癌性疾患修飾抗体
本発明は、スクリーニングの新規パラダイムを使用して、患者の癌性疾患修飾抗体を産生する方法に関する。本プロセスは、エンドポイントとして癌細胞への細胞傷害を使用して、抗癌抗体を分離することによって、治療目的および診断目的のための抗癌抗体の産生を可能にする。抗体は、癌の病期分類および診断の補助において使用でき、原発腫瘍および腫瘍転移を治療するために使用できる。抗癌抗体は、毒素、酵素、放射性化合物および造血細胞にコンジュゲートできる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および産生、ならびに任意で１つまたは複数の化学療法剤との組合せでの、治療および診断のプロセスにおけるこれらのＣＤＭＡＢの使用に関する。本発明は、さらに本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌におけるＣＤ６３：ＣＤ６３には現在３０のメンバーがあり、４つの膜貫通領域の存在によって特徴づけられるテトラスパニンファミリーのタイプＩＩＩ膜タンパク質である。いくつかのグループが、活性化血小板、顆粒球およびメラノーマ細胞の全細胞調製品に対して作製された抗体を使用して、独立してＣＤ６３を同定した。それらの同族の糖タンパク質抗原のそれぞれのｃＤＮＡのクローニングにより、異なる抗原が同一の分子であったという認識が導かれた。白血球分類に関する第６回国際ワークショップ（Ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ）（１９９６）は、その後にＣＤ６３抗体としてこれらの抗体を分類した。１９９６年のワークショップ以前には、ＣＤ６３は、複数の名称（メラノーマ１抗原、眼メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リゾソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィジン（ｇｒａｎｕｌｏｐｈｙｓｉｎ）、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１）により公知であり、時には部分的な特性評価および識別へ結びつく抗体に関連していた。したがって、ＣＤ６３は、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ ＭＥ４９１）、神経分泌腺（ｎｅｕｒｏｇｌａｎｄｕｌａｒ）抗原（ＭＡｂ ＬＳ５９、ＭＡｂ ＬＳ６２、ＭＡｂ ＬＳ７６、ＭＡｂ ＬＳ１１３、ＭＡｂ ＬＳ１４０およびＭＡｂ ＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂ Ｈ５Ｃ６、ＭＡｂ Ｈ４Ｆ８およびＭＡｂ Ｈ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ １２Ｆ１２）、骨前駆細胞特異的マーカー（ＭＡｂ ＨＯＰ−２６）およびインテグリン関連タンパク質（ＭＡｂ ６Ｈ１）とも呼ばれた。ヒトＣＤ６３と交差反応することが見出された他の抗体は、８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１との交差反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３およびＮＫＩ／ブラック−１３であった（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３５（３）：２８７-９５ （１９８５）； Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ ａｎｄ Ｒｕｍｋｅ， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２３（２）：９３-１００ （１９８６）； Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８４（６）：４２２-９ （１９９２）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １１０（３）：３９９-４０４ （１９９２））。免疫親和性により精製されたＮＫＩ／Ｃ３抗原に対して作製されたウサギポリクローナル抗体ＲａＣ３による研究から、見かけ上の分子量が２０ｋＤａ付近でありＮ結合型炭水化物によって高度に翻訳後修飾されたコアポリペプチドとして、標的タンパク質が明らかにされた（Ｇｒｕｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４９（２）：４５９-６５（１９８９））。
【０００３】
ＣＤ６３は、ＭＡｂ ＭＥ４９１（ＳＫＭｅｌ２３ヒト皮膚メラノーマ細胞株調製品に対して作製され、メラノーマ細胞への結合でスクリーニングされた多数の抗体の１つ）を使用して、メラノーマｃＤＮＡライブラリーから最初にクローニングされた。１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ標識メラノーマ細胞からの免疫沈降により、細胞表面に３０〜６０ｋＤａタンパク質が存在することが示された。この抗体により認識される抗原は、翻訳後に非常に修飾されるタンパク質であることが示された。免疫組織化学によって、抗体は、正常に見える周囲の細胞ではなく腫瘍組織中のメラノーマ細胞を認識することが見出され、したがってこの抗体が腫瘍特異抗原決定基を認識する可能性を示唆した（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４， ２４３-２５５ （１９８４））。この抗体は、８７％のぶどう膜メラノーマ症例中のメラノーマ細胞、およびぶどう膜メラノーマが存在する８６％の症例中の気球細胞もまた染色した。この研究において、正常な眼組織の染色は可変的であり、正常な症例の少数でのみ、および形態学的に正常なメラノサイトでまれに陽性であった（Ｆｏｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０３（２）：２７５-９ （１９８５））。別の実験において、さらにＳＫＭｅｌ２３細胞株に対して作製されたモノクローナル抗体ＭＡｂ６−Ｆ１、ＭＡｂ８−１ＨおよびＭＡｂ８−２Ａは、同一の抗原を認識し、ＭＡｂ ＭＥ４９１により得られたものに非常に類似する免疫組織化学的染色パターンをあらわすことが示された。さらにこれらの抗体は、原発性脈絡膜メラノーマを有する患者において、肝臓転移性腫瘍組織を染色したが、正常な肝細胞を染色しなかった。ヒトメラノーマ生検の別の研究において、ＭＡｂ ＭＥ４９１の反応性はメラノーマ進行と逆相関しているようであることが示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、正常なメラノサイトにおいて低く、メラノーマ進行の初期においてより高く（異形成母斑および水平増殖期（ＲＧＰ）腫瘍）、ならびに垂直増殖期（ＶＧＰ）のメラノーマ腫瘍などのさらに進行したメラノーマ腫瘍および転移性腫瘍において減少または存在しない。原発性ヒトぶどう膜メラノーマ細胞に対して作製された別のモノクローナル抗体（ＭＡｂ ４Ａ３）は、これらの細胞中に存在する抗原を特異的に認識することが見出され、健常人からのリンパ球への結合はバックグラウンドレベルのみであることが示された。この抗体によって検出される１つまたは複数の抗原は、メラノーマ組織のウェスタンイムノブロットにより、およその見かけ上の分子量が５５ｋＤａのダブレットであり、この抗体によって認識される抗原は、抗ＣＤ６３としてクラスターに分けされた抗体によって認識された抗原と同一でなかったことを示唆する（Ｄａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２７（９）： １３６２-７ （１９８６））。
【０００４】
ＣＤ６３は、トロンビン活性化血小板に対して作製されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ２．２８、ＭＡｂ２．１９、ＭＡｂ５．１５およびＭＡｂ５ｄ１０）を使用して、ヒト血小板においても見出され、部分的に特性を評価された。トロンビン活性化に際しての結合部位数の増加（１０倍以上）によって示されるように、これらの抗体は活性化依存性血小板膜５３ｋＤａ糖タンパク質を検出した。競合分析において、これらの抗体は結合を互いにブロックし、それらが同一のまたは空間的に近い抗原決定基を認識することを示唆する。血小板凝集実験からの結果から、これらの抗体がそれ自体で血小板凝集を引き起こさないこと、またアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンビン、コラーゲン、リストセチンおよびエピネフリンによって誘導される凝集を妨害しないことが明らかにされた。電子顕微鏡データーは、これらの抗体が静止血小板においてリゾソーム膜に局在する抗原を認識することを示唆した。免疫組織化学データーは、これらの抗体が脾臓、リンパ節、胸腺の限定された領域中に、および内皮細胞に存在する抗原を認識することを示した。別の研究において、ＭＡｂ ２．２８は、さらに静止血小板中の、ならびに巨核球および内皮細胞中の内部顆粒を標識し、後者の２つでは、その標識はリソソームのコンパートメントの既知のマーカーである酵素カテプシンＤの抗体と共局在した。抗体クラスタリングおよび発現クローニングによる続報研究から、この抗体によりＣＤ６３として認識される抗原の同定が導かれ、この抗原がリソソームのコンパートメント中に存在し、コンパートメント特異的マーカーＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２と共局在することがさらに確認された。この分子のクローニングにより、この分子をＣＤ６３として同定し、テトラスパニンファミリー中に含めた。
【０００５】
ＣＤ６３の発現は様々な組織および細胞タイプで検出された。細胞レベルでは、細胞膜およびさらに細胞内後期エンドソーム小胞構造に結合することが見出された。細胞活性化は、特定の場合に、ＣＤ６３の細胞内貯蔵の移動による表面発現の増加を導いた。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球中で（特にエンドソーム中で、表面へのＭＨＣクラスＩＩ複合体の輸送に関わるエキソソーム中で、および分泌小胞中で）ＭＨＣクラスＩＩと共局在し、これと物理的に結合することもまた見出された。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、好中球、乳癌およびメラノーマ細胞を含む、様々な細胞タイプにおいて、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，Ｘ）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）およびＣＤ２９（インテグリン鎖β１）などのテトラスパニンファミリーの他のメンバーと相互作用することが見出された。
【０００６】
癌におけるＣＤ６３の役割は明らかではなかった。ＣＤ６３は、血小板および顆粒球活性化、ＭＨＣクラスＩＩ依存性抗原提示、インテグリン依存性細胞接着および運動性、ならびに特定のタイプの癌における腫瘍進行などの多様な事象に関与することがいくつかの独立したグループによって最初に見出されたが、その機能はさらに完全に解明されなければならない。たとえ現在ある証拠が様々な細胞生理学的事象におけるＣＤ６３の役割を支持しても、これらの機能が互いから独立しているかどうか、またはＣＤ６３が関与する内在する一般的な細胞メカニズムがあるかどうかは明らかではない。
【０００７】
いくつかのグループは、ＣＤ６３と特定のタイプの腫瘍（特にメラノーマ）の進行との間の関連を研究してきた。Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体が、様々な進行病期での腫瘍を有する患者から得られる癌サンプルの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために開発された。腫瘍の進行および転移特性と染色の低下（ＣＤ６３の発現低下を反映する可能性が最も高いと著者によって解釈された）が関連することが観察された。より最近の研究により、ＣＤ６３を含むテトラスパニンタンパク質ファミリーのうちのいくつかのメンバーの発現レベルの明らかな低下（ｍＲＮＡ定量化後）といくつかの乳癌由来細胞株のインビトロの浸潤性との間での有意な相関性についてもまた記述された。別の研究は、エストロゲン枯渇を行なった培養乳癌細胞において、ディファレンシャルディスプレイによりＣＤ６３を同定した。このことは、ＣＤ６３発現がステロイドホルモンにより調節可能であり、ＣＤ６３の存在量および／または機能の変化もまた乳房腫瘍の進行に関連するかもしれないことを示した。
【０００８】
これとは対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ＦＣ−５．０１による研究から、この抗体に反応するエピトープは異なる正常組織で可変的に発現されるこが明らかにされた。この抗体はＣＤ６３を認識するが、初期メラノーマと進行期メラノーマ（転移性メラノーマを含む）を区別しないことが見出され（ＭＡｂ ＭＥ４９１とは異なり）、このことは、ＣＤ６３抗原はより進行した腫瘍中に存在するが、そのエピトープのいくつかは異なる病期の腫瘍からの細胞中ではマスクされているかもしれないことを示唆した。これは、ＣＤ６３コアポリペプチドの翻訳後修飾の変化、または他の分子とのＣＤ６３の相互作用のためであり、抗体の認識および結合のための特異的エピトープの利用可能性に影響するかもしれない。これらの結果は、原発性、水平増殖期、垂直増殖期および転移性のメラノーマなどの進行の異なる病期の組織切片の間での、抗ＣＤ６３のＭＡｂ ＮＫＩ−Ｃ３による染色がメラノーマを区別しなかったという、Ｓｉ ａｎｄ Ｈｅｒｓｅｙ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５４（１）：３７-４３ （１９９３）により記述された観察を支持した。他の研究（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６（４）： １３９７-４０６ （１９９８）； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５３（３）：９７３-８３ （１９９８））において、２つのテトラスパニンファミリーメンバー（ＣＤ９およびＣＤ８２）については、それらの発現レベルと腫瘍進行および患者予後との間に有意な相関性があることが、乳癌および非小細胞肺癌からの定量的ＰＣＲによるｍＲＮＡ分析により明らかにされたが、ＣＤ６３については、すべてのサンプルにおいてＣＤ６３の発現が同様であったのでそのような相関性は見出されなかった。これらの明らかに矛盾する結果を受けて、癌とＣＤ６３の関連を明確に示す強固で矛盾しないデーターが欠如している。
【０００９】
現在までに、ＣＤ６３と結果として生ずるこの分子の腫瘍抑制因子機能との間のつながりの立証を試みたインビボの研究は少数ない。これらの研究の１つにおいて、ＣＤ６３を過剰発現するヒトＨ−ｒａｓにより形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３株細胞は、無胸腺マウスへ皮下注射および腹腔内注射され、ＣＤ６３を過剰発現しない親細胞の挙動と比較した場合、生存期間の増加に加えて、腫瘍サイズおよび転移能力の低下によっても示されるように、悪性／腫瘍形成性表現型の低下を示した。このことから、形質転換細胞中のヒトＣＤ６３の存在が、それらの細胞の悪性挙動を抑制するかもしれないことが示唆された。最近では、ヒトＣＤ６３を発現し、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するように発生させたトランスジェニックマウスモデルによる研究から、ワクシニアウイルスに融合したヒトＣＤ６３による免疫に際して、注入されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）を共トランスフェクションしたマウスメラノーマ細胞株の腫瘍増殖が阻害され、生存を増加させることができるかもしれないことが示された。動物がＣＤ６３のみでトランスフェクションされた細胞株ではなく、ＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩで共トランスフェクションされた細胞を注射した場合でのみ、腫瘍増殖の阻害が起こったので、治療上の効果がＴリンパ球依存性であり、内在性の抗ＣＤ６３抗体がこの防護効果に関与するようではないことが、著者によって示唆された。この解釈は、精製ヒトＣＤ６３で前免疫され、抗ヒトＣＤ６３抗体が生じたことが示される野生型動物において、癌細胞増殖に対する防護効果がないという事実によって支持された。ヒトＣＤ６３によりトランスフェクションされたＫＭ３細胞株（最初はヒト起源であると考えられたが、後にラット系列であると特徴づけられた）を使用する、Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２（５）：６３１-５ （１９９５）によって記述された研究から、このタンパク質の発現は、無胸腺マウスに皮内注射した場合、非トランスフェクションの親ＫＭ３細胞を使用して観察されたものと比較して、これらの細胞の増殖および転移の能力を低下させるが、様々なトランスフェクション細胞株と非トランスフェクション細胞株の間のインビトロ増殖率には有意差がないということが示唆された。これらの観察は、腫瘍細胞のインビボ増殖率およびインビトロ増殖率の両方に影響することが公知である他の癌抑制遺伝子の効果から、ＣＤ６３の可能性のある効果を区別した。更に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（インビトロの分析においてランダムな運動性を低下させることで、同じ細胞に対する機能的効果を有することが見出された（Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８（７）：３３５３-８ （１９９７）））の追加は、それらのインビトロ増殖率に影響を与えなかった。
【００１０】
この研究は、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する化学誘引物質に反応してＣＤ６３が移動を促進し、インテグリンの抗体はこれらの効果をブロックすることができないが、この効果はβ１−タイプのインテグリンの機能的関与によって仲介されるという観察についてもまた記述した。しかしながら、ビトロネクチン（インテグリンαＶβ５に対する既知のリガンド）を介したシグナリングの役割と、ＣＤ６３をトランスフェクションした細胞上のフィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンなどの他のＥＣＭ構成要素によって仲介されるシグナリングの役割との間に拮抗作用があると思われた。このことは、特異的な条件下で（ＥＣＭ構成要素の存在下において）、ＣＤ６３の発現は移動の低下を導き、これは接着と運動性との間の微細なバランスに依存するだろうことを示唆した。別の研究において、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ７１０Ｆ）はＰＭＡ処理したＨＬ−６０細胞の接着および伸展を促進し、一方別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ２．２８）は同様の効果を促進したが、これは細胞集団の非常に少量の画分に対してのみ、また非常に多量に加えられた場合でのみ起こった。これらの結果は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されているがそれらの機能効果がかなり異なることを示した。
【００１１】
テトラスパニンは細胞増殖にも関与する。Ｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０（８）：４００７-１５ （１９９０）は、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）を認識するマウスＭＡｂ ５Ａ６のリンパ腫細胞株に対する抗増殖効果について記述した。別の研究において、Ｔリンパ球における抗体とのヒトＣＤ３７のライゲーションは、ＣＤ３７誘導性増殖をブロックした。より最近では、ＣＤ３７の発現が欠損した動物モデル（ＣＤ３７ノックアウト）による研究から、この動物からのＴリンパ球は、野生型動物からのＴリンパ球と比較して、コンカナバリンＡ活性化およびＣＤ３／Ｔ細胞受容体連結に反応して過剰増殖性であることが明らかにされた。したがって、細胞成長および増殖における機能的役割がテトラスパニンファミリーの一般的な特徴であることが提案された。肝芽腫および肝細胞癌の細胞による最近の研究から、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体とこれらの細胞の連結によりＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が導かれることが明らかにされた。このシグナル伝達経路は、細胞成長および増殖事象に関連することが示されている。平行研究において、ヒトＣＤ８１を過剰発現するトランスフェクション細胞株は、モックトランスフェクションされた対照細胞と比較して、増殖の増加を示した。したがって、利用可能な証拠から、細胞成長増殖および細胞接着／運動性に関連した事象における一般的なテトラスパニンの役割、および特にＣＤ６３の役割が指摘された。これらの２つのタイプの細胞の事象は、両方が腫瘍の進行および転移に中心的な役割を果たすので、現在これを標的として熱心に研究されている。
【００１２】
アミノ酸配列の決定および分析からは、テトラスパニンと他のタンパク質ファミリーとの間の相同性、または以前に特性を評価された任意の機能モジュールとの相同性は示されず、また以前から既知の任意の酵素の活性は示唆されなかった。その結果、シグナル伝達経路の調節におけるこのタンパク質ファミリーの役割を調べることは非常に困難であった。しかしながら、細胞生理における変化を導き、シグナル伝達経路の調節に密接に依存する、テトラスパニン特異的試薬を使用して得られた証拠から、テトラスパニンがシグナル伝達特性を有することが示唆される。ＣＤ６３は、それら自体が二次伝達シグナルの生成に関与する酵素であるか、またはそのような酵素と物理的および／または機能的に結合する多数の分子と、物理的および機能的の両方で結合することが示された。
【００１３】
内皮細胞とヒト好中球の相互作用（それらは炎症反応の最初のステップの１つである）を制御するメカニズムを細かに調べるためにデザインされた実験から、いくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３およびＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理は、培養内皮細胞層への好中球の接着を促進することが明らかにされた。更に、この効果はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）（多くの細胞内シグナル伝達経路の周知のモジュレーター）の存在に強く依存し、それは細胞が刺激抗体へ暴露される特定の期間に限定された。より長い抗体への暴露後には、内皮細胞への好中球の接着はＣａ２＋の後の追加に対して非感受性となり、したがって動的かつ一時的に調節された（一過性）事象に関係する。さらに、ＣＤ６３は、ＣＤ１１／ＣＤ１８タンパク質複合体と物理的に相互作用することが見出され、この複合体を特異的に標的とする試薬は修飾シグナルを仲介した。この研究において、ＣＤ６３は、酵素チロシンキナーゼＬｃｋおよびＨｃｋを含む複合体と物理的に結合するか、またはその一部であることもまた見出された。これらの酵素は、特異的な表面受容体の活性化に際して細胞内調節シグナルの仲介において中心的な役割を果たすタンパク質クラスのメンバーであり、細胞特異的な生理学的変化をもたらすシグナル伝達経路のカスケードの一部である。別の研究は、モノクローナル抗体とテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の共ライゲーションが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のコラーゲン基質への接着により誘導される酵素である接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化または活性を促進することを示唆した。このことは、インテグリンを介したチロシンキナーゼシグナル伝達経路の調節において、ＣＤ６３の（および他のテトラスパニンファミリーメンバーの）直接的な関与を示した。表面のＣＤ６３の存在および抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ７１０Ｆによるライゲーションと機能的に交差する他のシグナル伝達経路は、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（細胞内シグナル伝達経路の別の周知のモジュレーター）によるリン酸化の調節に依存するものであると思われる。この情況において、ＰＫＣの一時的な関与は決定的に示されなかったが、ＭＡｂ ７１０Ｆによる骨髄細胞株ＨＬ−６０における接着促進および形態変化は、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による細胞の前処理に依存した。しかしながら、独立したグループによる後の研究から、分子Ｒｏ３１−８２２０（この酵素の特異的阻害剤）がＰＭＡの効果をブロックしたので、ＰＭＡに誘導されたＨＬ−６０の分化がＰＫＣ活性依存性であることが実証された。
【００１４】
シグナル伝達経路と、ＣＤ６３および他のテトラスパニンファミリーメンバーの結合を支持するさらなる証拠は、チロシンホスファターゼ活性を備えたＣＤ６３（およびＣＤ５３も）分子の超分子複合体との間の直接的な物理的結合、またはその複合体の一部としての物理的結合のいずれかについて記述した研究から生じた。この研究において、抗ＣＤ６３抗体により単離された免疫沈降複合体はチロシンホスファターゼ活性に関連することが示されたが、ＣＤ５３（チロシンホスファターゼＣＤ４５と結合することが示された）と異なり、ＣＤ６３結合ホスファターゼを同定することは可能でなかった。より最近では、テトラスパニンファミリーのいくつかのメンバーは、ＩＩ型フォスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型ＰＩ４−Ｋ）とも結合することが見出された（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（５）：２５９５-８ （１９９７））。この相互作用は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１およびＡ１５／ＴＡＬＬＡについてのみ同定され、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２で起こることは観察されなかったので、非常に特異的であると思われた。さらに、各ＰＩ−４キナーゼ含有複合体は単一のテトラスパニンファミリーメンバーに限定的だったので、テトラスパニンファミリーメンバーとＰＩ−４Ｋとの間の結合は相互に排他的であった。特にＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、他のテトラスパニンメンバーにより形成された複合体とは異なり、脂質ラフト様ドメインの細胞内区画にほとんど完全に見出された。この観察は、ＰＩ−４キナーゼと相互作用することが見出されている、このＣＤ６３画分が、二次メッセンジャー分子としてのそれらの機能（Ｍａｒｔｉｎ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １４：２３１-６４ （１９９８））に加えて、フォスフォイノシチド生合成経路（膜輸送（エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス）、および細胞骨格再構成の調節におけるそれらの関与については周知である）に関連または依存する特異的な細胞内事象（Ｃｌａａｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（１１）：７９７４-８４ （２００１））に関与することを示唆した。
【００１５】
シグナル伝達経路の調節におけるすべての酵素（ＣＤ６３が直接結合することが今までに見出された）の直接的で重要な関与は、これらの酵素活性から下流の調節因子としてまたはエフェクター分子としての、ＣＤ６３とシグナル伝達経路の調節の関連性を支持するさらなる証拠を提供した。
【００１６】
腫瘍進行を導くメカニズムの解明は、しばしば明らかに矛盾する観察により示される非常に困難で複雑な試みであり、その結果、それらの観察が効果的な治療法にうまく変換されることはまれである。腫瘍の進行および転移ならびにシグナル伝達メカニズムとＣＤ６３の関連について現在公知であることを考慮して、その機能が腫瘍細胞において変化することはありえる。
【００１７】
認識抗原を発現する細胞を結合しそれ自体で腫瘍細胞に対する細胞傷害効果を備えた抗原特異的試薬、または他の分子を結合させた腫瘍細胞に対する細胞傷害効果を備えた抗原特異的試薬は、正常細胞集団に対する著しい有害効果なしに、癌細胞増殖および進行および転移を阻害するような細胞およびインビボの生理活性を有しており、これらの試薬の開発は可能な治療および／または診断ツールとして非常に有用だろう。
【００１８】
最近では、新しいデーターから正常細胞生理の調節におけるＣＤ６３の重要な作用様式が示され、改変された場合には、癌を含む病的な条件下での細胞挙動に重要な効果を有することが示されている。
【００１９】
乳癌細胞においてＣＤ６３の内部移行を引き起こすことが公知であるＭＡｂ抗体Ｆｃ−５．０１を、ヒト樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ６３の表面発現および内部移行のレベルを決定するために使用した（Ｍａｎｔｅｚａｚｚａ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｌｏｏｄ １０４（４）：１１８３-９０ （２００４））。ＣＤ６３は、エンドソームおよびリソソームのマーカーと一緒に共局在して、細胞表面および細胞内の両方に局在することが見出された。完全な形の抗体およびそのＦａｂフラグメントは、ＣＤ６３の内部移行を誘導することができた。同時に、Ｆｃ−５． ０１により促進されるＣＤ６３の内部移行は、β３またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現ではなく、いくつかのインテグリン分子、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ２９およびα５の表面発現低下をもたらした。走化性分析からの結果は、この抗体、およびタンパク質のテトラスパニンファミリーの他のメンバーを認識する他の抗体が、化学誘引物質に向かって膜バリアーを横切って移動した細胞数の増加を引き起こすことを明らかにした。これらの細胞（未成熟ＤＣ）において、酵母ファゴサイトーシス（それはβ１，３−グリカン受容体によって仲介される）には、テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ８１およびＣＤ８２またＨＬＡ−ＩＩ分子のレベルではなく、細胞表面ＣＤ６３のレベルの減少が付随した。一方、デキストランＦＩＴＣによって誘導される内部移行（それはマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）によって仲介される）は、ＣＤ６３表面発現の低下またはＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＨＬＡ−ＩおよびＨＬＡ−ＩＩ分子の発現低下をもたらさなかった。したがってβ１，３−グリカン受容体のデクチン−１の場合のように、ＣＤ６３は特異的受容体に時には物理的に結合し、内部移行イベントに参加するように思われる。いくつかのインテグリン分子の表面発現がＣＤ６３の抗体誘導性内部移行に際して低下するという事実は、そのようなＣＤ６３依存性事象が細胞表面受容体構成に有意な影響を及ぼすことができ、したがってＤＣ移動分析に対する効果によって示されるようなそのような細胞集団の生理に影響を及ぼすことができることもまた示唆する。
【００２０】
別の研究において、膜結合型メタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）の内部移行はＣＤ６３によって影響されることが見出された。この研究において、ＦＬＡＧタグ付加ＭＴ１−ＭＭＰは内部移行し、細胞表面レベルの減少が同時に起こる拡散した細胞質分布が得られた。クロルキン（ｃｈｌｏｒｑｕｉｎｅ）（既知のリソソームプロテイアーゼ（ｐｒｏｔｅｉａｓｅ）阻害剤）の追加は、細胞表面ＭＴ１−ＭＭＰのこの内部移行依存的消失を部分的に阻害し、同時に、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＤ６３陽性内部顆粒型構造への結合を維持するような方法で内部移行依存性の細胞質分布を変化させた。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＣＤ６３による細胞の共トランスフェクションはこのメタロプロテアーゼの細胞表面レベルの減少をもたらし、これらの分子の阻害剤（ＢＢ９４）がこの減少に対していかなる効果を持たないが、クロルキンは持っていたので、この減少はＭＭＰ活性の全体的なレベルに依存しなかった。この観察は、ＣＤ６３発現の増加がＭＴ１−ＭＭＰのターンオーバー／内部移行／分解を促進できることを示唆した。ＭＴ１−ＭＭＰの内部移行／分解の増加は、ＭＴ１−ＭＭＰとＣＤ６３との間の直接的な相互作用に依存した。このタイプの機能は、ＣＤ６３がアダプタータンパク質ＡＰ−２およびＡＰ−３のμ２およびμ３のサブウンビッツ（ｓｕｂｕｎｂｉｔｓ）と直接それぞれ相互作用し、エンドソームおよびリゾソームへのタンパク質選別に関与するという以前の観察によってさらに支持された。ＭＴ１−ＭＭＰの細胞質尾部がこの分子の内部移行のために重要であり、この事象は浸潤促進活性の調節において重要な役割を果たすこともまた以前に示された。ＭＴ１−ＭＭＰは悪性腫瘍細胞の浸潤においてもまた重要な役割を果たすと考えられる。したがって、ＭＴ１−ＭＭＰの全体的なレベルの調節は、ＣＤ６３との結合による相互作用および内部移行に依存しうる。
【００２１】
別の最近の出版（Ｘｕ ｅｔ ａｈ， Ｅｍｂｏ J２３（４）：８１ １-２２ （２００４））において、網膜変性に関与するショウジョウバエの眼に豊富な遺伝子についての遺伝学的スクリーニングにより、多数の遺伝子の中から「サングラス」（「ｓｕｎ」）と名付けられたテトラスパニン様分子が同定された。最も近縁の関連した哺乳類タンパク質はテトラスパニンＣＤ６３であった。そしてＣＤ６３への類似性で、免疫電子顕微鏡法により示唆されるように、「ｓｕｎ」はリゾソーム中に濃縮されることが見出された。この研究からの結果は、「ｓｕｎ」がＲｈ１シグナリングの正常なダウンレギュレーションに関与し、他のＧタンパク質共役型受容体に典型的なアレスチンが仲介するメカニズムから独立していることを示唆した。さらに、「ｓｕｎ」は活性化Ｒｈ１の通常のターンオーバーにおいて重要なだけではなく、およびこの事象に恐らく依存して、感桿分体の構造の維持において有意な効果もまた有しており、変異ハエにおける劇的なｓｕｎ依存性網膜変性をもたらす。これらのデーターはともに、タンパク質の正常輸送依存性ターンオーバーに哺乳類ＣＤ６３のこのホモログを密接に結び付け、その発現／機能における異常は生理学的異常をもたらす。
【００２２】
受容体内部移行におけるＣＤ６３の役割についての別の出版は、両方の分子で共トランスフェクションされたＣＯＳ細胞中で、このテトラスパニンと胃イオンポンプＨ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのβ−サブユニットの共局在することについて記述した。この研究において、Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼβ−サブユニットの内部移行およびリゾソーム様細胞質顆粒状構造への局在がＣＤ６３発現依存性促進を受けることもまた見出された。
【００２３】
上で記述された研究からのすべてのデーターは、ＣＤ６３もまた、それらの内部移行およびリソソーム依存の分解に参加すること、したがって正常細胞生理の制御に参加することによって、細胞表面分子の正常なターンオーバーに関与していることを示唆した。したがって、ＣＤ６３のこの機能の操作が、癌などの病的状態において表面の発現または機能が改変または異常な細胞挙動に寄与する特異的分子または分子群の活性に依存する事象を制御する重要なツールとなることは可能である。
【００２４】
最近まで、抗ＣＤ６３の抗体、またはＣＤ６３発現細胞を特異的に標的とした他の試薬が、腫瘍細胞のインビトロおよびインビボの増殖特性に対して、およびさらに腫瘍増殖の動物モデルの生存に対して、同時効果を有することは報告されていない。公開された米国特許出願第１０／８１０，７５１号は、ヒト癌細胞に対するインビトロおよびインビボの有効性を示す、２つのそのような抗ＣＤ６３抗体を開示する。
【００２５】
癌治療法としてのモノクローナル抗体：癌を持つ各個人は特有であり、その個人同一性と同様に、他の癌とは異なる癌に罹患している。にもかかわらず、現在の療法は、同じ病期の同じタイプの癌に罹患するすべての患者を、同じ方法で治療する。これらの患者の少なくとも３０％は第一選択療法に失敗し、したがって治療のさらなる繰り返し、ならびに治療の失敗、転移および最終的には死の可能性の増加へ結びつくだろう。治療に対する優れたアプローチは、特定の個人のために治療法をカスタム化することであろう。カスタム化に適している唯一の現在の療法は手術である。化学療法および放射線処理は患者に対して特別あつらえにはできず、手術単独は、ほとんどの場合には、治癒をもたらすには不適切である。
【００２６】
モノクローナル抗体の出現により、各抗体は単一のエピトープに向けることができるので、カスタム化療法のための方法の開発の可能性はより現実的になった。更に、特異的に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの立体配座に向けられる抗体の組合せを生ずることは可能である。
【００２７】
癌細胞と正常細胞との間の有意差が、癌細胞が形質転換細胞に特異的な抗原を含むとことであると認識されており、科学界では、モノクローナル抗体はこれらの癌抗原に特異的に結合することによって形質転換細胞を特異的に標的とするようにデザインできると長年考えられ、したがって癌細胞を除去する「特効薬」としてモノクローナル抗体が貢献できるという確信を生ずる。しかしながら、単一のモノクローナル抗体は癌のすべての実例において役に立つことができず、モノクローナル抗体が、クラスとしての標的化された癌治療として展開させることができることは今や広く認識される。開示された本発明の教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば全身腫瘍組織量を減少させることによって、患者に対して有益な方法で癌性疾患プロセスを修飾することが示されており、本明細書において癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体と様々に呼ばれるだろう。
【００２８】
現在では、癌患者は、通常少数の治療の選択肢しか持っていない。癌治療法に対する統制されたアプローチにより、生存率および罹患率の世界的な改善がもたらされた。しかしながら、特定の個人にとっては、これらの統計的な改善は必ずしも個人的状況の改善と相関しない。
【００２９】
したがって、実施者が同じコホート中の他の患者から独立して各腫瘍を治療することを可能にする方法が提出されたならば、これは、ただその１人に対する治療法を特別あつらえにするユニークなアプローチを可能にするだろう。治療法のそのような過程は、理想的には、治癒率を増加させてよりよい転帰を生じ、その結果として長年にわたる必要性を満たす。
【００３０】
歴史的には、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の治療の限定的な成功で使用されている。リンパ腫および白血病はヒト血漿により治療されたが、長期の寛解または奏効はほとんどなかった。更に、再現性は欠如しており、化学療法と比較して追加の利益はなかった。乳癌、メラノーマおよび腎細胞癌などの固形腫瘍もまた、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿およびウマ血清により治療され、同様に予測不能および効果がない結果であった。
【００３１】
固形腫瘍のためのモノクローナル抗体について多くの臨床試験が行なわれた。１９８０年代には、特異的な抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を使用するヒト乳癌についての少なくとも４つの臨床試験が行なわれ、その臨床試験は少なくとも４７人の患者からただ１人の奏効した患者を生じた。シスプラチンとの組合せでヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））を使用する成功した臨床試験は１９９８年までなかった。この試験において、３７人の患者の奏効について評価され、そのうちの約４分の１には部分奏効率があり別の４分の１にはわずかなまたは安定した疾患進行があった。奏効患者の中での進行までの期間の中央値は８．４か月であり、奏効持続期間の中央値は５．３か月であった。
【００３２】
ハーセプチン（登録商標）はタキソール（登録商標）との組合せにおいて第一選択使用のために１９９８年に承認された。臨床試験結果から、タキソール（登録商標）単独（３．０か月）を投与された群と比較して、抗体療法プラスタキソール（登録商標）（６．９か月）を投与された患者についての疾患進行までの期間の中央値が増加することが示された。生存の中央値もまたわずかに増加し、ハーセプチン（登録商標）プラスタキソール（登録商標）治療群ｖｓタキソール（登録商標）単独治療群については２２か月ｖｓ１８か月であった。さらに、抗体プラスタキソール（登録商標）組合せ群において、タキソール（登録商標）単独に比較して、完全に奏効した患者（８％ｖｓ２％）および部分的に奏効した患者（３４％ｖｓ１５％）の数は増加した。しかしながら、ハーセプチン（登録商標）とタキソール（登録商標）による治療は、タキソール（登録商標）治療単独と比較して、心臓毒性の発生率はより高かった（それぞれ１３％ｖｓ１％）。さらに、ハーセプチン（登録商標）治療法は、ヒト表皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）（現在のところ既知の機能または生物学的に重要なリガンドがない受容体）を過剰発現する患者（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって決定された）、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５％にのみ効果的であった。したがって、乳癌患者についての満たされていないニーズがまだ多くある。ハーセプチン（登録商標）治療が役立つ患者でさえまだ化学療法を必要とし、従って少なくともある程度はこの種の治療の副作用にまだ取り組まなければならない。
【００３３】
結腸直腸癌を研究する臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質の標的の両方に対する抗体に関与している。１７−１Ａなどの抗体（それらは腺癌についてのある程度の特異性がある）は、６０人以上の患者において第２相臨床試験を行ない、１人の患者に部分奏効があった。他の試験において、１７−１Ａの使用は、追加のシクロホスファミドを使用するプロトコールにおいて、５２人の患者の間でただ１人の完全奏効および２人のわずかな奏効を生じた。現在までに、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＩＩＩ期結腸癌のためのアジュバント療法として改善された有効性を示していない。最初にイメージングのために承認されたヒト化マウスモノクローナル抗体の使用もまた腫瘍退縮をもたらさなかった。
【００３４】
ごく最近になって、モノクローナル抗体の使用による結腸直腸癌の臨床試験から陽性の結果が得られた。２００４年に、エルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）（登録商標）は、イリノテカンベースの化学療法に対して抵抗性のあるＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌に罹患する患者の第二選択治療のために承認された。２群第ＩＩ相臨床試験および単群試験からの両方の結果は、イリノテカンによる組合せにおいてＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）は、それぞれ２３％および１５％の奏効率で、それぞれ４．１か月および６．５か月の疾患進行までの期間の中央値を示した。同じ２群第ＩＩ相臨床試験および別の単群試験からの結果は、エルビタックス（登録商標）単独による治療は、それぞれ１１％および９％の奏効率で、それぞれ１．５か月および４．２か月の疾患進行までの期間の中央値をもたらすことを示した。
【００３５】
従ってスイスおよび米国の両方において、イリノテカンとの組合せにおけるエルビタックス（登録商標）治療、および米国においてエルビタックス（登録商標）単独治療が、第一選択イリノテカン療法の効果のなかった結腸癌患者の第二選択治療として承認された。したがって、ハーセプチン（登録商標）のように、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体および化学療法の組合せとしてのみ承認される。さらに、スイスおよび米国の両方における治療は、第二選択治療法としての患者のためにのみ承認される。さらに２００４年に、アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）は、転移性結腸直腸癌の第一選択治療として、静脈投与の５−フルオロウラシルベースの化学療法との組合せにおける使用のために承認された。第ＩＩＩ相臨床試験の結果は、アバスチン（登録商標）プラス５−フルオロウラシルで治療された患者の生存の中央値は、５−フルオウロウラシル（ｆｌｕｏｕｒｏｕｒａｃｉｌ）単独で処理された患者と比較して延長されることを示した。（それぞれ２０か月ｖｓ１６か月）。しかしながら、再びハーセプチン（登録商標）およびエルビタックス（登録商標）のように、治療はモノクローナル抗体および化学療法の組合せとしてのみ承認される。
【００３６】
そこでは同様に、引き続き肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌および胃癌については成績不良である。非小細胞肺癌のための最も有望な最近の結果は、化学療法剤タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）との組合せで、細胞殺傷薬のドキソルビシンへコンジュゲートしたモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗シアリルルイスＸ）を含む治療の第ＩＩ相臨床試験からのものである。タキソテール（登録商標）は、肺癌の第二選択治療のためにＦＤＡに承認された唯一の化学療法である。初期のデーターから、タキソテール（登録商標）単独と比較して、全体的な生存の改善が示される。試験に組み入れられた６２人の患者のうち、３分の２はタキソテール（登録商標）との組合せでＳＧＮ−１５を投与されたが、残りの３分の１はタキソテール（登録商標）単独を投与された。タキソテール（登録商標）との組合せでＳＧＮ−１５を投与される患者については全体的な生存の中央値は７．３か月であり、比較のタキソテール（登録商標）単独を投与された患者については５．９か月であった。全体的な生存が１年および１８か月であるものは、ＳＮＧ−１５プラスタキソテール（登録商標）を投与された患者についてはそれぞれ２９％および１８％であり、比較してタキソテール（登録商標）単独を投与された患者についてはそれぞれ２４％および８％であった。さらなる臨床試験が計画される。
【００３７】
前臨床的にはメラノーマのためのモノクローナル抗体の使用はある程度の限定的な成功を収めた。これらの数少ない抗体は臨床試験に到達し、現在までにどの抗体も、承認されないか、または第ＩＩＩ相臨床試験において好ましい結果を実証していない。
【００３８】
疾患を治療する新薬の開発は、明確に疾患病因に寄与する３０，０００の既知の遺伝子の産物の中の関連する標的の同定が欠如することによって妨げられる。腫瘍学研究において、可能性のある薬物標的は、単にそれらが腫瘍細胞で過剰発現されるという事実に起因してしばしば選択されている。したがって次に同定された標的は、多くの化合物との相互作用についてスクリーニングされる。可能性のある抗体療法の場合では、これらの候補化合物は、通常Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって規定された根本原理に従うモノクローナル抗体作製の従来の方法に由来する（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５-４９７， Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）。脾臓細胞を、抗原（例えば全細胞、細胞画分、精製抗原）により免疫されたマウスから回収し、不死化ハイブリドーマパートナーと融合する。結果として生じるハイブリドーマをスクリーニングし、標的へ最も強く結合する抗体の分泌を選択する。ハーセプチン（登録商標）およびリツキシマブを含む、癌細胞に対して向けられる多くの治療用抗体および診断用抗体がこれらの方法を使用して作製され、それらの親和性に基づいて選択された。この戦略における欠点は２点ある。第１に、治療用抗体または診断用抗体結合のために切な標的の選択は、組織特異的発癌プロセスを取り巻く知識の不足、および過剰発現による選択などの結果的に単純化されたこれらの標的を同定する方法により限定的である。第２に、最大の親和性で受容体と結合する薬物分子が、通常シグナルの開始または阻害に対して最高の可能性を持つという仮定は、必ずしもそうだとは限らない。
【００３９】
乳癌および結腸癌の治療のある程度の進歩にもかかわらず、単一薬剤または併用治療のいずれかとして有効な抗体療法の同定および開発は、すべてのタイプの癌について不十分であった。
【００４０】
特許文献１は、患者の腫瘍からの細胞を、患者からの細胞または組織からクローニングされるＭＨＣ遺伝子によりトランスフェクションするプロセスを開示する。次にトランスフェクションされた細胞は患者をワクチン接種するために使用される。
【００４１】
特許文献２は、外部成分へではなく哺乳類の新生細胞および正常細胞の内部細胞成分へ特異的なモノクローナル抗体を得る工程と、モノクローナル抗体を標識する工程と、新生細胞を殺傷する療法を受けた哺乳類の組織と標識抗体を接触させる工程と、変性新生細胞の内部細胞成分に対する標識抗体の結合の測定によって、治療法の実効性を決定する工程を含むプロセスを開示する。ヒト細胞内抗原に向けられる抗体の調製において、特許権所有者は、悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。
【００４２】
特許文献３は新規抗体およびその産生のための方法を提供する。具体的には、ヒト腫瘍（例えば結腸腫瘍および肺腫瘍）に関連したタンパク質抗原に強く結合するが、正常細胞に非常に少ない程度で結合する特性を有するモノクローナル抗体の形成を、この特許は教示する。
【００４３】
特許文献４は、ヒト癌患者からの外科的に腫瘍組織を除去することと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処理することと、生存可能であるが非腫瘍形成性であるように腫瘍細胞を照射することと、原発腫瘍の再発を阻害し、同時に転移を阻害することができる患者用ワクチンを調製するためにこれらの細胞を使用することを含む癌治療法の方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。第４カラムの４５行、以下参照に示すように、特許権所有者は、ヒト新生物におけるモノクローナル抗体発現活性特異的免疫療法の開発において自発性腫瘍細胞を利用する。
【００４４】
特許文献５は、ヒト癌に特有であり起源の上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示する。
【００４５】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞においてアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２の抗体、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体を使用する癌を治療する方法および該抗体を含む医薬組成物を記述する。
【００４６】
特許文献７は、腫瘍および非腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新しいハイブリドーマ細胞株について記述する。
【００４７】
特許文献８は、所望される抗原に対して特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を産生する方法、モノクローナル抗体を産生する方法に加えて、この方法により産生されたモノクローナル抗体を記述する。この特許は、癌の診断および治療のために有用な抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生を特に記述する。
【００４８】
特許文献９は、ヒト癌細胞と反応性の抗体、抗体フラグメント、抗体複合体および一本鎖イムノトキシンに関する。これらの抗体が機能するメカニズムは、この分子がヒト癌の表面上に存在する細胞膜抗原と反応性である点、およびさらに抗体が癌細胞内に内部移行し、続いて結合する能力を持つ点、の２点であり、それらを抗体−薬物および抗体−毒素コンジュゲートの形成のために特に有用にする。それらの非修飾形態では、抗体は、同様に特定濃度での細胞傷害特性を示す。
【００４９】
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかしながら、この抗体は老齢哺乳類からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見出される自然抗体の１タイプであるといわれる。自己抗体が「老齢哺乳類」から生ずるので、自己抗体が治療されている患者から実際に生ずる必要はない。さらに、この特許は、老齢哺乳類からの天然およびモノクローナルの抗核自己抗体、ならびにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
【００５０】
特許文献１１は、２つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の使用、およびヒト乳癌、前立腺癌、膵臓癌およびメラノーマ癌の細胞に対するそれらのインビトロおよびインビボの有効性を開示する。
【００５１】
特許文献１２は、内部移行する癌細胞表面抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を選択するための方法、ならびに細胞代謝に対する抗転写効果および／または抗複製効果を有するモノクローナル抗体の同定のための方法を教示する。一例として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５およびＷＭ９８３メラノーマ細胞ならびにＳＷ９４８結腸直腸癌細胞において内部移行することが示された。さらに、ＭＥ４９１抗体はＳＷ９４８細胞において、転写および細胞増殖を低下させることが示された。特許文献１３（およびその関連出願：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）は、ＣＤ６３抗原を含む群のうちから選択される卵巣腫瘍マーカー遺伝子によりコードされた卵巣腫瘍マーカーポリペプチドを結合する抗体で、卵巣腫瘍の増殖または転移を阻害する方法を記述する。卵巣癌を使用する遺伝子発現の連続分析が、卵巣腫瘍マーカー遺伝子を同定して候補としてＣＤ６３を同定するために行なわれた。特許文献１４（およびその関連出願ＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を記述する。特許文献１５は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を記述する。特許文献１６は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を記述する。特許文献１７は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を記述する。これらの特許および特許出願はＣＤ６３の抗原および抗体を同定するが、本発明の単離モノクローナル抗体、または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性は開示しない。
【００５２】
ＭＥ４９１ポリペプチド抗原をコードする遺伝子はクローニングされ、配列は１９８８年２月２４日に出版のために受理され（非特許文献１）；ＣＤ６３をコードする遺伝子はクローニングされ、配列は１９９１年２月に出版され（非特許文献２）、その出版物は明確にＣＤ６３とＭＥ４９１の同一性を示した。
【００５３】
特許文献１８（配列番号：８９、優先出願日：２００４年６月２９日）、特許文献１９（配列番号：１、優先出願日：２００３年２月１３日（２００３ＷＯ−ＥＰＯＯ１４６１）；他の優先日：２００２年２月１４日（２００２ＧＢ−００００３４８０））、特許文献２０（配列番号：４０、優先出願日：２００２年１２月３０日（２００２ＷＯ−ＵＳ０４１７９８）；他の優先日：２００２年１月０２日（２００２ＵＳ−０３４５４４４Ｐ））のすべては、ＣＤ６３に１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５４】
特許文献２１（配列番号：９７８７および１２１０１、優先出願日：２００２年８月１４日（２００２ＷＯ−ＵＳ０２５７６５）；他の優先日：２００１年８月１４日（２００１ＵＳ−０３１２１４７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２３７アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５５】
特許文献２２（配列番号：２７、優先出願日：２００３年２月１８日（２００３ＷＯ−ＵＳ００４９０２）；他の優先日：２００２年２月２０日（２００２ＵＳ−０３５８２７９Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２２４アミノ酸と９４％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５６】
特許文献２３（配列番号：４１６８および４９１３、優先出願日：２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２０５アミノ酸および９４のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドをそれぞれ記述する。
【００５７】
特許文献２４（赤痢菌ｏｓｐＧ＃２６のためのヒト獲物タンパク質、優先出願日：２００２年１月１１日（２００２ＷＯ−ＥＰ０００７７７）；他の優先日：２００１年１月１２日（２００１ＵＳ−０２６１１３０Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１３０アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５８】
特許文献２５（配列番号：７５６、優先出願日：２０００年３月８日（２０００ＷＯ−ＵＳ００５９１８）；他の優先日：１９９９年３月１２日（９９ＵＳ−０１２４２７０Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１２７のアミノ酸と９９％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５９】
特許文献２６（配列番号：３２０３、優先出願日：２００１年６月７日（ＷＯ−ＵＳＯ ２００１年１８５６９）；他の優先日：２０００年６月７日（２０００ＵＳ−０２０９４６７Ｐ））ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１３２アミノ酸と９７％の配列相同性があるポリペプチドを記述する。
【００６０】
特許文献２７（ヒトＣＤ６３タンパク質からの大きな細胞外ループ配列、優先出願日：１９９９年６月１５日（９９ＷＯ−ＵＳ０１３４８０）；他の優先日：１９９８年６月１５日（９８ＵＳ−００８９２２６Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの９９アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６１】
特許文献２８（配列番号：１２０７、優先出願日：２００２年３月０５日（２００２ＷＯ−ＵＳ００５０９５）；他の優先日：２００１年３月０５日（２００１ＵＳ−００７９９４５１））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１０２アミノ酸と８６％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６２】
特許文献２９（配列番号：４１６９、２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの７４アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６３】
これらの特許出願は、ＣＤ６３抗原に対して相同性がある可変配列を有するポリペプチドを同定する。たいていの場合では、これらの出願は、同様に対応するポリペピド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅ）およびそれらのホモログに対する抗体および抗体誘導体を記述するが、本発明の単離モノクローナル抗体、またはヒト肺癌、前立腺癌および結腸癌もしくは他のヒト癌の治療のための本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示しない。重要なことには、上記のすべての出願は、ＣＤ６３をコードするポリヌクレオチドの配列の出版後に出願された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６４】
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【特許文献１１】米国特許出願第１０／８１０，７５１号
【特許文献１２】米国特許第５，２９６，３４８号
【特許文献１３】特許出願ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１
【特許文献１４】特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１
【特許文献１５】特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献１６】特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａ
【特許文献１７】特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａ
【特許文献１８】ＷＯ２００４０４１１７０．８９
【特許文献１９】ＷＯ２００３０６８２６８−Ａ２
【特許文献２０】ＷＯ２００３０５７１６０−Ａ２９
【特許文献２１】ＷＯ２００３０１６４７５−Ａ２
【特許文献２２】ＷＯ２００３０７０９０２−Ａ２
【特許文献２３】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【特許文献２４】ＷＯ２００２５７３０３−Ａ２
【特許文献２５】ＷＯ２０００５５１８０−Ａ２
【特許文献２６】ＷＯ２００２００６７７−Ａ１
【特許文献２７】ＷＯ９９６６０２７−Ａ１
【特許文献２８】ＷＯ２００２７０５３９−Ａ２
【特許文献２９】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【非特許文献】
【００６５】
【非特許文献１】Ｃａｎ Ｒｅｓ ４８：２９５５， １９８８， Ｊｕｎｅ １
【非特許文献２】ＪＢＣ ２６６（５）：３２３９-３２４５， １９９１
【発明の概要】
【００６６】
本願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための米国特許第６，１８０，３５７号で教示されるような患者特異的な抗癌抗体を産生する方法を利用する。これらの抗体は特異的に１つの腫瘍について作製され、したがって癌治療法のカスタム化を可能にできる。本願の文脈内で、細胞殺傷（細胞傷害性）特性または細胞増殖阻害（細胞静止）特性のいずれかを有する抗癌抗体は、今後細胞傷害性と呼ばれる。これらの抗体は癌の病期分類および診断の補助のために使用でき、腫瘍転移を治療するために使用できる。これらの抗体は、予防的治療として癌の予防のためにも使用できる。従来の創薬パラダイムに従って産生された抗体とは異なり、このように産生された抗体は、悪性組織の増殖および／または生存に必須であると以前に示されない分子および経路を標的とできる。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性相互作用でない細胞傷害性事象の開始のための必要条件に適合する。同様に、本発明のＣＤＭＡＢと、標準の化学療法の形態（例えば放射性核種）をコンジュゲートすることは本発明の範囲内にあり、その結果として、該化学療法の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞傷害性部分、酵素（例えばビオチン複合酵素）または造血性細胞にコンジュゲートすることもでき、それによって抗体コンジュゲートを形成する。
【００６７】
個別化された抗癌治療の可能性は、患者の管理法に変化をもたらすだろう。起こり得る臨床シナリオは、腫瘍サンプルは提示される時に得られて保存されるということである。このサンプルから、腫瘍は、癌性疾患修飾抗体の既存のパネルから分類することができる。患者は慣例通りに病期分類されるが、利用可能な抗体は患者の病期分類においてさらに使用できる。患者は既存の抗体により直ちに治療することができ、腫瘍に特異的な抗体のパネルは、本明細書において概要を述べられた方法を使用して、または本明細書において開示されたスクリーニング方法を併用するファージディスプレーライブラリーの使用によって、のいずれかで作製できる。治療されている腫瘍と同じエピトープのいくつかを、他の腫瘍が持つ可能性があるので、すべての産生された抗体は抗癌抗体のライブラリーに追加されるだろう。この方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する多数の患者において癌性疾患を治療するのに有用かもしれない。
【００６８】
抗癌抗体に加えて、患者は、治療の多様なレジメンの一部として現在推奨される療法を受けることを選択できる。本方法を介する単離抗体が非癌性細胞に対して比較的毒性がないという事実は、単独または従来の治療法との併用のいずれかで、高用量で抗体を組合せる使用を可能にする。高い治療指数は、治療耐性細胞の出現の可能性を低下させように、短時間スケールの再治療もまた可能にするだろう。
【００６９】
患者が治療法の初期の過程に対して抵抗性があるか、または転移が発生する場合、腫瘍に対して特異的な抗体を産生するプロセスは、再治療のために繰り返すことができる。更に、抗癌抗体はその患者から得られた赤血球にコンジュゲートすることができ、転移の治療のために再注入できる。転移癌に効果的な治療はほとんどなく、転移は通常悪い転帰の前兆となり、結果的に死をもたらす。しかしながら転移癌では通常かなり血管が発達しており、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍の部位に抗体を集中させる効果を持ちうる。転移以前でさえも、大部分の癌細胞は生存のために宿主の血液供給に依存しており、赤血球にコンジュゲートした抗癌抗体はその場で腫瘍に対して同様に効果的でありえる。あるいは、抗体は、他の造血性細胞（例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞など）にコンジュゲートしてもよい。
【００７０】
５つのクラスの抗体があり、各抗体は重鎖により付与される機能に関連している。一般に、そのままの抗体による癌細胞の殺傷は、抗体依存性細胞性細胞傷害または補体依存性細胞傷害のいずれかを介して仲介されると考えられる。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は補体系のＣ−１成分の結合によって、ヒト補体を活性化することができ、それによって腫瘍溶解をもたらすことができる補体活性化の古典経路を活性化する。ヒト抗体については、最も効果的な補体活性化抗体は一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球および特定のリンパ球によって細胞殺傷をもたらすＦｃ受容体を有する細胞傷害性細胞を動員する時に効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプの両方のヒト抗体はＡＤＣＣを仲介する。
【００７１】
抗体を仲介する癌殺傷の別の可能なメカニズムは、細胞膜およびそれに結合した糖タンパク質または糖脂質において様々な化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体（いわゆる触媒抗体）の使用によるものでありえる。
【００７２】
抗体を介した癌細胞殺傷には、３つの付加的なメカニズムがある。第１は、癌細胞上に存在する推定上の抗原に対する免疫反応を生ずるように生体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖受容体を標的としそれらの機能を妨害するか、またはその機能が効果的に失われるようにその受容体をダウンレギュレートする抗体の使用である。第３は、ＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＴＲＡＩＬ Ｒ２などの死受容体のライゲーションまたはαＶβ３などのインテグリン分子および同種のもののような直接的な細胞死をもたらす細胞表面部分の直接的なライゲーションに対するそのような抗体の効果である。
【００７３】
制癌剤の臨床的有用性は、患者に対する許容リスクプロフィール下の薬物の利益に基づく。癌治療法において、生存は一般に最も必要とされる利益だったが、生命の延長に加えて、多数の他のよく認識された利益がある。治療が生存に不利に影響しない場合、これらの他の利益は、病徴緩和、有害事象に対する防御、再発または無病生存までの期間の延長、および進行までの期間の延長を含んでいる。これらの基準は一般に容認され、アメリカ食品薬品局（Ｆ． Ｄ． Ａ．）などの規制団体は、これらの利益を生ずる薬物を承認する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ/Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２： １３７-１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、利益のこれらのタイプを予測できる他のエンドポイントがあることはよく認識される。ひとつには、米国Ｆ． Ｄ． Ａ．によって承諾された迅速承認プロセスは、患者利益を予測するようなサロゲートがあることを認める。２００３年末の時点で、このプロセス下で承認された１６の薬物があり、これらののうちの４つの薬物は完全承認へ進み、すなわち、フォローアップ試験はサロゲートエンドポイントによって予測されるような直接的な患者利益を実証した。固形腫瘍における薬物効果の決定ための重要な１つのエンドポイントは、治療に対する奏効の測定による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（３）：２０５-２１６ ２０００）。そのような評価のための臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、固形腫瘍ワーキンググループにおける奏効評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（癌の国際的専門家グループ）によって発布された。全身腫瘍組織量に対する実証された効果を有する薬物は、ＲＥＣＩＳＴ基準に従う客観的奏効によって示されるように、適切な対照群と比較して直接的な患者利益を最終的に生ずる傾向がある。前臨床設定において、全身腫瘍組織量は評価および立証することが一般により簡単である。前臨床試験を臨床設定へ移すことができるという点で、前臨床モデルにおいて生存延長を生ずる薬物は、最も高い期待される臨床的有用性を有する。臨床治療に対する陽性奏効を生ずることと類似して、前臨床設定において全身腫瘍組織量を減少させる薬物は、その疾患に有意な直接的な効果もまた有することができる。生存の延長は制癌剤治療からの最も必要とされる臨床転帰であるが、臨床的有用性を持つ他の利益が存在し、全身腫瘍組織量の減少（それは疾患進行の遅延、生存の延長または両方に相関する）が、直接的な利益をもたらし、臨床効果を有することもまた明らかである。（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． 発展的治療：標的化化合物の臨床試験デザインの成功および失敗（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）；ＡＳＣＯ教養書（Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ）、第３９回年次会議、２００３年、２０９〜２１９ページ）。
【００７４】
本発明は、細胞傷害性分析、およびヒト癌の動物モデルにおける効果によって同定された、ＡＲ７５Ａ１０５．８の開発および使用について記述する。本発明は、特異的にＣＤ６３分子上に存在する１つまたは複数のエピトープに結合し、さらにそのままの抗体として正常細胞ではなく悪性腫瘍細胞に対するインビトロの細胞傷害特性を有し、それはさらにそのままの抗体として直接腫瘍増殖の阻害を仲介する試薬について記述する。さらなる進歩は、腫瘍増殖阻害を達成するために、同種抗原マーカーを発現する標的腫瘍および癌治療の他の陽性のエンドポイントへのこのような抗癌抗体の使用である。
【００７５】
すべてにおいて、本発明は、投与した場合に、哺乳類において抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させることができる治療剤のための標的としてのＡＲ７５Ａ１０５．８抗原の使用を教示する。本発明は、哺乳類において抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させるために、それらの抗原を標的とする、ＣＤＭＡＢ（ＡＲ７５Ａ１０５．８）、およびそれらの誘導体、およびその抗原結合フラグメント、および細胞性細胞傷害を誘導するそのリガンドの使用もまた教示する。更に、本発明は、診断、治療法の予測、およびこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の予後のために有用な癌細胞のＡＲ７５Ａ１０５．８抗原の検出の使用もまた教示する。
【００７６】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株ならびに該ハイブリドーマ細胞株がコードする対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人に由来する癌細胞または１つまたは複数の特定の癌細胞株に対して作製された癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）（このＣＤＭＡＢは癌細胞について細胞傷害性であるが、同時に非癌細胞に対して比較的毒性がない）を産生するための方法を利用することである。
【００７７】
本発明の追加の目的は、癌性疾患修飾抗体、リガンドおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、細胞傷害が抗体依存性細胞毒性を介して仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００７９】
さらに本発明の追加の目的は、細胞傷害が補体依存性細胞毒性を介して仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８０】
さらに本発明のさらなる目的は、細胞傷害が細胞の化学結合の加水分解を触媒する能力の機能である、癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８１】
本発明のさらにさらなる目的は、癌の診断、予後およびモニターのための結合分析のために有用な癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８２】
本発明の他の目的および利点は、実例および実施例として本発明の特定の実施形態が示される以下の記述から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
特許または出願ファイルは、カラーで実施された少なくとも１つの図面を含む。１つまたは複数のカラー図面を備えたこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払いと同時に官庁によって提供される。
【図１】細胞株のＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＢ−２３１およびＨｓ８８８．Ｌｕに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害のパーセンテージおよび結合レベルを比較した図である。
【図２】細胞傷害分析における、ＡＲ７５Ａ１０５．８ｖｓ陽性対照および陰性対照を比較した図である。
【図３】癌細胞株および正常細胞株に対するＡＲ７５Ａ１０５．８および抗ＥＧＦＲの対照の結合を表わした図である。データーは、アイソタイプ対照を上回って何倍増加したかとして平均蛍光強度を示すように作表される。
【図４】いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に対して向けられたＡＲ７５Ａ１０５．８抗体および抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む図である。
【図５】予防的Ｌｏｖｏ結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ７５Ａ１０５．８の効果を実証した図である。垂直の破線は、抗体が投与された期間を示す。データーポイントは平均＋／−標準誤差を表わす。
【図６】予防的Ｌｏｖｏ結腸癌モデルにおいて、体重に対するＡＲ７５Ａ１０５．８の効果を実証した図である。データーポイントは平均＋／−標準誤差を表わす。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）およびＢｘＰＣ−３（レーン４）細胞株の全膜画分ならびにＰＣ−３（レーン２）およびＣＣＤ−２７ｓｋ（レーン３）細胞株の全細胞溶解物から得られたサンプルのウエスタンブロットを示した図である。ブロットは抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８および１Ａ２４５．６をプローブとした。
【図８】７ＢＤ−３３−１１Ａ（レーン１）、ＡＲ７５Ａ１０５．８（レーン２）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（レーン３）との免疫沈降によって調製された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの免疫複合体のウエスタンブロットを示した図である。重複したブロットは、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（左側パネル）、抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８（中央パネル）およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（右側パネル）をプローブとした。
【図９】ヒト組換え融合コンストラクトＧＳＴ−ＥＣ２（ＣＤ６３）のウエスタンブロットを示した図である。ブロットの各々のレーンは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（レーン２）、Ｈ４６０−２２−１（レーン３）、１Ａ２４５．６（レーン４）、７ＢＤＩ−５８（レーン５）、７ＢＤＩ−６０（レーン６）、ＡＲ５１Ａ９９４．１（レーン７）、ＡＲ７５Ａ １０５．８（レーン８）、ならびに陰性対照Ｈ４６０−１６−２（抗ＣＤ４４；レーン１）およびアイソタイプ対照抗体（レーン９、１０）をプローブとした。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
一般に、以下の単語または語句は、要約、記述、実施例、請求項に使用された場合、示された定義を有する。
【００８５】
用語「抗体」は最も広い意味に使用され、例えば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、および中和抗体、脱免疫化抗体、マウス抗体、キメラ化抗体またはヒト化抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を備えた抗体組成物、一本鎖抗体、免疫コンジュゲートおよび抗体のフラグメントを具体的には包含する（以下参照）。
【００８６】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量で存在できる天然に存在する可能な変異を除いて同一である。単一抗原部位に対して向けられるモノクローナル抗体は非常に特異的である。更に、ポリクローナル抗体調製品（それらは異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む）とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して向けられるものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずに合成されるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に抗体の均質集団から得られるような抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることとして解釈することができない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al． ， Nature， ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記述された、ハイブリドーマ（マウスまたはヒト）法によって作製できるか、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製できる。例えば、「モノクローナル抗体」は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４-６２８ （１９９１） ａｎｄ Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２：５８１ -５９７ （１９９１）中に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリーからもまた単離できる。
【００８７】
「抗体フラグメント」は、抗原結合またはその可変領域を好ましくは含む、完全な形の抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例は、全長抗体よりも小さい、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ 、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直線状抗体；一本鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成された一本鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質および多重特異性抗体を含んでいる。
【００８８】
「完全な形の」抗体は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２ およびＣＨ３に加えて抗原を結合する可変領域も含む１つである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異型でありえる。好ましくは、完全な形の抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００８９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な形の抗体は異なる「クラス」に割り当てることができる。５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）の完全な形の抗体があり、これらのうちのいくつかのものは、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２）の中へさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する、重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００９０】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション、などを含む。
【００９１】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介性反応を指す。ＡＤＣＣの仲介ための一次細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｒａｍ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７-９２ （１９９１）の４６４ページの表３中に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号中に記載されるようなインビトロのＡＤＣＣ分析を実行できる。そのような分析のための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいまたはその上に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２-６５６ （１９９８）で開示されるような動物モデルにおいてインビボで評価さできる。
【００９２】
「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞および好中球；好ましくはＰＢＭＣおよびＮＫ細胞を含む。エフェクター細胞は、その天然源から（例えば本明細書において記述されるような血液またはＰＢＭＣから）単離できる。
【００９３】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｅ領域に結合する受容体についての記述に使用される。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合し（γ受容体）、これらの受容体の対立遺伝子変異型およびオルタナティブスプライスされた形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体を含んでいるものである。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（総説Ｍ． Ｉｎ Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：２０３-２３４ （１９９７）を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７-９２ （１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５-３４ （１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０-４１ （１９９５）において概説される。今後同定されるものを含む他のＦｃＲは、用語「ＦｃＲ」により本明細書において包含される。この用語は、新生仔受容体（胎仔への母体のＩｇＧの移行のための関与するＦｃＲｎ）もまた含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７ （１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ． ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４２９ （１９９４））。
【００９４】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下において標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、同種抗原と共に複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣ分析（例えばＧａｚｚａｎｏ-Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２： １６３ （１９９６）中に記載されていたように）を実行できる。
【００９５】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列において広く異なり、特定の抗原について各々の特定の抗体の結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布しない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲを含み、このＦＲは、大部分がβ−シート立体配置をとり、接続ループを形成しある場合には＞シート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって結合される。各鎖中の超可変領域はＦＲによって隣接して保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することには直接関与しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００９６】
本明細書において使用された場合、用語「超可変領域」は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｌ ａｌ． 、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、第５版、公衆衛生局、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド（１９９１））、および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基 （例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２６３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１ -９１７ （１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、各々が一つの抗原結合部位を備えた「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメント（その名称は容易に結晶化する能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しており、抗原をまだ架橋することができるＦ（ａｂ’）２ フラグメントをもたらす。
【００９７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含んでいる最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合性会合で、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するように各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用する。まとめて、６つの超可変領域は抗体に抗原を結合する特異性を付与する。しかしながら、一つの可変ドメイン（または抗原について特異的な３つの超可変領域のみしか含まない、Ｆｖの半分）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。Ｆａｂフラグメントは、さらに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数残基の追加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するペアのＦａｂ’フラグメントとしてもともと産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた公知である。
【００９８】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に別個のタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００９９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬのドメインを含み、これらのドメインは一つのポリペプチド鎖で存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望される構造の形成を可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、１１３ 巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、２６９〜３１５ページ、１９９４年中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
【０１００】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を備えた低分子抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に結合された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合できないほど短いリンカー使用することによって、ドメインはもう一つの鎖の相補的なドメインと強制的にペアにさせられて、２つの抗原結合部位を生ずる。ダイアボディは、例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４-６４４８ （１９９３）中でより完全に記載されている。
【０１０１】
「単離」抗体とは、同定され、その天然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入成分は、抗体のための診断用使用または治療用使用を妨害し、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性の溶質を含みうる材料である。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離抗体は組換え細胞内のその場の抗体を含んでいる。通常は、しかしながら、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるだろう。
【０１０２】
対象となる抗原（例えばＣＤ６３抗原性部分）に「結合する」抗体とは、抗体が抗原を発現する細胞を標的とする治療用薬剤または診断用薬剤として有用であるように、その抗原に十分な親和性で結合できる抗体である。抗体がＣＤ６３抗原性部分を結合する抗体である場合、それは通常、他の受容体とは対照的にＣＤ６３抗原性部分を優先的に結合し、非特異的Ｆｃ接触などの偶発的な結合、または他の抗原に一般的な翻訳後修飾への結合を含んでおらず、他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体でありうる。対象となる抗原を結合する抗体の検出のための方法は、当技術分野において周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットなどの分析を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、同じ意味で使用され、そのような名称はすべて子孫を含む。計画的または偶然の変異のために、すべての子孫のＤＮＡも内容が正確に同一だとは限らないこともまた理解される。もともと形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれている。別の名称が意図される場合には、それは文脈から明らかだろう。
【０１０４】
「治療」は、療法的治療および予防的または防止的な対策の両方を指し、その目的は、標的とされた病理症状または障害を防止または減速（減少）させることである。治療を必要とするものは、障害を有する傾向のあるものに加えて、既に障害のあるものまたは障害が防止されるべきものを含んでいる。従って、本明細書において治療される哺乳類は、障害を有していると診断されるか、または罹患しやすいか、または障害に感受性があるだろう。
【０１０５】
「癌」、「癌性」という用語は、無秩序な細胞増殖または死によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理学的病態を指すか、または記述する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより多くの特定の例は、扁平上皮癌（例えば上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌に加えて、頭頸部癌を含んでいる。
【０１０６】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロスフォスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（サイトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類およびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）類；クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルマスティン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）類；アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）類、アクチノマイシン、ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルノマイシン（ｃａｒｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジオリピン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質 ；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎性製剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシッド（「アラ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標）、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ・オンコロジー（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）社、プリンストン、ニュージャージー）およびドセタセル（タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）、アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ）社、ローヌ・プーラン・ローラー（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）社、アントニー、フランス））；クロラムブチル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；（ＤＭＦＯ）レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまたこの定義に含まれる。
【０１０７】
治療の目的のための「哺乳類」は、ヒト、マウス、ＳＣＩＤマウスもしくはヌードマウスまたはマウスの系統、家庭動物および家畜、ならびにヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園動物、競技動物またはペット動物を含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、本明細書における哺乳類はヒトである。
【０１０８】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（１９８８年５月４日に出版されたＥＰ２６６，０３２に記載されるような固相技術を使用するホスホトリエステル化学、亜リン酸化学、またはホスホアミダイト化学など、またはＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ， １４：５３９９-５４０７， １９８６． によって記述されるようなデオキシリボヌクレオシドＨホスホナート中間体を介するもの）によって、化学的に合成される短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシリボヌクレオチドである。次に、それらはポリアクリルアミドゲル上で精製される。
【０１０９】
特別の指示のない限り、本明細書において使用される場合の用語「ＣＤ６３抗原性部分」は、テトラスパニンファミリーのタイプＩＩＩ膜タンパク質を指し、メラノーマ１抗原、眼メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リゾソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィジン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１もまた指す。
【０１１０】
「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはこれらに相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはこれらに相同である免疫グロブリンであり、それに加えて、それらが所望される生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントである（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ， ８１ ：６８５１-６８５５ （１９８４））。
【０１１１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２ または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。大部分については、ヒト化抗体は、所望される特異性、親和性および受容能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によってレシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が置き換えされる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの実例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置き換えされる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲまたはＦＲの配列中にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾はさらに抗体性能を改良し最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ残基である、実質的にすべての少なくとも１つの（典型的には２つの）可変ドメインを含むだろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部もまた含むだろう。
【０１１２】
「脱免疫化」抗体は、規定の種に対して、非免疫原性であるかまたは免疫原性が少ない免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体への構造的な変化によって達成することができる。当業者に公知である任意の脱免疫化技術を用いることができる。抗体の脱免疫化のために適切な１つの技術は、例えば２０００年６月１５日に出版されたＷＯ００／３４３１７中に記載されている。
【０１１３】
「相同性」は、配列をアライメントさせ、必要であるならば最大の％相同性を達成するためにギャップを導入した後に、同一である、アミノ酸配列変異型中の残基のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野において周知である。
【０１１４】
「アポトーシス」を誘導する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）によって確定されるようなプログラム細胞死を誘導するものである。
【０１１５】
本明細書の全体にわたって、ハイブリドーマ細胞株に加えて、それから産生される単離モノクローナル抗体は、あるいはそれらの内部名称（ＡＲ７５Ａ１０５．８）または寄託名称（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３）によって呼ばれる。
【０１１６】
本明細書において使用されるように、「抗体−リガンド」は、標的抗原についての結合特異性を示す部分を含み、それは、完全な形の抗体分子、抗体フラグメント、および少なくとも抗原結合領域またはその一部（すなわち抗体分子の可変部分）を有する任意の分子（例えば、Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質）、またはＩＤＡＣ２８０３０６−０３と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される単離モノクローナル抗体が結合する抗原（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原）を特異的に認識および結合する、任意の遺伝子操作された分子である。
【０１１７】
本明細書において使用されるように、「癌性疾患修飾抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、例えば全身腫瘍組織量を減少させることまたは癌を持った個人の生存を延長することによって、患者に有益な方法で癌性疾患プロセスを修飾するモノクローナル抗体、およびその抗体−リガンドを指す。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する、分子の一部を意味する。
【０１１９】
本明細書において使用されるように、「競合的に阻害する」は、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体）が向けられる決定基を、従来のレシプロカル抗体競合分析を使用して、認識および結合できること意味する。（Ｂｅｌａｎｇｅｒ Ｌ． ， Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ Ｃ． ａｎｄ Ｄｕｆｏｕｒ Ｄ． （１９７３）競合的なサンドイッチ手順によるαフェトプロテインのための酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）。Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ４８， １５）。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、「標的抗原」はＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原またはその一部である。
【０１２１】
本明細書において使用されるように、「免疫コンジュゲート」は、細胞毒素、放射性医薬品、酵素または毒素または抗腫瘍薬物または治療剤に対して、化学的にまたは生物学的に結合された、抗体などの任意の分子またはＣＤＭＡＢを意味する。抗体またはＣＤＭＡＢは、その標的を結合できる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性医薬品、抗腫瘍薬物または治療剤に結合できる。免疫コンジュゲートの例は、抗体毒素化学物質コンジュゲートおよび抗体−毒素融合タンパク質を含む。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、「融合タンパク質」は、生物学的活性のある分子（例えば毒素、酵素、タンパク薬物）に抗原結合領域が結合される、任意のキメラタンパク質を意味する。
【０１２３】
本明細書において記述される本発明をより完全に理解するために、以下の記述が示される。
【０１２４】
本発明は、特異的にＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原を認識および結合するＣＤＭＡＢ（すなわちＩＤＡＣ２８０３０６−０３ ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１２５】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、それがハイブリドーマＩＤＡＣ２８０３０６−０３によって産生される単離モノクローナル抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態でありうる。したがって、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体として同じ結合特異性を有する任意の組換えタンパク質（例えば、抗体が、リンホカインまたは腫瘍増殖阻害因子などの第２のタンパク質と組み合わされる融合タンパク質）は、本発明の範囲内である。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＭＡＢはＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体である。
【０１２７】
他の実施形態において、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体の抗原結合領域を有するＦｖ分子（一本鎖Ｆｖ分子などの）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、ヘテロ抗体または任意の組換え分子でありえる抗原結合フラグメントである。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３モノクローナル抗体が向けられるエピトープに対して向けられる。
【０１２８】
本発明のＣＤＭＡＢは、誘導体分子を産生するように、すなわち分子内のアミノ酸修飾によって修飾できる。化学的修飾もまた可能かもしれない。
【０１２９】
誘導体分子はポリペプチドの機能特性を保持する、すなわち、そのような置き換えがある分子は、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原またはその一部へのポリペプチドの結合をまだ可能とするだろう。
【０１３０】
これらのアミノ酸置き換えは、「保存的なもの」として当技術分野において公知のアミノ酸置き換えを含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３１】
例えば、立体配座またはタンパク質の機能のいずれかを改変せずに、タンパク質において、「保存的なアミノ酸置換」とされる特定のアミノ酸置き換えがしばしば作製されることは、タンパク質化学のよく確立された原理である。
【０１３２】
そのような変更は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のうちのいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の任意の他のもので置換すること；グルタミン酸（Ｅ）でアスパラギン酸（Ｄ）を置換することおよびその逆；アスパラギン（Ｎ）でグルタミン（Ｑ）を置換することおよびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でセリン（Ｓ）を置換することおよびその逆、を含んでいる。他の置き換えも、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えることができる。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）がそうであるように、グリシン（Ｇ）およびアラニンはしばしば交換可能でありえる。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシン、および時にはバリンと交換できる。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴はその荷電であり、これらの２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置においてしばしば交換可能である。なお、他の変更は、特定の環境において「保存的である」と考えることができる。
【０１３３】
抗体を考慮して、当業者は競合的に阻害するＣＤＭＡＢ（例えば同じエピトープを認識する抗体である競合抗体）を産生することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。１つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原による免疫を要する。サンプルは組織、単離タンパク質または細胞株を含むが、これらに限定されない。競合分析を使用して、生じるハイブリドーマをスクリーニングすることができ、それは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳまたは免疫沈降などの試験抗体の結合を阻害する抗体を同定する分析である。別の方法では、前記抗原を認識する抗体のためのファージディスプレーライブラリーの使用および選別を行なうことが可能であった（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。いずれの場合においても、ハイブリドーマは、その標的抗原に対してもとの抗体が結合することを競合するそれらの能力に基づいて選択される。したがって、そのようなハイブリドーマは、もとの抗体と同じ抗原を認識する特性を持ち、より特異的に同じエピトープを認識するだろう。
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８
【０１３４】
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ブダペスト条約に従って、カナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）、微生物学事務局、カナダ保健省、１０１５アーリントン街、ウイニペグ、マニトバ、カナダ、Ｒ３Ｅ ３Ｒ２に、２００６年３月２８日に、アクセッション番号２８０３０６−０３の下で寄託された。３７ＣＦＲ １．８０８に従って、寄託者は、特許の付与に際して、公衆に対する寄託材料の入手に関して課されたすべての制限が取消不能の形で削除されることを保証する。寄託場所が生存可能なサンプルを調合することができないならば、寄託は置き換えられるだろう。
【０１３５】
抗癌抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８を産生するハイブリドーマを産生するために、凍結ヒト肺明細胞癌腫瘍組織（ゲノミクス・コラボレイティブ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）の単離細胞懸濁物をＰＢＳ中に調製した。イムイージー（ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ）（商標）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、ヴェンロー、オランダ）アジュバントを、緩やかな混合によって使用のために調製した。５〜７週令のＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原アジュバント中の２００万細胞の皮下注射によって免疫した。免疫マウスの腹腔内ブーストのために、直近に調製した抗原アジュバントを５０マイクロリットル中の２００万細胞で、初回免疫の２週間後および５週間後に使用した。最後の免疫の３日後に、脾臓を融合のために使用した。ＮＳＯ−Ｉミエローマパートナーと単離脾細胞を融合させることによって、ハイブリドーマを調製した。融合細胞の上清を、ハイブリドーマのサブクローンから検査した。
【０１３６】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかを決定するために、ＥＬＩＳＡ分析を用いた。１００マイクロリットル／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．２〜９．６）中の２．４マイクログラム／ｍＬの濃度で、一晩４℃でＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０． ０５％ツイーン）中で３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのブロッキングバッファー（洗浄バッファー中の５％ミルク）を、室温で１時間プレートに加え、次に洗浄バッファー中で３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を室温で加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（１％のミルク含有ＰＢＳ中で希釈）のいずれかの１／１００，０００の希釈を、１００マイクロリットル／ウェルで加えた。室温で１時間プレートをインキュベート後に、プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ溶液を室温で１〜３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２ＭのＨ２ ＳＯ４の追加により発色反応を終了させ、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより４５０ｎｍでプレートを読み取った。図１中に示されるように、ＡＲ７５Ａ１０５．８ハイブリドーマは主としてＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌した。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを決定するために、アイソタイプ分類実験を、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ分類キット（ハイカルト・バイオテクノロジー（ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、フロントストラート、オランダ）を使用して実行した。５００マイクロリットルのバッファー溶液を、ラット抗マウスサブクラス特異的抗体含有試験ストリップに加えた。５００マイクロリットルのハイブリドーマ上清を試験管に加え、緩やかな撹拌によって沈めた。捕捉されたマウス免疫グロブリンを、コロイド粒子に結合した二次ラットモノクローナル抗体によって直接検出した。これらの２つのタンパク質の組合せは、アイソタイプを分析するために使用される可視シグナルを生ずる。抗癌抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８はＩｇＧ１、κアイソタイプである。
【０１３８】
１ラウンドの限界希釈後に、細胞ＥＬＩＳＡ分析で、ハイブリドーマ上清は標的細胞に対して結合した抗体について検査された。３つのヒト肺癌細胞株、１つのヒト乳癌細胞株および１つのヒト正常肺細胞株：それぞれ、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０−２３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）およびＨｓ８８８． Ｌｕを検査した。プレーティングした細胞を使用の前に固定した。プレートを、ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＰＢＳにより室温で３度洗浄した。１００マイクロリットルのＰＢＳ中で希釈された２％パラホルムアルデヒドを、室温で１０分間各ウェルに加え、次に廃棄した。プレートを、ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＰＢＳにより室温で３回再び洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０． ０５％のツイーン）中の５％ミルクにより室温で１時間ブロッキングを行った。プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を室温で１時間加えた。プレートを洗浄バッファーにより３回洗浄し、１／２５，０００の希釈の１００マイクロリットル／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１％ミルク含有ＰＢＳ中で希釈）を加えた。室温での１時間のインキュベーション後に、プレートを洗浄バッファーにより３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２ＭのＨ２ ＳＯ４により反応を終了し、パーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより４５０ｎｍでプレートを読み取った。図１中に作表されるような結果は、検査される細胞株に結合しないことが以前に示されている自家ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、バックグラウンドを上回った倍数として表現された。ハイブリドーマＡＲ７５Ａ１０５．８からの抗体は、検査された細胞株のすべてに対して検出可能な結合を示した。
【０１３９】
抗体結合のための検査と併用して、ハイブリドーマ上清の細胞傷害効果を細胞株：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０−２３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）およびＨｓ８８８．Ｌｕにおいて検査した。カルセインＡＭをモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社（ユージーン、オレゴン）から入手した。以下に概説された変更で製造者の使用説明書に従って、分析を実行した。分析の前に、細胞を所定の適切な密度でプレーティングした。２日後に、ハイブリドーママイクロタイタープレートからの１００マイクロリットルの上清を細胞プレートに移し、５％ＣＯ２ インキュベーター中で５日間インキュベートした。陽性対照として取り扱われるウェルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）またはシクロヘキシミドを加えた。５日間の処理後に、次にプレートを逆さにすることによって空にし、水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有する室温のＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）を、マルチチャンネルスクイーズボトルから各ウェルの中へ分注し、３回タッピングし、逆さにすることによって空にし、次に水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＤＰＢＳ中で希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン色素を各ウェルに加え、５％ＣＯ２ インキュベーター中で３７℃３０分間インキュベートした。プレートをパーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データーをマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）社エクセルで解析した。結果を図１中に示す。ＡＲ７５Ａ１０５．８ハイブリドーマからの上清は、Ａ５４９細胞上で１９％の特異的な細胞傷害を生じた。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ６３％および３３％だった。１１％の特異的な細胞傷害がＮＣＩ−Ｈ２３細胞上でも観察された。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ２７％および５５％だった。さらに、１７％の特異的な細胞傷害がＮＣＩ−Ｈ４６０−２３細胞上で観察された。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ２６％および１０６％だった。図１からの結果は、ＡＲ７５Ａ１０５．８の細胞傷害効果が癌細胞タイプに対する結合レベルに比例しないことを実証した。検査されたすべての細胞株に対する検出可能な結合、およびＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３およびＮＣＩ−Ｈ４６０−２３細胞については細胞傷害があった。図１中に示されるように、ＡＲ７５Ａ１０５．８はＨｓ８８８．Ｌｕ（正常なヒト肺細胞株）においては細胞傷害を生じなかった。公知の非特異的細胞傷害剤シクロヘキシミドおよびＮａＮ３は一般に予想されるような細胞傷害を生じた。
実施例２
インビトロの細胞傷害および結合
【０１４０】
ＡＲ７５Ａ１０５．８モノクローナル抗体は、回収および再播種を２回／週で行なって、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、オークヴィル、オンタリオ）中のハイブリドーマの培養によって産生された。プロテインＧセファロース４ファースト・フロー（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、ベ・デュルフェ、ケベック）による標準抗体精製手順は以下の通りである。脱免疫化モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ化モノクローナル抗体、またはマウスモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
【０１４１】
ＡＲ７５Ａ１０５．８を、細胞毒性分析（図２）において、２つの陽性対照（抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、κ、５マイクログラム／ｍＬ、セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）社、ホーンビー、オンタリオ）およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５マイクロモル、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、オークヴィル、オンタリオ））および１つの陰性アイソタイプ対照（１Ｂ７．１１（抗ＴＮＰ）、自家精製した）と比較した。前立腺癌（ＰＣ−３）および乳癌（ＭＢ−２３１）、ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株を検査した。細胞はすべてＡＴＣＣ、マナッサス、バージニアから入手した。カルセインＡＭはモレキュラー・プローブス社（ユージーン、オレゴン）から入手した。以下に概説された変更で製造者の使用説明書に従って、分析を実行した。分析の前に、細胞を所定の適切な密度でプレーティングした。２日後に、１００マイクロリットルの精製抗体または対照を培地中で希釈し、次に細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間インキュベートした。次にプレートを逆さにすることによって空にし、水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有する室温のＤＰＢＳを、マルチチャンネルスクイーズボトルから各ウェルの中へ分注し、３回タッピングし、逆さにすることよって空にし、次に水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＤＰＢＳ中で希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン色素を各ウェルに加え、５％ＣＯ２ インキュベーター中で３７℃３０分間インキュベートした。プレートはパーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データーをマイクロソフト社エクセルで解析し、結果を図２中に示した。各抗体については、三重で検査された４つの実験において観察された平均細胞傷害に基づいたスコアは５〜５０の間であり、分析間で観察されたばらつきに基づいたスコアは２５〜１００の間のであった。これらの２つのスコア（細胞傷害スコア）の合計は図２中に示される。５５以上の細胞傷害スコアは、検査された細胞株について陽性であると考えられた。アイソタイプ陰性対照およびバッファー陰性対照の両方と比較して、ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体はＰＣ−３前立腺癌細胞株において特異的な細胞傷害を生じた。ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ＭＢ−２３１乳癌細胞タイプにおいては陽性の細胞傷害スコアを生じなかった。これはＡＲ７５Ａ１０５．８クローンのハイブリドーマ上清からのデーターと合致し、それはさらにＭＢ−２３１癌細胞株に対して特異的な細胞傷害を検出しなかった（実施例１を参照）。重要なことに、ＡＲ７５Ａ１０５．８は、陰性対照と比較して、ＣＣＤ−２７ｓｋまたはＨｓ８８８．Ｌｕなどの非癌細胞株に対して有意な細胞傷害を生ぜず、抗体が癌細胞に向けて特異的な細胞傷害効果を有することを示唆する。１Ｂ７．１１についての細胞傷害スコアは複数の実験からの平均であった。化学的細胞傷害剤は、複数の細胞株に対して期待される細胞傷害を誘導した。
【０１４２】
前立腺癌（ＰＣ−３）および乳癌（ＭＢ−２３１）、ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株へのＡＲ７５Ａ１０５．８の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。細胞は、ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋不含有）で最初に細胞単層を洗浄することによりＦＡＣＳのために調製された。次に細胞培養プレートから細胞を解離するために、細胞解離バッファー（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、バーリントン、オンタリオ）を３７℃で使用した。遠心分離して回収した後に、細胞を、ＭｇＣｌ２ 、ＣａＣｌ２ および２％のウシ胎仔血清を含有するＤＰＢＳ（染色用培地）中に４℃で再懸濁してカウントし、適切な細胞密度に小分けし、遠心して細胞を沈殿させ、試験抗体（ＡＲ７５Ａ１０５．８）または対照抗体（アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）の存在下において染色培地中に４℃で再懸濁した。３０分間氷上で、アイソタイプ対照および試験抗体は２０マイクログラム／ｍＬで評価したが、抗ＥＧＦＲは５マイクログラム／ｍＬで評価した。アレクサ（Ａｌｅｘａ）蛍光５４６−コンジュゲート二次抗体の追加の前に、細胞を染色培地で一回洗浄した。次に染色培地中のアレクサ蛍光５４６−コンジュゲート抗体を４℃で３０分間加えた。次に細胞を最終時として洗浄し、固定培地（１．５％パラホルムアルデヒド含有染色培地）中に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる捕捉は、ＦＡＣＳアレイ（ＦＡＣＳａｒｒａｙ）（商標）システムソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社、オークヴィル、オンタリオ）を使用するＦＡＣＳアレイ（商標）上でサンプルを流すことにより評価された。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）は、ＦＳＣおよびＳＳＣの検出器に対する電圧利得および振幅利得の調整により設定された。蛍光（アレクサ−５４６）チャンネルのための検出器を、細胞がおよそ１〜５ユニットの蛍光強度中央値で均一のピークを有するように、無染色細胞を流すことによって調整した。各サンプルについては、およそ１０，０００のゲートイベント（染色固定細胞）が、分析のために捕捉され、結果は図３中に示される。
【０１４３】
図３は、アイソタイプ対照を上回って何倍増加したかを平均蛍光強度で示す。ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体の代表的なヒストグラムを図４のために編集した。ＡＲ７５Ａ１０５． ８は、正常な皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋ（２．２倍）に対して弱い結合を示した。ＡＲ７５Ａ１０５．８は、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（１５．５倍）、乳癌細胞株ＭＢ−２３１（９．９倍）に対しておよび正常肺細胞株Ｈｓ８８８．Ｌｕ（５．４倍）に対してより強い結合を示した。これらのデーターは、検査された癌細胞タイプに対して明らかな結合があったが、前立腺癌細胞株ＰＣ−３のみと細胞傷害が関連したという点で、ＡＲ７５Ａ１０５．８が機能的特異性を示したことを実証する。これは、結合するということが、その同種抗原の抗体ライゲーションの転帰を必ずしも予測するものではないというさらなる証拠でもあり、自明でない発見だった。これは、異なる細胞における抗体ライゲーションの情況が、単なる抗体結合単独よりもむしろ、細胞傷害を決定することを示唆した。
実施例３
インビボにおけるＬｏｖｏ細胞による腫瘍実験
【０１４４】
図５および６に関して、４〜６週令の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの生理食塩水中の１００万のヒト結腸癌細胞（Ｌｏｖｏ）を首筋に皮下注射して移植した。マウスを、６匹の２つの治療群へ無作為に分けた。移植の翌日に、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４を含む希釈剤によるストック濃縮物からの希釈後に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ７５Ａ１０５．８試験抗体またはバッファー対照を、３００マイクロリットルの体積で各コホートに対して腹腔内投与した。次に抗体および対照のサンプルを、同じ方式で、研究の期間１週あたり一回投与した。腫瘍増殖を約７日毎に測径器で測定した。抗体を８回注入した後に、研究を完了した。動物の体重は、研究の期間１週あたり一回記録した。研究の終了時に、すべての動物をＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【０１４５】
ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ヒト結腸癌の高侵攻性のＬｏｖｏのインビボの予防的モデルにおいて腫瘍増殖を減少させた。移植５６日後に（最後の治療投与６日後に）、ＡＲ７５Ａ１０５．８治療群における平均腫瘍容積は、バッファー対照で治療された群における腫瘍容積よりも４５％低かった（図５）。この効果は、各群内の動物が少数であるために統計的に有意ではなかった。４８日目に（７回の抗体投与後で、動物はまだ治療期間中である）、ＡＲ７５Ａ１０５．８による治療は、６２％（ｐ＝０．０２３９）の有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。
【０１４６】
研究の全体にわたって毒性についての臨床的症状はなかった。毎週の間隔で測定された体重を、健康および成長障害を代わりに示すものとした。対照群の平均体重は、研究の期間にわたって有意に変化しなかった（図６）。しかしながら、ＡＲ７５Ａ１０５． ８治療群の平均体重は、研究の終了時に対照群よりも有意に高かった（５６日目；ｐ＝０． ０２４）。この観察は、ＡＲ７５Ａ１０５．８治療群において観察される腫瘍容積の低下に関連しているかもしれない。
【０１４７】
要約すると、ＡＲ７５Ａ１０５．８は耐容性が良好であり、このヒト結腸癌異種移植片モデルにおいて全身腫瘍組織量を低下させた。
実施例４
ＡＲ７５Ａ１０５．８と抗ＣＤ６３抗体７ＢＤ−３３−１１Ａの間の交差反応性の決定
【０１４８】
全膜画分のおよび全細胞溶解物のウエスタンブロットからの結果により、モノクローナル抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８をプローブとした場合、別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体１Ａ２４５．６で得られた結果との強い類似性が明らかになった（図７）。前者の抗体がＣＤ６３と交差反応するかどうかを決定するために、それを、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗ＣＤ６３抗体またはＡＲ７５Ａ１０５．８のいずれかによりヒト乳癌細胞（ＭＢＤ−ＭＢ−２３１）の全膜画分から得られる免疫沈降複合体のウエスタンブロットに対するプローブとして使用した。
【０１４９】
簡潔には、各々が３００マイクログラムのＭＤＡ−ＭＢ−２３１全膜画分を含む３つの重複したサンプル（６００マイクロリットルの１×ＲＩＰＡバッファー中で０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）を、１５マイクロリットルの７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲ７５Ａ１０５．８またはＩｇＧ１アイソタイプ対照をコンジュゲートしたプロテインＧセファロースビーズと共に４℃で２時間インキュベートした。洗浄後、ビーズを１×の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で煮沸し、サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって解析した。ＰＶＤＦ膜の上への電気的な転写後にブロットは、標準ウエスタンブロット手順に従って、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲ７５Ａ１０５．８および１Ｂ７．１１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）をプローブとして調べられた。一次抗体はすべて５マイクログラム／ｍＬの濃度で使用された。結果のブロットの画像（図８）から、７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡＲ７５Ａ１０５．８の両方はそれらのいずれかによって免疫沈降させた抗原と交差反応することが示された。したがって、抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８は、既知の抗ＣＤ６３抗体によって免疫沈降させたＣＤ６３と交差反応した。
【０１５０】
ＡＲ７５Ａ１０５．８とヒトＣＤ６３の間の交差反応性をさらに確認するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたヒトＣＤ６３の最大の細胞外ループの組換えＧＳＴ融合コンストラクト（ＧＳＴ−ＥＣ２）のウエスタンブロット上で、抗体をプローブとして使用した。簡潔には、５マイクログラムの精製組換えＧＳＴ融合タンパク質を、１０％分取ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって解析した。転写後にブロットは、標準ウエスタンブロット手順に従って、ＡＲ７５Ａ１０５．８、ならびに抗ＣＤ６３抗体の７ＢＤＩ−５８、７ＢＤ１−６０、ＡＲ５１Ａ９９４．１、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６およびＨ４６０−２２−１ならびに抗ＣＤ４４抗体（クローンＨ４６０−１６−２）ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体をプローブとして調べられた。一次抗体はすべて５マイクログラム／ｍＬの濃度で使用された。この実験からの結果（図９）は、特異的にヒトＣＤ６３の最大の細胞外ループの組換えＧＳＴ融合コンストラクトとすべての抗体（抗ＣＤ４４の抗体およびアイソタイプ対照を例外として）が交差反応することを明らかにし、したがってすべての抗体（抗ＣＤ４４の抗体およびアイソタイプ対照を除いて）がヒトＣＤ６３と交差反応することを確証した。
【０１５１】
証拠の優越性から、ＣＤ６３の上に存在する１つまたは複数のエピトープのライゲーションを介してＡＲ７５Ａ１０５．８がその癌予防効果を仲介することが示される。ＡＲ７５Ａ１０５． ８抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などの発現細胞から同種抗原を免疫沈降させるのに使用できることが、実施例４において示された。さらに、ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体は、ＦＡＣＳまたは細胞ＥＬＩＳＡによって示される技術（しかしこれらに限定されない）を利用して、特異的にそれに結合するＣＤ６３抗原性部分を発現する細胞および／または組織の検出において使用できることを示すことができた。
【０１５２】
したがって、他の抗ＣＤ６３抗体は、ＣＤ６３抗原の他の形態を免疫沈降させて単離するのに使用でき、抗原もまた同じタイプの分析を使用して抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害することに使用できる。
【０１５３】
本明細書中で言及された特許および出版物はすべて、本発明が属する当業者のレベルを表す。各々の個別の出版物を参照することによって組み入れられることが特別に個別に示されるように、すべての特許および出版物は、参照することによって本明細書に同程度まで組み入れられる。
【０１５４】
本発明の特定の形態が示されているが、それが本明細書において記述および示された部分の具体的な形態または構成に限定的でないことが理解されるべきである。様々な変更が本発明の範囲から逸脱せずに行なえることは当業者に明らかであり、本発明が、明細書中に示されたことおよび記載されたことに限定的であると判断することはできない。
【０１５５】
目的を実行し、述べられた結果および利点に加えて、その中に固有のものを得るのに、本発明がよく適合していることを、当業者は容易に認識するだろう。本明細書において記述された任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生体関連化合物、方法、手順および技術は、現時点での好ましい実施形態の典型であり、例示的であるように意図され、範囲の限定としては意図されない。その中の変更および他の使用は本発明の趣旨内に包含され、添付の請求項の範囲によって定義されることは、当業者には考えつくだろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記述されたが、請求された本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定的であるべきでないことが理解されるに違いない。実際は、当業者にとって明らかな本発明の実行のために記述された形態の様々な修飾は、以下の請求項の範囲内であると意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および産生、ならびに任意で１つまたは複数の化学療法剤との組合せでの、治療および診断のプロセスにおけるこれらのＣＤＭＡＢの使用に関する。本発明は、さらに本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌におけるＣＤ６３：ＣＤ６３には現在３０のメンバーがあり、４つの膜貫通領域の存在によって特徴づけられるテトラスパニンファミリーのタイプＩＩＩ膜タンパク質である。いくつかのグループが、活性化血小板、顆粒球およびメラノーマ細胞の全細胞調製品に対して作製された抗体を使用して、独立してＣＤ６３を同定した。それらの同族の糖タンパク質抗原のそれぞれのｃＤＮＡのクローニングにより、異なる抗原が同一の分子であったという認識が導かれた。白血球分類に関する第６回国際ワークショップ（Ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ）（１９９６）は、その後にＣＤ６３抗体としてこれらの抗体を分類した。１９９６年のワークショップ以前には、ＣＤ６３は、複数の名称（メラノーマ１抗原、眼メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リゾソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィジン（ｇｒａｎｕｌｏｐｈｙｓｉｎ）、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１）により公知であり、時には部分的な特性評価および識別へ結びつく抗体に関連していた。したがって、ＣＤ６３は、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ ＭＥ４９１）、神経分泌腺（ｎｅｕｒｏｇｌａｎｄｕｌａｒ）抗原（ＭＡｂ ＬＳ５９、ＭＡｂ ＬＳ６２、ＭＡｂ ＬＳ７６、ＭＡｂ ＬＳ１１３、ＭＡｂ ＬＳ１４０およびＭＡｂ ＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂ Ｈ５Ｃ６、ＭＡｂ Ｈ４Ｆ８およびＭＡｂ Ｈ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ １２Ｆ１２）、骨前駆細胞特異的マーカー（ＭＡｂ ＨＯＰ−２６）およびインテグリン関連タンパク質（ＭＡｂ ６Ｈ１）とも呼ばれた。ヒトＣＤ６３と交差反応することが見出された他の抗体は、８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１との交差反応性）、ＮＫＩ／Ｃ−３およびＮＫＩ／ブラック−１３であった（Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３５（３）：２８７-９５ （１９８５）； Ｖｅｎｎｅｇｏｏｒ ａｎｄ Ｒｕｍｋｅ， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２３（２）：９３-１００ （１９８６）； Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８４（６）：４２２-９ （１９９２）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． １１０（３）：３９９-４０４ （１９９２））。免疫親和性により精製されたＮＫＩ／Ｃ３抗原に対して作製されたウサギポリクローナル抗体ＲａＣ３による研究から、見かけ上の分子量が２０ｋＤａ付近でありＮ結合型炭水化物によって高度に翻訳後修飾されたコアポリペプチドとして、標的タンパク質が明らかにされた（Ｇｒｕｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４９（２）：４５９-６５（１９８９））。
【０００３】
ＣＤ６３は、ＭＡｂ ＭＥ４９１（ＳＫＭｅｌ２３ヒト皮膚メラノーマ細胞株調製品に対して作製され、メラノーマ細胞への結合でスクリーニングされた多数の抗体の１つ）を使用して、メラノーマｃＤＮＡライブラリーから最初にクローニングされた。１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ標識メラノーマ細胞からの免疫沈降により、細胞表面に３０〜６０ｋＤａタンパク質が存在することが示された。この抗体により認識される抗原は、翻訳後に非常に修飾されるタンパク質であることが示された。免疫組織化学によって、抗体は、正常に見える周囲の細胞ではなく腫瘍組織中のメラノーマ細胞を認識することが見出され、したがってこの抗体が腫瘍特異抗原決定基を認識する可能性を示唆した（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４， ２４３-２５５ （１９８４））。この抗体は、８７％のぶどう膜メラノーマ症例中のメラノーマ細胞、およびぶどう膜メラノーマが存在する８６％の症例中の気球細胞もまた染色した。この研究において、正常な眼組織の染色は可変的であり、正常な症例の少数でのみ、および形態学的に正常なメラノサイトでまれに陽性であった（Ｆｏｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｒｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １０３（２）：２７５-９ （１９８５））。別の実験において、さらにＳＫＭｅｌ２３細胞株に対して作製されたモノクローナル抗体ＭＡｂ６−Ｆ１、ＭＡｂ８−１ＨおよびＭＡｂ８−２Ａは、同一の抗原を認識し、ＭＡｂ ＭＥ４９１により得られたものに非常に類似する免疫組織化学的染色パターンをあらわすことが示された。さらにこれらの抗体は、原発性脈絡膜メラノーマを有する患者において、肝臓転移性腫瘍組織を染色したが、正常な肝細胞を染色しなかった。ヒトメラノーマ生検の別の研究において、ＭＡｂ ＭＥ４９１の反応性はメラノーマ進行と逆相関しているようであることが示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、正常なメラノサイトにおいて低く、メラノーマ進行の初期においてより高く（異形成母斑および水平増殖期（ＲＧＰ）腫瘍）、ならびに垂直増殖期（ＶＧＰ）のメラノーマ腫瘍などのさらに進行したメラノーマ腫瘍および転移性腫瘍において減少または存在しない。原発性ヒトぶどう膜メラノーマ細胞に対して作製された別のモノクローナル抗体（ＭＡｂ ４Ａ３）は、これらの細胞中に存在する抗原を特異的に認識することが見出され、健常人からのリンパ球への結合はバックグラウンドレベルのみであることが示された。この抗体によって検出される１つまたは複数の抗原は、メラノーマ組織のウェスタンイムノブロットにより、およその見かけ上の分子量が５５ｋＤａのダブレットであり、この抗体によって認識される抗原は、抗ＣＤ６３としてクラスターに分けされた抗体によって認識された抗原と同一でなかったことを示唆する（Ｄａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ２７（９）： １３６２-７ （１９８６））。
【０００４】
ＣＤ６３は、トロンビン活性化血小板に対して作製されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ２．２８、ＭＡｂ２．１９、ＭＡｂ５．１５およびＭＡｂ５ｄ１０）を使用して、ヒト血小板においても見出され、部分的に特性を評価された。トロンビン活性化に際しての結合部位数の増加（１０倍以上）によって示されるように、これらの抗体は活性化依存性血小板膜５３ｋＤａ糖タンパク質を検出した。競合分析において、これらの抗体は結合を互いにブロックし、それらが同一のまたは空間的に近い抗原決定基を認識することを示唆する。血小板凝集実験からの結果から、これらの抗体がそれ自体で血小板凝集を引き起こさないこと、またアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、トロンビン、コラーゲン、リストセチンおよびエピネフリンによって誘導される凝集を妨害しないことが明らかにされた。電子顕微鏡データーは、これらの抗体が静止血小板においてリゾソーム膜に局在する抗原を認識することを示唆した。免疫組織化学データーは、これらの抗体が脾臓、リンパ節、胸腺の限定された領域中に、および内皮細胞に存在する抗原を認識することを示した。別の研究において、ＭＡｂ ２．２８は、さらに静止血小板中の、ならびに巨核球および内皮細胞中の内部顆粒を標識し、後者の２つでは、その標識はリソソームのコンパートメントの既知のマーカーである酵素カテプシンＤの抗体と共局在した。抗体クラスタリングおよび発現クローニングによる続報研究から、この抗体によりＣＤ６３として認識される抗原の同定が導かれ、この抗原がリソソームのコンパートメント中に存在し、コンパートメント特異的マーカーＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２と共局在することがさらに確認された。この分子のクローニングにより、この分子をＣＤ６３として同定し、テトラスパニンファミリー中に含めた。
【０００５】
ＣＤ６３の発現は様々な組織および細胞タイプで検出された。細胞レベルでは、細胞膜およびさらに細胞内後期エンドソーム小胞構造に結合することが見出された。細胞活性化は、特定の場合に、ＣＤ６３の細胞内貯蔵の移動による表面発現の増加を導いた。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球中で（特にエンドソーム中で、表面へのＭＨＣクラスＩＩ複合体の輸送に関わるエキソソーム中で、および分泌小胞中で）ＭＨＣクラスＩＩと共局在し、これと物理的に結合することもまた見出された。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、好中球、乳癌およびメラノーマ細胞を含む、様々な細胞タイプにおいて、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，Ｘ）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３またはインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６またはインテグリン鎖α６）およびＣＤ２９（インテグリン鎖β１）などのテトラスパニンファミリーの他のメンバーと相互作用することが見出された。
【０００６】
癌におけるＣＤ６３の役割は明らかではなかった。ＣＤ６３は、血小板および顆粒球活性化、ＭＨＣクラスＩＩ依存性抗原提示、インテグリン依存性細胞接着および運動性、ならびに特定のタイプの癌における腫瘍進行などの多様な事象に関与することがいくつかの独立したグループによって最初に見出されたが、その機能はさらに完全に解明されなければならない。たとえ現在ある証拠が様々な細胞生理学的事象におけるＣＤ６３の役割を支持しても、これらの機能が互いから独立しているかどうか、またはＣＤ６３が関与する内在する一般的な細胞メカニズムがあるかどうかは明らかではない。
【０００７】
いくつかのグループは、ＣＤ６３と特定のタイプの腫瘍（特にメラノーマ）の進行との間の関連を研究してきた。Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体が、様々な進行病期での腫瘍を有する患者から得られる癌サンプルの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために開発された。腫瘍の進行および転移特性と染色の低下（ＣＤ６３の発現低下を反映する可能性が最も高いと著者によって解釈された）が関連することが観察された。より最近の研究により、ＣＤ６３を含むテトラスパニンタンパク質ファミリーのうちのいくつかのメンバーの発現レベルの明らかな低下（ｍＲＮＡ定量化後）といくつかの乳癌由来細胞株のインビトロの浸潤性との間での有意な相関性についてもまた記述された。別の研究は、エストロゲン枯渇を行なった培養乳癌細胞において、ディファレンシャルディスプレイによりＣＤ６３を同定した。このことは、ＣＤ６３発現がステロイドホルモンにより調節可能であり、ＣＤ６３の存在量および／または機能の変化もまた乳房腫瘍の進行に関連するかもしれないことを示した。
【０００８】
これとは対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ＦＣ−５．０１による研究から、この抗体に反応するエピトープは異なる正常組織で可変的に発現されるこが明らかにされた。この抗体はＣＤ６３を認識するが、初期メラノーマと進行期メラノーマ（転移性メラノーマを含む）を区別しないことが見出され（ＭＡｂ ＭＥ４９１とは異なり）、このことは、ＣＤ６３抗原はより進行した腫瘍中に存在するが、そのエピトープのいくつかは異なる病期の腫瘍からの細胞中ではマスクされているかもしれないことを示唆した。これは、ＣＤ６３コアポリペプチドの翻訳後修飾の変化、または他の分子とのＣＤ６３の相互作用のためであり、抗体の認識および結合のための特異的エピトープの利用可能性に影響するかもしれない。これらの結果は、原発性、水平増殖期、垂直増殖期および転移性のメラノーマなどの進行の異なる病期の組織切片の間での、抗ＣＤ６３のＭＡｂ ＮＫＩ−Ｃ３による染色がメラノーマを区別しなかったという、Ｓｉ ａｎｄ Ｈｅｒｓｅｙ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５４（１）：３７-４３ （１９９３）により記述された観察を支持した。他の研究（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６（４）： １３９７-４０６ （１９９８）； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． ， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５３（３）：９７３-８３ （１９９８））において、２つのテトラスパニンファミリーメンバー（ＣＤ９およびＣＤ８２）については、それらの発現レベルと腫瘍進行および患者予後との間に有意な相関性があることが、乳癌および非小細胞肺癌からの定量的ＰＣＲによるｍＲＮＡ分析により明らかにされたが、ＣＤ６３については、すべてのサンプルにおいてＣＤ６３の発現が同様であったのでそのような相関性は見出されなかった。これらの明らかに矛盾する結果を受けて、癌とＣＤ６３の関連を明確に示す強固で矛盾しないデーターが欠如している。
【０００９】
現在までに、ＣＤ６３と結果として生ずるこの分子の腫瘍抑制因子機能との間のつながりの立証を試みたインビボの研究は少数ない。これらの研究の１つにおいて、ＣＤ６３を過剰発現するヒトＨ−ｒａｓにより形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３株細胞は、無胸腺マウスへ皮下注射および腹腔内注射され、ＣＤ６３を過剰発現しない親細胞の挙動と比較した場合、生存期間の増加に加えて、腫瘍サイズおよび転移能力の低下によっても示されるように、悪性／腫瘍形成性表現型の低下を示した。このことから、形質転換細胞中のヒトＣＤ６３の存在が、それらの細胞の悪性挙動を抑制するかもしれないことが示唆された。最近では、ヒトＣＤ６３を発現し、ＣＤ６３に対する耐性を誘導するように発生させたトランスジェニックマウスモデルによる研究から、ワクシニアウイルスに融合したヒトＣＤ６３による免疫に際して、注入されたヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）を共トランスフェクションしたマウスメラノーマ細胞株の腫瘍増殖が阻害され、生存を増加させることができるかもしれないことが示された。動物がＣＤ６３のみでトランスフェクションされた細胞株ではなく、ＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩで共トランスフェクションされた細胞を注射した場合でのみ、腫瘍増殖の阻害が起こったので、治療上の効果がＴリンパ球依存性であり、内在性の抗ＣＤ６３抗体がこの防護効果に関与するようではないことが、著者によって示唆された。この解釈は、精製ヒトＣＤ６３で前免疫され、抗ヒトＣＤ６３抗体が生じたことが示される野生型動物において、癌細胞増殖に対する防護効果がないという事実によって支持された。ヒトＣＤ６３によりトランスフェクションされたＫＭ３細胞株（最初はヒト起源であると考えられたが、後にラット系列であると特徴づけられた）を使用する、Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２（５）：６３１-５ （１９９５）によって記述された研究から、このタンパク質の発現は、無胸腺マウスに皮内注射した場合、非トランスフェクションの親ＫＭ３細胞を使用して観察されたものと比較して、これらの細胞の増殖および転移の能力を低下させるが、様々なトランスフェクション細胞株と非トランスフェクション細胞株の間のインビトロ増殖率には有意差がないということが示唆された。これらの観察は、腫瘍細胞のインビボ増殖率およびインビトロ増殖率の両方に影響することが公知である他の癌抑制遺伝子の効果から、ＣＤ６３の可能性のある効果を区別した。更に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１（インビトロの分析においてランダムな運動性を低下させることで、同じ細胞に対する機能的効果を有することが見出された（Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８（７）：３３５３-８ （１９９７）））の追加は、それらのインビトロ増殖率に影響を与えなかった。
【００１０】
この研究は、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する化学誘引物質に反応してＣＤ６３が移動を促進し、インテグリンの抗体はこれらの効果をブロックすることができないが、この効果はβ１−タイプのインテグリンの機能的関与によって仲介されるという観察についてもまた記述した。しかしながら、ビトロネクチン（インテグリンαＶβ５に対する既知のリガンド）を介したシグナリングの役割と、ＣＤ６３をトランスフェクションした細胞上のフィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンなどの他のＥＣＭ構成要素によって仲介されるシグナリングの役割との間に拮抗作用があると思われた。このことは、特異的な条件下で（ＥＣＭ構成要素の存在下において）、ＣＤ６３の発現は移動の低下を導き、これは接着と運動性との間の微細なバランスに依存するだろうことを示唆した。別の研究において、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ７１０Ｆ）はＰＭＡ処理したＨＬ−６０細胞の接着および伸展を促進し、一方別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ２．２８）は同様の効果を促進したが、これは細胞集団の非常に少量の画分に対してのみ、また非常に多量に加えられた場合でのみ起こった。これらの結果は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されているがそれらの機能効果がかなり異なることを示した。
【００１１】
テトラスパニンは細胞増殖にも関与する。Ｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０（８）：４００７-１５ （１９９０）は、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）を認識するマウスＭＡｂ ５Ａ６のリンパ腫細胞株に対する抗増殖効果について記述した。別の研究において、Ｔリンパ球における抗体とのヒトＣＤ３７のライゲーションは、ＣＤ３７誘導性増殖をブロックした。より最近では、ＣＤ３７の発現が欠損した動物モデル（ＣＤ３７ノックアウト）による研究から、この動物からのＴリンパ球は、野生型動物からのＴリンパ球と比較して、コンカナバリンＡ活性化およびＣＤ３／Ｔ細胞受容体連結に反応して過剰増殖性であることが明らかにされた。したがって、細胞成長および増殖における機能的役割がテトラスパニンファミリーの一般的な特徴であることが提案された。肝芽腫および肝細胞癌の細胞による最近の研究から、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体とこれらの細胞の連結によりＥｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が導かれることが明らかにされた。このシグナル伝達経路は、細胞成長および増殖事象に関連することが示されている。平行研究において、ヒトＣＤ８１を過剰発現するトランスフェクション細胞株は、モックトランスフェクションされた対照細胞と比較して、増殖の増加を示した。したがって、利用可能な証拠から、細胞成長増殖および細胞接着／運動性に関連した事象における一般的なテトラスパニンの役割、および特にＣＤ６３の役割が指摘された。これらの２つのタイプの細胞の事象は、両方が腫瘍の進行および転移に中心的な役割を果たすので、現在これを標的として熱心に研究されている。
【００１２】
アミノ酸配列の決定および分析からは、テトラスパニンと他のタンパク質ファミリーとの間の相同性、または以前に特性を評価された任意の機能モジュールとの相同性は示されず、また以前から既知の任意の酵素の活性は示唆されなかった。その結果、シグナル伝達経路の調節におけるこのタンパク質ファミリーの役割を調べることは非常に困難であった。しかしながら、細胞生理における変化を導き、シグナル伝達経路の調節に密接に依存する、テトラスパニン特異的試薬を使用して得られた証拠から、テトラスパニンがシグナル伝達特性を有することが示唆される。ＣＤ６３は、それら自体が二次伝達シグナルの生成に関与する酵素であるか、またはそのような酵素と物理的および／または機能的に結合する多数の分子と、物理的および機能的の両方で結合することが示された。
【００１３】
内皮細胞とヒト好中球の相互作用（それらは炎症反応の最初のステップの１つである）を制御するメカニズムを細かに調べるためにデザインされた実験から、いくつかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３およびＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理は、培養内皮細胞層への好中球の接着を促進することが明らかにされた。更に、この効果はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）（多くの細胞内シグナル伝達経路の周知のモジュレーター）の存在に強く依存し、それは細胞が刺激抗体へ暴露される特定の期間に限定された。より長い抗体への暴露後には、内皮細胞への好中球の接着はＣａ２＋の後の追加に対して非感受性となり、したがって動的かつ一時的に調節された（一過性）事象に関係する。さらに、ＣＤ６３は、ＣＤ１１／ＣＤ１８タンパク質複合体と物理的に相互作用することが見出され、この複合体を特異的に標的とする試薬は修飾シグナルを仲介した。この研究において、ＣＤ６３は、酵素チロシンキナーゼＬｃｋおよびＨｃｋを含む複合体と物理的に結合するか、またはその一部であることもまた見出された。これらの酵素は、特異的な表面受容体の活性化に際して細胞内調節シグナルの仲介において中心的な役割を果たすタンパク質クラスのメンバーであり、細胞特異的な生理学的変化をもたらすシグナル伝達経路のカスケードの一部である。別の研究は、モノクローナル抗体とテトラスパニン（ＣＤ６３を含む）の共ライゲーションが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のコラーゲン基質への接着により誘導される酵素である接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化または活性を促進することを示唆した。このことは、インテグリンを介したチロシンキナーゼシグナル伝達経路の調節において、ＣＤ６３の（および他のテトラスパニンファミリーメンバーの）直接的な関与を示した。表面のＣＤ６３の存在および抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ７１０Ｆによるライゲーションと機能的に交差する他のシグナル伝達経路は、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（細胞内シグナル伝達経路の別の周知のモジュレーター）によるリン酸化の調節に依存するものであると思われる。この情況において、ＰＫＣの一時的な関与は決定的に示されなかったが、ＭＡｂ ７１０Ｆによる骨髄細胞株ＨＬ−６０における接着促進および形態変化は、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による細胞の前処理に依存した。しかしながら、独立したグループによる後の研究から、分子Ｒｏ３１−８２２０（この酵素の特異的阻害剤）がＰＭＡの効果をブロックしたので、ＰＭＡに誘導されたＨＬ−６０の分化がＰＫＣ活性依存性であることが実証された。
【００１４】
シグナル伝達経路と、ＣＤ６３および他のテトラスパニンファミリーメンバーの結合を支持するさらなる証拠は、チロシンホスファターゼ活性を備えたＣＤ６３（およびＣＤ５３も）分子の超分子複合体との間の直接的な物理的結合、またはその複合体の一部としての物理的結合のいずれかについて記述した研究から生じた。この研究において、抗ＣＤ６３抗体により単離された免疫沈降複合体はチロシンホスファターゼ活性に関連することが示されたが、ＣＤ５３（チロシンホスファターゼＣＤ４５と結合することが示された）と異なり、ＣＤ６３結合ホスファターゼを同定することは可能でなかった。より最近では、テトラスパニンファミリーのいくつかのメンバーは、ＩＩ型フォスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型ＰＩ４−Ｋ）とも結合することが見出された（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（５）：２５９５-８ （１９９７））。この相互作用は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１およびＡ１５／ＴＡＬＬＡについてのみ同定され、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２またはＮＡＧ−２で起こることは観察されなかったので、非常に特異的であると思われた。さらに、各ＰＩ−４キナーゼ含有複合体は単一のテトラスパニンファミリーメンバーに限定的だったので、テトラスパニンファミリーメンバーとＰＩ−４Ｋとの間の結合は相互に排他的であった。特にＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ複合体は、他のテトラスパニンメンバーにより形成された複合体とは異なり、脂質ラフト様ドメインの細胞内区画にほとんど完全に見出された。この観察は、ＰＩ−４キナーゼと相互作用することが見出されている、このＣＤ６３画分が、二次メッセンジャー分子としてのそれらの機能（Ｍａｒｔｉｎ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １４：２３１-６４ （１９９８））に加えて、フォスフォイノシチド生合成経路（膜輸送（エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス）、および細胞骨格再構成の調節におけるそれらの関与については周知である）に関連または依存する特異的な細胞内事象（Ｃｌａａｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（１１）：７９７４-８４ （２００１））に関与することを示唆した。
【００１５】
シグナル伝達経路の調節におけるすべての酵素（ＣＤ６３が直接結合することが今までに見出された）の直接的で重要な関与は、これらの酵素活性から下流の調節因子としてまたはエフェクター分子としての、ＣＤ６３とシグナル伝達経路の調節の関連性を支持するさらなる証拠を提供した。
【００１６】
腫瘍進行を導くメカニズムの解明は、しばしば明らかに矛盾する観察により示される非常に困難で複雑な試みであり、その結果、それらの観察が効果的な治療法にうまく変換されることはまれである。腫瘍の進行および転移ならびにシグナル伝達メカニズムとＣＤ６３の関連について現在公知であることを考慮して、その機能が腫瘍細胞において変化することはありえる。
【００１７】
認識抗原を発現する細胞を結合しそれ自体で腫瘍細胞に対する細胞傷害効果を備えた抗原特異的試薬、または他の分子を結合させた腫瘍細胞に対する細胞傷害効果を備えた抗原特異的試薬は、正常細胞集団に対する著しい有害効果なしに、癌細胞増殖および進行および転移を阻害するような細胞およびインビボの生理活性を有しており、これらの試薬の開発は可能な治療および／または診断ツールとして非常に有用だろう。
【００１８】
最近では、新しいデーターから正常細胞生理の調節におけるＣＤ６３の重要な作用様式が示され、改変された場合には、癌を含む病的な条件下での細胞挙動に重要な効果を有することが示されている。
【００１９】
乳癌細胞においてＣＤ６３の内部移行を引き起こすことが公知であるＭＡｂ抗体Ｆｃ−５．０１を、ヒト樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ６３の表面発現および内部移行のレベルを決定するために使用した（Ｍａｎｔｅｚａｚｚａ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｌｏｏｄ １０４（４）：１１８３-９０ （２００４））。ＣＤ６３は、エンドソームおよびリソソームのマーカーと一緒に共局在して、細胞表面および細胞内の両方に局在することが見出された。完全な形の抗体およびそのＦａｂフラグメントは、ＣＤ６３の内部移行を誘導することができた。同時に、Ｆｃ−５． ０１により促進されるＣＤ６３の内部移行は、β３またはＨＬＡ−ＩＩ分子の表面発現ではなく、いくつかのインテグリン分子、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ２９およびα５の表面発現低下をもたらした。走化性分析からの結果は、この抗体、およびタンパク質のテトラスパニンファミリーの他のメンバーを認識する他の抗体が、化学誘引物質に向かって膜バリアーを横切って移動した細胞数の増加を引き起こすことを明らかにした。これらの細胞（未成熟ＤＣ）において、酵母ファゴサイトーシス（それはβ１，３−グリカン受容体によって仲介される）には、テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ８１およびＣＤ８２またＨＬＡ−ＩＩ分子のレベルではなく、細胞表面ＣＤ６３のレベルの減少が付随した。一方、デキストランＦＩＴＣによって誘導される内部移行（それはマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）によって仲介される）は、ＣＤ６３表面発現の低下またはＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＨＬＡ−ＩおよびＨＬＡ−ＩＩ分子の発現低下をもたらさなかった。したがってβ１，３−グリカン受容体のデクチン−１の場合のように、ＣＤ６３は特異的受容体に時には物理的に結合し、内部移行イベントに参加するように思われる。いくつかのインテグリン分子の表面発現がＣＤ６３の抗体誘導性内部移行に際して低下するという事実は、そのようなＣＤ６３依存性事象が細胞表面受容体構成に有意な影響を及ぼすことができ、したがってＤＣ移動分析に対する効果によって示されるようなそのような細胞集団の生理に影響を及ぼすことができることもまた示唆する。
【００２０】
別の研究において、膜結合型メタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）の内部移行はＣＤ６３によって影響されることが見出された。この研究において、ＦＬＡＧタグ付加ＭＴ１−ＭＭＰは内部移行し、細胞表面レベルの減少が同時に起こる拡散した細胞質分布が得られた。クロルキン（ｃｈｌｏｒｑｕｉｎｅ）（既知のリソソームプロテイアーゼ（ｐｒｏｔｅｉａｓｅ）阻害剤）の追加は、細胞表面ＭＴ１−ＭＭＰのこの内部移行依存的消失を部分的に阻害し、同時に、ＭＴ１−ＭＭＰのＣＤ６３陽性内部顆粒型構造への結合を維持するような方法で内部移行依存性の細胞質分布を変化させた。ＭＴ１−ＭＭＰおよびＣＤ６３による細胞の共トランスフェクションはこのメタロプロテアーゼの細胞表面レベルの減少をもたらし、これらの分子の阻害剤（ＢＢ９４）がこの減少に対していかなる効果を持たないが、クロルキンは持っていたので、この減少はＭＭＰ活性の全体的なレベルに依存しなかった。この観察は、ＣＤ６３発現の増加がＭＴ１−ＭＭＰのターンオーバー／内部移行／分解を促進できることを示唆した。ＭＴ１−ＭＭＰの内部移行／分解の増加は、ＭＴ１−ＭＭＰとＣＤ６３との間の直接的な相互作用に依存した。このタイプの機能は、ＣＤ６３がアダプタータンパク質ＡＰ−２およびＡＰ−３のμ２およびμ３のサブウンビッツ（ｓｕｂｕｎｂｉｔｓ）と直接それぞれ相互作用し、エンドソームおよびリゾソームへのタンパク質選別に関与するという以前の観察によってさらに支持された。ＭＴ１−ＭＭＰの細胞質尾部がこの分子の内部移行のために重要であり、この事象は浸潤促進活性の調節において重要な役割を果たすこともまた以前に示された。ＭＴ１−ＭＭＰは悪性腫瘍細胞の浸潤においてもまた重要な役割を果たすと考えられる。したがって、ＭＴ１−ＭＭＰの全体的なレベルの調節は、ＣＤ６３との結合による相互作用および内部移行に依存しうる。
【００２１】
別の最近の出版（Ｘｕ ｅｔ ａｈ， Ｅｍｂｏ J２３（４）：８１ １-２２ （２００４））において、網膜変性に関与するショウジョウバエの眼に豊富な遺伝子についての遺伝学的スクリーニングにより、多数の遺伝子の中から「サングラス」（「ｓｕｎ」）と名付けられたテトラスパニン様分子が同定された。最も近縁の関連した哺乳類タンパク質はテトラスパニンＣＤ６３であった。そしてＣＤ６３への類似性で、免疫電子顕微鏡法により示唆されるように、「ｓｕｎ」はリゾソーム中に濃縮されることが見出された。この研究からの結果は、「ｓｕｎ」がＲｈ１シグナリングの正常なダウンレギュレーションに関与し、他のＧタンパク質共役型受容体に典型的なアレスチンが仲介するメカニズムから独立していることを示唆した。さらに、「ｓｕｎ」は活性化Ｒｈ１の通常のターンオーバーにおいて重要なだけではなく、およびこの事象に恐らく依存して、感桿分体の構造の維持において有意な効果もまた有しており、変異ハエにおける劇的なｓｕｎ依存性網膜変性をもたらす。これらのデーターはともに、タンパク質の正常輸送依存性ターンオーバーに哺乳類ＣＤ６３のこのホモログを密接に結び付け、その発現／機能における異常は生理学的異常をもたらす。
【００２２】
受容体内部移行におけるＣＤ６３の役割についての別の出版は、両方の分子で共トランスフェクションされたＣＯＳ細胞中で、このテトラスパニンと胃イオンポンプＨ，Ｋ−ＡＴＰアーゼのβ−サブユニットの共局在することについて記述した。この研究において、Ｈ，Ｋ−ＡＴＰアーゼβ−サブユニットの内部移行およびリゾソーム様細胞質顆粒状構造への局在がＣＤ６３発現依存性促進を受けることもまた見出された。
【００２３】
上で記述された研究からのすべてのデーターは、ＣＤ６３もまた、それらの内部移行およびリソソーム依存の分解に参加すること、したがって正常細胞生理の制御に参加することによって、細胞表面分子の正常なターンオーバーに関与していることを示唆した。したがって、ＣＤ６３のこの機能の操作が、癌などの病的状態において表面の発現または機能が改変または異常な細胞挙動に寄与する特異的分子または分子群の活性に依存する事象を制御する重要なツールとなることは可能である。
【００２４】
最近まで、抗ＣＤ６３の抗体、またはＣＤ６３発現細胞を特異的に標的とした他の試薬が、腫瘍細胞のインビトロおよびインビボの増殖特性に対して、およびさらに腫瘍増殖の動物モデルの生存に対して、同時効果を有することは報告されていない。公開された米国特許出願第１０／８１０，７５１号は、ヒト癌細胞に対するインビトロおよびインビボの有効性を示す、２つのそのような抗ＣＤ６３抗体を開示する。
【００２５】
癌治療法としてのモノクローナル抗体：癌を持つ各個人は特有であり、その個人同一性と同様に、他の癌とは異なる癌に罹患している。にもかかわらず、現在の療法は、同じ病期の同じタイプの癌に罹患するすべての患者を、同じ方法で治療する。これらの患者の少なくとも３０％は第一選択療法に失敗し、したがって治療のさらなる繰り返し、ならびに治療の失敗、転移および最終的には死の可能性の増加へ結びつくだろう。治療に対する優れたアプローチは、特定の個人のために治療法をカスタム化することであろう。カスタム化に適している唯一の現在の療法は手術である。化学療法および放射線処理は患者に対して特別あつらえにはできず、手術単独は、ほとんどの場合には、治癒をもたらすには不適切である。
【００２６】
モノクローナル抗体の出現により、各抗体は単一のエピトープに向けることができるので、カスタム化療法のための方法の開発の可能性はより現実的になった。更に、特異的に特定の個人の腫瘍を定義するエピトープの立体配座に向けられる抗体の組合せを生ずることは可能である。
【００２７】
癌細胞と正常細胞との間の有意差が、癌細胞が形質転換細胞に特異的な抗原を含むとことであると認識されており、科学界では、モノクローナル抗体はこれらの癌抗原に特異的に結合することによって形質転換細胞を特異的に標的とするようにデザインできると長年考えられ、したがって癌細胞を除去する「特効薬」としてモノクローナル抗体が貢献できるという確信を生ずる。しかしながら、単一のモノクローナル抗体は癌のすべての実例において役に立つことができず、モノクローナル抗体が、クラスとしての標的化された癌治療として展開させることができることは今や広く認識される。開示された本発明の教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば全身腫瘍組織量を減少させることによって、患者に対して有益な方法で癌性疾患プロセスを修飾することが示されており、本明細書において癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体と様々に呼ばれるだろう。
【００２８】
現在では、癌患者は、通常少数の治療の選択肢しか持っていない。癌治療法に対する統制されたアプローチにより、生存率および罹患率の世界的な改善がもたらされた。しかしながら、特定の個人にとっては、これらの統計的な改善は必ずしも個人的状況の改善と相関しない。
【００２９】
したがって、実施者が同じコホート中の他の患者から独立して各腫瘍を治療することを可能にする方法が提出されたならば、これは、ただその１人に対する治療法を特別あつらえにするユニークなアプローチを可能にするだろう。治療法のそのような過程は、理想的には、治癒率を増加させてよりよい転帰を生じ、その結果として長年にわたる必要性を満たす。
【００３０】
歴史的には、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌の治療の限定的な成功で使用されている。リンパ腫および白血病はヒト血漿により治療されたが、長期の寛解または奏効はほとんどなかった。更に、再現性は欠如しており、化学療法と比較して追加の利益はなかった。乳癌、メラノーマおよび腎細胞癌などの固形腫瘍もまた、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿およびウマ血清により治療され、同様に予測不能および効果がない結果であった。
【００３１】
固形腫瘍のためのモノクローナル抗体について多くの臨床試験が行なわれた。１９８０年代には、特異的な抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を使用するヒト乳癌についての少なくとも４つの臨床試験が行なわれ、その臨床試験は少なくとも４７人の患者からただ１人の奏効した患者を生じた。シスプラチンとの組合せでヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））を使用する成功した臨床試験は１９９８年までなかった。この試験において、３７人の患者の奏効について評価され、そのうちの約４分の１には部分奏効率があり別の４分の１にはわずかなまたは安定した疾患進行があった。奏効患者の中での進行までの期間の中央値は８．４か月であり、奏効持続期間の中央値は５．３か月であった。
【００３２】
ハーセプチン（登録商標）はタキソール（登録商標）との組合せにおいて第一選択使用のために１９９８年に承認された。臨床試験結果から、タキソール（登録商標）単独（３．０か月）を投与された群と比較して、抗体療法プラスタキソール（登録商標）（６．９か月）を投与された患者についての疾患進行までの期間の中央値が増加することが示された。生存の中央値もまたわずかに増加し、ハーセプチン（登録商標）プラスタキソール（登録商標）治療群ｖｓタキソール（登録商標）単独治療群については２２か月ｖｓ１８か月であった。さらに、抗体プラスタキソール（登録商標）組合せ群において、タキソール（登録商標）単独に比較して、完全に奏効した患者（８％ｖｓ２％）および部分的に奏効した患者（３４％ｖｓ１５％）の数は増加した。しかしながら、ハーセプチン（登録商標）とタキソール（登録商標）による治療は、タキソール（登録商標）治療単独と比較して、心臓毒性の発生率はより高かった（それぞれ１３％ｖｓ１％）。さらに、ハーセプチン（登録商標）治療法は、ヒト表皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）（現在のところ既知の機能または生物学的に重要なリガンドがない受容体）を過剰発現する患者（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によって決定された）、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５％にのみ効果的であった。したがって、乳癌患者についての満たされていないニーズがまだ多くある。ハーセプチン（登録商標）治療が役立つ患者でさえまだ化学療法を必要とし、従って少なくともある程度はこの種の治療の副作用にまだ取り組まなければならない。
【００３３】
結腸直腸癌を研究する臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質の標的の両方に対する抗体に関与している。１７−１Ａなどの抗体（それらは腺癌についてのある程度の特異性がある）は、６０人以上の患者において第２相臨床試験を行ない、１人の患者に部分奏効があった。他の試験において、１７−１Ａの使用は、追加のシクロホスファミドを使用するプロトコールにおいて、５２人の患者の間でただ１人の完全奏効および２人のわずかな奏効を生じた。現在までに、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＩＩＩ期結腸癌のためのアジュバント療法として改善された有効性を示していない。最初にイメージングのために承認されたヒト化マウスモノクローナル抗体の使用もまた腫瘍退縮をもたらさなかった。
【００３４】
ごく最近になって、モノクローナル抗体の使用による結腸直腸癌の臨床試験から陽性の結果が得られた。２００４年に、エルビタックス（ＥＲＢＩＴＵＸ）（登録商標）は、イリノテカンベースの化学療法に対して抵抗性のあるＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌に罹患する患者の第二選択治療のために承認された。２群第ＩＩ相臨床試験および単群試験からの両方の結果は、イリノテカンによる組合せにおいてＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）は、それぞれ２３％および１５％の奏効率で、それぞれ４．１か月および６．５か月の疾患進行までの期間の中央値を示した。同じ２群第ＩＩ相臨床試験および別の単群試験からの結果は、エルビタックス（登録商標）単独による治療は、それぞれ１１％および９％の奏効率で、それぞれ１．５か月および４．２か月の疾患進行までの期間の中央値をもたらすことを示した。
【００３５】
従ってスイスおよび米国の両方において、イリノテカンとの組合せにおけるエルビタックス（登録商標）治療、および米国においてエルビタックス（登録商標）単独治療が、第一選択イリノテカン療法の効果のなかった結腸癌患者の第二選択治療として承認された。したがって、ハーセプチン（登録商標）のように、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体および化学療法の組合せとしてのみ承認される。さらに、スイスおよび米国の両方における治療は、第二選択治療法としての患者のためにのみ承認される。さらに２００４年に、アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（登録商標）は、転移性結腸直腸癌の第一選択治療として、静脈投与の５−フルオロウラシルベースの化学療法との組合せにおける使用のために承認された。第ＩＩＩ相臨床試験の結果は、アバスチン（登録商標）プラス５−フルオロウラシルで治療された患者の生存の中央値は、５−フルオウロウラシル（ｆｌｕｏｕｒｏｕｒａｃｉｌ）単独で処理された患者と比較して延長されることを示した。（それぞれ２０か月ｖｓ１６か月）。しかしながら、再びハーセプチン（登録商標）およびエルビタックス（登録商標）のように、治療はモノクローナル抗体および化学療法の組合せとしてのみ承認される。
【００３６】
そこでは同様に、引き続き肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌および胃癌については成績不良である。非小細胞肺癌のための最も有望な最近の結果は、化学療法剤タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）との組合せで、細胞殺傷薬のドキソルビシンへコンジュゲートしたモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗シアリルルイスＸ）を含む治療の第ＩＩ相臨床試験からのものである。タキソテール（登録商標）は、肺癌の第二選択治療のためにＦＤＡに承認された唯一の化学療法である。初期のデーターから、タキソテール（登録商標）単独と比較して、全体的な生存の改善が示される。試験に組み入れられた６２人の患者のうち、３分の２はタキソテール（登録商標）との組合せでＳＧＮ−１５を投与されたが、残りの３分の１はタキソテール（登録商標）単独を投与された。タキソテール（登録商標）との組合せでＳＧＮ−１５を投与される患者については全体的な生存の中央値は７．３か月であり、比較のタキソテール（登録商標）単独を投与された患者については５．９か月であった。全体的な生存が１年および１８か月であるものは、ＳＮＧ−１５プラスタキソテール（登録商標）を投与された患者についてはそれぞれ２９％および１８％であり、比較してタキソテール（登録商標）単独を投与された患者についてはそれぞれ２４％および８％であった。さらなる臨床試験が計画される。
【００３７】
前臨床的にはメラノーマのためのモノクローナル抗体の使用はある程度の限定的な成功を収めた。これらの数少ない抗体は臨床試験に到達し、現在までにどの抗体も、承認されないか、または第ＩＩＩ相臨床試験において好ましい結果を実証していない。
【００３８】
疾患を治療する新薬の開発は、明確に疾患病因に寄与する３０，０００の既知の遺伝子の産物の中の関連する標的の同定が欠如することによって妨げられる。腫瘍学研究において、可能性のある薬物標的は、単にそれらが腫瘍細胞で過剰発現されるという事実に起因してしばしば選択されている。したがって次に同定された標的は、多くの化合物との相互作用についてスクリーニングされる。可能性のある抗体療法の場合では、これらの候補化合物は、通常Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって規定された根本原理に従うモノクローナル抗体作製の従来の方法に由来する（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５-４９７， Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）。脾臓細胞を、抗原（例えば全細胞、細胞画分、精製抗原）により免疫されたマウスから回収し、不死化ハイブリドーマパートナーと融合する。結果として生じるハイブリドーマをスクリーニングし、標的へ最も強く結合する抗体の分泌を選択する。ハーセプチン（登録商標）およびリツキシマブを含む、癌細胞に対して向けられる多くの治療用抗体および診断用抗体がこれらの方法を使用して作製され、それらの親和性に基づいて選択された。この戦略における欠点は２点ある。第１に、治療用抗体または診断用抗体結合のために切な標的の選択は、組織特異的発癌プロセスを取り巻く知識の不足、および過剰発現による選択などの結果的に単純化されたこれらの標的を同定する方法により限定的である。第２に、最大の親和性で受容体と結合する薬物分子が、通常シグナルの開始または阻害に対して最高の可能性を持つという仮定は、必ずしもそうだとは限らない。
【００３９】
乳癌および結腸癌の治療のある程度の進歩にもかかわらず、単一薬剤または併用治療のいずれかとして有効な抗体療法の同定および開発は、すべてのタイプの癌について不十分であった。
【００４０】
特許文献１は、患者の腫瘍からの細胞を、患者からの細胞または組織からクローニングされるＭＨＣ遺伝子によりトランスフェクションするプロセスを開示する。次にトランスフェクションされた細胞は患者をワクチン接種するために使用される。
【００４１】
特許文献２は、外部成分へではなく哺乳類の新生細胞および正常細胞の内部細胞成分へ特異的なモノクローナル抗体を得る工程と、モノクローナル抗体を標識する工程と、新生細胞を殺傷する療法を受けた哺乳類の組織と標識抗体を接触させる工程と、変性新生細胞の内部細胞成分に対する標識抗体の結合の測定によって、治療法の実効性を決定する工程を含むプロセスを開示する。ヒト細胞内抗原に向けられる抗体の調製において、特許権所有者は、悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。
【００４２】
特許文献３は新規抗体およびその産生のための方法を提供する。具体的には、ヒト腫瘍（例えば結腸腫瘍および肺腫瘍）に関連したタンパク質抗原に強く結合するが、正常細胞に非常に少ない程度で結合する特性を有するモノクローナル抗体の形成を、この特許は教示する。
【００４３】
特許文献４は、ヒト癌患者からの外科的に腫瘍組織を除去することと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処理することと、生存可能であるが非腫瘍形成性であるように腫瘍細胞を照射することと、原発腫瘍の再発を阻害し、同時に転移を阻害することができる患者用ワクチンを調製するためにこれらの細胞を使用することを含む癌治療法の方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。第４カラムの４５行、以下参照に示すように、特許権所有者は、ヒト新生物におけるモノクローナル抗体発現活性特異的免疫療法の開発において自発性腫瘍細胞を利用する。
【００４４】
特許文献５は、ヒト癌に特有であり起源の上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示する。
【００４５】
特許文献６は、Ｈｅｒ２発現細胞においてアポトーシスを誘導する抗Ｈｅｒ２の抗体、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、抗体を使用する癌を治療する方法および該抗体を含む医薬組成物を記述する。
【００４６】
特許文献７は、腫瘍および非腫瘍組織源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新しいハイブリドーマ細胞株について記述する。
【００４７】
特許文献８は、所望される抗原に対して特異的な抗体を産生するヒトリンパ球を産生する方法、モノクローナル抗体を産生する方法に加えて、この方法により産生されたモノクローナル抗体を記述する。この特許は、癌の診断および治療のために有用な抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生を特に記述する。
【００４８】
特許文献９は、ヒト癌細胞と反応性の抗体、抗体フラグメント、抗体複合体および一本鎖イムノトキシンに関する。これらの抗体が機能するメカニズムは、この分子がヒト癌の表面上に存在する細胞膜抗原と反応性である点、およびさらに抗体が癌細胞内に内部移行し、続いて結合する能力を持つ点、の２点であり、それらを抗体−薬物および抗体−毒素コンジュゲートの形成のために特に有用にする。それらの非修飾形態では、抗体は、同様に特定濃度での細胞傷害特性を示す。
【００４９】
特許文献１０は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかしながら、この抗体は老齢哺乳類からの抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見出される自然抗体の１タイプであるといわれる。自己抗体が「老齢哺乳類」から生ずるので、自己抗体が治療されている患者から実際に生ずる必要はない。さらに、この特許は、老齢哺乳類からの天然およびモノクローナルの抗核自己抗体、ならびにモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
【００５０】
特許文献１１は、２つの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体の使用、およびヒト乳癌、前立腺癌、膵臓癌およびメラノーマ癌の細胞に対するそれらのインビトロおよびインビボの有効性を開示する。
【００５１】
特許文献１２は、内部移行する癌細胞表面抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を選択するための方法、ならびに細胞代謝に対する抗転写効果および／または抗複製効果を有するモノクローナル抗体の同定のための方法を教示する。一例として、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５およびＷＭ９８３メラノーマ細胞ならびにＳＷ９４８結腸直腸癌細胞において内部移行することが示された。さらに、ＭＥ４９１抗体はＳＷ９４８細胞において、転写および細胞増殖を低下させることが示された。特許文献１３（およびその関連出願：ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）は、ＣＤ６３抗原を含む群のうちから選択される卵巣腫瘍マーカー遺伝子によりコードされた卵巣腫瘍マーカーポリペプチドを結合する抗体で、卵巣腫瘍の増殖または転移を阻害する方法を記述する。卵巣癌を使用する遺伝子発現の連続分析が、卵巣腫瘍マーカー遺伝子を同定して候補としてＣＤ６３を同定するために行なわれた。特許文献１４（およびその関連出願ＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を記述する。特許文献１５は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を記述する。特許文献１６は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を記述する。特許文献１７は、新しいポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を記述する。これらの特許および特許出願はＣＤ６３の抗原および抗体を同定するが、本発明の単離モノクローナル抗体、または本発明の単離モノクローナル抗体の有用性は開示しない。
【００５２】
ＭＥ４９１ポリペプチド抗原をコードする遺伝子はクローニングされ、配列は１９８８年２月２４日に出版のために受理され（非特許文献１）；ＣＤ６３をコードする遺伝子はクローニングされ、配列は１９９１年２月に出版され（非特許文献２）、その出版物は明確にＣＤ６３とＭＥ４９１の同一性を示した。
【００５３】
特許文献１８（配列番号：８９、優先出願日：２００４年６月２９日）、特許文献１９（配列番号：１、優先出願日：２００３年２月１３日（２００３ＷＯ−ＥＰＯＯ１４６１）；他の優先日：２００２年２月１４日（２００２ＧＢ−００００３４８０））、特許文献２０（配列番号：４０、優先出願日：２００２年１２月３０日（２００２ＷＯ−ＵＳ０４１７９８）；他の優先日：２００２年１月０２日（２００２ＵＳ−０３４５４４４Ｐ））のすべては、ＣＤ６３に１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５４】
特許文献２１（配列番号：９７８７および１２１０１、優先出願日：２００２年８月１４日（２００２ＷＯ−ＵＳ０２５７６５）；他の優先日：２００１年８月１４日（２００１ＵＳ−０３１２１４７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２３７アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５５】
特許文献２２（配列番号：２７、優先出願日：２００３年２月１８日（２００３ＷＯ−ＵＳ００４９０２）；他の優先日：２００２年２月２０日（２００２ＵＳ−０３５８２７９Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２２４アミノ酸と９４％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５６】
特許文献２３（配列番号：４１６８および４９１３、優先出願日：２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの２０５アミノ酸および９４のアミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドをそれぞれ記述する。
【００５７】
特許文献２４（赤痢菌ｏｓｐＧ＃２６のためのヒト獲物タンパク質、優先出願日：２００２年１月１１日（２００２ＷＯ−ＥＰ０００７７７）；他の優先日：２００１年１月１２日（２００１ＵＳ−０２６１１３０Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１３０アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５８】
特許文献２５（配列番号：７５６、優先出願日：２０００年３月８日（２０００ＷＯ−ＵＳ００５９１８）；他の優先日：１９９９年３月１２日（９９ＵＳ−０１２４２７０Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１２７のアミノ酸と９９％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００５９】
特許文献２６（配列番号：３２０３、優先出願日：２００１年６月７日（ＷＯ−ＵＳＯ ２００１年１８５６９）；他の優先日：２０００年６月７日（２０００ＵＳ−０２０９４６７Ｐ））ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１３２アミノ酸と９７％の配列相同性があるポリペプチドを記述する。
【００６０】
特許文献２７（ヒトＣＤ６３タンパク質からの大きな細胞外ループ配列、優先出願日：１９９９年６月１５日（９９ＷＯ−ＵＳ０１３４８０）；他の優先日：１９９８年６月１５日（９８ＵＳ−００８９２２６Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの９９アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６１】
特許文献２８（配列番号：１２０７、優先出願日：２００２年３月０５日（２００２ＷＯ−ＵＳ００５０９５）；他の優先日：２００１年３月０５日（２００１ＵＳ−００７９９４５１））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの１０２アミノ酸と８６％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６２】
特許文献２９（配列番号：４１６９、２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含む２３８アミノ酸のうちの７４アミノ酸と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを記述する。
【００６３】
これらの特許出願は、ＣＤ６３抗原に対して相同性がある可変配列を有するポリペプチドを同定する。たいていの場合では、これらの出願は、同様に対応するポリペピド（ｐｏｌｙｐｅｐｉｄｅ）およびそれらのホモログに対する抗体および抗体誘導体を記述するが、本発明の単離モノクローナル抗体、またはヒト肺癌、前立腺癌および結腸癌もしくは他のヒト癌の治療のための本発明の単離モノクローナル抗体の有用性を開示しない。重要なことには、上記のすべての出願は、ＣＤ６３をコードするポリヌクレオチドの配列の出版後に出願された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６４】
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号
【特許文献２】米国特許第４，８６１，５８１号
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号
【特許文献１１】米国特許出願第１０／８１０，７５１号
【特許文献１２】米国特許第５，２９６，３４８号
【特許文献１３】特許出願ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１
【特許文献１４】特許出願ＷＯ０２０５５５５１Ａ１
【特許文献１５】特許出願ＣＮ１３２６９６２Ａ
【特許文献１６】特許出願ＣＮ１３２６９５１Ａ
【特許文献１７】特許出願ＣＮ１３５１０５４Ａ
【特許文献１８】ＷＯ２００４０４１１７０．８９
【特許文献１９】ＷＯ２００３０６８２６８−Ａ２
【特許文献２０】ＷＯ２００３０５７１６０−Ａ２９
【特許文献２１】ＷＯ２００３０１６４７５−Ａ２
【特許文献２２】ＷＯ２００３０７０９０２−Ａ２
【特許文献２３】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【特許文献２４】ＷＯ２００２５７３０３−Ａ２
【特許文献２５】ＷＯ２０００５５１８０−Ａ２
【特許文献２６】ＷＯ２００２００６７７−Ａ１
【特許文献２７】ＷＯ９９６６０２７−Ａ１
【特許文献２８】ＷＯ２００２７０５３９−Ａ２
【特許文献２９】ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
【非特許文献】
【００６５】
【非特許文献１】Ｃａｎ Ｒｅｓ ４８：２９５５， １９８８， Ｊｕｎｅ １
【非特許文献２】ＪＢＣ ２６６（５）：３２３９-３２４５， １９９１
【発明の概要】
【００６６】
本願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための米国特許第６，１８０，３５７号で教示されるような患者特異的な抗癌抗体を産生する方法を利用する。これらの抗体は特異的に１つの腫瘍について作製され、したがって癌治療法のカスタム化を可能にできる。本願の文脈内で、細胞殺傷（細胞傷害性）特性または細胞増殖阻害（細胞静止）特性のいずれかを有する抗癌抗体は、今後細胞傷害性と呼ばれる。これらの抗体は癌の病期分類および診断の補助のために使用でき、腫瘍転移を治療するために使用できる。これらの抗体は、予防的治療として癌の予防のためにも使用できる。従来の創薬パラダイムに従って産生された抗体とは異なり、このように産生された抗体は、悪性組織の増殖および／または生存に必須であると以前に示されない分子および経路を標的とできる。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性相互作用でない細胞傷害性事象の開始のための必要条件に適合する。同様に、本発明のＣＤＭＡＢと、標準の化学療法の形態（例えば放射性核種）をコンジュゲートすることは本発明の範囲内にあり、その結果として、該化学療法の使用を集中させる。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞傷害性部分、酵素（例えばビオチン複合酵素）または造血性細胞にコンジュゲートすることもでき、それによって抗体コンジュゲートを形成する。
【００６７】
個別化された抗癌治療の可能性は、患者の管理法に変化をもたらすだろう。起こり得る臨床シナリオは、腫瘍サンプルは提示される時に得られて保存されるということである。このサンプルから、腫瘍は、癌性疾患修飾抗体の既存のパネルから分類することができる。患者は慣例通りに病期分類されるが、利用可能な抗体は患者の病期分類においてさらに使用できる。患者は既存の抗体により直ちに治療することができ、腫瘍に特異的な抗体のパネルは、本明細書において概要を述べられた方法を使用して、または本明細書において開示されたスクリーニング方法を併用するファージディスプレーライブラリーの使用によって、のいずれかで作製できる。治療されている腫瘍と同じエピトープのいくつかを、他の腫瘍が持つ可能性があるので、すべての産生された抗体は抗癌抗体のライブラリーに追加されるだろう。この方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する多数の患者において癌性疾患を治療するのに有用かもしれない。
【００６８】
抗癌抗体に加えて、患者は、治療の多様なレジメンの一部として現在推奨される療法を受けることを選択できる。本方法を介する単離抗体が非癌性細胞に対して比較的毒性がないという事実は、単独または従来の治療法との併用のいずれかで、高用量で抗体を組合せる使用を可能にする。高い治療指数は、治療耐性細胞の出現の可能性を低下させように、短時間スケールの再治療もまた可能にするだろう。
【００６９】
患者が治療法の初期の過程に対して抵抗性があるか、または転移が発生する場合、腫瘍に対して特異的な抗体を産生するプロセスは、再治療のために繰り返すことができる。更に、抗癌抗体はその患者から得られた赤血球にコンジュゲートすることができ、転移の治療のために再注入できる。転移癌に効果的な治療はほとんどなく、転移は通常悪い転帰の前兆となり、結果的に死をもたらす。しかしながら転移癌では通常かなり血管が発達しており、赤血球による抗癌抗体の送達は腫瘍の部位に抗体を集中させる効果を持ちうる。転移以前でさえも、大部分の癌細胞は生存のために宿主の血液供給に依存しており、赤血球にコンジュゲートした抗癌抗体はその場で腫瘍に対して同様に効果的でありえる。あるいは、抗体は、他の造血性細胞（例えばリンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞など）にコンジュゲートしてもよい。
【００７０】
５つのクラスの抗体があり、各抗体は重鎖により付与される機能に関連している。一般に、そのままの抗体による癌細胞の殺傷は、抗体依存性細胞性細胞傷害または補体依存性細胞傷害のいずれかを介して仲介されると考えられる。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は補体系のＣ−１成分の結合によって、ヒト補体を活性化することができ、それによって腫瘍溶解をもたらすことができる補体活性化の古典経路を活性化する。ヒト抗体については、最も効果的な補体活性化抗体は一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球および特定のリンパ球によって細胞殺傷をもたらすＦｃ受容体を有する細胞傷害性細胞を動員する時に効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプの両方のヒト抗体はＡＤＣＣを仲介する。
【００７１】
抗体を仲介する癌殺傷の別の可能なメカニズムは、細胞膜およびそれに結合した糖タンパク質または糖脂質において様々な化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体（いわゆる触媒抗体）の使用によるものでありえる。
【００７２】
抗体を介した癌細胞殺傷には、３つの付加的なメカニズムがある。第１は、癌細胞上に存在する推定上の抗原に対する免疫反応を生ずるように生体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖受容体を標的としそれらの機能を妨害するか、またはその機能が効果的に失われるようにその受容体をダウンレギュレートする抗体の使用である。第３は、ＴＲＡＩＬ Ｒ１またはＴＲＡＩＬ Ｒ２などの死受容体のライゲーションまたはαＶβ３などのインテグリン分子および同種のもののような直接的な細胞死をもたらす細胞表面部分の直接的なライゲーションに対するそのような抗体の効果である。
【００７３】
制癌剤の臨床的有用性は、患者に対する許容リスクプロフィール下の薬物の利益に基づく。癌治療法において、生存は一般に最も必要とされる利益だったが、生命の延長に加えて、多数の他のよく認識された利益がある。治療が生存に不利に影響しない場合、これらの他の利益は、病徴緩和、有害事象に対する防御、再発または無病生存までの期間の延長、および進行までの期間の延長を含んでいる。これらの基準は一般に容認され、アメリカ食品薬品局（Ｆ． Ｄ． Ａ．）などの規制団体は、これらの利益を生ずる薬物を承認する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ/Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２： １３７-１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、利益のこれらのタイプを予測できる他のエンドポイントがあることはよく認識される。ひとつには、米国Ｆ． Ｄ． Ａ．によって承諾された迅速承認プロセスは、患者利益を予測するようなサロゲートがあることを認める。２００３年末の時点で、このプロセス下で承認された１６の薬物があり、これらののうちの４つの薬物は完全承認へ進み、すなわち、フォローアップ試験はサロゲートエンドポイントによって予測されるような直接的な患者利益を実証した。固形腫瘍における薬物効果の決定ための重要な１つのエンドポイントは、治療に対する奏効の測定による全身腫瘍組織量の評価である（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（３）：２０５-２１６ ２０００）。そのような評価のための臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、固形腫瘍ワーキンググループにおける奏効評価基準（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（癌の国際的専門家グループ）によって発布された。全身腫瘍組織量に対する実証された効果を有する薬物は、ＲＥＣＩＳＴ基準に従う客観的奏効によって示されるように、適切な対照群と比較して直接的な患者利益を最終的に生ずる傾向がある。前臨床設定において、全身腫瘍組織量は評価および立証することが一般により簡単である。前臨床試験を臨床設定へ移すことができるという点で、前臨床モデルにおいて生存延長を生ずる薬物は、最も高い期待される臨床的有用性を有する。臨床治療に対する陽性奏効を生ずることと類似して、前臨床設定において全身腫瘍組織量を減少させる薬物は、その疾患に有意な直接的な効果もまた有することができる。生存の延長は制癌剤治療からの最も必要とされる臨床転帰であるが、臨床的有用性を持つ他の利益が存在し、全身腫瘍組織量の減少（それは疾患進行の遅延、生存の延長または両方に相関する）が、直接的な利益をもたらし、臨床効果を有することもまた明らかである。（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． 発展的治療：標的化化合物の臨床試験デザインの成功および失敗（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）；ＡＳＣＯ教養書（Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ）、第３９回年次会議、２００３年、２０９〜２１９ページ）。
【００７４】
本発明は、細胞傷害性分析、およびヒト癌の動物モデルにおける効果によって同定された、ＡＲ７５Ａ１０５．８の開発および使用について記述する。本発明は、特異的にＣＤ６３分子上に存在する１つまたは複数のエピトープに結合し、さらにそのままの抗体として正常細胞ではなく悪性腫瘍細胞に対するインビトロの細胞傷害特性を有し、それはさらにそのままの抗体として直接腫瘍増殖の阻害を仲介する試薬について記述する。さらなる進歩は、腫瘍増殖阻害を達成するために、同種抗原マーカーを発現する標的腫瘍および癌治療の他の陽性のエンドポイントへのこのような抗癌抗体の使用である。
【００７５】
すべてにおいて、本発明は、投与した場合に、哺乳類において抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させることができる治療剤のための標的としてのＡＲ７５Ａ１０５．８抗原の使用を教示する。本発明は、哺乳類において抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させるために、それらの抗原を標的とする、ＣＤＭＡＢ（ＡＲ７５Ａ１０５．８）、およびそれらの誘導体、およびその抗原結合フラグメント、および細胞性細胞傷害を誘導するそのリガンドの使用もまた教示する。更に、本発明は、診断、治療法の予測、およびこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の予後のために有用な癌細胞のＡＲ７５Ａ１０５．８抗原の検出の使用もまた教示する。
【００７６】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞株ならびに該ハイブリドーマ細胞株がコードする対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離するために、特定の個人に由来する癌細胞または１つまたは複数の特定の癌細胞株に対して作製された癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）（このＣＤＭＡＢは癌細胞について細胞傷害性であるが、同時に非癌細胞に対して比較的毒性がない）を産生するための方法を利用することである。
【００７７】
本発明の追加の目的は、癌性疾患修飾抗体、リガンドおよびその抗原結合フラグメントを教示することである。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、細胞傷害が抗体依存性細胞毒性を介して仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００７９】
さらに本発明の追加の目的は、細胞傷害が補体依存性細胞毒性を介して仲介される癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８０】
さらに本発明のさらなる目的は、細胞傷害が細胞の化学結合の加水分解を触媒する能力の機能である、癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８１】
本発明のさらにさらなる目的は、癌の診断、予後およびモニターのための結合分析のために有用な癌性疾患修飾抗体を産生することである。
【００８２】
本発明の他の目的および利点は、実例および実施例として本発明の特定の実施形態が示される以下の記述から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
特許または出願ファイルは、カラーで実施された少なくとも１つの図面を含む。１つまたは複数のカラー図面を備えたこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払いと同時に官庁によって提供される。
【図１】細胞株のＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＭＢ−２３１およびＨｓ８８８．Ｌｕに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害のパーセンテージおよび結合レベルを比較した図である。
【図２】細胞傷害分析における、ＡＲ７５Ａ１０５．８ｖｓ陽性対照および陰性対照を比較した図である。
【図３】癌細胞株および正常細胞株に対するＡＲ７５Ａ１０５．８および抗ＥＧＦＲの対照の結合を表わした図である。データーは、アイソタイプ対照を上回って何倍増加したかとして平均蛍光強度を示すように作表される。
【図４】いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に対して向けられたＡＲ７５Ａ１０５．８抗体および抗ＥＧＦＲ抗体の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを含む図である。
【図５】予防的Ｌｏｖｏ結腸癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＡＲ７５Ａ１０５．８の効果を実証した図である。垂直の破線は、抗体が投与された期間を示す。データーポイントは平均＋／−標準誤差を表わす。
【図６】予防的Ｌｏｖｏ結腸癌モデルにおいて、体重に対するＡＲ７５Ａ１０５．８の効果を実証した図である。データーポイントは平均＋／−標準誤差を表わす。
【図７】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（レーン１）およびＢｘＰＣ−３（レーン４）細胞株の全膜画分ならびにＰＣ−３（レーン２）およびＣＣＤ−２７ｓｋ（レーン３）細胞株の全細胞溶解物から得られたサンプルのウエスタンブロットを示した図である。ブロットは抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８および１Ａ２４５．６をプローブとした。
【図８】７ＢＤ−３３−１１Ａ（レーン１）、ＡＲ７５Ａ１０５．８（レーン２）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（レーン３）との免疫沈降によって調製された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の全膜画分からの免疫複合体のウエスタンブロットを示した図である。重複したブロットは、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（左側パネル）、抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８（中央パネル）およびＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（右側パネル）をプローブとした。
【図９】ヒト組換え融合コンストラクトＧＳＴ−ＥＣ２（ＣＤ６３）のウエスタンブロットを示した図である。ブロットの各々のレーンは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（レーン２）、Ｈ４６０−２２−１（レーン３）、１Ａ２４５．６（レーン４）、７ＢＤＩ−５８（レーン５）、７ＢＤＩ−６０（レーン６）、ＡＲ５１Ａ９９４．１（レーン７）、ＡＲ７５Ａ １０５．８（レーン８）、ならびに陰性対照Ｈ４６０−１６−２（抗ＣＤ４４；レーン１）およびアイソタイプ対照抗体（レーン９、１０）をプローブとした。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
一般に、以下の単語または語句は、要約、記述、実施例、請求項に使用された場合、示された定義を有する。
【００８５】
用語「抗体」は最も広い意味に使用され、例えば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、および中和抗体、脱免疫化抗体、マウス抗体、キメラ化抗体またはヒト化抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を備えた抗体組成物、一本鎖抗体、免疫コンジュゲートおよび抗体のフラグメントを具体的には包含する（以下参照）。
【００８６】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量で存在できる天然に存在する可能な変異を除いて同一である。単一抗原部位に対して向けられるモノクローナル抗体は非常に特異的である。更に、ポリクローナル抗体調製品（それらは異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む）とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して向けられるものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずに合成されるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に抗体の均質集団から得られるような抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすることとして解釈することができない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al． ， Nature， ２５６：４９５ （１９７５）によって最初に記述された、ハイブリドーマ（マウスまたはヒト）法によって作製できるか、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製できる。例えば、「モノクローナル抗体」は、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４-６２８ （１９９１） ａｎｄ Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２：５８１ -５９７ （１９９１）中に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリーからもまた単離できる。
【００８７】
「抗体フラグメント」は、抗原結合またはその可変領域を好ましくは含む、完全な形の抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例は、全長抗体よりも小さい、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ 、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直線状抗体；一本鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成された一本鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質および多重特異性抗体を含んでいる。
【００８８】
「完全な形の」抗体は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２ およびＣＨ３に加えて抗原を結合する可変領域も含む１つである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異型でありえる。好ましくは、完全な形の抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００８９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な形の抗体は異なる「クラス」に割り当てることができる。５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）の完全な形の抗体があり、これらのうちのいくつかのものは、「サブクラス」（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２）の中へさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する、重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００９０】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因するそれらの生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション、などを含む。
【００９１】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞仲介性反応を指す。ＡＤＣＣの仲介ための一次細胞（ＮＫ細胞）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｒａｍ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７-９２ （１９９１）の４６４ページの表３中に要約される。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号中に記載されるようなインビトロのＡＤＣＣ分析を実行できる。そのような分析のための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいまたはその上に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２-６５６ （１９９８）で開示されるような動物モデルにおいてインビボで評価さできる。
【００９２】
「エフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞および好中球；好ましくはＰＢＭＣおよびＮＫ細胞を含む。エフェクター細胞は、その天然源から（例えば本明細書において記述されるような血液またはＰＢＭＣから）単離できる。
【００９３】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｅ領域に結合する受容体についての記述に使用される。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合し（γ受容体）、これらの受容体の対立遺伝子変異型およびオルタナティブスプライスされた形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスの受容体を含んでいるものである。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含み、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（総説Ｍ． Ｉｎ Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：２０３-２３４ （１９９７）を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７-９２ （１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５-３４ （１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０-４１ （１９９５）において概説される。今後同定されるものを含む他のＦｃＲは、用語「ＦｃＲ」により本明細書において包含される。この用語は、新生仔受容体（胎仔への母体のＩｇＧの移行のための関与するＦｃＲｎ）もまた含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７ （１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ． ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４２９ （１９９４））。
【００９４】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下において標的を溶解する能力を指す。補体活性化経路は、同種抗原と共に複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣ分析（例えばＧａｚｚａｎｏ-Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２： １６３ （１９９６）中に記載されていたように）を実行できる。
【００９５】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列において広く異なり、特定の抗原について各々の特定の抗体の結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布しない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのうちのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲを含み、このＦＲは、大部分がβ−シート立体配置をとり、接続ループを形成しある場合には＞シート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって結合される。各鎖中の超可変領域はＦＲによって隣接して保持され、他の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することには直接関与しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００９６】
本明細書において使用された場合、用語「超可変領域」は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｌ ａｌ． 、免疫学的に興味のあるタンパク質の配列、第５版、公衆衛生局、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド（１９９１））、および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基 （例えば軽鎖可変ドメイン中の残基２６３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１ -９１７ （１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化は、各々が一つの抗原結合部位を備えた「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメント（その名称は容易に結晶化する能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しており、抗原をまだ架橋することができるＦ（ａｂ’）２ フラグメントをもたらす。
【００９７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含んでいる最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密な非共有結合性会合で、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。この立体配置において、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するように各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用する。まとめて、６つの超可変領域は抗体に抗原を結合する特異性を付与する。しかしながら、一つの可変ドメイン（または抗原について特異的な３つの超可変領域のみしか含まない、Ｆｖの半分）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。Ｆａｂフラグメントは、さらに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数残基の追加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、それらの間にヒンジシステインを有するペアのＦａｂ’フラグメントとしてもともと産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングもまた公知である。
【００９８】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に別個のタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００９９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬのドメインを含み、これらのドメインは一つのポリペプチド鎖で存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望される構造の形成を可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、モノクローナル抗体の薬理学（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、１１３ 巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、２６９〜３１５ページ、１９９４年中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照。
【０１００】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を備えた低分子抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に結合された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対合できないほど短いリンカー使用することによって、ドメインはもう一つの鎖の相補的なドメインと強制的にペアにさせられて、２つの抗原結合部位を生ずる。ダイアボディは、例えばＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４-６４４８ （１９９３）中でより完全に記載されている。
【０１０１】
「単離」抗体とは、同定され、その天然環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入成分は、抗体のための診断用使用または治療用使用を妨害し、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性の溶質を含みうる材料である。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離抗体は組換え細胞内のその場の抗体を含んでいる。通常は、しかしながら、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されるだろう。
【０１０２】
対象となる抗原（例えばＣＤ６３抗原性部分）に「結合する」抗体とは、抗体が抗原を発現する細胞を標的とする治療用薬剤または診断用薬剤として有用であるように、その抗原に十分な親和性で結合できる抗体である。抗体がＣＤ６３抗原性部分を結合する抗体である場合、それは通常、他の受容体とは対照的にＣＤ６３抗原性部分を優先的に結合し、非特異的Ｆｃ接触などの偶発的な結合、または他の抗原に一般的な翻訳後修飾への結合を含んでおらず、他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体でありうる。対象となる抗原を結合する抗体の検出のための方法は、当技術分野において周知であり、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットなどの分析を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、同じ意味で使用され、そのような名称はすべて子孫を含む。計画的または偶然の変異のために、すべての子孫のＤＮＡも内容が正確に同一だとは限らないこともまた理解される。もともと形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれている。別の名称が意図される場合には、それは文脈から明らかだろう。
【０１０４】
「治療」は、療法的治療および予防的または防止的な対策の両方を指し、その目的は、標的とされた病理症状または障害を防止または減速（減少）させることである。治療を必要とするものは、障害を有する傾向のあるものに加えて、既に障害のあるものまたは障害が防止されるべきものを含んでいる。従って、本明細書において治療される哺乳類は、障害を有していると診断されるか、または罹患しやすいか、または障害に感受性があるだろう。
【０１０５】
「癌」、「癌性」という用語は、無秩序な細胞増殖または死によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理学的病態を指すか、または記述する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより多くの特定の例は、扁平上皮癌（例えば上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌に加えて、頭頸部癌を含んでいる。
【０１０６】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロスフォスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（サイトキサン（ＣＹＴＯＸＡＮ）（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン類およびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）類；クロラムブチル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード類；カルマスティン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）類；アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）類、アクチノマイシン、ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルノマイシン（ｃａｒｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジオリピン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質 ；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎性製剤；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシッド（「アラ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標）、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ・オンコロジー（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）社、プリンストン、ニュージャージー）およびドセタセル（タキソテール（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）（登録商標）、アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ）社、ローヌ・プーラン・ローラー（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）社、アントニー、フランス））；クロラムブチル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；（ＤＭＦＯ）レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまたこの定義に含まれる。
【０１０７】
治療の目的のための「哺乳類」は、ヒト、マウス、ＳＣＩＤマウスもしくはヌードマウスまたはマウスの系統、家庭動物および家畜、ならびにヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園動物、競技動物またはペット動物を含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、本明細書における哺乳類はヒトである。
【０１０８】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（１９８８年５月４日に出版されたＥＰ２６６，０３２に記載されるような固相技術を使用するホスホトリエステル化学、亜リン酸化学、またはホスホアミダイト化学など、またはＦｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ， １４：５３９９-５４０７， １９８６． によって記述されるようなデオキシリボヌクレオシドＨホスホナート中間体を介するもの）によって、化学的に合成される短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシリボヌクレオチドである。次に、それらはポリアクリルアミドゲル上で精製される。
【０１０９】
特別の指示のない限り、本明細書において使用される場合の用語「ＣＤ６３抗原性部分」は、テトラスパニンファミリーのタイプＩＩＩ膜タンパク質を指し、メラノーマ１抗原、眼メラノーマ関連抗原、メラノーマ関連抗原ＭＥ４９１、リゾソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィジン、メラノーマ関連抗原ＭＬＡ１もまた指す。
【０１１０】
「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはこれらに相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の中の対応する配列と同一であるかまたはこれらに相同である免疫グロブリンであり、それに加えて、それらが所望される生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントである（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ， ８１ ：６８５１-６８５５ （１９８４））。
【０１１１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２ または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。大部分については、ヒト化抗体は、所望される特異性、親和性および受容能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によってレシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が置き換えされる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの実例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置き換えされる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、移入されたＣＤＲまたはＦＲの配列中にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾はさらに抗体性能を改良し最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ残基である、実質的にすべての少なくとも１つの（典型的には２つの）可変ドメインを含むだろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部もまた含むだろう。
【０１１２】
「脱免疫化」抗体は、規定の種に対して、非免疫原性であるかまたは免疫原性が少ない免疫グロブリンである。脱免疫化は、抗体への構造的な変化によって達成することができる。当業者に公知である任意の脱免疫化技術を用いることができる。抗体の脱免疫化のために適切な１つの技術は、例えば２０００年６月１５日に出版されたＷＯ００／３４３１７中に記載されている。
【０１１３】
「相同性」は、配列をアライメントさせ、必要であるならば最大の％相同性を達成するためにギャップを導入した後に、同一である、アミノ酸配列変異型中の残基のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野において周知である。
【０１１４】
「アポトーシス」を誘導する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）によって確定されるようなプログラム細胞死を誘導するものである。
【０１１５】
本明細書の全体にわたって、ハイブリドーマ細胞株に加えて、それから産生される単離モノクローナル抗体は、あるいはそれらの内部名称（ＡＲ７５Ａ１０５．８）または寄託名称（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３）によって呼ばれる。
【０１１６】
本明細書において使用されるように、「抗体−リガンド」は、標的抗原についての結合特異性を示す部分を含み、それは、完全な形の抗体分子、抗体フラグメント、および少なくとも抗原結合領域またはその一部（すなわち抗体分子の可変部分）を有する任意の分子（例えば、Ｆｖ分子、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、二重特異性抗体、融合タンパク質）、またはＩＤＡＣ２８０３０６−０３と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される単離モノクローナル抗体が結合する抗原（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原）を特異的に認識および結合する、任意の遺伝子操作された分子である。
【０１１７】
本明細書において使用されるように、「癌性疾患修飾抗体」（ＣＤＭＡＢ）は、例えば全身腫瘍組織量を減少させることまたは癌を持った個人の生存を延長することによって、患者に有益な方法で癌性疾患プロセスを修飾するモノクローナル抗体、およびその抗体−リガンドを指す。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する、分子の一部を意味する。
【０１１９】
本明細書において使用されるように、「競合的に阻害する」は、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３と呼ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体（ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体）が向けられる決定基を、従来のレシプロカル抗体競合分析を使用して、認識および結合できること意味する。（Ｂｅｌａｎｇｅｒ Ｌ． ， Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ Ｃ． ａｎｄ Ｄｕｆｏｕｒ Ｄ． （１９７３）競合的なサンドイッチ手順によるαフェトプロテインのための酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｌｐｈａ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）。Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ４８， １５）。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、「標的抗原」はＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原またはその一部である。
【０１２１】
本明細書において使用されるように、「免疫コンジュゲート」は、細胞毒素、放射性医薬品、酵素または毒素または抗腫瘍薬物または治療剤に対して、化学的にまたは生物学的に結合された、抗体などの任意の分子またはＣＤＭＡＢを意味する。抗体またはＣＤＭＡＢは、その標的を結合できる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性医薬品、抗腫瘍薬物または治療剤に結合できる。免疫コンジュゲートの例は、抗体毒素化学物質コンジュゲートおよび抗体−毒素融合タンパク質を含む。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、「融合タンパク質」は、生物学的活性のある分子（例えば毒素、酵素、タンパク薬物）に抗原結合領域が結合される、任意のキメラタンパク質を意味する。
【０１２３】
本明細書において記述される本発明をより完全に理解するために、以下の記述が示される。
【０１２４】
本発明は、特異的にＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原を認識および結合するＣＤＭＡＢ（すなわちＩＤＡＣ２８０３０６−０３ ＣＤＭＡＢ）を提供する。
【０１２５】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢは、それがハイブリドーマＩＤＡＣ２８０３０６−０３によって産生される単離モノクローナル抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態でありうる。したがって、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体として同じ結合特異性を有する任意の組換えタンパク質（例えば、抗体が、リンホカインまたは腫瘍増殖阻害因子などの第２のタンパク質と組み合わされる融合タンパク質）は、本発明の範囲内である。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態において、ＣＤＭＡＢはＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体である。
【０１２７】
他の実施形態において、ＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗体の抗原結合領域を有するＦｖ分子（一本鎖Ｆｖ分子などの）、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆ（ａｂ’）２分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、ヘテロ抗体または任意の組換え分子でありえる抗原結合フラグメントである。本発明のＣＤＭＡＢは、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３モノクローナル抗体が向けられるエピトープに対して向けられる。
【０１２８】
本発明のＣＤＭＡＢは、誘導体分子を産生するように、すなわち分子内のアミノ酸修飾によって修飾できる。化学的修飾もまた可能かもしれない。
【０１２９】
誘導体分子はポリペプチドの機能特性を保持する、すなわち、そのような置き換えがある分子は、ＩＤＡＣ２８０３０６−０３抗原またはその一部へのポリペプチドの結合をまだ可能とするだろう。
【０１３０】
これらのアミノ酸置き換えは、「保存的なもの」として当技術分野において公知のアミノ酸置き換えを含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３１】
例えば、立体配座またはタンパク質の機能のいずれかを改変せずに、タンパク質において、「保存的なアミノ酸置換」とされる特定のアミノ酸置き換えがしばしば作製されることは、タンパク質化学のよく確立された原理である。
【０１３２】
そのような変更は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のうちのいずれかをこれらの疎水性アミノ酸の任意の他のもので置換すること；グルタミン酸（Ｅ）でアスパラギン酸（Ｄ）を置換することおよびその逆；アスパラギン（Ｎ）でグルタミン（Ｑ）を置換することおよびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でセリン（Ｓ）を置換することおよびその逆、を含んでいる。他の置き換えも、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えることができる。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）がそうであるように、グリシン（Ｇ）およびアラニンはしばしば交換可能でありえる。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシン、および時にはバリンと交換できる。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特徴はその荷電であり、これらの２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置においてしばしば交換可能である。なお、他の変更は、特定の環境において「保存的である」と考えることができる。
【０１３３】
抗体を考慮して、当業者は競合的に阻害するＣＤＭＡＢ（例えば同じエピトープを認識する抗体である競合抗体）を産生することができる（Ｂｅｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。１つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原による免疫を要する。サンプルは組織、単離タンパク質または細胞株を含むが、これらに限定されない。競合分析を使用して、生じるハイブリドーマをスクリーニングすることができ、それは、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳまたは免疫沈降などの試験抗体の結合を阻害する抗体を同定する分析である。別の方法では、前記抗原を認識する抗体のためのファージディスプレーライブラリーの使用および選別を行なうことが可能であった（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。いずれの場合においても、ハイブリドーマは、その標的抗原に対してもとの抗体が結合することを競合するそれらの能力に基づいて選択される。したがって、そのようなハイブリドーマは、もとの抗体と同じ抗原を認識する特性を持ち、より特異的に同じエピトープを認識するだろう。
実施例１
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８
【０１３４】
ハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ブダペスト条約に従って、カナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ）、微生物学事務局、カナダ保健省、１０１５アーリントン街、ウイニペグ、マニトバ、カナダ、Ｒ３Ｅ ３Ｒ２に、２００６年３月２８日に、アクセッション番号２８０３０６−０３の下で寄託された。３７ＣＦＲ １．８０８に従って、寄託者は、特許の付与に際して、公衆に対する寄託材料の入手に関して課されたすべての制限が取消不能の形で削除されることを保証する。寄託場所が生存可能なサンプルを調合することができないならば、寄託は置き換えられるだろう。
【０１３５】
抗癌抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８を産生するハイブリドーマを産生するために、凍結ヒト肺明細胞癌腫瘍組織（ゲノミクス・コラボレイティブ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）の単離細胞懸濁物をＰＢＳ中に調製した。イムイージー（ＩＭＭＵＮＥＡＳＹ）（商標）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、ヴェンロー、オランダ）アジュバントを、緩やかな混合によって使用のために調製した。５〜７週令のＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０マイクロリットルの抗原アジュバント中の２００万細胞の皮下注射によって免疫した。免疫マウスの腹腔内ブーストのために、直近に調製した抗原アジュバントを５０マイクロリットル中の２００万細胞で、初回免疫の２週間後および５週間後に使用した。最後の免疫の３日後に、脾臓を融合のために使用した。ＮＳＯ−Ｉミエローマパートナーと単離脾細胞を融合させることによって、ハイブリドーマを調製した。融合細胞の上清を、ハイブリドーマのサブクローンから検査した。
【０１３６】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであるかを決定するために、ＥＬＩＳＡ分析を用いた。１００マイクロリットル／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を、コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．２〜９．６）中の２．４マイクログラム／ｍＬの濃度で、一晩４℃でＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０． ０５％ツイーン）中で３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのブロッキングバッファー（洗浄バッファー中の５％ミルク）を、室温で１時間プレートに加え、次に洗浄バッファー中で３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を室温で加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（１％のミルク含有ＰＢＳ中で希釈）のいずれかの１／１００，０００の希釈を、１００マイクロリットル／ウェルで加えた。室温で１時間プレートをインキュベート後に、プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ溶液を室温で１〜３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２ＭのＨ２ ＳＯ４の追加により発色反応を終了させ、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより４５０ｎｍでプレートを読み取った。図１中に示されるように、ＡＲ７５Ａ１０５．８ハイブリドーマは主としてＩｇＧアイソタイプの抗体を分泌した。
【０１３７】
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを決定するために、アイソタイプ分類実験を、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ分類キット（ハイカルト・バイオテクノロジー（ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、フロントストラート、オランダ）を使用して実行した。５００マイクロリットルのバッファー溶液を、ラット抗マウスサブクラス特異的抗体含有試験ストリップに加えた。５００マイクロリットルのハイブリドーマ上清を試験管に加え、緩やかな撹拌によって沈めた。捕捉されたマウス免疫グロブリンを、コロイド粒子に結合した二次ラットモノクローナル抗体によって直接検出した。これらの２つのタンパク質の組合せは、アイソタイプを分析するために使用される可視シグナルを生ずる。抗癌抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８はＩｇＧ１、κアイソタイプである。
【０１３８】
１ラウンドの限界希釈後に、細胞ＥＬＩＳＡ分析で、ハイブリドーマ上清は標的細胞に対して結合した抗体について検査された。３つのヒト肺癌細胞株、１つのヒト乳癌細胞株および１つのヒト正常肺細胞株：それぞれ、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０−２３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）およびＨｓ８８８． Ｌｕを検査した。プレーティングした細胞を使用の前に固定した。プレートを、ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＰＢＳにより室温で３度洗浄した。１００マイクロリットルのＰＢＳ中で希釈された２％パラホルムアルデヒドを、室温で１０分間各ウェルに加え、次に廃棄した。プレートを、ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＰＢＳにより室温で３回再び洗浄した。１００マイクロリットル／ウェルの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０． ０５％のツイーン）中の５％ミルクにより室温で１時間ブロッキングを行った。プレートを洗浄バッファーにより３度洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのハイブリドーマ上清を室温で１時間加えた。プレートを洗浄バッファーにより３回洗浄し、１／２５，０００の希釈の１００マイクロリットル／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１％ミルク含有ＰＢＳ中で希釈）を加えた。室温での１時間のインキュベーション後に、プレートを洗浄バッファーにより３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分間インキュベートした。５０マイクロリットル／ウェルの２ＭのＨ２ ＳＯ４により反応を終了し、パーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００プレートリーダーにより４５０ｎｍでプレートを読み取った。図１中に作表されるような結果は、検査される細胞株に結合しないことが以前に示されている自家ＩｇＧアイソタイプ対照と比較して、バックグラウンドを上回った倍数として表現された。ハイブリドーマＡＲ７５Ａ１０５．８からの抗体は、検査された細胞株のすべてに対して検出可能な結合を示した。
【０１３９】
抗体結合のための検査と併用して、ハイブリドーマ上清の細胞傷害効果を細胞株：Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ４６０−２３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）およびＨｓ８８８．Ｌｕにおいて検査した。カルセインＡＭをモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社（ユージーン、オレゴン）から入手した。以下に概説された変更で製造者の使用説明書に従って、分析を実行した。分析の前に、細胞を所定の適切な密度でプレーティングした。２日後に、ハイブリドーママイクロタイタープレートからの１００マイクロリットルの上清を細胞プレートに移し、５％ＣＯ２ インキュベーター中で５日間インキュベートした。陽性対照として取り扱われるウェルを空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）またはシクロヘキシミドを加えた。５日間の処理後に、次にプレートを逆さにすることによって空にし、水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有する室温のＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）を、マルチチャンネルスクイーズボトルから各ウェルの中へ分注し、３回タッピングし、逆さにすることによって空にし、次に水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＤＰＢＳ中で希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン色素を各ウェルに加え、５％ＣＯ２ インキュベーター中で３７℃３０分間インキュベートした。プレートをパーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データーをマイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）社エクセルで解析した。結果を図１中に示す。ＡＲ７５Ａ１０５．８ハイブリドーマからの上清は、Ａ５４９細胞上で１９％の特異的な細胞傷害を生じた。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ６３％および３３％だった。１１％の特異的な細胞傷害がＮＣＩ−Ｈ２３細胞上でも観察された。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ２７％および５５％だった。さらに、１７％の特異的な細胞傷害がＮＣＩ−Ｈ４６０−２３細胞上で観察された。これは、陽性対照のアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドにより得られた細胞傷害のそれぞれ２６％および１０６％だった。図１からの結果は、ＡＲ７５Ａ１０５．８の細胞傷害効果が癌細胞タイプに対する結合レベルに比例しないことを実証した。検査されたすべての細胞株に対する検出可能な結合、およびＡ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３およびＮＣＩ−Ｈ４６０−２３細胞については細胞傷害があった。図１中に示されるように、ＡＲ７５Ａ１０５．８はＨｓ８８８．Ｌｕ（正常なヒト肺細胞株）においては細胞傷害を生じなかった。公知の非特異的細胞傷害剤シクロヘキシミドおよびＮａＮ３は一般に予想されるような細胞傷害を生じた。
実施例２
インビトロの細胞傷害および結合
【０１４０】
ＡＲ７５Ａ１０５．８モノクローナル抗体は、回収および再播種を２回／週で行なって、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、オークヴィル、オンタリオ）中のハイブリドーマの培養によって産生された。プロテインＧセファロース４ファースト・フロー（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、ベ・デュルフェ、ケベック）による標準抗体精製手順は以下の通りである。脱免疫化モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ化モノクローナル抗体、またはマウスモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。
【０１４１】
ＡＲ７５Ａ１０５．８を、細胞毒性分析（図２）において、２つの陽性対照（抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５、ＩｇＧｌ、κ、５マイクログラム／ｍＬ、セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）社、ホーンビー、オンタリオ）およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ、０．５マイクロモル、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、オークヴィル、オンタリオ））および１つの陰性アイソタイプ対照（１Ｂ７．１１（抗ＴＮＰ）、自家精製した）と比較した。前立腺癌（ＰＣ−３）および乳癌（ＭＢ−２３１）、ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株を検査した。細胞はすべてＡＴＣＣ、マナッサス、バージニアから入手した。カルセインＡＭはモレキュラー・プローブス社（ユージーン、オレゴン）から入手した。以下に概説された変更で製造者の使用説明書に従って、分析を実行した。分析の前に、細胞を所定の適切な密度でプレーティングした。２日後に、１００マイクロリットルの精製抗体または対照を培地中で希釈し、次に細胞プレートに移し、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間インキュベートした。次にプレートを逆さにすることによって空にし、水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有する室温のＤＰＢＳを、マルチチャンネルスクイーズボトルから各ウェルの中へ分注し、３回タッピングし、逆さにすることよって空にし、次に水分を吸い取って乾燥させた。ＭｇＣｌ２ およびＣａＣｌ２ を含有するＤＰＢＳ中で希釈した５０マイクロリットルの蛍光カルセイン色素を各ウェルに加え、５％ＣＯ２ インキュベーター中で３７℃３０分間インキュベートした。プレートはパーキン・エルマー社ＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、データーをマイクロソフト社エクセルで解析し、結果を図２中に示した。各抗体については、三重で検査された４つの実験において観察された平均細胞傷害に基づいたスコアは５〜５０の間であり、分析間で観察されたばらつきに基づいたスコアは２５〜１００の間のであった。これらの２つのスコア（細胞傷害スコア）の合計は図２中に示される。５５以上の細胞傷害スコアは、検査された細胞株について陽性であると考えられた。アイソタイプ陰性対照およびバッファー陰性対照の両方と比較して、ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体はＰＣ−３前立腺癌細胞株において特異的な細胞傷害を生じた。ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ＭＢ−２３１乳癌細胞タイプにおいては陽性の細胞傷害スコアを生じなかった。これはＡＲ７５Ａ１０５．８クローンのハイブリドーマ上清からのデーターと合致し、それはさらにＭＢ−２３１癌細胞株に対して特異的な細胞傷害を検出しなかった（実施例１を参照）。重要なことに、ＡＲ７５Ａ１０５．８は、陰性対照と比較して、ＣＣＤ−２７ｓｋまたはＨｓ８８８．Ｌｕなどの非癌細胞株に対して有意な細胞傷害を生ぜず、抗体が癌細胞に向けて特異的な細胞傷害効果を有することを示唆する。１Ｂ７．１１についての細胞傷害スコアは複数の実験からの平均であった。化学的細胞傷害剤は、複数の細胞株に対して期待される細胞傷害を誘導した。
【０１４２】
前立腺癌（ＰＣ−３）および乳癌（ＭＢ−２３１）、ならびに皮膚（ＣＣＤ−２７ｓｋ）および肺（Ｈｓ８８８．Ｌｕ）からの非癌細胞株へのＡＲ７５Ａ１０５．８の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって評価した。細胞は、ＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋不含有）で最初に細胞単層を洗浄することによりＦＡＣＳのために調製された。次に細胞培養プレートから細胞を解離するために、細胞解離バッファー（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社、バーリントン、オンタリオ）を３７℃で使用した。遠心分離して回収した後に、細胞を、ＭｇＣｌ２ 、ＣａＣｌ２ および２％のウシ胎仔血清を含有するＤＰＢＳ（染色用培地）中に４℃で再懸濁してカウントし、適切な細胞密度に小分けし、遠心して細胞を沈殿させ、試験抗体（ＡＲ７５Ａ１０５．８）または対照抗体（アイソタイプ対照、抗ＥＧＦＲ）の存在下において染色培地中に４℃で再懸濁した。３０分間氷上で、アイソタイプ対照および試験抗体は２０マイクログラム／ｍＬで評価したが、抗ＥＧＦＲは５マイクログラム／ｍＬで評価した。アレクサ（Ａｌｅｘａ）蛍光５４６−コンジュゲート二次抗体の追加の前に、細胞を染色培地で一回洗浄した。次に染色培地中のアレクサ蛍光５４６−コンジュゲート抗体を４℃で３０分間加えた。次に細胞を最終時として洗浄し、固定培地（１．５％パラホルムアルデヒド含有染色培地）中に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリーによる捕捉は、ＦＡＣＳアレイ（ＦＡＣＳａｒｒａｙ）（商標）システムソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社、オークヴィル、オンタリオ）を使用するＦＡＣＳアレイ（商標）上でサンプルを流すことにより評価された。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）は、ＦＳＣおよびＳＳＣの検出器に対する電圧利得および振幅利得の調整により設定された。蛍光（アレクサ−５４６）チャンネルのための検出器を、細胞がおよそ１〜５ユニットの蛍光強度中央値で均一のピークを有するように、無染色細胞を流すことによって調整した。各サンプルについては、およそ１０，０００のゲートイベント（染色固定細胞）が、分析のために捕捉され、結果は図３中に示される。
【０１４３】
図３は、アイソタイプ対照を上回って何倍増加したかを平均蛍光強度で示す。ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体の代表的なヒストグラムを図４のために編集した。ＡＲ７５Ａ１０５． ８は、正常な皮膚細胞株ＣＣＤ−２７ｓｋ（２．２倍）に対して弱い結合を示した。ＡＲ７５Ａ１０５．８は、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（１５．５倍）、乳癌細胞株ＭＢ−２３１（９．９倍）に対しておよび正常肺細胞株Ｈｓ８８８．Ｌｕ（５．４倍）に対してより強い結合を示した。これらのデーターは、検査された癌細胞タイプに対して明らかな結合があったが、前立腺癌細胞株ＰＣ−３のみと細胞傷害が関連したという点で、ＡＲ７５Ａ１０５．８が機能的特異性を示したことを実証する。これは、結合するということが、その同種抗原の抗体ライゲーションの転帰を必ずしも予測するものではないというさらなる証拠でもあり、自明でない発見だった。これは、異なる細胞における抗体ライゲーションの情況が、単なる抗体結合単独よりもむしろ、細胞傷害を決定することを示唆した。
実施例３
インビボにおけるＬｏｖｏ細胞による腫瘍実験
【０１４４】
図５および６に関して、４〜６週令の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルの生理食塩水中の１００万のヒト結腸癌細胞（Ｌｏｖｏ）を首筋に皮下注射して移植した。マウスを、６匹の２つの治療群へ無作為に分けた。移植の翌日に、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４を含む希釈剤によるストック濃縮物からの希釈後に、２０ｍｇ／ｋｇのＡＲ７５Ａ１０５．８試験抗体またはバッファー対照を、３００マイクロリットルの体積で各コホートに対して腹腔内投与した。次に抗体および対照のサンプルを、同じ方式で、研究の期間１週あたり一回投与した。腫瘍増殖を約７日毎に測径器で測定した。抗体を８回注入した後に、研究を完了した。動物の体重は、研究の期間１週あたり一回記録した。研究の終了時に、すべての動物をＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【０１４５】
ＡＲ７５Ａ１０５．８は、ヒト結腸癌の高侵攻性のＬｏｖｏのインビボの予防的モデルにおいて腫瘍増殖を減少させた。移植５６日後に（最後の治療投与６日後に）、ＡＲ７５Ａ１０５．８治療群における平均腫瘍容積は、バッファー対照で治療された群における腫瘍容積よりも４５％低かった（図５）。この効果は、各群内の動物が少数であるために統計的に有意ではなかった。４８日目に（７回の抗体投与後で、動物はまだ治療期間中である）、ＡＲ７５Ａ１０５．８による治療は、６２％（ｐ＝０．０２３９）の有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。
【０１４６】
研究の全体にわたって毒性についての臨床的症状はなかった。毎週の間隔で測定された体重を、健康および成長障害を代わりに示すものとした。対照群の平均体重は、研究の期間にわたって有意に変化しなかった（図６）。しかしながら、ＡＲ７５Ａ１０５． ８治療群の平均体重は、研究の終了時に対照群よりも有意に高かった（５６日目；ｐ＝０． ０２４）。この観察は、ＡＲ７５Ａ１０５．８治療群において観察される腫瘍容積の低下に関連しているかもしれない。
【０１４７】
要約すると、ＡＲ７５Ａ１０５．８は耐容性が良好であり、このヒト結腸癌異種移植片モデルにおいて全身腫瘍組織量を低下させた。
実施例４
ＡＲ７５Ａ１０５．８と抗ＣＤ６３抗体７ＢＤ−３３−１１Ａの間の交差反応性の決定
【０１４８】
全膜画分のおよび全細胞溶解物のウエスタンブロットからの結果により、モノクローナル抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８をプローブとした場合、別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体１Ａ２４５．６で得られた結果との強い類似性が明らかになった（図７）。前者の抗体がＣＤ６３と交差反応するかどうかを決定するために、それを、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗ＣＤ６３抗体またはＡＲ７５Ａ１０５．８のいずれかによりヒト乳癌細胞（ＭＢＤ−ＭＢ−２３１）の全膜画分から得られる免疫沈降複合体のウエスタンブロットに対するプローブとして使用した。
【０１４９】
簡潔には、各々が３００マイクログラムのＭＤＡ−ＭＢ−２３１全膜画分を含む３つの重複したサンプル（６００マイクロリットルの１×ＲＩＰＡバッファー中で０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）を、１５マイクロリットルの７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲ７５Ａ１０５．８またはＩｇＧ１アイソタイプ対照をコンジュゲートしたプロテインＧセファロースビーズと共に４℃で２時間インキュベートした。洗浄後、ビーズを１×の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー中で煮沸し、サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって解析した。ＰＶＤＦ膜の上への電気的な転写後にブロットは、標準ウエスタンブロット手順に従って、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲ７５Ａ１０５．８および１Ｂ７．１１（ＩｇＧ１アイソタイプ対照）をプローブとして調べられた。一次抗体はすべて５マイクログラム／ｍＬの濃度で使用された。結果のブロットの画像（図８）から、７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡＲ７５Ａ１０５．８の両方はそれらのいずれかによって免疫沈降させた抗原と交差反応することが示された。したがって、抗体ＡＲ７５Ａ１０５．８は、既知の抗ＣＤ６３抗体によって免疫沈降させたＣＤ６３と交差反応した。
【０１５０】
ＡＲ７５Ａ１０５．８とヒトＣＤ６３の間の交差反応性をさらに確認するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたヒトＣＤ６３の最大の細胞外ループの組換えＧＳＴ融合コンストラクト（ＧＳＴ−ＥＣ２）のウエスタンブロット上で、抗体をプローブとして使用した。簡潔には、５マイクログラムの精製組換えＧＳＴ融合タンパク質を、１０％分取ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動によって解析した。転写後にブロットは、標準ウエスタンブロット手順に従って、ＡＲ７５Ａ１０５．８、ならびに抗ＣＤ６３抗体の７ＢＤＩ−５８、７ＢＤ１−６０、ＡＲ５１Ａ９９４．１、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６およびＨ４６０−２２−１ならびに抗ＣＤ４４抗体（クローンＨ４６０−１６−２）ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体をプローブとして調べられた。一次抗体はすべて５マイクログラム／ｍＬの濃度で使用された。この実験からの結果（図９）は、特異的にヒトＣＤ６３の最大の細胞外ループの組換えＧＳＴ融合コンストラクトとすべての抗体（抗ＣＤ４４の抗体およびアイソタイプ対照を例外として）が交差反応することを明らかにし、したがってすべての抗体（抗ＣＤ４４の抗体およびアイソタイプ対照を除いて）がヒトＣＤ６３と交差反応することを確証した。
【０１５１】
証拠の優越性から、ＣＤ６３の上に存在する１つまたは複数のエピトープのライゲーションを介してＡＲ７５Ａ１０５．８がその癌予防効果を仲介することが示される。ＡＲ７５Ａ１０５． ８抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などの発現細胞から同種抗原を免疫沈降させるのに使用できることが、実施例４において示された。さらに、ＡＲ７５Ａ１０５．８抗体は、ＦＡＣＳまたは細胞ＥＬＩＳＡによって示される技術（しかしこれらに限定されない）を利用して、特異的にそれに結合するＣＤ６３抗原性部分を発現する細胞および／または組織の検出において使用できることを示すことができた。
【０１５２】
したがって、他の抗ＣＤ６３抗体は、ＣＤ６３抗原の他の形態を免疫沈降させて単離するのに使用でき、抗原もまた同じタイプの分析を使用して抗原を発現する細胞または組織に対するそれらの抗体の結合を阻害することに使用できる。
【０１５３】
本明細書中で言及された特許および出版物はすべて、本発明が属する当業者のレベルを表す。各々の個別の出版物を参照することによって組み入れられることが特別に個別に示されるように、すべての特許および出版物は、参照することによって本明細書に同程度まで組み入れられる。
【０１５４】
本発明の特定の形態が示されているが、それが本明細書において記述および示された部分の具体的な形態または構成に限定的でないことが理解されるべきである。様々な変更が本発明の範囲から逸脱せずに行なえることは当業者に明らかであり、本発明が、明細書中に示されたことおよび記載されたことに限定的であると判断することはできない。
【０１５５】
目的を実行し、述べられた結果および利点に加えて、その中に固有のものを得るのに、本発明がよく適合していることを、当業者は容易に認識するだろう。本明細書において記述された任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生体関連化合物、方法、手順および技術は、現時点での好ましい実施形態の典型であり、例示的であるように意図され、範囲の限定としては意図されない。その中の変更および他の使用は本発明の趣旨内に包含され、添付の請求項の範囲によって定義されることは、当業者には考えつくだろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記述されたが、請求された本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定的であるべきでないことが理解されるに違いない。実際は、当業者にとって明らかな本発明の実行のために記述された形態の様々な修飾は、以下の請求項の範囲内であると意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体から産生されたヒト化抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体から産生されたキメラ抗体。
【請求項４】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された単離ハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
ヒト腫瘍から選択される組織サンプルにおける癌細胞の抗体誘導性細胞性細胞傷害を開始する方法であって、
該ヒト腫瘍からの組織サンプルを提供することと；
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを提供し、ＣＤＭＡＢがその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられることと；
該組織サンプルと、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを接触させることと、
を含み；
該組織サンプルと該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢの結合が細胞性細胞傷害を誘導する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項７】
請求項２に記載のヒト化抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項８】
請求項３に記載のキメラ抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項９】
細胞傷害性部分、酵素ならびに放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されたメンバーにコンジュゲートされる、請求項１、２、３、６、７または８のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項１０】
哺乳類においてヒト腫瘍を治療する方法であって、該ヒト腫瘍がアクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに対して特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ＣＤＭＡＢはその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられ、該哺乳類の全身腫瘍組織量の減少をもたらすのに効果的な量で該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該哺乳類に対して投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞性細胞傷害を仲介する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体がキメラ化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類において抗体誘導性細胞性細胞傷害に対して感受性のあるヒト腫瘍を治療する方法であって、該ヒト腫瘍がアクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに対して特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ＣＤＭＡＢはその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられ、該哺乳類の全身腫瘍組織量の減少をもたらすのに効果的な量で該モノクローナル抗体またはその該ＣＤＭＡＢを該哺乳類に対して投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記単離モノクローナル抗体が細胞傷害性部分に対してコンジュゲートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞性細胞傷害を仲介する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離モノクローナル抗体がキメラ化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトＣＤ６３に対して特異的結合が可能である単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢはＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体と同様に同じヒトＣＤ６３の１つまたは複数のエピトープに反応し、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項２５】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、その標的エピトープまたはエピトープに対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項２６】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、
該ヒト癌に罹患する個体に対して、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されたエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを投与することを含み、
該１つまたは複数のエピトープの結合が全身腫瘍組織量の減少をもたらすプロセス。
【請求項２７】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、
該ヒト癌に罹患する個体に対して、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１つの化学療法剤と併用して投与することを含み、
該投与が全身腫瘍組織量の減少をもたらすプロセス。
【請求項２８】
ヒト腫瘍から選択される組織サンプルにおいてＣＤ６３の１つまたは複数のエピトープを発現し、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合される癌細胞の存在を決定する結合分析であって、
該ヒト腫瘍から組織サンプルを提供することと；
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを提供することと；
該組織サンプルと少なくとも１つの該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを接触させることと；
該組織サンプルと少なくとも１つの該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢの結合を決定することと、
を含み、
それによって該組織サンプルにおける該癌細胞の存在が示される結合分析。
【請求項１】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生された、単離モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体から産生されたヒト化抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体から産生されたキメラ抗体。
【請求項４】
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託された単離ハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
ヒト腫瘍から選択される組織サンプルにおける癌細胞の抗体誘導性細胞性細胞傷害を開始する方法であって、
該ヒト腫瘍からの組織サンプルを提供することと；
アクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを提供し、ＣＤＭＡＢがその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられることと；
該組織サンプルと、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを接触させることと、
を含み；
該組織サンプルと該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢの結合が細胞性細胞傷害を誘導する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項７】
請求項２に記載のヒト化抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項８】
請求項３に記載のキメラ抗体のＣＤＭＡＢ。
【請求項９】
細胞傷害性部分、酵素ならびに放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されたメンバーにコンジュゲートされる、請求項１、２、３、６、７または８のいずれか一項に記載の単離抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項１０】
哺乳類においてヒト腫瘍を治療する方法であって、該ヒト腫瘍がアクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに対して特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ＣＤＭＡＢはその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられ、該哺乳類の全身腫瘍組織量の減少をもたらすのに効果的な量で該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを該哺乳類に対して投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記単離モノクローナル抗体が細胞傷害性部分にコンジュゲートされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞傷害性部分が放射性同位元素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞性細胞傷害を仲介する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記単離モノクローナル抗体がキメラ化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類において抗体誘導性細胞性細胞傷害に対して感受性のあるヒト腫瘍を治療する方法であって、該ヒト腫瘍がアクセッション番号２８０３０６−０３としてＩＤＡＣに寄託されたクローンによってコードされた単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢに対して特異的に結合する抗原の少なくとも１つのエピトープを発現し、ＣＤＭＡＢはその標的抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられ、該哺乳類の全身腫瘍組織量の減少をもたらすのに効果的な量で該モノクローナル抗体またはその該ＣＤＭＡＢを該哺乳類に対して投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記単離モノクローナル抗体が細胞傷害性部分に対してコンジュゲートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが補体を活性化する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢが抗体依存性細胞性細胞傷害を仲介する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離モノクローナル抗体がキメラ化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトＣＤ６３に対して特異的結合が可能である単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢはＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体と同様に同じヒトＣＤ６３の１つまたは複数のエピトープに反応し、その標的ヒトＣＤ６３抗原に対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項２５】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する、単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢであって、その標的エピトープまたはエピトープに対する該単離モノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、該モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢ。
【請求項２６】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、
該ヒト癌に罹患する個体に対して、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されたエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを投与することを含み、
該１つまたは複数のエピトープの結合が全身腫瘍組織量の減少をもたらすプロセス。
【請求項２７】
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトＣＤ６３抗原の少なくとも１つのエピトープを発現するヒト癌性腫瘍を治療するプロセスであって、
該ヒト癌に罹患する個体に対して、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５．８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを、少なくとも１つの化学療法剤と併用して投与することを含み、
該投与が全身腫瘍組織量の減少をもたらすプロセス。
【請求項２８】
ヒト腫瘍から選択される組織サンプルにおいてＣＤ６３の１つまたは複数のエピトープを発現し、ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって特異的に結合される癌細胞の存在を決定する結合分析であって、
該ヒト腫瘍から組織サンプルを提供することと；
ＩＤＡＣアクセッション番号２８０３０６−０３を有するハイブリドーマ細胞株ＡＲ７５Ａ１０５． ８によって産生される単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同じ１つまたは複数のエピトープを認識する少なくとも１つの単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを提供することと；
該組織サンプルと少なくとも１つの該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢを接触させることと；
該組織サンプルと少なくとも１つの該単離モノクローナル抗体またはそのＣＤＭＡＢの結合を決定することと、
を含み、
それによって該組織サンプルにおける該癌細胞の存在が示される結合分析。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５４５５２８（Ｐ２００９−５４５５２８Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２１０７４（Ｐ２００９−５２１０７４）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１３１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１７１１
【国際公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【出願人】（５０９０１８３８４）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１３１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１１７１１
【国際公開日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【出願人】（５０９０１８３８４）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (5)
【Ｆターム（参考）】
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