癌抗原非特異的な標的化Ｔ細胞の製造方法及び医薬
【課題】 癌抗原特異的ワクチン療法のための癌抗原の情報が得られない癌やヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプがワクチン療法に適合しない癌患者の治療に有用な癌治療剤を提供すること。
【解決手段】 癌患者より得られた少量の末梢血を癌抗原以外のＴ細胞を活性化しうる抗原の存在下に、タイプ１サイトカインを加えて培養することにより、抗原特異的Ｔｈ１細胞を製造する。特異的Ｔｈ１細胞の誘導に用いた抗原とその抗原特異的Ｔｈ１細胞を組み合わせて投与することにより、担癌ホストの生体内で腫瘍特異的ＣＴＬが誘導される。
【解決手段】 癌患者より得られた少量の末梢血を癌抗原以外のＴ細胞を活性化しうる抗原の存在下に、タイプ１サイトカインを加えて培養することにより、抗原特異的Ｔｈ１細胞を製造する。特異的Ｔｈ１細胞の誘導に用いた抗原とその抗原特異的Ｔｈ１細胞を組み合わせて投与することにより、担癌ホストの生体内で腫瘍特異的ＣＴＬが誘導される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌以外の抗原に特異的なＴ細胞からなる、癌の治療に用いるための標的化Ｔ細胞の製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において癌とは悪性新生物をいい、また癌と腫瘍は同義として扱うものとする。
【０００３】
癌の主な治療法としては外科療法、化学療法、放射線療法があるが、それだけで癌細胞を根絶することはできない。これらの治療効果やその後の非再発期間の長さは、宿主の免疫能に依存すると考えられるが、化学療法、放射線療法の副作用により宿主の免疫能は影響を受け、これらの治療によるマイナスの影響は無視できない。
【０００４】
そこで宿主の生体防御機構を増強して癌を克服しようという考えから、免疫能を非特異的に増強させる菌体成分、植物由来成分などの生体外物質を用いた癌治療も試みられている。また免疫を調節する生体内物質であるサイトカイン類を使用した治療も進められている。これらの物質は生物応答修飾剤（ＢＲＭ）と呼ばれ、単独で癌治療に用いられることもあるが、外科療法、化学療法、放射線療法と組み合わせて用いられることもある。
【０００５】
ＢＲＭとして臨床応用されている菌体成分としては、ＢＣＧ、ＯＫ４３２（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎなどがあり、植物由来成分としてはＬｅｎｔｉｎａｎ、Ｓｏｎｉｆｉｌａｎ、Ｋｕｒｅｓｔｉｎなどがある。
【０００６】
ＢＣＧは結核予防のための弱毒性生ワクチンとして知られているが、ワクチンの副作用を取り除くためにＢＣＧ株の細胞壁骨格成分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）や結核菌の培養上清などから有効成分の分離が試みられた。結核の感染、既往や予防接種の検査に用いられるツベルクリンは、結核菌培養上清を過熱処理後に濾過したものであるが、最近ではこれを精製したＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が使われている。
【０００７】
ＢＣＧは遅延型過敏症（ＤＴＨ）をひき起こし、ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１細胞）を誘導することが知られている。ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＰＰＤもまたＢＣＧと同様にＤＴＨをひき起こし、ＢＣＧ−ＣＷＳによる免疫治療が多くの癌で有効であることが示された（例えば、非特許文献１参照）。
【０００８】
ＢＲＭ以外に宿主の免疫を増強する方法として、血液細胞をいったん生体外へ取り出し、サイトカイン類を加えて抗腫瘍効果を高めた免疫細胞を誘導した後、再び生体内に移入する治療法も行われている。末梢血より分離した単核球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下で培養することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抵抗性の腫瘍に対して幅広く抗腫瘍活性をもつリンフォカイン活性化キラ−（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ、ＬＡＫ）細胞を誘導することができる（例えば、非特許文献２参照）。その後、遺伝子組み換え技術により大量のＩＬ−２が入手可能となり（例えば、非特許文献３参照）、腫瘍に対するＬＡＫ細胞を用いた養子免疫療法の臨床応用がなされ、その有用性が示された（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
さらにＩＬ−２に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を加えて培養することにより、少量の末梢血から得られた単核球よりＬＡＫ活性をもつ細胞を大量に培養することが
可能となった（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
末梢のＴリンパ球は細胞表面にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と共にＣＤ３分子を発現しており、ＣＤ４またはＣＤ８分子の発現の違いにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分類される。
【００１１】
細胞表面に発現した分子（たとえばＣＤ４分子、ＣＤ８分子）に対するＭｏＡｂと磁気ビーズを用いることにより、目的の細胞表面抗原を有する細胞を濃縮または除去することができる（例えば、特許文献１参照）。
【００１２】
Ｔｈ細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２などのタイプ１サイトカインを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのタイプ２サイトカインを産生するＴｈ２細胞に分けられ（例えば、非特許文献６参照）、Ｔｈ１細胞は細胞性免疫のエフェクターとして働き、Ｔｈ２細胞は体液性免疫の調節を担っている。またＴｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４はＴｈ１細胞を抑制する（例えば、非特許文献７参照）。
【００１３】
初期のＴｈ細胞活性化の際にＩＬ−１２の存在によりＴｈ１細胞の分化が起こり（例えば、非特許文献８参照）、ＩＬ−４の存在によりＴｈ２細胞の分化が起こる（例えば、非特許文献９参照）。
【００１４】
腫瘍局所ではＴｈ２細胞由来サイトカインが優位になっており（例えば、非特許文献１０参照）、癌免疫療法ではＴｈ１／Ｔｈ２バランスを是正しＴｈ１主導の細胞性免疫を活性化することも重要であり、ＢＣＧ由来の成分以外にもＴｈ１型のタイプ１サイトカインの産生を誘導するＢＲＭが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許番号 第２５３０９６６号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉら，１９９８，Ｐｏｒｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７４（Ｂ）：５０−５５
【非特許文献２】Ｇｒｉｍｍら，１９８２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５５：１８２３−１８４１
【非特許文献３】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０２：３０５−３１０
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８５，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３：１４８５−１４９２
【非特許文献５】Ｏｃｈｏａら，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７２８−２７３３
【非特許文献６】Ｍｏｓｍｓｎｎら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：２３４８−２３５７
【非特許文献７】Ｍａｇｇｉら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２１４２−２１４７
【非特許文献８】Ｓｅｄｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０１８８−１０１９２
【非特許文献９】Ｈｓｉｅｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０６５−６０６９
【非特許文献１０】Ｈｕａｎｇ，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：３８４７−３８５３
【非特許文献１１】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：５６１９−５６２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
担癌状態ではＴｈ１／Ｔｈ２バランスがくずれＴｈ２細胞由来サイトカインが優位になっているため、Ｔｈ１主導の細胞性免疫の活性化が必要である。
【００１８】
生体外で腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、手術によって患者本人の腫瘍組織を得る必要がある。また最近では腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導が可能となっているが、限られた既知の腫瘍抗原ペプチドと限られたタイプの主要組織適合性複合体（ヒト白血球抗原ともいう）を有する患者しか適応できない。
【００１９】
さらに腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、多くの手間と時間さらには誘導に使用するＡＰＣ（抗原提示細胞）を得るために大量の血液を必要とし、生体外で細胞治療に必要な量の腫瘍特異的Ｔ細胞を得るのは困難である。
【００２０】
したがって、本発明は、癌患者において細胞性免疫を活性化して腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導することができる癌治療剤ならびに癌治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、癌抗原以外の抗原と、この抗原により活性化されたＴ細胞とを組み合わせて投与することにより、癌の有効な治療が可能であることを見いだした。すなわち、本発明は、癌抗原以外の抗原と組み合わせて患者に投与するための、その抗原により活性化されたＴ細胞を含む癌治療剤を提供する。本発明はまた、癌抗原以外の抗原により活性化されたＴ細胞と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原を含む癌治療剤を提供する。好ましくは、Ｔ細胞は本発明の癌治療剤を投与すべき患者に由来するものである。また好ましい態様においては、癌抗原以外の抗原は、癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍などに投与される。抗原により活性化されたＴ細胞は、癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍、静脈内などに投与される。
【００２２】
好ましくは、抗原により活性化されたＴ細胞を含む本発明の癌治療剤において、Ｔ細胞はこの抗原に特異的なＴｈ１細胞である。
【００２３】
本発明の癌治療剤において、好ましくは、抗原は菌体成分であり、例えば、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格からなる群より選択される。
【００２４】
また好ましくは、抗原は植物由来成分であり、例えば、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンからなる群より選択される。
【００２５】
また好ましくは、抗原は、化学合成物質であり、例えば、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンからなる群より選択される。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、抗原により活性化されたＴ細胞を含む本発明の癌治療剤を製造する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞を前記抗原により活性化することを含む。好ましくはＴ細胞は本発明の癌治療剤を投与される患者に由来するものである。本発明の方法においては、好ましくは、前記抗原およびＩＬ−２の存在下でＴ細胞を培養することによりＴ細胞を活性化する。
【００２７】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程は、抗体磁気ビーズまたはセルソーターを使用することにより
行われる。別の態様においては、本発明の方法は、分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む。
【００２８】
さらに別の態様においては、本発明は、癌抗原以外の抗原と、その抗原により活性化された本発明のＴ細胞とを含む、癌治療用組成物ならびに癌治療用キットを提供する。
【００２９】
本発明にしたがって、癌抗原以外の抗原と、その抗原により活性化されたＴ細胞とを担癌ホストに投与することにより、その生体内で腫瘍特異的ＣＴＬを誘導し、腫瘍を拒絶することができる。特に、本発明は、癌抗原特異的ワクチン療法のための癌抗原の情報が得られない癌、および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプがワクチン療法に適合しない癌患者において用いるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本方法による細胞の増殖
【図２】培養中のＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合
【図３】ＣＤ４陽性細胞の細胞内サイトカイン染色
【図４】ＰＰＤを反応させた刺激用細胞またはＰＰＤを反応させない刺激用細胞との共培養によるＩＦＮ−γ産生能の比較
【図５】各治療群における担癌マウスの腫瘍サイズの変化
【図６】各治療群における担癌マウスの生存率
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、癌抗原以外の抗原と、この抗原により活性化されたＴ細胞とを組み合わせて患者に投与することからなる、新規な癌の治療方法を提供する。これらを組み合わせて投与することにより、生体内で腫瘍特異的ＣＴＬが誘導され、腫瘍を拒絶することができる。
【００３２】
癌抗原以外の抗原としては、菌体成分、植物由来成分、および化学合成物質等を用いることができる。菌体成分の例としては、限定されないが、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格等が挙げられる。植物由来成分の例としては、限定されないが、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンが挙げられる。化学合成物質の例としては、限定されないが、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンが挙げられる。
【００３３】
抗原により活性化されたＴ細胞は、好ましくはこの抗原に特異的なＴｈ１細胞である。抗原により活性化されたＴ細胞は、以下の方法により製造することができる。
【００３４】
ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗原を加えた培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ：インビトロジェン社、血清を加えないか、またはヒトＡＢ型血清または培養細胞と同一血液型血清、好ましくは自己血清を０．１〜３０％、好ましくは５〜１０％加える。なおここでいう血清は、血漿または血漿を処理したもの、あるいはヒト以外の血清、血漿も含まれる）で培養する。抗原の濃度は、０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１．０〜１０μｇ／ｍｌである。さらに培養中の適当な時期（例えば１〜７日後、好ましくは３〜５日後）に、培地に終濃度で０．５〜５００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を加えてＴ細胞を活性化する。さらに、培養中の適当な時期に、同じ抗原を反応させた同一人の単核球をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理して不活性化した細胞で再刺激を行うことが好ましい。このようにして、抗原に特異的なＴ細胞を誘導することができる。
【００３５】
特に好ましくは、Ｔｈ１細胞が優先的に増殖する条件で単核球を培養することにより、抗原に特異的なＴｈ１細胞を誘導する。Ｔｈ１細胞を誘導する工程は、単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下で培養することにより行われる。
【００３６】
Ｔｈ細胞の誘導は、得られた細胞を蛍光標識した抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ８抗体を用いてデュアルカラー染色を行い、フローサイトメーターにてＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を測定することにより確認することができる。さらにＴｈ１細胞の誘導は、得られ
た細胞をブルフェルジンＡ存在下に抗ＣＤ３抗体で刺激した後にＩＦＮ−γの産生を測定することにより確認することができる。
【００３７】
Ｔｈ１細胞の抗原に対する特異性は、このＴｈ１細胞を、同じ抗原を反応させた同一人の単核球またはリンフォブラスト（ＬＣＬ）細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化したものと共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定することにより評価することができる。比較対照としては、Ｔｈ１細胞を、抗原を反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化した細胞と共培養したものを用いる。
【００３８】
また、上述のようにして得られた活性化Ｔ細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離してもよい。この工程は、ＣＤ４またはＣＤ８抗体を結合した磁気ビーズまたはセルソーターを使用して、抗原特異性を有するＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞を単離することにより行うことができる。このようにして分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とは、癌の治療において、最適な効果が得られるように任意の割合で混合することができる。
【００３９】
以上のようにして本発明にしたがって得られた抗原特異的Ｔ細胞は、抗原と組み合わせて癌の治療に用いることができる。本発明の抗原特異的Ｔ細胞を用いて治療しうる癌としては、例えば、扁平上皮癌，肺癌，膀胱癌，頭頚部癌，黒色腫，卵巣癌，子宮頚部、前立腺癌，乳癌，尿生殖器癌および消化器癌等が挙げられる。特に、本発明の抗原特異的Ｔｈ１細胞は、癌抗原特異的ワクチン療法のための癌抗原の情報が得られない癌、および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプが癌抗原ペプチドを用いたワクチン療法に適合しない癌患者の治療に有用である。
【００４０】
抗原を癌患者の癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍などに投与するとともに、抗原特異的Ｔ細胞を癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍、静脈内などに投与することにより、腫瘍内に浸潤した抗原特異的Ｔ細胞が抗原により活性化する。このことにより、腫瘍局所において癌抗原非特異的なＴｈ１主導の細胞性免疫が活性化され、非特異的に腫瘍の破壊がひき起こされる。非特異的な腫瘍の破壊にともない、その処理過程に生体内で腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）が誘導される。
【００４１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４２】
ヒトの末梢血から比重遠心法により回収した単核球に、２．５μｇ／ｍｌになるようにＰＰＤ（日本ビーシージー製造株式会社）を加えて培養し、４日目に２０Ｕ／ｍｌになるようにＩＬ−２を加えて培養を続けた。
【００４３】
７日目と１４日目に、ＰＰＤを反応させた同一人の単核球をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理して不活性化した細胞で再刺激を行い、ＩＬ−２の存在下にさらに培養を行ってＰＰＤ特異的なＴ細胞を誘導した。３０ｍｌの末梢血より１×１０10個以上の細胞を得た（図１）。
【００４４】
培養中の細胞を適宜回収し、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ８抗体を用いてデュアルカラー染色を行い、フローサイトメーターにてＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を測定した。
【００４５】
その結果、ＣＤ４陽性細胞の割合は増加し、ＣＤ８陽性細胞の割合は減少しており、本方法によりＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞が優位に増殖することが示された（図２）。
【００４６】
さらに回収した細胞の一部はブルフェルジンＡ存在下に抗ＣＤ３抗体で４時間の刺激を行い、細胞表面のＣＤ４と細胞内に蓄積したＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、それぞれに対する蛍光標識抗体を用いて３カラー染色を行った。
【００４７】
その結果、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の大部分がＩＦＮ−γを産生しており、ほとんどのＣＤ４陽性細胞がＴｈ１細胞であり、ほとんどのＣＤ８陽性細胞がＴｃ１細胞であった（図３）。
【００４８】
ＰＰＤを反応させた同一人の単核球またはリンフォブラスト（ＬＣＬ）細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化し、上で得られたＰＰＤ特異的Ｔ細胞と２４時間の共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。比較対照としてＰＰＤを反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化した細胞と、上で得られたＰＰＤ特異的Ｔ細胞との共培養を行った。
【００４９】
その結果、ＰＰＤを反応させた同一人の単核球またはＬＣＬ細胞との共培養ではＩＦＮ−γの強い産生を示し、ＰＰＤを反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞との共培養ではＩＦＮ−γの産生がほとんど見られなかった（図４）。
【００５０】
以上の結果より、本方法によりヒトにおいて容易にＰＰＤ特異的なＴ細胞が誘導されることが示された。
【実施例２】
【００５１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ．Ｇ７癌細胞株（ＥＬ−４癌細胞株に遺伝子導入により仮想癌抗原として卵白アルブミンＯＶＡを発現させた細胞）を皮内接種して担癌マウスモデルを作成し、腫瘍径が８〜１０ｍｍに達した後（２×１０6のＥ．Ｇ７癌細胞株を側腹部の
皮内接種した場合約１０日）に治療を開始した。
【００５２】
治療にはＥ．Ｇ７癌細胞株の抗原とは無関係な抗原としてＰＰＤを用いた。また同時に投与するＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞は、あらかじめＣ５７ＢＬ／６マウスにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを用いてエマルジョンにしたＰＰＤを１匹あたり１００μｇになるように免疫し、さらに２週間間隔で数回Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントを用いてエマルジョンにしたＰＰＤを１匹あたり１００μｇになるように過免疫しておき、最終免疫から７〜１０日後に回収したリンパ節細胞より誘導した。
【００５３】
ＰＰＤ免疫マウスのリンパ節細胞より磁気ビーズ標識抗マウスＣＤ４抗体を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を集め、２．５μｇ／ｍｌのＰＰＤ存在下に抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。本実験では、ＭＭＣ処理したＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞をＡＰＣとして用いた。さらに培養４日目より１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１２、１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、５０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体を加えて培養した（タイプ１培養条件）。
【００５４】
培養７日目に、これとは別に２．５μｇ／ｍｌのＰＰＤ存在下に一晩培養したＡＰＣをＭＭＣ処理したものと１：１になるよう混合し、タイプ１培養条件でさらに培養した。培養１４日目にも同様の操作を行い、その後、細胞内サイトカイン染色法にてＩＦＮ−γ産生細胞であることを確認し、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞を得た。
【００５５】
治療は次の３群に分けて行った（各群５匹ずつ）。１．ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞（２×１０７／匹）を尾静脈単独投与、２．ＰＰＤ（１０μｇ／匹）を腫瘍内単独投与、３．ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞（２×１０７／匹）尾静脈投与とＰＰＤ（１０μｇ／匹）腫瘍内投与とを併用。この治療を２日おきに計３回行った。
【００５６】
その結果、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞とＰＰＤとの併用群では腫瘍局所において激しい壊死が起こり腫瘍の完全な退縮がみられた。一方、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞単独投与群では顕著な抗腫瘍効果は認められず、ＰＰＤ単独投与群においては炎症による壊死はみられたものの顕著な抗腫瘍効果は認められなかった（図５）。
【００５７】
また各治療群の生存率をＥ．Ｇ７癌細胞株接種後６０日目まで追跡したところ、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞単独投与群およびＰＰＤ単独投与群においては３４〜３６日目に全例死亡したのに対し、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞とＰＰＤとの併用群では４０日目に１例死亡したものの、残り４例は６０日目まで生存していた（図６）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌以外の抗原に特異的なＴ細胞からなる、癌の治療に用いるための標的化Ｔ細胞の製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において癌とは悪性新生物をいい、また癌と腫瘍は同義として扱うものとする。
【０００３】
癌の主な治療法としては外科療法、化学療法、放射線療法があるが、それだけで癌細胞を根絶することはできない。これらの治療効果やその後の非再発期間の長さは、宿主の免疫能に依存すると考えられるが、化学療法、放射線療法の副作用により宿主の免疫能は影響を受け、これらの治療によるマイナスの影響は無視できない。
【０００４】
そこで宿主の生体防御機構を増強して癌を克服しようという考えから、免疫能を非特異的に増強させる菌体成分、植物由来成分などの生体外物質を用いた癌治療も試みられている。また免疫を調節する生体内物質であるサイトカイン類を使用した治療も進められている。これらの物質は生物応答修飾剤（ＢＲＭ）と呼ばれ、単独で癌治療に用いられることもあるが、外科療法、化学療法、放射線療法と組み合わせて用いられることもある。
【０００５】
ＢＲＭとして臨床応用されている菌体成分としては、ＢＣＧ、ＯＫ４３２（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎなどがあり、植物由来成分としてはＬｅｎｔｉｎａｎ、Ｓｏｎｉｆｉｌａｎ、Ｋｕｒｅｓｔｉｎなどがある。
【０００６】
ＢＣＧは結核予防のための弱毒性生ワクチンとして知られているが、ワクチンの副作用を取り除くためにＢＣＧ株の細胞壁骨格成分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）や結核菌の培養上清などから有効成分の分離が試みられた。結核の感染、既往や予防接種の検査に用いられるツベルクリンは、結核菌培養上清を過熱処理後に濾過したものであるが、最近ではこれを精製したＰＰＤ（ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）が使われている。
【０００７】
ＢＣＧは遅延型過敏症（ＤＴＨ）をひき起こし、ヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１細胞）を誘導することが知られている。ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＰＰＤもまたＢＣＧと同様にＤＴＨをひき起こし、ＢＣＧ−ＣＷＳによる免疫治療が多くの癌で有効であることが示された（例えば、非特許文献１参照）。
【０００８】
ＢＲＭ以外に宿主の免疫を増強する方法として、血液細胞をいったん生体外へ取り出し、サイトカイン類を加えて抗腫瘍効果を高めた免疫細胞を誘導した後、再び生体内に移入する治療法も行われている。末梢血より分離した単核球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下で培養することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抵抗性の腫瘍に対して幅広く抗腫瘍活性をもつリンフォカイン活性化キラ−（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ、ＬＡＫ）細胞を誘導することができる（例えば、非特許文献２参照）。その後、遺伝子組み換え技術により大量のＩＬ−２が入手可能となり（例えば、非特許文献３参照）、腫瘍に対するＬＡＫ細胞を用いた養子免疫療法の臨床応用がなされ、その有用性が示された（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
さらにＩＬ−２に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を加えて培養することにより、少量の末梢血から得られた単核球よりＬＡＫ活性をもつ細胞を大量に培養することが
可能となった（例えば、非特許文献５参照）。
【００１０】
末梢のＴリンパ球は細胞表面にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と共にＣＤ３分子を発現しており、ＣＤ４またはＣＤ８分子の発現の違いにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分類される。
【００１１】
細胞表面に発現した分子（たとえばＣＤ４分子、ＣＤ８分子）に対するＭｏＡｂと磁気ビーズを用いることにより、目的の細胞表面抗原を有する細胞を濃縮または除去することができる（例えば、特許文献１参照）。
【００１２】
Ｔｈ細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２などのタイプ１サイトカインを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのタイプ２サイトカインを産生するＴｈ２細胞に分けられ（例えば、非特許文献６参照）、Ｔｈ１細胞は細胞性免疫のエフェクターとして働き、Ｔｈ２細胞は体液性免疫の調節を担っている。またＴｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４はＴｈ１細胞を抑制する（例えば、非特許文献７参照）。
【００１３】
初期のＴｈ細胞活性化の際にＩＬ−１２の存在によりＴｈ１細胞の分化が起こり（例えば、非特許文献８参照）、ＩＬ−４の存在によりＴｈ２細胞の分化が起こる（例えば、非特許文献９参照）。
【００１４】
腫瘍局所ではＴｈ２細胞由来サイトカインが優位になっており（例えば、非特許文献１０参照）、癌免疫療法ではＴｈ１／Ｔｈ２バランスを是正しＴｈ１主導の細胞性免疫を活性化することも重要であり、ＢＣＧ由来の成分以外にもＴｈ１型のタイプ１サイトカインの産生を誘導するＢＲＭが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許番号 第２５３０９６６号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉら，１９９８，Ｐｏｒｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，７４（Ｂ）：５０−５５
【非特許文献２】Ｇｒｉｍｍら，１９８２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５５：１８２３−１８４１
【非特許文献３】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０２：３０５−３１０
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８５，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３：１４８５−１４９２
【非特許文献５】Ｏｃｈｏａら，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７２８−２７３３
【非特許文献６】Ｍｏｓｍｓｎｎら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：２３４８−２３５７
【非特許文献７】Ｍａｇｇｉら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２１４２−２１４７
【非特許文献８】Ｓｅｄｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０１８８−１０１９２
【非特許文献９】Ｈｓｉｅｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０６５−６０６９
【非特許文献１０】Ｈｕａｎｇ，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：３８４７−３８５３
【非特許文献１１】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：５６１９−５６２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
担癌状態ではＴｈ１／Ｔｈ２バランスがくずれＴｈ２細胞由来サイトカインが優位になっているため、Ｔｈ１主導の細胞性免疫の活性化が必要である。
【００１８】
生体外で腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、手術によって患者本人の腫瘍組織を得る必要がある。また最近では腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導が可能となっているが、限られた既知の腫瘍抗原ペプチドと限られたタイプの主要組織適合性複合体（ヒト白血球抗原ともいう）を有する患者しか適応できない。
【００１９】
さらに腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、多くの手間と時間さらには誘導に使用するＡＰＣ（抗原提示細胞）を得るために大量の血液を必要とし、生体外で細胞治療に必要な量の腫瘍特異的Ｔ細胞を得るのは困難である。
【００２０】
したがって、本発明は、癌患者において細胞性免疫を活性化して腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導することができる癌治療剤ならびに癌治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、癌抗原以外の抗原と、この抗原により活性化されたＴ細胞とを組み合わせて投与することにより、癌の有効な治療が可能であることを見いだした。すなわち、本発明は、癌抗原以外の抗原と組み合わせて患者に投与するための、その抗原により活性化されたＴ細胞を含む癌治療剤を提供する。本発明はまた、癌抗原以外の抗原により活性化されたＴ細胞と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原を含む癌治療剤を提供する。好ましくは、Ｔ細胞は本発明の癌治療剤を投与すべき患者に由来するものである。また好ましい態様においては、癌抗原以外の抗原は、癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍などに投与される。抗原により活性化されたＴ細胞は、癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍、静脈内などに投与される。
【００２２】
好ましくは、抗原により活性化されたＴ細胞を含む本発明の癌治療剤において、Ｔ細胞はこの抗原に特異的なＴｈ１細胞である。
【００２３】
本発明の癌治療剤において、好ましくは、抗原は菌体成分であり、例えば、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格からなる群より選択される。
【００２４】
また好ましくは、抗原は植物由来成分であり、例えば、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンからなる群より選択される。
【００２５】
また好ましくは、抗原は、化学合成物質であり、例えば、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンからなる群より選択される。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、抗原により活性化されたＴ細胞を含む本発明の癌治療剤を製造する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞を前記抗原により活性化することを含む。好ましくはＴ細胞は本発明の癌治療剤を投与される患者に由来するものである。本発明の方法においては、好ましくは、前記抗原およびＩＬ−２の存在下でＴ細胞を培養することによりＴ細胞を活性化する。
【００２７】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程は、抗体磁気ビーズまたはセルソーターを使用することにより
行われる。別の態様においては、本発明の方法は、分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む。
【００２８】
さらに別の態様においては、本発明は、癌抗原以外の抗原と、その抗原により活性化された本発明のＴ細胞とを含む、癌治療用組成物ならびに癌治療用キットを提供する。
【００２９】
本発明にしたがって、癌抗原以外の抗原と、その抗原により活性化されたＴ細胞とを担癌ホストに投与することにより、その生体内で腫瘍特異的ＣＴＬを誘導し、腫瘍を拒絶することができる。特に、本発明は、癌抗原特異的ワクチン療法のための癌抗原の情報が得られない癌、および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプがワクチン療法に適合しない癌患者において用いるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本方法による細胞の増殖
【図２】培養中のＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合
【図３】ＣＤ４陽性細胞の細胞内サイトカイン染色
【図４】ＰＰＤを反応させた刺激用細胞またはＰＰＤを反応させない刺激用細胞との共培養によるＩＦＮ−γ産生能の比較
【図５】各治療群における担癌マウスの腫瘍サイズの変化
【図６】各治療群における担癌マウスの生存率
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、癌抗原以外の抗原と、この抗原により活性化されたＴ細胞とを組み合わせて患者に投与することからなる、新規な癌の治療方法を提供する。これらを組み合わせて投与することにより、生体内で腫瘍特異的ＣＴＬが誘導され、腫瘍を拒絶することができる。
【００３２】
癌抗原以外の抗原としては、菌体成分、植物由来成分、および化学合成物質等を用いることができる。菌体成分の例としては、限定されないが、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格等が挙げられる。植物由来成分の例としては、限定されないが、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンが挙げられる。化学合成物質の例としては、限定されないが、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンが挙げられる。
【００３３】
抗原により活性化されたＴ細胞は、好ましくはこの抗原に特異的なＴｈ１細胞である。抗原により活性化されたＴ細胞は、以下の方法により製造することができる。
【００３４】
ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗原を加えた培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ：インビトロジェン社、血清を加えないか、またはヒトＡＢ型血清または培養細胞と同一血液型血清、好ましくは自己血清を０．１〜３０％、好ましくは５〜１０％加える。なおここでいう血清は、血漿または血漿を処理したもの、あるいはヒト以外の血清、血漿も含まれる）で培養する。抗原の濃度は、０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１．０〜１０μｇ／ｍｌである。さらに培養中の適当な時期（例えば１〜７日後、好ましくは３〜５日後）に、培地に終濃度で０．５〜５００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を加えてＴ細胞を活性化する。さらに、培養中の適当な時期に、同じ抗原を反応させた同一人の単核球をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理して不活性化した細胞で再刺激を行うことが好ましい。このようにして、抗原に特異的なＴ細胞を誘導することができる。
【００３５】
特に好ましくは、Ｔｈ１細胞が優先的に増殖する条件で単核球を培養することにより、抗原に特異的なＴｈ１細胞を誘導する。Ｔｈ１細胞を誘導する工程は、単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下で培養することにより行われる。
【００３６】
Ｔｈ細胞の誘導は、得られた細胞を蛍光標識した抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ８抗体を用いてデュアルカラー染色を行い、フローサイトメーターにてＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を測定することにより確認することができる。さらにＴｈ１細胞の誘導は、得られ
た細胞をブルフェルジンＡ存在下に抗ＣＤ３抗体で刺激した後にＩＦＮ−γの産生を測定することにより確認することができる。
【００３７】
Ｔｈ１細胞の抗原に対する特異性は、このＴｈ１細胞を、同じ抗原を反応させた同一人の単核球またはリンフォブラスト（ＬＣＬ）細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化したものと共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定することにより評価することができる。比較対照としては、Ｔｈ１細胞を、抗原を反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化した細胞と共培養したものを用いる。
【００３８】
また、上述のようにして得られた活性化Ｔ細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離してもよい。この工程は、ＣＤ４またはＣＤ８抗体を結合した磁気ビーズまたはセルソーターを使用して、抗原特異性を有するＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞を単離することにより行うことができる。このようにして分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とは、癌の治療において、最適な効果が得られるように任意の割合で混合することができる。
【００３９】
以上のようにして本発明にしたがって得られた抗原特異的Ｔ細胞は、抗原と組み合わせて癌の治療に用いることができる。本発明の抗原特異的Ｔ細胞を用いて治療しうる癌としては、例えば、扁平上皮癌，肺癌，膀胱癌，頭頚部癌，黒色腫，卵巣癌，子宮頚部、前立腺癌，乳癌，尿生殖器癌および消化器癌等が挙げられる。特に、本発明の抗原特異的Ｔｈ１細胞は、癌抗原特異的ワクチン療法のための癌抗原の情報が得られない癌、および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のタイプが癌抗原ペプチドを用いたワクチン療法に適合しない癌患者の治療に有用である。
【００４０】
抗原を癌患者の癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍などに投与するとともに、抗原特異的Ｔ細胞を癌組織内、癌組織近傍、所属リンパ組織近傍、静脈内などに投与することにより、腫瘍内に浸潤した抗原特異的Ｔ細胞が抗原により活性化する。このことにより、腫瘍局所において癌抗原非特異的なＴｈ１主導の細胞性免疫が活性化され、非特異的に腫瘍の破壊がひき起こされる。非特異的な腫瘍の破壊にともない、その処理過程に生体内で腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞障害性Ｔ細胞）が誘導される。
【００４１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４２】
ヒトの末梢血から比重遠心法により回収した単核球に、２．５μｇ／ｍｌになるようにＰＰＤ（日本ビーシージー製造株式会社）を加えて培養し、４日目に２０Ｕ／ｍｌになるようにＩＬ−２を加えて培養を続けた。
【００４３】
７日目と１４日目に、ＰＰＤを反応させた同一人の単核球をマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理して不活性化した細胞で再刺激を行い、ＩＬ−２の存在下にさらに培養を行ってＰＰＤ特異的なＴ細胞を誘導した。３０ｍｌの末梢血より１×１０10個以上の細胞を得た（図１）。
【００４４】
培養中の細胞を適宜回収し、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ８抗体を用いてデュアルカラー染色を行い、フローサイトメーターにてＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を測定した。
【００４５】
その結果、ＣＤ４陽性細胞の割合は増加し、ＣＤ８陽性細胞の割合は減少しており、本方法によりＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞が優位に増殖することが示された（図２）。
【００４６】
さらに回収した細胞の一部はブルフェルジンＡ存在下に抗ＣＤ３抗体で４時間の刺激を行い、細胞表面のＣＤ４と細胞内に蓄積したＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、それぞれに対する蛍光標識抗体を用いて３カラー染色を行った。
【００４７】
その結果、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の大部分がＩＦＮ−γを産生しており、ほとんどのＣＤ４陽性細胞がＴｈ１細胞であり、ほとんどのＣＤ８陽性細胞がＴｃ１細胞であった（図３）。
【００４８】
ＰＰＤを反応させた同一人の単核球またはリンフォブラスト（ＬＣＬ）細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化し、上で得られたＰＰＤ特異的Ｔ細胞と２４時間の共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。比較対照としてＰＰＤを反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化した細胞と、上で得られたＰＰＤ特異的Ｔ細胞との共培養を行った。
【００４９】
その結果、ＰＰＤを反応させた同一人の単核球またはＬＣＬ細胞との共培養ではＩＦＮ−γの強い産生を示し、ＰＰＤを反応させない同一人の単核球またはＬＣＬ細胞との共培養ではＩＦＮ−γの産生がほとんど見られなかった（図４）。
【００５０】
以上の結果より、本方法によりヒトにおいて容易にＰＰＤ特異的なＴ細胞が誘導されることが示された。
【実施例２】
【００５１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ．Ｇ７癌細胞株（ＥＬ−４癌細胞株に遺伝子導入により仮想癌抗原として卵白アルブミンＯＶＡを発現させた細胞）を皮内接種して担癌マウスモデルを作成し、腫瘍径が８〜１０ｍｍに達した後（２×１０6のＥ．Ｇ７癌細胞株を側腹部の
皮内接種した場合約１０日）に治療を開始した。
【００５２】
治療にはＥ．Ｇ７癌細胞株の抗原とは無関係な抗原としてＰＰＤを用いた。また同時に投与するＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞は、あらかじめＣ５７ＢＬ／６マウスにＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントを用いてエマルジョンにしたＰＰＤを１匹あたり１００μｇになるように免疫し、さらに２週間間隔で数回Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバントを用いてエマルジョンにしたＰＰＤを１匹あたり１００μｇになるように過免疫しておき、最終免疫から７〜１０日後に回収したリンパ節細胞より誘導した。
【００５３】
ＰＰＤ免疫マウスのリンパ節細胞より磁気ビーズ標識抗マウスＣＤ４抗体を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を集め、２．５μｇ／ｍｌのＰＰＤ存在下に抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。本実験では、ＭＭＣ処理したＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞をＡＰＣとして用いた。さらに培養４日目より１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１２、１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、５０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体を加えて培養した（タイプ１培養条件）。
【００５４】
培養７日目に、これとは別に２．５μｇ／ｍｌのＰＰＤ存在下に一晩培養したＡＰＣをＭＭＣ処理したものと１：１になるよう混合し、タイプ１培養条件でさらに培養した。培養１４日目にも同様の操作を行い、その後、細胞内サイトカイン染色法にてＩＦＮ−γ産生細胞であることを確認し、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞を得た。
【００５５】
治療は次の３群に分けて行った（各群５匹ずつ）。１．ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞（２×１０７／匹）を尾静脈単独投与、２．ＰＰＤ（１０μｇ／匹）を腫瘍内単独投与、３．ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞（２×１０７／匹）尾静脈投与とＰＰＤ（１０μｇ／匹）腫瘍内投与とを併用。この治療を２日おきに計３回行った。
【００５６】
その結果、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞とＰＰＤとの併用群では腫瘍局所において激しい壊死が起こり腫瘍の完全な退縮がみられた。一方、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞単独投与群では顕著な抗腫瘍効果は認められず、ＰＰＤ単独投与群においては炎症による壊死はみられたものの顕著な抗腫瘍効果は認められなかった（図５）。
【００５７】
また各治療群の生存率をＥ．Ｇ７癌細胞株接種後６０日目まで追跡したところ、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞単独投与群およびＰＰＤ単独投与群においては３４〜３６日目に全例死亡したのに対し、ＰＰＤ特異的Ｔｈ１細胞とＰＰＤとの併用群では４０日目に１例死亡したものの、残り４例は６０日目まで生存していた（図６）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌抗原以外の抗原と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原により活性化されたＴ細胞を含む癌治療剤。
【請求項２】
癌抗原以外の抗原により活性化されたＴ細胞と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原を含む癌治療剤。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が前記抗原に特異的なＴｈ１細胞である、請求項１または２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
前記抗原が菌体成分である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項５】
菌体成分が、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格からなる群より選択される、請求項４記載の癌治療剤。
【請求項６】
前記抗原が植物由来成分である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項７】
植物由来成分が、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンからなる群より選択される、請求項６記載の癌治療剤。
【請求項８】
前記抗原が化学合成物質である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項９】
化学合成物質が、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンからなる群より選択される、請求項８記載の癌治療剤。
【請求項１０】
請求項１記載の癌治療剤を製造する方法であって、Ｔ細胞を前記抗原により活性化することを含む方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞が前記患者に由来するものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞を活性化する工程が、前記抗原およびＩＬ−２の存在下でＴ細胞を培養することを含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む、請求項１０−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、セルソーターを使用することにより行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む、請求項１３−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
癌抗原以外の抗原と、前記抗原により活性化されたＴ細胞とを含む、癌治療用組成物。
【請求項１８】
癌抗原以外の抗原と、前記抗原により活性化されたＴ細胞とを含む、癌治療用キット。
【請求項１】
癌抗原以外の抗原と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原により活性化されたＴ細胞を含む癌治療剤。
【請求項２】
癌抗原以外の抗原により活性化されたＴ細胞と組み合わせて患者に投与するための、前記抗原を含む癌治療剤。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が前記抗原に特異的なＴｈ１細胞である、請求項１または２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
前記抗原が菌体成分である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項５】
菌体成分が、ＰＰＤ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ、ＯＫ４３２、Ａｎｃｅｒ，Ｂｅｓｔａｔｉｎ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、ＬＣ９０１８、ＷＰＧ、およびＮｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ細胞壁骨格からなる群より選択される、請求項４記載の癌治療剤。
【請求項６】
前記抗原が植物由来成分である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項７】
植物由来成分が、レンチナン、ソニフィランおよびクレスチンからなる群より選択される、請求項６記載の癌治療剤。
【請求項８】
前記抗原が化学合成物質である、請求項１−３のいずれかに記載の癌治療剤。
【請求項９】
化学合成物質が、ＭＤＰ、ＭＤＰ−Ｌｙｓ、レバミゾールおよびシメチジンからなる群より選択される、請求項８記載の癌治療剤。
【請求項１０】
請求項１記載の癌治療剤を製造する方法であって、Ｔ細胞を前記抗原により活性化することを含む方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞が前記患者に由来するものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞を活性化する工程が、前記抗原およびＩＬ−２の存在下でＴ細胞を培養することを含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む、請求項１０−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原により活性化されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、セルソーターを使用することにより行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む、請求項１３−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
癌抗原以外の抗原と、前記抗原により活性化されたＴ細胞とを含む、癌治療用組成物。
【請求項１８】
癌抗原以外の抗原と、前記抗原により活性化されたＴ細胞とを含む、癌治療用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２６５３２７（Ｐ２０１０−２６５３２７Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８８６８５（Ｐ２０１０−１８８６８５）
【出願日】平成２２年８月２５日（２０１０．８．２５）
【分割の表示】特願２００４−１６３８７９（Ｐ２００４−１６３８７９）の分割
【原出願日】平成１６年５月２日（２００４．５．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年１１月５日 日本免疫学会発行の「日本免疫学会総会・学術集会記録 第３３巻」に発表
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２５日（２０１０．８．２５）
【分割の表示】特願２００４−１６３８７９（Ｐ２００４−１６３８７９）の分割
【原出願日】平成１６年５月２日（２００４．５．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年１１月５日 日本免疫学会発行の「日本免疫学会総会・学術集会記録 第３３巻」に発表
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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