癌および他の疾患の治療のための新規な（ピロロキノキサリニル）ピラジンカルボヒドラジド−シュウ酸共結晶
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との新規な共結晶が開示される。開示されるシュウ酸共結晶は、癌細胞増殖抑制を示し、懸濁液として投与したとき、対応する遊離塩基より生物学的利用能が高い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この開示は、疾患治療のための含窒素複素環のカルボン酸との共結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅａｍａｔｉらは、癌および血管形成機能と関連付けられる疾患の治療のための含窒素複素環を報告している（その全体が参照により本明細書に特に援用される、米国特許出願第１１／２６５５９３号；Ｇｒａｎｄｅら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第１５巻、２８８〜９４頁（２００７年）を参照されたい）。こうした含窒素複素環には、式ＩＩの化合物
【０００３】
【化１】
［式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、またはハロゲンであり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル、またはハロゲンであり；Ｘは、ＣＨまたはＮであり；Ｙは、単素環または複素環を含み；ただし、ＲがＨであり、Ｒ’がＨであり、ＸがＣＨであり、Ｙがピラジニルまたはピリジニルであるとき、Ｙは、３−、５−もしくは６−ピラジニル、または３−、４−、５−もしくは６−ピリジニルである］が含まれる。その中で報告されている一例が、Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド（「ＮＶＸ−１４４」）である。
【０００４】
【化２】
【０００５】
Ａａｋｅｒｏｙらは、含窒素複素環のカルボン酸との共結晶の、対応する塩に優る利点を論じている（その全体が参照により本明細書に特に援用される、Ａａｋｅｒｏｙら、「Cocrystal or Salt: Does It Really Matter?」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第４巻、３１７〜２２頁（２００７年）を参照されたい）。この著者らは、酸から塩基へのプロトン移動の結果として起こる塩形成は、予測できない化学組成（溶媒和物）または化学量論組成の格子が生じる見込みが、プロトン移動が起こらない分子共結晶形成のほぼ１０倍であることを報告している。著者らは、この結果構造予測およびターゲットとなる超分子合成が簡素化するので、望ましい性質を示す、利用しやすい原薬固体形態の多様性が増すようになるはずであると結論付けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との新規な共結晶（「ＮＶＸ−４１２」）を開示する。開示されるシュウ酸共結晶は、癌細胞増殖抑制を示し、懸濁液として投与したとき、対応する遊離塩基より生物学的利用能が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】米国国立癌研究所癌細胞系の標準パネル（ＮＣＩ６０）をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示す表である。
【図２】５１８Ａ２黒色腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図３】ＣａＣｏ２結腸癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図４】ＨＥＬＡ子宮頚癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図５】Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図６】ＴＣ３２およびＴＣ７１ユーイング肉腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図７Ａ−７Ｏ】薬物動態データの片対数プロットを個々の動物について示すグラフである。
【図８】静脈内投与したＮＶＸ−１４４について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図９】懸濁液にして経口投与したＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１０】懸濁液にして経口投与したＮＶＸ−４１２について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１１】溶液にして経口投与したＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１２】溶液にして経口投与したＮＶＸ−４１２について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌは、綿毛状の静電荷電した吸湿性結晶として存在し、こうした物理的特性が、錠剤やカプセル剤のような経口剤形の製剤において問題となる場合がある。したがって、医薬製剤にいっそう適した、可能性のある新規な化合物としての、塩酸以外の酸のＮＶＸ−１４４塩の調製を評価するために、一連の実験を行った。そうした実験では、（ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌから調製した）遊離のＮＶＸ−１４４塩基が非常に弱い塩基であり、したがって典型的な弱い有機酸とは塩を形成しなかったことが示された。予想したとおり、ＮＶＸ−１４４塩基は、強い有機酸と容易に塩を形成した。しかし、非常に意外なことに、ＮＶＸ−１４４塩基をシュウ酸で処理すると、予想されたＮＶＸ−１４４シュウ酸塩の性質とは一致しない性質を有する新規な結晶性物質が生成した。新規なＮＶＸ−１４４−シュウ酸生成物の分光特性を評価すると、以下の構造を有する新たなＮＶＸ−１４４−シュウ酸共結晶（「ＮＶＸ−４１２」）が生成したことが示唆された。
【０００９】
【化３】
【００１０】
シュウ酸共結晶は希有ではあるが、Ｔｒａｓｋらが、カフェインのシュウ酸との共結晶を報告している（Ｔｒａｓｋら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｒｅｍｅｄｙ ｆｏｒ Ｃａｆｆｅｉｎｅ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ」、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｅｓｉｇｎ、第５巻、１０１３〜２１頁（２００５年）を参照されたい）。ＮＶＸ−４１２は、医薬品の製剤に適する安定な一水和物および二水和物を形成し、様々な疾患の治療に有用であることがわかった。
【００１１】
ＮＶＸ−４１２の合成
以下で詳述するとおり、シュウ酸共結晶ＮＶＸ−４１２は、ＮＶＸ−１４４遊離塩基から生成した。４−クロロ−７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン溶液にピラジン酸ヒドラジドを加えることにより、ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌをまず合成した。次いで、単離した塩酸塩ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌを水酸化ナトリウム溶液で中和して、ＮＶＸ−１４４遊離塩基を生成した。次いで、単離した遊離塩基ＮＶＸ−１４４をシュウ酸溶液に加えて、ＮＶＸ−４１２を生成した。
【実施例】
【００１２】
〈実施例１〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド塩酸塩（ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌ）の調製。アルゴン中にて、８．０ｇの４−クロロ−７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリンを１００ｍＬのエタノールに溶かした溶液に、撹拌しながら５．０ｇのピラジン酸ヒドラジドを加えた。混合物を４時間撹拌し、濾過して、１１ｇ（９４％）のＮＶＸ−１４４・ＨＣｌをオフホワイトの結晶、融点２８２℃、ＬＣ／ＭＳによる純度９８％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．０３（ｍ，１Ｈ）、７．４１（ｔ，１Ｈ）、７．７３（ｍ，２Ｈ）、８．３７（ｄｄ，１Ｈ）、８．６５（ｂｓ，１Ｈ）、８．９０（ｍ，１Ｈ）、９．０１（ｄ，１Ｈ）、９．３０（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｂｓ，１Ｈ）。元素分析：Ｃ１６Ｈ１２Ｎ６ＣｌＦＯの計算値：Ｃ ５３．５７、Ｈ ３．３７、Ｎ ２３．４３、Ｃｌ ９．８８、Ｆ ５．３０；実測値：Ｃ ５３．７０、Ｈ ３．４１、Ｎ ２３．２９、Ｃｌ ９．９２、Ｆ ５．２１。ＨＲＭＳ計算値 ３２２．０９７８；実測値 ３２２．０９８４。ＵＶ λｍａｘ ２２０ｎｍ。ＦＴＩＲ（ニート）３０８４、１６７３、１９２９ｃｍ−１。
【００１３】
〈実施例２〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド（ＮＶＸ−１４４）の調製。４．５ｇのＮＶＸ−１４４・ＨＣｌ、１００ｍＬの水、および１００ｍＬのアセトニトリルの混合物を加熱して、溶液を生成した。溶液を、撹拌しながら６．５ｍＬの２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整し、室温に冷まし、その後沈殿を分離した。混合物を濾過して、３．０ｇ（６８％）のＮＶＸ−１４４をオフホワイトの結晶、融点１６６〜１７０℃、ＬＣ／ＭＳによる純度９６％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：６．８１（ｍ，１Ｈ）、７．１３（ｍ，１Ｈ）、７．２０（ｍ，２Ｈ）、８．１５（ｄｄ，１Ｈ）、８．３３（ｍ，１Ｈ）、８．８５（ｍ，１Ｈ）、８．９６（ｍ，１Ｈ）、９．２４（ｍ，１Ｈ）、９．７８（ｂｓ，１Ｈ）、１０．９６（ｂｓ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。ＵＶ λｍａｘ ２２５ｎｍ。ＦＴＩＲ（ニート）３１１７、１６７１、１４８９ｃｍ−１。
【００１４】
〈実施例３〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドシュウ酸共結晶（ＮＶＸ−４１２）の調製。窒素中にて、５．１ｇのＮＶＸ−１４４と５９０ｍＬの水の混合物に、３．９１ｇのシュウ酸を６０ｍＬの水に溶かした溶液を撹拌しながら滴下した。２時間撹拌した後、スラリーを濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、１１．８ｇ（９２％）のＮＶＸ−４１２を淡黄色の結晶、ＬＣ／ＭＳによる純度９９％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：６．８（１Ｈ）、７．１〜７．２（３Ｈ）、８．１５（１Ｈ）、８．３（１Ｈ）、８．８５（１Ｈ）、８．９５（１Ｈ）、９．２５（１Ｈ）、１０．９５（１Ｈ）。
【００１５】
ＮＶＸ−１４４は、強酸（たとえば、塩酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）とは容易に塩を形成するが、弱いモノカルボン酸（たとえば、酢酸、アスパラギン酸、グルコン酸、乳酸）またはそれよりも強いジカルボン酸（たとえば、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ムコン酸、コハク酸）とは塩を形成しない。したがって、ＮＶＸ−１４４は、比較的強いジカルボン酸であるシュウ酸と塩を形成するとは予想されないことになる。
【００１６】
しかし、ＮＶＸ−１４４は、シュウ酸と、１：１の化学量論性を有する新規な実在物（ＮＶＸ−４１２）を形成する。ＮＶＸ−４１２のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンは、ＮＶＸ−１４４のパターンとは著しく異なり、新たな結晶性物質が生成されたことを示している。さらに、ＮＶＸ−４１２の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌの化学シフトとは異なっており、ＮＶＸ−１４４塩基の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトと基本的に同一である。これは、共結晶では、２種の構成成分がＮＭＲ溶液中で別々に溶媒和するので、予想される結果である。表１は、ＤＭＳＯ−ｄ６中でのＮＶＸ−１４４、ＮＶＸ−１４４．ＨＣｌ、およびＮＶＸ−４１２の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトの比較を示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
ＮＶＸ−４１２の治療への使用
ＮＶＸ−４１２は、様々な疾患の治療に有用であることが実証された。一実施形態では、ＮＶＸ−４１２は、癌細胞の増殖を抑制する。図１〜６は、以下のヒト癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すものである。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）、ＨＬ−６０（白血病）、Ｋ５６２（白血病）、ＭＯＬＴ−４（白血病）、ＲＰＭＩ−８２２６（白血病）、ＳＲ（白血病）、Ａ−５４９（肺癌）、ＥＫＶＸ（肺癌）、ＨＯＰ−６２（肺癌）、ＨＯＰ−９２（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２３（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（肺癌）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＨＣＣ−２９９８（結腸癌）、ＨＣＴ−１１６（結腸癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＨＴ２９（結腸癌）、ＫＭ１２（結腸癌）、ＳＷ−６２０（結腸癌）、ＣａＣｏ２（結腸癌）、ＳＦ−２６８（ＣＮＳ癌）、ＳＦ−２９５（ＣＮＳ癌）、ＳＦ−５３９（ＣＮＳ癌）、ＳＮＢ−１９（ＣＮＳ癌）、ＳＮＢ−７５（ＣＮＳ癌）、Ｕ２５１（ＣＮＳ癌）、Ｕ８７ＭＧ（神経膠芽腫）、ＬＯＸ ＩＭＶＩ（黒色腫）、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（黒色腫）、Ｍ１４（黒色腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）、ＵＡＣＣ−２５７（黒色腫）、ＵＡＣＣ−６２（黒色腫）、５１８Ａ２（黒色腫）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−４（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−５（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣癌）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（卵巣癌）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌）、ＨＥＬＡ（子宮頚癌）、７８６−０（腎癌）、Ａ４９８（腎癌）、ＡＣＨＮ（腎癌）、ＣＡＫＩ−１（腎癌）、ＲＸＦ ３９３（腎癌）、ＳＮ１２Ｃ（腎癌）、ＴＫ−１０（腎癌）、ＵＯ−３１（腎癌）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、ＨＳ ５７８Ｔ（乳癌）、Ｔ−４７Ｄ（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＴＣ７１ｌｕｃ（ユーイング肉腫）、およびＴＣ３２ｌｕｃ（ユーイング肉腫）。実験の詳細を以下での実施例４および５に示す。
【００１９】
〈実施例４〉
様々な癌細胞系のＮＶＸ−４１２での処理。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.htmlを参照されたい）およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ ＲＨ（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、第６巻、８１３〜８２３頁（２００６年））ならびにそこに引用されている参考資料に詳述されている手順に従い、６０種を超えるヒト癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した。試験した細胞系の多くは、アメリカ培養細胞系統保存機関（米国メリーランド州ロックヴィル）から入手可能である。黒色腫細胞系５１８Ａ２については、以前に記述がなされている（Ｊａｎｓｅｎら、「Activated
N−Ras Contributes to the Chemoresistance of Human Melanoma in Severe Combined
Immunodeficiency (SCID) Mice by Blocking Apoptosis」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第５７巻、３６２〜６５頁（１９９７年））。ＮＶＸ−４１２による癌細胞処理の典型的なスクリーニングには、以下の手順を用いた。
【００２０】
癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞系を、５％のウシ胎児血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。典型的なスクリーニング実験では、細胞を、個々の細胞系の倍加時間に応じて５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの範囲のプレーティング密度で、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬにして播種した。細胞を播種した後、ＮＶＸ−４１２を加える前に、マイクロタイタープレートを相対湿度１００％の５％ＣＯ２／９５％空気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２１】
２４時間後、各細胞系の２枚のプレートをｉｎ ｓｉｔｕでＴＣＡ固定して、ＮＶＸ−４１２を加える時点における各細胞系の細胞集団を測定値とした（Ｔｚ）。ＮＶＸ−４１２を、所望の最終最大試験濃度の４００倍でジメチルスルホキシドに可溶化し、使用前に凍結保存した。ＮＶＸ−４１２を加える時点で、一定分量の凍結した濃縮物を解凍し、５０μｇ／ｍｏｌのゲンタマイシンを含有する完全培地で所望の最終最大試験濃度の２倍に希釈した。追加の４段階の１０倍または１／２対数段階希釈を行って、合計５段階の濃度のＮＶＸ−４１２プラス対照を準備した。これらの異なるＮＶＸ−４１２希釈物の一定分量１００μｌを、１００μＬの培地をすでに含有する適切なマイクロタイターウェルに加え、必要な最終ＮＶＸ−４１２濃度とした。
【００２２】
ＮＶＸ−４１２を加えた後、プレートを相対湿度１００％の５％ＣＯ２／９５％空気中にて３７℃でさらに４８時間インキュベートした。付着細胞については、冷ＴＣＡを加えてアッセイを終わらせた。５０μＬの冷５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（最終濃度、１０％ＴＣＡ）を穏やかに加えて細胞をｉｎ ｓｉｔｕで固定し、４℃で６０分間インキュベートした。上清を捨て、プレートを水道水で５回洗浄し、風乾した。１％酢酸中０．４％（ｗ／ｖ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（１００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。染色後、１％酢酸で５回洗浄して、結合していない色素を除去し、プレートを風乾した。引き続いて、結合した着色を１０ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基で可溶化し、自動化プレートリーダーにおいて５１５ｎｍの波長で吸光度を読み取った。浮遊細胞については、ウェルの底の沈降した細胞を、５０μＬの８０％ＴＣＡ（最終濃度、１６％ＴＣＡ）を穏やかに加えることにより固定してアッセイを終わらせたことを除き、方法は同じであった。７つの吸光度測定値［０時間（Ｔｚ）、対照増殖物（Ｃ）、および５段階の濃度レベルのＮＶＸ−４１２存在下の試験増殖物（Ｔｉ）］を使用して、各ＮＶＸ−４１２濃度レベルでの増殖パーセンテージを算出した。増殖抑制パーセンテージは、以下のように算出した。
Ｔｉ≧Ｔｚである濃度については、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００
Ｔｉ＜Ｔｚである濃度については、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００
【００２３】
３つの用量反応パラメーターを算出した。５０％増殖抑制（ＧＩ５０）は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝５０から算出したが、これは、インキュベートの間、対照細胞における（ＳＲＢ染色によって測定される）正味のタンパク質増加を５０％減少させる濃度である。完全増殖抑制（ＴＧＩ）をもたらす濃度は、Ｔｉ＝Ｔｚから算出した。処理の後の細胞の正味の減少を示す、ＬＣ５０（処理の終わりのタンパク質測定値を、始めの測定値と比べて５０％減少させる濃度）は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００＝−５０から算出した。活性のレベルに達していれば、これら３つのパラメーターそれぞれについて値を算出したが、しかし、効果が及ばない、または上回る場合、パラメーターの値は、最大または最小試験濃度超過または未満であると表示した。
【００２４】
図１には、試験したそれぞれの癌細胞系の増殖を５０％減少させるのに必要となるＮＶＸ−４１２濃度（ＧＩ５０）を示す。
【００２５】
結果を図２〜５に示す追加実験では、５１８Ａ２黒色腫細胞、ＣａＣｏ２結腸癌細胞、ＨＥＬＡ子宮頚癌細胞、およびＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞をＮＶＸ−４１２で処理した。細胞は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ベルリン）の１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した、４５００ｍｇ／Ｌのグルコースを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞生存アッセイでは、細胞を２４ウェルプレート（５Ｔ／ウェル）に播種し、３日間処理するか、または処理しなかった。次いで、細胞数をカウントし、未処理対照に対するパーセンテージとして記した。各データポイントは、４つのウェルから得られる平均細胞数を表す。各実験を３回行った。細胞増殖を評価するために、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ（ドイツ国クレーフェルト）の自動化細胞カウンターを使用して、処理期間終了時の生存細胞の数を求めた。
【００２６】
図２〜５には、表示した癌細胞系をＮＶＸ−４１２処理した後の、腫瘍細胞増殖の対照に対する抑制パーセントを示す（適用できる場合、表示した濃度での３日間の癌細胞の処理について平均および標準偏差（ｎ＝３）を示す）。
【００２７】
要約すると、ＮＶＸ−４１２処理によって、腫瘍細胞増殖が著しく抑制され、試験したほとんどすべての細胞系のＧＩ５０値が、ナノモルの範囲にあった。
【００２８】
〈実施例５〉
ユーイング肉腫のＮＶＸ−４１２処理。ＴＣ７１ｌｕｃおよびＴＣ３２ｌｕｃユーイング腫瘍細胞系は、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現させる。細胞を、活性化合物で処理する２４時間前に９６ウェルプレートに播種して、付着させた。細胞を７２時間ＮＶＸ−４１２で処理した。ＮＶＸ−４１２の段階希釈物を、１０μＭのＤＭＳＯ保存液から培地中に調製した。このアッセイにおける最大ＤＭＳＯ濃度は、細胞生存度に影響を及ぼさない（データは示さない）、０．１％とした。７２時間後、Ｓａｐｈｉｒｅ２プレートリーダーを使用して、細胞生存度を発光によって測定した。実験はトリプリケートで実施し、図６には、少なくとも３回の独立した実験についての平均および標準偏差を示す。表２には、３日後に残存する細胞の割合をＮＶＸ−４１２の濃度に応じて示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
要約すると、ＮＶＸ−４１２は、上述のようにいくつかの上皮細胞系の増殖を抑制し得るだけでなく、肉腫、黒色腫、およびＣＮＳ癌細胞系に対しても非常に有効であった。
【００３１】
薬物動態学
薬物動態実験では、懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の生物学的利用能がＮＶＸ−１４４と比べて向上したことが実証された。実験の詳細および結果を以下の実施例６に示す。薬物動態実験では、ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、０．９３〜１．１５時間の終末血漿半減期を有し、クリアランスが中等度の３８０６ｍＬ／ｈ／ｋｇ、分布容積が中等度の３９８５ｍＬ／ｋｇとなったことが示された。溶液または懸濁液として投与したときのＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の経口吸収は、どちらも中等度であった。ＮＶＸ−１４４の経口生物学的利用能は、懸濁液として経口投与後は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。ＮＶＸ−４１２の経口生物学的利用能は、懸濁液として経口投与後は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。すなわち、溶液として投与したとき、経口吸収ではＮＶＸ−４１２とＮＶＸ−１４４とに有意差はなかったが、懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の経口吸収がＮＶＸ−１４４遊離塩基より若干向上していた。
【００３２】
〈実施例６〉
ＮＶＸ−４１２およびＮＶＸ−１４４の薬物動態実験
用量調製
経口懸濁液製剤は、試験物を５％のＰＥＧ−２００／９５％のメチルセルロース０．５％溶液に懸濁させて調製した。試験物の濃度は、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の経口溶液製剤は、試験物を１０体積％のジメチルアセトアミド、続いて６０体積％のＰＥＧ−４００に溶解させ、次いで３０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を５０ｍＭの乳酸に溶かした溶液をゆっくりと加えて、残りの３０％の体積に充てることにより調製した。試験物の濃度は、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。ＮＶＸ−４１２のＩＶ製剤は、試験物を１０体積％のジメチルアセトアミド、続いて１０体積％のＰＥＧ−４００に溶解させ、次いで１０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を５０ｍＭの乳酸に溶かした溶液をゆっくりと加えて、残りの８０％の体積に充てることにより調製した。試験物の濃度は、２．５ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。投与する用量は、投与のすぐ前に計測した各動物の体重に基づくものとした。製剤は、調製後直ちに使用した。
【００３３】
研究計画
合計１５匹のラットを研究に割り当てた。それぞれ３匹の雄ラットからなる５群によって研究を構成した。以下の表３に明細に記すとおり、各群を、経口経管栄養または尾静脈からの静脈内注射によって１回処置した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
試験物投与
動物を投与前に一晩絶食させ、投与の約２時間後に飼料を戻した。各動物の用量は、最新の体重に基づくものとした。経口用量を経管栄養によって投与した。動物には経口１回量あたり１０ｍＬ／ｋｇを与えた。静脈内用量を尾静脈注射によって投与した。各動物の用量は、最新の体重に基づくものとした。動物には静脈内１回量あたり２．５ｍＬ／ｋｇで投与した。
【００３６】
生存能観察
動物の生存能を、研究の間終始少なくとも朝１回晩１回観察した。
【００３７】
体重
すべての動物について、投与の直前に体重を測定した。
【００３８】
薬物動態サンプル
薬物動態分析用に、群１〜５の動物の血液を収集した。経口経路によって処置した各ラットから、４度の時点（投与後３０分、１時間、４時間、および８時間）で、約０．３ｍＬの血液を眼窩静脈叢からＥＤＴＡカリウム管に収集し、血液サンプルを処理にかけて、血漿を調製した。静脈内経路によって処置した各ラットからは、４度の時点（投与後５分、３０分、１時間、および２時間）で血液を収集し、血液サンプルを処理にかけて、血漿を調製した。動物をその最後のサンプル収集の後に（剖検せずに）処分した。
【００３９】
全血サンプルは、（約５℃にセットした）冷却遠心機にて最短で１０分間遠心分離した（約１５００×ｇ）。血液収集／遠心分離から３０分以内に、血漿を調製し、適切にラベルされた管に移した。次いで、管を凍結させ、分析するまで暗所にて−７０℃以下で保存した。血漿サンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析して、ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の血漿濃度を求めた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１を用い、ノンコンパートメント解析を使用して、血漿濃度データの薬物動態分析を行った。
【００４０】
ＮＶＸ−４１２を５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した後、投与後０．０８３時間でピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は１８４２ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．０時間であり、平均ＡＵＣ（０〜∞）は１３１４ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は４８７ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は、１．４時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は１８２６ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。表４に、ＮＶＸ−４１２を静脈内投与後の個々の動物について（ｎｇ／ｍＬで）血漿濃度データを示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表５に、静脈内投与後のＮＶＸ−４１２について、算出された薬物動態パラメーターを示す。
【００４３】
【表５】
【００４４】
ＮＶＸ−４１２を懸濁液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後１時間でピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は５２５ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．２時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２３０７ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を溶液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は７１４ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．６時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２５２１ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。
【００４５】
ＮＶＸ−４１２を溶液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は６４３ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．４時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２２８９ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として経口投与後の生物学的利用能は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。ＮＶＸ−４１２を懸濁液として経口投与後の生物学的利用能は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。
【００４６】
表６に、ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２を経口投与後の個々の動物について（ｎｇ／ｍＬで）血漿濃度データを示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
表７に、経口投与後のＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２について、算出された薬物動態パラメーターを示す。
【００４９】
【表７】
【００５０】
図７Ａ〜７Ｏは、個々の各動物について、薬物動態データの片対数プロットを示すものである。
【００５１】
図８〜１２は、静脈内投与、懸濁液で経口投与、および溶液で経口投与したＮＶＸ−４１２およびＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個別および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すものである。
【００５２】
すなわち、以下の事項が発見された。
● ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、終末血漿半減期が０．９３〜１．１５時間であった。
● ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、クリアランスが中等度の３８０６ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、分布容積が中等度の３９８５ｍＬ／ｋｇとなった。
● ＮＶＸ−１４４遊離塩基の経口吸収は、溶液または懸濁液として投与したとき、中等度であった。
● ＮＶＸ−４１２の経口吸収は、溶液または懸濁液として投与したとき、中等度であった。
● ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として経口投与後の経口生物学的利用能は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。
● ＮＶＸ−４１２を懸濁液として経口投与後の経口生物学的利用能は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。
● 溶液として投与したとき、経口吸収ではＮＶＸ−４１２とＮＶＸ−１４４遊離塩基とに有意差はなかった。
● 懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の経口吸収がＮＶＸ−１４４遊離塩基より若干向上していた。
【００５３】
こうして、Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との新規な共結晶、ＮＶＸ−４１２が発見された。この新規な化合物は、十分な生物学的利用能および癌細胞増殖抑制能を示した。
【００５４】
本発明の特定の実施形態について上で述べてきたが、そうした実施形態は、本発明を例示するものにすぎず、以下の特許請求の範囲に従って解釈される本発明を限定するとみなすべきでない。
【技術分野】
【０００１】
この開示は、疾患治療のための含窒素複素環のカルボン酸との共結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅａｍａｔｉらは、癌および血管形成機能と関連付けられる疾患の治療のための含窒素複素環を報告している（その全体が参照により本明細書に特に援用される、米国特許出願第１１／２６５５９３号；Ｇｒａｎｄｅら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｈｙｄｒａｚｉｎｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第１５巻、２８８〜９４頁（２００７年）を参照されたい）。こうした含窒素複素環には、式ＩＩの化合物
【０００３】
【化１】
［式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、またはハロゲンであり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル、またはハロゲンであり；Ｘは、ＣＨまたはＮであり；Ｙは、単素環または複素環を含み；ただし、ＲがＨであり、Ｒ’がＨであり、ＸがＣＨであり、Ｙがピラジニルまたはピリジニルであるとき、Ｙは、３−、５−もしくは６−ピラジニル、または３−、４−、５−もしくは６−ピリジニルである］が含まれる。その中で報告されている一例が、Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド（「ＮＶＸ−１４４」）である。
【０００４】
【化２】
【０００５】
Ａａｋｅｒｏｙらは、含窒素複素環のカルボン酸との共結晶の、対応する塩に優る利点を論じている（その全体が参照により本明細書に特に援用される、Ａａｋｅｒｏｙら、「Cocrystal or Salt: Does It Really Matter?」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第４巻、３１７〜２２頁（２００７年）を参照されたい）。この著者らは、酸から塩基へのプロトン移動の結果として起こる塩形成は、予測できない化学組成（溶媒和物）または化学量論組成の格子が生じる見込みが、プロトン移動が起こらない分子共結晶形成のほぼ１０倍であることを報告している。著者らは、この結果構造予測およびターゲットとなる超分子合成が簡素化するので、望ましい性質を示す、利用しやすい原薬固体形態の多様性が増すようになるはずであると結論付けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との新規な共結晶（「ＮＶＸ−４１２」）を開示する。開示されるシュウ酸共結晶は、癌細胞増殖抑制を示し、懸濁液として投与したとき、対応する遊離塩基より生物学的利用能が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】米国国立癌研究所癌細胞系の標準パネル（ＮＣＩ６０）をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示す表である。
【図２】５１８Ａ２黒色腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図３】ＣａＣｏ２結腸癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図４】ＨＥＬＡ子宮頚癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図５】Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図６】ＴＣ３２およびＴＣ７１ユーイング肉腫細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すグラフである。
【図７Ａ−７Ｏ】薬物動態データの片対数プロットを個々の動物について示すグラフである。
【図８】静脈内投与したＮＶＸ−１４４について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図９】懸濁液にして経口投与したＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１０】懸濁液にして経口投与したＮＶＸ−４１２について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１１】溶液にして経口投与したＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【図１２】溶液にして経口投与したＮＶＸ−４１２について、個々および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌは、綿毛状の静電荷電した吸湿性結晶として存在し、こうした物理的特性が、錠剤やカプセル剤のような経口剤形の製剤において問題となる場合がある。したがって、医薬製剤にいっそう適した、可能性のある新規な化合物としての、塩酸以外の酸のＮＶＸ−１４４塩の調製を評価するために、一連の実験を行った。そうした実験では、（ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌから調製した）遊離のＮＶＸ−１４４塩基が非常に弱い塩基であり、したがって典型的な弱い有機酸とは塩を形成しなかったことが示された。予想したとおり、ＮＶＸ−１４４塩基は、強い有機酸と容易に塩を形成した。しかし、非常に意外なことに、ＮＶＸ−１４４塩基をシュウ酸で処理すると、予想されたＮＶＸ−１４４シュウ酸塩の性質とは一致しない性質を有する新規な結晶性物質が生成した。新規なＮＶＸ−１４４−シュウ酸生成物の分光特性を評価すると、以下の構造を有する新たなＮＶＸ−１４４−シュウ酸共結晶（「ＮＶＸ−４１２」）が生成したことが示唆された。
【０００９】
【化３】
【００１０】
シュウ酸共結晶は希有ではあるが、Ｔｒａｓｋらが、カフェインのシュウ酸との共結晶を報告している（Ｔｒａｓｋら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ： Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｒｅｍｅｄｙ ｆｏｒ Ｃａｆｆｅｉｎｅ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ」、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ＆Ｄｅｓｉｇｎ、第５巻、１０１３〜２１頁（２００５年）を参照されたい）。ＮＶＸ−４１２は、医薬品の製剤に適する安定な一水和物および二水和物を形成し、様々な疾患の治療に有用であることがわかった。
【００１１】
ＮＶＸ−４１２の合成
以下で詳述するとおり、シュウ酸共結晶ＮＶＸ−４１２は、ＮＶＸ−１４４遊離塩基から生成した。４−クロロ−７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン溶液にピラジン酸ヒドラジドを加えることにより、ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌをまず合成した。次いで、単離した塩酸塩ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌを水酸化ナトリウム溶液で中和して、ＮＶＸ−１４４遊離塩基を生成した。次いで、単離した遊離塩基ＮＶＸ−１４４をシュウ酸溶液に加えて、ＮＶＸ−４１２を生成した。
【実施例】
【００１２】
〈実施例１〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド塩酸塩（ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌ）の調製。アルゴン中にて、８．０ｇの４−クロロ−７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリンを１００ｍＬのエタノールに溶かした溶液に、撹拌しながら５．０ｇのピラジン酸ヒドラジドを加えた。混合物を４時間撹拌し、濾過して、１１ｇ（９４％）のＮＶＸ−１４４・ＨＣｌをオフホワイトの結晶、融点２８２℃、ＬＣ／ＭＳによる純度９８％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．０３（ｍ，１Ｈ）、７．４１（ｔ，１Ｈ）、７．７３（ｍ，２Ｈ）、８．３７（ｄｄ，１Ｈ）、８．６５（ｂｓ，１Ｈ）、８．９０（ｍ，１Ｈ）、９．０１（ｄ，１Ｈ）、９．３０（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｂｓ，１Ｈ）。元素分析：Ｃ１６Ｈ１２Ｎ６ＣｌＦＯの計算値：Ｃ ５３．５７、Ｈ ３．３７、Ｎ ２３．４３、Ｃｌ ９．８８、Ｆ ５．３０；実測値：Ｃ ５３．７０、Ｈ ３．４１、Ｎ ２３．２９、Ｃｌ ９．９２、Ｆ ５．２１。ＨＲＭＳ計算値 ３２２．０９７８；実測値 ３２２．０９８４。ＵＶ λｍａｘ ２２０ｎｍ。ＦＴＩＲ（ニート）３０８４、１６７３、１９２９ｃｍ−１。
【００１３】
〈実施例２〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジド（ＮＶＸ−１４４）の調製。４．５ｇのＮＶＸ−１４４・ＨＣｌ、１００ｍＬの水、および１００ｍＬのアセトニトリルの混合物を加熱して、溶液を生成した。溶液を、撹拌しながら６．５ｍＬの２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７に調整し、室温に冷まし、その後沈殿を分離した。混合物を濾過して、３．０ｇ（６８％）のＮＶＸ−１４４をオフホワイトの結晶、融点１６６〜１７０℃、ＬＣ／ＭＳによる純度９６％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：６．８１（ｍ，１Ｈ）、７．１３（ｍ，１Ｈ）、７．２０（ｍ，２Ｈ）、８．１５（ｄｄ，１Ｈ）、８．３３（ｍ，１Ｈ）、８．８５（ｍ，１Ｈ）、８．９６（ｍ，１Ｈ）、９．２４（ｍ，１Ｈ）、９．７８（ｂｓ，１Ｈ）、１０．９６（ｂｓ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２３．１［Ｍ＋Ｈ］＋。ＵＶ λｍａｘ ２２５ｎｍ。ＦＴＩＲ（ニート）３１１７、１６７１、１４８９ｃｍ−１。
【００１４】
〈実施例３〉
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドシュウ酸共結晶（ＮＶＸ−４１２）の調製。窒素中にて、５．１ｇのＮＶＸ−１４４と５９０ｍＬの水の混合物に、３．９１ｇのシュウ酸を６０ｍＬの水に溶かした溶液を撹拌しながら滴下した。２時間撹拌した後、スラリーを濾過し、水で洗浄し、乾燥させて、１１．８ｇ（９２％）のＮＶＸ−４１２を淡黄色の結晶、ＬＣ／ＭＳによる純度９９％として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：６．８（１Ｈ）、７．１〜７．２（３Ｈ）、８．１５（１Ｈ）、８．３（１Ｈ）、８．８５（１Ｈ）、８．９５（１Ｈ）、９．２５（１Ｈ）、１０．９５（１Ｈ）。
【００１５】
ＮＶＸ−１４４は、強酸（たとえば、塩酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）とは容易に塩を形成するが、弱いモノカルボン酸（たとえば、酢酸、アスパラギン酸、グルコン酸、乳酸）またはそれよりも強いジカルボン酸（たとえば、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ムコン酸、コハク酸）とは塩を形成しない。したがって、ＮＶＸ−１４４は、比較的強いジカルボン酸であるシュウ酸と塩を形成するとは予想されないことになる。
【００１６】
しかし、ＮＶＸ−１４４は、シュウ酸と、１：１の化学量論性を有する新規な実在物（ＮＶＸ−４１２）を形成する。ＮＶＸ−４１２のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンは、ＮＶＸ−１４４のパターンとは著しく異なり、新たな結晶性物質が生成されたことを示している。さらに、ＮＶＸ−４１２の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、ＮＶＸ−１４４・ＨＣｌの化学シフトとは異なっており、ＮＶＸ−１４４塩基の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトと基本的に同一である。これは、共結晶では、２種の構成成分がＮＭＲ溶液中で別々に溶媒和するので、予想される結果である。表１は、ＤＭＳＯ−ｄ６中でのＮＶＸ−１４４、ＮＶＸ−１４４．ＨＣｌ、およびＮＶＸ−４１２の１Ｈ ＮＭＲ化学シフトの比較を示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
ＮＶＸ−４１２の治療への使用
ＮＶＸ−４１２は、様々な疾患の治療に有用であることが実証された。一実施形態では、ＮＶＸ−４１２は、癌細胞の増殖を抑制する。図１〜６は、以下のヒト癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した結果を示すものである。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）、ＨＬ−６０（白血病）、Ｋ５６２（白血病）、ＭＯＬＴ−４（白血病）、ＲＰＭＩ−８２２６（白血病）、ＳＲ（白血病）、Ａ−５４９（肺癌）、ＥＫＶＸ（肺癌）、ＨＯＰ−６２（肺癌）、ＨＯＰ−９２（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ２３（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺癌）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（肺癌）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＨＣＣ−２９９８（結腸癌）、ＨＣＴ−１１６（結腸癌）、ＨＣＴ−１５（結腸癌）、ＨＴ２９（結腸癌）、ＫＭ１２（結腸癌）、ＳＷ−６２０（結腸癌）、ＣａＣｏ２（結腸癌）、ＳＦ−２６８（ＣＮＳ癌）、ＳＦ−２９５（ＣＮＳ癌）、ＳＦ−５３９（ＣＮＳ癌）、ＳＮＢ−１９（ＣＮＳ癌）、ＳＮＢ−７５（ＣＮＳ癌）、Ｕ２５１（ＣＮＳ癌）、Ｕ８７ＭＧ（神経膠芽腫）、ＬＯＸ ＩＭＶＩ（黒色腫）、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ（黒色腫）、Ｍ１４（黒色腫）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（黒色腫）、ＳＫ−ＭＥＬ−５（黒色腫）、ＵＡＣＣ−２５７（黒色腫）、ＵＡＣＣ−６２（黒色腫）、５１８Ａ２（黒色腫）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−４（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−５（卵巣癌）、ＯＶＣＡＲ−８（卵巣癌）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（卵巣癌）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣癌）、ＨＥＬＡ（子宮頚癌）、７８６−０（腎癌）、Ａ４９８（腎癌）、ＡＣＨＮ（腎癌）、ＣＡＫＩ−１（腎癌）、ＲＸＦ ３９３（腎癌）、ＳＮ１２Ｃ（腎癌）、ＴＫ−１０（腎癌）、ＵＯ−３１（腎癌）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、ＨＳ ５７８Ｔ（乳癌）、Ｔ−４７Ｄ（乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌）、ＴＣ７１ｌｕｃ（ユーイング肉腫）、およびＴＣ３２ｌｕｃ（ユーイング肉腫）。実験の詳細を以下での実施例４および５に示す。
【００１９】
〈実施例４〉
様々な癌細胞系のＮＶＸ−４１２での処理。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.htmlを参照されたい）およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ ＲＨ（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、第６巻、８１３〜８２３頁（２００６年））ならびにそこに引用されている参考資料に詳述されている手順に従い、６０種を超えるヒト癌細胞系をＮＶＸ−４１２で処理した。試験した細胞系の多くは、アメリカ培養細胞系統保存機関（米国メリーランド州ロックヴィル）から入手可能である。黒色腫細胞系５１８Ａ２については、以前に記述がなされている（Ｊａｎｓｅｎら、「Activated
N−Ras Contributes to the Chemoresistance of Human Melanoma in Severe Combined
Immunodeficiency (SCID) Mice by Blocking Apoptosis」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第５７巻、３６２〜６５頁（１９９７年））。ＮＶＸ−４１２による癌細胞処理の典型的なスクリーニングには、以下の手順を用いた。
【００２０】
癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞系を、５％のウシ胎児血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で増殖させた。典型的なスクリーニング実験では、細胞を、個々の細胞系の倍加時間に応じて５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの範囲のプレーティング密度で、９６ウェルマイクロタイタープレートに１００μＬにして播種した。細胞を播種した後、ＮＶＸ−４１２を加える前に、マイクロタイタープレートを相対湿度１００％の５％ＣＯ２／９５％空気中にて３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２１】
２４時間後、各細胞系の２枚のプレートをｉｎ ｓｉｔｕでＴＣＡ固定して、ＮＶＸ−４１２を加える時点における各細胞系の細胞集団を測定値とした（Ｔｚ）。ＮＶＸ−４１２を、所望の最終最大試験濃度の４００倍でジメチルスルホキシドに可溶化し、使用前に凍結保存した。ＮＶＸ−４１２を加える時点で、一定分量の凍結した濃縮物を解凍し、５０μｇ／ｍｏｌのゲンタマイシンを含有する完全培地で所望の最終最大試験濃度の２倍に希釈した。追加の４段階の１０倍または１／２対数段階希釈を行って、合計５段階の濃度のＮＶＸ−４１２プラス対照を準備した。これらの異なるＮＶＸ−４１２希釈物の一定分量１００μｌを、１００μＬの培地をすでに含有する適切なマイクロタイターウェルに加え、必要な最終ＮＶＸ−４１２濃度とした。
【００２２】
ＮＶＸ−４１２を加えた後、プレートを相対湿度１００％の５％ＣＯ２／９５％空気中にて３７℃でさらに４８時間インキュベートした。付着細胞については、冷ＴＣＡを加えてアッセイを終わらせた。５０μＬの冷５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（最終濃度、１０％ＴＣＡ）を穏やかに加えて細胞をｉｎ ｓｉｔｕで固定し、４℃で６０分間インキュベートした。上清を捨て、プレートを水道水で５回洗浄し、風乾した。１％酢酸中０．４％（ｗ／ｖ）のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（１００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。染色後、１％酢酸で５回洗浄して、結合していない色素を除去し、プレートを風乾した。引き続いて、結合した着色を１０ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基で可溶化し、自動化プレートリーダーにおいて５１５ｎｍの波長で吸光度を読み取った。浮遊細胞については、ウェルの底の沈降した細胞を、５０μＬの８０％ＴＣＡ（最終濃度、１６％ＴＣＡ）を穏やかに加えることにより固定してアッセイを終わらせたことを除き、方法は同じであった。７つの吸光度測定値［０時間（Ｔｚ）、対照増殖物（Ｃ）、および５段階の濃度レベルのＮＶＸ−４１２存在下の試験増殖物（Ｔｉ）］を使用して、各ＮＶＸ−４１２濃度レベルでの増殖パーセンテージを算出した。増殖抑制パーセンテージは、以下のように算出した。
Ｔｉ≧Ｔｚである濃度については、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００
Ｔｉ＜Ｔｚである濃度については、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００
【００２３】
３つの用量反応パラメーターを算出した。５０％増殖抑制（ＧＩ５０）は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝５０から算出したが、これは、インキュベートの間、対照細胞における（ＳＲＢ染色によって測定される）正味のタンパク質増加を５０％減少させる濃度である。完全増殖抑制（ＴＧＩ）をもたらす濃度は、Ｔｉ＝Ｔｚから算出した。処理の後の細胞の正味の減少を示す、ＬＣ５０（処理の終わりのタンパク質測定値を、始めの測定値と比べて５０％減少させる濃度）は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００＝−５０から算出した。活性のレベルに達していれば、これら３つのパラメーターそれぞれについて値を算出したが、しかし、効果が及ばない、または上回る場合、パラメーターの値は、最大または最小試験濃度超過または未満であると表示した。
【００２４】
図１には、試験したそれぞれの癌細胞系の増殖を５０％減少させるのに必要となるＮＶＸ−４１２濃度（ＧＩ５０）を示す。
【００２５】
結果を図２〜５に示す追加実験では、５１８Ａ２黒色腫細胞、ＣａＣｏ２結腸癌細胞、ＨＥＬＡ子宮頚癌細胞、およびＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞をＮＶＸ−４１２で処理した。細胞は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ国ベルリン）の１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した、４５００ｍｇ／Ｌのグルコースを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞生存アッセイでは、細胞を２４ウェルプレート（５Ｔ／ウェル）に播種し、３日間処理するか、または処理しなかった。次いで、細胞数をカウントし、未処理対照に対するパーセンテージとして記した。各データポイントは、４つのウェルから得られる平均細胞数を表す。各実験を３回行った。細胞増殖を評価するために、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ（ドイツ国クレーフェルト）の自動化細胞カウンターを使用して、処理期間終了時の生存細胞の数を求めた。
【００２６】
図２〜５には、表示した癌細胞系をＮＶＸ−４１２処理した後の、腫瘍細胞増殖の対照に対する抑制パーセントを示す（適用できる場合、表示した濃度での３日間の癌細胞の処理について平均および標準偏差（ｎ＝３）を示す）。
【００２７】
要約すると、ＮＶＸ−４１２処理によって、腫瘍細胞増殖が著しく抑制され、試験したほとんどすべての細胞系のＧＩ５０値が、ナノモルの範囲にあった。
【００２８】
〈実施例５〉
ユーイング肉腫のＮＶＸ−４１２処理。ＴＣ７１ｌｕｃおよびＴＣ３２ｌｕｃユーイング腫瘍細胞系は、ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現させる。細胞を、活性化合物で処理する２４時間前に９６ウェルプレートに播種して、付着させた。細胞を７２時間ＮＶＸ−４１２で処理した。ＮＶＸ−４１２の段階希釈物を、１０μＭのＤＭＳＯ保存液から培地中に調製した。このアッセイにおける最大ＤＭＳＯ濃度は、細胞生存度に影響を及ぼさない（データは示さない）、０．１％とした。７２時間後、Ｓａｐｈｉｒｅ２プレートリーダーを使用して、細胞生存度を発光によって測定した。実験はトリプリケートで実施し、図６には、少なくとも３回の独立した実験についての平均および標準偏差を示す。表２には、３日後に残存する細胞の割合をＮＶＸ−４１２の濃度に応じて示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
要約すると、ＮＶＸ−４１２は、上述のようにいくつかの上皮細胞系の増殖を抑制し得るだけでなく、肉腫、黒色腫、およびＣＮＳ癌細胞系に対しても非常に有効であった。
【００３１】
薬物動態学
薬物動態実験では、懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の生物学的利用能がＮＶＸ−１４４と比べて向上したことが実証された。実験の詳細および結果を以下の実施例６に示す。薬物動態実験では、ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、０．９３〜１．１５時間の終末血漿半減期を有し、クリアランスが中等度の３８０６ｍＬ／ｈ／ｋｇ、分布容積が中等度の３９８５ｍＬ／ｋｇとなったことが示された。溶液または懸濁液として投与したときのＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の経口吸収は、どちらも中等度であった。ＮＶＸ−１４４の経口生物学的利用能は、懸濁液として経口投与後は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。ＮＶＸ−４１２の経口生物学的利用能は、懸濁液として経口投与後は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。すなわち、溶液として投与したとき、経口吸収ではＮＶＸ−４１２とＮＶＸ−１４４とに有意差はなかったが、懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の経口吸収がＮＶＸ−１４４遊離塩基より若干向上していた。
【００３２】
〈実施例６〉
ＮＶＸ−４１２およびＮＶＸ−１４４の薬物動態実験
用量調製
経口懸濁液製剤は、試験物を５％のＰＥＧ−２００／９５％のメチルセルロース０．５％溶液に懸濁させて調製した。試験物の濃度は、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の経口溶液製剤は、試験物を１０体積％のジメチルアセトアミド、続いて６０体積％のＰＥＧ−４００に溶解させ、次いで３０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を５０ｍＭの乳酸に溶かした溶液をゆっくりと加えて、残りの３０％の体積に充てることにより調製した。試験物の濃度は、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。ＮＶＸ−４１２のＩＶ製剤は、試験物を１０体積％のジメチルアセトアミド、続いて１０体積％のＰＥＧ−４００に溶解させ、次いで１０％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を５０ｍＭの乳酸に溶かした溶液をゆっくりと加えて、残りの８０％の体積に充てることにより調製した。試験物の濃度は、２．５ｍＬ／ｋｇの投与体積によって目的の投与量レベルが送達されるようなものとした。投与する用量は、投与のすぐ前に計測した各動物の体重に基づくものとした。製剤は、調製後直ちに使用した。
【００３３】
研究計画
合計１５匹のラットを研究に割り当てた。それぞれ３匹の雄ラットからなる５群によって研究を構成した。以下の表３に明細に記すとおり、各群を、経口経管栄養または尾静脈からの静脈内注射によって１回処置した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
試験物投与
動物を投与前に一晩絶食させ、投与の約２時間後に飼料を戻した。各動物の用量は、最新の体重に基づくものとした。経口用量を経管栄養によって投与した。動物には経口１回量あたり１０ｍＬ／ｋｇを与えた。静脈内用量を尾静脈注射によって投与した。各動物の用量は、最新の体重に基づくものとした。動物には静脈内１回量あたり２．５ｍＬ／ｋｇで投与した。
【００３６】
生存能観察
動物の生存能を、研究の間終始少なくとも朝１回晩１回観察した。
【００３７】
体重
すべての動物について、投与の直前に体重を測定した。
【００３８】
薬物動態サンプル
薬物動態分析用に、群１〜５の動物の血液を収集した。経口経路によって処置した各ラットから、４度の時点（投与後３０分、１時間、４時間、および８時間）で、約０．３ｍＬの血液を眼窩静脈叢からＥＤＴＡカリウム管に収集し、血液サンプルを処理にかけて、血漿を調製した。静脈内経路によって処置した各ラットからは、４度の時点（投与後５分、３０分、１時間、および２時間）で血液を収集し、血液サンプルを処理にかけて、血漿を調製した。動物をその最後のサンプル収集の後に（剖検せずに）処分した。
【００３９】
全血サンプルは、（約５℃にセットした）冷却遠心機にて最短で１０分間遠心分離した（約１５００×ｇ）。血液収集／遠心分離から３０分以内に、血漿を調製し、適切にラベルされた管に移した。次いで、管を凍結させ、分析するまで暗所にて−７０℃以下で保存した。血漿サンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析して、ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２の血漿濃度を求めた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１を用い、ノンコンパートメント解析を使用して、血漿濃度データの薬物動態分析を行った。
【００４０】
ＮＶＸ−４１２を５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した後、投与後０．０８３時間でピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は１８４２ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．０時間であり、平均ＡＵＣ（０〜∞）は１３１４ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は４８７ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は、１．４時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は１８２６ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。表４に、ＮＶＸ−４１２を静脈内投与後の個々の動物について（ｎｇ／ｍＬで）血漿濃度データを示す。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表５に、静脈内投与後のＮＶＸ−４１２について、算出された薬物動態パラメーターを示す。
【００４３】
【表５】
【００４４】
ＮＶＸ−４１２を懸濁液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後１時間でピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は５２５ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．２時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２３０７ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を溶液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は７１４ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．６時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２５２１ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。
【００４５】
ＮＶＸ−４１２を溶液として２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した後、投与後０．５時間〜１時間の間にピーク血漿濃度に到達し、平均濃度は６４３ｎｇ／ｍＬであった。終末血漿半減期は１．４時間と推定され、平均ＡＵＣ（０〜∞）は２２８９ｈ・ｎｇ／ｍＬであった。ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として経口投与後の生物学的利用能は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。ＮＶＸ−４１２を懸濁液として経口投与後の生物学的利用能は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。
【００４６】
表６に、ＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２を経口投与後の個々の動物について（ｎｇ／ｍＬで）血漿濃度データを示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
表７に、経口投与後のＮＶＸ−１４４およびＮＶＸ−４１２について、算出された薬物動態パラメーターを示す。
【００４９】
【表７】
【００５０】
図７Ａ〜７Ｏは、個々の各動物について、薬物動態データの片対数プロットを示すものである。
【００５１】
図８〜１２は、静脈内投与、懸濁液で経口投与、および溶液で経口投与したＮＶＸ−４１２およびＮＶＸ−１４４遊離塩基について、個別および平均の濃度−時間データの片対数プロットを示すものである。
【００５２】
すなわち、以下の事項が発見された。
● ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、終末血漿半減期が０．９３〜１．１５時間であった。
● ＮＶＸ−４１２は、ラットに静脈内投与したとき、クリアランスが中等度の３８０６ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ、分布容積が中等度の３９８５ｍＬ／ｋｇとなった。
● ＮＶＸ−１４４遊離塩基の経口吸収は、溶液または懸濁液として投与したとき、中等度であった。
● ＮＶＸ−４１２の経口吸収は、溶液または懸濁液として投与したとき、中等度であった。
● ＮＶＸ−１４４遊離塩基を懸濁液として経口投与後の経口生物学的利用能は平均して３４．７％であり、溶液として経口投与後は４６．１％であった。
● ＮＶＸ−４１２を懸濁液として経口投与後の経口生物学的利用能は平均して４３．９％であり、溶液として経口投与後は４３．５％であった。
● 溶液として投与したとき、経口吸収ではＮＶＸ−４１２とＮＶＸ−１４４遊離塩基とに有意差はなかった。
● 懸濁液として投与したとき、ＮＶＸ−４１２の経口吸収がＮＶＸ−１４４遊離塩基より若干向上していた。
【００５３】
こうして、Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との新規な共結晶、ＮＶＸ−４１２が発見された。この新規な化合物は、十分な生物学的利用能および癌細胞増殖抑制能を示した。
【００５４】
本発明の特定の実施形態について上で述べてきたが、そうした実施形態は、本発明を例示するものにすぎず、以下の特許請求の範囲に従って解釈される本発明を限定するとみなすべきでない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との共結晶を含む化合物。
【請求項２】
シュウ酸の溶液をＮ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドに加えることを含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【請求項３】
ヒトまたは動物における疾患の治療方法であって、請求項１に記載の化合物を前記ヒトまたは動物に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記疾患が癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、子宮頚癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、脳の癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、白血病、および肉腫からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を、前記疾患の治療に十分な量で投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を経口投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を非経口投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を局所投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物をヒトに投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物を動物に投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を含む医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬製剤を投与することを含む、疾患の治療方法。
【請求項１４】
前記疾患が癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物を含む、疾患の治療に適する医薬品賦形剤。
【請求項１６】
前記疾患が癌である、請求項１５に記載の医薬品賦形剤。
【請求項１】
Ｎ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドのシュウ酸との共結晶を含む化合物。
【請求項２】
シュウ酸の溶液をＮ’−（７−フルオロピロロ［１，２ａ］キノキサリン−４−イル）ピラジン−２−カルボヒドラジドに加えることを含む、請求項１に記載の化合物の調製方法。
【請求項３】
ヒトまたは動物における疾患の治療方法であって、請求項１に記載の化合物を前記ヒトまたは動物に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記疾患が癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、子宮頚癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、脳の癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、白血病、および肉腫からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物を、前記疾患の治療に十分な量で投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を経口投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を非経口投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を局所投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物をヒトに投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物を動物に投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を含む医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬製剤を投与することを含む、疾患の治療方法。
【請求項１４】
前記疾患が癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物を含む、疾患の治療に適する医薬品賦形剤。
【請求項１６】
前記疾患が癌である、請求項１５に記載の医薬品賦形剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図７Ｌ】
【図７Ｍ】
【図７Ｎ】
【図７Ｏ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図７Ｉ】
【図７Ｊ】
【図７Ｋ】
【図７Ｌ】
【図７Ｍ】
【図７Ｎ】
【図７Ｏ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５１６５６７（Ｐ２０１１−５１６５６７Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４１５８（Ｐ２０１１−５０４１５８）
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９９６１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２６７４３
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０２６７９９３）ノベリックス ファーマシューティカルズ、 インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月８日（２００９．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３９９６１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２６７４３
【国際公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【出願人】（５１０２６７９９３）ノベリックス ファーマシューティカルズ、 インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
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