癌療法のための、樹状細胞を癌に対して感作させるための癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体ペプチド
本発明は、癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に対する樹状細胞をパルシングするために使用することができるペプチドまたはペプチド混合物を作製する方法に関する。より詳細には、免疫系が特異的抗原を攻撃するように方向付けできる様々な異なる供給源から樹状細胞を得ることができる。ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで感作させた後、樹状細胞は、個体の自己免疫系を補助して、あらゆる種類のＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌に対して保護するまたはそれを処置する。また、ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を検出、診断および監視、ならびに処置するためにも使用し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮出願第６１／１６３，８０８号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に関する。より詳細には、本発明は、樹状細胞を癌に対して感作させるために使用することができるペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の初期の特徴づけは、癌胎児性抗原またはラミニン受容体を研究していた３つの独立のグループによって行われた［１〜３（非特許文献１〜３）］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰとは、様々な異なる癌において過剰発現され、リボソームタンパク質ｐ４０としての二重機能を有する、高度に保存されたタンパク質である［４〜２７］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質は２９５個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなり、約３７〜４４ＫＤａの分子量を有する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの構造が最近２．１５Åまで解明され、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸１１２から１４０までの間の領域がラミニン受容体タンパク質（ＬＲＰ）を形成するためのＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化［２８］に関与していることを示す。［２８］。ラミニン受容体の成熟型は、６７ｋＤａの分子量を有するアセチル化された未成熟ＬＲＰの二量体であると考えられる。成熟した６７ｋＤａの型は多くの正常細胞および腫瘍細胞上に存在するが、胎児および腫瘍細胞によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの優先的な発現が存在すると考えられる。したがって、発現パターンにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、癌および他の疾患を処置するために免疫系を感作させるための可能な候補タンパク質となる［６］。したがって、樹状細胞に基づく治療における特定のＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの使用が新規の応用である。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）とは、哺乳動物の免疫系の一部を形成する免疫細胞である。その主な機能は、抗原物質をプロセスし、それを免疫系の他の細胞の表面上に提示することである。したがって、これらは抗原提示細胞として機能する。樹状細胞は非リンパ組織と直接情報交換し、傷害シグナル（例えば、虚血、感染症、もしくは炎症）または腫瘍増殖について非リンパ組織を調査する。シグナル伝達された後、樹状細胞は、ＩＬ−１、ＴＮＦアルファ、ならびにリンパ球および骨髄性細胞を始動させる様々な他の炎症性サイトカインを放出することによって免疫応答を開始させる。例えば腫瘍に対する免疫不全など、様々な免疫不全が、樹状細胞の機能の損失の結果として生じると考えられている。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作させ、Ｔ細胞発生中の自己抗原および免疫中の外来抗原の両方の抗原をｉｎ ｓｉｔｕでＴ細胞に提示するための有効な経路を提供する高い能力を有する。したがって、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍または感染性疾患のワクチンアジュバントとして使用することに関する関心が高まっている。樹状細胞は、免疫系が特異的抗原を攻撃するように方向付けできる様々な異なる供給源（骨髄およびリンパ系）に由来することができる。例えば、これらは以下の供給源に由来し得る：単球由来（ＣＤ１４＋）、造血幹細胞由来（ＣＤ３４＋もしくはＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１１７＋）、形質細胞様（ＣＤ３０３＋／ＣＤ３０４＋）、骨髄由来（ＣＤ１ｃ＋もしくはＣＤ１４１＋もしくはＣＤ２０９＋）、またはランゲルハンス細胞。ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで感作させた後、樹状細胞は、あらゆる種類のＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患または癌に対して保護するまたはそれを処置するために、個体の自己免疫系を補助する。感作、または樹状細胞のパルシングとは、標的となっている免疫応答を解明するために樹状細胞を標的タンパク質に曝露させるプロセスである。
【０００５】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ樹状細胞療法は、後期の癌腫を有する患者の生存率を最小限の副作用で増大させることが示されている［１３、２２］。以前の実験では、樹状細胞を感作させるために推定上のＭＨＣ（主要組織適合性複合体）結合配列を有するペプチドを使用していた。しかし、推定上のＭＨＣ結合部位は、ペプチド上のその位置が原因で、またはそれが複数のペプチドにまたがるために、免疫系に見逃される場合がある。Ｓｉｅｇｅｌらは、ＨＬＡ−Ａ＊２０１を標的としたペプチドを使用したが、ペプチドの溶解度およびペプチドに関連する他の問題を考慮しなかった［２２］。Ｒｏｈｒｅｒらは、マウスに由来するＯＦＡ／ｉＬＲＰの１２量体ペプチドに重複したアミノ酸の増殖プロフィールを分析した［２９］。この研究では比Ｘ／ｎの分析に焦点を当て、Ｘはアミノ酸中のタンパク質の長さであり、ｎはペプチドの長さである（図１）。しかし、この連続的なペプチド方法に基づいても、推定上のＨＬＡ（ヒト白血球抗原）部位は、それだけには限定されないが、ペプチド溶解度、ペプチド構造、２つのペプチド間に位置するＨＬＡ部位、ＨＬＡ結合を制限するアミノ酸に隣接するＨＬＡ部位、および不適切な二次構造を含めた様々な理由が原因で、依然として免疫系によって見逃されるまたは認識されない場合がある。したがって、連続的なペプチドの使用は、情報価値がある一方で、完全長タンパク質を処理した場合に認識される可能性がある有用なタンパク質配列を見逃す高い確率を有する。実際、以前の研究では、公的に利用可能なＨＬＡ結合配列の予測プログラムと免疫応答を生じる可能性がより高い領域を発見するための統計的方法の使用を組み合わせることによって判明した、推定上のＨＬＡ結合配列のうちのいくつかを示すことができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅｓｏｔ， Ｈ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９８３）２（６）：ｐ８６１〜８６５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｎｏｆｆ， Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）９６（５）：ｐ１４７５〜９
【非特許文献３】Ｒａｏ， Ｎ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９８３）１１１（３）：ｐ８０４〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらに、以前のＯＦＡ／ｉＬＲＰ細胞に基づく療法では、細菌発現させたまたは小さなＨＬＡ特異的ペプチドを使用していた。［１３、２２］。細菌発現は時間がかかり、ＧＭＰに認定された様式で産生させることが困難である。したがって、樹状細胞および免疫系を刺激するために推定上のＭＨＣ結合部位の数が増加した領域を有するように具体的に設計されたペプチドを開発する必要性が存在する。また、ペプチドを用いた有効なＯＦＡ／ｉＬＲＰ樹状細胞療法を開発する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、樹状細胞を感作させることができる単離ペプチドまたはその混合物を提供する。ペプチドの例には、それだけには限定されないが、
【０００９】
【化１】
およびその混合物が含まれる。
【００１０】
さらなるアミノ酸をペプチドまたはペプチド混合物のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかに付加させ得る。一実施形態では、本発明のペプチドには以下のペプチドが含まれる：
【００１１】
【化２】
別の実施形態では、本発明のペプチドはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する。ペプチドは樹状細胞を感作させることができる。
【００１２】
本発明のペプチドは、ペプチドの免疫刺激、安定性、および／または溶解度を増大させる担体と結合体化させ得る。担体の例には、それだけには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏ／ｅｌｅｃｔｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、およびコロイド粒子が含まれる。
【００１３】
また、本発明のペプチドは、アセチル化、脂肪酸性化（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ミリスチン酸酸性化（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化（ａｂｉｄａｔｉｏｎ）、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＡＨＸ、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、または多抗原性ペプチド系（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＡＰ）が含まれるように修飾してもよい。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドが含まれる組成物を提供する。組成物は医薬組成物またはワクチンであることができる。医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれ得る。また、組成物は、本発明のペプチドによって感作させた樹状細胞であってもよい。
【００１５】
また、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法も提供する。該方法には、本発明のペプチドを、個々にまたは混合物として、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で被験体に投与するステップが含まれる。一実施形態では、ペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導する。
【００１６】
別の実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）樹状細胞を本発明のペプチドで感作させるステップと、（ｂ）感作させた樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で、被験体に投与するステップとを含む。
【００１７】
また、本発明のペプチドは、試料中の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法で使用してもよい。該方法は、
（ａ）本発明のペプチドを、抗体がペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で試料と接触させるステップと、
（ｂ）試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法で使用する。該方法は、（１）本発明のペプチドを、療法に対する被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明のペプチドは、被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法で使用する。処置は、Ｔ細胞関連応答またはＢ細胞関連応答のいずれか（抗体応答）を誘導し得る。該方法は、（１）処置を受ける被験体の生体液（ｂｉｏｆｌｕｉｄ）を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、ペプチドとＴ細胞もしくはＢ細胞またはＴ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む。
【００２０】
本発明の上述および他の特長ならびにこれらを獲得および使用する様式は、以下の説明を添付の図面と併せて参照することによって、より明らかとなり、かつ最も良好に理解されるであろう。図面は本発明の典型的な実施形態のみを示し、したがってその範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＨＬＡ結合モチーフのコンピュータ分析を示す図である。（Ａ）は、予測の関数としてのアミノ酸の数を示すグラフである。（Ｂ）は、％ＯＰＴの関数としてのアミノ酸の数を示すグラフである。（Ｃ）は、５個のアミノ酸のビンの関数としての分布部位の数を示すグラフである。
【図２】図２は、樹状細胞の感作における選択したペプチドのウィスカープロットを示す図である。％ＯＰＴの関数としての、クラスター形成したＨＬＡ結合ペプチドを示すグラフである。中実の丸は、結果を歪める可能性があり、最も強い免疫原性の領域が見つかる場所の不当表示を可能にする、外れ値を示す。
【図３Ａ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｃ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｄ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、細胞接着に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果を示す図である。（Ａ）は、ＤＵ−１４５細胞接着を示すグラフである。（Ｂ）は、ＳＫ−ＭＥＬ細胞接着を示すグラフである。
【図６】図６は、細胞生存度に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果を示す図である。（Ａ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド１における細胞生存度を示すグラフである。（Ｂ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド２における細胞生存度を示すグラフである。（Ｃ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド３における細胞生存度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一態様は、樹状細胞をＯＦＡ／ｉＬＲＰに対してパルシングするために使用できるペプチドまたはペプチド混合物を提供する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質の特異的領域を認識するように免疫系を方向付けるペプチドは、ホモ二量体形成領域、ラミニン結合領域、多剤耐性領域、リボソーム相互作用領域、および生物学的意義を有する他の部位などの、様々なユニークなタンパク質領域を中心に設計されている。ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体形成、抗原性、ＭＨＣ−１結合、ＭＨＣ−２結合、プロテアソーム切断、溶媒接近性、およびタンパク質配列に特異的なペプチドを焦点として、完全長のタンパク質に基づいて設計されている。本発明では、コンピュータおよび統計的分析を用いて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患の療法に対して使用し得る最適なペプチドを決定する。この方法はＸ−ｎペプチドのコンピュータ分析および複数のペプチド長さの迅速な分析の付加を可能にし、これにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたは同様の処置／療法で使用される任意の他の可能なタンパク質を用いた、樹状細胞またはワクチン接種療法のための最適なペプチドの発生の確率が増加する。
【００２３】
様々なＯＦＡ／ｉＬＲＰエピトープの分布を決定するために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質配列を、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いてすべての公知のＨＬＡ結合モチーフについてマイニングした（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｊｕｔｔａ Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｎｉｅｌｓ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｅｍｍｅｒｉｃｈ、Ｏｓｋａｒ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｃｈｏｒ、Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ： ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９年）５０巻：２１３〜２１９頁（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅからアクセス））。しかし、ＨＬＡ結合モチーフを個々に分析する代わりに、データベース中のすべての公知のＨＬＡ結合モチーフの表を、配列、開始部位、および％最適結合（実験ＨＬＡ結合データに対する％一致）を用いてＥｘｃｅｌに保存した。ＨＬＡ結合部位のデータが得られた後、Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＰｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いてこれらを分析した。ＨＬＡ結合部位が増加した領域を探すために、いくつかの異なる分析を行った。まず、予測されたＨＬＡ結合部位の開始部位をプロットして、ＨＬＡ結合の確率が増加している潜在的な領域を示した。その後、％最適（ＯＰＴ）を検査し、アミノ酸開始部位に対してプロットした。最後に、ＨＬＡ結合部位の数が増加した領域を探すために、部位の数をビニングした（５個のアミノ酸）。これらの分析を一緒にして、より大きなＨＬＡ結合部位の分布を有する特異的領域が存在していたことが示された。より多数のＨＬＡ結合部位を有する領域が同定された後、これらの領域中のＥｘｃｅｌシートからのデータを抽出し、％ＯＰＴをすべての予測されたＨＬＡ結合領域に対してプロットした。有意な差異を有する領域を全タンパク質（すべてのＨＬＡ部位）に対して分析するために、選択したペプチド領域を一元配置ＡＮＯＶＡで分析し、続いてダネットの多重比較試験を行った。分析により、群間に有意な差異が存在することが示された（ｐ＝０．００６８）。ダネットの事後分析により、１３２〜１３４および２１１〜２１７のペプチド群がすべてのＭＨＣペプチドの対照群と有意に異なっていたことが示された（＊＝ｐ＜０．０５）（図２）。
【００２４】
本明細書中に記載の本発明のマイニング方法を用いて、免疫系を感作させるために使用できるペプチドを同定した。表１は、本発明のペプチド配列の例のリストを提供する。領域がＭＨＣタンパク質と結合できると推定される回数を分析することで、ペプチド領域を選択および／または組み合わせて生物活性ペプチドを発生させることができる（図１）。分布分析を領域の平均％ＯＰＴスコアと共に用いることで、５個の領域が、免疫系の適切な構成成分と結合する確率がより高いことが見出された。これにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患を処置するために、様々な異なるｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの刺激を用いて患者を感作させることが可能となる。
【００２５】
したがって、一実施形態では、本発明のペプチドには、それだけには限定されないが、
【００２６】
【化３】
およびその混合物が含まれる。さらなるアミノ酸をペプチドまたはペプチド混合物のｎ末端および／またはｃ末端に付加させ得る。別の実施形態では、本発明のペプチドはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する。
【００２７】
本発明のペプチドは、免疫刺激、安定性、および／またはペプチド溶解度のために適切な担体と結合体化させ得る。結合体化の種類には、それだけには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、コロイド粒子、他のペプチド配列および様々なタンパク質で完成されるものが含まれる。結合体化のためのシステイン残基の位置は、必要に応じていずれかの末端または内部に存在することができる。結合体化の目的は、免疫系、処置としての抗癌性、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに関連する任意の他の関連活性を増大させることである。
【００２８】
本発明のペプチド配列は、より高い免疫系の反応性、増加した溶解度、および他の機能を可能にするためにわずかに変動してもよく、ペプチド配列のそのような変動は本発明のペプチドの一部であると見なされる。さらに、１つまたは複数の本発明の免疫反応性ペプチド配列を一緒に配置して新しい免疫反応性ペプチドを形成し得る。配列は、十分予測可能な免疫活性の領域またはいくつかの他の部位もしくはタンパク質に由来することができる。さらに、ペプチドは、免疫系に関連しない特定の機能を遮断または増強するために使用し得る。１つまたは複数の反復ペプチドの連結されたペプチドを作製して、長い生物活性ポリマーを形成し得る。製造中、ペプチドは、それだけには限定されないが、アセチル化、ホルミル化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、脂肪酸性化、ミリスチン酸酸性化、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）、ならびに／または、溶解度、安定性、免疫反応性、および／もしくは生物活性を増大させることを含めた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド機能に影響を与える他のものを含めた、１つまたは複数の修飾を有し得る。
【００２９】
本発明のペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患またはワクチンの処置中の非特異的な効果を減少させ得る、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に向けることができる。ペプチドは、表１に示す１つのペプチド配列またはペプチド配列の組合せから作製する。どの領域が免疫系刺激の確率が増加しているかを決定するために、クラスター形成した推定上のＨＬＡ結合部位を設計し、平均％ＯＰＴ（コンセンサスと比較した場合のペプチドのスコア）［５３、５４］を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ全体にわたるすべての推定上のＨＬＡ部位と比較した（図２）。比較に使用した複数の推定上のＨＬＡ結合部位が含まれるように具体的に設計したペプチドの例を図２に記載する。
【００３０】
個々の本発明のペプチドまたは組合せを用いて、免疫系を、提供したＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列で感作させ得る。また、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する免疫応答を誘導するように設計したペプチドを用いて、それだけには限定されないが、受容体結合、ラミニン機能の遮断および／または他のＯＦＡ／ｉＬＲＰの細胞機能に影響を与えることを含めた、さらなる臨床応用も提供し得る。ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの免疫反応性を増大させるために最終産物を結合体化させ得る。結合体化は、マレジオアミドＫＬＨタンパク質と反応させるためのシステインの付加を含めた、本明細書中に記載または当分野で公知の様々な方法によって形成させ得る［５５、５６］。これらのペプチドおよびその組合せは、癌に対するｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのワクチン接種として使用する前に結合体化または修飾し得る。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、コンピュータに基づく手法により、樹状細胞および免疫系の療法に使用し得るいくつかの可能なタンパク質配列を同定した。一実施形態では、平均％ＯＰＴを、アミノ酸１３２、１１７および５４を中心に設計された３個のペプチドについて計算した（図２）。設計したペプチドを平均％ＯＰＴスコアと比較し、これらはすべて平均を超えており、１３２領域は有意に異なっていた（図２）。ペプチドはＨＬＡプロトタイプ配列の一部ではない少なくとも３個のアミノ酸のフランキング配列を有しており、必要な場合は抗原プロセッシングおよびＨＬＡ結合を最適化するために修飾することができる。他の可能なペプチドはアミノ酸１０４および２１１付近から開始され、単独で、または他のペプチドと組み合わせて使用することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは、ｅｘ ｖｉｖｏの樹状細胞の誘導および感作中に細菌発現させたＯＦＡ／ｉＬＲＰを置き換えるために使用することができる。ヒトまたは獣医学的な応用に適している限りは、ペプチドを様々な巨大分子と結合体化させることができる。
【００３３】
ペプチドは、化学合成またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどを用いた生化学的合成によって調製し得る。当業者に周知の方法を合成に使用し得る。
【００３４】
本発明のペプチドが化学合成である場合、ペプチド合成の分野で周知の方法を使用し得る。例えば、アジド方法、酸塩化物方法、酸無水物方法、混合酸無水物方法、ＤＣＣ方法、活性エステル方法、カルボジイミダゾール方法および酸化還元方法などの方法を列挙し得る。固相合成または液相合成のいずれかを使用し得る。また、市販のペプチド合成機（例えばＳｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＳＭ−８）も使用し得る。
【００３５】
反応後、本発明のペプチドは、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーまたは再結晶化などの慣用の精製方法の組合せによって精製し得る。
【００３６】
本発明の一態様によれば、ペプチドは、被験体に投与する組成物中に含め得る。組成物は医薬組成物またはワクチンであることができる。医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれ得る。また、組成物は、本発明のペプチドによって感作させた樹状細胞であってもよい。
【００３７】
本明細書中で使用する樹状細胞（ＤＣ）とは、抗原物質をプロセスし、それを表面上に免疫系の他の細胞に対して提示し、したがって抗原提示細胞として機能する、免疫細胞である。様々なプロセスを使用して、樹状細胞を抗原に対して感作させ得る。一実施形態では、これらのプロセスは、樹状細胞を抗原ペプチドと接触させるステップを含む（「ペプチドパルシング」）。この手法は、樹状細胞を、可変の時間（通常は約３０分間〜約５時間）の間、１つまたは複数の抗原ペプチドと共に、すなわち、ペプチドを用いて処理が、感作させた樹状細胞とも呼ばれる抗原提示細胞をもたらすような、抗原に由来するペプチドと共にインキュベーションすることからなる。
【００３８】
樹状細胞を癌に特異的な抗原で処理することは、ワクチン組成物またはペプチドを含む組成物を哺乳動物に投与した場合に宿主の免疫が刺激されるような、抗原を提示する樹状細胞をもたらす任意の方法によって、例えば、ワクチン組成物を哺乳動物に投与する前に樹状細胞を抗原の存在下でパルシングまたは培養することによって行うことができる。
【００３９】
樹状細胞は、樹状細胞が適切な細胞に到達することを可能にする任意の方法によって哺乳動物に投与することができる。これらの方法には、例えば、注射、インフュージョン、堆積、移植、経口摂取、もしくは局所投与、またはその任意の組合せが含まれる。注射は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内であることができる。当業者が必要以上の実験を行わずに決定できるように、癌に応じて単一または複数の用量を所定の期間にわたって投与することができる。注射は複数の位置で与えることができる。樹状細胞の投与は、単独または他の治療剤と組み合わせて行うことができる。
【００４０】
本明細書中で使用する「ワクチン」とは、無害の形態の抗原を含有する生物または物質を意味する。ワクチンは免疫保護応答を始動するように設計されている。ワクチンは組換えまたは非組換えであり得る。非免疫宿主内に接種した際、ワクチンは生物または物質に対する活性免疫を誘発するが、疾患を引き起こさない。ワクチンは、例えば、解毒されているが、その主要な免疫原性決定要因を依然として保持している毒素、もしくは腸チフス、コレラおよび灰白髄炎などの死滅させた生物、もしくは生きているが非病原性の形態の病原体である、弱毒化した生物として定義される、トキソイドの形態を取り得るか、またはそのような生物によってコードされている抗原であり得るか、または生きた腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞上に存在する抗原であり得る。
【００４１】
ワクチン組成物の用量は抗原、種、ワクチン接種したまたはワクチン接種する宿主の体重などに依存するが、薬理学的に有効な量のワクチン組成物の用量は、通常、マウスモデルにおいて体重１キログラムあたり約５０．ｍｕ．ｇ〜約５００．ｍｕ．ｇ／用量の範囲である。
【００４２】
原則として、本発明のワクチン組成物は経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内もしくは腹腔内）、頬内、鼻腔内、または経皮で好都合に投与する。本発明によって企図される投与経路は、抗原物質および共配合剤に依存する。
【００４３】
ワクチン組成物の用量は、選択した抗原、投与経路、種、体重、および他の標準の要因に依存する。有効な免疫化量および投与方法を達成するために、当業者が容易かつ敏速にそれぞれの抗原について免疫原性応答に適切な用量を滴定できることが企図される。
【００４４】
本発明の組成物は、その意図する投与経路に適合性があるように配合する。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸の投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下の施用に使用する液剤または懸濁液には、以下の構成成分、すなわち、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための薬剤を含めることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアル中に封入することができる。
【００４５】
注射用の使用に適した組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または無菌的注射用の液剤もしくは分散液を即時調製するための分散液および滅菌散剤が含まれる。静脈内投与には、適切な担体には、生理食塩水、滅菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコールなど）、ならびに適切なその混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖もしくはポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００４６】
無菌的注射用液剤は、所要量の化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、化合物を、基本分散媒および上記列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に取り込ませることによって調製する。滅菌散剤の場合、無菌的注射用液剤の調製には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および以前に滅菌濾過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
【００４７】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。経口治療的投与の目的には、化合物を賦形剤と共に取り込ませ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、洗口液として使用するために流体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質の化合物のうちの任意のものを含有することができる：結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。
【００４８】
吸入による投与には、組成物は、エアロゾルスプレーの形態で、加圧容器または適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素などの気体を含有するディスペンサー、すなわち噴霧器から送達する。
【００４９】
また、全身投与は経粘膜または経皮手段による場合もある。経粘膜または経皮の投与には、透過する障壁に適した浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は当分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を使用することによって達成することができる。経皮投与には、化合物は、当分野で一般に公知のように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム内に配合する。
【００５０】
また、本発明の組成物は、坐薬（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いる）または直腸送達用の保留浣腸の形態で調製することもできる。
【００５１】
一実施形態では、組成物は、移植片および微小カプセル封入送達系を含めた徐放性配合物など、化合物を身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物の調製方法は当業者に明らかであろう。また、材料をＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから購入することもできる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的化したリポソームが含まれる）も薬学的に許容される担体として使用することができる。
【００５２】
投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で配合することが有利である。本明細書中で使用する「単位剤形」とは、処置する被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、必要な製薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。
【００５３】
本発明の組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与の指示と一緒に含めて、梱包された製品を形成することができる。また、他の活性化合物も組成物内に取り込ませることができる。
【００５４】
また、本発明は、本発明のペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容される賦形剤は当分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は形もしくは稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、カプセル封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤および配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に記載されている。
【００５５】
本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を検出、診断および監視、ならびに処置するために本発明のペプチドを使用する方法を提供する。本発明の目的のために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌とは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ発現（正常な試料と比較して増加もしくは減少した、および／または不適切な発現、例えば、通常はエピトープ発現を欠く組織および／または細胞における発現の存在）に関連する任意の疾患、障害、または状態をいう。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法を提供する。該方法は、本発明のペプチドを、個々にまたは混合物として、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で、被験体に投与するステップを含む。ペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患の進行を低下させる免疫応答を誘導し得る。免疫応答には、Ｔ細胞またはＢ細胞関連の応答の両方が含まれ得る。また、ペプチドは、免疫応答に依存しない応答も誘導し得る。この応答の例は、それだけには限定されないが、生存度、接着、遊走、血管化、または免疫応答に依存しない可能性がある他の応答であり得る。
【００５７】
別の実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）樹状細胞を本発明のペプチドで感作させるステップと、（ｂ）感作させた樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で、被験体に投与するステップとを含む。樹状細胞の感作および投与は上述されており、ここでは繰り返さない。樹状細胞の例には、それだけには限定されないが、単球由来細胞（ＣＤ１４＋）、造血幹細胞由来細胞（ＣＤ３４＋もしくはＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１１７＋）、形質細胞様（ＣＤ３０３＋／ＣＤ３０４＋）、骨髄由来細胞（ＣＤ１ｃ＋もしくはＣＤ１４１＋もしくはＣＤ２０９＋）、またはランゲルハンス細胞が含まれる。
【００５８】
また、本発明のペプチドは、試料中のＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法で使用してもよい。該方法は、
（ａ）本発明のペプチドを、抗体がペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で試料と接触させるステップと、
（ｂ）試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む。
【００５９】
慣用の方法を用いて、抗体との複合体の量を決定し得る。例には、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、ＦＡＣＳ、または抗体を検出することができる任意の公知の方法が含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法で使用する。該方法は、（１）本発明のペプチドを、療法に対する被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明のペプチドは、被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法で使用する。処置は、抗体応答などのＴ細胞関連の応答またはＢ細胞関連の応答を誘導することができる。該方法は、（１）処置を受ける被験体の生体液を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、ペプチドとＴ細胞もしくはＢ細胞またはＴ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む。
【００６２】
本発明の目的では、生体液とは、排泄される、分泌される、針を用いて得る、または病理過程の結果として発生する場合がある、任意の生物学的な流体または組織溶解液である。生体液の例には、それだけには限定されないが、血液、尿、組織溶解液、血清、血漿、胆汁、汗、唾液、嚢胞液、水疱液、膿瘍液、脳脊髄液などが含まれる。
【００６３】
Ｔ細胞の産物には、それだけには限定されないが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１０、Ｔ細胞受容体、ケモカイン、ペロリン（ｐｅｒｏｒｉｎ）、グランザイムｂ、ＩＬ−９、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＣＤ４、ＣＤ８、インテグリン、ＭＨＣなどが含まれる。
【００６４】
Ｂ細胞の産物には、それだけには限定されないが、免疫グロブリン、ＢＬＡＭＥ、ＢＴＣ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＩＦＮＧＲ２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３インテグリン、ＤＬＦ、ＬＡＸ、ロイコトリエン、Ｌｙｎ、Ｌｉｌｌｒｃ１、ＮＦＡＭ１、ＮＴＢ−ａ、ＯＸ４０Ｌ、Ｐａｘ５、ＰＤＣＤ６、ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７Ｒ、ＴＥＲ−１１９、ＴＲＡ、ＴＲＥＭＬ２、ＴＳＬＰ、Ｖａｖ−１、Ｂ細胞受容体、ＢＡＦＦ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ４０リガンド、ＢＣＬ−６、ＡＤＡＭ、ＩＬ−１１、ＩＬ−４、ＣＤ２７、ＳＴＡＴなどが含まれる。
【００６５】
本発明のペプチドは多くの応用を有する。応用の一部を以下に例として記載する。
【００６６】
樹状細胞療法におけるペプチドの使用
本発明のペプチドは、樹状細胞療法またはｅｘ ｖｉｖｏ免疫療法の一部として使用することができる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを、単独で、あるいはＫＬＨまたは他の免疫系賦活剤、アジュバント（ａｄｊｕｔａｎｔ）もしくは他の分子と併せて使用して、ｅｘ ｖｉｖｏの免疫応答を誘発することができる。「パルシングした」樹状細胞をドナー内に注射して戻して、すべての形態のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させることができ得る抗癌免疫応答をもたらす。ＫＬＨと結合体化したペプチドの初期効果は、サイトカイン／ケモカイン発現を用いて細胞培養物中で測定することができる。
【００６７】
感作に使用するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドは、末梢血から単離した単球、白血球除去細胞、またはバフィーコートのいずれかから開始して、単球から樹状細胞を作製して調製する［３０、３１］。単球の単離および培養は、完全ＲＰＭＩ−１０（ウシ胎児血清、１５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１×抗生物質／抗糸状菌溶液または同等物を含むＲＰＭＩ１６４０）［３０〜３５］を用いた標準のプロトコルに従う。単球の分化およびパルシング（抗原への曝露）は標準の方法に従って行う［１３］。樹状細胞の感作および成熟の測度として、ガンマ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の産生を細胞培地中で測定することができる。刺激していない対照細胞よりも統計的に高い、細胞培地中のγ−ＩＦＮの増加が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドによる陽性樹状細胞刺激と見なされる。以前の研究ではいくつかの異なるサイトカインの組合せを使用しており、複数のサイトカインまたはケモカインをアッセイして、完全なサイトカインの展望を提供し得る。細胞刺激の前、その間、およびその後の免疫細胞の部分組を決定するための、分化抗原群（ＣＤ）分子発現を用いたさらなる分析を行い得る。動物モデルを用いて、注射後の全体的なｉｎ ｖｉｖｏのサイトカインの展望に対する様々なペプチドの正確な効果を決定し得る。また、このことは、ヒト処置にスケーリングするための概念証明も提供する。いくつかのモデル系（すなわち、細胞培養物、健康なドナーの全血、および動物モデル）の組合せにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドモデルをヒト抗癌治療おいて開発するためのデータが提供される。
【００６８】
ペプチドは、ヒト樹状細胞をパルシングするために以前に使用されていたが［２３］、使用する領域は１つの例外を除いては異なる。以前の研究ではアミノ酸５８から開始されたペプチドを使用した一方で［２３］、ここでは非常に具体的な理由でアミノ酸５４から開始される。まず、開始部位は、より良好な溶解度および３個の非極性の疎水性残基に関連する他の問題のために選択した［２３］。次のアミノ酸は非極性の側鎖を有するため、スレオニンを最初のアミノ酸に選択した。さらに、荷電および配列の変化を欠くことが結合に影響を与えるために十分な場合があり、立ち代ってこれはＭＨＣ結合の潜在性に影響を与える場合がある［５３、５４、５７］。
【００６９】
樹状細胞患者免疫応答ツールとしてのペプチドの使用
本発明の別の態様によれば、本発明のペプチド、例えば表１に記載のペプチドを使用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを用いた癌ワクチン接種療法の進行を監視することができる。一実施形態では、個々の断片を皮下または皮内に注射して、患者の免疫応答を監視することができる。注射後、部位を応答について監視し、反応の直径を測定する。複数のペプチドを感作に使用する場合、複数の注射部位が存在することができ、反応を比較することができる。ペプチドをＫＬＨまたは同様の物質と結合体化させた場合、結合体単独を免疫応答の陽性対照として使用することができる。試験する感作ペプチド／試薬が２つまたは３つを超える場合は、ペプチドをＭａｎｔｏｕｘ／ＰＰＤ試験に類似の改変した皮膚掻爬試験、皮膚皮刺試験、または皮膚貼付試験で使用することができる［３６］。
【００７０】
皮膚皮刺試験に使用するペプチドは、様々な希釈率で、かつＯＦＡ／ｉＬＲＰ、ＫＬＨ（もしくは他の結合体）、または樹状細胞／癌ワクチン接種療法に使用される任意の他のタンパク質からの様々な異なるペプチドと共に調製し得る［１３、２７］。希釈率および／または様々なペプチドを使用して、個体の免疫応答をマッピングし、免疫系を感作させることができる。ペプチドの代わりにタンパク質を用いて患者を感作させる場合、改変した皮膚貼付／皮刺試験を使用して個体の免疫反応性エピトープを発見することができる。タンパク質の推定上のＭＨＣ−１または２をカバーするように合成したペプチド（６〜３０個のアミノ酸）を使用して、患者を感作させ得る／ワクチン接種し得る。ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの選択に類似の様式で選択することができる。あるいは、タンパク質配列をカバーするペプチドのライブラリを合成して、反応のエピトープおよび量を決定するために使用することができる。ペプチドおよび対照溶液に対する免疫応答は、利用可能な皮膚貼付試験キットのアプリケーターを用いて皮膚を掻爬／皮刺することによって、同時に決定することができる。あるいは、針に適切なペプチドまたは対照溶液を「載せる」ことができ、皮膚のパッチを試験することができる。免疫反応は早ければ２０分間で現れ得る。しかし、反応は接種後１週間の期間にわたって生じる可能性が高く、ただし、最大の過敏反応は接種後の２４〜７２時間で現れる傾向にある。ペプチドの反応および最適な希釈率が決定された後、臨床家が標準化された試験を用いて樹状細胞またはワクチン接種療法の大きさまたはグレードを決定し得る。この試験は結核のツベルクリンまたはＭａｎｔｏｕｘ／ＰＰＤ試験に類似している［３６］。遅延型の過敏反応によって提供される情報により、樹状細胞またはワクチン接種が有効であったこと、および患者がどの程度まで標的エピトープに対する感受性を有するかが示される。
【００７１】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、サイトカイン応答のｅｘ ｖｉｖｏ定量によって、樹状細胞またはワクチン接種療法によって引き起こされる免疫反応性の程度を決定するために使用し得る。ｅｘ ｖｉｖｏサイトカイン応答の測定を行うために、患者の血液を採取し、メトリザミド勾配、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、または赤血球の低張溶解によって白血球を単離する。生じる白血球を洗浄し、適切な成長培地中にプレートする。細胞を３７℃で、５％のＣＯ２を含有する湿環境でインキュベーションする。１８〜２４時間後、細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたは任意の他の樹状細胞もしくはワクチン接種療法からの様々な希釈率のペプチドを用いて「免疫誘発する」ことができる、個々のプレートまたは複数ウェルプレートのいずれかで成長させる。上記のように７２時間までインキュベーションした後、細胞培地を単離し、標準のＥＬＩＳＡまたは多重ＥＬＩＳＡ技術を用いてサイトカイン／ケモカイン発現を決定する。免疫活性を決定するために使用することができるサイトカイン発現の一部には、それだけには限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、および／またはＩＬ−１２が含まれる。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］。
【００７２】
ワクチンとしてのペプチドの使用
本発明のペプチド、例えば表１に記載のペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏワクチンに、個々にまたは結合体化した状態で使用することができる。これらは、癌（診断前が含まれる）に対する保護を提供するため、または存在する癌の進行を遅らせることを援助するために、個体内に直接注射することができる。ペプチドは、適切なｉｎ ｖｉｖｏのワクチン接種応答を与えるために適切な基質と結合体化している。個体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに、筋肉内、皮内、血管内、経口、または任意の他の一般的に使用される経路／機構を介して曝露される。注射した後、個体の免疫系は適切な免疫応答を開始させて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌および場合によっては他のＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患に対して保護する。ワクチン接種は、（ｉ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する確率を低下させるため、（ｉｉ）局在化した形態のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌について処置した後に再発率を低下させるため、（ｉｉｉ）現在の化学療法、放射性ヌクレオチド接種、または放射線に基づく癌療法の増大を支援するため、（ｉｖ）進行期の癌の進行を遅らせることを支援するため、（ｖ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰで感作させた樹状細胞療法を介して免疫を増強するために有用である。
【００７３】
一連の感作、および／またはＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する最小限の力価の後にＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して感作させるために、ペプチドを動物内に注射することができる。非特異的な免疫系の影響の対照として、対照動物はキーホールリンペットヘモシアニンに対して感作させ得る。適切な一連の感作の後、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を感作させた動物の尾部静脈内に注射することによって、動物を「免疫誘発する」ことができる。注入した癌細胞は動物の肺中でコロニー形成する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して感作させた動物は、未処置の動物よりも肺中により少ない数の癌コロニーを有するはずである。あるいは、他の動物モデル／測定基準を使用することができる。しかし、処置の性質が原因で、免疫無防備状態の動物を使用する系は作動しない場合がある。動物における癌モデルの大多数での問題は、これらが血液由来のＳＣＩＤ、または完全に機能的な免疫系を欠く他の系を使用することである。しかし、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ癌治療は、動物において以前にモデリングが成功している［６、９、１１、１８、２３、４１〜４３］。この処置の免疫性質の理由から、機能的な免疫系が必要である。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌に対するこれらのペプチドの治療的価値を決定するための代替方法が存在する。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］、その関連する内容が本明細書中に参考として組み込まれている。
【００７４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連疾患の処置におけるペプチドの使用
本発明のペプチド、例えば表１に記載のものを、個々にまたは組み合わせて、結合体化したまたは結合体化していない形態で使用して、免疫系に依存しないまたは連動し得る作用を介して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関与する疾患の進行を変更することができる。例えば、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのペプチドＧ領域は、ラミニン受容体の安定化を介して転移に役割を果たすことが示されている［１６、２４、４４］。その突然変異体および／または修飾体を含めた表１に記載のペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ活性に影響を与えることによって薬理学的薬剤として使用し得る。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物および非哺乳動物の細胞に対する成長速度の薬理学的効果を決定するための試験を提供する。試験には、様々な濃度の本発明のペプチドを用いてまたは用いずに細胞を成長させるステップと、アポトーシス、壊死、および細胞増殖に対する効果を測定するステップとが含まれる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な基底膜上に、様々な用量の本発明のペプチドを用いて成長させることができる。ペプチドの効果は、それだけには限定されないが、ＤＮＡラダー、細胞死検出ＥＬＩＳＡ、カスパーゼ測定、ＴＵＮＥＬアッセイ、アネキシン−Ｖ膜変化、ＤＮＡ染色、ＦＡＳ、ｐ５３、細胞毒性アッセイ、細胞増殖、および細胞生存度を含めた様々な方法によって測定することができる。
【００７６】
ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の侵襲性を増加または減少させるために使用し得る。これは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を、様々な濃度で、ペプチドを用いておよび用いずに、他のタンパク質に関与するいくつかの研究と同様の改変ボイデンチャンバを用いて成長させることによって、測定することができる［４５〜４８］。また、ペプチドを、細胞接着に影響を与えるために使用してもよく、標準の方法を用いて測定することができる。例えば、接着培養したＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を、様々な細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ）の存在下で、ペプチドを用いて培養する。その後、細胞を標準の方法によってアッセイして、ペプチドの存在下における細胞系の相対的接着を決定する［４９〜５２］。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、細胞生存度、増殖、細胞死、およびアポトーシスに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰの影響を決定し得る［３７〜４０］。
【００７７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連疾患の監視におけるペプチドの使用
本発明のペプチドを用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患に対するｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの応答を監視することができる。例えば、表１に記載のペプチドを、個々にまたは組み合わせて、結合体化したまたは結合体化していない形態で使用して、疾患の処置に対する身体の応答の程度を決定し得る。表１に記載のペプチドを固体基質上にコーティングすることができ（単独で、または組み合わせて）、細胞応答、自己免疫抗体の存在、結合タンパク質の存在、および／または他の試験を使用して、樹状細胞療法に対する応答を決定することができる。
【００７８】
エピトープの検出および免疫グロブリンの定量におけるペプチドの使用
ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでエピトープを検出および免疫グロブリンを定量するための基質として使用することができる。表１に記載のＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープをラテックスビーズまたは粒子上にコーティングすることができ、これを用いて、凝集を使用して患者の血清をスクリーニングすることができる。手短に述べると、表１に記載のペプチドをラテックスまたはコロイドなどの粒子に付着させることができる。ペプチド／粒子の混合物を患者の血清と共にインキュベーションして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対して反応する、存在する免疫グロブリンの相対量を測定することができる。１つのペプチド試薬のみを使用して樹状細胞を感作させた場合は、必要なのはそのペプチドのみである。完全長のタンパク質試薬を使用して樹状細胞を感作させた場合は、様々なペプチドが表１に記載のペプチドとして予測される場合がある。クラスタリングするペプチド領域の合計数を減らすために、上述のようにＭＨＣペプチド予測を組み合わせることができる。これらのペプチドはラテックスビーズ、コロイド、または粒子に個々に結合体化しており、凝集研究に使用する。反応性を決定するために、希釈したまたは希釈していない状態の患者の血清を、直径約２５ｍｍのワックスサークルを有する血清ガラス皿または血清学インキュベーション鋳型として具体的に設計されたプラットフォームに移す。血清を適切な量のペプチド／粒子の混合物と共にインキュベーションすることができる。血清、ペプチド／粒子の混合物は、非特異的な凝集を防止するために水平プラットフォーム上で常に回転させるべきである。試験には、陽性血清および陰性対照試料が含まれ得る。１５分間〜２時間、室温で回転しながらインキュベーションした後、凝集反応を読み取り、凝集の程度に基づいてグレードする。特定の場合では、非ＩｇＭ分子の感度および検出率を増大させるために、さらなる抗ヒト抗体を加え得る。これは上述の凝集試験の拡張であり、「間接的な凝集」と呼ばれる。さらに、ＩｇＭ（直接凝集）対ＩｇＧ（受動凝集）の比は、患者のワクチン接種の状態に関する臨床的に意味のある情報を提供し得る。この技法は、特異的なエピトープに対する患者の免疫を、グレードスケールを参照して迅速に決定および解釈する必要がある場合に、任意の樹状細胞療法または癌ワクチンに適用し得る。凝集スコア付けの代替として、試験は、分光光度計、化学発光、放射性、電気、または蛍光定量を用い得る。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］。
【００７９】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるペプチドの使用
本発明のペプチドはＥＬＩＳＡアッセイで使用し得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、可溶性の抗原または抗体を定量および／または検出するために使用することができる。さらに、様々なペプチドを使用して、様々なＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対する特異的な個々の応答を生じさせる。第１の応用は、ペプチドを、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ療法を受けている患者の血清に対する抗原として作用するように使用することである。この方法は標準のプロトコルに従う［４０］。第２の方法は、循環抗原を決定するための標準の直接競合的アッセイとしての、ペプチドの別の新規の応用である。この方法は標準の方法に従うが、本発明のペプチドを使用する［４０］。
【００８０】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するが、限定することを意図しない。そのような実施例は使用し得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順を代わりに利用し得る。実際、当業者は、本明細書中の教示に基づいて、必要以上の実験を行わずに、さらなる実施形態を容易に想定および生じることができる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
ペプチドの予測およびＯＦＡで感作させた樹状細胞との結合
コンピュータに基づくクラスタリング方法を用いていくつかの領域を予測した（図２）。ペプチド修飾の効果をさらに実証するために使用できるため、アミノ酸１２９から開始される領域（Ａｃ−ＣＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−アミド）を選択した。さらに、１２９は、以前の研究｛Ｒｏｈｒｅｒ、２００６年、＃１｝で、エピトープを含有せず、必要であると示されたＹＶＮＬＰＴＩＡＬエピトープの半分を欠くと示された領域中にある。１２９領域が抗原性であるかどうかを決定するために、樹状細胞を完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングし、成熟させ、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎ）で標識したペプチドを用いて１２９エピトープについて分析した（図３ＡおよびＣ）。
【００８２】
ＣＤ１４＋単球を、１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ、イリノイ州Ａｎｔｉｏｃｈ）を含有する無血清樹状細胞培地中、１×１０６個の細胞／ｍｌで成長させた。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのｒＨｕＯＦＡまたは
【００８３】
【化４】
の等量のペプチド混合物（２０ｎｇ／ｍｌ）で３６時間パルシングした。パルシングした樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび１μｍのプロスタグランジンＥ２を含有する無血清樹状細胞培地を用いて成熟させ、２日間成熟させた。２日間の終わりに、細胞をプレートから掻爬し、フローサイトメトリー分析を用いて分析した（図３Ａ〜Ｂ）。
【００８４】
アミノ酸１２９から開始されるエピトープの蛍光標識は標準の手順に従って行い、例えば、標準のプロトコルに従って、最初にシステイン上で標識したペプチドを付加して、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎｅ）−５−マレイミド（ｍａｌｅｄｉｍｉｄｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いた結合体化を可能にした。未結合のフルオレセインは標準の色素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて除去した。
【００８５】
成熟が成功したかどうかを決定するために、標準のプロトコル（ｐｒｏｔｏｔｏｃｏｌ）に従って、細胞をＣＤ１４、ＣＤ８０／８６、およびクラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）で分析した（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）。手短に述べると、約５．０×１０５個の細胞／チューブを、２％のウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。細胞を氷上に置き、２５μｌの適切な抗体、フルオレセインで標識したペプチドまたはアイソタイプ対照抗体を細胞と共に氷上で１時間インキュベーションした。１時間後、２％のＦＣＳを含む４ｍｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加え、チューブを３００×ｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化した。細胞を、２％のＦＣＳを含む４００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、分析した（図３Ｂ）。細胞をすぐに分析できない場合は、これらを０．５％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、４℃、暗所で固定した。細胞は、ＣＤ１４陰性ならびにＣＤ８３、ＣＤ８０／８６およびクラスＩＩ ＭＨＣ陽性である場合に、樹状細胞であると見なされた。
【００８６】
図３は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのコンピュータＨＬＡ分析から誘導した、完全長の組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰ（図３Ａ）または等量（重量で）のペプチド混合物（図３Ｂ）でパルシングした樹状細胞の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。データは、ｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびペプチドがどちらも樹状細胞を有効にパルシングできることを示している。ヒトｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰで感作させた細胞は５３．９０±３．０５８ Ｎ＝４によって認識された一方で、ペプチド混合物のパルシングは４０．４３±２．６１８ Ｎ＝４を認識し、差異は１３．４８±４．０２５であった（図３Ｃ）。両側スチューデントｔ検定を使用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの１２９領域を認識した成熟樹状細胞の百分率間に有意な差異が存在したかどうかを決定した。群間の差異は有意であることが判明し（ｐ＝０．０１５５）、平均＋／−ＳＥＭおよび有意性（＊）を図３Ｃに示す。
【００８７】
データは、ｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰでパルシングした樹状細胞の５３．９％が１２９領域のエピトープを認識し（図３Ａ）、以前に同定されていないエピトープの予測においてコンピュータ分析が正確であったことを示している。領域の強度のさらなる証拠として、パルシングした樹状細胞の大多数がこの領域を認識した。樹状細胞を刺激するペプチドの能力を図３Ｃに示し、細胞の４０．４３％が１２９領域を認識した。１１７個のペプチドが下線を引いた領域によって示す重複配列を有するため、樹状細胞の約４０％が１２９領域を認識するはずであると予想される。このことは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを用いた樹状細胞のパルシングを使用して完全長のタンパク質の特異的領域に対する免疫応答を変調できることを示している。さらに、これらの実験は、ペプチドの蛍光体を感作剤および診断試薬のどちらとしても使用できることを示している。
【００８８】
（実施例２）
１２９領域の樹状細胞結合に対するペプチド修飾の効果
コンピュータに基づくクラスタリング方法を用いていくつかの領域を予測した（図２）。ペプチド修飾の効果をさらに実証するために使用できるため、アミノ酸１２９から開始される領域（Ａｃ−ＣＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−アミド）を選択した。１２９領域が、樹状細胞に対するその相対的結合を向上できるかどうかを決定するために、ペプチド配列を、カルボキシル末端に４個のさらなるアミノ酸が含まれるように、かつ結合障害を最小限にするためにアミノ末端にスペーサーとして６−アミノヘキサノイルが含まれるように、修飾した。これらの修飾は、標準の１２９ペプチドと比較した場合に蛍光強度メジアンを増大させるはずである。
【００８９】
ＣＤ１４＋単球を、１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ、イリノイ州Ａｎｔｉｏｃｈ）を含有する無血清樹状細胞培地中、１×１０６個の細胞／ｍｌで成長させた。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒＨｕＯＦＡで３６時間パルシングした。パルシングした樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび１μｍのプロスタグランジンＥ２を含有する無血清樹状細胞培地を用いて成熟させ、２日間成熟させた。２日間の終わりに、細胞をプレートから掻爬し、フローサイトメトリー分析を用いて分析した。
【００９０】
ペプチド１２９および１２９−ａ（Ａｃ−ＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−Ａｈｘ−Ｃ−アミド）の蛍光標識は、標準の手順に従って行った。手短に述べると、システイン上で標識したペプチドには、標準のプロトコルに従ってフルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いた結合体化を可能にすることが含まれていた。未結合のフルオレセインは標準の色素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて除去した。また、このシステインは、ペプチドを様々な異なる生成物と結合体化させるためにも使用することができる。
【００９１】
成熟が成功したかどうかを決定するために、標準のプロトコルに従って、細胞をＣＤ１４、ＣＤ８３、ＣＤ８０／８６、およびクラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）で分析した （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）。手短に述べると、０．５×１０５個の細胞／チューブを、２％のウシ胎児血清を含む２５μｌのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁させた。細胞を氷上に置き、２５μｌの適切な抗体、フルオレセインで標識したペプチドまたはアイソタイプ対照抗体を細胞と共に氷上で１時間インキュベーションした。１時間後、２％のＦＣＳを含む４ｍｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加え、チューブを３００×ｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化した。細胞を、２％のＦＣＳを含む４００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、分析した。細胞をすぐに分析できない場合は、これらを０．５％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、４℃、暗所で固定した。ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ分析器を用いて少なくとも２，０００個の事象を分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．３を用いて表示させた（図４Ａ〜Ｂ）。細胞は、ＣＤ１４陰性ならびにＣＤ８３、ＣＤ８０／８６、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性である場合に樹状細胞であると見なされた。
【００９２】
図４Ｄは、組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰでパルシングした樹状細胞が１２９エピトープに対して活性であり、より高い確率で修飾した１２９−ａと結合することを示す。１２９ペプチドは１１，３９０＋／−５００．６の平均蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｎｔｅｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）を有していた一方で、１２９−ａペプチドは３８，６７０＋／−５０６７のＭＦＩ、すなわち蛍光強度の３．４倍の増加を示した。１２９および１２９−ａのＦＩＴＣで標識したペプチドの代表例をそれぞれ図４ＡおよびＢに示し、１２９−ａがｔ検定によって１２９とは異なる結合プロフィールを有するかどうかを決定し（ｐ＝０．００３２）、リンカー残基（Ａｈｘ）またはさらなるペプチドのどちらかの使用によるペプチドへの修飾が、その蛍光強度を増加させたことが示された（図４Ｄ）。このＭＦＩの増加は、結合能力の増加の指標である。
【００９３】
このデータは、わずかな変化がペプチドの結合および蛍光強度に影響を与えることができることを実証している。ペプチドは、樹状細胞を感作させるため、および樹状細胞パルシングの効率を決定するために使用することができる。このデータは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質に対して設計されたペプチドの使用は、パルシング効率、結合活性、免疫刺激、および免疫細胞の定量を向上させるために、様々な異なる方法によってわずかに改変できることを示している。ペプチドは、単独でまたは混合物中で使用して、特異的なＯＦＡ抗原に対する免疫細胞／タンパク質の反応性の程度を決定することができる。
【００９４】
（実施例３）
Ｉｎｎｏｃｙｔｅ９６ウェル細胞接着アッセイ
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計したペプチドが接着細胞系と細胞外基質の構成成分との細胞接着に何らかの影響を与えたかどうかを決定することであった。接着の減少は転移能を増大させるはずであることから、所望の応答は、接着に変化がないことである。
【００９５】
すべての細胞を、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、加湿チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）内で成長させた。ＤＵ−１４５およびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手し、標準のプロトコルに従って培地中で成長させた。細胞を７５〜８５％の密度まで成長させ、標準のプロトコルに従って収集し、改変ノイバウエル輝線赤血球計を用いて計数し、４００，０００個の細胞／ｍｌで懸濁させた。
【００９６】
ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＤＭＳＯのどちらかに溶かし、その後、最大２０％のＤＭＳＯまでＰＢＳに溶かし、２×溶液を作製し、完全培地中に入れた。ペプチドを適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニンＩ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびコラーゲンＩＶでコーティングされた２×８ウェルのストリップとして供給されるキット中に提供される９６ウェルアッセイプレート（ＥＭＤ、ニュージャージー州Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ内に、５０μｌの細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）と共に分注し、その後、細胞培養インキュベータ内で２時間、３７℃でインキュベーションした。内容物を生物学的廃棄物容器内に振り出し、２００μｌのＰＢＳをそれぞれのウェルに加えることによって穏やかに洗浄し、このステップで内容物を廃棄物容器内に振り出すことを合計２回洗浄するまで繰り返した。次に、１００μｌのカルセイン−ＡＭ作業溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、３７℃、インキュベータ内でインキュベーションした。ＤＴＸ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）を使用して、標準の蛍光プロトコルに従って、４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光波長を用いて、それぞれのウェルの蛍光を測定した。
【００９７】
図５は、ラミニンＩおよびコラーゲンＩのウェルからのデータを示す。生物活性濃度のペプチドの存在下において、これらの細胞の接着に有意な差異は見られない。データはすべての基質について同様である（示さず）。
【００９８】
このデータは、設計したＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドが細胞接着に影響を与えないことを示す。したがって、接着が影響を受けないため、これらは癌細胞の接着を減少させることによって転移負荷を増加させないはずである。このことは、ペプチドが、患者の転移負荷を増大させるはずのない、ｉｎ ｖｉｖｏの臨床的／治療的使用を有することができることを意味する。
【００９９】
（実施例４）
細胞生存度に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計したペプチドが細胞生存度に対して何らかの影響を与えるかどうかを決定することであった。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの性質が理由で、ペプチドは、ＯＦＡ｜ＯＦＡからＬＲへの変換を乱すまたは他のタンパク質｜タンパク質の相互作用を阻害するように設計されていると予想された。
【０１００】
すべての細胞を、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、加湿チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）内で成長させた。ＤＵ１４５細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手し、標準のプロトコルに従って培地中で成長させた。ＤＵ１４５細胞を７５〜８５％の密度まで成長させ、標準のプロトコルに従って収集し、改変ノイバウエル輝線赤血球計を用いて計数し、４００，０００個の細胞／ｍｌで懸濁させた。
【０１０１】
ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＤＭＳＯのどちらかに溶かし、その後、最大２０％のＤＭＳＯまでＰＢＳに溶かし、２×溶液を作製し、完全培地中に入れた。適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニン／エンタクチン複合体（５０μｇ／ｍｌ）でコーティングした、または未処理（黒色で透明な底）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）９６ウェルアッセイプレート、５０μｌの細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）内に分注し、終夜成長させた。その後、細胞に２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ））を加え、さらに２時間、３７℃でインキュベーションした。その後、細胞を、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）上で、標準の蛍光プロトコルに従って、０．００１秒間の積分時間を用いて読み取った。カスパーゼ活性が誘導されたかどうかを決定するために、ＡｐｏＯｎｅ アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いてカスパーゼ３／７活性を決定した。データをＥｘｃｅｌ、その後、Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）に出力し、ここでこれをプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを用いてバックグラウンド対照（ペプチドに使用した希釈剤）との統計的差異について分析した。
【０１０２】
すべてのＤＵ１４５細胞は、コーティングしていないまたはラミニン／エンタクチンでコーティングした９６ウェルプレートのどちらかで成長させた。ペプチド１またはペプチド３のどちらかの存在下では（表２）、コーティングしていない（ラミニンなし）またはコーティングした（ラミニン）群のどちらにおいても、対照と処置群との間に統計的差異は存在しなかった（図６ＡおよびＣ）。しかし、ラミニンの存在を必要とする、ペプチドによって引き起こされる何らかのすべての潜在的な効果の興味深い傾向が存在していた。ペプチド２（表２）は、２倍を超えて細胞生存度を減少させる能力を有する、最も顕著な生物学的効果を示し、これは対照とは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。ＡｐｏＯｎｅカスパーゼ３／７アッセイではどの群でも有意な差異は見られなかった（データ示さず）。さらに、以前に記載したＯＦＡ／ｉＬＲＰエピトープ（アミノ酸４９〜６０、ＤＭＳＯ／ＰＢＳで希釈）に対して作製したペプチドは、Ｔ細胞を増殖させることはできたが、細胞生存度に影響を与えるまたはアポトーシスを誘導することができなかった（データ示さず）。
【０１０３】
この実験の目的は、免疫原性を有すると予測されたＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドのうちのいずれかが、細胞生存度に対して何らかの効果を有するかどうかを決定することであった。ＤＵ１４５細胞をペプチド２の存在下で成長させた場合、これは、ペプチド希釈剤対照（２０％のＤＭＳＯ／８０％のＰＢＳ）と比較して、細胞生存度に対して有意な効果を有することが見られた。しかし、カスパーゼ３／７の活性化に依存しておらず、ＡｐｏＯｎｅアッセイの有意な変化は見られなかった（データ示さず）。さらに、以前に良好なエピトープであると示されたペプチド（Ｒｏｈｒｅｒ、２００６年、＃１）は細胞生存度に影響を与えなかった（アミノ酸４９〜６０、データ示さず）。このことはペプチドが治療的活性を有する可能性があり、それにより、これらを免疫または場合によっては細胞生存度の標的手法のいずれかとして使用することが可能となることを示す。
【０１０４】
本明細書中に上述した本発明の多くの改変および変形は、その精神および範囲から逸脱せずに行うことができ、したがって、課されるべき限定は、添付の特許請求の範囲によって示されるもののみである。
【０１０５】
本明細書中で引用したすべての特許および参考文献は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【０１０６】
表１．樹状細胞療法のための推定上のＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列の初期スクリーニング。列挙した配列は、免疫刺激もしくは樹状細胞療法または他の臨床応用のために、単独でまたは組み合わせて使用し得る。
【０１０７】
【表１】
表２．個々の予測された部位を組み合わせて１つのペプチドを作製する例。上記５つの例は、免疫および／または細胞活性の確率が増加した領域をどのように一緒にグループ化することができるかを示す。いずれかの末端でのわずかな修飾およびシステインの付加が結合体化に必要であり得る。
【０１０８】
【表２】
参考文献
【０１０９】
【化５】
【０１１０】
【化６】
【０１１１】
【化７】
【０１１２】
【化８】
【０１１３】
【化９】
【０１１４】
【化１０】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮出願第６１／１６３，８０８号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に関する。より詳細には、本発明は、樹状細胞を癌に対して感作させるために使用することができるペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌胎児性抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の初期の特徴づけは、癌胎児性抗原またはラミニン受容体を研究していた３つの独立のグループによって行われた［１〜３（非特許文献１〜３）］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰとは、様々な異なる癌において過剰発現され、リボソームタンパク質ｐ４０としての二重機能を有する、高度に保存されたタンパク質である［４〜２７］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質は２９５個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなり、約３７〜４４ＫＤａの分子量を有する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの構造が最近２．１５Åまで解明され、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸１１２から１４０までの間の領域がラミニン受容体タンパク質（ＬＲＰ）を形成するためのＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化［２８］に関与していることを示す。［２８］。ラミニン受容体の成熟型は、６７ｋＤａの分子量を有するアセチル化された未成熟ＬＲＰの二量体であると考えられる。成熟した６７ｋＤａの型は多くの正常細胞および腫瘍細胞上に存在するが、胎児および腫瘍細胞によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの優先的な発現が存在すると考えられる。したがって、発現パターンにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、癌および他の疾患を処置するために免疫系を感作させるための可能な候補タンパク質となる［６］。したがって、樹状細胞に基づく治療における特定のＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの使用が新規の応用である。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）とは、哺乳動物の免疫系の一部を形成する免疫細胞である。その主な機能は、抗原物質をプロセスし、それを免疫系の他の細胞の表面上に提示することである。したがって、これらは抗原提示細胞として機能する。樹状細胞は非リンパ組織と直接情報交換し、傷害シグナル（例えば、虚血、感染症、もしくは炎症）または腫瘍増殖について非リンパ組織を調査する。シグナル伝達された後、樹状細胞は、ＩＬ−１、ＴＮＦアルファ、ならびにリンパ球および骨髄性細胞を始動させる様々な他の炎症性サイトカインを放出することによって免疫応答を開始させる。例えば腫瘍に対する免疫不全など、様々な免疫不全が、樹状細胞の機能の損失の結果として生じると考えられている。樹状細胞は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞を感作させ、Ｔ細胞発生中の自己抗原および免疫中の外来抗原の両方の抗原をｉｎ ｓｉｔｕでＴ細胞に提示するための有効な経路を提供する高い能力を有する。したがって、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍または感染性疾患のワクチンアジュバントとして使用することに関する関心が高まっている。樹状細胞は、免疫系が特異的抗原を攻撃するように方向付けできる様々な異なる供給源（骨髄およびリンパ系）に由来することができる。例えば、これらは以下の供給源に由来し得る：単球由来（ＣＤ１４＋）、造血幹細胞由来（ＣＤ３４＋もしくはＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１１７＋）、形質細胞様（ＣＤ３０３＋／ＣＤ３０４＋）、骨髄由来（ＣＤ１ｃ＋もしくはＣＤ１４１＋もしくはＣＤ２０９＋）、またはランゲルハンス細胞。ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで感作させた後、樹状細胞は、あらゆる種類のＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患または癌に対して保護するまたはそれを処置するために、個体の自己免疫系を補助する。感作、または樹状細胞のパルシングとは、標的となっている免疫応答を解明するために樹状細胞を標的タンパク質に曝露させるプロセスである。
【０００５】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ樹状細胞療法は、後期の癌腫を有する患者の生存率を最小限の副作用で増大させることが示されている［１３、２２］。以前の実験では、樹状細胞を感作させるために推定上のＭＨＣ（主要組織適合性複合体）結合配列を有するペプチドを使用していた。しかし、推定上のＭＨＣ結合部位は、ペプチド上のその位置が原因で、またはそれが複数のペプチドにまたがるために、免疫系に見逃される場合がある。Ｓｉｅｇｅｌらは、ＨＬＡ−Ａ＊２０１を標的としたペプチドを使用したが、ペプチドの溶解度およびペプチドに関連する他の問題を考慮しなかった［２２］。Ｒｏｈｒｅｒらは、マウスに由来するＯＦＡ／ｉＬＲＰの１２量体ペプチドに重複したアミノ酸の増殖プロフィールを分析した［２９］。この研究では比Ｘ／ｎの分析に焦点を当て、Ｘはアミノ酸中のタンパク質の長さであり、ｎはペプチドの長さである（図１）。しかし、この連続的なペプチド方法に基づいても、推定上のＨＬＡ（ヒト白血球抗原）部位は、それだけには限定されないが、ペプチド溶解度、ペプチド構造、２つのペプチド間に位置するＨＬＡ部位、ＨＬＡ結合を制限するアミノ酸に隣接するＨＬＡ部位、および不適切な二次構造を含めた様々な理由が原因で、依然として免疫系によって見逃されるまたは認識されない場合がある。したがって、連続的なペプチドの使用は、情報価値がある一方で、完全長タンパク質を処理した場合に認識される可能性がある有用なタンパク質配列を見逃す高い確率を有する。実際、以前の研究では、公的に利用可能なＨＬＡ結合配列の予測プログラムと免疫応答を生じる可能性がより高い領域を発見するための統計的方法の使用を組み合わせることによって判明した、推定上のＨＬＡ結合配列のうちのいくつかを示すことができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅｓｏｔ， Ｈ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９８３）２（６）：ｐ８６１〜８６５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｎｏｆｆ， Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）９６（５）：ｐ１４７５〜９
【非特許文献３】Ｒａｏ， Ｎ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（１９８３）１１１（３）：ｐ８０４〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらに、以前のＯＦＡ／ｉＬＲＰ細胞に基づく療法では、細菌発現させたまたは小さなＨＬＡ特異的ペプチドを使用していた。［１３、２２］。細菌発現は時間がかかり、ＧＭＰに認定された様式で産生させることが困難である。したがって、樹状細胞および免疫系を刺激するために推定上のＭＨＣ結合部位の数が増加した領域を有するように具体的に設計されたペプチドを開発する必要性が存在する。また、ペプチドを用いた有効なＯＦＡ／ｉＬＲＰ樹状細胞療法を開発する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、樹状細胞を感作させることができる単離ペプチドまたはその混合物を提供する。ペプチドの例には、それだけには限定されないが、
【０００９】
【化１】
およびその混合物が含まれる。
【００１０】
さらなるアミノ酸をペプチドまたはペプチド混合物のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかに付加させ得る。一実施形態では、本発明のペプチドには以下のペプチドが含まれる：
【００１１】
【化２】
別の実施形態では、本発明のペプチドはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する。ペプチドは樹状細胞を感作させることができる。
【００１２】
本発明のペプチドは、ペプチドの免疫刺激、安定性、および／または溶解度を増大させる担体と結合体化させ得る。担体の例には、それだけには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏ／ｅｌｅｃｔｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、およびコロイド粒子が含まれる。
【００１３】
また、本発明のペプチドは、アセチル化、脂肪酸性化（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ミリスチン酸酸性化（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化（ａｂｉｄａｔｉｏｎ）、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＡＨＸ、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、または多抗原性ペプチド系（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＭＡＰ）が含まれるように修飾してもよい。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドが含まれる組成物を提供する。組成物は医薬組成物またはワクチンであることができる。医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれ得る。また、組成物は、本発明のペプチドによって感作させた樹状細胞であってもよい。
【００１５】
また、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法も提供する。該方法には、本発明のペプチドを、個々にまたは混合物として、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で被験体に投与するステップが含まれる。一実施形態では、ペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導する。
【００１６】
別の実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）樹状細胞を本発明のペプチドで感作させるステップと、（ｂ）感作させた樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で、被験体に投与するステップとを含む。
【００１７】
また、本発明のペプチドは、試料中の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法で使用してもよい。該方法は、
（ａ）本発明のペプチドを、抗体がペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で試料と接触させるステップと、
（ｂ）試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法で使用する。該方法は、（１）本発明のペプチドを、療法に対する被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明のペプチドは、被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法で使用する。処置は、Ｔ細胞関連応答またはＢ細胞関連応答のいずれか（抗体応答）を誘導し得る。該方法は、（１）処置を受ける被験体の生体液（ｂｉｏｆｌｕｉｄ）を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、ペプチドとＴ細胞もしくはＢ細胞またはＴ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む。
【００２０】
本発明の上述および他の特長ならびにこれらを獲得および使用する様式は、以下の説明を添付の図面と併せて参照することによって、より明らかとなり、かつ最も良好に理解されるであろう。図面は本発明の典型的な実施形態のみを示し、したがってその範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＨＬＡ結合モチーフのコンピュータ分析を示す図である。（Ａ）は、予測の関数としてのアミノ酸の数を示すグラフである。（Ｂ）は、％ＯＰＴの関数としてのアミノ酸の数を示すグラフである。（Ｃ）は、５個のアミノ酸のビンの関数としての分布部位の数を示すグラフである。
【図２】図２は、樹状細胞の感作における選択したペプチドのウィスカープロットを示す図である。％ＯＰＴの関数としての、クラスター形成したＨＬＡ結合ペプチドを示すグラフである。中実の丸は、結果を歪める可能性があり、最も強い免疫原性の領域が見つかる場所の不当表示を可能にする、外れ値を示す。
【図３Ａ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３は、パルシングした樹状細胞の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。（Ａ）は、完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｂ）は、ペプチド混合物でパルシングした樹状細胞のＦＡＣＳを示す。（Ｃ）は、１２９ペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ａ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｃ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図４Ｄ】図４は、１２９領域の樹状細胞認識に対するペプチド修飾の効果を示すグラフである。（Ａ）は、１２９ペプチドのＦＡＣＳである。（Ｂ）は、１２９ａペプチドのＦＡＣＳである。（Ｃ）は、１２９および１２９ａ領域の蛍光強度メジアン（ＭＦＩ）である。（Ｄ）は、１２９ペプチド対１２９ａペプチドの樹状細胞認識に対するパルシング剤の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、細胞接着に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果を示す図である。（Ａ）は、ＤＵ−１４５細胞接着を示すグラフである。（Ｂ）は、ＳＫ−ＭＥＬ細胞接着を示すグラフである。
【図６】図６は、細胞生存度に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果を示す図である。（Ａ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド１における細胞生存度を示すグラフである。（Ｂ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド２における細胞生存度を示すグラフである。（Ｃ）は、ラミニンを用いたおよび用いない場合の、ペプチド３における細胞生存度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一態様は、樹状細胞をＯＦＡ／ｉＬＲＰに対してパルシングするために使用できるペプチドまたはペプチド混合物を提供する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質の特異的領域を認識するように免疫系を方向付けるペプチドは、ホモ二量体形成領域、ラミニン結合領域、多剤耐性領域、リボソーム相互作用領域、および生物学的意義を有する他の部位などの、様々なユニークなタンパク質領域を中心に設計されている。ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体形成、抗原性、ＭＨＣ−１結合、ＭＨＣ−２結合、プロテアソーム切断、溶媒接近性、およびタンパク質配列に特異的なペプチドを焦点として、完全長のタンパク質に基づいて設計されている。本発明では、コンピュータおよび統計的分析を用いて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患の療法に対して使用し得る最適なペプチドを決定する。この方法はＸ−ｎペプチドのコンピュータ分析および複数のペプチド長さの迅速な分析の付加を可能にし、これにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたは同様の処置／療法で使用される任意の他の可能なタンパク質を用いた、樹状細胞またはワクチン接種療法のための最適なペプチドの発生の確率が増加する。
【００２３】
様々なＯＦＡ／ｉＬＲＰエピトープの分布を決定するために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質配列を、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いてすべての公知のＨＬＡ結合モチーフについてマイニングした（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｊｕｔｔａ Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｎｉｅｌｓ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｅｍｍｅｒｉｃｈ、Ｏｓｋａｒ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂａｃｈｏｒ、Ｓｔｅｆａｎ Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ： ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９年）５０巻：２１３〜２１９頁（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅからアクセス））。しかし、ＨＬＡ結合モチーフを個々に分析する代わりに、データベース中のすべての公知のＨＬＡ結合モチーフの表を、配列、開始部位、および％最適結合（実験ＨＬＡ結合データに対する％一致）を用いてＥｘｃｅｌに保存した。ＨＬＡ結合部位のデータが得られた後、Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＰｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いてこれらを分析した。ＨＬＡ結合部位が増加した領域を探すために、いくつかの異なる分析を行った。まず、予測されたＨＬＡ結合部位の開始部位をプロットして、ＨＬＡ結合の確率が増加している潜在的な領域を示した。その後、％最適（ＯＰＴ）を検査し、アミノ酸開始部位に対してプロットした。最後に、ＨＬＡ結合部位の数が増加した領域を探すために、部位の数をビニングした（５個のアミノ酸）。これらの分析を一緒にして、より大きなＨＬＡ結合部位の分布を有する特異的領域が存在していたことが示された。より多数のＨＬＡ結合部位を有する領域が同定された後、これらの領域中のＥｘｃｅｌシートからのデータを抽出し、％ＯＰＴをすべての予測されたＨＬＡ結合領域に対してプロットした。有意な差異を有する領域を全タンパク質（すべてのＨＬＡ部位）に対して分析するために、選択したペプチド領域を一元配置ＡＮＯＶＡで分析し、続いてダネットの多重比較試験を行った。分析により、群間に有意な差異が存在することが示された（ｐ＝０．００６８）。ダネットの事後分析により、１３２〜１３４および２１１〜２１７のペプチド群がすべてのＭＨＣペプチドの対照群と有意に異なっていたことが示された（＊＝ｐ＜０．０５）（図２）。
【００２４】
本明細書中に記載の本発明のマイニング方法を用いて、免疫系を感作させるために使用できるペプチドを同定した。表１は、本発明のペプチド配列の例のリストを提供する。領域がＭＨＣタンパク質と結合できると推定される回数を分析することで、ペプチド領域を選択および／または組み合わせて生物活性ペプチドを発生させることができる（図１）。分布分析を領域の平均％ＯＰＴスコアと共に用いることで、５個の領域が、免疫系の適切な構成成分と結合する確率がより高いことが見出された。これにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患を処置するために、様々な異なるｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの刺激を用いて患者を感作させることが可能となる。
【００２５】
したがって、一実施形態では、本発明のペプチドには、それだけには限定されないが、
【００２６】
【化３】
およびその混合物が含まれる。さらなるアミノ酸をペプチドまたはペプチド混合物のｎ末端および／またはｃ末端に付加させ得る。別の実施形態では、本発明のペプチドはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する。
【００２７】
本発明のペプチドは、免疫刺激、安定性、および／またはペプチド溶解度のために適切な担体と結合体化させ得る。結合体化の種類には、それだけには限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｏｍｅｒ）、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、コロイド粒子、他のペプチド配列および様々なタンパク質で完成されるものが含まれる。結合体化のためのシステイン残基の位置は、必要に応じていずれかの末端または内部に存在することができる。結合体化の目的は、免疫系、処置としての抗癌性、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに関連する任意の他の関連活性を増大させることである。
【００２８】
本発明のペプチド配列は、より高い免疫系の反応性、増加した溶解度、および他の機能を可能にするためにわずかに変動してもよく、ペプチド配列のそのような変動は本発明のペプチドの一部であると見なされる。さらに、１つまたは複数の本発明の免疫反応性ペプチド配列を一緒に配置して新しい免疫反応性ペプチドを形成し得る。配列は、十分予測可能な免疫活性の領域またはいくつかの他の部位もしくはタンパク質に由来することができる。さらに、ペプチドは、免疫系に関連しない特定の機能を遮断または増強するために使用し得る。１つまたは複数の反復ペプチドの連結されたペプチドを作製して、長い生物活性ポリマーを形成し得る。製造中、ペプチドは、それだけには限定されないが、アセチル化、ホルミル化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、脂肪酸性化、ミリスチン酸酸性化、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）、ならびに／または、溶解度、安定性、免疫反応性、および／もしくは生物活性を増大させることを含めた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド機能に影響を与える他のものを含めた、１つまたは複数の修飾を有し得る。
【００２９】
本発明のペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患またはワクチンの処置中の非特異的な効果を減少させ得る、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に向けることができる。ペプチドは、表１に示す１つのペプチド配列またはペプチド配列の組合せから作製する。どの領域が免疫系刺激の確率が増加しているかを決定するために、クラスター形成した推定上のＨＬＡ結合部位を設計し、平均％ＯＰＴ（コンセンサスと比較した場合のペプチドのスコア）［５３、５４］を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ全体にわたるすべての推定上のＨＬＡ部位と比較した（図２）。比較に使用した複数の推定上のＨＬＡ結合部位が含まれるように具体的に設計したペプチドの例を図２に記載する。
【００３０】
個々の本発明のペプチドまたは組合せを用いて、免疫系を、提供したＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列で感作させ得る。また、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する免疫応答を誘導するように設計したペプチドを用いて、それだけには限定されないが、受容体結合、ラミニン機能の遮断および／または他のＯＦＡ／ｉＬＲＰの細胞機能に影響を与えることを含めた、さらなる臨床応用も提供し得る。ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの免疫反応性を増大させるために最終産物を結合体化させ得る。結合体化は、マレジオアミドＫＬＨタンパク質と反応させるためのシステインの付加を含めた、本明細書中に記載または当分野で公知の様々な方法によって形成させ得る［５５、５６］。これらのペプチドおよびその組合せは、癌に対するｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏのワクチン接種として使用する前に結合体化または修飾し得る。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、コンピュータに基づく手法により、樹状細胞および免疫系の療法に使用し得るいくつかの可能なタンパク質配列を同定した。一実施形態では、平均％ＯＰＴを、アミノ酸１３２、１１７および５４を中心に設計された３個のペプチドについて計算した（図２）。設計したペプチドを平均％ＯＰＴスコアと比較し、これらはすべて平均を超えており、１３２領域は有意に異なっていた（図２）。ペプチドはＨＬＡプロトタイプ配列の一部ではない少なくとも３個のアミノ酸のフランキング配列を有しており、必要な場合は抗原プロセッシングおよびＨＬＡ結合を最適化するために修飾することができる。他の可能なペプチドはアミノ酸１０４および２１１付近から開始され、単独で、または他のペプチドと組み合わせて使用することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは、ｅｘ ｖｉｖｏの樹状細胞の誘導および感作中に細菌発現させたＯＦＡ／ｉＬＲＰを置き換えるために使用することができる。ヒトまたは獣医学的な応用に適している限りは、ペプチドを様々な巨大分子と結合体化させることができる。
【００３３】
ペプチドは、化学合成またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどを用いた生化学的合成によって調製し得る。当業者に周知の方法を合成に使用し得る。
【００３４】
本発明のペプチドが化学合成である場合、ペプチド合成の分野で周知の方法を使用し得る。例えば、アジド方法、酸塩化物方法、酸無水物方法、混合酸無水物方法、ＤＣＣ方法、活性エステル方法、カルボジイミダゾール方法および酸化還元方法などの方法を列挙し得る。固相合成または液相合成のいずれかを使用し得る。また、市販のペプチド合成機（例えばＳｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＳＭ−８）も使用し得る。
【００３５】
反応後、本発明のペプチドは、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーまたは再結晶化などの慣用の精製方法の組合せによって精製し得る。
【００３６】
本発明の一態様によれば、ペプチドは、被験体に投与する組成物中に含め得る。組成物は医薬組成物またはワクチンであることができる。医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれ得る。また、組成物は、本発明のペプチドによって感作させた樹状細胞であってもよい。
【００３７】
本明細書中で使用する樹状細胞（ＤＣ）とは、抗原物質をプロセスし、それを表面上に免疫系の他の細胞に対して提示し、したがって抗原提示細胞として機能する、免疫細胞である。様々なプロセスを使用して、樹状細胞を抗原に対して感作させ得る。一実施形態では、これらのプロセスは、樹状細胞を抗原ペプチドと接触させるステップを含む（「ペプチドパルシング」）。この手法は、樹状細胞を、可変の時間（通常は約３０分間〜約５時間）の間、１つまたは複数の抗原ペプチドと共に、すなわち、ペプチドを用いて処理が、感作させた樹状細胞とも呼ばれる抗原提示細胞をもたらすような、抗原に由来するペプチドと共にインキュベーションすることからなる。
【００３８】
樹状細胞を癌に特異的な抗原で処理することは、ワクチン組成物またはペプチドを含む組成物を哺乳動物に投与した場合に宿主の免疫が刺激されるような、抗原を提示する樹状細胞をもたらす任意の方法によって、例えば、ワクチン組成物を哺乳動物に投与する前に樹状細胞を抗原の存在下でパルシングまたは培養することによって行うことができる。
【００３９】
樹状細胞は、樹状細胞が適切な細胞に到達することを可能にする任意の方法によって哺乳動物に投与することができる。これらの方法には、例えば、注射、インフュージョン、堆積、移植、経口摂取、もしくは局所投与、またはその任意の組合せが含まれる。注射は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内であることができる。当業者が必要以上の実験を行わずに決定できるように、癌に応じて単一または複数の用量を所定の期間にわたって投与することができる。注射は複数の位置で与えることができる。樹状細胞の投与は、単独または他の治療剤と組み合わせて行うことができる。
【００４０】
本明細書中で使用する「ワクチン」とは、無害の形態の抗原を含有する生物または物質を意味する。ワクチンは免疫保護応答を始動するように設計されている。ワクチンは組換えまたは非組換えであり得る。非免疫宿主内に接種した際、ワクチンは生物または物質に対する活性免疫を誘発するが、疾患を引き起こさない。ワクチンは、例えば、解毒されているが、その主要な免疫原性決定要因を依然として保持している毒素、もしくは腸チフス、コレラおよび灰白髄炎などの死滅させた生物、もしくは生きているが非病原性の形態の病原体である、弱毒化した生物として定義される、トキソイドの形態を取り得るか、またはそのような生物によってコードされている抗原であり得るか、または生きた腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞上に存在する抗原であり得る。
【００４１】
ワクチン組成物の用量は抗原、種、ワクチン接種したまたはワクチン接種する宿主の体重などに依存するが、薬理学的に有効な量のワクチン組成物の用量は、通常、マウスモデルにおいて体重１キログラムあたり約５０．ｍｕ．ｇ〜約５００．ｍｕ．ｇ／用量の範囲である。
【００４２】
原則として、本発明のワクチン組成物は経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内もしくは腹腔内）、頬内、鼻腔内、または経皮で好都合に投与する。本発明によって企図される投与経路は、抗原物質および共配合剤に依存する。
【００４３】
ワクチン組成物の用量は、選択した抗原、投与経路、種、体重、および他の標準の要因に依存する。有効な免疫化量および投与方法を達成するために、当業者が容易かつ敏速にそれぞれの抗原について免疫原性応答に適切な用量を滴定できることが企図される。
【００４４】
本発明の組成物は、その意図する投与経路に適合性があるように配合する。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸の投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下の施用に使用する液剤または懸濁液には、以下の構成成分、すなわち、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤、アセテート、シトレートまたはホスフェートなどの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調節するための薬剤を含めることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアル中に封入することができる。
【００４５】
注射用の使用に適した組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または無菌的注射用の液剤もしくは分散液を即時調製するための分散液および滅菌散剤が含まれる。静脈内投与には、適切な担体には、生理食塩水、滅菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流体であるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコールなど）、ならびに適切なその混合物を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、マンニトール、ソルビトールなどの糖もしくはポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００４６】
無菌的注射用液剤は、所要量の化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に取り込ませ、続いて滅菌濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、化合物を、基本分散媒および上記列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に取り込ませることによって調製する。滅菌散剤の場合、無菌的注射用液剤の調製には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および以前に滅菌濾過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
【００４７】
経口組成物には、一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。経口治療的投与の目的には、化合物を賦形剤と共に取り込ませ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、洗口液として使用するために流体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質の化合物のうちの任意のものを含有することができる：結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。
【００４８】
吸入による投与には、組成物は、エアロゾルスプレーの形態で、加圧容器または適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素などの気体を含有するディスペンサー、すなわち噴霧器から送達する。
【００４９】
また、全身投与は経粘膜または経皮手段による場合もある。経粘膜または経皮の投与には、透過する障壁に適した浸透剤を配合物中で使用する。そのような浸透剤は当分野で一般に公知であり、例えば、経粘膜投与には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬を使用することによって達成することができる。経皮投与には、化合物は、当分野で一般に公知のように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム内に配合する。
【００５０】
また、本発明の組成物は、坐薬（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いる）または直腸送達用の保留浣腸の形態で調製することもできる。
【００５１】
一実施形態では、組成物は、移植片および微小カプセル封入送達系を含めた徐放性配合物など、化合物を身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような配合物の調製方法は当業者に明らかであろう。また、材料をＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから購入することもできる。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的化したリポソームが含まれる）も薬学的に許容される担体として使用することができる。
【００５２】
投与の容易性および用量の均一性のために、経口または非経口組成物を単位剤形で配合することが有利である。本明細書中で使用する「単位剤形」とは、処置する被験体の単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、それぞれの単位は、必要な製薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性化合物を含有する。
【００５３】
本発明の組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与の指示と一緒に含めて、梱包された製品を形成することができる。また、他の活性化合物も組成物内に取り込ませることができる。
【００５４】
また、本発明は、本発明のペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容される賦形剤は当分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は形もしくは稠度を与えるか、または希釈剤として作用することができる。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、カプセル封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤および配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に記載されている。
【００５５】
本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を検出、診断および監視、ならびに処置するために本発明のペプチドを使用する方法を提供する。本発明の目的のために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌とは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ発現（正常な試料と比較して増加もしくは減少した、および／または不適切な発現、例えば、通常はエピトープ発現を欠く組織および／または細胞における発現の存在）に関連する任意の疾患、障害、または状態をいう。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法を提供する。該方法は、本発明のペプチドを、個々にまたは混合物として、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で、被験体に投与するステップを含む。ペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患の進行を低下させる免疫応答を誘導し得る。免疫応答には、Ｔ細胞またはＢ細胞関連の応答の両方が含まれ得る。また、ペプチドは、免疫応答に依存しない応答も誘導し得る。この応答の例は、それだけには限定されないが、生存度、接着、遊走、血管化、または免疫応答に依存しない可能性がある他の応答であり得る。
【００５７】
別の実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法は、（ａ）樹状細胞を本発明のペプチドで感作させるステップと、（ｂ）感作させた樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で、被験体に投与するステップとを含む。樹状細胞の感作および投与は上述されており、ここでは繰り返さない。樹状細胞の例には、それだけには限定されないが、単球由来細胞（ＣＤ１４＋）、造血幹細胞由来細胞（ＣＤ３４＋もしくはＣＤ１３３＋もしくはＣＤ１１７＋）、形質細胞様（ＣＤ３０３＋／ＣＤ３０４＋）、骨髄由来細胞（ＣＤ１ｃ＋もしくはＣＤ１４１＋もしくはＣＤ２０９＋）、またはランゲルハンス細胞が含まれる。
【００５８】
また、本発明のペプチドは、試料中のＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法で使用してもよい。該方法は、
（ａ）本発明のペプチドを、抗体がペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で試料と接触させるステップと、
（ｂ）試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む。
【００５９】
慣用の方法を用いて、抗体との複合体の量を決定し得る。例には、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、ＦＡＣＳ、または抗体を検出することができる任意の公知の方法が含まれる。
【００６０】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法で使用する。該方法は、（１）本発明のペプチドを、療法に対する被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明のペプチドは、被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法で使用する。処置は、抗体応答などのＴ細胞関連の応答またはＢ細胞関連の応答を誘導することができる。該方法は、（１）処置を受ける被験体の生体液を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、ペプチドとＴ細胞もしくはＢ細胞またはＴ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む。
【００６２】
本発明の目的では、生体液とは、排泄される、分泌される、針を用いて得る、または病理過程の結果として発生する場合がある、任意の生物学的な流体または組織溶解液である。生体液の例には、それだけには限定されないが、血液、尿、組織溶解液、血清、血漿、胆汁、汗、唾液、嚢胞液、水疱液、膿瘍液、脳脊髄液などが含まれる。
【００６３】
Ｔ細胞の産物には、それだけには限定されないが、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１０、Ｔ細胞受容体、ケモカイン、ペロリン（ｐｅｒｏｒｉｎ）、グランザイムｂ、ＩＬ−９、ＩＬ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＣＤ４、ＣＤ８、インテグリン、ＭＨＣなどが含まれる。
【００６４】
Ｂ細胞の産物には、それだけには限定されないが、免疫グロブリン、ＢＬＡＭＥ、ＢＴＣ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＩＦＮＧＲ２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３インテグリン、ＤＬＦ、ＬＡＸ、ロイコトリエン、Ｌｙｎ、Ｌｉｌｌｒｃ１、ＮＦＡＭ１、ＮＴＢ−ａ、ＯＸ４０Ｌ、Ｐａｘ５、ＰＤＣＤ６、ＷＳＸ−１／ＩＬ−２７Ｒ、ＴＥＲ−１１９、ＴＲＡ、ＴＲＥＭＬ２、ＴＳＬＰ、Ｖａｖ−１、Ｂ細胞受容体、ＢＡＦＦ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ４０リガンド、ＢＣＬ−６、ＡＤＡＭ、ＩＬ−１１、ＩＬ−４、ＣＤ２７、ＳＴＡＴなどが含まれる。
【００６５】
本発明のペプチドは多くの応用を有する。応用の一部を以下に例として記載する。
【００６６】
樹状細胞療法におけるペプチドの使用
本発明のペプチドは、樹状細胞療法またはｅｘ ｖｉｖｏ免疫療法の一部として使用することができる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを、単独で、あるいはＫＬＨまたは他の免疫系賦活剤、アジュバント（ａｄｊｕｔａｎｔ）もしくは他の分子と併せて使用して、ｅｘ ｖｉｖｏの免疫応答を誘発することができる。「パルシングした」樹状細胞をドナー内に注射して戻して、すべての形態のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させることができ得る抗癌免疫応答をもたらす。ＫＬＨと結合体化したペプチドの初期効果は、サイトカイン／ケモカイン発現を用いて細胞培養物中で測定することができる。
【００６７】
感作に使用するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドは、末梢血から単離した単球、白血球除去細胞、またはバフィーコートのいずれかから開始して、単球から樹状細胞を作製して調製する［３０、３１］。単球の単離および培養は、完全ＲＰＭＩ−１０（ウシ胎児血清、１５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１×抗生物質／抗糸状菌溶液または同等物を含むＲＰＭＩ１６４０）［３０〜３５］を用いた標準のプロトコルに従う。単球の分化およびパルシング（抗原への曝露）は標準の方法に従って行う［１３］。樹状細胞の感作および成熟の測度として、ガンマ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の産生を細胞培地中で測定することができる。刺激していない対照細胞よりも統計的に高い、細胞培地中のγ−ＩＦＮの増加が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドによる陽性樹状細胞刺激と見なされる。以前の研究ではいくつかの異なるサイトカインの組合せを使用しており、複数のサイトカインまたはケモカインをアッセイして、完全なサイトカインの展望を提供し得る。細胞刺激の前、その間、およびその後の免疫細胞の部分組を決定するための、分化抗原群（ＣＤ）分子発現を用いたさらなる分析を行い得る。動物モデルを用いて、注射後の全体的なｉｎ ｖｉｖｏのサイトカインの展望に対する様々なペプチドの正確な効果を決定し得る。また、このことは、ヒト処置にスケーリングするための概念証明も提供する。いくつかのモデル系（すなわち、細胞培養物、健康なドナーの全血、および動物モデル）の組合せにより、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドモデルをヒト抗癌治療おいて開発するためのデータが提供される。
【００６８】
ペプチドは、ヒト樹状細胞をパルシングするために以前に使用されていたが［２３］、使用する領域は１つの例外を除いては異なる。以前の研究ではアミノ酸５８から開始されたペプチドを使用した一方で［２３］、ここでは非常に具体的な理由でアミノ酸５４から開始される。まず、開始部位は、より良好な溶解度および３個の非極性の疎水性残基に関連する他の問題のために選択した［２３］。次のアミノ酸は非極性の側鎖を有するため、スレオニンを最初のアミノ酸に選択した。さらに、荷電および配列の変化を欠くことが結合に影響を与えるために十分な場合があり、立ち代ってこれはＭＨＣ結合の潜在性に影響を与える場合がある［５３、５４、５７］。
【００６９】
樹状細胞患者免疫応答ツールとしてのペプチドの使用
本発明の別の態様によれば、本発明のペプチド、例えば表１に記載のペプチドを使用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを用いた癌ワクチン接種療法の進行を監視することができる。一実施形態では、個々の断片を皮下または皮内に注射して、患者の免疫応答を監視することができる。注射後、部位を応答について監視し、反応の直径を測定する。複数のペプチドを感作に使用する場合、複数の注射部位が存在することができ、反応を比較することができる。ペプチドをＫＬＨまたは同様の物質と結合体化させた場合、結合体単独を免疫応答の陽性対照として使用することができる。試験する感作ペプチド／試薬が２つまたは３つを超える場合は、ペプチドをＭａｎｔｏｕｘ／ＰＰＤ試験に類似の改変した皮膚掻爬試験、皮膚皮刺試験、または皮膚貼付試験で使用することができる［３６］。
【００７０】
皮膚皮刺試験に使用するペプチドは、様々な希釈率で、かつＯＦＡ／ｉＬＲＰ、ＫＬＨ（もしくは他の結合体）、または樹状細胞／癌ワクチン接種療法に使用される任意の他のタンパク質からの様々な異なるペプチドと共に調製し得る［１３、２７］。希釈率および／または様々なペプチドを使用して、個体の免疫応答をマッピングし、免疫系を感作させることができる。ペプチドの代わりにタンパク質を用いて患者を感作させる場合、改変した皮膚貼付／皮刺試験を使用して個体の免疫反応性エピトープを発見することができる。タンパク質の推定上のＭＨＣ−１または２をカバーするように合成したペプチド（６〜３０個のアミノ酸）を使用して、患者を感作させ得る／ワクチン接種し得る。ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの選択に類似の様式で選択することができる。あるいは、タンパク質配列をカバーするペプチドのライブラリを合成して、反応のエピトープおよび量を決定するために使用することができる。ペプチドおよび対照溶液に対する免疫応答は、利用可能な皮膚貼付試験キットのアプリケーターを用いて皮膚を掻爬／皮刺することによって、同時に決定することができる。あるいは、針に適切なペプチドまたは対照溶液を「載せる」ことができ、皮膚のパッチを試験することができる。免疫反応は早ければ２０分間で現れ得る。しかし、反応は接種後１週間の期間にわたって生じる可能性が高く、ただし、最大の過敏反応は接種後の２４〜７２時間で現れる傾向にある。ペプチドの反応および最適な希釈率が決定された後、臨床家が標準化された試験を用いて樹状細胞またはワクチン接種療法の大きさまたはグレードを決定し得る。この試験は結核のツベルクリンまたはＭａｎｔｏｕｘ／ＰＰＤ試験に類似している［３６］。遅延型の過敏反応によって提供される情報により、樹状細胞またはワクチン接種が有効であったこと、および患者がどの程度まで標的エピトープに対する感受性を有するかが示される。
【００７１】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、サイトカイン応答のｅｘ ｖｉｖｏ定量によって、樹状細胞またはワクチン接種療法によって引き起こされる免疫反応性の程度を決定するために使用し得る。ｅｘ ｖｉｖｏサイトカイン応答の測定を行うために、患者の血液を採取し、メトリザミド勾配、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、または赤血球の低張溶解によって白血球を単離する。生じる白血球を洗浄し、適切な成長培地中にプレートする。細胞を３７℃で、５％のＣＯ２を含有する湿環境でインキュベーションする。１８〜２４時間後、細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたは任意の他の樹状細胞もしくはワクチン接種療法からの様々な希釈率のペプチドを用いて「免疫誘発する」ことができる、個々のプレートまたは複数ウェルプレートのいずれかで成長させる。上記のように７２時間までインキュベーションした後、細胞培地を単離し、標準のＥＬＩＳＡまたは多重ＥＬＩＳＡ技術を用いてサイトカイン／ケモカイン発現を決定する。免疫活性を決定するために使用することができるサイトカイン発現の一部には、それだけには限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、および／またはＩＬ−１２が含まれる。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］。
【００７２】
ワクチンとしてのペプチドの使用
本発明のペプチド、例えば表１に記載のペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏワクチンに、個々にまたは結合体化した状態で使用することができる。これらは、癌（診断前が含まれる）に対する保護を提供するため、または存在する癌の進行を遅らせることを援助するために、個体内に直接注射することができる。ペプチドは、適切なｉｎ ｖｉｖｏのワクチン接種応答を与えるために適切な基質と結合体化している。個体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに、筋肉内、皮内、血管内、経口、または任意の他の一般的に使用される経路／機構を介して曝露される。注射した後、個体の免疫系は適切な免疫応答を開始させて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌および場合によっては他のＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患に対して保護する。ワクチン接種は、（ｉ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する確率を低下させるため、（ｉｉ）局在化した形態のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌について処置した後に再発率を低下させるため、（ｉｉｉ）現在の化学療法、放射性ヌクレオチド接種、または放射線に基づく癌療法の増大を支援するため、（ｉｖ）進行期の癌の進行を遅らせることを支援するため、（ｖ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰで感作させた樹状細胞療法を介して免疫を増強するために有用である。
【００７３】
一連の感作、および／またはＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する最小限の力価の後にＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して感作させるために、ペプチドを動物内に注射することができる。非特異的な免疫系の影響の対照として、対照動物はキーホールリンペットヘモシアニンに対して感作させ得る。適切な一連の感作の後、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を感作させた動物の尾部静脈内に注射することによって、動物を「免疫誘発する」ことができる。注入した癌細胞は動物の肺中でコロニー形成する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して感作させた動物は、未処置の動物よりも肺中により少ない数の癌コロニーを有するはずである。あるいは、他の動物モデル／測定基準を使用することができる。しかし、処置の性質が原因で、免疫無防備状態の動物を使用する系は作動しない場合がある。動物における癌モデルの大多数での問題は、これらが血液由来のＳＣＩＤ、または完全に機能的な免疫系を欠く他の系を使用することである。しかし、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ癌治療は、動物において以前にモデリングが成功している［６、９、１１、１８、２３、４１〜４３］。この処置の免疫性質の理由から、機能的な免疫系が必要である。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌に対するこれらのペプチドの治療的価値を決定するための代替方法が存在する。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］、その関連する内容が本明細書中に参考として組み込まれている。
【００７４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連疾患の処置におけるペプチドの使用
本発明のペプチド、例えば表１に記載のものを、個々にまたは組み合わせて、結合体化したまたは結合体化していない形態で使用して、免疫系に依存しないまたは連動し得る作用を介して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関与する疾患の進行を変更することができる。例えば、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのペプチドＧ領域は、ラミニン受容体の安定化を介して転移に役割を果たすことが示されている［１６、２４、４４］。その突然変異体および／または修飾体を含めた表１に記載のペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ活性に影響を与えることによって薬理学的薬剤として使用し得る。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、哺乳動物および非哺乳動物の細胞に対する成長速度の薬理学的効果を決定するための試験を提供する。試験には、様々な濃度の本発明のペプチドを用いてまたは用いずに細胞を成長させるステップと、アポトーシス、壊死、および細胞増殖に対する効果を測定するステップとが含まれる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、様々な基底膜上に、様々な用量の本発明のペプチドを用いて成長させることができる。ペプチドの効果は、それだけには限定されないが、ＤＮＡラダー、細胞死検出ＥＬＩＳＡ、カスパーゼ測定、ＴＵＮＥＬアッセイ、アネキシン−Ｖ膜変化、ＤＮＡ染色、ＦＡＳ、ｐ５３、細胞毒性アッセイ、細胞増殖、および細胞生存度を含めた様々な方法によって測定することができる。
【００７６】
ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の侵襲性を増加または減少させるために使用し得る。これは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を、様々な濃度で、ペプチドを用いておよび用いずに、他のタンパク質に関与するいくつかの研究と同様の改変ボイデンチャンバを用いて成長させることによって、測定することができる［４５〜４８］。また、ペプチドを、細胞接着に影響を与えるために使用してもよく、標準の方法を用いて測定することができる。例えば、接着培養したＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を、様々な細胞外基質タンパク質（ＥＣＭ）の存在下で、ペプチドを用いて培養する。その後、細胞を標準の方法によってアッセイして、ペプチドの存在下における細胞系の相対的接着を決定する［４９〜５２］。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、細胞生存度、増殖、細胞死、およびアポトーシスに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰの影響を決定し得る［３７〜４０］。
【００７７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連疾患の監視におけるペプチドの使用
本発明のペプチドを用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連の疾患に対するｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの応答を監視することができる。例えば、表１に記載のペプチドを、個々にまたは組み合わせて、結合体化したまたは結合体化していない形態で使用して、疾患の処置に対する身体の応答の程度を決定し得る。表１に記載のペプチドを固体基質上にコーティングすることができ（単独で、または組み合わせて）、細胞応答、自己免疫抗体の存在、結合タンパク質の存在、および／または他の試験を使用して、樹状細胞療法に対する応答を決定することができる。
【００７８】
エピトープの検出および免疫グロブリンの定量におけるペプチドの使用
ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでエピトープを検出および免疫グロブリンを定量するための基質として使用することができる。表１に記載のＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープをラテックスビーズまたは粒子上にコーティングすることができ、これを用いて、凝集を使用して患者の血清をスクリーニングすることができる。手短に述べると、表１に記載のペプチドをラテックスまたはコロイドなどの粒子に付着させることができる。ペプチド／粒子の混合物を患者の血清と共にインキュベーションして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対して反応する、存在する免疫グロブリンの相対量を測定することができる。１つのペプチド試薬のみを使用して樹状細胞を感作させた場合は、必要なのはそのペプチドのみである。完全長のタンパク質試薬を使用して樹状細胞を感作させた場合は、様々なペプチドが表１に記載のペプチドとして予測される場合がある。クラスタリングするペプチド領域の合計数を減らすために、上述のようにＭＨＣペプチド予測を組み合わせることができる。これらのペプチドはラテックスビーズ、コロイド、または粒子に個々に結合体化しており、凝集研究に使用する。反応性を決定するために、希釈したまたは希釈していない状態の患者の血清を、直径約２５ｍｍのワックスサークルを有する血清ガラス皿または血清学インキュベーション鋳型として具体的に設計されたプラットフォームに移す。血清を適切な量のペプチド／粒子の混合物と共にインキュベーションすることができる。血清、ペプチド／粒子の混合物は、非特異的な凝集を防止するために水平プラットフォーム上で常に回転させるべきである。試験には、陽性血清および陰性対照試料が含まれ得る。１５分間〜２時間、室温で回転しながらインキュベーションした後、凝集反応を読み取り、凝集の程度に基づいてグレードする。特定の場合では、非ＩｇＭ分子の感度および検出率を増大させるために、さらなる抗ヒト抗体を加え得る。これは上述の凝集試験の拡張であり、「間接的な凝集」と呼ばれる。さらに、ＩｇＭ（直接凝集）対ＩｇＧ（受動凝集）の比は、患者のワクチン接種の状態に関する臨床的に意味のある情報を提供し得る。この技法は、特異的なエピトープに対する患者の免疫を、グレードスケールを参照して迅速に決定および解釈する必要がある場合に、任意の樹状細胞療法または癌ワクチンに適用し得る。凝集スコア付けの代替として、試験は、分光光度計、化学発光、放射性、電気、または蛍光定量を用い得る。いくつかの他の一般的に使用されている技法を適用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチド療法の免疫学的応答を決定し得る［３７〜４０］。
【００７９】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるペプチドの使用
本発明のペプチドはＥＬＩＳＡアッセイで使用し得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、可溶性の抗原または抗体を定量および／または検出するために使用することができる。さらに、様々なペプチドを使用して、様々なＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対する特異的な個々の応答を生じさせる。第１の応用は、ペプチドを、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ療法を受けている患者の血清に対する抗原として作用するように使用することである。この方法は標準のプロトコルに従う［４０］。第２の方法は、循環抗原を決定するための標準の直接競合的アッセイとしての、ペプチドの別の新規の応用である。この方法は標準の方法に従うが、本発明のペプチドを使用する［４０］。
【００８０】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するが、限定することを意図しない。そのような実施例は使用し得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順を代わりに利用し得る。実際、当業者は、本明細書中の教示に基づいて、必要以上の実験を行わずに、さらなる実施形態を容易に想定および生じることができる。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
ペプチドの予測およびＯＦＡで感作させた樹状細胞との結合
コンピュータに基づくクラスタリング方法を用いていくつかの領域を予測した（図２）。ペプチド修飾の効果をさらに実証するために使用できるため、アミノ酸１２９から開始される領域（Ａｃ−ＣＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−アミド）を選択した。さらに、１２９は、以前の研究｛Ｒｏｈｒｅｒ、２００６年、＃１｝で、エピトープを含有せず、必要であると示されたＹＶＮＬＰＴＩＡＬエピトープの半分を欠くと示された領域中にある。１２９領域が抗原性であるかどうかを決定するために、樹状細胞を完全長の組換えヒトＯＦＡでパルシングし、成熟させ、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎ）で標識したペプチドを用いて１２９エピトープについて分析した（図３ＡおよびＣ）。
【００８２】
ＣＤ１４＋単球を、１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ、イリノイ州Ａｎｔｉｏｃｈ）を含有する無血清樹状細胞培地中、１×１０６個の細胞／ｍｌで成長させた。細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのｒＨｕＯＦＡまたは
【００８３】
【化４】
の等量のペプチド混合物（２０ｎｇ／ｍｌ）で３６時間パルシングした。パルシングした樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび１μｍのプロスタグランジンＥ２を含有する無血清樹状細胞培地を用いて成熟させ、２日間成熟させた。２日間の終わりに、細胞をプレートから掻爬し、フローサイトメトリー分析を用いて分析した（図３Ａ〜Ｂ）。
【００８４】
アミノ酸１２９から開始されるエピトープの蛍光標識は標準の手順に従って行い、例えば、標準のプロトコルに従って、最初にシステイン上で標識したペプチドを付加して、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎｅ）−５−マレイミド（ｍａｌｅｄｉｍｉｄｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いた結合体化を可能にした。未結合のフルオレセインは標準の色素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて除去した。
【００８５】
成熟が成功したかどうかを決定するために、標準のプロトコル（ｐｒｏｔｏｔｏｃｏｌ）に従って、細胞をＣＤ１４、ＣＤ８０／８６、およびクラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）で分析した（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）。手短に述べると、約５．０×１０５個の細胞／チューブを、２％のウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させた。細胞を氷上に置き、２５μｌの適切な抗体、フルオレセインで標識したペプチドまたはアイソタイプ対照抗体を細胞と共に氷上で１時間インキュベーションした。１時間後、２％のＦＣＳを含む４ｍｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加え、チューブを３００×ｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化した。細胞を、２％のＦＣＳを含む４００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、分析した（図３Ｂ）。細胞をすぐに分析できない場合は、これらを０．５％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、４℃、暗所で固定した。細胞は、ＣＤ１４陰性ならびにＣＤ８３、ＣＤ８０／８６およびクラスＩＩ ＭＨＣ陽性である場合に、樹状細胞であると見なされた。
【００８６】
図３は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのコンピュータＨＬＡ分析から誘導した、完全長の組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰ（図３Ａ）または等量（重量で）のペプチド混合物（図３Ｂ）でパルシングした樹状細胞の代表的なＦＡＣＳ分析を示す。データは、ｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびペプチドがどちらも樹状細胞を有効にパルシングできることを示している。ヒトｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰで感作させた細胞は５３．９０±３．０５８ Ｎ＝４によって認識された一方で、ペプチド混合物のパルシングは４０．４３±２．６１８ Ｎ＝４を認識し、差異は１３．４８±４．０２５であった（図３Ｃ）。両側スチューデントｔ検定を使用して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの１２９領域を認識した成熟樹状細胞の百分率間に有意な差異が存在したかどうかを決定した。群間の差異は有意であることが判明し（ｐ＝０．０１５５）、平均＋／−ＳＥＭおよび有意性（＊）を図３Ｃに示す。
【００８７】
データは、ｒＨｕＯＦＡ／ｉＬＲＰでパルシングした樹状細胞の５３．９％が１２９領域のエピトープを認識し（図３Ａ）、以前に同定されていないエピトープの予測においてコンピュータ分析が正確であったことを示している。領域の強度のさらなる証拠として、パルシングした樹状細胞の大多数がこの領域を認識した。樹状細胞を刺激するペプチドの能力を図３Ｃに示し、細胞の４０．４３％が１２９領域を認識した。１１７個のペプチドが下線を引いた領域によって示す重複配列を有するため、樹状細胞の約４０％が１２９領域を認識するはずであると予想される。このことは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを用いた樹状細胞のパルシングを使用して完全長のタンパク質の特異的領域に対する免疫応答を変調できることを示している。さらに、これらの実験は、ペプチドの蛍光体を感作剤および診断試薬のどちらとしても使用できることを示している。
【００８８】
（実施例２）
１２９領域の樹状細胞結合に対するペプチド修飾の効果
コンピュータに基づくクラスタリング方法を用いていくつかの領域を予測した（図２）。ペプチド修飾の効果をさらに実証するために使用できるため、アミノ酸１２９から開始される領域（Ａｃ−ＣＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−アミド）を選択した。１２９領域が、樹状細胞に対するその相対的結合を向上できるかどうかを決定するために、ペプチド配列を、カルボキシル末端に４個のさらなるアミノ酸が含まれるように、かつ結合障害を最小限にするためにアミノ末端にスペーサーとして６−アミノヘキサノイルが含まれるように、修飾した。これらの修飾は、標準の１２９ペプチドと比較した場合に蛍光強度メジアンを増大させるはずである。
【００８９】
ＣＤ１４＋単球を、１０００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ、イリノイ州Ａｎｔｉｏｃｈ）を含有する無血清樹状細胞培地中、１×１０６個の細胞／ｍｌで成長させた。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのｒＨｕＯＦＡで３６時間パルシングした。パルシングした樹状細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび１μｍのプロスタグランジンＥ２を含有する無血清樹状細胞培地を用いて成熟させ、２日間成熟させた。２日間の終わりに、細胞をプレートから掻爬し、フローサイトメトリー分析を用いて分析した。
【００９０】
ペプチド１２９および１２９−ａ（Ａｃ−ＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥＡＳＹＶＮＬＰＴ−Ａｈｘ−Ｃ−アミド）の蛍光標識は、標準の手順に従って行った。手短に述べると、システイン上で標識したペプチドには、標準のプロトコルに従ってフルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いた結合体化を可能にすることが含まれていた。未結合のフルオレセインは標準の色素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて除去した。また、このシステインは、ペプチドを様々な異なる生成物と結合体化させるためにも使用することができる。
【００９１】
成熟が成功したかどうかを決定するために、標準のプロトコルに従って、細胞をＣＤ１４、ＣＤ８３、ＣＤ８０／８６、およびクラスＩＩ ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）で分析した （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）。手短に述べると、０．５×１０５個の細胞／チューブを、２％のウシ胎児血清を含む２５μｌのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁させた。細胞を氷上に置き、２５μｌの適切な抗体、フルオレセインで標識したペプチドまたはアイソタイプ対照抗体を細胞と共に氷上で１時間インキュベーションした。１時間後、２％のＦＣＳを含む４ｍｌのＰＢＳをそれぞれのチューブに加え、チューブを３００×ｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化した。細胞を、２％のＦＣＳを含む４００μｌのＰＢＳに再懸濁させ、分析した。細胞をすぐに分析できない場合は、これらを０．５％のホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、４℃、暗所で固定した。ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ分析器を用いて少なくとも２，０００個の事象を分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．１．３を用いて表示させた（図４Ａ〜Ｂ）。細胞は、ＣＤ１４陰性ならびにＣＤ８３、ＣＤ８０／８６、およびＨＬＡ−ＤＲ陽性である場合に樹状細胞であると見なされた。
【００９２】
図４Ｄは、組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰでパルシングした樹状細胞が１２９エピトープに対して活性であり、より高い確率で修飾した１２９−ａと結合することを示す。１２９ペプチドは１１，３９０＋／−５００．６の平均蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｎｔｅｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）を有していた一方で、１２９−ａペプチドは３８，６７０＋／−５０６７のＭＦＩ、すなわち蛍光強度の３．４倍の増加を示した。１２９および１２９−ａのＦＩＴＣで標識したペプチドの代表例をそれぞれ図４ＡおよびＢに示し、１２９−ａがｔ検定によって１２９とは異なる結合プロフィールを有するかどうかを決定し（ｐ＝０．００３２）、リンカー残基（Ａｈｘ）またはさらなるペプチドのどちらかの使用によるペプチドへの修飾が、その蛍光強度を増加させたことが示された（図４Ｄ）。このＭＦＩの増加は、結合能力の増加の指標である。
【００９３】
このデータは、わずかな変化がペプチドの結合および蛍光強度に影響を与えることができることを実証している。ペプチドは、樹状細胞を感作させるため、および樹状細胞パルシングの効率を決定するために使用することができる。このデータは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質に対して設計されたペプチドの使用は、パルシング効率、結合活性、免疫刺激、および免疫細胞の定量を向上させるために、様々な異なる方法によってわずかに改変できることを示している。ペプチドは、単独でまたは混合物中で使用して、特異的なＯＦＡ抗原に対する免疫細胞／タンパク質の反応性の程度を決定することができる。
【００９４】
（実施例３）
Ｉｎｎｏｃｙｔｅ９６ウェル細胞接着アッセイ
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計したペプチドが接着細胞系と細胞外基質の構成成分との細胞接着に何らかの影響を与えたかどうかを決定することであった。接着の減少は転移能を増大させるはずであることから、所望の応答は、接着に変化がないことである。
【００９５】
すべての細胞を、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、加湿チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）内で成長させた。ＤＵ−１４５およびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手し、標準のプロトコルに従って培地中で成長させた。細胞を７５〜８５％の密度まで成長させ、標準のプロトコルに従って収集し、改変ノイバウエル輝線赤血球計を用いて計数し、４００，０００個の細胞／ｍｌで懸濁させた。
【００９６】
ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＤＭＳＯのどちらかに溶かし、その後、最大２０％のＤＭＳＯまでＰＢＳに溶かし、２×溶液を作製し、完全培地中に入れた。ペプチドを適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニンＩ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、およびコラーゲンＩＶでコーティングされた２×８ウェルのストリップとして供給されるキット中に提供される９６ウェルアッセイプレート（ＥＭＤ、ニュージャージー州Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ内に、５０μｌの細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）と共に分注し、その後、細胞培養インキュベータ内で２時間、３７℃でインキュベーションした。内容物を生物学的廃棄物容器内に振り出し、２００μｌのＰＢＳをそれぞれのウェルに加えることによって穏やかに洗浄し、このステップで内容物を廃棄物容器内に振り出すことを合計２回洗浄するまで繰り返した。次に、１００μｌのカルセイン−ＡＭ作業溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、３７℃、インキュベータ内でインキュベーションした。ＤＴＸ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）を使用して、標準の蛍光プロトコルに従って、４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光波長を用いて、それぞれのウェルの蛍光を測定した。
【００９７】
図５は、ラミニンＩおよびコラーゲンＩのウェルからのデータを示す。生物活性濃度のペプチドの存在下において、これらの細胞の接着に有意な差異は見られない。データはすべての基質について同様である（示さず）。
【００９８】
このデータは、設計したＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドが細胞接着に影響を与えないことを示す。したがって、接着が影響を受けないため、これらは癌細胞の接着を減少させることによって転移負荷を増加させないはずである。このことは、ペプチドが、患者の転移負荷を増大させるはずのない、ｉｎ ｖｉｖｏの臨床的／治療的使用を有することができることを意味する。
【００９９】
（実施例４）
細胞生存度に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドの効果
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計したペプチドが細胞生存度に対して何らかの影響を与えるかどうかを決定することであった。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの性質が理由で、ペプチドは、ＯＦＡ｜ＯＦＡからＬＲへの変換を乱すまたは他のタンパク質｜タンパク質の相互作用を阻害するように設計されていると予想された。
【０１００】
すべての細胞を、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中、３７℃、加湿チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）内で成長させた。ＤＵ１４５細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手し、標準のプロトコルに従って培地中で成長させた。ＤＵ１４５細胞を７５〜８５％の密度まで成長させ、標準のプロトコルに従って収集し、改変ノイバウエル輝線赤血球計を用いて計数し、４００，０００個の細胞／ｍｌで懸濁させた。
【０１０１】
ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＤＭＳＯのどちらかに溶かし、その後、最大２０％のＤＭＳＯまでＰＢＳに溶かし、２×溶液を作製し、完全培地中に入れた。適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニン／エンタクチン複合体（５０μｇ／ｍｌ）でコーティングした、または未処理（黒色で透明な底）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニューヨーク州Ｃｏｒｎｉｎｇ）９６ウェルアッセイプレート、５０μｌの細胞（２０，０００個の細胞／ウェル）内に分注し、終夜成長させた。その後、細胞に２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ））を加え、さらに２時間、３７℃でインキュベーションした。その後、細胞を、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）上で、標準の蛍光プロトコルに従って、０．００１秒間の積分時間を用いて読み取った。カスパーゼ活性が誘導されたかどうかを決定するために、ＡｐｏＯｎｅ アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いてカスパーゼ３／７活性を決定した。データをＥｘｃｅｌ、その後、Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）に出力し、ここでこれをプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを用いてバックグラウンド対照（ペプチドに使用した希釈剤）との統計的差異について分析した。
【０１０２】
すべてのＤＵ１４５細胞は、コーティングしていないまたはラミニン／エンタクチンでコーティングした９６ウェルプレートのどちらかで成長させた。ペプチド１またはペプチド３のどちらかの存在下では（表２）、コーティングしていない（ラミニンなし）またはコーティングした（ラミニン）群のどちらにおいても、対照と処置群との間に統計的差異は存在しなかった（図６ＡおよびＣ）。しかし、ラミニンの存在を必要とする、ペプチドによって引き起こされる何らかのすべての潜在的な効果の興味深い傾向が存在していた。ペプチド２（表２）は、２倍を超えて細胞生存度を減少させる能力を有する、最も顕著な生物学的効果を示し、これは対照とは有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。ＡｐｏＯｎｅカスパーゼ３／７アッセイではどの群でも有意な差異は見られなかった（データ示さず）。さらに、以前に記載したＯＦＡ／ｉＬＲＰエピトープ（アミノ酸４９〜６０、ＤＭＳＯ／ＰＢＳで希釈）に対して作製したペプチドは、Ｔ細胞を増殖させることはできたが、細胞生存度に影響を与えるまたはアポトーシスを誘導することができなかった（データ示さず）。
【０１０３】
この実験の目的は、免疫原性を有すると予測されたＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドのうちのいずれかが、細胞生存度に対して何らかの効果を有するかどうかを決定することであった。ＤＵ１４５細胞をペプチド２の存在下で成長させた場合、これは、ペプチド希釈剤対照（２０％のＤＭＳＯ／８０％のＰＢＳ）と比較して、細胞生存度に対して有意な効果を有することが見られた。しかし、カスパーゼ３／７の活性化に依存しておらず、ＡｐｏＯｎｅアッセイの有意な変化は見られなかった（データ示さず）。さらに、以前に良好なエピトープであると示されたペプチド（Ｒｏｈｒｅｒ、２００６年、＃１）は細胞生存度に影響を与えなかった（アミノ酸４９〜６０、データ示さず）。このことはペプチドが治療的活性を有する可能性があり、それにより、これらを免疫または場合によっては細胞生存度の標的手法のいずれかとして使用することが可能となることを示す。
【０１０４】
本明細書中に上述した本発明の多くの改変および変形は、その精神および範囲から逸脱せずに行うことができ、したがって、課されるべき限定は、添付の特許請求の範囲によって示されるもののみである。
【０１０５】
本明細書中で引用したすべての特許および参考文献は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【０１０６】
表１．樹状細胞療法のための推定上のＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列の初期スクリーニング。列挙した配列は、免疫刺激もしくは樹状細胞療法または他の臨床応用のために、単独でまたは組み合わせて使用し得る。
【０１０７】
【表１】
表２．個々の予測された部位を組み合わせて１つのペプチドを作製する例。上記５つの例は、免疫および／または細胞活性の確率が増加した領域をどのように一緒にグループ化することができるかを示す。いずれかの末端でのわずかな修飾およびシステインの付加が結合体化に必要であり得る。
【０１０８】
【表２】
参考文献
【０１０９】
【化５】
【０１１０】
【化６】
【０１１１】
【化７】
【０１１２】
【化８】
【０１１３】
【化９】
【０１１４】
【化１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化１１】
およびその混合物からなる群より選択される単離ペプチドであって、前記ペプチドは、樹状細胞を感作させることができる、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、３個までのさらなるアミノ酸を、それぞれ、そのＮ末端、Ｃ末端またはそれらの両方に含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、
【化１２】
である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
担体との結合体化を可能にするシステインまたは他の官能基を含有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
担体との結合体化を可能にするシステインまたは他の官能基を含有する、請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドの免疫刺激、安定性、および／または溶解度を増大させる担体と結合体化している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、デンドリマー、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
アセチル化、脂肪酸性化、ミリスチン酸酸性化、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＡＨＸ、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、または多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）が含まれるように修飾されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する単離ペプチドであって、樹状細胞を感作させることができるペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドまたはその混合物によって感作させた樹状細胞。
【請求項１４】
請求項３に記載のペプチドまたはその混合物によって感作させた樹状細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離ペプチドを含むワクチン。
【請求項１６】
請求項３に記載の単離ペプチドを含むワクチン。
【請求項１７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）樹状細胞を請求項１に記載のペプチドまたはその混合物で感作させるステップと、（ｂ）感作させた前記樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）樹状細胞を請求項３に記載のペプチドまたはその混合物で感作させるステップと、（ｂ）感作させた前記樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記ペプチドが、前記被験体において、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する被験体を処置する方法であって、請求項３に記載のペプチドまたはその混合物を、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させるために十分な量で前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
試料中のＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記抗体が前記ペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で前記試料と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
試料中の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法であって、
（ａ）請求項３に記載のペプチドを、前記抗体が前記ペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で前記試料と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法であって、（１）請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記療法に対する前記被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、前記被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）前記投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む、方法。
【請求項２５】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法であって、（１）請求項３に記載のペプチドまたはその混合物を、前記療法に対する前記被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、前記被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）前記投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む、方法。
【請求項２６】
被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法であって、ここで、前記処置は、Ｔ細胞関連応答、Ｂ細胞関連応答、またはそれらの両方の応答を誘導し、前記方法は、（１）前記処置を受ける前記被験体の生体液を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、前記ペプチドと前記Ｔ細胞、前記Ｂ細胞または前記Ｔ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で前記生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む、方法。
【請求項１】
以下：
【化１１】
およびその混合物からなる群より選択される単離ペプチドであって、前記ペプチドは、樹状細胞を感作させることができる、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、３個までのさらなるアミノ酸を、それぞれ、そのＮ末端、Ｃ末端またはそれらの両方に含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、
【化１２】
である、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
担体との結合体化を可能にするシステインまたは他の官能基を含有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
担体との結合体化を可能にするシステインまたは他の官能基を含有する、請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドの免疫刺激、安定性、および／または溶解度を増大させる担体と結合体化している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、生物学的ポリマー、抗体、化学療法、カーボンナノチューブ、微小電気／電気流体デバイス、分子機械、アミノ酸ＭＡＰポリマー、デンドリマー、生物学的に活性な脂質、生物学的に活性な糖分子／ポリマー、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
アセチル化、脂肪酸性化、ミリスチン酸酸性化、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、ｐ−ニトロアニリド、ＡＭＣ、スクシニル化、ＮＨＳ、ＣＭＫ／ＦＭＫ、Ｄ−アミノ酸、ジニトロベンゾイル化、メチル化、リン酸化、ＡＨＸ、ＳＯ３Ｈ２、オクタン酸、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＧＡＭ、ダンシル、ＭＣＡ、ＨＹＮＩＣ、ＤＴＰＡ、環形成、または多抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）が含まれるように修飾されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体化領域に由来する単離ペプチドであって、樹状細胞を感作させることができるペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドまたはその混合物によって感作させた樹状細胞。
【請求項１４】
請求項３に記載のペプチドまたはその混合物によって感作させた樹状細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離ペプチドを含むワクチン。
【請求項１６】
請求項３に記載の単離ペプチドを含むワクチン。
【請求項１７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）樹状細胞を請求項１に記載のペプチドまたはその混合物で感作させるステップと、（ｂ）感作させた前記樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項１８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、（ａ）樹状細胞を請求項３に記載のペプチドまたはその混合物で感作させるステップと、（ｂ）感作させた前記樹状細胞を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させる免疫応答を誘導するために十分な量で前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項１９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌を有する被験体を処置する方法であって、請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させるために十分な量で前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記ペプチドが、前記被験体において、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌の進行を低下させる免疫応答を誘導する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する被験体を処置する方法であって、請求項３に記載のペプチドまたはその混合物を、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌の進行を低下させるために十分な量で前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
試料中のＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記抗体が前記ペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で前記試料と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２３】
試料中の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体の量を決定する方法であって、
（ａ）請求項３に記載のペプチドを、前記抗体が前記ペプチドと結合して複合体を形成することを可能にする条件下で前記試料と接触させるステップと、
（ｂ）前記試料中で形成された複合体の量を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法であって、（１）請求項１に記載のペプチドまたはその混合物を、前記療法に対する前記被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、前記被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）前記投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む、方法。
【請求項２５】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連癌ワクチン接種療法の進行を監視する方法であって、（１）請求項３に記載のペプチドまたはその混合物を、前記療法に対する前記被験体の免疫応答を検出するのに十分な量で、前記被験体の部位に皮下または皮内で投与するステップと、（２）前記投与部位での反応の直径を監視するステップとを含む、方法。
【請求項２６】
被験体におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ関連処置の進行をｅｘ ｖｉｖｏで監視する方法であって、ここで、前記処置は、Ｔ細胞関連応答、Ｂ細胞関連応答、またはそれらの両方の応答を誘導し、前記方法は、（１）前記処置を受ける前記被験体の生体液を提供するステップと、（２）本発明のペプチドを、前記ペプチドと前記Ｔ細胞、前記Ｂ細胞または前記Ｔ細胞もしくはＢ細胞によって生じた産物との相互作用が可能となる条件下で前記生体液と接触させるステップと、（３）相互作用の量をＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔ、蛍光偏光、共鳴、またはＦＡＣＳ方法によって決定するステップとを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２２０１６（Ｐ２０１２−５２２０１６Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２３１２（Ｐ２０１２−５０２３１２）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８９４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６６９
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３２４８８）クアンタム イミュノロジクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８９４５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６６９
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３２４８８）クアンタム イミュノロジクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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