮＡの酸加水分解を記載し、５．０ＮのＨＣＬを使用する室温（２６℃）でのフォイルゲンの加水分解は、１．０ＮのＨＣＬを使用する６０℃でのＤＮＡの酸加水分解と本質的に同等であったことを結論付けた、「Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ Ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」という表題の論文を発表した。この著者らは、室温において前者によって与えられた１２０分の停滞状態は、６０℃で観察された２０分の安定状態より優れていたことを示した。さらに彼らは、脱プリン化（ＤＮＡからのプリン塩基の除去）は酸濃度に主に依存しており、その後のＤＮＡ分解は酸よりも熱に主に依存すると結論付けた。したがって、加水分解に関するこれらの反応温度及び条件は、従来技術で論じられたものとは反対である。本発明のいくつかの実施形態は、優先的な染色によって評価するためのＤＮＡユークロマチンを同定し、例えば、ＤＮＡの酸加水分解に関する反応温度を約１０℃低下させると、加水分解は（所与の温度で）４倍遅れると思われ、これによってＤＮＡ染色よりも改善された対照が与えられ、より詳細にはＤＮＡユークロマチンの優先的な染色が容易になる。
【００２３】
その後、Ｆｕｋｕｄａは、ＤＮＡの酸加水分解及び染色の歴史を、「Ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」中に要約し、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」中でさらに論じた。同様の結論が、Ｚｅｌｅｎｉｎによる「Ｐｅｃｕｌｉａｒｉｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｂｙ Ｓｔｕｄｙ Ｏｆ Ｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｏ Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ」中、及びＫｊｅｌｌｓｔａｎｄの「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ａｎｄ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」中で観察された。
【００２４】
さらに近年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｌｏｉｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５０１６２８３号は、５ＮのＨＣＬ中での６０〜７５分間の酸加水分解と、それに続く６０分間のチオニン染色を教示している。同様に、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５４８５５２７号は、５ＮのＨＣＬ中での６０〜約７５分間の酸加水分解を教示している。さらに、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｉａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」という表題のＬａｍの米国特許第５９４２４１０号は、ＤＮＡ染色に関する従来技術についてまとめ、５ＮのＨＣＬ中での６０分のＤＮＡ加水分解時間、次に７５分の染色をさらに推奨している。ＤＮＡ染色は、「Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」という表題のＺａｈｎｉｓｅｒの米国特許第６３４８３２５号中でも論じられている。
【００２５】
ＤＮＡの測定値を測定し活用するための現在の装置及び方法は、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ」という表題のＭａｃＡｕｌａｙの米国特許第５８８９８８１号中、及び「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ」という表題のＰａｌｃｉｃの米国特許第６０２６１７４号中にも教示されている。この従来技術は、疾患を検出するための、ＤＮＡ含量（倍数性）及びＭＡＣ（表面上は正常な細胞内のＤＮＡの分布状態において主に表される、わずかな変化）の使用を教示し、且つ様々な有用な細胞の特徴を論じる。さらに、ＭＡＣを使用する疾患検出用のＤＮＡの記述子は、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ」という表題の２００２年８月２９日前後に出願された、ＭａｃＡｕｌａｙ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ他の同時係属米国特許出願第１０／２３２，６９８号中でさらに論じられており、これは特に、ＤＮＡの測定、細胞の特徴、及び細胞のデジタル画像を最初に正規化することによって、細胞の特徴を正規化するための方法を論じている。
【００２６】
このＭＡＣの従来技術は、細胞の特徴の組合せを使用すること、及びＤＮＡ測定値を、ＣＲＦと同様に細胞応答因子であるとみなすことができる、ＭＡＣ値などの値に低下させることについても論じている。したがって、このＭＡＣの従来技術、及び本明細書中で引用した他の従来技術は、本明細書に参照によって含まれる。
【００２７】
今日、ＤＮＡらせんが、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を開始させるために特定の遺伝子座において、局所的な鎖の分離を受けなければならないことは理解されている。このような活性は、遺伝子の転写及び複製中に観察される。様々細胞型中の大部分のＤＮＡは、細胞のプログラミングの後は特に、不活性な状態である。したがって、全ＤＮＡ及びＤＮＡユークロマチンを測定すること、及びＤＮＡユークロマチンの割合などの比率としてこれらの値を表すことが、有用である可能性がある。
【００２８】
関連した研究において、研究者達は、酸不安定ＤＮＡの増加が、悪性腫瘍と関係している可能性があると考えた。酸不安定ＤＮＡは、Ｓｉｎｃｏｃｋによって探された。彼はＦｕｋｕｄａ（「Ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」）より低い加水分解温度を提案し、５ＮのＨＣＬ中で３０℃において加水分解を行い、いくつかの疾患（ＣＩＮ２）は、Ｓ期（その最中に、有糸分裂中の細胞が、ほぼ同じそれらのＤＮＡをコピーする期）の細胞の割合の増大を引き起こす可能性があることを示した。以前、Ｍｉｌｌｅｎも、「Ｆｅｕｌｇｅｎ−Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｃｅｒｖｉｘ Ｕｔｅｒｏ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｉｄ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」中で、以前の研究で使用された温度より低い温度を提案し、室温における５ＮのＨＣＬを選択した。同様に、Ｐａｒｔｉｎｇｔｏｎは、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ」中でこの提案をした。「Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ａｎｄ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｏｒａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」という表題のＳｏａｍｅｓの１９９５年の論文中では、加水分解条件は、室温における５ＮのＨＣＬであった。前に引用したＫｊｅｌｌｓｔａｎｄは、フォイルゲン加水分解に関する広範囲の温度及び酸性を論じているが、彼が部分的なＤＮＡ染色に関する利点を論じ認めることはなく、したがって、本発明の方法及び実施形態とは反対の結論及び推奨を与えている。
【００２９】
「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ａｎｄ ｍｕｔａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」という表題のＤｕｆｆｙの米国特許第５８７１９１７号は、特に、遺伝子のコード領域及び調節領域の近くに存在するゲノムＤＮＡ断片を、検出し単離するための方法を論じている。ＤＮＡは腫瘍細胞中ではメチル化されることが多いことを記す。
【００３０】
「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｔｅｓｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ ＤＮＡ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ」という表題のＤｕｆｆｙの米国特許第６４５１５５５号は、遺伝子のコード領域及び調節領域の近くに存在するゲノムＤＮＡ断片を検出及び単離し、様々な領域中でＤＮＡがメチル化される程度を感知するための方法を論じている。
【００３１】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｂａｓｅ−ｐａｉｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍｓ」という表題のＭｏｄｒｉｃｈの米国特許第５５５６７５０号は、指標としてＤＮＡタンパク質複合体形成を使用して、塩基対ミスマッチを検出するための、ＤＮＡ鎖の接触及び比較を論じている。
【００３２】
ヒトゲノムプロジェクトでは、本質的に線状構造の問題（核酸配列）に対処したが、タンパク質は、大部分のそれらの官能基を、それらをしばしば高い特異性で他の化学物質及びタンパク質と反応及び相互作用させる形状及び暴露又は帯電領域から誘導する、三次元の問題点を示す。したがって本発明は、塩基対ミスマッチなどの特異的な異常を測定しようとするものではなく、細胞レベルでＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある変化を測定しようとするものである。
【００３３】
「Ｈｙｄｒｏｍｅｔｈｙｌ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ）ｐｕｒｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」という表題のＺａｈｌｅｒの米国特許第５２０６２４４号は、メチル化試薬、及びタンパク質合成、及びより詳細にはＤＮＡの構成単位−プリン、アデニン及びグアニン、並びにピラミジン、シトシン及びチミンのメチル化状態と関係がある、様々な因子を論じている。
【００３４】
「Ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＬＳ）ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ」という表題のＢａｘｔｅｒの米国特許第５９３６０６４号は、特異的な酸不安定タンパク質及びその断片を論じている。この従来技術は概して、酸不安定タンパク質、及びタンパク質状態をそれらのアミノ酸に基づいて評価するための手段に関するものである。
【００３５】
「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｎｎｉｎｇ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ」という表題のＧｉｌｃｈｒｅｓｔの米国特許第５６４３５５６号は、紫外線光などの物質への暴露に由来する皮膚へのダメージを特に論じている。この特許（５５６）はメラニン形成−刺激に関心を置くものであるが、本発明を使用して、様々な物質が細胞応答と関係があるかどうか、評価するのを手助けすることができると思われる。
【００３６】
「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」という表題のＳａｎｆｏｒｄ−Ｍｉｆｆｌｉｎの米国特許第５７７３２１９号は、ギャップ及び切断などのＤＮＡの評価値を使用する。このような変化は、本明細書において企図されるように、ＤＮＡユークロマチンの評価値によって推測することもできる。
【００３７】
「ＤＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」という表題のＤｏｎａｈｕｅの米国特許第５６７０６２１号は、ＤＮＡ構造、哺乳動物の細胞因子及び薬剤応答を特に論じている。
【００３８】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ」という表題のＧｒｉｍｌｅｙの米国特許第６４５５５９３号は、細胞抑制物質及び標的化細胞毒性障害を記載している。ここでも、本発明を単独又は組合せで使用して、様々な物質の発見を評価又は支持するのを手助けすることができる。
【００３９】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ」という表題のＨｕｎｇの米国特許第６３９１０２６号は、乳疾患を治療するために使用される診断法及びエネルギー形態を記載している。本発明は、例えば、このような治療の有効性を調べるのを手助けする際に、使用することができると思われる。
【００４０】
「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓａｙｉｎｇ ｍａｍｍａｒｙ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ」という表題のＱｕａｙの米国特許第６２８７５２１号は、哺乳動物の体液などの、細胞を含む生物サンプルを得ることを論じている。本明細書に記載するように、乳吸引液は、本発明によって企図されるように乳癌を検出するための関連組織であると考えられる。
【００４１】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎ」という表題のＦｒｅｅｄの米国特許第６０３５２５８号は、組織学的組織のフォイルゲン染色をさらに論じている。同様の方法を、望み通りに本発明の方法に適用することができると思われる。
【００４２】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｒａｔｅ」という表題のＶａｎ Ｈｏｕｔｅｎの米国特許第５９８９８１６号は、ＤＮＡの修復を測定し様々な治療法の有効性を調べるためのＤＮＡアッセイを論じている。本発明を使用して、このようなアッセイを支持することができる。
【００４３】
「Ａｃｃｕｒａｃｙ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｉｔｏｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＫａｍｅｎｔｓｋｙの米国特許第５６３３９４５号は、蛍光染色物質を用いたＤＮＡ染色、及びサイトメーターを使用する測定を記載している。したがって、ＤＮＡの測定、及び細胞周期の評価が論じられ、例えばこの特許の図３、１４、１５及び１６中と同様にプロットされている。したがって、ＤＮＡのヒストグラムは、本発明の図１ａ中の従来技術のものと同様に表される。
【００４４】
「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＤｏｕｇｌａｓｓ他の米国特許第６２１５８９２号は、ＤＮＡを測定するために使用することができるイメージサイトメーターを論じている。
【００４５】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｅｄｉａ」という表題のＡｌｆａｎｏの米国特許第５８４９５９５号は、レチノイン酸などの物質、及び細胞レベルでの影響を測定するための手段を特に論じている。様々な物質の影響のモニタリングは、本発明に関して企図される。
【００４６】
「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」という表題のＧｉｂｓｏｎの米国特許第３９５７５８３号は、生物活性の評価、及び薬理学的スクリーニンング、及び様々な培養培地における問題及び関心のいくつかを論じている。
【００４７】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｌｏｉｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５０１６２８３号は、他の構造のイメージサイトメーター、及び時にはエストロゲンなどの他の生物学的指標と共に、ＤＮＡを染色し測定するための方法（例えばフォイルゲン）を論じている。さらに、この特許（２８３）は、例えば、ＤＮＡキャリブレータを使用し、ＤＮＡ値をピコグラムに転換する、ＤＮＡ含量を表す様々な方法を論じている。このような転換は、望み通りに本明細書で企図されるようにＤＮＡユークロマチンに適用することができると思われる。
【００４８】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５４８５５２７号は、確立されており提案済みのＤＮＡ染色（例えば、チオニンを使用する）及びさらに詳細にはＤＮＡの加水分解条件のさらに他の例となるＤＮＡ測定をさらに論じている。
【００４９】
ＤＮＡ染色は、さらに詳細に、「Ｔｈｉｏｎｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」という表題のＺａｈｎｉｓｅｒの米国特許第５１６８０６６号で論じられており、チオニンを用いるＤＮＡ染色、及び細胞質などの様々な細胞要素の対比染色をさらに論じている。
【００５０】
「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｉａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ」という表題のＬａｍの米国特許第５９４２４１０号は、ＤＮＡ及びフォイルゲン染色法をさらに論じている。
【００５１】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｏｃｃｕｌｔ ｏｒ ｎｏｎ−ｅｘｉｓｔｅｎｔ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」という表題のＲａｖｉｄｉｎの米国特許第５８６２３０４号は、予後のデータの評価及びＤＮＡのヒストグラムを論じている。
【００５２】
「Ｍｅｄｉｃａｌ ｗｅｌｌｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ，ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」という表題のＣｏｓｅｎｔｉｎｏの米国特許第６４５４７０５号は、患者をモニターすること、情報に修正を加えて値を形成することを論じており、且つ傾向の認識及び調査頻度を論じている。この特許（７０５）は、症候性患者を同定するための系統的な意思決定法を記載しており、さらに、本発明の方法を使用して、ＤＮＡユークロマチン中で観察される、非特異的な変化（例えば、ＲＮＡ／タンパク質合成の変化）を同定することができ、これらの変化を、癌を含めた肺関連疾患の現在又は過去の喫煙者などの無症候群をスクリーニングするために使用することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００５３】
本発明は、例えば、疾患を検出し、健康状態をモニターし、生物活性を評価し、且つ薬理学的スクリーニングをするための、生物学的細胞中のＤＮＡユークロマチンを同定し評価する方法である。一実施形態は、例えば生物学的細胞中のＤＮＡを優先的に染色することにより、ＤＮＡユークロマチンを同定し評価することに基づいて、疾患を検出し、治療に対する疾患の応答性をモニターするための方法を記載する。他の実施形態は、ＤＮＡユークロマチン、例えば個々の細胞中のＤＮＡユークロマチンの量及びＤＮＡユークロマチンの分布状態を同定し評価するための手段を提供し、疾患、又は様々な影響に対する細胞の暴露などの、いくつかの条件において変化する可能性がある、ＲＮＡ／タンパク質合成と一般に関係があるアッセイを確立させる。
【００５４】
したがって本発明は、ＣＲＦなどの値として表すことができる、ＤＮＡユークロマチンを測定することによって、癌などの疾患の潜在的な存在を検出するための方法を与える。みかけは正常な細胞中のＤＮＡユークロマチンを評価することによって、特異的又は非特異的な細胞の異常性の存在を利用する遺伝的試験又は他のアッセイに、有用な追加的情報を与えることができる。本発明は、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）などのアッセイと比較して、感度及び特異性の改善ももたらす。さらに、個々の生物学的細胞又は生物学的細胞の源の、ＤＮＡユークロマチン染色の基底レベルを確定することによって、本発明は、健康状態の指標として使用することができる変化、疾患の治療を含めた様々な影響に対する応答性をモニターするための手段を提供する。様々な物質の薬理学的スクリーニング又は生物活性の評価用に、暴露の前、後、最中、或いはこのような影響を取り除いて、例えばＤＮＡユークロマチン中で観察されるＤＮＡの応答性を評価した後で、細胞を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明の好ましい実施形態の方法の編成及び様式、並びにその他の目的及び利点は、以下の図面と共に以下の説明を参照することによって、最もよく理解することができる。
【００５６】
図１ａ（従来技術）は、肺癌患者から採取した内皮細胞のサンプルに関する、典型的なＤＮＡ含量のヒストグラム１１０を示す。この場合、ＤＮＡ異数体のピーク１３０は診断情報を与え、癌としてこれを同定することができる。さらに、このような診断指標の不在下でも、ＭＡＣはみかけは正常な細胞、例えばＤＮＡ含量のヒストグラム１１０の、２倍体ピーク１１０中の細胞で評価することができ、典型的にはそうされる。
【００５７】
図１ｂ（従来技術）は、肺内皮細胞の正常サンプルに関する、典型的なＤＮＡ酸加水分解の典型的な時間基準測定１４０、及び肺癌に関する酸不安定曲線１５０を示す。研究者達は、彼らが「酸不安定」と呼んだＤＮＡ分画の酸加水分解の割合の違いに潜在的な診断有用性があることを示した。このようなデータを得るためには、多数のスライドを処理する（特定の時間間隔で加水分解し染色する）ことが必要である。これによって、酸加水分解（ＤＮＡ動態）は診断情報を与えることができることが実証されるが、本発明は、加水分解条件を変えてＤＮＡ動態を活用し、より詳細にはＤＮＡユークロマチンを優先的に染色する。
【００５８】
図１ｃは、フォイルゲン法を使用して優先的に染色されるそのＤＮＡユークロマチンを有する、正常な生物学的細胞に関する本発明のヒストグラム１７０を示す。このヒストグラムは、これらの細胞中で起こる潜在的なＲＮＡ／タンパク質合成の、細胞中の比較的均一なＤＮＡユークロマチン染色、並びに（例えば、標準偏差、勾配、その他などの、人口静態によって評価した）範囲、及び程度（例えば、ピーク平均染色強度）を示すピーク１７１を示す。前で論じたように、ＤＮＡユークロマチンと全体の細胞ＤＮＡの比率を表すことも有用な場合もある。
【００５９】
図１ｄは、疾患細胞中のＤＮＡユークロマチンの優先染色に関する、本発明のヒストグラム１８０を示す。領域１８１の細胞は、増大したＤＮＡユークロマチン（転写中に活性がある可能性がある、より小さなＤＮＡファイバー）を示し、第２の小さなピーク１８２は、異なる活性（ＲＮＡ／タンパク質合成）を有する細胞の亜群を表す可能性がある。ここでもまた、ＤＮＡユークロマチンと全体の細胞ＤＮＡの比率が、診断情報を与える可能性もある。このような比率は、すべての細胞に関して、或いは様々な細胞の亜群に関して、表すことができると思われる。例えば、ＤＮＡユークロマチン又はＤＮＡユークロマチンの比率は、図１ａに関して論じたＤＮＡ含量のヒストグラム１１０の、ピーク１２０の２Ｓ．Ｄ．以内の細胞などの細胞の亜群に関して、測定することができると思われる。大きさ、形状、丸さ、表面積、規則性、その他などの、様々な細胞の特徴を一般的に使用して、細胞及び細胞の亜群を同定し、これらは然るべく適用することができる。
【００６０】
図２ａ（従来技術）は、核２０５、及び染色されたＤＮＡ２１０を有する典型的な内皮細胞２００を図によって示す。明るい染色領域と暗い染色領域（ヘテロクロマチン）を、細胞の特徴の点において表し評価することはできるが、明るい染色領域及びＤＮＡの微細な糸（潜在的なユークロマチン）は不明瞭であり、或いはこれらのシグナルは、重複又は隣接する暗いＤＮＡ染色領域によって部分的に覆い隠されている。ＭＡＣのいくつかの特徴的な影響は、ＤＮＡ再編成、したがってＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある可能性がある。したがって本発明によって、類似の、ＭＡＣ、又はＭＡＣ単独よりも、おそらくより一層の診断感受性を付与することができる。
【００６１】
図２ｂは、そのＤＮＡが染色された、図２ａに関して論じた細胞などの、細胞核２０５のピクセレート画像を示す。大きさ、形状、積分光学濃度（ＤＮＡ全体）などの細胞の特徴、及びＤＮＡの空間的分布を記載する他の細胞の特徴は、一般的にこれらのデジタル画像から測定する。細胞の特徴の例、及びそれらの適用例は、第５８８９８８１号及び第６０６２１７４号などの本明細書で引用した様々な米国特許に見ることができる。
【００６２】
図２ｃは、優先的な染色によって同定した、核２０５、及びＤＮＡユークロマチン２２０を有する、典型的な内皮細胞２００を図によって示す。この場合、図２ａに関して論じた、暗い染色された凝縮ＤＮＡ（ヘテロクロマチン）は染色されず、しかしながら、ＤＮＡユークロマチン２２０は、優先的な染色によって同定された。
【００６３】
図２ｄは、優先的な染色によって同定した、そのＤＮＡユークロマチン２２０を有する、典型的な細胞核２０５のピクセレート画像を示す。ＤＮＡユークロマチンの量、及びＤＮＡユークロマチンの空間的分布は、このデジタル画像から測定することができる。微細なＤＮＡ糸（直径約１０ｎＭ、いくつかの鎖は直径約４ｎＭの一本鎖に分離する可能性あり）、及び直径約２０〜３０ｎＭのＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ／タンパク質合成の可能性のある部位である。全体の暗さは、核境界の有用な指標も与えるので、いくつかの場合、通常の細胞の特徴の測定法以外に、或いはこれと組み合わせて、他の境界要素法又は評価法を、例えばおおまかな細胞の大きさに基づいて使用することができ、楕円形の測定値を、対比染色した細胞のデータ又は核又は細胞質に適合させることができる。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態では、診断情報は、ＤＮＡユークロマチン／細胞全体のＤＮＡなどのＤＮＡの割合を含むことができ、これは比率として表すこともできる。さらに、個々の細胞上でのＤＮＡ測定以外に、組織切片上で測定するとき、細胞の分布状態が、例えば腫瘍の侵襲性又は段階を評価する際に有用な組織構造に関する、診断情報を与える可能性がある。したがって、数個〜数百個の細胞画像を含むシーンでは、いくらかの量のＤＮＡ及び／又はＤＮＡユークロマチンを有する細胞の分布状態を、診断指標として潜在的に使用することができる。ボロノイ図などの様々な技法を使用して、培養中の組織構造又は細胞編成の説明が与えられてきている。これらの技法の基本及び適用例のいくつかは、「Ｓｙｓｔｅｍ、ｍｅｔｈｏｄ、ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｄａｔａ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐａｃｅ」という表題のＡｇｒａｆｉｏｔｉｓの米国特許第６４５３２４６号で論じられている。（２４６）のある部分は化学構造の記述子を対象とするが、領域中のＤＮＡユークロマチンの分布状態を記載するために、同様の技法を使用することができると思われ、このような使用は本発明で企図される。
【００６５】
図３ａは、細胞を回収するステップ３００、ＤＮＡユークロマチンを優先的に染色するステップ３１０、及びＤＮＡユークロマチンの量及び分布状態を測定するステップを含む、本発明の実施形態を示す。
【００６６】
図３ｂは、全ＤＮＡを測定すること３３０、及び様々なＤＮＡのパラメータ又はＤＮＡユークロマチンの比率を計算すること３４０をさらに含む、図３ａに関して論じた、本発明の他の実施形態を示す。
【００６７】
図３ｃは、細胞応答因子（ＣＲＦ）及びＤＮＡの比率などの様々な計算の結果を表すこと３３０、及びこれらの結果とデータベースを比較すること３６０をさらに含む、図３ａ及び図３ｂに関して論じた、本発明のさらに他の実施形態を示す。データベースは、複数の正常サンプル及び疾患サンプルに関して得られた、結果を含むことができる。
【００６８】
図３ｄは、試験例の以前のデータと現在の結果を比較して、それによって例えば個々の植物、細胞系、動物又は生物学的細胞の他の源中の、ＲＮＡ／タンパク質合成の変化をモニターするための高感度の手段を与えるステップ３８０をさらに含む、本発明のさらに他の実施形態を示す。フォイルゲン法と共に用いられるように、本発明の方法は、従来技術で論じられたこととは異なり、加水分解条件を変えることにより利点を得て、これによって新規の診断情報が誘導される。より詳細には、一実施形態において、本発明の方法は、室温より低い温度でＤＮＡ酸加水分解を実施し、ＤＮＡユークロマチン（タンパク質合成と最も関係があるＤＮＡのその部分）に対する染色を制限することを試みる。例えば、摂氏１５度において５ＮのＨＣＬ中で１時間の酸加水分解を実施し、次に着色剤としてチオニン又はパラロサニリンを用いて、１時間のフォイルゲン染色を実施する。新規の加水分解条件を確定させること以外に、ＤＮＡユークロマチンの全体量（酸不安定ＤＮＡと関係している可能性がある）を定量化することを単に試みるのではなく、本発明のさらに他の実施形態では、ＤＮＡユークロマチンの分布状態を、この独特に染色されたＤＮＡ分画上で測定する。細胞が疾患又は化学因子に応答すると、いくつかの場合、これらの細胞のＤＮＡユークロマチン中において、ＤＮＡ合成の変化を観察し測定することができる。このような細胞応答をＣＲＦなどの値として表すことは、有用である可能性がある。
【００６９】
細胞調製物は、頚管又は頬粘膜のスクレーピング、乳頭吸引、気管支洗浄、喀痰又は他の体液、又は非凝集性組織の細胞調製物から調製される。本明細書で使用する、関連組織は、疾患組織の細胞、又は疾患組織に由来する細胞を有すると予想することができる、任意の組織を意味する。例えば、喀痰サンプルは、肺癌を試験するために使用するとき、関連組織として定義される。何故なら、このようなサンプルは、大部分が剥離した肺細胞を典型的には含むからである。同様に、乳頭吸引液の使用は、乳癌を検出するための関連組織と考えられる。本明細書で使用する非関連組織は、主に評価する疾患に由来する細胞は、典型的には含まない組織を意味するものであり、例えば、肺癌を検出するために使用される頬粘膜（口腔由来の細胞）は非関連組織と考えられ、前立腺癌を検出するための排尿又は前立腺洗浄物の使用も同様であろう。血液、ＣＳＦ、血漿などの体液を試験する場合、それは非関連組織と考えられるであろう。何故なら、癌又は疾患部位は、他のマーカーを用いて同定されない限り、或いは予想されない限り、再発の場合と同様に、一般的には知られないからである。この特徴によって、関連組織において局所的に、非関連組織においてさらに全身的な影響として、細胞応答因子（ＣＲＳ）を検出するための本発明の方法の能力及び意図が明らかになる。
【００７０】
寄託済みの細胞物質を、適切なＤＮＡ染色法及び測定ツール、例えばイメージサイトメトリーにより行う、ＤＮＡユークロマチンの量及びＤＮＡユークロマチンの分布状態の評価を伴う、フォイルゲン染色を使用して染色する。ＤＮＡユークロマチンは、研究者達が酸不安定ＤＮＡと以前に呼んだものと関係がある可能性があるが、しかしながら、本発明の染色法は、酸加水分解の動態を活用してＤＮＡユークロマチンを標的化する反応条件を確定する。
【００７１】
一般的な定義によって、ＭＡＣの評価には、表面上は正常な細胞の分析が必要である。これを実施するためには、ＤＮＡ含量を最初に測定して（典型的には分布状態として）、閾値を確定して（例えば、２倍体ピークからの２つの標準偏差）、ほぼ正常な量のＤＮＡを有する細胞をグループ分けしなければならない。異常なＤＮＡ含量（異数体）は、それ自体が病状を示す可能性があり、したがって、これらの細胞は典型的には、ＭＡＣに関して評価されないと思われる。
【００７２】
本発明の方法は、ほぼすべてのＤＮＡを染色することを必要とするＭＡＣ法とは、さらに区別される。本発明の方法は、Ｐａｐスクリーニング用の頚管のスクレーピングと同様に、疾患組織を直接サンプル採取するときでも、実質的な制約を示す可能性がない相当群の表面上は正常な細胞を含むと予想することができる、患者サンプルに適用することが最良である。多くの頚椎癌の場合、顕微鏡のスライド上に相当数の癌細胞が出現することは、ある程度まれなことであると考えられる。乳癌を検出するための乳頭吸引液、肺癌を検出するための頬粘膜などのサンプル、及び剥離細胞中で豊富な他のサンプルに関しては、これらの考慮事項が本発明の方法の活用を妨げることはない。何故ならこれらは、相当数の表面上は正常な細胞を含むからである。ＤＮＡ含量及びＤＮＡ分布状態に基づく、他の疾患検出法との他の有意な違いは、本発明の方法は、細胞周期の古典的なＤＮＡのヒストグラムを作製しないことである。分析用にＤＮＡ２倍体細胞を選択する必要がない。何故なら、適切なサンプル中の大部分の細胞が、ｓ期に存在しないと思われるからである。本発明の方法の感度又は特異性を向上させるために、ＣＲＦの測定を、ＤＮＡ１倍体、ＭＡＣ又は他の診断試験などの、他のアッセイと共に使用することができる。同様に、ＣＲＦの測定を使用して、危険性のある群をスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を有する細胞表面マーカー、又は遺伝子マーカーの評価などの後の試験用に、さらに限られた群を同定することができる。ＤＮＡユークロマチン（例えばＣＲＦとして表される）の診断評価は、試験サンプル中において細胞単位で細胞に行うことができ、或いは同じ源由来の試験サンプル（疾患又は疾患の治療を調べるための手段を与える）間の、スライド毎の単位で行うことができ、或いは試験サンプル中のＣＲＦは、群の範囲又は他の有用な標的範囲と比較することができる。
【００７３】
米国特許出願第１０／２３２，６９８号中で論じられたのと同様に、デジタル画像の正規化を使用し、細胞の特徴を計算する前に、利点を得ることができる。以前の方法（例えばＭＡＣ）は、細胞周期のＤＮＡのヒストグラムの分析に頼るものであった。本発明の方法は、デジタル画像の正規化の独特の方法を与える。さらに、全体のＤＮＡを評価し、ＤＮＡユークロマチン分画を推定するための基盤を与えることができる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態を示し記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明の変更形態を考案することができることは想定される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】（従来技術）、肺癌患者から採取した上皮細胞のサンプルに関する、典型的なＤＮＡ含量のヒストグラムの図である。
【図１ｂ】（従来技術）、肺内皮細胞の正常サンプルに関する、ＤＮＡ酸加水分解の典型的な時間基準測定、及び肺癌に関する酸不安定曲線の図である。
【図１ｃ】フォイルゲン法を使用して優先的に染色されるそのＤＮＡユークロマチンを有する正常な生物学的細胞に関する、本発明の実施形態の図である。
【図１ｄ】疾患細胞中のＤＮＡユークロマチンの優先染色に関する、本発明の実施形態の図である。
【図２ａ】（従来技術）、染色された核を有する典型的な内皮細胞の図である。
【図２ｂ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する、図２ａの典型的な内皮細胞の図である。
【図２ｃ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する、典型的な生物学的細胞の図式図である。
【図２ｄ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する典型的な生物学的細胞の、ピクセレート画像の図である。
【図３ａ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｂ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｃ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｄ】本発明の実施形態のブロック図である。
【技術分野】
【０００１】
生物学的細胞は、それらがそのプログラム化された義務を果たす際に、栄養、化学物質及び細胞因子の海に浸っている複雑な経路を介して生存し連絡している。疾患及び感染のいくつかの場合、多数の細胞が、身体の防御機構に関与する、或いは他の場合はそれを支援することを要求される。生物学的活性を有する様々な分子が、細胞核に浸透し、二本鎖状態又は一本鎖状態のＤＮＡと結合し、これによってＤＮＡらせんの開裂又は閉鎖に関与し、それ故のＲＮＡ／タンパク質合成の上方又は下方制御に関与する。疾患に直面すると、細胞は劇的な様式で応答し、現在の義務を放棄して新しい役割を採り入れ、時折分化して抗体産生細胞又はスカベンジャー細胞になる可能性がある。しかしながら、細胞修復などの通常の有益な機能調整任務を果たす他の細胞は破壊されて、癌組織の増殖又は血管新生を助長する因子が生成する可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
時折、罹患組織と隣接しているか或いはそこから離れている細胞が、系中を循環する細胞因子によって疾患の存在に変わる可能性がある。しかしながら、明確な様式で応答する代わりに、様々な細胞がＤＮＡのわずかな再編成を受ける可能性があり、この再編成は、凝縮クロマチン（ヘテロクロマチン）と、ＲＮＡ／タンパク質合成において一般的に活性がある可能性がある、さらに緩くパッケージされたＤＮＡ（ユークロマチン）の両方において、観察することができる。典型的には、これらの方法によってＤＮＡを観察するためには、ＤＮＡを視覚的に増大させることが必要であり、これは染色を伴う。しかしながら、ＤＮＡの量及び／又はＤＮＡの分布状態を測定するためには、ＤＮＡを化学両論的に、即ち特異的且つ割合的に染色することが必要である。
【０００３】
（細胞の有糸分裂と関係がない）全ＤＮＡ含量の変化は診断上使用されてきており、さらに近年は、ＤＮＡの空間的分布の立体配置の変化に基づいて、癌などの疾患を検出するための改善された法が導入されてきている。１つのこのような方法は、悪性腫瘍関連変化（「ＭＡＣ」）と呼ばれるものを使用するものであり、これらの変化は、癌などの疾患の存在下において時々観察され、細胞因子に対する一般に非特異的な応答の一例を提供する。
【０００４】
悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は、表面上は正常な細胞中のＤＮＡの分布状態において主に観察される、わずかな変化であると考えられる。ＭＡＣに基づくアッセイは、総ＤＮＡに基づく測定、又は特定のＤＮＡ変化を検出する遺伝的試験とは著しく異なる。何故ならＭＡＣとは異なり、これらのアッセイは、異常な細胞を利用するものだからである。したがって、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は、遺伝的試験ほど特異的ではない可能性はあるが、それらは、表面上は正常な細胞中の、疾患の存在又はＤＮＡ分布状態の変化を検出するための手段を提供する。ＭＡＣの利点には、関連又は非関連組織由来の細胞を利用して、癌などの疾患を検出できることが挙げられる。
【０００５】
関連組織は、試験する組織由来のみかけが正常な細胞を含むと妥当に予想することができる、サンプルであると思われる。例えば、喀痰サンプルを、肺癌をスクリーニングするために使用する場合、それは（剥離した肺細胞を含む）関連組織であると考えられ、乳癌を検出するための乳頭吸引液も同様であろう。乳頭吸引の考察は、Ｐｅｔｒａｋｉｓ、「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｏｆ Ｎｉｐｐｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｅ Ｆｌｕｉｄ」中で見ることができ、他の考察はＬｅｉｆによる「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｎｉｐｐｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」中に与えられている。或いは、さらに利用しやすいか或いは好都合な細胞源（化学的メッセージによって疾患の存在に変えられている可能性がある）が、試験中の組織由来の多数の細胞を含む可能性がない場合、これは非関連組織であると考えられるであろう。したがって、例えば、口腔（頬粘膜）由来の細胞を、肺癌を検出するためのアッセイ用に使用する場合、頬粘膜は非関連組織であると考えられるであろう。
【０００６】
ＭＡＣのパラダイムの１つの考えられる制約は、本発明によって企図されるように、それが細胞核中のほぼすべてのＤＮＡを染色することに基づくものであり、ＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある細胞活性を不明瞭にする可能性があることである。
【０００７】
したがって、疾患の存在に対する高い感受性を与え、みかけが正常な細胞に基づく疾患検出法を与えることは有利であると思われる。本発明はこのような方法であり、ＤＮＡユークロマチンの量及び／又はＤＮＡユークロマチンの分布状態で測定される変化に基づいて、疾患を検出しモニターするための手段を提供し、したがってＲＮＡ／タンパク質合成に関する細胞の現在の可能性を評価する間接的な方法を提供する。
【０００８】
本明細書で使用する、「細胞応答因子」（ＣＲＦ）とは、生物学的細胞中のＤＮＡユークロマチンの量及び／又はＤＮＡユークロマチンの分布状態で測定又は観察することができる、タンパク質、化学物質、ストレス（例えば熱、磁気又は電磁気エネルギー、圧力、又は他の形のエネルギー）、薬剤、ビタミン、薬草、化粧品、又は環境条件などの外部の影響に対する、任意の細胞応答を意味する。濃度、及び細胞が遭遇するストレスの程度は、ｉｎ ｖｉｖｏでは限られる可能性があるが、本発明の方法は単独で使用することができ、或いは、他のアッセイ又はバイオマーカーと組み合わせて、植物細胞、培養細胞、幹細胞、細菌、又は、生きているか若しくは死んでいる、生物学的細胞の任意の他の源中において使用することができる。
【０００９】
一般にＤＮＡユークロマチンは、正確、安全且つ柔軟に細胞核内の壮大な細胞プログラムを進行させる、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質のユニークな組合せである。本明細書で使用する、「ユークロマチン」又は「ＤＮＡユークロマチン」とは、転写により活性状態になると思われる、生物学的細胞中のＤＮＡの部分を意味する。この定義は、緩くコイル状であるＤＮＡ部分を含む。約１０パーセントのＤＮＡユークロマチンが、１０ｎｍの繊維として細胞中に存在する可能性があり、何本かの開いた鎖は直径約４ｎｍである。ＤＮＡユークロマチンの残りは、典型的には２０〜３０ｎｍの繊維として出現する。逆に、ヘテロクロマチンはユークロマチンよりも凝縮されており、転写により活性状態になることはなく、さらにコイル状になって、直径３００ｎｍの範囲の繊維を形成する可能性がある。
【００１０】
生物学界では、ＤＮＡ、及び癌などの疾患とＤＮＡとの関係の発見以来、生物学的細胞中のＤＮＡ含量を定量化するための方法を開発するために、相当な尽力がなされてきている。さらに近年、細胞学者はイメージサイトメーター、濃度計、フローサイトメーター、及びレーザースキャン式サイトメーターなどのツールを与えて、大きさ、形状、ＤＮＡ含量及びＤＮＡ分布状態などの細胞の特徴を測定してきている。イメージサイトメーターによって細胞全体のＤＮＡを測定するためには、ＤＮＡを最初に化学両論的に、即ちＤＮＡの量に比例して染色することが必要である。フォイルゲン法は、１つのこのようなＤＮＡ染色法であり、その対照物質はパラロサニリン又はチアジン誘導体であることが多い。フォイルゲン手順で使用される、最も一般的な染色物質には、パラロサニリン、アズールＡ、チオニン、及びアクリフラビン（吸光度及び蛍光染色手順において使用することができる）がある。有用なＤＮＡ染色物質に関する他の詳細は、「Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｉｎ ｉｍａｇｅ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」という表題のＭｉｋｅｌの刊行物中で見ることができる。
【００１１】
フォイルゲン法を使用してＤＮＡを染色するために、典型的には塩酸を使用して、ＤＮＡを最初に加水分解し、これによってプリン塩基を特異的且つ定量的に除去し、ＤＮＡのピリマジン−糖結合を完全な状態に保つ。裸にされたデオキシリボース糖は、ＤＮＡの骨格に沿ったアルデヒド基を暴露し、これらの基が後にシッフの試薬と結合して染色強度を生み出し、これは細胞中のＤＮＡの量と正比例することが理想的である。
【００１２】
フォイルゲン染色法は数十年で進化し、この進展中に、ＤＮＡ染色に影響を与えるいくつかの変数が同定された。これらの変数には、細胞固定、反応温度、加水分解時間、酸濃度、組織型及びクロマチンの凝縮性がある。２つの一般的なＤＮＡ用のフォイルゲン染色法が認められるようになっており、ＤＮＡ加水分解に関する条件が主に異なる。第１の方法は、比較的高い酸濃度（５ＮのＨＣＬ）での室温（２５℃）におけるＤＮＡ加水分解を支持するものである。第２の方法は、１ＮのＨＣＬを使用する６０℃の反応温度を採用するものである。
【００１３】
簡潔には、顕微鏡スライド上に置いた細胞を、前に記載した加水分解条件下で、典型的には２０分から６５分の間浸す。この時間中に、すべてのプリン塩基（アデニン及びグアニン）が、ＤＮＡから除去されることが理想的である。この還元状態は、ある程度の時間の間は比較的安定していることがあり、その後、連続的な酸加水分解によって、光学濃度の低下により示すことができるような、ＤＮＡの分解が引き起こされる。
【００１４】
ＤＮＡ加水分解を研究しながら、何人かの研究者達は、ＤＮＡの分画はすぐに染色されるらしいことを観察した。彼らは、ＤＮＡのこの部分を酸不安定と呼び、酸加水分解の動態をさらに詳しく研究し始め、酸不安定の特性を使用して、正常細胞と疾患細胞を区別することを期待した。さらなる考察は、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ｓｅｍｉ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａ−Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｇｒａｄｅ ２ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｎｕｃｌｅｉ」、Ｓｏａｍｅｓ、「Ｆｅｕｌｇｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ ｉｎ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｆｉｎｃｈ、「Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ Ｉｎ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｍｅａｒｓ」、Ｋｌａｗｅ、「Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）Ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｏｆ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｍｅａｒｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｂｙ Ｍｅａｎｓ Ｏｆ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｐａｒｔｉｎｇｔｏｎ、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ− Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｉｄ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」、Ｏｇｄｅｎ、「Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｄｉｓｔａｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ｕｐｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｏｆ Ｎｏｒｍａｌ Ｏｒａｌ Ｍｕｃｏｓａ」、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ａ Ｓｅｍｉ−Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｆｏｒ Ａｉｄｉｎｇ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｉｎｃｏｃｋ、「Ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ＤＮＡ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｍｍａｒｙ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、及びＳｉｎｃｏｃｋ、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｂｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ」に見ることができる。
【００１５】
残念ながら、これらの研究からは、酸不安定ＤＮＡの全量に基づく、広く受け入れられるアッセイは発展しなかった。制約としては、厳しい条件下で多数のスライドを調製する必要性があることが含まれ、したがって、時間、コスト及びこれらの可能性のある方法の複雑性が増大する。加えて、さらに論じるように、これらの適用例は、ＭＡＣアッセイと同様に、ＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある細胞変化に対して低い感受性を有する可能性がある。
【００１６】
興味を引いたＤＮＡの他の側面は、細胞核中でのその空間的分布であった。１９５０年代後半に、Ｎｉｅｂｕｒｇｓはわずかな細胞の変化を同定し、これを疾患と関連付けた。最初に記載されたとき、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）は珍奇なものであった。Ｎｉｅｂｕｒｇｓ；「Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）」、ＡＣＴＡ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ、１９６８、Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．６。様々な研究者達が、Ｎｅｉｂｕｒｇｓの研究を再現しようと試みた。ごく最近、ＭＡＣのパラダイムが再浮上し、自動式測定法が示唆された。依然として議論の余地はあるが、ＭＡＣは、みかけは正常な細胞核のＤＮＡの分布状態で測定される、わずかな変化として説明され、腫瘍又は他の細胞因子に対する非特異的且つ潜在的に全身性の応答と関係がある。したがって本発明では、好都合な術語として、一般的用語「細胞応答因子」即ち「ＣＲＦ」を採用する。
【００１７】
ＭＡＣ法は米国特許第５８８９８８１号中に記載され、さらに米国特許第６０２６１７４号中に記載されている。さらに、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ」という表題の２００２年８月２９日前後に出願された、ＭａｃＡｕｌａｙ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ他の同時係属米国特許出願第１０／２３２，６９８号は、細胞の特徴を計算する前にデジタル画像の正規化に基づきＭＡＣの評価を改善し、それによってこれらの細胞の特徴を識別する能力を保つための方法をさらに記載している。本発明は、ＣＲＦ又はＤＮＡユークロマチンの他の記述子を測定する際に使用するための、画像の正規化を支持する実施形態を含む。
【００１８】
ＤＮＡユークロマチンは、優先的に染色し評価することができる。いくつかの場合、例えば顕微鏡スライドなどの受容表面に細胞を置く場合、同じ細胞をさらに加水分解し、残りのＤＮＡを染色することができる。これによって、ＤＮＡユークロマチンの量及び分布状態と、細胞全体のＤＮＡ及びその分布状態を、細胞毎の単位で比較するための手段が提供される。この方法で測定されるＤＮＡ合成の量及び所在部位によって、さらなる診断情報を提供することができる。他の顕微鏡法が広い容認を得ているので、これらの能力は高い重要性を有する可能性がある。例えば、共焦点顕微鏡によって、三次元の再構築用の複数の細胞の画像片を集める能力が提供される（例えば米国特許第６３８８８０９号）。本明細書において企図されるように、受容表面に関するこの但し書きは、フローサイトメーターなどの他の測定ツールが、ＤＮＡ及び関連する細胞の特徴を測定する能力を与えることができることを、思い出させるものとして働く。これらのシステムは、流体環境中に細胞を維持し、典型的には細胞を、レーザーを含むことが多いセンサーへと誘導する。フローサイトメトリーによる分析の後、細胞選別などの特別な努力を利用しない限りは、アッセイで使用する生物学的細胞は、典型的には失われる。
【００１９】
数十年の努力が、ほぼすべてのＤＮＡを染色するためのフォイルゲン法の最適化に費やされているが、フォイルゲン法は典型的には、ＤＮＡユークロマチンの優先的な染色を提供するわけではなく、本発明に利点を与えるために活用することができる方法における１ステップを与える。このステップはＤＮＡ加水分解に関するものであり、それにより酸を使用して、ＤＮＡ骨格からプリン塩基を選択的且つ特異的に取り除く。典型的には、パラロサニリン又はチオニンなどのチアジン誘導体などのＤＮＡ吸収性染色物質が、対照物質として使用される。他のＤＮＡ染色物質には、ヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（３３３４２及び３３２５８）、ＳＹＴＯＸ（青色、緑色又はオレンジ色）などの、アデニン−チアミン選択的染色物質、並びにクロモマイシンＡ３及びミトラマイシンなどのシトシン−グアニン染色物質がある。しかしながら、典型的にはこれらの染色物質が、濃縮クロマチンとユークロマチンを区別することはない。しかしながら、将来的に、いくつかのＤＮＡ部位を阻害して、その後１つ又は複数のこれらのＤＮＡ蛍光染色物質を本発明用に活用することができる可能性がある。核酸を素早く染色するための新しい方法（例えばＵＳ６２７１０３５）が導入されており、マイクロ波も染色を容易にするために使用されてきている。
【００２０】
ＤＮＡ及びＤＮＡユークロマチンを評価するための他の方法は、ＤＮＡのメチル化状態に基づく。これらの技法は比較的複雑で、ＤＮＡを細胞から除去し、ＰＣＲ又は他の技法を使用してさらに操作することを典型的には必要とする。ここでも、メチル化状態に基づくＤＮＡ法は、入手又は接近することが困難である可能性があり、ときにはバイオプシー手順を必要とする異常な細胞に対して最適に機能する。
【００２１】
したがって、容易に接近可能な、みかけは正常な細胞に適用することができると思われる、疾患を検出し調べる簡潔な方法を提供することが有利であると思われる。バイオプシーから得た組織は、本発明、危険集団のスクリーニングなどの、多量体積の用途に使用することができるが、接近可能な体腔（例えば頚部）、体液（例えば血液又は尿）、吸引液（例えば乳液又は穿刺吸引液）、洗浄物（例えば気管支洗浄又は前立腺洗浄）、又は典型的には剥離細胞が豊富なサンプル（例えば、肺喀痰又は口腔由来の細胞）からの細胞のスクレーピングを使用することが好ましい可能性がある。本発明の方法は、特異的マーカー又は疾患機構がまだ完全には理解されていない疾患、例えば自己免疫疾患、ストレス障害、慢性疲労症候群、アレルギー、加齢性障害、感染、又はアルツハイマー病などの他の変性疾患を検出しモニターするのに有用となる可能性もある。同様に、ビタミン、薬草、食品栄養剤、薬剤の複雑な相互作用、及び日光から細胞音までの様々な形のエネルギーへの暴露によっても、ＤＮＡユークロマチンにおいて観察可能な細胞の変化を引き起こす可能性がある。これらは例えば、治療に対する疾患応答性のモニタリング、健康状態の評価、生物活性の評価、又は薬理学的物質のスクリーニングに利用することができる。一般的に言うと、細胞中のＲＮＡ／タンパク質合成の変化を引き起こすか、或いはそうした変化と関係があるものは何でも、これらの変化が微生物、植物又はヒト中で起ころうと、潜在的に関心が持たれる。さらに、ＤＮＡユークロマチンの評価を使用して、細胞死（アポトーシス）又は他の生物学的プロセスを、或いは例えば死滅した細胞又は死滅しつつある細胞をサンプル採取することによる「死期」の決定などの、新しいアッセイの基盤として、さらに特徴付けることが有用である可能性がある。
【００２２】
１９６０年代半ばに、Ｄｅｃｏｓｓｅ及びＡｉｅｌｌｏは、ＤＮＡの酸加水分解を記載し、５．０ＮのＨＣＬを使用する室温（２６℃）でのフォイルゲンの加水分解は、１．０ＮのＨＣＬを使用する６０℃でのＤＮＡの酸加水分解と本質的に同等であったことを結論付けた、「Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ａｃｉｄ Ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」という表題の論文を発表した。この著者らは、室温において前者によって与えられた１２０分の停滞状態は、６０℃で観察された２０分の安定状態より優れていたことを示した。さらに彼らは、脱プリン化（ＤＮＡからのプリン塩基の除去）は酸濃度に主に依存しており、その後のＤＮＡ分解は酸よりも熱に主に依存すると結論付けた。したがって、加水分解に関するこれらの反応温度及び条件は、従来技術で論じられたものとは反対である。本発明のいくつかの実施形態は、優先的な染色によって評価するためのＤＮＡユークロマチンを同定し、例えば、ＤＮＡの酸加水分解に関する反応温度を約１０℃低下させると、加水分解は（所与の温度で）４倍遅れると思われ、これによってＤＮＡ染色よりも改善された対照が与えられ、より詳細にはＤＮＡユークロマチンの優先的な染色が容易になる。
【００２３】
その後、Ｆｕｋｕｄａは、ＤＮＡの酸加水分解及び染色の歴史を、「Ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」中に要約し、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」中でさらに論じた。同様の結論が、Ｚｅｌｅｎｉｎによる「Ｐｅｃｕｌｉａｒｉｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｒｅｖｅａｌｅｄ Ｂｙ Ｓｔｕｄｙ Ｏｆ Ｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｏ Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ」中、及びＫｊｅｌｌｓｔａｎｄの「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ａｎｄ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」中で観察された。
【００２４】
さらに近年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｌｏｉｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５０１６２８３号は、５ＮのＨＣＬ中での６０〜７５分間の酸加水分解と、それに続く６０分間のチオニン染色を教示している。同様に、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５４８５５２７号は、５ＮのＨＣＬ中での６０〜約７５分間の酸加水分解を教示している。さらに、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｉａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」という表題のＬａｍの米国特許第５９４２４１０号は、ＤＮＡ染色に関する従来技術についてまとめ、５ＮのＨＣＬ中での６０分のＤＮＡ加水分解時間、次に７５分の染色をさらに推奨している。ＤＮＡ染色は、「Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」という表題のＺａｈｎｉｓｅｒの米国特許第６３４８３２５号中でも論じられている。
【００２５】
ＤＮＡの測定値を測定し活用するための現在の装置及び方法は、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ」という表題のＭａｃＡｕｌａｙの米国特許第５８８９８８１号中、及び「Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ」という表題のＰａｌｃｉｃの米国特許第６０２６１７４号中にも教示されている。この従来技術は、疾患を検出するための、ＤＮＡ含量（倍数性）及びＭＡＣ（表面上は正常な細胞内のＤＮＡの分布状態において主に表される、わずかな変化）の使用を教示し、且つ様々な有用な細胞の特徴を論じる。さらに、ＭＡＣを使用する疾患検出用のＤＮＡの記述子は、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ（ＭＡＣ）ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｃａｎｃｅｒ」という表題の２００２年８月２９日前後に出願された、ＭａｃＡｕｌａｙ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ他の同時係属米国特許出願第１０／２３２，６９８号中でさらに論じられており、これは特に、ＤＮＡの測定、細胞の特徴、及び細胞のデジタル画像を最初に正規化することによって、細胞の特徴を正規化するための方法を論じている。
【００２６】
このＭＡＣの従来技術は、細胞の特徴の組合せを使用すること、及びＤＮＡ測定値を、ＣＲＦと同様に細胞応答因子であるとみなすことができる、ＭＡＣ値などの値に低下させることについても論じている。したがって、このＭＡＣの従来技術、及び本明細書中で引用した他の従来技術は、本明細書に参照によって含まれる。
【００２７】
今日、ＤＮＡらせんが、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を開始させるために特定の遺伝子座において、局所的な鎖の分離を受けなければならないことは理解されている。このような活性は、遺伝子の転写及び複製中に観察される。様々細胞型中の大部分のＤＮＡは、細胞のプログラミングの後は特に、不活性な状態である。したがって、全ＤＮＡ及びＤＮＡユークロマチンを測定すること、及びＤＮＡユークロマチンの割合などの比率としてこれらの値を表すことが、有用である可能性がある。
【００２８】
関連した研究において、研究者達は、酸不安定ＤＮＡの増加が、悪性腫瘍と関係している可能性があると考えた。酸不安定ＤＮＡは、Ｓｉｎｃｏｃｋによって探された。彼はＦｕｋｕｄａ（「Ｅｒｒｏｒｓ ｉｎ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」）より低い加水分解温度を提案し、５ＮのＨＣＬ中で３０℃において加水分解を行い、いくつかの疾患（ＣＩＮ２）は、Ｓ期（その最中に、有糸分裂中の細胞が、ほぼ同じそれらのＤＮＡをコピーする期）の細胞の割合の増大を引き起こす可能性があることを示した。以前、Ｍｉｌｌｅｎも、「Ｆｅｕｌｇｅｎ−Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｃｅｒｖｉｘ Ｕｔｅｒｏ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｉｄ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」中で、以前の研究で使用された温度より低い温度を提案し、室温における５ＮのＨＣＬを選択した。同様に、Ｐａｒｔｉｎｇｔｏｎは、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ」中でこの提案をした。「Ｆｅｕｌｇｅｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ Ａｎｄ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ ＤＮＡ Ｉｎ Ｏｒａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」という表題のＳｏａｍｅｓの１９９５年の論文中では、加水分解条件は、室温における５ＮのＨＣＬであった。前に引用したＫｊｅｌｌｓｔａｎｄは、フォイルゲン加水分解に関する広範囲の温度及び酸性を論じているが、彼が部分的なＤＮＡ染色に関する利点を論じ認めることはなく、したがって、本発明の方法及び実施形態とは反対の結論及び推奨を与えている。
【００２９】
「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ａｎｄ ｍｕｔａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」という表題のＤｕｆｆｙの米国特許第５８７１９１７号は、特に、遺伝子のコード領域及び調節領域の近くに存在するゲノムＤＮＡ断片を、検出し単離するための方法を論じている。ＤＮＡは腫瘍細胞中ではメチル化されることが多いことを記す。
【００３０】
「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｔｅｓｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ ＤＮＡ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ」という表題のＤｕｆｆｙの米国特許第６４５１５５５号は、遺伝子のコード領域及び調節領域の近くに存在するゲノムＤＮＡ断片を検出及び単離し、様々な領域中でＤＮＡがメチル化される程度を感知するための方法を論じている。
【００３１】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｎｇ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｒ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｂａｓｅ−ｐａｉｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍｓ」という表題のＭｏｄｒｉｃｈの米国特許第５５５６７５０号は、指標としてＤＮＡタンパク質複合体形成を使用して、塩基対ミスマッチを検出するための、ＤＮＡ鎖の接触及び比較を論じている。
【００３２】
ヒトゲノムプロジェクトでは、本質的に線状構造の問題（核酸配列）に対処したが、タンパク質は、大部分のそれらの官能基を、それらをしばしば高い特異性で他の化学物質及びタンパク質と反応及び相互作用させる形状及び暴露又は帯電領域から誘導する、三次元の問題点を示す。したがって本発明は、塩基対ミスマッチなどの特異的な異常を測定しようとするものではなく、細胞レベルでＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある変化を測定しようとするものである。
【００３３】
「Ｈｙｄｒｏｍｅｔｈｙｌ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ）ｐｕｒｉｎｅｓ ａｎｄ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ」という表題のＺａｈｌｅｒの米国特許第５２０６２４４号は、メチル化試薬、及びタンパク質合成、及びより詳細にはＤＮＡの構成単位−プリン、アデニン及びグアニン、並びにピラミジン、シトシン及びチミンのメチル化状態と関係がある、様々な因子を論じている。
【００３４】
「Ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ ｓｕｂｕｎｉｔ（ＡＬＳ）ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ」という表題のＢａｘｔｅｒの米国特許第５９３６０６４号は、特異的な酸不安定タンパク質及びその断片を論じている。この従来技術は概して、酸不安定タンパク質、及びタンパク質状態をそれらのアミノ酸に基づいて評価するための手段に関するものである。
【００３５】
「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｎｎｉｎｇ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｒ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ」という表題のＧｉｌｃｈｒｅｓｔの米国特許第５６４３５５６号は、紫外線光などの物質への暴露に由来する皮膚へのダメージを特に論じている。この特許（５５６）はメラニン形成−刺激に関心を置くものであるが、本発明を使用して、様々な物質が細胞応答と関係があるかどうか、評価するのを手助けすることができると思われる。
【００３６】
「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」という表題のＳａｎｆｏｒｄ−Ｍｉｆｆｌｉｎの米国特許第５７７３２１９号は、ギャップ及び切断などのＤＮＡの評価値を使用する。このような変化は、本明細書において企図されるように、ＤＮＡユークロマチンの評価値によって推測することもできる。
【００３７】
「ＤＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」という表題のＤｏｎａｈｕｅの米国特許第５６７０６２１号は、ＤＮＡ構造、哺乳動物の細胞因子及び薬剤応答を特に論じている。
【００３８】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｄａｍａｇｅ」という表題のＧｒｉｍｌｅｙの米国特許第６４５５５９３号は、細胞抑制物質及び標的化細胞毒性障害を記載している。ここでも、本発明を単独又は組合せで使用して、様々な物質の発見を評価又は支持するのを手助けすることができる。
【００３９】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｔｉｓｓｕｅ」という表題のＨｕｎｇの米国特許第６３９１０２６号は、乳疾患を治療するために使用される診断法及びエネルギー形態を記載している。本発明は、例えば、このような治療の有効性を調べるのを手助けする際に、使用することができると思われる。
【００４０】
「Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓａｙｉｎｇ ｍａｍｍａｒｙ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ」という表題のＱｕａｙの米国特許第６２８７５２１号は、哺乳動物の体液などの、細胞を含む生物サンプルを得ることを論じている。本明細書に記載するように、乳吸引液は、本発明によって企図されるように乳癌を検出するための関連組織であると考えられる。
【００４１】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｓｅｃｔｉｏｎ」という表題のＦｒｅｅｄの米国特許第６０３５２５８号は、組織学的組織のフォイルゲン染色をさらに論じている。同様の方法を、望み通りに本発明の方法に適用することができると思われる。
【００４２】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｒａｔｅ」という表題のＶａｎ Ｈｏｕｔｅｎの米国特許第５９８９８１６号は、ＤＮＡの修復を測定し様々な治療法の有効性を調べるためのＤＮＡアッセイを論じている。本発明を使用して、このようなアッセイを支持することができる。
【００４３】
「Ａｃｃｕｒａｃｙ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｉｔｏｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＫａｍｅｎｔｓｋｙの米国特許第５６３３９４５号は、蛍光染色物質を用いたＤＮＡ染色、及びサイトメーターを使用する測定を記載している。したがって、ＤＮＡの測定、及び細胞周期の評価が論じられ、例えばこの特許の図３、１４、１５及び１６中と同様にプロットされている。したがって、ＤＮＡのヒストグラムは、本発明の図１ａ中の従来技術のものと同様に表される。
【００４４】
「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＤｏｕｇｌａｓｓ他の米国特許第６２１５８９２号は、ＤＮＡを測定するために使用することができるイメージサイトメーターを論じている。
【００４５】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｎｅｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｅｄｉａ」という表題のＡｌｆａｎｏの米国特許第５８４９５９５号は、レチノイン酸などの物質、及び細胞レベルでの影響を測定するための手段を特に論じている。様々な物質の影響のモニタリングは、本発明に関して企図される。
【００４６】
「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」という表題のＧｉｂｓｏｎの米国特許第３９５７５８３号は、生物活性の評価、及び薬理学的スクリーニンング、及び様々な培養培地における問題及び関心のいくつかを論じている。
【００４７】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｌｏｉｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５０１６２８３号は、他の構造のイメージサイトメーター、及び時にはエストロゲンなどの他の生物学的指標と共に、ＤＮＡを染色し測定するための方法（例えばフォイルゲン）を論じている。さらに、この特許（２８３）は、例えば、ＤＮＡキャリブレータを使用し、ＤＮＡ値をピコグラムに転換する、ＤＮＡ含量を表す様々な方法を論じている。このような転換は、望み通りに本明細書で企図されるようにＤＮＡユークロマチンに適用することができると思われる。
【００４８】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」という表題のＢａｃｕｓの米国特許第５４８５５２７号は、確立されており提案済みのＤＮＡ染色（例えば、チオニンを使用する）及びさらに詳細にはＤＮＡの加水分解条件のさらに他の例となるＤＮＡ測定をさらに論じている。
【００４９】
ＤＮＡ染色は、さらに詳細に、「Ｔｈｉｏｎｉｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」という表題のＺａｈｎｉｓｅｒの米国特許第５１６８０６６号で論じられており、チオニンを用いるＤＮＡ染色、及び細胞質などの様々な細胞要素の対比染色をさらに論じている。
【００５０】
「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｉａｚｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｏｒ ｅｔｈａｎｏｌ」という表題のＬａｍの米国特許第５９４２４１０号は、ＤＮＡ及びフォイルゲン染色法をさらに論じている。
【００５１】
「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｏｃｃｕｌｔ ｏｒ ｎｏｎ−ｅｘｉｓｔｅｎｔ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」という表題のＲａｖｉｄｉｎの米国特許第５８６２３０４号は、予後のデータの評価及びＤＮＡのヒストグラムを論じている。
【００５２】
「Ｍｅｄｉｃａｌ ｗｅｌｌｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ，ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ」という表題のＣｏｓｅｎｔｉｎｏの米国特許第６４５４７０５号は、患者をモニターすること、情報に修正を加えて値を形成することを論じており、且つ傾向の認識及び調査頻度を論じている。この特許（７０５）は、症候性患者を同定するための系統的な意思決定法を記載しており、さらに、本発明の方法を使用して、ＤＮＡユークロマチン中で観察される、非特異的な変化（例えば、ＲＮＡ／タンパク質合成の変化）を同定することができ、これらの変化を、癌を含めた肺関連疾患の現在又は過去の喫煙者などの無症候群をスクリーニングするために使用することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００５３】
本発明は、例えば、疾患を検出し、健康状態をモニターし、生物活性を評価し、且つ薬理学的スクリーニングをするための、生物学的細胞中のＤＮＡユークロマチンを同定し評価する方法である。一実施形態は、例えば生物学的細胞中のＤＮＡを優先的に染色することにより、ＤＮＡユークロマチンを同定し評価することに基づいて、疾患を検出し、治療に対する疾患の応答性をモニターするための方法を記載する。他の実施形態は、ＤＮＡユークロマチン、例えば個々の細胞中のＤＮＡユークロマチンの量及びＤＮＡユークロマチンの分布状態を同定し評価するための手段を提供し、疾患、又は様々な影響に対する細胞の暴露などの、いくつかの条件において変化する可能性がある、ＲＮＡ／タンパク質合成と一般に関係があるアッセイを確立させる。
【００５４】
したがって本発明は、ＣＲＦなどの値として表すことができる、ＤＮＡユークロマチンを測定することによって、癌などの疾患の潜在的な存在を検出するための方法を与える。みかけは正常な細胞中のＤＮＡユークロマチンを評価することによって、特異的又は非特異的な細胞の異常性の存在を利用する遺伝的試験又は他のアッセイに、有用な追加的情報を与えることができる。本発明は、悪性腫瘍関連変化（ＭＡＣ）などのアッセイと比較して、感度及び特異性の改善ももたらす。さらに、個々の生物学的細胞又は生物学的細胞の源の、ＤＮＡユークロマチン染色の基底レベルを確定することによって、本発明は、健康状態の指標として使用することができる変化、疾患の治療を含めた様々な影響に対する応答性をモニターするための手段を提供する。様々な物質の薬理学的スクリーニング又は生物活性の評価用に、暴露の前、後、最中、或いはこのような影響を取り除いて、例えばＤＮＡユークロマチン中で観察されるＤＮＡの応答性を評価した後で、細胞を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明の好ましい実施形態の方法の編成及び様式、並びにその他の目的及び利点は、以下の図面と共に以下の説明を参照することによって、最もよく理解することができる。
【００５６】
図１ａ（従来技術）は、肺癌患者から採取した内皮細胞のサンプルに関する、典型的なＤＮＡ含量のヒストグラム１１０を示す。この場合、ＤＮＡ異数体のピーク１３０は診断情報を与え、癌としてこれを同定することができる。さらに、このような診断指標の不在下でも、ＭＡＣはみかけは正常な細胞、例えばＤＮＡ含量のヒストグラム１１０の、２倍体ピーク１１０中の細胞で評価することができ、典型的にはそうされる。
【００５７】
図１ｂ（従来技術）は、肺内皮細胞の正常サンプルに関する、典型的なＤＮＡ酸加水分解の典型的な時間基準測定１４０、及び肺癌に関する酸不安定曲線１５０を示す。研究者達は、彼らが「酸不安定」と呼んだＤＮＡ分画の酸加水分解の割合の違いに潜在的な診断有用性があることを示した。このようなデータを得るためには、多数のスライドを処理する（特定の時間間隔で加水分解し染色する）ことが必要である。これによって、酸加水分解（ＤＮＡ動態）は診断情報を与えることができることが実証されるが、本発明は、加水分解条件を変えてＤＮＡ動態を活用し、より詳細にはＤＮＡユークロマチンを優先的に染色する。
【００５８】
図１ｃは、フォイルゲン法を使用して優先的に染色されるそのＤＮＡユークロマチンを有する、正常な生物学的細胞に関する本発明のヒストグラム１７０を示す。このヒストグラムは、これらの細胞中で起こる潜在的なＲＮＡ／タンパク質合成の、細胞中の比較的均一なＤＮＡユークロマチン染色、並びに（例えば、標準偏差、勾配、その他などの、人口静態によって評価した）範囲、及び程度（例えば、ピーク平均染色強度）を示すピーク１７１を示す。前で論じたように、ＤＮＡユークロマチンと全体の細胞ＤＮＡの比率を表すことも有用な場合もある。
【００５９】
図１ｄは、疾患細胞中のＤＮＡユークロマチンの優先染色に関する、本発明のヒストグラム１８０を示す。領域１８１の細胞は、増大したＤＮＡユークロマチン（転写中に活性がある可能性がある、より小さなＤＮＡファイバー）を示し、第２の小さなピーク１８２は、異なる活性（ＲＮＡ／タンパク質合成）を有する細胞の亜群を表す可能性がある。ここでもまた、ＤＮＡユークロマチンと全体の細胞ＤＮＡの比率が、診断情報を与える可能性もある。このような比率は、すべての細胞に関して、或いは様々な細胞の亜群に関して、表すことができると思われる。例えば、ＤＮＡユークロマチン又はＤＮＡユークロマチンの比率は、図１ａに関して論じたＤＮＡ含量のヒストグラム１１０の、ピーク１２０の２Ｓ．Ｄ．以内の細胞などの細胞の亜群に関して、測定することができると思われる。大きさ、形状、丸さ、表面積、規則性、その他などの、様々な細胞の特徴を一般的に使用して、細胞及び細胞の亜群を同定し、これらは然るべく適用することができる。
【００６０】
図２ａ（従来技術）は、核２０５、及び染色されたＤＮＡ２１０を有する典型的な内皮細胞２００を図によって示す。明るい染色領域と暗い染色領域（ヘテロクロマチン）を、細胞の特徴の点において表し評価することはできるが、明るい染色領域及びＤＮＡの微細な糸（潜在的なユークロマチン）は不明瞭であり、或いはこれらのシグナルは、重複又は隣接する暗いＤＮＡ染色領域によって部分的に覆い隠されている。ＭＡＣのいくつかの特徴的な影響は、ＤＮＡ再編成、したがってＲＮＡ／タンパク質合成と関係がある可能性がある。したがって本発明によって、類似の、ＭＡＣ、又はＭＡＣ単独よりも、おそらくより一層の診断感受性を付与することができる。
【００６１】
図２ｂは、そのＤＮＡが染色された、図２ａに関して論じた細胞などの、細胞核２０５のピクセレート画像を示す。大きさ、形状、積分光学濃度（ＤＮＡ全体）などの細胞の特徴、及びＤＮＡの空間的分布を記載する他の細胞の特徴は、一般的にこれらのデジタル画像から測定する。細胞の特徴の例、及びそれらの適用例は、第５８８９８８１号及び第６０６２１７４号などの本明細書で引用した様々な米国特許に見ることができる。
【００６２】
図２ｃは、優先的な染色によって同定した、核２０５、及びＤＮＡユークロマチン２２０を有する、典型的な内皮細胞２００を図によって示す。この場合、図２ａに関して論じた、暗い染色された凝縮ＤＮＡ（ヘテロクロマチン）は染色されず、しかしながら、ＤＮＡユークロマチン２２０は、優先的な染色によって同定された。
【００６３】
図２ｄは、優先的な染色によって同定した、そのＤＮＡユークロマチン２２０を有する、典型的な細胞核２０５のピクセレート画像を示す。ＤＮＡユークロマチンの量、及びＤＮＡユークロマチンの空間的分布は、このデジタル画像から測定することができる。微細なＤＮＡ糸（直径約１０ｎＭ、いくつかの鎖は直径約４ｎＭの一本鎖に分離する可能性あり）、及び直径約２０〜３０ｎＭのＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ／タンパク質合成の可能性のある部位である。全体の暗さは、核境界の有用な指標も与えるので、いくつかの場合、通常の細胞の特徴の測定法以外に、或いはこれと組み合わせて、他の境界要素法又は評価法を、例えばおおまかな細胞の大きさに基づいて使用することができ、楕円形の測定値を、対比染色した細胞のデータ又は核又は細胞質に適合させることができる。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態では、診断情報は、ＤＮＡユークロマチン／細胞全体のＤＮＡなどのＤＮＡの割合を含むことができ、これは比率として表すこともできる。さらに、個々の細胞上でのＤＮＡ測定以外に、組織切片上で測定するとき、細胞の分布状態が、例えば腫瘍の侵襲性又は段階を評価する際に有用な組織構造に関する、診断情報を与える可能性がある。したがって、数個〜数百個の細胞画像を含むシーンでは、いくらかの量のＤＮＡ及び／又はＤＮＡユークロマチンを有する細胞の分布状態を、診断指標として潜在的に使用することができる。ボロノイ図などの様々な技法を使用して、培養中の組織構造又は細胞編成の説明が与えられてきている。これらの技法の基本及び適用例のいくつかは、「Ｓｙｓｔｅｍ、ｍｅｔｈｏｄ、ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｄａｔａ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｐａｃｅ」という表題のＡｇｒａｆｉｏｔｉｓの米国特許第６４５３２４６号で論じられている。（２４６）のある部分は化学構造の記述子を対象とするが、領域中のＤＮＡユークロマチンの分布状態を記載するために、同様の技法を使用することができると思われ、このような使用は本発明で企図される。
【００６５】
図３ａは、細胞を回収するステップ３００、ＤＮＡユークロマチンを優先的に染色するステップ３１０、及びＤＮＡユークロマチンの量及び分布状態を測定するステップを含む、本発明の実施形態を示す。
【００６６】
図３ｂは、全ＤＮＡを測定すること３３０、及び様々なＤＮＡのパラメータ又はＤＮＡユークロマチンの比率を計算すること３４０をさらに含む、図３ａに関して論じた、本発明の他の実施形態を示す。
【００６７】
図３ｃは、細胞応答因子（ＣＲＦ）及びＤＮＡの比率などの様々な計算の結果を表すこと３３０、及びこれらの結果とデータベースを比較すること３６０をさらに含む、図３ａ及び図３ｂに関して論じた、本発明のさらに他の実施形態を示す。データベースは、複数の正常サンプル及び疾患サンプルに関して得られた、結果を含むことができる。
【００６８】
図３ｄは、試験例の以前のデータと現在の結果を比較して、それによって例えば個々の植物、細胞系、動物又は生物学的細胞の他の源中の、ＲＮＡ／タンパク質合成の変化をモニターするための高感度の手段を与えるステップ３８０をさらに含む、本発明のさらに他の実施形態を示す。フォイルゲン法と共に用いられるように、本発明の方法は、従来技術で論じられたこととは異なり、加水分解条件を変えることにより利点を得て、これによって新規の診断情報が誘導される。より詳細には、一実施形態において、本発明の方法は、室温より低い温度でＤＮＡ酸加水分解を実施し、ＤＮＡユークロマチン（タンパク質合成と最も関係があるＤＮＡのその部分）に対する染色を制限することを試みる。例えば、摂氏１５度において５ＮのＨＣＬ中で１時間の酸加水分解を実施し、次に着色剤としてチオニン又はパラロサニリンを用いて、１時間のフォイルゲン染色を実施する。新規の加水分解条件を確定させること以外に、ＤＮＡユークロマチンの全体量（酸不安定ＤＮＡと関係している可能性がある）を定量化することを単に試みるのではなく、本発明のさらに他の実施形態では、ＤＮＡユークロマチンの分布状態を、この独特に染色されたＤＮＡ分画上で測定する。細胞が疾患又は化学因子に応答すると、いくつかの場合、これらの細胞のＤＮＡユークロマチン中において、ＤＮＡ合成の変化を観察し測定することができる。このような細胞応答をＣＲＦなどの値として表すことは、有用である可能性がある。
【００６９】
細胞調製物は、頚管又は頬粘膜のスクレーピング、乳頭吸引、気管支洗浄、喀痰又は他の体液、又は非凝集性組織の細胞調製物から調製される。本明細書で使用する、関連組織は、疾患組織の細胞、又は疾患組織に由来する細胞を有すると予想することができる、任意の組織を意味する。例えば、喀痰サンプルは、肺癌を試験するために使用するとき、関連組織として定義される。何故なら、このようなサンプルは、大部分が剥離した肺細胞を典型的には含むからである。同様に、乳頭吸引液の使用は、乳癌を検出するための関連組織と考えられる。本明細書で使用する非関連組織は、主に評価する疾患に由来する細胞は、典型的には含まない組織を意味するものであり、例えば、肺癌を検出するために使用される頬粘膜（口腔由来の細胞）は非関連組織と考えられ、前立腺癌を検出するための排尿又は前立腺洗浄物の使用も同様であろう。血液、ＣＳＦ、血漿などの体液を試験する場合、それは非関連組織と考えられるであろう。何故なら、癌又は疾患部位は、他のマーカーを用いて同定されない限り、或いは予想されない限り、再発の場合と同様に、一般的には知られないからである。この特徴によって、関連組織において局所的に、非関連組織においてさらに全身的な影響として、細胞応答因子（ＣＲＳ）を検出するための本発明の方法の能力及び意図が明らかになる。
【００７０】
寄託済みの細胞物質を、適切なＤＮＡ染色法及び測定ツール、例えばイメージサイトメトリーにより行う、ＤＮＡユークロマチンの量及びＤＮＡユークロマチンの分布状態の評価を伴う、フォイルゲン染色を使用して染色する。ＤＮＡユークロマチンは、研究者達が酸不安定ＤＮＡと以前に呼んだものと関係がある可能性があるが、しかしながら、本発明の染色法は、酸加水分解の動態を活用してＤＮＡユークロマチンを標的化する反応条件を確定する。
【００７１】
一般的な定義によって、ＭＡＣの評価には、表面上は正常な細胞の分析が必要である。これを実施するためには、ＤＮＡ含量を最初に測定して（典型的には分布状態として）、閾値を確定して（例えば、２倍体ピークからの２つの標準偏差）、ほぼ正常な量のＤＮＡを有する細胞をグループ分けしなければならない。異常なＤＮＡ含量（異数体）は、それ自体が病状を示す可能性があり、したがって、これらの細胞は典型的には、ＭＡＣに関して評価されないと思われる。
【００７２】
本発明の方法は、ほぼすべてのＤＮＡを染色することを必要とするＭＡＣ法とは、さらに区別される。本発明の方法は、Ｐａｐスクリーニング用の頚管のスクレーピングと同様に、疾患組織を直接サンプル採取するときでも、実質的な制約を示す可能性がない相当群の表面上は正常な細胞を含むと予想することができる、患者サンプルに適用することが最良である。多くの頚椎癌の場合、顕微鏡のスライド上に相当数の癌細胞が出現することは、ある程度まれなことであると考えられる。乳癌を検出するための乳頭吸引液、肺癌を検出するための頬粘膜などのサンプル、及び剥離細胞中で豊富な他のサンプルに関しては、これらの考慮事項が本発明の方法の活用を妨げることはない。何故ならこれらは、相当数の表面上は正常な細胞を含むからである。ＤＮＡ含量及びＤＮＡ分布状態に基づく、他の疾患検出法との他の有意な違いは、本発明の方法は、細胞周期の古典的なＤＮＡのヒストグラムを作製しないことである。分析用にＤＮＡ２倍体細胞を選択する必要がない。何故なら、適切なサンプル中の大部分の細胞が、ｓ期に存在しないと思われるからである。本発明の方法の感度又は特異性を向上させるために、ＣＲＦの測定を、ＤＮＡ１倍体、ＭＡＣ又は他の診断試験などの、他のアッセイと共に使用することができる。同様に、ＣＲＦの測定を使用して、危険性のある群をスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を有する細胞表面マーカー、又は遺伝子マーカーの評価などの後の試験用に、さらに限られた群を同定することができる。ＤＮＡユークロマチン（例えばＣＲＦとして表される）の診断評価は、試験サンプル中において細胞単位で細胞に行うことができ、或いは同じ源由来の試験サンプル（疾患又は疾患の治療を調べるための手段を与える）間の、スライド毎の単位で行うことができ、或いは試験サンプル中のＣＲＦは、群の範囲又は他の有用な標的範囲と比較することができる。
【００７３】
米国特許出願第１０／２３２，６９８号中で論じられたのと同様に、デジタル画像の正規化を使用し、細胞の特徴を計算する前に、利点を得ることができる。以前の方法（例えばＭＡＣ）は、細胞周期のＤＮＡのヒストグラムの分析に頼るものであった。本発明の方法は、デジタル画像の正規化の独特の方法を与える。さらに、全体のＤＮＡを評価し、ＤＮＡユークロマチン分画を推定するための基盤を与えることができる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態を示し記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明の変更形態を考案することができることは想定される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】（従来技術）、肺癌患者から採取した上皮細胞のサンプルに関する、典型的なＤＮＡ含量のヒストグラムの図である。
【図１ｂ】（従来技術）、肺内皮細胞の正常サンプルに関する、ＤＮＡ酸加水分解の典型的な時間基準測定、及び肺癌に関する酸不安定曲線の図である。
【図１ｃ】フォイルゲン法を使用して優先的に染色されるそのＤＮＡユークロマチンを有する正常な生物学的細胞に関する、本発明の実施形態の図である。
【図１ｄ】疾患細胞中のＤＮＡユークロマチンの優先染色に関する、本発明の実施形態の図である。
【図２ａ】（従来技術）、染色された核を有する典型的な内皮細胞の図である。
【図２ｂ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する、図２ａの典型的な内皮細胞の図である。
【図２ｃ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する、典型的な生物学的細胞の図式図である。
【図２ｄ】優先的に染色されたＤＮＡユークロマチンを有する典型的な生物学的細胞の、ピクセレート画像の図である。
【図３ａ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｂ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｃ】本発明の実施形態のブロック図である。
【図３ｄ】本発明の実施形態のブロック図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユークロマチンの評価に基づいて疾患を検出する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、及び
前記評価変数と前記変数の期待値を比較することを含む方法。
【請求項２】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記加水分解ステップを行うことをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸が塩酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記期待値が、前記生物学的細胞に関する前記変数の正規値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記期待値をデータベースに保存する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記期待値を、実質的に健常な生物学的細胞において検出した参照データ組から決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記期待値をデータベースに保存する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価すること、及び
前記第２の評価変数と前記期待値を比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体の健康状態を評価しモニターする方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記変数の基底レベルを確定させること、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記基底レベルを比較することを含む方法。
【請求項３０】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
摂氏２５度未満で前記加水分解ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記加水分解ステップを摂氏約１５度で行う、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記加水分解ステップを行うことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記酸が塩酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が動物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体がヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が植物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が微生物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体の健康状態を評価し調べる方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記評価変数と前記変数の期待値を比較すること、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記変数の前記期待値を比較することを含む方法。
【請求項５４】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記酸が塩酸である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体が動物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験体がヒトである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記被験体が植物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７６】
前記被験体が微生物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７７】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体による影響に曝すことへの応答性を評価する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記変数の基底レベルを確定させること、
前記被験体を影響に曝すこと、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記基底レベルを比較することを含む方法。
【請求項７８】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記酸が塩酸である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
前記被験体が動物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
前記被験体がヒトである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記被験体が植物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
前記被験体が微生物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０１】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体による影響に曝すことへの応答性を評価する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記評価変数と前記変数の期待値を比較すること、
前記被験体を影響に曝すこと、
前記第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記変数の前記期待値を比較することを含む方法。
【請求項１０２】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記酸が塩酸である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２１】
前記被験体が動物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２２】
前記被験体がヒトである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記被験体が植物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記被験体が微生物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１】
ユークロマチンの評価に基づいて疾患を検出する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、及び
前記評価変数と前記変数の期待値を比較することを含む方法。
【請求項２】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記加水分解ステップを行うことをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸が塩酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記期待値が、前記生物学的細胞に関する前記変数の正規値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記期待値をデータベースに保存する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記期待値を、実質的に健常な生物学的細胞において検出した参照データ組から決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記期待値をデータベースに保存する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価すること、及び
前記第２の評価変数と前記期待値を比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体が動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体の健康状態を評価しモニターする方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記変数の基底レベルを確定させること、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記基底レベルを比較することを含む方法。
【請求項３０】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
摂氏２５度未満で前記加水分解ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記加水分解ステップを摂氏約１５度で行う、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記加水分解ステップを行うことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記酸が塩酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が動物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体がヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が植物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が微生物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体の健康状態を評価し調べる方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記評価変数と前記変数の期待値を比較すること、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記変数の前記期待値を比較することを含む方法。
【請求項５４】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記酸が塩酸である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体が動物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験体がヒトである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記被験体が植物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７６】
前記被験体が微生物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項７７】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体による影響に曝すことへの応答性を評価する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記変数の基底レベルを確定させること、
前記被験体を影響に曝すこと、
第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記基底レベルを比較することを含む方法。
【請求項７８】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８４】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記酸が塩酸である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
前記被験体が動物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
前記被験体がヒトである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記被験体が植物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
前記被験体が微生物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０１】
生物学的細胞中のユークロマチンの評価に基づいて、被験体による影響に曝すことへの応答性を評価する方法であって、
第１組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第１組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する変数を評価すること、
前記評価変数と前記変数の期待値を比較すること、
前記被験体を影響に曝すこと、
前記第２組の生物学的細胞中のユークロマチンを同定すること、
前記第２組の生物学的細胞中の、前記ユークロマチンに関する前記変数を評価すること、及び
前記第２組の生物学的細胞中の前記ユークロマチンに関する前記変数と、前記変数の前記期待値を比較することを含む方法。
【請求項１０２】
前記同定ステップが、前記ユークロマチンを染色することを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記染色ステップが、ＤＮＡ定量用染色物質を使用することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がパラロサニリンである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＤＮＡ定量用染色物質がチアジン誘導体である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記チアジン誘導体がチオニンである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記染色ステップがフォイルゲン染色を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
摂氏２５度未満で前記染色ステップを行うことによって、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記染色ステップを摂氏約１５度で行う、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
１分から２時間の間の期間、前記ユークロマチンを優先的に加水分解することをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記期間が１５分から２時間の間である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
０．１〜５．０Ｎの範囲で酸を用いて、前記染色ステップを行うことをさらに含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
前記酸が塩酸である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記評価変数が前記ユークロマチンの量である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記評価変数が前記ユークロマチンの分布状態である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記評価変数が細胞応答因子である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの量から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞応答因子を前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞応答因子を、前記ユークロマチンの量及び前記ユークロマチンの分布状態から決定する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１組の生物学的細胞の前記核中の、前記ユークロマチンに関する第２の変数を評価することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２１】
前記被験体が動物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２２】
前記被験体がヒトである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記被験体が植物である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記被験体が微生物である、請求項１０１に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【公表番号】特表２００６−５０６６１０（Ｐ２００６−５０６６１０Ａ）
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５０５７２（Ｐ２００４−５５０５７２）
【出願日】平成１５年１１月５日（２００３．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００３／００１７１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４２３７
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０４３１４４１０）ジー６・サイエンス・コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月５日（２００３．１１．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００３／００１７１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４２３７
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０４３１４４１０）ジー６・サイエンス・コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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